Функциональный анализ ДНК-метилтрансфераз SssI и HhaI с помощью сайт-направленного мутагенеза и модифицированных субстратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

□□3452982

На правах рукописи ДАРИЙ Мария Валерьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ

8551 И Н11а1 С ПОМОЩЬЮ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА И МОДИФИЦИРОВАННЫХ СУБСТРАТОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2008

1 А ^.О-1

003452982

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Громова Елизавета Сергеевна

Официальные оппоненты. доктор химических наук

ведущий научный сотрудник Михайлов Сергей Николаевич

кандидат биологических наук ведущий научный сотрудник Прохорчук Егор Борисович

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится 25 ноября 2008 года в 17 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 24 октября 2008 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ДНК-метилгрансферазы (МТазы) присутствуют в различных организмах, от бактерий до растений и животных. Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метильную группу на атом углерода С5 остатка цитозииа, образуя 5-метилцитозин. Донором метальной группы выступает кофактор аденозил-ь-метионин (Ас1оМеО, который в ходе реакции превращается в 8-аденозил-[,-гомоцистеин (AdoHcy). В прокариотах МТазы функционируют, главным образом, как компоненты систем рестрикции-модификации, осуществляющих защиту клетки от проникновения чужеродной ДНК. В высших организмах метилирование ДНК играет ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как транскрипция и импринтинг генов, эмбриональное развитие, репарация ДНК, конденсация хроматина. Отклонения от нормального уровня метилирования в клетках млекопитающих (как гипо-, так и гиперметилирование) связаны с возникновением рака. Показано, что первичные структуры МТаз млекопитающих в С-концевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5-МТаз. В связи с этим, представляется важным изучение прокариотических С5-МТаз, которые могут служить моделями для изучения механизмов метилирования у млекопитающих.

Бензо[а]пирен (В[а]Р) является одним из полициклических ароматических углеводородов-загрязнителей, широко распространенных в окружающей среде. В организмах, подверженных воздействию В[а]Р, отмечено образование множественных мутаций, что в конечном итоге может приводить к возникновению рака. Сам В[а]Р не является биологически активным, однако, при попадании в клетку он метаболизируется с образованием весьма реакционноспособных диолэпоксидов, которые могут ковалентно присоединяться к ДНК. При этом преимущественно модифицируются остатки гуанина с образованием стереоизомерных (+/-)-цгк- и (+/-)-транс-анти-В[а]Р-М2-АС аддуктов. Известно, что транс-анти-В[а]'Р-Ы2-в.О аддукты плохо поддаются репарации. Вследствие этого, они могут вызывать нарушение функционирования различных ферментов, взаимодействующих с ДНК, в том числе МТаз. Однако на сегодняшний день молекулярный механизм действия В[я]Р-повреждений на С5-МТазы не изучен.

Одним из объектов настоящей работы стала прокариотическая МТаза НЪа1. Она узнает в ДНК последовательность ОСвС и метилирует внутренний остаток цитозина участка узнавания (подчеркнут). M.HtmI является одной из наиболее изученных С5-МТаз: для нее разрешена пространственная структура и достаточно подробно изучен механизм действия. Это явилось предпосылкой выбора М.НЬа1 в качестве модельного фермента для изучения влияния В[д]Р-повреждений ДНК на метилирование.

Другим объектом работы стала М^кГ - уникальная прокариотическая МТаза, которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК последовательность Св. Благодаря этой особенности, М^к! может служить прекрасной моделью для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами. Этот фермент был обнаружен еще в 1985 году, однако на сегодняшний день он практически не изучен. В частности, нет данных о пространственной структуре и практически отсутствуют данные о механизме действия М^яЬ Известна первичная структура фермента, а также методом футпринтинга определены несколько функциональных групп ДНК, образующих контакты с ферментом. В нашей лаборатории методом компьютерного моделирования по гомологии была построена модель комплекса М.8$81-ДНК-Ас1оНсу. Однако до сих пор функционального анализа аминокислотных остатков М.85«1 не проводилось.

Цель работы. Целью работы явилось изучение влияния (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-ЛР~-сЮ аддуктов на функционирование ДНК-метилтрансферазы НЬа1, а также определение функционально значимых аминокислотных остатков М.5$81.

В работе решались следующие задачи: 1) определение влияния стереоизомерии В[а]Р-Л^-сЮ аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии реакции метилирования ДНК МТазой НЬа1; 2) выбор аминокислот, предположительно существенных для функционирования М^звГ и сайт-направленный мутагенез гена т1М с целью получения мутантных форм М^я!; 3) изучение влияния вводимых аминокислотных замен на связывание и метилирование ДНК МТазой Бея! и определение участия выбранных аминокислот в основных стадиях реакции метилирования.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе впервые был изучен молекулярный механизм действия В[а]Р на функционирование модельной прокариотической МТазы НЬа1. Было изучено связывание и метилирование МТазой НЬа1 аналогов субстрата, содержащих (+)- и (-)-т£>анс-онти-В[я]Р-Л,"-с1С-аддукты вместо остатков гуанина участка узнавания. Получены значения констант диссоциации комплексов М.НЬа1 с В[а]Р-ДНК, на основании которых установлено, что связывание ДНК при введении модификации ухудшается в 3.5-100 раз в зависимости от локализации и стереоизомерии аддукта. На основании анализа каталитических констант показано, что метилирование ДНК, содержащей В[а]Р-адцукты, затруднено или практически блокировано в зависимости от локализации аддукта в участке узнавания. Высказаны предположения о том, что в зависимости от положения В[«]Р-аддукта в участке узнавания и его стереохимии могут нарушаться как контакты каталитической петли М.НЬа1 (в частности, остатка 11е86) с малой бороздкой ДНК, так и контакты «узнающего» домена (в частности, остатков 8ег252 и С1у256) с большой бороздкой ДНК. С учетом сходства первичных структур

прокариотических МТаз и каталитических доменов МТаз млекопитающих, можно предполагать, что повреждение ДНК В[а]Р будет оказывать похожее действие на метилирование в случае эукариотических организмов.

Далее, в работе с помощью метода сайт-направленного мутагенеза были получены конструкции для продукции мутантов M.SssI, содержащих единичные замены ряда аминокислот. Впервые были получены мутантные ферменты, содержащие замены остатков, предположительно участвующих в узнавании ДНК (К297А, N299A, S300G/P и S317A), стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина (S145A, Q147L, V188A, R232A и T313A/D/H) и катализе (Е186А и R230A). Было изучено связывание и метилирование ими ДНК. Показано, что остатки Glul86 и Arg230 играют важнейшую роль в катализе. Обнаружено, что остатки Serl45, Glnl47, Arg232 и Thr313 участвуют в «выпетливании» цитозина из двойной спирали и стабилизации промежуточного комплекса, а Ser317 может участвовать в узнавании ДНК-мишени. Таким образом, впервые получены результаты, позволяющие достаточно детально описать механизм реакции метилирования ДНК МТазой SssI, а также подтверждена компьютерная модель этого фермента.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» и «Ломоносов-2005» (Москва, 2004 и 2005 г.г.), 31-м международном конгрессе FEBS (Стамбул, 2006 г.), международной конференции «Биокатализ-2007» (Санкт-Петербург, 2007 г.) и IV-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (120 ссылок). Материал иллюстрирован 34 рисунками и 3 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Взаимодействие MHhal с ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти-Ъ[а\Р-^-АО-аддукты в участке узнавания.

Изучение механизма M.Hhal позволило выделить основные стадии реакции метилирования ДНК (рис. 1). Коротко их можно представить как (1) образование специфического комплекса МТаза-ДНК-AdoMet, (2) «выпетливание» метилируемого цитозина из двойной спирали в каталитическую полость фермента для сближения с кофактором, (3) образование ковалентного аддукта фермента с ДНК и перенос метальной группы на ДНК, (4) диссоциация комплекса и высвобождение продуктов реакции.

Рис. 1. Схематическое представление основных этапов реакции метилирования, катализируемой М.НЬа1 (УИкаШ е1 а1, 2001). Фермент выделен голубым цветом, участок узнавания МТазы в ДНК - розовым цветом, А(1оМе1 и Ас1оНсу - желтым и зеленым цветами соответственно.

При этом М.НЬа1 может вносить метальную группу как в еще не метилированную ДНК, превращая ее в полуметилированную (как показано на рис. 1), так и в ДНК, уже содержащую метальную группу в одной из цепей, превращая ее в полностью метилированную. Для определения влияния В[а]Р-аддуктов на различные стадии реакции были изучены связывание и метилирование В[а]Р-содержащих дуплексов М.НЬа1.

В качестве аналогов субстрата были использованы В[а]Р-содержащие производные 18-звенного неметилированного (ССО/ССтС) (табл. 1) или полуметилированного (СКХЗ/ССМ) ДНК-дуплексов (табл. 1). Модифицированные ДНК содержали (+)- и (-)-трапс-анти- ВМР-Л^-сЮ адцукты (В+ и В соответственно) вместо внешнего (примыкающего к метилируемому цитозину с 5'-стороны) или внутреннего (расположенного с З'-стороны от метилируемого цитозина) остатков гуанина участка узнавания (табл. 1).

Таблица 1, Параметры взаимодействия МТазы Hhal с ДНК-дуплексами, содержащими остаток В[о]Р.

ДНК-дуплекс1 Обозначение Kg, nM д-^UHl. ь кем, мин"1 к оти b teat

5'-GAGCCAAGCGCACTCTGA 3'-CTCGGTTCGCGTGAGACT GCG/CGC 8.6 + 0.5 1 3.7 + 0.3 l

5' -GAGCCAAB'CGCACTCTGA З'-CTCGGTTC GCGTGAGACT BXG/CGC 30 + 1 3.5 2.3 + 0.3 0.62

5 ' -GAGCCAAB*CGCACTCTGA З'-CTCGGTTC GCGTGAGACT B*CG/CGC 126 + 33 14.7 2.7 + 0.1 0.73

5' -GAGCCAAGCB'CACTCTGA З'-CTCGGTTCGC GTGAGACT GCB7CGC 400 + 23 46.5 0.9 + 0.1 0.24

5' -GAGCCAAGCB+CACTCTGA 3 '-CTCGGTTCGC GTGAGACT GCBVCGC 282 + 60 32.8 1.3 + 0.4 0.35

5'-GAGCCAAGCGCACTCTGA 3'-CTCGGTTCGMGTGAGACT GCG/CGM 7.2+1.2 1 3.7 + 0.1 1

5' -GAGCCAAB'CGCACTCTGA З'-CTCGGTTC GMGTGAGACT B"CG/CGM 124+13 17.2 0.0045 + 0.0005 1.210"3

5 ' -САСССААВ+СССАСТСТСА З'-СТСООТТС СМвТСАСАСТ В*СО/ССМ 746 ± 205 103 6 0.020 ± 0.002 5.4-Ю"3

5 ' -САСССААССВ'САСТСТСА З'-СТССОТТСИ! вТСАСАСТ ССВ7С0М 581 + 84 80.7 0.4 + 0.1 0.11

5 ' -САОССААССВ*САСТСТСА З'-СТССОТТОЗМ БТСАОАСТ ССВ7ССМ 323 ±139 45 1.2 ± 0.1 0.32

а Участок узнавания М Н11а1 выделен жирным шрифтом, метилируемое основание подчеркнуто; М - 5-метил-2'-дезоксицитидин; В* и В' - (+)- и (-)-транс-анти-Ща]Р-№-(\0 аддукты соответственно. 6 Определены относительно соответствующего параметра для дуплекса ССС/СвС (для неметилированных дуплексов) или дуплекса ССв/СОМ (для полуметилированных дуплексов).

