Особенности взаимодействия С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз с ДНК-дуплексами, содержащими аддукты 2'-дезоксигуанозина с бензо[a]пирендиолэпоксидом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Баскунов Владимир Борисович

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С5-ЦИТОЗИНОВЫХ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ С ДНК-ДУПЛЕКСАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ АДДУКТЫ 2'-ДЕЗОКСИГУАНОЗИНА С БЕНЗО [а] ПИРЕНДИОЛ ЭПОКСИДОМ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

А

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель :

доктор химических наук, профессор Громова Елизавета Сергеевна

Официальные оппоненты'.

доктор химических наук Михайлов Сергей Николаевич

доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится 25 апреля 2006 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 24 марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

er?*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Метилирование ДНК является природной эпигенетической модификацией генома и играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов. Метилирование ДНК осуществляется ДНК-метилтрансферазам и (МТазами), использующими в качестве донора метальной группы кофактор, 5-аденозил-ь-метионин (AdoMet); AdoMet при этом превращается в 5-аденозил-Ь-гомоцистеин (AdoHcy). В эукариотах метилирование происходит по атому углерода С5 остатков цитозина преимущественно в CpG-последовательностях. Распределение метилированных и неметилированных CpG-последовательносгей в геноме формирует профиль метилирования, нарушение которого приводит к онкогенезу.

Полициклические ароматические углеводороды, к числу которых относится бензо[а]пирен (В[а]Р), являются широко распространенными загрязнителями окружающей среды. В организмах, подверженных воздействию В[я]Р, отмечено образование множественных мутаций и возникновение рака Основными метаболитами В[а]Р являются диолэпоксиды - (+) и (-) 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10 тетрагидробензо[а]пирены (B[a]PDE), способные образовывать ковалентные аддукты с ДНК. Присоединение преимущественно происходит по аминогруппе гуанина с образованием (+)- и (-)-транс-анти -аддукгов Репарация таких аддуктов в эукариотах происходит с низкой

эффективностью, поэтому остатки В[а]Р, коваленгно присоединенные к ДНК, могут вызывать нарушение взаимодействия ферментов клеточного аппарата, в том числе МТаз, с ДНК

Большое количество повреждений, вызванных B[a]PDE, приходится на CpG-последовательности, в особенности, если остаток цитозина в них метилирован. В ранних работах показано, что статистическая обработка B[a]PDE эукариотических клеток приводила к снижению общего уровня метилирования генома (Wilson et al., 1987). Неясными остаются молекулярные механизмы взаимодействия стереоизомерных B[a]P-N2-dG-azwyKn>B с МТазами млекопитающих.

МТазы млекопитающих являются малоизученными ферментами. Показано, что их первичные структуры в С-концевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5-МТаз, которые изучены более подробно. В связи с этим, прокариотические МТазы могут быть использованы как модельные системы эукариотических аналогов.

В качестве модельных прокариотических МТаз в настоящей работе были использованы МТазы Sssl (M.SssI) из Spiroptasma и EcoRII (MEcoRII) из E.colt. М Sssl и М EcoRII узнают в ДНК последовательности CpG и CCt/aGG, соответственно, и метилируют в них остатки цитозина (подчеркнуты) по атому углерода в 5-ом положении. Выбор данных

РОС НАЦИОНАЛЬНА).

\

МТаз продиктован их сайт-специфичностью, поскольку в эукариотах метилированные остатки цитозина обнаружены как CpG-, так и в меньшей степени, в последовательностях. Кроме того, объектами исследования были ставшие доступными в процессе выполнения работы МТазы млекопитающих: каталитический домен Dnmt3a мыши (Dnmt3a-CD) и Dnmt2 человека. Dnmt3a вводит метальную группу в новое положение в геноме (т.е. осуществляет метилирование de novo) на стадиях гаметогенеза и эмбриогенеза Dnmt3a-CD не отличается по каталитическим свойствам от полноразмерного фермента. Роль Dnmt2 в клетке неясна и эффективность метилирования ДНК данным белком крайне низкая.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение влияния введения в ДНК канцерогенных (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-1^-Ю-аддукгов на функционирование С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, узнающих последовательности CpG и CCt/aGG.

Задачи работы: 1) конструирование ДНК-дуплексов, содержащих (+)- и (-)-транс-awnu-BMP-A^-dG в различных позициях ДНК-субсграта;

2) определение влияния стереоизомерии аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии каталитического цикла прокариотических МТаз SssI и EcoRIl и каталитического домена МТазы мыши Dnmt3a.

4) Изучение связывания Dnmt2 с ДНК-дуплексами, содержащими (+)- и (-)-транс-анти-Ъ[а]Р-Ы2-<Ю.

Научная новизна и практическая ценность.

Для M.SssI, M.EcoRII, Dnmt3a-CD и Dnmt2 впервые определены субстрат-связывающие характеристики и кинетические параметры метилирования широкого набора немодифицированных и модифицированных ДНК-дуплексов.

Методами поляризации флуоресценции и торможения в геле получены значения констант диссоциации фермент-субстратных комплексов указанных МТаз с немодифицированной ДНК. Для M.SssI взаимодействие с таким субстратом изучено постадийно: найдены каталитические константы и константы скорости переноса метальной группы на ДНК.

В качестве аналогов субстрата были получены ДНК-дуплексы, содержащие в участках узнавания МТаз или прилегающих к ним нуклеотидным последовательностям (+)-и (-)-w/?aHC-flHmu-B[a]P-AfJ-dG-aAflyKTbi (В). Установлено, что устойчивость комплексов M.SssI, Dnmt3a-CD и Dnmt2 с немодифицированной и с В[а]Р-ДНК примерно одинакова. Комплексы M.EcoRII с В[д]Р-ДНК были менее прочные по сравнению с комплексами М EcoRIl с немодифицированным субстратом. На основании анализа кинетических констант показано, что для М SssI, М EcoRIl и Dnmt3a-CD метилирование ДНК, содержащей В-аддуктъг, затруднено или даже блокировано в зависимости от стереоизомерии аддукта и его

положения относительно метилируемого цитозина В случае М SssI наибольшее ухудшение метилирования В[а]Р-ДНК наблюдалось при локализации (+)- или (-)-аддукта с 5'-конца участка узнавания В случае Dnmt3a-CD ухудшение метилирования наблюдалось при локализации (+)- или (-)-аддукта в участке узнавания и (-)-аддукта вне его.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения влияния канцерогенных повреждений ДНК на функционирование МТаз млекопитающих Показано, что канцерогенное действие загрязнителя окружающей среды - В[а]Р - включает эпигенетическую составляющую - изменение профиля метилирования ДНК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), 5-м международном симпозиуме New England Biolabs «Restriction/Modification», (Бристоль, 2004), международной конференции «Химические и биологические проблемы протеомики» (Новосибирск, 2004), международной научной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен механизмам функционирования эукариотических ДНК-метилтрансфераз), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (130 ссылок). Материал иллюстрирован 19 рисунками, 8 таблицами и 4 схемами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Настоящая работа посвящена изучению влияния повреждения ДНК остатками бензо[а]пирена на процесс метилирования ДНК МТазами SssI, EcoRII и Dnmt3a-CD Были сконструированы ДНК-дуплексы, содержащие остаток (+)- и (-)-mpaHc-aHmu-B[a]P-N2-dG (рис. 1, А). В таких дуплексах объемный канцерогенный остаток локализован в малой бороздке ДНК (Geacintov et al, 1997) В случае (+)-изомера остаток В[а]Р ориентирован в сторону 5'-конца, а в случае (-)-изомера - в сторону З'-конца модифицированной цепи (рис. 1£). По данным ЯМР-спектроскопии комплементационные взаимодействия между основаниями в таких модифицированных дуплексах сохраняются и отклонения геометрии ДНК от В-формы минимальны (Cosman et al., 1992) Тем не менее, наши данные по термической устойчивости В[а]Р-ДНК, совместно с результатами, полученными в других группах, указывают на незначительную дестабилизацию двойной спирали (на 4-6 градусов).

о

о

1 OS (+)-mpaHC-aHmu-B[ä\P-N2-dG (В*) 1OR (-)-mpaHC-aHmu-B[a]P-N2-<SG (В")

Рис. 1. (А) Структурные формулы (+)- и (-)-mpcmc-aHmu-B[a]P-N2-dG аддуктов. (Б) Пространственная структура ДНК-дуплексов, содержащих (+)- и (-)-транс-анти-В[а\?-Ы2-dG (вид на малую бороздку).

МТазы Sssl, EcoRII и Dnmßa-CD являются мономерными белками, которые за один акт связывания с участком узнавания в ДНК переносят метальную группу на остаток цитозина только в одной цепи Вторая цепь ДНК метилируется за следующий акт связывания ферментом ДНК Рентгеноструктурный анализ (РСА) выполнен только для комплексов двух прокариотических С5-МТаз - MHhal и М.НаеШ - с ДНК. Показано, что ферменты достигают специфичности по отношению к узнаваемой нуклеотидной последовательности посредством образования ДНК-белковых контактов в большой бороздке ДНК. При метилировании остаток цитозина-мишени выводится из двойной спирали ДНК и помещается в полость активного центра МТазы. При этом каталитическая петля, содержащая консервативный остаток Cys, смещается по направлению к малой бороздке ДНК и взаимодействует с выпетленным цитозином. Предполагается, что этот механизм может быть общим для всех С5-МТаз, в том числе и эукариотических (Göll & Bester, 2005)

Взаимодействие МТазы (Е) с ДНК (S) можно упрощенно представить в виде нескольких стадий - образования фермент-субстратного комплекса (ES), переноса метальной группы на ДНК и диссоциации комплекса фермента с продуктами реакции (Р) (схема 1):

Е + S <- ES

Ал»

ЕР —

Е + Р

Схема 1.

Поскольку влияние В[а]Р-ДНК-аддукта может проявляться на каждой из стадий, нами были определены константы диссоциации (АГа) комплексов МТаз с В[а]Р-ДНК, а также каталитические константы (¿са0 и константы скорости переноса метальной группы (Асьст).

Изучение устойчивости комплексов МТаз с ДНК проводили в присутствии аналога кофактора, А<1оНсу, поскольку для многих прокариотических МТаз показано, что в его присутствии специфичность узнавания ферментом нужной последовательности в ДНК и стабильность ДНК-белкового комплекса увеличивается Значения К^ тройного комплекса МТазаДНКАс1оНсу определяли различными способами' а) методом прямого титрования фиксированного количества ДНК различными аликвотами фермента, б) методом конкурентного равновесного связывания двух различных ДНК (модифицированной и немодифицированной) с ферментом и в) методом конкурентного вытеснения дуплекса из предварительно полученного комплекса с ферментом добавлением к комплексу ДНК-конкурента Регистрацию ДНК-белкового комплекса проводили по изменению сигнала поляризации флуоресценции в реакционной смеси либо радиоавтографией неденатурирующего полиакриламидного геля (ПААГ), в котором комплекс отделяли от несвязанной ДНК Используемые ДНК содержали на 5'-конце одной из олигонуклеотидных цепей 5(6)-карбоксифлуоресцеин (РАМ), либо [32Р], соответственно Расчет значений Кл проводился методом нелинейной регрессии полученных данных в соответствии с бимолекулярным механизмом образования фермент-субстратного комплекса Каждый из описанных методов имеет свои преимущества и ограничения, и Кц определялись, как правило, двумя методами

Кинетический анализ взаимодействия МТазы с ДНК-дуплексами проводили в условиях стационарной кинетики и в условиях «одного оборота», что позволило определить влияние канцерогенного остатка на и &сьст, соответственно. За прохождением реакции следили по включению тритиевой метки в ДНК-дуплекс, происходящему в процессе переноса метальной группы от [СН3-3Н]-А(1оМе( в ходе ферментативной реакции. Расчет ^сЬоп проводился по уравнению 1 в соответствии с представлением о псевдопервом порядке реакции метилирования в условиях насыщения по ДНК и Ас)оМе1:. [3Н-ДНК]/[ДНК0]=1-ехр(-Лс11еп1-0 (Г)

1. Дизайн субстратов и их модифицированных аналогов

В качестве канонических субстратов нами были выбраны 18-ти звенные ДНК-дуплексы, содержащие участки узнавания ЗввГ и ЕсоШ1 (выделены жирным шрифтом, метилируемое основание подчеркнуто):

5' -бАСССААСгСвгСАСТСТСА-З' 5' -САСССААССТв^гСТСТСА

3' -СТССЗТТС-<ЗС-СТСАСАСТ-5' 3' -СТСССГТТСАС-С-САСАСТ

ОСО/ССЮ ТСЮ/АСС

Совместно с лабораторией Н Э. Гиацинтова (США) был сконструирован набор ДНК-дуплексов, в которых один из остатков сЮ (в] или вг) был заменен на (+)- или (-)-транс-аноты-В[а]Р-Л^-(Ю аддукт (табл. 1 и 2) Модифицированный остаток <Ю находился в участках узнавания изучаемых ферментов, а также с 5-конца от СрО-последовательности Также использовались полуметилированные ДНК, содержащие остаток т5с1С в цепи участка узнавания, модифицированной В[д]РОЕ (ВСО/СОМ и ОСВ/СОМ, табл. 1; ТВД/АМС и ТОВ/АМС, табл 2), либо в комплементарной ^модифицированной цепи (вМВ/ССЮ, табл. I). Такие дуплексы позволили определить влияние В-ацдуктов на метилирование каждой из цепей ДНК-дуплекса.

Разделение рацемических смесей исходных олигонуклеотидов (синтезированы в лаборатории Н Э Гиацинтова в Нью-йоркском университете), содержащих (+,-)-транс-анти-В[а]Р-Л^-<Ю проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Однако В[а]Р-модифицирован-ные олигонуклеотиды 5'-ОАОССААССТОВСТСГСА и 5'-ОАОССААССТОВ+СТСТОА не удалось разделить в этих условиях. Была разработана методика их препаративного разделения в виде дуплексов в 8%-ном неденатурирующем ПААГ с последующим разделением цепей в 20%-ном денатурирующем ПААГ и получением индивидуальных стереоизомеров. Для получения олигонуклеотидов 5'-ОАОССААОМВ'САСТСТОА и 5'-САОССААОМ[(+)С*]САСТСТОА проводили исчерпывающее метилирование олигонуклеотидов ДНК-дуплексов ОСВУСвМ и вСВ7СОМ М 5зз1 с последующим разделением цепей в 20%-ном денатурирующем ПААГ.