Изучение связывания фермента с ДНК-дуплексами осуществляли в присутствии аналога кофактора, А(1оНсу, поскольку сродство М.НЬа1 к ДНК повышается в присутствии кофактора или его аналогов Щпёигот ег а1. 2000). Сначала мы попытались определить константы диссоциации фермент-субстратных комплексов с помощью титрования В[о]Р-поврежденных неметилированных дуплексов М.Н11а1 («прямое» титрование). К сожалению, получаемые этим методом значения Кл воспроизводились недостаточно хорошо (в некоторых случаях ошибка составляла более 100%), и только одна из констант (для дуплекса В+СО/ССС) была определена с относительно небольшой ошибкой (~ 20%). В связи с этим, был использован метод равновесного конкурентного связывания с МТазой В[а]Р-ДНК и 33Р-мечекного дуплекса ОСв/ССМ. В[й]Р-содержащие дуплексы конкурировали с 32Р-меченным каноническим субстратом за центр связывания фермента, уменьшая тем самым количество комплекса М.НЬа1-,2Р-ДНК-АёоНсу. Данный метод позволяет получить отношение (к = Кл'/Кй) констант диссоциации комплексов фермента с вытесняемым дуплексом (К¿') и дуплексом-конкурентом (Кл). В качестве вытесняемого был использован полуметилированный канонический дуплекс ССС/СвМ. Анализ образования комплексов при постепенном увеличении концентраций ДНК-конкурентов проводили методом «торможения» в геле. Пример радиоавтографа геля, полученного в ходе подобного эксперимента, представлен на рис. 2.

ДНК-конкурент

■

X 2 3 4 5 6789

М.НЬа1-ДНК-Ас1оНсу

ДНК ^ -» >■» " « «-■

Рис. 2. Конкурентное связывание дуплекса В+СС/ССМ и з:Р-меченного дуплекса вСС/ССМ (2 нМ) с М.НЬа1 (1 нМ) в присутствии 0.1 мМ Ас1оНсу. Радиоавтограф 8%-ного ПААГ. СдНк (В+СС/СОМ) 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.5 и 3 мкМ в дорожках 1-8 соответственно. 9 - ДНК-дуплекс ССС/СвМ.

Далее строи™ зависимости степени образования комплекса от концентрации ДНК-конкурента (рис. 3) и определяли значение к. С помощью полученной методом прямого титрования величины ЛГ^ комплекса М.НЪа1 с дуплексом В+Св/ССС была рассчитана К,I комплекса М.Н1и1 с дуплексом вСО/ССМ. С использованием этой константы были рассчитаны Кл комплексов фермента с В[я]Р-модифицированными ДНК (табл. 1).

Рис. 3. Кривые вытеснения неметилированными (А) и полуметилированными (Б) В[я]Р-модифицированными ДНК-конкурентами 32Р-меченного субстрата вСО/СОМ (1 нМ) из тройного комплекса М.НИаЬДНК-АсЬНсу. Сдлнсу 0.1 мМ, Смнш 2 нМ. Я - относительная степень связывания, определяемая как отношение степени образования комплекса при данной концентрации ДНК-конкурента к степени образования комплекса в отсутствие ДНК-конкурента. Обозначения дуплексов: (А) ССв/ССС (А), Ъ'Св/ССС (о), ВЧЮ/ССС (•), вСВ'/СОС (□), ССВ7ССС (■); (£) В'СС/ССМ (о), В+СС/СОМ (•),ССВ7С0М (□), ОСВ+/ССМ (■).

Как видно из табл. 1, все модифицированные дуплексы связываются ферментом хуже, чем канонические. Влияние положения ВМР-Л^-сЮ аддуктов в участке узнавания на связывание ДНК для неметилированных и полуметилированных дуплексов различается. Первые хуже связываются М.Н11а1 при модификации внешнего остатка гуанина (В+/" Св/ССС). Для вторых отсутствует четкое соответствие между локализацией аддукта и наблюдаемыми эффектами. Для полу- и неметилированных дуплексов не наблюдается четкой корреляции между стереохимией В[а]Р-/У2-сЮ аддукта и эффективностью связывания, однако можно сказать, что в случае модификации внешнего остатка гуанина (В+/'СС/ССС и хуже связываются (+)-т/инс-изомеры, а в случае модификации внутреннего остатка гуанина (ССВ+/7ССС и ССВ^ /СвМ) хуже связываются (-)-транс-изоыеры.

Кинетику метилирования В[а]Р-поврежденных ДНК-дуплексов изучали в стационарных условиях. Уровень метилирования определялся по включению тритиевой метки в ДНК, происходящему в процессе переноса метильной группы от [3Н-СНз]АёоМе1 в ходе ферментативной реакции. С помощью полученных зависимостей уровней

метилирования В[а]Р-содержащих ДНК-дуплексов от времени были определены величины начальных скоростей реакции (Уо) (рис. 4), а затем - значения каталитических констант (^л).

время, мин время, мин

Рис. 4. Временные зависимости степени метилирования неметилированных (А) и полуметилированных (£) В[а]Р-модифицированных ДНК-дуплексов в условиях стационарной кинетики. Сднк 100 нМ, Смны 5 нМ, СдаоМя 1-3 мкМ. Обозначения дуплексов такие же, как на рис. 3.

Как видно из табл. 1, все В[д]Р-содержащие ДНК-дуплексы метилируются МТазой НЬа1 хуже, чем немодифицированные субстраты. В случае неметилированных В[а]Р-ДНК наблюдается относительно небольшое снижение эффективности метилирования по сравнению с каноническим субстратом; дуплексы с В[а]Р-поврежденным внутренним остатком гуанина (ССВ+/7ССС) метилируются хуже, чем те, в которых поврежден внешний остаток гуанина (в^сассс). В случае полуметилированных дуплексов эффективность метилирования снижается сильнее, причем при модификации внешнего остатка гуанина (В+А СаСйМ) метилирование практически блокируется (£са1 снижается на 2-3 порядка). Можно отметить, что (-)-транс-изомеры метилируются хуже, чем (+)-лгранс-изомеры.

Далее было необходимо определить, какие контакты М.НЬа1 с ДНК, важные для функционирования фермента, нарушались при введении В[я]Р-аддуктов. Для этого использовали данные о структуре ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-Ы2-1Ю аддукты (рис. 5) и данные о контактах М.НЬа1 с ДНК в тройном комплексе М НЬаЬДНК-Ас1оНсу (рис. 6). Согласно данным ЯМР, в ДНК-дуплексах, содержащих (+)- или (-)-транс-анти-В[а]Р-Л'~-сЮ аддукт (рис. 5Л), объемный остаток В[а]Р локализован в малой бороздке ДНК ((Зеаапип' ег а!., ¡997). В случае (+)-изомера он ориентирован в сторону 5'-конца, а в случае (-)-изомера - в сторону З'-конца модифицированной цепи (рис. 5Б). Введение таких аддуктов в ДНК практически не нарушает комплементационные взаимодействия между основаниями и В-форму двойной спирали (Сошап е1 а1, 1992).

N. N

. X ЛШ

Л ОТ"

(+)-транс-анти-В[а]Р-^-йв (В+)

{-)-транс-анти-В[а]Р-1Г-йО (В")

3'

Рис. 5. (А) Структурные формулы (+)- и (-Утранс-анти-Ща^-Ы -сЮ аддуктов. (Б) Пространственные структуры ДНК-дуплексов, содержащих (+)- и (-)-транс-анти-Ъ[а]Р-Л'2-<Ю (вид на малую бороздку). Структуры разрешены методом ЯМР (реасШт а а!., 1997).

Методом РСА была разрешена пространственная структура комплекса М.НЬаЬДНК-АйоНсу, в которой метилируемый цитозин находится в «выпетленном» положении (КНтахаизкаь ег я/., 1994). Согласно полученным данным, М.НЬа1 состоит из двух доменов -большого и малого, в полости между доменами связывается ДНК-субстрат. При этом каталитическая петая (остатки 80-99) из большого домена взаимодействует с малой бороздкой, а две «узнающие» петли (остатки 233-240 и 250-257) из малого домена образуют контакты с большой бороздкой ДНК (рис. 6). Таким образом, специфические контакты с основаниями ДНК образуются малым доменом со стороны большой бороздки.

¥2« с 85

5' © ® ®

А

у?54

, 3 К89

' Ъ © © © 3'

¥1 с256

0 _______ ____

3' ©©©©©© ©|© ©

с257

Рис. б. Схематическое изображение контактов М.НЬа1 с ДНК в тройном комплексе М.НЬаГ-ДНК-Ас1оНсу согласно КИташткси е! а1., 1994. Структура тройного комплекса разрешена методом РСА.

Рассмотрим влияние положения транс-анти-Ъ[а]?-^-йО аддуктов в участке узнавания на формирование контактов М.НЬа1 с ДНК на примере полуметилированных дуплексов. В комплексах М.НЬа1 с полуметилированными ДНК-дуплексами возможна только одна ориентация фермента относительно ДНК - когда в активный центр попадает еще не метилированный остаток цитознна. В данном случае можно однозначно судить о том, какие контакты образуются с метилируемой и неметилируемой цепями ДНК.

При модификации внешнего остатка гуанина (дуплексы В+'"СО/ССМ) наблюдается резкое снижение эффективности метилирования ДНК (табл. 1). Это может быть обусловлено, во-первых, тем, что расположенный в малой бороздке остаток В[а]Р мешает «выпетливанию» цитозина и, таким образом, препятствует образованию каталитически компетентного комплекса. Кроме того, могут быть нарушены контакты каталитической петли с малой бороздкой ДНК, необходимые для ее стабилизации, что приводит к нарушению метилирования. В частности, может пропадать контакт 11е86 с аминогруппой внешнего остатка гуанина (рис. 6). Ухудшение связывания фермента с дуплексами В*'" Св/СОМ также может быть обусловлено нарушением «вьшетливания» метилируемого цитозина из двойной спирали, поскольку в случае М.НЬа1 наблюдается корреляция между эффективностью «выпетливания» цитозина-мишени и прочностью фермент-субстратного комплекса (ЕшЬгоок е/ а1„ 2004). Моделирование комплекса М.НЬа1 с В СО/СОМ и АёоНсу (здесь и далее моделирование проводилось Е.В. Кудан) показало, что, помимо отсутствия контакта 11е86 с внешним остатком гуанина, также нарушаются контакты С1п237 (малый домен), с неспаренным остатком гуанина (рис. 6). В нашем случае это согласуется с ухудшением связывания дуплекса ВХв/СОМ МТазой №а1. Известно, что при замене 01п237 на другие аминокислоты связывание фермента с ДНК ухудшается (Мг с/ а1„ 1995).