2. Взаимодействие с немодифицированными субстратами

Изучение субстратных свойств ^модифицированной ДНК проводилось с целью подбора условий для получения и анализа фермент-субстратных комплексов и для проведения реакции метилирования ДНК. Полученные данные также позволяют провести в дальнейшем сравнительный анализ влияния повреждения ДНК В[а]РОЕ на функционирование МТаз.

Определение параметров обратимого фермент-субстратного взаимодействия в случае М Бээ! проводилось на примере полуметилированного ДНК-дуплекса СКХ}/СОМ-РАМ Ка тройного комплекса М ЗБбГССО/СОМ-РАМАЛэНсу (5 3+0.3 нМ) определяли прямым титрованием дуплекса (ХХ}/ССМ-РАМ М.Бвв! (рис 2А, табл 1) Константу скорости диссоциации, к.\, комплекса М ЗввМЗСО/СОМ-РАМАскМсу (5*10'э с'1) определяли вытеснением флуоресцеин-меченного дуплекса из комплекса с ферментом избытком

немеченного дуплекса (рис. 2Б) Время, необходимое для установления равновесия в системе МТаза-ДНК может быть оценено как ~Мк.\ = 10 мин Полученное значение использовалось нами как время, необходимое для достижения равновесия при определении АГа комплексов М ЭвзГДНК АЛэНсу методом конкурентного равновесного связывания Равновесные комплексы М ЗвзРДНКАсЬНсу, в силу их прочности и относительно медленной скорости диссоциации, можно анализировать методом «торможения» в геле А Б

Рис. 2 Определение физико-химических параметров комплекса М ЗввГОСО/СОМ-РАМ Ас1оНсу. (А) Зависимость поляризации флуоресценции от концентрации М Ээв! для системы М БззМЗСО/СОМ-КАМ в присутствии 1 мМ А(1оНсу Концентрация дуплекса (Си) 5 нМ (Б) Кинетический анализ изменения поляризации флуоресценции в системе при добавлении к комплексу М.5551РАМ-ОСО/СОМАс1оНсу избытка ОСй/СОМ. В начальный момент времени дуплекс ОСО/СвМ (1600 нМ) добавлен к комплексу М вээ! РАМ-СЮО/СОМ-АёоНсу (15 нМ).

Для дуплекса ОСО/СвМ константы скорости ^ьсш и ксщ равны 4 4 мин'1 и 2 3 мин'1, соответственно (табл. 1).

Дуплекс (ЗСО/СОС и полуметилированный дуплекс ОМО/СвС образуют такие же прочные комплексы с Мввв!, как и дуплекс (ЗСв/ССМ (табл 1). Эффективности метилирования М Эвв! неметилированной и полуметилированной ДНК отличаются: для дуплекса ОСв/СОС (4 3 мин"1) в два раза больше, чем для дуплексов вСО/СОМ и ОМО/ССЗС (2.3 и 1.9 мин1)

3. Взаимодействие М.8$я1 с ДНК, содержащей (+)- и (-)-трянс-ян»ш-В[в]Р-/У2-(Ю Поскольку участки узнавания $551 и МТаз млекопитающих совпадают, среди многообразия прокариотических МТаз мы выбрали именно М^эГ Изучение взаимодействия М.Зээ! с В[а]Р-ДНК представляется нам как наиболее адекватная модель влияния повреждения ДНК В[ог]РОЕ на метилирование СрО-последовательности

К& комплексов М.8881В[а]Р-ДНКА<1оНсу определяли методом конкурентного равновесного связывания В[а]Р-ДНК и ^модифицированного дуплекса с М^б! в

присутствии АёоНсу (рис. 3, табл 1) В[а]Р-ДНК-дуплексы конкурировали с [32Р]-меченным немодифицированным субстратом за центр связывания фермента, уменьшая тем самым количество комплекса 5581 [32Р]-ДНКА<1оНсу. Анализ образования комплексов проводился методом «торможения» в геле. М.Эвв! практически одинаково связывается с немодифицированными и модифицированными ДНК, вне зависимости от стереохимии аддукта, его локализации относительно метилируемого цитозина и наличия т5дС в модифицированной или «модифицированной цепи исследуемой ДНК. Следовательно, объемный В[а]Р- заместитель, находящийся в малой бороздке, не влияет на узнавание ДНК ферментом.

Рис. 3. Равновесное конкурентное связывание М.Эзв! (50 нМ) с [Э2Р]-меченным дуплексом ОСв/СОМ (100 нМ) в присутствии различных количеств В[я]Р-модифицированных ДНК-дуплексов: ОСО/СОМ (А), В-СО/СвМ (о), В+СО/СОМ (•), (ЗСВ'/СОМ (□) или ОСВ+/СОМ (■) и 1 мМ Ас1оНсу К - относительная степень связывания, определяемая как отношение количества комплекса ЗввЮСО/СОМАдоНсу при данной концентрации ДНК-конкурента к количеству комплекса ЗвзГОСО/СОМАсЬНсу в отсутствие ДНК-конкурента.

В большинстве случаев метилирование неметилированных и полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих В+- или В"-аддукты МТазой Звэ! было нарушено (табл 1). Уменьшение всегда сопровождалось уменьшением Алт, следовательно, влияние В-аддуктов на метилирование \1SssI проявляется на химической стадии катализа. Ухудшение метилирования в случае полуметилированных В[а]Р-ДНК (ВСй/СОМ, (ЗСВ/ССМ и СМВ/СвС) было более существенным, чем в случае неметилированных аналогов (ВСО/С(5С и ОСВ/СбС, табл. 1) В условиях стационарной и однооборотной кинетики ухудшение метилирования полуметилированных В[а]Р-ДНК МТазой вээ! было наибольшим (метилирование блокировалось) при локализации В+ или В" с 5'-конца от метилируемого остатка цитозина При локализации В+ или В" напротив метилируемого остатка цитозина также наблюдалось ухудшение метилирования, однако менее значительное (уменьшение в 2-5 раз) При локализации В+ или В" с З'-стороны от метилируемого остатка цитозина заметного ухудшения метилирования не наблюдалось.

Таблица 1 Взаимодействие М SssI с ДНК-дуплексами, содержащими (+)- и (-)-транс-ант«-В[а]Р-Л'2-сК}-аддукты.

ДНК-дуплекс" Обозначение Кл, нМ 0 ксжи МИН ^chem* МИН

5'GAGCCAAGCGCACTCTGA 3' CTCGGTTCGCGTGAGACT GCG/CGC 5.6 ±0.2' 4.3 ± 0.5 -

5' GAGCCAAB'CGCACTCTGA 3'CTCGGTTC GCGTGAGACT B'CG/CGC 6.7 ±1.3 02±0.1 -

5' GAGCCAAB'CGCACTCTGA 3'CTCGGTTC GCGTGAGACT B+CG/CGC 8.2 ± 1.7 0.5 ±0.1 -

5' GAGCCAAGCB~CACTCTGA 3' CTCGGTTCGC GTGAGACT GCB'/CGC 9.9 ±2.0 09±0 1 -

5' GAGC С AAGCBTC AC T С T GA 3'CTCGGTTCGC GTGAGACT GCB+/CGC 7.5 ±1.4 2.4 ±0.4 -

5'GAGCCAAGCGCACTCTGA 3'CTCGGTTCGMGTGAGACT GCG/CGM 5.3 ±0.3* 2.3 ± 0.2 44± 1.0

5' GAGCCAAB'CGCACTCTGA 3'CTCGGTTC GMGTGAGACT B'CG/CGM 9.8 ± 1.9 <0 0005 <0.002

5' GAGCCAAB'CGCACTCTGA 3'CTCGGTTC GMGTGAGACT B+CG/CGM 24.4 ±49 < 0.0005 < 0.002

5' GAGCCAAGCB'CACTCTGA 3'CTCGGTTCGM GTGAGACT GCB/CGM 5.3 ±1.0 1.9 ±0.1 2.5 ±0.2

5' GAGCCAAGCB"CACTCTGA 3'CTCGGTTCGM GTGAGACT GCB+/CGM 7.5 ±1.5 3.6 ±0.2 3 5± 0.2

5' GAGCCAAGMGCACTCTGA 3'CTCGGTTCGCGTGAGACT GMG/CGC 5.0± 1.0 1.9 ±0.2 -

5' GAGCCAAGMB'CACTCTGA 3'CTCGGTTCGC GTGAGACT GMB7CGC 8 9 ± 1.7 0.32 ±0.02 0.3 ± 0 1

5' GAGCCAAGMB'CACTCTGA 3'CTCGGTTCGC GTGAGACT GMB+/CGC 5.9± 1 2 1 5±0 1 1 7± 0 2

"Выделены участок узнавания М Яяя! (жирный шрифт) и метилируемые остатки цитозина (С), В (+)-транс-анти-Ъ[а]Р-Ы2-ЛО, В" - (-Утраис-антиЩа^-Ы^-да, М - т5с1С

Определены для комплексов М SssI-B[o]P-flHK»AdoHcy методом конкурентного равновесного связывания В[а]Р-ДНК и немодифицированного дуплекса с М SssI,

* Определены прямым титрованием дуплексов GCG/CGC-FAM и GCG/CGM-FAM МТазой SssI в присутствии AdoHcy

Как уже отмечалось, ДНК, содержащая транс-анти-В [<з] P-^-dG обладает рядом структурных особенностей' присоединенный к экзоциклической аминогруппе гуанина объемный канцерогенный радикал локализован в малой бороздке двойной спирали ДНК На основании компьютерной модели комплекса М SssI-ДНК AdoHcy в каталитической петле М SssI можно выделить остатки Phe139, Cys141, Gin146 и Gin147, образующие контакты с ДНК со стороны ее малой бороздки (Koudan et al, 2004) (рис 4)

Рис. 4. Схематическое 3' представление контактов каталитической петли М^ с

гетероциклическими основаниями в ДНК (Кошкпе1а1„ 2004).

Мы связываем ухудшение метилирования в В[а]Р-ДНК с нарушением образования контактов каталитической петли M.SssI с ДНК со стороны малой бороздки, необходимых для стабилизации каталитически компетентного переходного комплекса.

Рассмотрим влияние локализации В-аддукта относительно метилируемого остатка цитозина в поврежденной ДНК на примере метилирования дуплексов BCG/CGM, GCB/CGM и GMB/CGC M.SssI. В дуплексе BCG/CGM, метилирование которого блокировано, можно предположить, что объемный канцерогенный радикал не только нарушает перестройку каталитической петли, но и может препятствовать выпетливанию цитозина-мишени. В пользу этого свидетельствует тот факт, что при проведении реакции в условиях одного оборота в течение 2 часов метилирование этого дуплекса отсутствовало. Таким образом, наличие В-аддукта с 5'-конца от метилируемого цитозина неблагоприятно для метилирования рассматриваемой CpG-последовательности М Sssl Метилирование дуплексов GCB/CGM не нарушено, поэтому можно предположить, что непосредственное влияние пиренильного радикала на перестройку каталитической петли и выпетливание цитозина-мишени в этом случае отсутствует. Наши результаты находятся в соответствии с моделью комплекса M.SssI-ДНК-AdoHcy, согласно которой каталитическая петля M.SssI не образует контактов с остатком гуанина, расположенным с З'-стороны метилируемого цитозина Метилирование дуплексов GMB/CGC, в которых В-аддукт расположен напротив цитозина-мишени, происходит менее эффективно по сравнению с немодифицированной ДНК, что свидетельствует о нарушении канцерогенным остатком предполагаемого по модели контакта Gin147 с экзоциклической группой модифицированного гуанина (рис 4). Поскольку метилирование дуплексов GMB/CGC и GCB/CGM не блокировалось, мы предполагаем, канцерогенный остаток не препятствует выпетливанию цитозина-мишени в их комплексах с M.SssI.

Эффективность метилирования также зависела от стереоизомерии аддукта: В+-аддукты метилировались более эффективно по сравнению с В"- стереоизомерами Известно, что локальная дестабилизация двойной спирали ДНК, наблюдаемая для В+-аддукга, более существенная, по сравнению с В~-аддуктами и вызвана расширением малой бороздки Такие локальные нарушения двойной спирали в случае В+-аддуктов могут благоприятствовать выпетливанию цитозина-мишени и более эффективному метилированию такой ДНК.

4. Взаимодействие M.EcoRII с ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анпш-Ща\¥-^-АО.

Недавно в эукариотах обнаружено метилирование ССА/тОО-последовательностей Изучение взаимодействия M.EcoRII ДНК, содержащей В-аддукты, позволяет определить влияние остатков (+)- и (-)-mpaHc-aHmu-B[a\P-Nl-&G на метилирование таких протяженных

последовательностей, в которых метилируемый остаток цитозина удален от поврежденного нукпеотида.

Определение К^ комплексов М ЕсоШ1 с ДНК проводилось методом конкурентного вытеснения дуплекса ТвО/РАМ-АСС из комплекса М ЕсоЯП-ТСЮ/РАМ-АСС-АйоНсу при добавлении к нему В[а]Р-ДНК-конкурента (рис 5, табл 2) Анализ образования фермент-субстратных комплексов проводился по изменению сигнала поляризации флуоресценции

-1-г---1-1-i-■-р-■-1

О 700 400 «00 ООО 1000

В[в]Р-ДНК-коикурвнТ, НМ

Рис. 5 Зависимость поляризации флуоресценции комплекса М EcoRII TGG/FAM-ACC AdoHcy (30 нМ) от концентрации добавленного В[а]Р-модифицированного дуплекса-TBG/ACC (■), TB+G/ACC (□), TGB7ACC (А) и TGB+/ACC (Д).

М EcoRII в присутствии AdoHcy способна образовывать комплексы с В[а]Р-модифици-рованными ДНК, однако в 5-30 раз менее прочные, чем с ^модифицированным субстратом Этот факт может быть объяснен тем, что наряду с преимущественным образованием специфических контактов М EcoRII с узнаваемой последовательностью в ДНК со стороны большой бороздки двойной спирали (Subach et al, 2004), сиквенс-специфическое узнавание центральной А/т-пары ферментом происходит со стороны малой бороздки (Kiss et al, 2001)

Как и в случае М SssI, модификация участка узнавания EcoRII остатками (+)- и (-)-mpaHC-aHmu-b[a\P-N1-dG приводит к ухудшению, либо блокированию метилирования. Степень ухудшения метилирования В[а]Р-ДНК МТазой EcoRII зависит от положения заместителя в участке узнавания. В дуплексах TBG/ACC и TBG/AMC (табл 2) уменьшение ксл по сравнению с ^модифицированными субстратами происходит в 350 раз и более В случае дуплексов TGB/ACC и TGB/AMC (табл. 2) наблюдалось менее значительное уменьшение ксл - в 4-90 раз. Таким образом, модификация в участке узнавания CCa/tGiG2 остатка гуанина Gi B[a]PDE значительно менее благоприятна для метилирования, чем модификация остатка G2.

В дуплексах TBG/ACC, метилирование которых блокировано, остатки (+)- и (-)-mpaHC-anmu-B[a]P-N2-AG вызывают нарушение метилирования как в модифицированной, так

и в ^модифицированной цепи. Такое влияние находится в соответствии с полученными результатами для дуплексов ТЕЮ/АМС, для которых мы отмечаем практически полное блокирование метилирования цепи, содержащей В В дуплексах ТвВ/АМС также можно говорить о нарушении метилирования цепи, содержащей В, однако менее существенном, чем в случае дуплексов ТВО/АМС (Леи дуплексов ТСВ/АМС в 4-25 раз меньше, чем ксгл дуплекса ТСЮ/АМС).

Таблица 2. Взаимодействие М ЕсоЯИ с ДНК-дуплексами, содержащими (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-М2-<Ю-аддукты.

ДНК-дуплекс" Обозначение Ка,иМ° МИН

5'-САСССААССТевСТСТСА 3 '-СТССБТТвСАСССАСАСТ ТОО/АСС 1 9+ 0.1* 17.66 ±0.90

5' -САСССААССТВ'вСТСТСА З'-СТСввТТССАССвАСАСТ ТВЧ}/АСС 21.8+0 8 <0.02

5' -САСССААССТВ*вСТСТСА 3'-СТСббТТСЗСАСССАСАСТ ТВЧ}/АСС 15.2+0.7 <0.02

5' - вАвСС ААССТОТ'СТСТСА 3' -СТССОТТЮЗАСССАСАСТ ТОВ'/АСС 57.2+ 2.2 0.20 ±0.06

5' - вАвСС ААССТОТ+СТСТСА З'-СТСССТТвСАСССАБАСТ ТОВ+/АСС 8.5+ 1 2 0.38 ±0.02

5'-6А6ССААССТввСТСТвА З'-СТСССГТОЗАМССАОАСТ ТОС/АМС - 14.14 ±0.84

5' -САСССААССТВ~(ЗСТСТСА З'-СТСССТТввАМССАСАСТ ТВЧЗ/АМС - 0.04 ±0.02

5'-6АСССААССТВ*ОСТСТСА З'-СТСССТТСЗ5АМССА6АСТ ТВ+0/АМС - 0.04 ±0.02

5' -САСССААССТ<гВ"СТСТСА 3' -СТССвТТОЗаМССАСАСТ ТОВ/АМС - 0.60 + 0.08

5'-6А6ССААССТ6В*СТСТСА 3' -СТСССТТТСАМССАСАСТ ТОВ+/АМС - 3.28 + 034

° Участок узнавания М ЕсоЮ1 выделен жирным шрифтом, сокращения и условные обозначения аналогичны приведенным в табл 1

6 Определены для комплексов М ЕсоИ1В[а]Р-ДНК-Ас1оНсу методом конкурентного равновесного вытеснения дуплекса ТСЮ/РАМ-АСС из комплекса М ЕсоМ1ТСЮ/РАМ-АССА<1оНсу 6 Определено для комплекса М ЕсоМ1-РАМ-ТСК}/АСС Ас1оНсу методом прямого титрования

Как и в случае МБвв^ мы предполгаем, что нарушение метилирования ДНК МТазой ЕсоИ1, вызванное В+- или В"-повреждениями участка узнавания связано с нарушением перестройки каталитической петли белка (каталитическая петля взаимодействует с ДНК со стороны малой бороздки двойной спирали) и/или нарушением выпетливания метилируемого цитозина. Интересно, что в случае дуплексов ТОВ'/АМО и ТОВУАСКЗ, в которых канцерогенный остаток направлен в сторону 3'-конца от участка узнавания и не затрагивает участок малой бороздки в районе метилируемого цитозина в поврежденной цепи, уменьшение ¿са1 по сравнению с немодифицированными дуплексами значительны (в 25-90 раз). Это может явиться следствием образования предполагаемой протяженной сети

контактов каталитической петли MEcoRII с группами атомов CCA/jGG-y4aCTKa (Кудан, неопубликованные данные).

5. Взаимодействие Dnmt3a-CD с ^модифицированными субстратами.

Dnmt3a состоит двух доменов- регуляторного N-концевого домена и каталитического С-концевого домена, содержащего 10 консервативных мотивов, характерных для МТаз В настоящей работе использовался каталитический домен Dnmt3a.

K¿ комплексов Dnmt3a-CD с ДНК определяли титрованием флуоресцеин-меченных дуплексов ферментом в присутствии AdoHcy. K¿ комплекса Dnmt3a-CDGCG/CGC-AdoHcy составляет 7.1 нМ (табл 3). Данное значение хорошо согласуется со значением K¿ (4.6 нМ), полученным методом поверхностного плазмонного резонанса для комплекса DnmCa-CD с 30-звенным ДНК-дуплексом (Gowher et al., 2005). K¿ комплексов Dnmt3a-CD с полуметилированными дуплексами GCG/CGM и GMG/CGC в 1.7 paja выше, чем с неметилированным GCG/CGC

Рис. 6. Временные зависимости метилирования немодифицированных дуплексов ОСО/ССС (■), ОМО/СОС (•) и ОСО/СОМ(А) в условиях стационарной кинетики (А: Сошли»« 0.1 мкМ, С<ь 2 мкМ, Сдаом« 2 5 мкМ) и в условиях одного оборота (Б- Сштоа-со 1 мкМ, С<ь 0 3 мкМ, СалоМи 2 мкМ).

Скорости метилирования дуплексов ОСО/СйС, ОМв/СвС и ОСв/СОМ очень низкие: ^¡ц составляют 1.57 ч'1,1.21 ч'1 и 0.51 ч'1, соответственно (табл. 3) Это находится в соответствии с данными других авторов о медленном метилировании ДНК ОппиЗа ЦокI е/ а1„ 2001) Наблюдаемые различия в стационарных скоростях метилирования дуплексов йСв/СОС, ОМО/СОС и ОСС/СОМ (рис. 6А) отражают предпочтительное метилирование МТазой Г)пт13а цепи ТСАСАСТССССТГСОСТС по сравнению с цепью ОАОССААОСССАСТСТОА в составе полуметилированных дуплексов и находятся в соответствии с недавно обнаруженным предпочтительным метилированием Г)пт13а последовательностей Ру'2Ри'1СОРу+| (Ьт е/ а1, 2002).

Временные зависимости метилирования дуплексов ОСС/СвС, ОМО/СОС и ОСв/СОМ также отличалось при проведении реакции в условиях одного оборота (рис. 6£) В этих условиях количество образующегося продукта [СН3-3Н]-ДНК отражает метилирование ферментом участка узнавания за один акт связывания Максимальные количества [СН3-3Н]-ДНК для дуплексов ОСО/СвС, ОМв/СОС и ОСС/ССМ соотносятся как 1.0 6.0.3, соответственно (рис. 65). Этот факт может быть объяснен тем, что Е)пп«За-СО способна связываться с полуметилированной ДНК в двух ориентациях, когда активный центр фермента взаимодействует либо с еще не метилированным цитозином (продуктивная

ориентация #1), либо с уже метилированным цитозином (непродуктивная ориентация #2) (рис 7).

Рис. 7 Продуктивная (#1) и непродуктивная (#2) ориентация ОппЛЗа-СО относительно 1

полуметилированной ДНК.

Таким образом, определяемое количество [СНз-3Н]-ДНК при выходе кривой на плато отвечает количеству фермента, связанного в продуктивной ориентации (рис 6Б) Различные уровни плато для дуплексов ОМО/СОС и ОСО/СйМ свидетельствуют о способности ОтМЗа-СО уже на стадии связывания проявлять предпочтение к определенным фланкирующим последовательностям. Можно предположить, что ОппиЗа-СБ предпочтительно связываться с ДНК в ориентации, при которой активный центр фермента взаимодействует с цепью, содержащей предпочтительные для метилирования фланкирующие последовательности (в нашем случае - ТСАОАОТОС(»СТТ(ЮСТС или ТСАОАОТОМССГГООСТС). Действительно, степень метилирования дуплекса СМО/СОС больше, чем в случае дуплекса вСО/СОМ. г

Найденные по уравнению (1) значения АсЬсш для дуплексов ОМО/ССС и ОСО/СОМ равны 4.8 и 2 6 ч'1, соответственно (табл. 3) Можно предположить, что ОппйЗа-СО, первоначально связавшись с ДНК в ориентации, при которой активный центр фермента взаимодействует с цепью, содержащей более предпочтительные фланкирующие последовательности, также более эффективно переносит на эту цепь метальную группу по сравнению с комплементарной цепью, содержащей менее предпочтительные фланкирующие последовательности.

Кинетические зависимости метилирования дуплекса вСО/СОС в условиях одного оборота неудовлетворительно описывалась уравнением (1) Для описания кинетических кривых метилирования дуплекса ОСО/ССС мы предложили уравнение (2), учитывающее

#1

активный центр ОС<ЗС

семо

#2

активный центр

вмвс СвСв

способность МТазы связываться с ДНК в двух ориентациях - на «верхнюю» цепь (5'ОАОССААОСОСАСТСТСА) и «нижнюю» (ТСАОАОТССССТТСЮСТС). ['Н-ДНК]/[ДНКо]=1-€хр(-Лсь«я.д1)-а (ехр(-Л£ке11,,| О- ехр(-*г(Ь«т^1)) (2)

[3Н-ДНК] - концентрация метилированной ДНК, [ДНКо] -начальная концентрация ДНК-субстрата, ¿сьтл и ¿сыпи - константы скорости переноса метальной группы в каждой из ориентация, а -коэффициент, отражающий относительную долю одной из ориентации

Было принято, что обе ориентации являются каталитически компетентными, но могут отличаться эффективностью переноса метальной группы. Используемые в расчетах относительные доли каждой из ориентации ШпиЗа-СО в дуплексе С(ЗС/ОСО принимались равными 0.6 и 0.4, т.е. приблизительно такими же, как соотношение степеней метилирования дуплексов ОМв/СйС и (КХЗ/СОМ. Расчет по уравнению (2) показал, что ксьвп метилирования каждой из ориентации фермента в комплексе с СНХт/ССтС отличаются, и составляют 9,4 ч"1 и 2,1 ч'1, соответственно (табл. 3).

Таким образом, метилирование обеих цепей дуплекса ССЗСЛЗСО ШпиЗа-СО не равнозначно: МТаза предпочтительно связывается в ориентации на одну цепь (предположительно нижнюю), а также, по сравнению с комплементарной цепью, более эффективно ее метилирует.

6. Взаимодействие ОппИЗа-СБ с ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти-Ща]¥-^-ЛС.

ШпиЗа-СО эффективно связывалась с В[л]Р-ДНК, Кл образующихся комплексов были в 2-6 раз меньше по сравнению с комплексов с немодифицированной ДНК (табл. 3) Следовательно, объемный канцерогенный радикал, находящийся в малой бороздке, не влияет на узнавание ДНК ШтОа-СО Незначительное улучшение связывания в случае В[а]Р-ДНК может быть вызвано локальной дестабилизацией двойной спирали поврежденной ДНК, что может облегчить выпетливание цитозина-мишени.

Были получены зависимости эффективности метилирования В[я]Р-ДНК Е)ппйЗа-СО в условиях стационарной кинетики и «одного оборота» (рис 8). Расчет ксЬст метилирования дуплексов ВСв/СОС и СгСВ/СОС проводился, как в случае дуплекса (ЗСО/ССгС, с учетом ориентаций каталитического центра фермента на каждую из цепей дуплекса (табл. 3). Для большинства В[а]Р-ДНК мы наблюдали ухудшение метилирования как в стационарных условиях, так и в условиях одного оборота. Аналогично результатам, полученным для М^эг!, ухудшение метилирования полуметилированных дуплексов (ВСО/СОМ, (ЗСВ/СОМ и ОМВ/ССгС) было более существенным, чем неметилированных дуплексов (ВСО/С(ЗС, ОСВ/С<ЗС) Ухудшение метилирования В[а]Р-ДНК ОппиЗа-СО наблюдалось при локализации В+- и В' -аддукта в участке узнавания (дуплексы вСП/СйС, бСВ/СбМ и ОМВ/С(ЗС), а также при локализации В' -аддукта с 5'-конца от него (дуплексы В'СО/С(ЗС и

Вте/СОМ) В случае дуплексов В+СО/С(ЗС и В+ССг/ССМ, в которых В+ локализован с 5'-конца от участка узнавания, модификация не оказывала существенного влияния на метилирование (рис 8, табл. 3).