При модификации внутреннего остатка гуанина метилирование сохраняется, пусть и на невысоком уровне. Можно сделать вывод, что в этом случае наиболее важные контакты каталитической петли М.НЬа1 с малой бороздкой ДНК не нарушены. Вместе с тем, наличие В[а]Р-повреждения приводит к увеличению значений Кл комплексов М.НЬа1 с ССВ+'"/СОМ и Ас1оНсу. В случае (+)-изомера моделирование показало, что нарушаются водородные связи Яп237 с ДНК. Ухудшение связывания в случае (-)-изомера может объясняться тем, что локальное нарушение структуры ДНК, вызываемое введением аддукта, приводит к смещению модифицированного остатка гуанина относительно его положения в немодифицированном субстрате. При этом исчезают водородные связи, образованные остатками 8ег252 и в1у256 с ДНК со стороны большой бороздки.

Эффективность метилирования дуплексов, поврежденных В[д]Р, зависела не только от положения, но и от стереоизомерии аддукта: (+)-изомеры метилировались более

эффективно, чем (-)-изомеры (табл. 1). Известно, что (+)-транс-анти-Ща]Р-М2-дй аддукты вызывают несколько большую локальную дестабилизацию двойной спирали ДНК, чем (-)-изомеры; при этом происходит большее расширение малой бороздки и наблюдается больший изгиб ДНК в месте повреждения. Такие локальные нарушения могут облегчать конформационные перестройки в ДНК, приводящие к «выпетливанию» цитозина-мишени, и, таким образом, способствовать более эффективному метилированию ДНК.

Поскольку в целом механизмы катализа эукариотических и прокариотических МТаз схожи, можно предположить, что В[а]Р-повреждения будут оказывать похожее действие на МТазы млекопитающих. С помощью полуметилированных дуплексов показано, что локализация объемного остатка В[а]Р в малой бороздке ДНК может препятствовать образованию контактов каталитической петли фермента с ДНК, модифицированной В[а]Р. На основании выявленного снижения эффективности метилирования неметилированных и полуметилированных дуплексов, поврежденных В[а]Р, можно предположить, что наличие В[л]Р-аддуктов способно нарушать de novo метилирование ДНК в клетках млекопитающих.

Вероятность влияния В[я]Р-повреждений на метилирование ДНК у высших эукариот высока, поскольку наиболее часто В[а]Р-поврежденные остатки гуанина встречаются в CG-последовательностях, узнаваемых эукариотическими МТазами. Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что повреждения бензо[а]пиреном остатков гуанина в CG участках (и примыкающих к ним с 5'-стороны) могут приводить к локальному гипометилированию ДНК. Ранее уже было показано, что при обработке эукариотических клеток В[а]Р происходит снижение количества метилированных остатков цитозина в геномной ДНК (Wilson et al., 1987). Таким образом, помимо известного мутагенного действия бензо[д]пирена, проявляется и его влияние на метилирование, что может вносить дополнительный вклад в канцерогенное действие этого загрязнителя.

2. Мутационный анализ ДНК-метилтрансферазы Sssl.

Вторая часть работы посвящена изучению уникальной прокариотической МТазы Sssl, которая узнает короткую последовательность CG, и, таким образом, проявляет такую же специфичность, как МТазы млекопитающих. На сегодняшний день этот фермент практически не изучен. В частности, отсутствуют данные о пространственной структуре и крайне мало данных о механизме действия M.SssI. Данные футпринтинга свидетельствуют о том, что M.SssI взаимодействует преимущественно с остатками гуанина участка узнавания в большой бороздке ДНК (Renbaum et а!., 1995). Также выявлены многочисленные контакты M.SssI с межнуклеотидными фосфатами, расположенными преимущественно с 5'-стороны от

Св-участка. Предполагается, что именно эти контакты могут способствовать узнаванию короткой СО-последователыюсти.

2.1. Выбор аминокислотных остатков - объектов мутационного анализа.

Нас интересовало, какие аминокислотные остатки участвуют в ключевых стадиях реакции метилирования, катализируемой М.5ет1. Мы предполагали, что основные этапы реакции будут такими же, как в случае М.НЬа1 (рис. 1). Для выбора остатков - объектов мутационного анализа мы воспользовались данными выполненного в нашей лаборатории компьютерного моделирования по гомологии комплекса М 5х$1-ДНК-А(1оНсу, предсказывающего контакты фермента с гетероциклическими основаниями участка узнавания, а также с углеводофосфатным остовом ДНК (рис. 7).

с 291 E1Sf> ■ -3.3 R-I ?Пд51

y.w

\\1 ys ''' Схема контактов

M.SssI с ДНК согласно

'риш

J— S317

ша

3' ©

компьютерной модели комплекса M.SssI-ДНК-et al.,

5'

Т ■••Л \ / / 2004).

Кроме того, предположения о роли отдельных аминокислот в функционировании M.SssI базировались на анализе первичных структур M.SssI и ряда прокариотических и эукариотических С5-МТаз (рис. 8). Как известно, С5-МТазы имеют очень высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей (Posfai et al, 1989). В первичной структуре M.SssI содержатся 10 консервативных для семейства С5-МТаз аминокислотных мотивов, между мотивами VIII и IX расположен вариабельный участок - TRD (target recognition domain), предположительно отвечающий за узнавание в ДНК последовательности-мишени. Можно предположить, что остатки, занимающие в ферментах одну и ту же консервативную позицию, выполняют одну и ту же функцию. Некоторые предположения относительно роли аминокислотных остатков M.SssI в реакции метилирования были сделаны с учетом литературных данных по мутационному анализу М Hhal.

Прежде всего, нас интересовал вопрос о том, какие остатки могут отвечать за узнавание короткой последовательности CG (этап 1 на рис. 1). Согласно модели, важную роль в этом играют Ser300 и Ser317 из TRD (рис. 7 и 8). Атомы кислорода и азота основной цепи фермента в районе Ser300 образуют водородные связи с аминогруппой цитозина и

карбонильным кислородом гуанина неметилируемой цепи ДНК соответственно. Для проверки роли Ser300 мы заменяли его на Gly и Pro. Боковая цепь Ser317 взаимодействует с атомом азота N7 гуанина метилируемой цепи, что хорошо согласуется с результатами футпринтинга комплекса M.SssI с ДНК (Renbaum et al, 1995). Этот остаток Ser был заменен на Ala. Кроме того, мы приняли во внимание важность контактов M.SssI с межнуклеотидными фосфатами (Renbaum et al., 1995), и в качестве объектов мутационного анализа выбрали остатки К297 и N299 из TRD (рис. 7 и 8), заменив их на Ala.

MSssl

MHhal

М Haelll

М EcoRII

Dnmtí

Dnmt3a

Dnmt3b

Qs-rpif----гтаЕксЦк-------КРКБЖШЛИ—:KIVSEKD-ILÍÍ 2?O

iLlIIQlIFQFjKPFE-------LirTFVKBLjjL—pfsEVEH-LVI 207

__ £r,FbKEl.HIKY—¡flplPHI.------TRPTFpVlWDIKÍWFrPAI.DKM 199

:2^tVeEp|LHIHOGFTLR-glSRFÍP-EO|PSFGEt2EPW|)SKÍILTPKL 337

jLQS-EPLPFQftjG-qVUffiFPKIESVOT^KXWroVEHKIQEiaiVEP 212

--HGRI-------789

■-FSRT-------765

j----------TJi»!B!-TI ASTVH^ÍCÍ 11 q£< JK 1

'^IID^TKVSAAIÍ iJ^Y^GH J----------^GMipPVIUVSKHDIfl 1

MSssl

MHhal

M.Haelll

M EcoRII

Dnmt2

DnmOa

Dnmt3b

K297 N299 S 300 T313 S317

W / 11

271 Н1ХЮГЩ.ТЕ--------------------------------rXKTKSHI-----HKASLIGYSKFHSEGYtraPEFTGPni^Js------317

208 DRXD — LU--------------------------------HTHQEIEQTTP — KTVRLGIVGKGGQGER|YSTRGlIlRLSnYGGGIFA 260

200 KTHGHK------------------------------------------CITPHIIf.'¿ti GS'/ST IFH'.PHIfyií (JHIirl'Af Tv'J^S----GR 243

333 WEIL*----------------------------------------------lrCAKKHmUCGHGFGFGLVTiPEHKESIAliJiLSJItYHKDGS 381

2 13 HISFDGSI0CSGKTAILFlO.ETAEEIlOüaíg01)SDLSVKÍILKI)FLEDDIDVH9YLLPPKSLLRYALLLI)lf0PTCRR§VCFraÍGYGSYIE 302

790 -------------------------------------------------------------------------AKTSKVUglyTRSHSIKQ 607

766 ------------------------------------------------------------------------^AKLKKVgGxyTKSHSIRQ 783

Рис. 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей прокариотических С5-МТаз (M.SssI, M.Hhal, M.Haelll и M.EcoRlI) и МТаз млекопитающих (Dnmt2, Dnmt3a и Dnmt3b) Консервативные остатки выделены черным фоном, остатки с одинаковой химической природой выделены серым фоном. Консервативные мотивы выделены рамками и пронумерованы согласно (Posfai et al., 1989), после мотива VIII показана N-концевая часть последовательности TRD. Над аминокислотной последовательностью M.SssI отмечены остатки, выбранные для мутационного анализа.

Далее был выбран ряд остатков из мотивов IV, VI и VIII и из TRD, предположительно участвующих в «выпетливании» и стабилизации метилируемого цитозина (этап 2 на рис. 1). Одним из таких остатков является консервативный Serl45 (мотив IV) (рис. 8). Согласно модели, он взаимодействует с фосфатом, примыкающим к цитозину-мишени с 5'-стороны (Е.В. Кудан, личное сообщение) Роль этого остатка проверяли, заменяя его на Ala. Следующим остатком, для которого мы предположили участие в «выпетливании» цитозина из ДНК, был неконсервативный остаток Gin 147 (рис. 8). Согласно построенной модели, Gin 147 в M.SssI взаимодействует с неспаренным остатком гуанина со стороны малой бороздки ДНК (рис. 7). Его заменяли на Leu. Еще одна аминокислота, предположительно поддерживающая остаток цитозина в «выпетленном» положении - это

высококонсервативный Val 188 из мотива VI (рис. 8). В M.Hhal соответствующий остаток необходим для «выпетливания» цитозина из ДНК и, как следствие, для катализа (Estabrook et ai, 2004). Val 188 заменяли на Ala. Другим остатком, для которого мы предполагали участие в закреплении правильного положения «выпетленного» цитозина, был консервативный остаток Arg232 из мотива VIII (рис. 8). Согласно компьютерной модели, Arg232 образует водородные связи с атомом 02 метилируемого цитозина и с фосфатной группой, примыкающей к нему с 5'-стороны (рис. 7). Его важность проверяли заменой остатка на Ala. Наконец, была проверена роль Thr313 в «выпетливании» метилируемого цитозина из ДНК. Этот остаток, являющийся частью консервативного дипептида TL в TRD (рис. 8), согласно модели, взаимодействует с углеводофосфатным остовом (рис. 7). Мы заменяли Thr313 на Ala, Asp и His.

Наконец, нас интересовал вопрос о том, какие аминокислоты принимают участие в каталитическом акте (этап 3 на рис. 1). На рис. 9 показан механизм реакции метилирования, предложенный для С5-МТаз (Chen et. al.. 1993). Он включает протонирование N3 положения метилируемого цитозина остатком Glu из мотива ENV, что вызывает активацию С6 положения для нуклеофильной атаки остатка Cys из мотива PCQ и образование ковалентного аддукта фермента с ДНК. В свою очередь, образование ковалентной связи по С6 вызывает активацию атома углерода С5 остатка цитозина для присоединения метильиой группы.

Рис. 9. Механизм реакции метилирования цитозина по положению С5 (Chen et. al., 1993).

Для проверки справедливости этой схемы в случае M.Sssl проводили замены аминокислот, предположительно участвующих в катализе. Первым таким остатком стал инвариантный остаток Cysl41 из мотива IV (рис. 8), предположительно образующий ковалентную связь с цитозином (рис. 9). Он был заменен на Ser. Ранее было показано, что каталитическая активность му1ангного фермента С141S в 100 раз меньше таковой для фермента дикого типа (Rathen et al., 2007). Однако не было изучено, как такая замена влияет на эффективность связывания с ДНК. Вторым был выбран консервативный остаток Glul86 из мотива VI (рис. 8), предположительно протонирующий положение N3 цитозина (рис. 9), и заменен на Ala. Наконец, третьим заменяемым остатком стал консервативный остаток Arg230 из мотива VIII

AdoMct

ь, Adolicy

•СН3

(рис. 8). Мы предположили, что этот остаток участвует в катализе, поскольку для M Hhal методом компьютерной симуляции динамики активного центра была показана возможность соответствующего остатка аргинина протонировать положение N3 метилируемого цитозина через молекулу воды совместно с остатком глутаминовой кислоты из мотива VI. Arg230 был заменен на Ala.

2.2. Конструирование плазмид с мутациями в гене sssIM и выделение мутантных

ферментов.

Конструкции для продукции мутантных ферментов V188A, S300P и S300G были получены с помощью сайт-паправленного мутагенеза плазмиды pCAL/nH, кодирующей M.SssI с кластером из шести гистидинов на N-конце (рис. 10). Общая схема конструирования плазмид, несущих гены мутантных белков, была следующей: из плазмиды pCAL/nH вырезали ген белка M.SssI (или его часть) и выделяли большой фрагмент без гена. Затем с помощью ПЦР копировали ген с внесением в него мутаций, в результате чего получали два фрагмента, которые обрабатывали эндонуклеазами рестрикции и соединяли с большим фрагментом ДНК-лигазой.

Рис. 10. Схематическое изображение этапов получения мутантных плазмид. 1 - плазмида, продуцирующая M.SssI дикого типа, 2-4 - плазмиды, продуцирующие мутантные ферменты S300P, S300G и V188A соответственно. Темно-серым цветом показана последовательность Hist,, светло-серым - ген sssIM.

Конструкции, несущие гены других мутантных белков, были получены в лаборатории А. Киша (Венгрия). Все эти мутантные ферменты были производными M.SssI, содержащей дополнительную последовательность Ser-Hise на С-конце. Ген такого варианта M.SssI дикого типа кодировался плазмидой pBHNS-MSssI.

В качестве штамма-реципиента для плазмид pCAL7/nH, pBHNS-MSssI и мутантных плазмид использовали штамм Е. coli ER1821. Ферменты выделяли с помощью Со2+-содержащей смолы TALON, используя ступенчатый градиент концентрации имидазола.

Выход ферментных препаратов составлял около 0.8 мг белка на 1 л клеточной культуры. Ферменты имели степень чистоты около 90%.

2.3. Подходы к изучению свойств мутантов M.SssI. Определение концентрации мутантов M.SssI. Для большинства мутантных ферментов определяли общую концентрацию белка по методу Брэдфорд. В случае мутантных ферментов V188A и S300G/P методом поляризации флуоресценции определяли концентрацию молекул, способных связываться с ДНК («активных» молекул). Проводили прямое титрование меченного 6-карбокси-флуоресцеином (FAM) дуплекса 5'-FAM-GAGCCAAGCGCACTCTGА/5'-TCAGAGTGCGCTTGGCTC (FAM-GCG/CGC) ферментами в условиях стехиометрического связывания (Сднк»/ч]) и определяли концентрации активных молекул V188A и S300G/P.

Метилирование ДНК. Были определены начальные скорости реакции метилирования ДНК-дуплекса 5' -G AGCCAAGCGCACTCTGA/5 ' -TCAGAGTGCGCTTGGCTC (GCG/CGC) МТазой SssI и мутантными ферментами в стационарных условиях (Сднк 1 мкМ, Смташ 50 нМ) (табл. 2). Как и в случае M.Hhal, использовали меченный тритием кофактор AdoMet (CajoMci 1.3 мкМ) Для трех мутантных ферментов V188A, S300G и S300P измеряли Vb за первые три минуты реакции. Для остальных ферментов, многие из которых имели очень низкие активности, временной интервал для определения начальных скоростей реакции был увеличен до 25 мин, чтобы получить достаточно высокие счета радиоактивности продукта. При этом линейность зависимости выхода продукта от времени сохранялась. На рис. 11 показан пример определения Vo для ряда мутантных ферментов.

Рис. 11. Зависимости уровней метилирования ДНК-дуплекса ССС/СОС М дикого типа и мутантными

ферментами 5145А, <3147Ц 1Ш2А и Т313АЛ5/Н от времени при Сднк 1 мкМ, СаОоМс! 1 з мкМ, СмТа <ы 50 нМ.

Таблица 2. Параметры взаимодействия \l.SssI дикого типа и мутантных ферментов с ДНК.

МТаза Положение заменяемого остатка Кл, нМ а Vo, нМ/мин ' VoM>7VoWT

M.SssI WT 42.4 + 9.2 11.1 ±2.0б 1 2.62 + 0.17 72.1 + 1.9Г 1

C141S Мотив IV 40 + 8.35 0.94 - -

S145A Мотив IV 31.3+5.3 0.74 0.221 + 0.003 0.08

Q147L Мотив IV 532.4 + 97.6 12.6 0.199 + 0.001 0.08

Е186А Мотив VI 10.5 ± 1.6 0.25 0 0

VI88 А Мотив VI 2 03+ 0.46 6 0.18 34.2 +0.9г 0.47

R230A Мотив VIII 51.3 ±8.3 1.21 0 0

R232A Мотив VIII 11.8 ±2.1 0.28 0.059 + 0.019 0.02

К297А TRD 55.9+10.8 1.32 2.03 + 0.09 0.77

N299A TRD 39.7 + 11.4 0.94 2.66 ± 0.02 1.02

S300G TRD 9.6+ 2.16 0.86 87.8 ±5.2Г 1.22

S300P TRD 32.7+ 4.46 2.95 58.8 ± 3.4г 0.82

Т313А TRD 26.8 + 6.4 0.63 2.56 + 0.23 0.98

T313D TRD 420.7 + 113.6 9.92 0 0

Т313Н TRD 1111.4 ± 186.0 26 2 0 0

S317A TRD 132.7 + 20 3.13 1.421 ±0.004 0.54

й - определены методом «торможения» в геле с учетом общих концентраций ферментов. ° -определены методом поляризации флуоресценции с учетом концентраций активных молекул ферментов.

в - определены за 25 мин реакции с учетом общих концентраций ферментов.г - определены за 3 мин реакции с учетом концентраций активных молекул ферментов.

Связывание ДНК. Для изучения стабильности фермент-субстратных комплексов проводили прямое титрование ДНК ферментами в присутствии AdoHcy. Для мутантных ферментов V188A, S300G и S300P использовали метод поляризации флуоресценции, для остальных -метод «торможения» в геле. В обоих случаях в качестве субстрата использовали дуплекс FAM-GCG/CGC (с концентрацией 10 или 15 нМ соответственно); концентрация AdoHcy составляла 0.1 мМ. На рис. 12 показаны изотермы связывания ряда мутантных ферментов с ДНК.

Рис.12. Титрование дуплекса РАМ-ССО/ССС М.5ьч1 дикого типа и мутаитными ферментами 5145А, (21471,, 1Ш2А и Т313А/Р/Н (по данным, полученным с помощью метода «торможения» в геле). Сднк '5 нМ, СА^уОЛ мМ, Смта 1ы 0-600 нМ.

[МТаза], нМ

Определение Ко проводилось методом регрессионного анализа, в качестве параметров которого использовали экспериментальные зависимости степени образования комплекса от общей концентрации фермента. Полученные значения Ко для мутантных ферментов приведены в табл. 2.

2.4. Функциональный анализ мутантных ферментов.

Как уже было сказано, мы выделили ряд аминокислотных остатков которые

могут участвовать в основных этапах реакции метилирования. В данном разделе все заменяемые остатки поделены на три группы согласно предполагаемым функциям. Узнавание последовательности СО в ДНК.

Ьу$797 и А$п299. Результаты связывания и метилирования ДНК мутантными ферментами К297А и №99А показали, что замена этих аминокислот не влияет на активность фермента (табл. 2). Таким образом, аминокислотные остатки в положениях 297 и 299 не важны для узнавания ДНК.

5егЗОО. Мутантный белок БЗООО связывал и метилировал ДНК так же эффективно, как и фермент дикого типа (табл. 2). Введение в М^хГ вместо ЗегЗОО остатка пролина (более «жесткая» замена) привело к росту Ко примерно в 3 раза (табл. 2), что свидетельствует о некотором снижении устойчивости комплекса мутангного фермента БЗООР с ДНК. Величина начальной скорости метилирования при такой замене практически не менялась (табл. 2). Поскольку даже замена БегЗОО на пролин в М.Зяя! не привела к значительному ухудшению связывания и метилирования ДНК, можно предположить, что ЭегЗОО не играет важной роли в связывании с участком узнавания.