Рис. 8 Временные зависимости метилирования дуплексов GCG/CGC (■), B'CG/CGC (Д), B+CG/CGC (•), GCB'/CGC (Д), GCB+/CGC (А) в условиях стационарной кинетики (А CftimOa-CD 0 1 МкМ, Cds 2 МкМ, Сад>Мм 2 5 МкМ) и в условиях одного оборота (£' cdnmt3a-cd 1 мкМ, Cj, 0.3 мкМ, Сдаома 2 мкМ)

Были исследованы субстратные свойства дуплексов GCG/CGCB' и GCG/CGCB+, в которых, в отличие от дуплекса BCG/CGC, В-аддукт локализован с 5'-конца от цитозина-мишени в «нижней» цепи (табл 3) Как и в случае дуплексов BCG/CGC, метилирование дуплекса GCG/CGCB", содержащего В'-адцукг, происходило менее эффективно

Характер уменьшения ксhem метилирования каждой из цепей в дуплексах BCG/CGC и GCB/CGC по сравнению с соответствующей цепью в дуплексе GCG/CGC различен-метилирование одной из цепей происходит эффективно (значение fchem варьирует от 6 до 9 ч" '), в то время как метилирование комплементарной цепи может быть нарушено и даже блокировано (например, в дуплексе GCB'/CGC) Можно предположить, что нарушение метилирования Dnmt3a-CD преимущественно происходит в цепи ДНК, содержащей В-адцукт Данное предположение подтверждается тем, что дуплексы BCG/CGM и GCB'/CGM метилируются крайне неэффективно (табл 3)

Влияние канцерогенного радикала в ДНК на ее метилирование Dnmt3a-CD определяется структурными особенностями В[а]Р-ДНК В случае дуплекса B+CG/CGM объемный остаток В[а]Р, располагаясь в малой бороздке, направлен к 5'-концу модифицированной цепи ДНК, в сторону «от участка узнавания» Метилирование такого дуплекса практически не нарушено В случае дуплексов GCB'/CGM, GCB+/CGM, B"CG/CGM и GMB+/CGC остаток В[а]Р стерически экранирует малую бороздку в районе участка узнавания Вероятно, тем самым нарушается взаимодействие каталитической петли Dnmt3a-CD с ДНК, что приводит к блокированию метилирования.

Таблица 3. Взаимодействие Е)шШЗа-СО с ДНК-дуплексами, содержащими (+)- и (-)-

транс-анти-Ща\?-И2-йО-аддукш.

ДНК-дуплекс" Обозначение Кл, нМ" ч"1 в

5' САСССАА(ЗСвСАСТСТСА 3' СТаЗСГТСбССТСАСАСТ осо/сос 7.1 ± 1 3 1.57 ± 0.14 2,1±1 (0,4) 9,4±1Д (0,6)

5' вЛЗССААВ'СвСАСТСТвА З'СТСССГТС (ЗССТСАСАСТ воз/сос 5.2 ±0.9 0.58 ± 0.04 0,4±0,1 (0,4) 9,5±1,5 (0,6)

5' САСССААВ,СОСАСТСТСА З'СТСОЗТТС вССТвАСАСТ в+со/сос 3.8 ± 0.4 1.58 ± 0.11 2,6±1 (0,4) 6Д±1,8 (0,6)

5' САБССААСЗСвСАСТСТСА 3' СТСОвТТСвСВ'ТбАСАСТ СКХ5/СОСВ- 0.4±0.03

5' СА6ССАА<ЗСвСАСТСТСА 3' СТС<3<зТТС(ЗСВ+ТСА6АСТ (5со/сссв+ 0.74±0.05

5' САСССАА(ЗСВ"САСТСТСА 3' СТСввТТСвСвТв&САСТ <ЗСВ7С(5С 3.7 ±0.5 0.54 ±0.14 <0.1 (0,4) 6,8±0,7 (0,6)

5' САСССААССВ*САСТСТСА 3'СТСвОТТСвССТОАОАСТ осв+/сос 6.0 ±1.0 0.42 ± 0.04 0.6±0.1 (0,4) 8.7±0.8 (0,6)

5' САСССААССвСАСТСТСЗА 3' СТСССТТСОЮТСАСАСТ (гсо/сом 12.4 ±2.4 0 51 ±0.15 2,6±0,8

5' САСССААВ'СОСАСТСТСА 3' СТССЗСЗТТССМСЗТСАСАСТ ваз/сом 2.3 ±0.5 0 09 ±0.01 <0.1

5' САСССААВ*СвСАСТСТСА 3' СТС<3<ЗТТС(ЗМСТСАСАСТ в+со/сом 4.7 ± 0.5 0.27 ±0.01 0,7±0,1

5' САвССААССВ'САСТСТвА 3' СТСаЗТТСЭКТСАСАСТ осв/сом 2.3 ±0.5 0.11 ±002 <0.1

5' САСССААССВ*САСТСТСА 3' СТСССТТС<»«ЗТСАСАСТ <зсв+/сом 4.5 ± 1.1 0.12 ±0.02 0,5±0,1

5' САСССААЭКЗСАСТСТСА 3'СТСССТТСвССТСАСАСТ омо/сос 12.0 ±2.0 1.21 ±0.01 4,8±1,3

5' САСССААСМВ'САСТСТСА 3' СТСССТТСвСетСАЙАСТ ОМВ'/СбС 6 2± 0 8 0.49 ±0.01 0,25±0,05

5' САСССААСМВ*САСТСТСА 3' СТСССТТСОССТСАЙАСТ омв+/сск: 6.0 ±0.8 0.20 ±0.03 0,14±0,03

* Участок узнавания ОптОа выделен жирным шрифтом, сокращения и условные

обозначения аналогичны приведенным в табл 1.

6 Определено для комплексов Е>пт13а-СЕ)ДНКАс1оНсу методом прямого титрования

''Указанный в скобках коэффициент отвечает количеству фермента, связанного в ориентации, метилирование которой происходит с приведенным ка^

Представляется интересным сравнить влияние введения (+)- и (-)-транс-анти-Ща\\>-Л,2-сЮ в ДНК на ее метилирование двумя Срв-узнающими МТазами- Эзэ! и ОппиЗа-СБ В случае М ЗввГ нарушение метилирования наблюдалось при локализации аддукта с 5'-конца от метилируемого остатка цитозина, либо напротив него В случае ЭппИЗа-СО влияние локализации аддукта на метилирование несколько иное - нарушение метилирования происходит большей частью в дуплексах, содержащих аддукт с З'-конца от метилируемого

остатка цитозина Такое различие в эффектах может быть связано с возможными различными ориентациями каталитических петель М SssI и Dnmt3a-CD относительно участка узнавания Согласно данным футпринтинга MSssI, фермент со стороны малой бороздки ДНК образует не задействованные в сиквенс-специфическом узнавании контакты с позициями -1 и -2 с 5'-конца NjN.jCG последовательности (Renbaum et al, 1995) Компьютерное моделирование комплекса M.SssI-flHKAdoHcy также показывает, что каталитическая петля взаимодействует с нукпеозидным остатком, расположенным с 5'-конца CpG-последовательности. В случае Dnmt3a-CD можно сделать предположение о том, что каталитическая петля образует контакты непосредственно в районе участка узнавания.

7. Связывание Dnmt2 с ДНК, содержащей (+)- и (-)-mpaHC-mmu-B\a\P-N2-dG.

Dnmt2 является единственной МТазой млекопитающих, для которой определена пространственная структура. Структуры Dnmt2 и бактериальной MHhal очень похожи. Несмотря на то, что есть все основания полагать, что Dnmt2 является ДНК-метилтрансферазой, т vivo и in vitro эффективность метилирования ДНК этим ферментом крайне низкая Недавно показано, что Dnmt2 также пособна метилировать тРНКА5р.

В связи с этим, мы ограничились изучением связывания Dnmt2 с ДНК, содержащей остатки (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-М2-йО Кл комплексов Dnmt2 с ДНК определяли методом прямого титрования флуоресцеин-меченных дуплексов ферментом (табл 4) В случае ^модифицированного ДНК-дуплекса GCG/CGC нами были определены двойного (Dnmt2GCG/CGC) и тройного (Dnmt2GCG/CGC-AdoMet) комплексов Kd комплекса Dnmt2 GCG/CGC составляет 55 нМ В присутствии AdoMet сродство к Dnmt2 увеличивается в 1,2 раза. Поскольку скорость переноса метальной группы на ДНК МТазой Dnmt2 является крайне низкой, дальнейшее изучение связывания Dnmt2 с ДНК проводили в присутствии кофактора, AdoMet Dnmt2 практически одинаково связывается с ^модифицированными и В[а]Р-ДНК, в случае дуплексов, содержащих в участке узнавания В', наблюдалось незначительное улучшение связывания (табл. 4).

Таблица 4. Связывание ОптС с ДНК-дуплексами, содержащими (+)- и (-)-транс-

ДНК-дуплекс" Обозначение Кб, нМ 5

5'САСССААССвСАСТСТСА 3'СТСССГТСбССТСАСАСТ ОСО/СОС 39 ±2

5' САСССААВ~С(ЗСАСТСТСА 3' СТСССТ"ГС<ЗС6Т6АСАСТ всо/сск: 37 ±2

5' САСССААВ+СвСАСТСТ6А 3'СТСССТТСвССТСАЗАСТ В+СО/С(ЗС 39 ± 2

5' САбССААССВ'САСТСТСА 3' СТСССТТССЗССТСАСАСТ осв/сск: 26 ±2

5' САбССААЭСВ'САСТСТСА 3'СТСССГТСвСбТОАбАСТ <зсв+/сос 34 ±4

5' вАСССАА<ЗС(!САСТСТ6А 3' СТСССГТСОМСТСАСАСТ (зсо/сом 40 ± 3

5' 6АСССААВ~СвСАСТСТ6А 3' СТС6СТТС<ЗМЗТСА6АСТ всо/сом 34 ±2

5' САСССААВ*С<ЗСАСТСТСА 3' СТСССТТСвКУТбАСАСТ в^м/евм 33 ±2

5' вАСССАА(5СВ~САСТСТ6А 3' СТСССГТССМСТСАСАСТ (тсв/сом 25 ± 1

5' САСССААССВ^САСТСТвА 3'СТСССТТСвМСТСАСАСТ <зсв+/сом 34 ±2

5' САЗССААСВМвСАСТСТСА 3'СТСССГТССССТСАСАСТ омо/сск: 44±2

5' САСССААСМВ'САСТСТбА 3' СТСС6ТТС<ЗС6ТСАСАСТ омв/сск: 29 ±5

5' БАбССААСМВ'САСТСТСА 3'СТСССТТСвССТСАСАСТ омв7сос 39 ±4

* Участок узнавания Е>тт2 выделен жирным шрифтом, сокращения и условные обозначения аналогичны приведенным в табл 1

6 Определено для комплексов П>ттйЗа-СОДНКАс1оНсу методом прямого титрования

Локализация объемного канцерогенного радикала в малой бороздке ДНК не

препятствует связыванию Оптт2 с модифицированным субстратом. Такая природа

связывания является возможной в случае, если Оппгё, так же, как и другие Срв-узнающие

МТазы и ОппиЗа-СБ, при узнавании ДНК не образует с ней контакты со стороны ее

малой бороздки.

Заключение

Интересным представляется сравнить влияние введения (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-А^-сЮ-аддуктов в ДНК на функционирование рассмотренных МТаз В случае МТаз, узнающих Срв, введение в состав ДНК остатка В[а]Р не приводит к ухудшению связывания МТаза EcoR.II, узнающая более протяженную нуклеотидную последовательность, менее эффективно связывает ДНК, содержащую В в участке узнавания Аналогичные результаты были получены в нашей лаборатории для другой С5 МТазы - М ННа1, сродство которой к ДНК, содержащей аддукты в участке узнавания (ОСОС) снижалось в 3-100 раз Наши

результаты позволяют предположить, что объемный канцерогенный остаток нарушает образование сиквенс-специфических контактов со стороны малой бороздки только в случае МТаз, узнающих более протяженные последовательности, чем CpG

Влияние BfaJPDE-повреждений на метилтрансферазную активную активность для всех МТаз в целом одинаково - при определенной локализации стереоизомерных аддуктов наблюдалось значительное ухудшение или блокирование метилирования Таким образом, для Dnmt3a-CD так же, как и для прокариотических МТаз реализуется механизм ингибирования, согласно которому остаток В стерически затрудняет взаимодействие каталитической петли фермента с малой бороздкой ДНК

Говоря о процессах, протекающих в клетке, наиболее интересным представляется рассмотреть повреждения (+)- и (^-трянс-антц-ВИР-Л^-сЮ-аддуктами неметилированного CpG-участка ДНК на стадии гаметогенеза или раннего эмбриогенеза, в течение которых происходит активное метилирование ДНК de novo МТазой Dnmtía Наши данные показывают, что вероятность метилирования МТазой Dnmtía такого участка будет в 3-4 раза меньше, чем в отсутствие повреждения, вне зависимости от типа образующегося стереоизомера Уменьшение метилирования будет наблюдаться и в случае образования (-)-транс-анти-В[а]Р-,\'2-(Ю-аддукта с 5'-конца от CpG-последовательности Следует отметить, что наблюдаемое 3-х - 4-х кратное снижение kcai является весьма существенным, поскольку за время жизни клетки Dnmt3a успевает сделать 24 ч*1,5 ч'1 -30 каталитических актов на немодифицировнной ДНК Таким образом, в дополнение к широко известному мутагенному действию В[а]Р на ДНК, проявляется эпигенетическая составляющая В[а]РОЕ-повреждений

выводы

1. С целью изучения влияния повреждения ДНК бензо[а]пирендиолэпоксидом на ее метилирование сконструированы ДНК-дуплексы, содержащие (+)- или {-)-транс-owwrn-BfaJP-A^-dG в различных положениях ДНК-субстрата и исследовано взаимодействие с ними прокариотических МТаз (Sssl и EcoRII) и МТаз млекопитающих (Dnmt3a-CD и Dnmt2).

2. На основании анализа констант диссоциации комплексов CpG-узнающих МТаз (Sssl, Dnmt3a-CD и Dnmt2) с В[я]Р-ДНК показано, что введение (+)- и (-)-транс-анти-B[a]P-A^-dG-ajwyKTOB в участок узнавания, либо с 5'-конца от него не оказывает влияния на связывание этих МТаз с ДНК. В случае M EcoRII (узнает CCViGG) замена каждого из G на аддукт ухудшала ее связывание с ДНК.