БегЗП, При замене 5ег317 на аланин эффективности связывания и метилирования ДНК снизились в 3 и 2 раза соответственно (табл. 2). Мы предполагаем, что 8егЗ 17 участвует в узнавании ДНК. Интересно, что в другой С5-МТазе, М.^оРП, согласно данным компьютерного моделирования, соответствующий остаток серина (5ег245) также может

участвовать в узнавании ДНК (Radlinska et al, 2004). Его замена на аланин приводила к шестикратному снижению активности фермента.

«Выпетливаиие» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.

Serl45. Мутантный фермент S145A показал практически такую же эффективность связывания ДНК, как и фермент дикого типа, но начальная скорость метилирования была снижена в 12 раз (табл. 2). Эти результаты свидетельствовали о важности остатка Serl45 для ферментативной активности. Однако это не было прямым подтверждением того, что этот остаток играет роль именно на стадии «выпетливания». Для изучения возможности выведения основания-мишени из состава двойной спирали был использован ДНК-дуплекс, содержащий в положении цитозина-мишени флуоресцентный аналог аденина, 2-аминопурин. Флуоресценция 2-аминопурина потушена, когда основание находится в составе ДНК, и разгорается при его выведении из двойной спирали (Holz et al, 1998). Был проведен анализ разгорания флуоресценции при взаимодействии мутантного фермента SI45A с ДНК-дуплексом, содержащим остаток 2-аминопурина (здесь и далее анализ флуоресценции проводился H.A. Черепановой). Было показано, что флуоресценция в случае мутантного фермента практически не разгоралась (интенсивность флуоресценции была в 7 раз ниже, чем для фермента дикого типа). Таким образом, полученные данные подтвердили участие Serl45 в «выпетливании» цитозина-мишени. Можно предположить, что этот остаток стабилизирует «выпетленный» цитозин. По данным РСА структур M.Hhal и M.HaelII, соответствующий остаток серина в этих ферментах образует водородную связь с фосфатной группой, расположенной с 5'-стороны от метилируемого цитозина (Klimasauskas et al., 1994; Reiniscli etal., 1995).

Glnl47. При замене этого остатка на лейцин связывание и метилирование ДНК ухудшились примерно в 12 раз (табл. 2). Такое резкое снижение активности фермента свидетельствует о том, что остаток Gin 147 необходим для функционирования M.SssI. Кроме того, в случае мутантного фермента Q147L практически не наблюдалось разгорания флуоресценции 2-аминопурина (интенсивность флуоресценции была в 20 раз ниже, чем в случае M.SssI дикого типа), что свидетельствует о необходимости Gin 147 для «выпетливания» цитозина. Сравнение данных РСА комплекса M.Hhal-flHK-AdoHcy (Klimasauskas et al. 1994) с моделью комплекса M.SssI^HK-AdoHcy (рис. 7) показало, что Glnl47 в паре с Ser300 в M.SssI, подобно паре Ser87 с Gln237 в M.Hhal занимают пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина и стабилизируют неспаренный остаток гуанина.

Val 188. Замена Val 188 на аланин привела к некоторому улучшению связывания мутантного фермента V188A с ДНК (К^ снижается примерно в 5 раз, табл. 2). Начальная скорость

метилирования ДНК при введении мутации снизилась примерно в 2 раза (табл. 2). Исходя из полученных данных, можно было бы предположить, что остаток Val 188 не является важным для стабилизации «выпетленного» цитозина. Однако, учитывая, что остаток Val 188 является высококонсервативным, а также тот факт, что его замена на аланин в случае M.Hhal приводит к полной потере ферментативной активности, мы не можем исключить его взаимодействия с метилируемым цитозином. Val 188, скорее всего, образует контакт с «выпетленным» цитозином. По всей вероятности, в случае мутантиого белка V188A этот контакт может быть образован с А1а188, поскольку у M.SssI в соседней позиции (189) присутствует остаток глицина (рис. 8), дающий ферменту возможность «подстроиться» под мутацию и не потерять активность.

Arg232. При замене этого остатка на Ala наблюдался рост сродства фермента к ДНК в 3.5 раза, а каталитическая активность снизилась в 45 раз (табл. 2). Кроме того, было показано, что разгорание флуоресценции 2-аминопурина было совсем незначительным (в 11 раз ниже, чем для фермента дикого типа). Эти результаты свидетельствуют об участии- Arg232 в «выпетливании» цитозина-мишенц и/или в поддержании его конформацин, необходимой для катализа. Для M.Hhal было продемонстрировано участие соответствующего остатка аргинина в «выпетливании» цитозина-мишени и стабилизации его внеспирального положения (Shieh et ah, 2006).

Thr3I3. В M.Hhal, с помощью замены соответствующего остатка треонина на аминокислоты с различным размером боковых цепей и с использованием анализа флуоресценции 2-аминопурина было показано, что этот остаток участвует в конформационных перестройках во время «выпетливания» цитозина и поддерживает правильную конформацию остова ДНК и метилируемого цитозина (Villains et al., 2000). В нашем случае, замена Thr313 на A.sp и His привела к значительному снижению устойчивости комплексов фермента с ДНК (в 10 и 25 раз соответственно) и к потере ферментативной активности (табл. 2). Также было показано снижение интенсивности флуоресценции 2-аминопурина в случае мутанта T313D в 5 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Для мутантиого белка Т313А, напротив, не наблюдалось снижения эффективности связывания или метилирования ДНК (табл. 2), и интенсивность флуоресценции 2-аминопурина была снижена всего в два раза. Эти данные согласуются с полученными для M.Hhal, поэтому можно предположить, что Thr313 в M.SssI выполняет такую же функцию, т.е. поддерживает нужную конформацию углеводофосфатного остова и метилируемого цитозина во время его «выпетливания» из ДНК.

Катализ переноса метильнон группы на ДНК.

Cxsl4l. Полученные для мутантного фермента C141S данные (табл. 2) свидетельствуют о том, что связывание им ДНК не меняется по сравнению с ферментом дикого типа. При этом каталитическая активность C141S в 100 раз меньше таковой для M.SssI дикого типа (Rathert et al., 2007). Эти данные свидетельствуют о том, что Cysl41 необходим именно для катализа и не существенен для прочного связывания M.SssI с ДНК.

Glul86. Мутантный фермент Е186А образовывал в 4 раза более прочные комплексы с ДНК, чем фермент дикого типа, но при этом терял каталитическую активность (табл. 2). Это подтвердило необходимость Glul86 для катализа. Однако мутантный белок El86А не утратил способности образовывать ковалентный аддукт с ДНК (здесь и далее показано H.A. Черепановой). Это позволило сделать предположение, что в протонировании положения N3 цитозина, необходимом для образования ковалентного аддукта, может участвовать и другой аминокислотный остаток M.SssI. Интересно, что в случае M.Hhal замена соответствующего остатка глутаминовой кислоты на аланин приводила к падению каталитической активности в 500 раз и к отсутствию ковалентного аддукта с ДНК (Shieh et al, 2007). Arg230. Замена Arg230 на Ala почти не оказала влияния на связывание фермента с ДНК, но каталитическая активность мутантного фермента R230A была полностью потеряна (табл. 2). Кроме того, не наблюдалось образования ковалентного аддукта R230A с ДНК. Эти результаты свидетельствуют об исключительной важности Arg230 для образования ковалентной связи фермента с ДНК и катализа. Кроме того, если предположить, что этот остаток участвует в протонировании положения N3 цитозина, становится понятным, почему наблюдалось образование ковалентного аддукта мутантного фермента EI86A с ДНК. Мы предполагаем, что Arg230 непосредственно участвует в катализе.

Таким образом, с помощью мутационного анализа M.SssI удалось выявить остатки, участвующие в узнавании последовательности CG (Ser317), «выпетливании» метилируемого цитозина (Serl45, Glnl47, Arg232 и Thr313) и катализе (Cysl41, Glul86 и Arg230). Впервые на примере M.SssI была продемонстрирована важность консервативных остатков Serl45 (мотив VI) и Arg230 (мотив VIII) для функционирования С5-МТаз. Важным моментом явилось то, что была показана значимость неконсервативного остатка Glnl47, роль которого была предсказана по данным компьютерного моделирования.

выводы

1. Введение (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-^-<Ю-аддуктов в участок узнавания M.Hhal приводит к увеличению констант диссоциации комплексов M.Hhal-ДНК-AdoHcy на 1-2 порядка и к снижению эффективности метилирования ДНК M.Hhal. При расположении В[а]Р-аддукта с 5'-стороны от цитозина-мишени в случае полуметилированных ДНК метилирование практически блокируется. Высказаны предположения о том, что локализация объемного остатка В[а]Р в малой бороздке ДНК препятствует контактам каталитической петли фермента с ДНК, модифицированной В[а]Р.

2. Получено 15 мутантных форм M.SssI, содержащих единичные замены ряда аминокислот в функционально значимых участках фермента.

3. Показано, что замены остатков, предположительно участвующих в узнавании ДНК (Lys297, Asn299, Ser300 и Ser317), практически не влияют на активность M.SssI. Замены остатков, которые могут участвовать в стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина (Serl45, Glnl47, Vall88, Arg232 и Thr313) и активации метилируемого цитозина в процессе катализа (Glul86 и Arg230) приводят, за исключением замены Val 188, к значительному снижению эффективности метилирования ДНК, а в случае мутантных ферментов Q147L и ТЗ13D/H - еще и к заметному ухудшению связывания субстрата. Эти данные указывают на участие остатков Serl45, Glnl47, Arg232 и Thr313 в стабилизации промежуточного комплекса и на участие остатков Glu 186 и Arg230 в каталитическом акте.

4. На примере M.SssI показана важность консервативных остатков серина из мотива IV (Serl45 в M.SssI) и аргинина из мотива VIII (Arg230 в M.SssI) для функционирования С5-МТаз. Выявлен неконсервативный остаток Glnl47, играющий важную роль в процессе метилирования, осуществляемого M.SssI.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. О.М. Subach, V.B. Baskunov, M.V. Darii. D.V. Maltseva, D.A. Alexandrov, O.V. Kirsanova, A. Kolbanovskiy, M. Kolbanovskiy, F. Johnson, R. Bonala, N.E. Geacintov, E.S. Gromova (2006) Impact of benzo[a]pyrene-2'-deoxyguanosine lesions on methylation of DNA by SssI and Hhal DNA methyltransferases. Biochemistry, 45, 6142-6159.

2. M.B. Дарий. O.B. Кирсанова, ВЛ. Друца, С.Н. Кочетков, Е.С. Громова (2007) Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы SssI. Молекуляр. биология, 41, 121-129.

3. Дарий М.В.. Субач О.М. (2004) Влияние модификации ДНК бензо[а]пиреном на ее взаимодействие с ДНК-метилтрансферазой Hhal. Материалы международной конференции Ломоносов-2004, Москва; т. 1, стр. 90.

4. Darii M.V.. Subach О.М. (2005) Interactions between benzo[a]pyrene-modified DNA molecules and Hhal DNA methyltransferase. Материалы международной конференции Ломоносов-2005, Москва; т. 1, стр. 199.

5. Е. Gromova, О. Subach, V. Baskunov, М. Darii. D. Maltseva, A. Jeltsch, A. Kolbanovskiy, M. Kolbanovskiy and N. Geacintov (2006) Impact of benzo[a]pyrene diol epoxide-DNA adducts on DNA methylation. FEBS Journal, v.273, Supplement 1, p.187-188.

6. M. Darii. O. Kirsanova, V. Dratsa, A. Kiss and E. Gromova (2007) Functional analysis of mutants of DNA methyltransferase SssI. International conference Biocatalysis-2007: fundamentals and applications, St. Petersburg, Russia; p.85.

7. E.S. Gromova, M.V. Darii. N.A. Cherepanova, O.M. Subach, O.V. Kirsanova, T. Rask6, K. Slaska-Kiss and A. Kiss. (2007) Study of the catalytic mechanism and DNA recognition of the CpG methyltransferase M.SssI by site-directed mutagenesis and with modified substrates. FEBS-CNRS Workshop. DNA and RNA Modification Enzymes: Comparative Structure, Mechanism, Function and Evolution. Aussois, France; p. 16.

8. Дарий M.B.. Черепанова H.A., Субач O.M., Кирсанова О.В., Раско Т., Сласка-Киш К., Киш А., Громова Е.С. (2008) Мутационный анализ и механизм-зависимое ингибирование CpG-узнающей ДНК метилтрансферазы M.SssI как инструмент изучения ДНК-белковых взаимодействий. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск; стр. 75.

Заказ № 193/10/08 Подписано в печать 23 10 2008 Тираж 100 экз. Уел пл 1,5

/ Г ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 ' www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. С5-ДНК-метилтрансферазы Hhal и SssI. Мутационный анализ прокариотических и эукариотических С5-ДНК-метилтрансфераз (Обзор литературы).

1.1. ДНК-метилтрансфераза Hhal.

1.1.1 Общие сведения о структуре и механизме действия M.Hhal.

1.1.2. Структурный и мутационный анализ M.Hhal.

1.2. ДНК-метилтрансфераза SssI.

1.2.1. Общие сведения о ферменте.

1.2.2. Изучение механизма взаимодействия M.SssI с ДНК.

1.3. Мутационный анализ прокариотических и эукариотических С5-ДНК-метилтрансфераз.

Глава 2. Функциональный анализ ДНК-метилтрансфераз SssI и Hhal с помощью сайт-направленного мутагенеза и модифицированных субстратов (Обсуждение результатов).

2.1. Взаимодействие M.Hhal с ДНК, содержащей (+)- и (-)-mpaHC-aHmu-B[a]P-N2-dG-аддукты в участке узнавания.

2.1.1. Дизайн модифицированных субстратов.

2.1.2. Связывание M.Hhal В[а]Р-модифицированных ДНК-дуплексов.

2.1.3. Метилирование M.Hhal В[я]Р-модифицированных ДНК-дуплексов.

2.1.4. Выявление контактов M.Hhal с ДНК, нарушающихся при введении (+)и (-)-mpaHc-aHmu-B[a]P-N2-dG аддуктов.

2.2. Мутационный анализ ДНК-метилтрансферазы SssI.

2.2.1. Выбор аминокислотных остатков - объектов мутационного анализа.

2.2.2. Конструирование плазмид с мутациями в гене sssIM.

2.2.3. Выделение и очистка M.SssI и мутантных ферментов.

2.2.4. Подходы к изучению свойств мутантов M.SssI.

2.2.5. Функциональный анализ мутантов M.SssI.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Реактивы и материалы.

3.2. Приборы и методы.

3.3. Общие методики.

3.3.1. Конструирование плазмид для продукции мутантов M.SssI.

3.3.2. Выделение M.SssI и мутантных ферментов.

3.3.3. Ферментативное 5'-фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов

3.3.4. Выделение олигонуклеотидов из геля.

3.3.5. Определение концентраций активных молекул М.8яя! и мутантных ферментов с помощью метода поляризации флуоресценции.

3.3.6. Определение КА комплексов М.НЬаГ или М.8зз1 (и мутантных ферментов) с ДНК и АёоНсу с помощью метода поляризации флуоресценции.

3.3.7. Определение Кй комплексов М.НЬа! с ДНК и АёоНсу с помощью метода «торможения» в геле.

3.3.8. Определение Кй комплексов М^яГ или мутантных ферментов с ДНК и Ас1оНсу методом прямого титрования фиксированного количества ДНК различными аликвотами фермента с помощью «торможения» в геле.

3.3.9. Определение начальных скоростей и каталитических констант реакции метилирования В[а|Р-содержащих ДНК-дуплексов М.НЬаТ.

3.3.10. Определение начальных скоростей метилирования ДНК М.88з1 и мутантными ферментами.

Выводы.

ДНК-метилтрансферазы (МТазы) присутствуют в различных организмах, от бактерий до растений и животных. Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метальную группу на атом углерода С5 остатка цитозина, образуя 5-метилцитозин. Донором метальной группы выступает кофактор S-аденозпл-^-метионин (AdoMet), который в ходе реакции превращается в S-аденозил-ь-гомоцистеин (AdoHcy). В прокариотах МТазы функционируют, главным образом, как компоненты систем рестрикции-модификации, осуществляющих защиту клетки от проникновения чужеродной ДНК. В высших организмах метилирование ДИК играет ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как транскрипция и импринтинг генов, эмбриональное развитие, репарация ДНК, конденсация хроматина. Отклонения от нормального уровня метилирования в клетках млекопитающих (как гипо-, так и гиперметилирование) связаны с возникновением рака. Показано, что первичные структуры МТаз млекопитающих в С-коицевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5-МТаз. В связи с этим, представляется важным изучение прокариотических С5-МТаз, которые могут служить моделями для изучения механизмов метилирования у млекопитающих.

Бензо[а]пирен (В[а]Р) является одним из полициклических ароматических углеводородов-загрязнителей, широко распространенных в окружающей среде. В организмах, подверженных воздействию В[а]Р, отмечено образование множественных мутаций, что в конечном итоге может приводить к возникновению рака. Сам В[а]Р не является биологически активным, однако, при попадании в клетку он метаболизируется с образованием весьма реакционноспособных диолэпоксидов, которые могут ковалентно присоединяться к ДНК. При этом преимущественно модифицируются остатки гуанина с образованием стереоизомерных {+/-)-цис- и (+/-)-mpaHC-anmu-B[a]P-N2-dG аддуктов. Известно, что mpanc-anmii-]i[a)V-N2-dG аддукты плохо поддаются репарации. Вследствие этого, они могут вызывать нарушение функционирования различных ферментов, взаимодействующих с ДНК, в том числе МТаз. Однако на сегодняшний день молекулярный механизм действия В [¿/IP-повреждении па С5-МТазы не изучен.

Одним из объектов настоящей работы стала прокариотическая МТаза НИа1. Она узнает в ДИК последовательность ССОС и метилирует внутренний остаток цитозина участка узнавания (подчеркнут). М.НЬа! является одной из наиболее изученных С5-МТаз: для нее разрешена пространственная структура и достаточно подробно изучен механизм действия. Это явилось предпосылкой выбора М.НИа1 в качестве модельного фермента для изучения влияния В[а]Р-повреждений ДНК на метилирование.

Другим объектом работы стала М.Яээ! - уникальная прокариотическая МТаза, которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК последовательность Св. Благодаря этой особенности, М^эя! может служить прекрасной моделью для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами. Этот фермент был обнаружен еще в 1985 году, однако на сегодняшний день он практически не изучен. В частности, нет данных о пространственной структуре и практически отсутствуют данные о механизме действия Известна первичная структура фермента, а также методом футпринтинга определены несколько функциональных групп ДНК. образующих контакты с ферментом. В нашей лаборатории методом компьютерного моделирования по гомологии была построена модель комплекса М.8881-ДНК-Ас1оНсу. Однако до сих пор функционального анализа аминокислотных остатков М.8зз1 не проводилось.

Целью работы явилось изучение влияния (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-М2-(Ю аддуктов на функционирование ДНК-метилтрансферазы НЬа1, а также определение функционально значимых аминокислотных остатков М^бЬ

В работе решались следующие задачи: 1) определение влияния стереоизомерии В|//]Р-уУ2-с1Ст аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии реакции метилирования ДНК МТазой НЬа1; 2) выбор аминокислот, предположительно существенных для функционирования М.8881, и сайт-направленный мутагенез гена ^¿■/Л/ с целью получения мутантных форм М.8зз1; 3) изучение влияния вводимых аминокислотных замен на связывание и метилирование ДНК МТазой 8зз1 и определение участия выбранных аминокислот в основных стадиях реакции метилирования.

выводы

1. Показано, что введение (+)- и (-)-трш/с-аш/ш-В[«]Р-Л/2-с10-аддуктов в участок узнавания M.Hhal приводит к увеличению констант диссоциации комплексов M.HhaI-/]HK-AdoHcy на 1-2 порядка и к снижению эффективности метилирования ДНК M.Hhal. При расположении В[й]Р-аддукта с 5'-стороны от цнтозина-мишени в случае полуметилированных ДНК метилирование практически блокируется. Высказаны предположения о том, что локализация объемного остатка В[а]Р в малой бороздке ДНК препятствует контактам каталитической петли фермента с ДНК, модифицированной В[я]Р.

2. Получено 15 мутантных форм M.SssI, содержащих единичные замены ряда аминокислот в функционально значимых участках фермента.

3. Установлено, что замены остатков, предположительно участвующих в узнавании ДНК (Lys297, Asn299, Ser300 и Ser317), практически не влияют на активность M.SssI. Замены остатков, которые могут участвовать в стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина (Ser 145, Gin 147, Vail 88, Arg232 и Thr313) и активации метилируемого цитозина в процессе катализа (Glul86 и Arg230) приводят, за исключением замены Vail88, к значительному снижению эффективности метилирования ДНК, а в случае мутантных ферментов Q147L и T313D/H - еще и к заметному ухудшению связывания субстрата. Эти данные указывают на участие остатков Ser 145, Gin 147, Arg232 и Thr313 в стабилизации промежуточного комплекса и на участие остатков Glul86 и Arg230 в каталитическом акте.