3. Введение (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-М2^0-аддукгя в ДНК приводит к ухудшению или блокированию ее метилирования МТазами Sssl, EcoRII и Dnmt3a-CD (уменьшаются км и ^ьст). Выявлены позиции в ДНК, введение в которые стереоизомерных В[а]Р-остатков особенно неблагоприятно для функционирования МТаз. Сделано предположение, что наблюдаемые эффекты обусловлены нарушением контактов каталитической петли МТаз с ДНК ввиду расположения объемного В[а]Р-остатка в малой бороздке двойной спирали.

4. Высказано предположение, что канцерогенное действие бензо[а]пирендиолэпоксида может быть связано не только с его мутагенными свойствами, но и со снижением уровня метилирования ДНК.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1) Subach О M, Khoroshaev A.V, Gerasimov DN , Baskunov V В. Shchyolkina A К , Giomova E.S. 2-Pyrimidinone as a probe for studying the EcoRII DNA methyltransferase-substrate interaction //Eur J.Biochem.,2004,v 271,p 2391-2399

2) Baskunov V В. Subach F.V., Kolbanovskiy A, Kolbanovskiy M., Eremin S.A., Johnson F, Bonala R, Geacintov N E, Gromova E S Effects of benzo[a]pyrene-deoxyguanosine lesions on DNA methylation catalyzed by EcoRII DNA methyltransferase and on DNA cleavage effected by EcoRII restriction endonuclease //Biochemistry, 2005, v 44, p. 1054-1066

3) Мальцева ДВ., Баскунов В.Б.. Громова E.C. Поляризация флуоресценции как метод исследования взаимодействия ДНК-метилтрансфераз с ДНК, содержащей остаток бензо[а]пирена. // 8-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» 17.05-21.05.2004, Пущино, 2004, Сборник тезисов, с 60-61

4) Мальцева Д, Баскунов В Взаимодействие ДНК-метилтрансферазы EcoRIT с ДНК, содержащей остаток бензо[а]пирена // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004», 12 04-15 04 2004, Сборник тезисов, стр 102.

5) Baskunov V . Maltseva D, Subach F, Kolbanovsliy A , Kolbanovsliy M, Geacintov N E, and Gromova E S Role of benzo[a]pyrene-dG substitution in the interaction of the EcoRII methyltransferase with DNA // 5-th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification,

04 09-08 09 2004, Bristol, UK, Abstracts, p 128

6) Gromova E S , Subach О M, Baskunov V В . Dariy M, Maltseva D V , Geacintov N E Impact of benzo[a]pyrene diol epoxide-DNA adducts on DNA methylation // 5-th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, 04 09-08 09 2004, Bristol, UK, Abstracts, p 150

7) Gromova E S , Subach О M, Baskunov V В . Dariy M, Aleksandrov D A , Maltseva D V, Geacintov N E Effect of DNA adducts derived from tumorigenic benzo[a]pyrene diol epoxides on DNA methylation // International Conference Chemical and Biological Problems of Proteomics,

05 07-09 07.2004, Novosibirsk, Russia, Abstracts, p. 51

Ло&М ЦТ?

2- 6 55 ?

Подписано в печать 24 марта 2006 г. Заказ 636 Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

Список сокращений

Введение

Глава 1. Метилтрансферазы млекопитающих - функциональные особенности 7 взаимодействия с ДНК (Обзор литературы)

1.1. CpG-островки, распределение неметилированных и метилированных остатков цитозина в геноме и профиль метилирования

1.2. Динамика метилирования генома

1.3. Механизм метилирования остатков цитозина в ДНК

1.4. ДНК-метилтрансферазы млекопитающих

1.4.1. Семейство Dnmt 1 19 Каталитическая активность Dnmtl

1.4.2. Семейство Dnmt2 21 Структура Dnmt2 22 Метилирование ДНК 23 Метилирование РНК

1.4.3. Семейство Dnmt3 25 Подсемейства Dnmt3a и Dnmt3b 26 Подсемейство Dnmt3L 28 Взаимодействие Dnmt3a, Dnmt3b и Dnmt3L с ДНК 28 Субстратная специфичность 30 Особенности связывания и метилирования ДНК 30 С-концевые домены Dnmt3a и Dnmt3b 32 Взаимодействие Dnmt3a и Dnmt3b с Dnmt3L 32 Мутантные формы Dnmt3a и Dnmt3b

Глава 2. Особенности взаимодействия С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз с ДНК 37 дуплексами, содержащими адцукты 2'-дезоксигуанозина с бензо[а]пирендиолэпоксидом (обсуждение результатов)

2.1. Дизайн субстратов и их модифицированных аналогов

2.2. Взаимодействие M.SssI с немодифицированными субстратами

2.3. Взаимодействие M.SssI с ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти

2.4. Взаимодействие M.EcoRII с ДНК, содержащей

- и (-)-транс-анти-В[а]Р-Ы2-<Ю

2.5. Взаимодействие Dnmt3a-CD с немодифицированными субстратами

2.6. Взаимодействие Dnmt3a-CD с ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-A^ -dG.

2.7. Связывание Dnmt2 с ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-N -dG.

2.8. Роль кофактора в устойчивости комплекса МТаз с немодифицированной ДНК

Метилирование ДНК является природной эпигенетической модификацией генома и играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов. Метилирование ДНК осуществляется ДНК-метилтрансферазами (МТазами), использующими в качестве донора метальной группы кофактор, .^-аденозил-Ь-метионин (AdoMet); AdoMet при этом превращается в £-аденозил-Ь-гомоцистеин (AdoHcy). В эукариотах метилирование происходит по атому углерода С5 остатков цитозина преимущественно в CpG-последовательностях. Распределение метилированных и неметилированных CpG-последовательностей в геноме формирует профиль метилирования, нарушение которого приводит к онкогенезу.

Полициклические ароматические углеводороды, к числу которых относится бензо[я]пирен (В[а]Р), являются широко распространенными загрязнителями окружающей среды. В организмах, подверженных воздействию В[а]Р, отмечено образование множественных мутаций и возникновение рака. Основными метаболитами В[а]Р являются диолэпоксиды - (+) и (-) 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10 тетрагидробензо[а]пирены (B[a]PDE), способные образовывать ковалентные аддукты с ДНК. Присоединение преимущественно происходит по аминогруппе гуанина с образованием (+)- и (-)-/я/?анс-ш/?ш-В[а]Р-Л^О-аддуктов. Репарация таких аддуктор в эукариотах происходит с низкой эффективностью, поэтому остатки В[а]Р, ковалентно присоединенные к ДНК, могут вызывать нарушение взаимодействия ферментов клеточного аппарата, в том числе МТаз, с ДНК.

Большое количество повреждений, вызванных B[a]PDE, приходится на CpG-последовательности, в особенности, если остаток цитозина в них метилирован. В ранних работах показано, что статистическая обработка B[a]PDE эукариотических клеток приводила к снижению общего уровня метилирования генома [2]. Неясными остаются молекулярные механизмы взаимодействия стереоизомерных B[a]P-iV2-dG-аддуктов с МТазами млекопитающих.

МТазы млекопитающих являются малоизученными ферментами. Показано, что их первичные структуры в С-концевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5-МТаз, которые изучены более подробно. В связи с этим, прокариотические МТазы могут быть использованы как модельные системы эукариотических аналогов.

В качестве модельных прокариотических МТаз в настоящей работе были использованы МТазы SssI (M.SssI) из Spiroplasma и EcoRII (M.EcoRII) из E.coli. M.SssI и M.EcoRII узнают в ДНК последовательности CpG и CCT/AGG, соответственно, и метилируют в них остатки цитозина (подчеркнуты) по атому углерода в 5-ом положении. Выбор данных МТаз продиктован их сайт-специфичностью, поскольку в эукариотах метилированные остатки цитозина обнаружены как CpG-, так и в меньшей степени, в СрА/т- и ССА/тОО-последовательностях. Кроме того, объектами исследования были ставшие доступными в процессе выполнения работы МТазы млекопитающих: каталитический домен Dnmt3a мыши (Dnmt3a-CD) и Dnmt2 человека.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния введения в ДНК канцерогенных (+)- и (-Э-трш/с-аятм-ВИР-Л^-сЮ-аддуктов на функционирование С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, узнающих последовательности CpG и cct/agg.

В работе решались следующие задачи: 1) конструирование ДНК-дуплексов, содержащих (+)- и (-)-mpanc-aHmu-B[a]P-N2-dG в различных позициях ДНК-субстрата;

2) определение влияния стереоизомерии аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии каталитического цикла прокариотических МТаз SssI и EcoRII и каталитического домена МТазы мыши Dnmt3a.

выводы

1. С целью изучения влияния повреждения ДНК бензо[а]пирендиолэпоксидом на ее метилирование сконструированы ДНК-дуплексы, содержащие (+)- или (-)-mpaHC-aHmu-B[a]P-N2-dG в различных положениях ДНК-субстрата и исследовано взаимодействие с ними прокариотических МТаз (SssI и EcoRII) и МТаз млекопитающих (Dnmt3a-CD и Dnmt2).

2. На основании анализа констант диссоциации комплексов CpG-узнающих МТаз (SssI, Dnmt3a-CD и Dnmt2) с В[а]Р-ДНК показано, что введение (+)- и (-)

•у транс-анти-В[а\P-N -dG-аддуктов в участок узнавания, либо с 5'-конца от него не оказывает влияния на связывание этих МТаз с ДНК. В случае M.EcoRII (узнает CCA/TGG) замена каждого из G на аддукт ухудшала ее связывание с ДНК.

3. Введение (+)- и (-)-транс-анти-В[а\Р-И2-6С-а}щукта в ДНК приводит к ухудшению или блокированию ее метилирования МТазами SssI, EcoRII и Dnmt3a-CD (уменьшаются кса1 и £-chem). Выявлены позиции в ДНК, введение в которые стереоизомерных В[а]Р-остатков особенно неблагоприятно для функционирования МТаз. Сделано предположение, что наблюдаемые эффекты обусловлены нарушением контактов каталитической петли МТаз с ДНК ввиду расположения объемного В[а]Р-остатка в малой бороздке двойной спирали.

4. Высказано предположение, что канцерогенное действие бензо[а]пирендиолэпоксида может быть связано не только с его мутагенными свойствами, но и со снижением уровня метилирования ДНК.

Заключение

Интересным представляется сравнить влияние введения (+)- и (-)-транс-анти-B[a]P-iV2-dG-aflflyKTOB в ДНК на функционирование рассмотренных МТаз. В случае МТаз, узнающих CpG, введение в состав ДНК остатка В[а]Р не приводит к ухудшению связывания. МТаза EcoRII, узнающая более протяженную нуклеотидную последовательность, менее эффективно связывает ДНК, содержащую В в участке узнавания. Аналогичные результаты были получены в нашей лаборатории для другой С5 МТазы - M.Hhal, сродство которой к ДНК, содержащей аддукты в участке узнавания (GCGC) снижалось в 3-100 раз. Наши результаты позволяют предположить, что объемный канцерогенный остаток нарушает образование сиквенс-специфических контактов со стороны малой бороздки только в случае МТаз, узнающих более протяженные последовательности, чем CpG.

Влияние В[я]РБЕ-повреждений на метилтрансферазную активную активность для всех МТаз в целом одинаково - при определенной локализации стереоизомерных аддуктов наблюдалось значительное ухудшение или блокирование метилирования. Таким образом, для Dnmt3a-CD так же, как и для прокариотических МТаз реализуется механизм ингибирования, согласно которому остаток В стерически затрудняет взаимодействие каталитической петли фермента с малой бороздкой ДНК. Сравним влияние введения (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-Л^-сЮ в ДНК на ее метилирование двумя CpG-узнающими МТазами: SssI и Dnmt3a-CD. В случае M.SssI нарушение метилирования наблюдалось при локализации аддукта с 5'-конца от метилируемого остатка цитозина, либо напротив него. В случае Dnmt3a-CD влияние локализации аддукта на метилирование несколько иное - нарушение метилирования происходит большей частью в дуплексах, содержащих аддукт с 3'-конца от метилируемого остатка цитозина. Такое различие в эффеетах может быть связано с возможными различными ориентациями каталитических петель M.SssI и Dnmt3a-CD относительно участка узнавания. Согласно данным футпринтинга M.SssI, фермент со стороны малой бороздки ДНК образует не задействованные в сиквенс-специфическом узнавании контакты с позициями -1 и -2 с 5'-конца N^N.jCG последовательности [119]. Компьютерное моделирование комплекса M.SssI-ДНК-AdoHcy также показывает, что каталитическая петля взаимодействует с нуклеозидным остатком, расположенным с 5'-конца CpG-последовательности. В случае Dnmt3a-CD можно сделать предположение о том, что каталитическая петля образует контакты непосредственно в районе участка узнавания.