4. На примере M.SssI показана важность консервативных остатков серина из мотива IV (Serl45 в M.SssI) и аргинина из мотива VIH (Arg230 в M.SssI) для функционирования С5-МТаз. Выявлен неконсервативный остаток Glnl47, играющий важную роль в процессе метилирования ДНК, осуществляемого M.SssI.

1. Roberts, R.J., Myers, Р.А., Morrison, A., Murray, K. (1976) A specific endonuclease from Haemophilus hacmolyticus. J Mol Biol, 103, 199-208.

2. Sankpal, U.T., Rao, D.N. (2002) Structure, function, and mechanism of Hhal DNA methyltransferases. Crit Rev Biochem Mol Biol, 37, 167-197.

3. Wu, J.C., Santi, D.V. (1987) Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase. J Biol Chem, 262, 4778-4786.

4. Lindstrom, W.M., Jr., Flynn, J., Reich, N.O. (2000) Reconciling structure and function in Hhal DNA cytosine-C-5 methyltransferase. J Biol Chem, 275, 4912-4919.

5. Renbaum, P., Razin, A. (1992) Mode of action of the Spiroplasma CpG methylase M.SssI. FEBS Lett, 313, 243-247.

6. Svedrir/ic, Z.M., Reich, N.O. (2004) The mechanism of target base attack in DNA cytosine carbon 5 methylation. Biochemistry, 43, 11460-11473.

7. Caserta, M., Zacharias, W., Nwankwo, D., Wilson, G.G., Wells, R.D. (1987) Cloning, sequencing, in vivo promoter mapping, and expression in Escherichia coli of the gene for the Hhal methyltransferase. J Biol Chem, 262, 4770-4777.

8. Klimasauskas, S., Nelson, J.L., Roberts. R.J. (1991) The sequence specificity domain of cytosine-C5 methylases. Nucleic Acids Res, 19, 6183-6190.

9. Goll, M.G., Bestor, Т.Н. (2005) Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem, 74,481-514.

10. Lauster, R., Trautner, T.A., Noyer-Weidner, M. (1989) Cytosine-specific type II DNA methyltransferases. A conserved enzyme core with variable target-recognizing domains. JMolBiol, 206,305-312.

11. Posfai, J., Bhagwat, A.S., Posfai, G., Roberts, R.J. (1989) Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res, 17, 2421-2435.

12. Kumar, S., Cheng, X., Klimasauskas, S., Mi, S., Posfai, J., Roberts, R.J., Wilson, G.G. (1994) The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res, 22, 1-10.

13. Chen, L., MacMillan, A.M., Vcrdine, G.L. (1993) Mutational separation of DNA binding from catalysis in a DNA cytosine methyltransferase. J Am Chem Soc, 115, 5318-5319.

14. Klimasauskas, S., Kumar, S., Roberts, R.J., Cheng, X. (1994) Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell, 76, 357-369.

15. Youngblood, B., Shieh, F.K., Buller, F., Bullock, T., Reich, N.O. (2007) S-adenosyl-L-methionine-dependent methyl transfer: observable precatalytic intermediates during DNA cytosine methylation. Biochemistry, 46, 8766-8775.

16. Cheng, X. (1995) Structure and function of DNA methyltransferases. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 293-318.

17. Vilkaitis, G., Merkiene, E., Serva, S., Weinhold, E., Klimasauskas, S. (2001) The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hhai methyltransferase. J Biol Chem, 276, 20924-20934.

18. Sharma, V., Youngblood, B., Reich, N. (2005) Residues distal from the active site that alter enzyme function in M.Hhal DNA cytosine methyltransferase. J Biomol Struct Dyn, 22, 533-543.

19. Kumar, S., Cheng, X., Pflugrath, J.W., Roberts, R.J. (1992) Purification, crystallization, and preliminary X-ray diffraction analysis of an M.Hhal-AdoMet complex. Biochemistry, 31, 8648-8653.

20. Cheng, X., Kumar, S., Posfai, J., Pflugrath, J.W., Roberts, R.T. (1993) Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. Cell. 74, 299-307.

21. O'Gara, M., Klimasauskas, S., Roberts, R.J., Cheng, X. (1996) Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. J Mol Biol, 261, 634-645.

22. Kumar, S., Horton, J.R., Jones, G.D., Walker, R.T., Roberts, R.J., Cheng, X. (1997) DNA containing 4'-thio-2'-deoxycytidine inhibits methylation by Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res, 25, 2773-2783.

23. O'Gara, M., Roberts, R.J., Cheng, X. (1996) A structural basis for the preferential binding of hemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. J Mol Biol, 263, 597-606.

24. O'Gara. M., Horton, J.R., Roberts, R.J., Cheng, X. (1998) Structures of Hhal methyltransferase complexed with substrates containing mismatches at the target base. Nat Struct Biol, 5, 872-877.

25. Klimasauskas, S., Roberts, R.J. (1995) M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base. Nucleic Acids Res, 23, 1388-1395.

26. Holz, B., Klimasauskas, S., Serva, S., Weinhold, E. (1998) 2-Aminopurine as a fluorescent probe for DNA base flipping by methyltransferases. Nucleic Acids Res, 26, 1076-1083.

27. Xu, D., Evans, K.O., Nordlund, T.M. (1994) Melting and premelting transitions of an oligomer measured by DNA base fluorescence and absorption. Biochemistry, 33, 95929599.

28. Allan, B.W., Reich, N.O. (1996) Targeted base stacking disruption by the EcoRI DNA methyltransferase. Biochemistry, 35, 14757-14762.

29. Vilkaitis, G., Dong, A., Weinhold, E., Cheng, X., Klimasauskas, S. (2000) Functional roles of the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase. J Biol Chem, 275, 38722-38730.

30. Youngblood, B., Buller, F., Reich, N.O. (2006) Determinants of sequence-specific DNA methylation: target recognition and catalysis are coupled in M.Hhal. Biochemistry, 45, 15563-15572.

31. Estabrook, R.A., Reich, N. (2006) Observing an induced-fit mechanism during sequence-specific DNA methylation. J Biol Chem, 281, 37205-37214.

32. Lau, E.Y., Bruice, T.C. (1999) Active site dynamics of the Hhal methyltransferase: insights from computer simulation. J Mol Biol, 293, 9-18.

33. Wilke, K., Rauhut, E., Noyer-Weidner, M., Lauster, R., Pawlek, B., Behrens, B., Trautner, T.A. (1988) Sequential order of target-recognizing domains in multispecific DNA-methyltransferases. EMBOJ, 7, 2601-2609.

34. Trautner, T.A., Balganesh, T.S., Pawlek, B. (1988) Chimeric multispecific DNA methyltransferases with novel combinations of target recognition. Nucleic Acids Res, 16, 6649-6658.

35. Lee, Y.F., Tawfik, D.S., Griffiths, A.D. (2002) Investigating the target recognition of DNA cytosine-5 methyltransferase Hhal by library selection using in vitro compartmentalisation. Nucleic Acids Res, 30, 4937-4944.

36. O'Gara, M., Zhang, X., Roberts, R.J., Cheng, X. (1999) Structure of a binary complex of Hhal methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine formed in the presence of a short non-specific DNA oligonucleotide. J Mol Biol, 287, 201-209.

37. Sankpal, U.T., Rao, D.N. (2002) Mutational analysis of conserved residues in Hhal DNA methyltransferase. Nucleic Acids Res, 30, 2628-2638.

38. Estabrook, R.A., Lipson, R., Hopkins, B., Reich, N. (2004) The coupling of tight DNA binding and base flipping: identification of a conserved structural motif in base flipping enzymes. J Biol Chem, 279, 31419-31428.

39. Mi, S., Roberts, R.J. (1993) The DNA binding affinity of Hhal methylase is increased by a single amino acid substitution in the catalytic center. Nucleic Acids Res, 21, 2459-2464.

40. Shieh, F.K., Reich, N.O. (2007) AdoMet-dependent methyl-transfer: Glull9 is essential for DNA C5-cytosine methyltransferase M.Hhal. J Mol Biol, 373, 1157-1168.

41. Shieh, F.K., Youngblood, B., Reich, N.O. (2006) The role of Argl65 towards base flipping, base stabilization and catalysis in M.Hhal. J Mol Biol, 362, 516-527.

42. Youngblood, B., Shieh, F.K., De Los Rios, S., Perona, J.J., Reich, N.O. (2006) Engineered extrahelical base destabilization enhances sequence discrimination of DNA methyltransferase M.Hhal. J Mol Biol, 362, 334-346.

43. Mi, S., Alonso, D., Roberts, RJ. (1995) Functional analysis of Gln-237 mutants of Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res, 23, 620-627.

44. Daujotyte, D., Serva, S., Vilkaitis, G., Merkiene, E., Venclovas, C., Klimasauskas, S. (2004) Hhal DNA methyltransferase uses the protruding Gln237 for active flipping of its target cytosine. Structure, 12, 1047-1055.

45. Nur, I., Szyf, M., Razin, A., Glaser, G., Rottem, S., Razin, S. (1985) Procaryotic and eucaryotic traits of DNA methylation in spiroplasmas (mycoplasmas). J Bacterial, 164, 19-24.

46. Clark, S.J., Harrison, J., Paul, C.L., Frommer, M. (1994) High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res, 22, 2990-2997.

47. Xu, G.L., Bestor, T.H. (1997) Cytosine methylation targetted to pre-determined sequences. Nat Genet, 17, 376-378.

48. Galm, O., Rountree, M.R., Bachman, K.E., Jair, K.W., Baylin, S.B., Herman, J.G. (2002) Enzymatic regional methylation assay: a novel method to quantify regional CpG methylation density. Genome Res, 12, 153-157.

49. Szyf, M., Gruenbaum, Y., Urieli-Shoval, S., Razin, A. (1982) Studies on the biological role of DNA methylation: V. The pattern of E.coli DNA methylation. Nucleic Acids Res, 10, 7247-7259.

50. Koudan, E.V., Bujnicki, .T.M., Gromova, E.S. (2004) Homology modeling of the CG-specific DNA methyltransferase SssI and its complexes with DNA and AdoHcy. J Biomol Struct Dyn, 22, 339-345.

51. Pradhan, S., Roberts, R.J. (2000) Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain. EMBO./, 19, 2103-2114.

52. Matsuo, K., Silke, J., Gramatikoff, K., Schaffner, W. (1994) The CpG-specific methylase SssI has topoisomerase activity in the presence of Mg2+. Nucleic Acids Res, 22, 53545359.

53. Bhattacharya, S.K., Dubey, A.K. (2002) The N-terminus of m5C-DNA methyltransferase Mspl is involved in its topoisomerase activity. Eur JBiochem, 269, 2491-2497.

54. Renbaum, P., Razin, A. (1995) Interaction of M.SssI and M.Hhal with single-base mismatched oligodeoxynucleotide duplexes. Gene, 157, 177-179.