В ранних работах [2, 144, 145] статистическая обработка эукариотических клеток бензо[д]пиреном также приводила к гипометилированию ДНК. Однако оставалось непонятным функционирование каких МТаз (de novo или поддерживающих) было нарушено, какова степень и механизм их ингибирования, а также каково влияние стереизомерии канцерогенного аддукта и его локализации на метилирование. На основании данных, полученных в настоящей работе, наиболее интересным представляется рассмотреть повреждения (+)- и (-)-mpanc-anmu-B[a]P-N2-dG-aflflyicraMH неметилированного CpG-участка ДНК на стадии гаметогенеза или раннего эмбриогенеза, в течение которых происходит активное метилирование ДНК de novo МТазой Dnmt3a. Наши данные показывают, что вероятность метилирования МТазой Dnmt3a такого участка будет в 3-4 раза меньше, чем в отсутствие повреждения, вне зависимости от типа образующегося стереоизомера. Уменьшение метилирования будет наблюдаться и в случае образования (-)-транс-анти-В[а]Р-М2-dG-аддукта с 5'-конца от CpG-последовательности. Следует отметить, что наблюдаемое 3-х - 4-х кратное снижение kcat является весьма существенным, поскольку за время жизни клетки Dnmt3a успевает сделать 24 ч*1,5 ч"1 ~30

66 каталитических актов на немодифицировнной ДНК. Таким образом, в дополнение к широко известному мутагенному действию В[я]Р на ДНК, проявляется эпигенетическая составляющая В[я]РОЕ-повреждений.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

Синтез олигонуклеотидов. Немодифицированные олигонуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие флуоресцентный краситель 5(6)-карбоксифлуоресцеин (FAM), ковалентно присоединенный через аминолинкер -(CH2)6-NH- к 5'-концевой фосфатной группе олигонуклеотида, являются коммерческими препаратами (ЗАО "Синтол" (Москва, Россия) и IDT (Нью-Йорк, США). Олигонуклеотиды, содержащие рацемическую смесь (+)- и (-)-диастереомеров остатка транс-анти-B[a]P--/V2-dG синтезированы с помощью автоматического амидофосфитного метода синтеза олигонуклеотидов в лаборатории Н.Э. Геацинтова (Нью-йоркский университет, Ныо-йорк, США). Рацемический 5'-O-DMTr-З '-О-амидофосфит был получен в соответствии с [136].

Олигонуклеотиды 5'-GAGCCAAGMB"CACTCTGA и 5'-GAGCCAAGMB+CACTCTGA получены метилированием дуплексов GCB7CGM и GCB+/CGM МТазой SssI. Дуплексы GCB7CGM и GCB+/CGM получали отжигом смеси олигонуклеотидных цепей 5'GAGCCAAGCB'CACTCTGA (5'GAGCCAAGCB+CACTCTGA) (2.5 нмоль) и 5'-TCAGAGTGMGCTTGGCTC (2.6 нмоль) в 440 мкл буфера А. Полученные дуплексы (3.1 мкМ) метилировались M.SssI (17 нМ) в буфере Б, содержащем AdoMet (160 мкМ) в течение 1 часа. Затем добавляли новую аликвоту M.SssI (17 нМ) и инкубировали реакцию в течение 2 часов. Реакцию останавливали добавлением AcONa (0.3 М), ЭДТА (1 мМ) и смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (300 мл) с последующей экстракцией водной фазы. Разделение цепей дуплексов проводилось в денатурирующем 20%-ПААГ. Масс-спектрометрический (MALDI-TOF) анализ показал, что массы полученных олигонуклеотидов (5'-GAGCCAAGMB"CACTCTGA и 5'-GAGCCAAGMB+C ACTCTGA) на 14 а.е.м. больше, чем массы исходных олигонуклеотидов (5'-GAGCCAAGCB'CACTCTGA и 5'

GAGCCAAGCB+CACTCTGA). Сигналы, соответствующие исходным олигонуклеотидам в продукте метилирования отсутствовали. В качестве дополнительного доказательства метилирования всех остатков цитозина в составе полученных цепей были получены дуплексы GAGCCAAGMBCACTCTGA/5'

TCAGAGTGMGCTTGGCTC. Мы не наблюдали переноса метальной группы на эти дуплексы M.SssI с [CH3-3H]-AdoMet, что свидетельствует о том, что модифицированная олигонуклеотидная цепь не содержит в участке CpG неметилированных остатков цитозина.

Ферменты: Т4-полинуклеотидкиназа (10 тыс. ед.акт./мл, MBI "Fermentas", Литва или "Синтол", Россия), нуклеаза Р1 из Penicillium citrinum ("Sigma", США, 1 мг/мл, 389 ед.акт./мл) и фосфодиэстераза змеиного яда типа I из Crotalus adamanteus Venom ("Pharmacia Biotech", Швеция, 1 мг/мл, 19.5 ед.акт./мл).

Плазмиды: Плазмида pQEMet2, содержащая ген ecoRIIM, кодирующий M.EcoRII, была ранее получена в нашей лаборатории Бабкиной О.В. [136]. Плазмида для экспрессии рекомбинантной M.SssI (M.SssI/nH) была сконструирована Друцей B.JI. Клетки E.coli штамма ER1821 для экспрессии M.SssI любезно предоставлены фирмой New England BioLabs. Плазмиды рЕТ28а, содержащие ген dnmt2 человека или dnmt3a-cd мыши, были любезно предоставлены профессором А. Елшем (Германия). Реактивы: изопропилтио-Р-О-галактозид (ИПТГ) (Research Organics Inc); 2-меркаптоэтанол (МЭ), персульфат аммония и этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (Merck, ФРГ); формамид (Fluka, Швейцария); трис-(гидроксиметил)-аминометан, акриламид, Ы,Ы'-метилен-бисакриламид, мочевина, додецилсульфат натрия (ДДС) и глицин (ДиаЭм, Россия); красители - маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (КЦ) (NEB, Англия); Ы,Ы,Ы',Ы'-тетраметилэтилендиамин, 1,4-дитиотреитол (ДТТ), маркеры молекулярной массы белков, глицерин; (у-32Р)-АТФ (1000 Ku/ммоль) производства ВО «Изотоп», Обнинск, Россия; ледяная уксусная и муравьиная кислоты (ООО «Авогадро», Россия); бычий сывороточный альбумин (БСА) (Biomed, Польша); бикарбонат аммония, гуанидингидрохлорид (Gua-HCl), тритон Х-100, фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), имидазол. ИПТГ (Research Organics Inc, США), бактотриптон, дрожжевой экстракт и бактоагар (Difco, США); смола TALON для металлоаффинной хроматографии (Clontech, США), 2-меркаптоэтанол (Merck, Германия), AdoMet и AdoHcy (Sigma, США), лейпептин (MP Biomedicals, США), пепстатин A (Serva, Германия); [3H-CH3]-AdoMet (77 Ku/ммоль) (Amersham Biosciences, США).

Буферные растворы:

A) 10 мМ Tris-HCl, рН 7.9, 50 мМ NaCl;

Б) 10 мМ Tris-HCl, рН 7.9, 50 мМ NaCl; 1 мМ DTT;

B) 50 мМ Tris-борат, рН 8.3, 1 мМ ЭДТА; Г) 25 мМ Tris-борат, рН 8.3, 0.5 мМ ЭДТА; Д) 125 мМ Tris-HCl, рН 6.8;

Е) 375 мМ Tris-HCl, рН 8.8;

Ж) 62.5 мМ Трис-HCl, рН 6.8, 3% ДСН, 5% МЭ, 8 М мочевина, 5% глицерин, 0.1% ВРВ;

3) 20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 100 мМ NaCl, 7 мМ МЭ, 0.01% тритон Х-100, 5 % глицерин, 17 мкг/мл ФМСФ

И) 50 мМ NaH2P04, рН 6.0, 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, 0.1% тритон Х-100, 10 мМ с

МЭ);

К) 20 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 0.2 мМ ЭДТА, 2 мМ дитиотреитол, 5%-ный (об/об) глицерин;

Л) 50 мМ Tris-HCl, рН 9.0, 5 мМ ДТТ, 10 мМ MgCl2, 1 мМ спермидин; М) 50 mM NaCl, 6% глицерин, 1 мМ AdoHcy;

Н) 10 мМ Трис-HCl, рН 7.6, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 0,1 мг/мл БСА;

О) 10 мМ Tris-HCl, рН 7.9, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 8 % глицерин, 0,1 мг/мл БСА; П) 20 мМ HEPES, рН 7.0, 100 мМ КС1, 1 мМ ЭДТА, 0.2 мМ DTT;

Используемые кислоты, щелочи, соли и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации "о.с.ч." или "х.ч.".

3.2. Приборы и методы Оптические измерения проводили в кварцевых кюветах (длина оптического пути 1 см) фирмы "Pye unicam" (Англия) и "Hellma" (ФРГ). Молярные коэффициенты экстинкции одноцепочечных олигонуклеотидов с общей формулой DpEpFpC.KpL и длиной п расчитывали с точностью 10% по формуле: s^lpFpC KpL=[2*(eDpE+ eEpF + eFpC +

• •• + Ekpl) - Ее - Ef - Ее - ••• - Ек]/п. £^=15.4 о.е./мкмоль, s™c=lA о.е./мкмоль, s2^a =11.5 о.е./мкмоль, е2<£- =8.7 о.е./мкмоль, ^^,=13.7 о.е./мкмоль, 0.6 о.е./мкмоль, ff^jc=12.5 о.е./мкмоль, sff^^lA о.е./мкмоль, ^"^=10.6 о.е./мкмоль, s™pJC=7.3 о.е./мкмоль, £"^=9.0 о.е./мкмоль, s^>Jr=7.6 о.е./мкмоль, £^£^=12.6 о.е./мкмоль, sdG,Hic=%-% о.е./мкмоль, £^g=10.8 о.е./мкмоль, е^д.=10.0 о.е./мкмоль, s2^xlA=\\.7 о.е./мкмоль, e™pJC= 8.1 о.е./мкмоль, е^°хЮ=9.5 о.е./мкмоль, s%£l/r=8.4 о.е./мкмоль. В случае модифицированных олигонуклеотидов s260 вычисляли как сумму е260 немодифицированной цепи и =20.96 о.е./мкмоль, или elfDE=l4.5 о.е./мкмоль. Спектры поглощения водных растворов олигонуклеотидов в УФ-области записывали на спектрофотометре "Hitachi", Model 150-20 (Япония) при комнатной температуре. Концентрацию нуклеотидного материала определяли спектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера.

Температурную зависимость УФ-поглощения олигонуклеотидных смесей измеряли на спекторофотометре "Hitachi" (Япония), оснащенным температурным контроллером "SPR-10". ДНК-дуплексы получали смешением эквимолярных количеств соответствующих олигонуклеотидов (0,5 мкМ) в буфере А, нагреванием полученной смеси до 80 °С и медленным охлаждением до комнатной температуры. Измерение зависимости УФ-поглощения олигонуклеотидных смесей от температуры проводили в закрытой кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см, в объеме 130 мкл. К раствору дуплексов добавляли 150 мкл минерального масла для предотвращения испарения воды. Температуру увеличивали от 20 до 80°С со скоростью 0,5 град/мин. Температуру плавления находили по максимальному значению полученной в результате дифференцирования экспериментальных данных кривой.

Обессоливание олигонуклеотидов проводили на картриджах Sep-Pak С18 (Waters) или в носике для пипетмана ZipTip С18, Р10 (Millipore).

КД-спектры ДНК-дуплексов снимали в буфере А (Сднк 1-2 мкМ), используя дихрограф Roussel-Jouan III (Франция).

Масс-спектры ДНК-дуплексов снимали, используя масс-спектрометры Bruker Daltonics OmniFlex или Reflex IV MALDITOF MS (Bruker, Billerica, MA).

Измерения поляризации флуоресценции проводили при 25°С на приборе Beacon 2000 Fluorescence Polarization System (PanVera, США). Длина волны возбуждающего света составляла 488 нМ, регистрация сигнала испускаемого света происходила при 535 нМ. Реакции и детектирование сигнала проводились в пробирках из боросиликатного стекла. Поляризация флуоресценции (Р) определялась как отношение разности вертикальной (Iv) и горизонтальной (Ih) составляющих о (Л-л) испускаемого света к их сумме: Р = ^—j4j.

Препаративное микроцентрифугирование проводили на микроцентрифуге "Eppendorf-5414S" (Германия). Для упаривания микроколичеств водных растворов, а также для удаления следовых количеств этанола и ацетона использовали прибор Speed Vac (США). Микрообъемы растворов дозировали микрошприцами фирмы Hamilton (США) и автоматическими дозаторами фирмы Gilson (Франция) с точностью 5%.

Ультрацентрифугирование проводили с использованием ультрацентрифуги фирмы Beckman (США). рН растворов измеряли на потенциометре Model 701А фирмы Orion (США) с точностью до 0.005 рН.

Электрофорез а) Электрофорез синтетических олигонуклеотидов и реакционных смесей после кинирования олигонуклеотидов, после метилирования дуплексов GCB7CGM и GCB7CGM с целью получения олигонуклеотидов 5'-GAGCCAAGMB'CACTCTGА и 5'-GAGCCAAGMB+CACTCTGA проводили при 25°С, в плоском 20%-ном ПААГ (20% акриламида, 0.66% N,N'-метиленбисакриламида, 8 М мочевина в буфере В толщиной 0.75 мм при напряженности поля 50 В/см. Пробы наносили в 4-14 мкл 80%-ного водного раствора формамида, содержащего красители-маркеры КЦ (0.1%) и ВРВ (0.1%). б) Электрофорез ДНК-дуплексов и комплексов M.EcoRII или M.SssI с синтетическими субстратами в неденатурирующих условиях (метод "торможения в геле") проводили при 5°С, в плоском 8%-ном ПААГ (8% акриламида, 0.4% Ы,Ы'-метиленбисакриламида в буфере Г) толщиной 0.75 мм при напряженности поля 8.5 В/см. Пробы наносили в объеме 10-30 мкл. в) Электрофорез M.EcoRII, M.SssI, Dnmt3a-Cd и Dnmt2 проводили в плоском (20x20x0.075 см) ПААГ по Леммли. Концентрирующий гель: 4% акриламид, 0.104% Ы,Ы'-метиленбисакриламид, 0.1% ДСН в буфере Д; разделяющий гель: -12.5% акриламид, 0.33% Ы,Ы'-метиленбисакриламид, 0.1% ДДС в буфере Е. Пробы наносили в 5-12 мкл буфера Ж.

Перед прокрашиванием геля Кумасси R-250, гель вымачивали в фиксирующем растворе (СНзС00Н:С2Н50Н:Н20=1:2:2) в течение 10 мин, затем в растворе Кумасси R-250 (СНзСООН: С2Н50Н:Н20= 1:3:6 и 0.75 г Кумасси R-250) в течение 30 мин. Гель отмывали 10%-ным раствором СН3СООН до обесцвечивания фона. Гели сушили на приборе Gel Slab Dryer фирмы Hoefer Scientific Instruments (США).

Для полимеризации всех акриламидных гелей к соответствующим растворам добавляли персульфат аммония и Ы,Ы,Ы',Ы'-тетраметилэтилендиамин.

Положение 32Р-меченных соединений определяли авторадиографией или с помощью Phosphorlmager. Для авторадиографии использовали рентгенографическую пленку Retina Х-100 (ФРГ). Определялись радиоактивности зон ДНК-белкового комплекса (cpmbound) и несвязанной ДНК (cpmfree).

Радиоактивность 32Р-меченных препаратов измеряли методом счета по Черенкову на счетчике Delta 300 фирмы Тгасог (Нидерланды) или после регистрации радиоактивности- на приборе Phosphorlmager обсчитывали с помощью программы ImageQuant5.2. Ошибка счета не превышала 2%.

Радиоактивность 3Н-меченных препаратов измеряли методами жидко-сцинтиляционного счета, в импульсах в минуту, на счетчике Analytic Тгасог Delta 300 фирмы ThermoQuest/CE Instruments (США). Для измерения гетерогенного счета 3Н-меченных препаратов, сорбированных на DE81 фильтрах, к пробе добавляли 5 мл сцинтилятора ЖС106. Ошибка счета не превышала 2%.

3.3. Общие методики

3.3.1. Выделение M.EcoRII

Препаративное выделение метилтрансферазы EcoRII, содержащей шесть остатков гистидина на N-конце, проводили по методике отработанной О.В. Кирсановой в нашей лаборатории. "Ночные культуры" E.coli JM109, трансформированные плазмидой pQEMet2 растили в среде LB с ампициллином (0.15 мг/мл), разбавляли в 20 раз средой LB с тем же антибиотиком и растили клетки при 37°С, 200 об/мин, 3 ч до оптической плотности раствора 0.6-0.7 OD550. Транскрипцию гена qcoRIIMиндуцировали ИПТГ (1 мМ). Экспрессию проводили около 3 ч при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием при 4 тыс. об./мин в течение 15 мин, суспендировали в буфере 3, добавляли 1000-кратный раствор ФМСФ в этаноле (17 мг/мл), и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора с частотой 22 кГц. После посадки M.EcoRII на колонку с Ni-NTA-агарозой, колонку промывали буфером И, 50 мМ имидазолом в буфере И. Белок смывали 400 мМ имидазолом в буфере И. Затем проводили диализ при 5°С в течение ночи напротив буфера К, добавляли один объем глицерина и хранили при -20°С.

3.3.2. Выделение M.SssI/nH

10 мл «ночной культуры» E.coli ER1821 с плазмидой pCAL/nH (или мутантными плазмидами) в среде LB с ампициллином (0.15 мг/мл) разбавляли в 50 раз средой LB с тем же антибиотиком. Выращивали при 37°С с интенсивной аэрацией в течение ~3 ч до мутности 0.6 OD550, после этого проводили индукцию ИПТГ (1 мМ) и растили клетки еще около 4 ч при 37°С. Клетки собирали центрифугированием и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора в 5 мл буфера И с добавлением ингибиторов протеиназ: фенилметансульфонилфторида (17 мкг/мл), лейпептина (5 мкг/мл) и пепстатина А (1 мкг/мл). Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4°С на микроцентрифуге. Все стадии выделения белка проводили при 4°С. л .

Супернатант пропускали через колонку с 650 мкл Со -содержащей смолы TALON для аффинной хроматографии. Колонку промывали последовательно 5 мл буфера И, затем 4 мл 10 мМ и 2 мл 20 мМ раствора имидазола в буфере И. Белок элюировали 1 мл 150 мМ раствора имидазола в буфере И и хранили при -20°С.

При выделении больших количеств МТазы проводили диализ против буфера К при 4°С в течение ночи, добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и БСА до концентрации 200 мкг/мл.

3.3.3. Выделение Dnmt2 и Dnmt3a-CD

Экспрессию Dnmt2 и CD-Dnmt3a содержащих кластер His6 на N-конце белка проводили в трансформированном плазмидой штамме E.coli BL21 Rosetta(DE3) (Novagen). Выделение белков проводилось по взятой за основу методике [107]. Повышение уровня экспрессии было достигнуто за счет выращивания клеток в среде LB с канамицином при 32°С с интенсивной аэрацией до мутности 0.7 OD600 и увеличением времени индукции транскрипции генов dnmt2 и cd-dnmt3a (1 мМ ИПТГ) до 3 ч. Клетки собирали центрифугированием и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора в 5 мл буфера И с добавлением ингибиторов протеиназ, как в случае выделений M.SssI. Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4°С на микроцентрифуге. Все стадии выделения белка проводили при 4°С. Супернатант пропускали через колонку с 500 мкл Ni-NTA агарозы для аффинной хроматографии. Колонку промывали последовательно 5 мл буфера И, затем 4 мл 10 мМ и 2 мл 20 мМ раствора имидазола в буфере И. Белок элюировали 1 мл 150 мМ раствора имидазола в буфере И и хранили при -20°С.

Проводили диализ против буфера К при 4°С в течение ночи, добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и БСА до концентрации 200 мкг/мл.

3.3.4.5'-Фосфорилирование олигонуклеотидов

5'-32Р-фосфорилирование олигонуклеотидов (~60 пмоль) Т4-полинуклеотидкиназой (5-10 ед.акт.) проводили в течение 60 мин при 37°С в 10 мкл буфера JI, содержащего (у-32Р)-АТФ. Киназу денатурировали нагреванием до 95 °С в течение 5 мин. Кинированные олигонуклеотиды выделяли методом гель-электрофореза.

3.3.5. Выделение олигонуклеотидов из геля

Часть олигонуклеотидов элюировали из геля 1 М водным раствором перхлората лития в течение 16 часов при 5°С, затем осаждали 80%-ным ацетоном (2 раза), осадок центрифугировали, промывали ацетоном и высушивали на приборе "SpeedVac" (США).

Часть олигонуклеотидов элюировали из геля 0.6 М водным раствором ацетата натрия в течение 16 часов при 5°С, затем осаждали 77%-ным этанолом, осадок центрифугировали, промывали 80%-ным этанолом и высушивали.

3.3.6. Разделение (-)- и (+)-диастереомеров олигонуклеотидов, содержащих остаток (+,-)-mpanc-anmu-B[a]P-N2-dG

Каждая из пар диастереомеров олигонуклеотидов 5'-GAGCCAACCTB+GCTCTGA и 5 '-GAGCCAACCTB'GCTCTGA; 5' GAGCCAAB" CGCACTCTGA и 5' GAGCCAAB+CGCACTCTGA; 5' GAGCCAAGCB'CACTCTGA и 5' GAGCCAAGCB+CACTCTGA была разделена с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, при 60 °С, на колонке X Terra (Waters) с сорбентом С18.

Смесь олигонуклеотидов 5'-GAGCCAACCTGB"CTCTGA и 5'-GAGCCAACCTGB+CTCTGA смешивали с эквимолярным количеством комплементарного олигонуклеотида 5'-TCAGAGCCAGGTTGGCTC в буфере А, нагревали до 70°С с последующим охлаждением до 5°С в течение нескольких часов для получения смеси ДНК-дуплексов TB'G/ACC и TB+G/ACC. Затем смесь ДНК-дуплексов TB'G/ACC и TB+G/ACC разделяли в неденатурирующем ПААГ. Немодифицированный олигонуклеотид отделяли от модифицированных олигонуклеотидов в денатурирующем ПААГ.

Конфигурацию диастереомеров определяли из КД-спектров олигонуклеотидов.

3.3.7. Определение концентраций активных молекул M.EcoRII по Скетчарду M.EcoRII (20 нМ белковая концентрация, определенная по Брэдфорду) и и AdoHcy (1 мМ) инкубировали в присутствии 32Р-меченного ДНК-дуплекса 5'

GCCAACCTGGCTCT/3'-CGGTTGGACCGAGA (1-50 нМ) в буфере М в течение 15 минут при комнатной температуре и 10 минут при 0°С. Белково-нуклеиновые комплексы анализировались в неденатурирующем 8% ПААГ. Определялись радиоактивности зон комплекса M.EcoRII-DNA(cpmb0und) и несвязанной ДНК (cpmfree). Рассчитывалось отношение (cpmbound)/(cpmfree) и концентрация связанной ДНК ([S0](cpmbound)/(cpmbound+cpmfree)). Строилась зависимость (cpmbound)/(cpmfree) от концентрации связанной ДНК. Концентрация активных молекул M.EcoRII определялась из пересечения полученной зависимости с осью концентраций связанной

3.3.8. Определение концентраций активных молекул M.EcoRII, M.SssI, Dnmt2 и Dnmt3a-CD с помощью поляризации флуоресценции

FAM-меченный ДНК-дуплекс TGG/ACC, либо GCG/CGC (50 нМ) и AdoHcy (0.1 мМ) инкубировали в 500 мкл буфера Б и через ~30 сек регистрировали знаяение поляризации флуоресценции ДНК-дуплекса в отсутствие фермента (Р0). Затем добавляли к смеси аликвоты фермента так, чтобы после каждой добавки концентрация фермента в смеси увеличивалась на 20 нМ (до конечной концентрации 460 нМ), каждый раз измеряя значение поляризации флуоресценции. Строили график зависимости Р от общей концентрации фермента и по характерному излому на полученной зависимости определяли концентрацию активных молекул фермента.

3.3.9. Определение Кл комплексов M.EcoRII с ДНК методом прямого титрования фиксированного количества ДНК различными аликвотами фермента

M.EcoRII (5-100 нМ) и AdoHcy (0.1 мМ) инкубировали с 32Р-меченными ДНК TGG/ACC, TB'G/ACC, TB+G/ACC, TGB7ACC или TGB+/ACC (10 нМ) в буфере Н в течение 5 мин при 37°С, затем 15 мин во льду. После электрофоретического разделения (условия см. выше) проводили радиоавтографию геля. Рассчет Kd проводился по уравнению (3):

ДНК. cpm bounJ + срт frce) [50 ] 2[50 ]

CP= ДО] = А

Е0]+ КГ -#0]+К]+^7)2-4-[£о]-[5О]) (3) где [S]0, [Е]0 - общие концентрации 32Р-меченной ДНК и M.EcoRII, соответственно.

3.3.10. Определение Кй комплексов M.EcoRII с ДНК методом конкурентного вытеснения дуплекса из предварительно полученного комплекса с ферментом добавлением к комплексу ДНК-конкурента

FAM-меченный ДНК-дуплекс TGG/ACC (50 нМ) инкубировали с M.EcoRII (30 нМ) и AdoHcy (0.1 мМ) в 500 мкл буфера Н. Измеряли значение поляризации флуоресценции образовавшегося комплекса. К полученному комплексу добавляли аликвоты (1-2 мкл) ДНК-дуплексов TB'G/ACC, TB+G/ACC, TGB7ACC или TGB+/ACC и измеряли значение поляризации флуоресценции. Концентрации модифицированной ДНК варьировали от 35 до 850 нМ. Рассчет К& проводился по уравнению (4):

Р = Р0 + (Р™ХС f°V. +№о + Р1о

4^0 J Л2

С^Г. +^-[С]0+[Е]0 +[S]0)2 -4[S]0[£]0 2 (4) где Р0 и Ртах - значения поляризации флуоресценции свободной и полностью связанной FAM-меченной ДНК; [S]0, [С]0 и [Е]0 - общие концентрации FAM-меченной канонической, немеченой В[а]Р-ДНК и M.EcoRII.

3.3.11. Определение Кй комплексов M.SssI с ДНК) методом конкурентного равновесного связывания двух различных ДНК (модифицированной и немодифицированной

К смеси, содержащей 100 нМ 32Р-меченного дуплекса GCG/CGC, GCG/CGM или

GMG/CGC, 0-650 нМ одного из немеченых ДНК-дуплексов BCG/CGC, GCB /CGC, t

BCG/CGM, GCB/CGM или GMB/CGC и 1 мМ AdoHcy в буфере О, добавляли 50 нМ M.SssI. Реакционную смесь инкубировали 5 мин при 25°С, 5 мин при 0°С. После электрофоретического разделения проводили авторадиографию геля. Отношения констант диссоциации комплексов M.SssI с немодифицированным дуплексом и с В[а]Р-ДНК-дуплексом рассчитывали методом нелинейной регрессии по уравнению

5).

FS] {[S]0 +[Е]0 +М[С]0 -[E]0)-V[([S]0 +[Е]0 +*([С]0 ~[Е]0))2 -4[S]0[E]0(1-A)J}

5)

Я 2[S]0(1-*) где [S]0, [С]0 и [Е]о - общие концентрации 32Р-меченной канонической, немеченой В[а]Р- ДНК и M.SssI, соответственно; к=Каг/Ка, где KdT и Kd - константы диссоциации комплексов M.SssI-AdoHcy-(32P-меченная немодифицированная ДНК) и M.SssI-AdoHcy-( В[я]Р- ДНК), соответственно.

3.3.12. Определение Кй комплексов Dnmt2 и Dnmt3a-CD с ДНК методом прямого титрования фиксированного количества ДНК различными аликвотами фермента

FAM-меченный ДНК-дуплекс GCG/CGC, GCG/CGM, GMG/CGC, BCG/CGC, GCB/CGC, BCG/CGM, GCB/CGM или GMB/CGC (5 нМ) и AdoHcy (0.1 мМ) инкубировали в 500 мкл буфера П и регистрировали Р0. Затем добавляли аликвоты МТазы (Dnmt2 и Dnmt3a-CD) и измеряли поляризацию флуоресценции. Строили зависимость Р от концентрации активной формы фермента, из которой далее рассчитывали Kd комплекса MTa3a-AdoHcy-,flHK методом нелинейной регрессии по уравнению (6):

Р = Ро + P2[S] ([S]° + [Е]о +Kj~#]o+[£]o+*J-4-[£]o-[S]o), (6) где Р0 и Ртах - значения поляризации флуоресценции свободной и полностью связанной FAM-меченной ДНК; [Е]0 и [S]0 - общие концентрации Dnmt2 (или Dnmt3a-CD) и ДНК-дуплекса.