55. Renbaum, P., Razin, A. (1995) Footprint analysis of M.SssI and M.Hhal methyltransferases reveals extensive interactions with the substrate DNA backbone. J Mol Biol, 248, 19-26.

56. Daujotyte, D., Liutkeviciute. Z., Tamulaitis, G., Klimasauskas, S. (2008) Chemical mapping of cytosines enzymatically flipped out of the DNA helix. Nucleic Acids Res, 36, e57.

57. Marriott, G., Ottl, J., Heidecker, M., Gabriel, D. (1998) Light-directed activation of protein activity from caged protein conjugates. Methods Enzymol, 291, 95-116.

58. Rathert, P., Rasko, T., Roth, M., Slaska-Kiss, K., Pingoud, A., Kiss, A., Jeltsch, A. (2007) Reversible inactivation of the CG specific SssI DNA (cytosine-C5)-methyltransferase with a photocleavable protecting group. Chembiochem, 8, 202-207.

59. Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. (2004) Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cell Mol Life Sci, 61, 2571-2587.

60. Gowher, H., Jeltsch, A. (2002) Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases. J Biol Chem, 277, 20409-20414.

61. Mi, S., Roberts, R.J. (1992) How M.MspI and M.Hpall decide which base to methylate. Nucleic Acids Res, 20, 4811-4816.

62. Cohen, H.M., Tawfik, D.S., Griffiths, A.D. (2004) Altering the sequence specificity of Haelll methyltransferase by directed evolution using in vitro compartmentalization. Protein Eng Des Sei, 17, 3-11.

63. Reinisch, K.M., Chen, L., Verdine, G.L., Lipscomb, W.N. (1995) The crystal structure of Haelll methyltransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell, 82, 143-153.

64. Kiss, A., Posfai, G., Zsurka, G., Rasko, T., Venetianer, P. (2001) Role of DNA minor groove interactions in substrate recognition by the M.SinI and M.EcoRII DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res, 29, 3188-3194.

65. Seeman, N.C., Rosenberg, J.M., Rich, A. (1976) Sequence-specific recognition of double helical nucleic acids by proteins. Proc Natl Acad Sei USA, 73, 804-808.

66. Timar, E., Groma, G., Kiss, A., Venetianer, P. (2004) Changing the recognition specificity of a DNA-methyltransferase by in vitro evolution. Nucleic Acids Res, 32, 3898-3903.

67. Gowher, H., Loutchanwoot, P., Vorobjeva, O., Handa, V., Jurkowska, R.Z. Jurkowski, T.P., Jeltsch, A. (2006) Mutational analysis of the catalytic domain of the murine Dnmt3a DNA-(cytosine C5)-methyltransferase. J Mol Biol, 357, 928-941.

68. Handa, V., Jeltsch, A. (2005) Profound flanking sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyltransferases shape the human epigenome. J Mol Biol, 348, 1103-1112.

69. Wyszynski, M.W., Gabbara, S., Bhagwat, A.S. (1992) Substitutions of a cysteine conserved among DNA cytosine methylases result in a variety of phenotypes. Nucleic Acids Res, 20,319-326.

70. Kossykh, V.G., Schlagman, S.L., Hartman, S. (1995) Function of Pro-185 in the ProCys of conserved motif IV in the EcoRII cytosine-C5.-DNA methyltransferase. FEBS Lett, 370, 75-77.

71. Pinarbasi, E., Elliott, J., Hornby, D.P. (1996) Activation of a yeast pseudo DNA methyltransferase by deletion of a single amino acid. J Mol Biol, 257, 804-813.

72. Hsieh. C.L. (1999) In vivo activity of murine de novo methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b. Mol Cell Biol, 19. 8211-8218.

73. Reither, S., Li, F., Gowher, H., Jeltsch, A. (2003) Catalytic mechanism of DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases revisited: covalent intermediate formation is not essential for methyl group transfer by the murine Dnmt3a enzyme. J Mol Biol, 329, 675684.

74. Cheng, X., Blumenthal, R.M. (2008) Mammalian DNA methyltransferases: a structural perspective. Structure. 16, 341-350.

75. Sims, P., Grover, P.L. (1974) Epoxides in polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism and carcinogenesis. Adv Cancer Res, 20. 165-274.

76. Weinstein, I.B., Jeffrey, A.M., .Tennette, K.W., Blobstein, S.H., Harvey, R.G., Harris, C., Autrup, H., Kasai, H., Nakanishi, K. (1976) Benzo(a)pyrene diol epoxides as intermediates in nucleic acid binding in vitro and in vivo. Science, 193. 592-595.

77. Koreeda, M„ Moore, P.D., Wislocki, P.G., Levin, W., Yagi, H., Jerina, D.M. (1978) Binding of benzoa.pyrene 7,8-diol-9,10-epoxides to DNA, RNA, and protein of mouse skin occurs with high stereoselectivity. Science, 199, 778-781.

78. Albert, R.E., Bums, F.J. (1977), in Origin of Human Cancer (Hiatt, H.H., Watson, I.D., and Winston, J.A., Eds.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 289-292.

79. Gu, J., Horikawa, Y., Chen, M„ Dinney, C.P., Wu, X. (2008) Benzo(a)pyrene diol epoxide-induced chromosome 9p21 aberrations are associated with increased risk of bladder cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 17, 2445-2450.

80. Geacintov, N.E., Cosman, M., Hingerty, B.E., Amin, S., Broyde, S., Patel, D.J. (1997) NMR solution structures of stereoisometric covalent polycyclic aromatic carcinogen-DNA adduct: principles, patterns, and diversity. Chem Res Toxicol, 10, 111-146.

81. Meehan, T., Straub, K. (1979) Double-stranded DNA stcroselectively binds benzo(a)pyrene diol epoxides. Nature, 277, 410-412.

82. Cheng, S.C., Hilton, B.D., Roman, J.M., Dipple, A. (1989) DNA adducts from carcinogenic and noncarcinogenic enantiomers of benzoa.pyrene dihydrodiol epoxide. Chem Res Toxicol, 2, 334-340.

83. Yan, S., Wu, M., Patel, D.J., Geacintov, N.E., Broyde, S. (2003) Simulating structural and thermodynamic properties of carcinogen-damaged DNA. Biophys J, 84, 2137-2148.

84. Hess, M.T., Gunz, D., Luneva, N., Geacintov, N.E., Naegeli, H. (1997) Base pair conformation-dependent excision of benzoa.pyrene diol epoxide-guanine adducts by human nucleotide excision repair enzymes. Mol Cell Biol, 17, 7069-7076.

85. Denissenko, M.F., Chen, J.X., Tang, M.S., Pfeifer, G.P. (1997) Cytosine methylation determines hot spots of DNA damage in the human P53 gene. Proc Natl Acad Sei USA, 94, 3893-3898.

86. Connoly, B.A., Liu, H.H., Parry, D., Engler, L.E., Kurpiewski, M.R., Jen-Jacobson, L. (2001), Methods in Molecular Biology, in DNA-Protein Interactions (Moss, T., Eds.), 2nd edn. Humana Press Inc, Totowa, New Jersey.

87. Lakowicz, J.R. (1999) Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Publishers, New York.

88. Rasko, T., Finta, C., Kiss, A. (2000) DNA bending induced by DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res, 28, 3083-3091.

89. Tsao, H., Mao, B., Zhuang, P., Xu, R., Amin, S., Geacintov, N.E. (1998) Sequence dependence and characteristics of bends induced by site-specific polynuclear aromatic carcinogen-deoxyguanosine lesions in oligonucleotides. Biochemistry, 37, 4993-5000.

90. Tian, L., Sayer, J.M., Kroth, H., Kalena, G., Jerina, D.M., Shuman, S. (2003) Benzoa.pyrene-dG adduct interference illuminates the interface of vaccinia topoisomerase with the DNA minor groove. J Biol Chem, 278, 9905-9911.

91. Jeltsch, A. (2006) Molecular enzymology of mammalian DNA methyltransferases. Curr Top Microbiol Immunol, 301, 203-225.

92. Perera, F.P., Tang, D., Tu, Y.H., Cruz, L.A., Borjas, M., Bernert, T., Whyatt, R.M. (2004) Biomarkers in maternal and newborn blood indicate heightened fetal susceptibility to procarcinogenic DNA damage. Environ Health Perspecl, 112, 11331136.

93. Hainaut, P., Pfeifer, G.P. (2001) Patterns of p53 G~>T transversions in lung cancers reflect the primary mutagenic signature of DNA-damage by tobacco smoke. Carcinogenesis, 22, 367-374.

94. Wilson, V.L., Smith, R.A., Longoria, J., Liotta, M.A., Harper, C.M., Harris, C.C. (1987) Chemical carcinogen-induced decreases in genomic 5-methyldeoxycytidine content of normal human bronchial epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA, 84, 3298-3301.

95. Кантор, Ч., Шиммел, П. (1984) Биофизическая химия. Мир, Москва.

96. Дарий, М.В., Кирсанова, О.В., Друца, В.Л., Кочетков, С.Н., Громова, Е.С. (2007) Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы Sssl. Молекуляр. биология, 41, 121-129.

97. Bradford, М.М. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biocheiiu 72, 248-254.

98. Subach, O.M., Khoroshaev, A.V., Gerasimov, D.N., Baskunov, V.B., Shchyolkina, A.K., Gromova, E.S. (2004) 2-Pyrimidinone as a probe for studying the EcoRII DNA methyltransferase-substrate interaction. Eur J Biochem, 271, 2391-2399.

99. Мао, В., Li, В., Amin, S., Cosman, M., Geacintov, N.E. (1993) Opposite stereoselectiveresistance to digestion by phosphodiesterases I and II of benzoa.pyrene diol epoxidemodified oligonucleotide adducts. Biochemistry, 32, 11785-11793.

100. Johnson, F., Bonala, R., Tawde, D., Torres, M.C., Iden, C.R. (2002) Efficient synthesis ofthe benzoa.pyrcne metabolic adducts of 2'-deoxyguanosine and 2'-deoxyadenosine andtheir direct incorporation into DNA. Chem Res Toxicol, 15, 1489-1494.

101. Karle, I.L., Yagi, H., Sayer, J.M., Jerina, D.M. (2004) Crystal and molecular structure ofa bcnzoa.pyrene 7,8-diol 9,10-epoxide N2-deoxyguanosine adduct: absoluteconfiguration and conformation. Proc Natl AcadSci USA, 101, 1433-1438.

102. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

103. Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

104. Воробьева, O.B., Карягина, A.C., Волков, E.M., Вирясов, М.Б., Орецкая, Т.С.,

105. Кубарева, Е.А. (2002) Анализ контактов метилтрансферазы SsoII с ДНК в ферментсубстратном комплексе. Биоорган, химия, 28, 402-410.