3.3.13. Метилирование ДНК в стационарных условиях

Эффективность метилирования определялась по введению тритиевой метки (3Н-СН3) в состав олигонуклеотидных дуплексов. ДНК-дуплексы (1-2 мкМ) инкубировали с МТазой (10-100 нМ) в буфере Б, Н или П в присутствии [3Н-СН3]AdoMet (1.3-2.5 мкМ) при 37°С. Реакцию инициировали добавлением фермента. Через интервалы времени из реакционной смеси отбирали аликвоту 4.9 мкл и наносили на фильтр DE81 (Whatman). Далее фильтры четыре раза промывали 50 мМ КН2Р04 и один раз водой, высушивали, помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и определяли радиоактивность [126]. Количество метилированных молекул ДНК рассчитывали согласно [146]. Строили зависимость концентрации метилированных ДНК от времени (рис. 4), по тангенсу угла наклона которой определяли начальную скорость реакции метилирования (V0). В условиях насыщения по субстратам принимали, что Vo= Vmax-Значение kcal рассчитывали согласно уравнению 7: cat= Vmax/E0(7) где E0 - концентрация фермента с реакционной смеси. 3.3.13. Метилирование ДНК в условиях одного оборота

ДНК-дуплексы (100-300 нМ) инкубировали с МТазой (1.3-2 мкМ) в буфере Б, Н или П в присутствии [3Н-СН3]AdoMet (1.3-2.5 мкМ) при 37°С. Реакцию инициировали добавлением AdoMet. Через интервалы времени из реакционной смеси отбирали аликвоту 4.9 мкл и наносили на фильтр DE81 (Whatman). Далее фильтры четыре раза промывали 50 мМ КН2Р04 и один раз водой, высушивали, помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и определяли радиоактивность [126]. Количество метилированных молекул ДНК рассчитывали согласно [146]. Строили зависимость концентрации метилированных ДНК от времени (рис. 4), Значение &chem рассчитывали согласно уравнению 1 или 2.

1. Koudan, Е. V., Bujnicki, J. M., and Gromova, E. S. (2004) Homology modeling of the CG-speciflc DNA methyltransferase SssI and its complexes with DNA and AdoHcy, J Biomol. Struct. Dyn 22,339-345.

2. Finishing the euchromatic sequence of the human genome (2004), Nature 431, 931-945.

3. Eckhardt, F., Beck, S., Gut, I. G., and Berlin, K. (2004) Future potential of the Human Epigenome Project, Expert. Rev. Mol. Diagn. 4, 609-618.

4. Novik, K. L., Nimmrich, I., Gene, В., Maier, S., Piepenbrock, C., Olek, A., and Beck, S. (2002) Epigenomics: genome-wide study of methylation phenomena, Curr. Issues. Mol. Biol. 4,111-128.

5. Bonfils, C., Beaulieu, N., Chan, E., Cotton-Montpetit, J., and MacLeod, A. R. (2000) Characterization of the human DNA methyltransferase splice variant Dnmtlb, J. Biol. Chem. 275, 10754-10760.

6. Delaval, K., and Feil, R. (2004) Epigenetic regulation of mammalian genomic imprinting, Curr. Opin. Genet. Dev. 14,188-195.

7. Gruenbaum, Y., Cedar, H., and Razin, A. (1982) Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase, Nature 295, 620-622.

8. El-Osta, A. (2003) DNMT cooperativity—the developing links between methylation, chromatin structure and cancer, Bioessays 25,1071-1084.

9. Liu, K., Wang, Y. F., Cantemir, C., and Muller, M. T. (2003) Endogenous assays of DNA methyltransferases: Evidence for differential activities of DNMT1, DNMT2, and DNMT3 in mammalian cells in vivo, Mol. Cell. Biol. 23,2709-2719.

10. Hermann, A., Gowher, H., and Jeltsch, A. (2004) Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases, Cell. Mol. Life Sci. 61,2571-2587.

11. Goll, M. G., and Bestor, Т. H. (2005) Eukaryotic cytosine methyltransferases, Annu. Rev. Biochem. 74,481-514.

12. Turek-Plewa, J., and Jagodzinski, P. P. (2005) The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression, Cell. Mol. Biol. Lett. 10,631647.

13. Лихтенштейн, А. В., and Киселева, H. П. (2001) Метилирование ДНК и канцерогенез, Биохимия 66,293-317.

14. Ehrlich, М., Gama-Sosa, М. A., Huang, L. Н., Midgett, R. М., Кио, К. С., McCune, R. A., and Gehrke, С. (1982) Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells, Nucleic Acids Res. 10,2709-2721.

15. Wood, R. D., Mitchell, M., Sgouros, J., and Lindahl, T. (2001) Human DNA repair genes, Science 291,1284-1289.

16. Gardiner-Garden, M., and Frommer, M. (1987) CpG islands in vertebrate genomes, J. Mol. Biol. 196,261-282.

17. Baylin, S. В., Herman, J. G., Graff, J. R., Vertino, P. M., and Issa, J. P. (1998) Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia, Adv. Cancer. Res. 72, 141-196.

18. Yeivin, A., and Razin, A. (1993) Gene methylation patterns and expression, Exs. 64, 523568.

19. Yeivin, A., and Razin, A. (1993) Gene methylation patterns and expression, Exs. 64, 523568.

20. Lucifero, D., Mann, M. R., Bartolomei, M. S., and Trasler, J. M. (2004) Gene-specific timing and epigenetic memory in oocyte imprinting, Hum. Mol. Genet. 13, 839-849.

21. Carlson, L. L., Page, A. W„ and Bestor, Т. H. (1992) Properties and localization of DNA methyltransferase in preimplantation mouse embryos: implications for genomic imprinting, Genes. Dev. 6,2536-2541.

22. Bhattacharya, S. K., Ramchandani, S., Cervoni, N., and Szyf, M. (1999) A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA, Nature 397, 579-583.

23. Cervoni, N., Bhattacharya, S., and Szyf, M. (1999) DNA demethylase is a processive enzyme, J Biol Chem 274, 8363-8366.

24. Sankpal, U. Т., and Rao, D. N. (2002) Hhal DNA Methyltransferase — A Paradigm for C5-Cytosine Methyltransferase Family, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 1-44.

25. Vilkaitis, G., Merkiene, E., Serva, S., Weinhold, E., and Klimasauskas, S. (2001) The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hhai methyltransferase, J. Biol. Chem. 276,20924-20934.

26. Cheng, X., and Roberts, R. J. (2001) AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping, Nucleic Acids Res. 29,3784-3795.

27. Posfai, J., Bhagwat, A. S„ Posfai, G., and Roberts, R. J. (1989) Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases, Nucleic Acids Res. 17,2421-2435.

28. Gromova, E. S., and Khoroshaev, A. V. (2003) Prokaryotic DNA methyltransferases: the structure and the mechanism of interaction with DNA., Mol. Biol. (Mosk) 37,300314.

29. Jeltsch, A. (2002) Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases, Chembiochem. 3,274-293.

30. Klimasauskas, S., Kumar, S., Roberts, R. J., and Cheng, X. (1994) Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix, Cell 76,357-369.

31. Gowher, H., Loutchanwoot, P., Vorobjeva, O., Handa, V., Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., and Jeltsch, A. (2006) Mutational Analysis of the Catalytic Domain of the Murine Dnmt3a DNA-(cytosine C5)-methyltransferase, J. Mol. Biol. 357, 928-941.

32. Wu, J. C., and Santi, D. V. (1987) Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase, J. Biol. Chem. 262,4778-4786.

33. Chen, L., MacMillan, A. M., and Verdine, G. L. (1993) Mutational Separation of DNA binding from catalysis in a DNA cytosine methyltransferase, J. Am. Chem. Soc. 115, 5318-5319.

34. Osterman, D. G., DePillis, G. D., Wu, J. C., Matsuda, A., and Santi, D. V. (1988) 5-Fluorocytosine in DNA is a mechanism-based inhibitor of Hhal methylase, Biochemistry 27, 5204-5210.

35. Klimasauskas, S., Szyperski, Т., Serva, S., and Wuthrich, K. (1998) Dynamic modes of the flipped-out cytosine during Hhal methyltransferase-DNA interactions in solution, EmboJ 17, 317-324.

36. Vilkaitis, G., Dong, A., Weinhold, E., Cheng, X., and Klimasauskas, S. (2000) Functional roles of the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase, J. Biol. Chem. 275,38722-38730.

37. O'Gara, M., Horton, J. R., Roberts, R. J., and Cheng, X. (1998) Structures of Hhal methyltransferase complexed with substrates containing mismatches at the target base, Nat. Struct. Biol. 5, 872-877.

38. Estabrook, R. A., Lipson, R., Hopkins, В., and Reich, N. (2004) The coupling of tight DNA binding and base flipping: identification of a conserved structural motif in base flipping enzymes, J. Biol. Chem. 279,31419-31428.

39. Svedruzic, Z. M., and Reich, N. O. (2004) The mechanism of target base attack in DNA cytosine carbon 5 methylation, Biochemistry 43,11460-11473.

40. Daujotyte, D., Serva, S., Vilkaitis, G., Merkiene, E., Venclovas, C., and Klimasauskas, S. (2004) Hhal DNA methyltransferase uses the protruding Gln237 for active flipping of its target cytosine, Structure 12,1047-1055.

41. Kumar, S., Cheng, X., Klimasauskas, S., Mi, S., Posfai, J., Roberts, R. J., and Wilson, G. G. (1994) The DNA (cytosine-5) methyltransferases, Nucleic Acids Res. 22,1-10.

42. Huang, N., and MacKerell, A. D., Jr. (2005) Specificity in protein-DNA interactions: energetic recognition by the (cytosine-C5)-methyltransferase from Hhal, J. Mol. Biol. 345,265-274.

43. Huang, N., Banavali, N. K., and MacKerell, A. D., Jr. (2003) Protein-facilitated base flipping in DNA by cytosine-5-methyltransferase, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 6873.

44. Merkiene, E., and Klimasauskas, S. (2005) Probing a rate-limiting step by mutational perturbation of AdoMet binding in the Hhal methyltransferase, Nucleic Acids Res. 33, 307-315.

45. Schroeder, S. G., and Samudzi, С. T. (1997) Structural studies of EcoRII methylase: exploring similarities among methylases, Protein Eng. 10, 1385-1393.

46. Dong, A., Yoder, J. A., Zhang, X., Zhou, L., Bestor, Т. H., and Cheng, X. (2001) Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA, Nucleic Acids Res. 29,439-448.

47. Lin, I. G., Han, L., Taghva, A., O'Brien, L. E., and Hsieh, C. L. (2002) Murine de novo methyltransferase Dnmt3a demonstrates strand asymmetry and site preference in the methylation of DNA in vitro, Mol. Cell. Biol. 22, 704-723.

48. Hermann, A., Schmitt, S., and Jeltsch, A. (2003) The human Dnmt2 has residual DNA-(cytosine-C5) methyltransferase activity, J. Biol. Chem. 278,31717-31721.

49. Hsieh, C. L. (1999) In vivo activity of murine de novo methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, Mol. Cell. Biol. 19, 8211-8218.

50. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2002) Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases, Л Biol. Chem. 277,20409-20414.

51. Bachman, К. E., Rountree, M. R., and Baylin, S. B. (2001) Dnmt3a and Dnmt3b are transcriptional repressors that exhibit unique localization properties to heterochromatin, J. Biol. Chem. 276,32282-32287.

52. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. U., and Bestor, Т. H. (1992) A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei, Cell 71, 865-873.

53. Robertson, K. D., Ait-Si-Ali, S., Yokochi, Т., Wade, P. A., Jones, P. L., and Wolffe, A. P. (2000) DNMT1 forms a complex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters, Nat. Genet. 25, 338-342.

54. Tatematsu, К. I., Yamazaki, Т., and Ishikawa, F. (2000) MBD2-MBD3 complex binds to hemi-methylated DNA and forms a complex containing DNMT1 at the replication foci in late S phase, Genes Cells 5, 677-688.

55. Kimura, H., and Shiota, K. (2003) Methyl-CpG-binding protein, MeCP2, is a target molecule for maintenance DNA methyltransferase, Dnmtl, J. Biol. Chem. 278,48064812.

56. Rountree, M. R., Bachman, К. E., and Baylin, S. B. (2000) DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci, Nat Genet 25,269-277.

57. Fuks, F., Hurd, P. J., Deplus, R., and Kouzarides, T. (2003) The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase, Nucleic Acids Res. 31, 2305-2312.

58. Eads, C. A., Danenberg, K. D., Kawakami, K., Saltz, L. В., Danenberg, P. V., and Laird, P. W. (1999) CpG island hypermethylation in human colorectal tumors is not associated with DNA methyltransferase overexpression, Cancer Res. 59,2302-2306.

59. Lee, P. J., Washer, L. L., Law, D. J., Boland, C. R., Horon, I. L., and Feinberg, A. P. (1996) Limited up-regulation of DNA methyltransferase in human colon cancer reflecting increased cell proliferation, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93,10366-10370.

60. Ко, Y. G., Nishino, K., Hattori, N., Arai, Y., Tanaka, S., and Shiota, K. (2005) Stage-by-stage change in DNA methylation status of Dnmtl locus during mouse early development, J. Biol. Chem. 280,9627-9634.

61. Mund, C., Musch, Т., Strodicke, M., Assmann, В., Li, E., and Lyko, F. (2004) Comparative analysis of DNA methylation patterns in transgenic Drosophila overexpressing mouse DNA methyltransferases, Biochem. J. 378,763-768.

62. Yokochi, Т., and Robertson, K. D. (2002) Preferential methylation of unmethylated DNA by Mammalian de novo DNA methyltransferase Dnmt3a, J Biol. Chem. 277, 1173511745.

63. Zucker, К. E., Riggs, A. D., and Smith, S. S. (1985) Purification of human DNA (cytosine-5-)-methyltransferase, J. Cell. Biochem. 29,337-349.

64. Flynn, J., Glickman, J. F., and Reich, N. O. (1996) Murine DNA cytosine-C5 methyltransferase: pre-steady- and steady-state kinetic analysis with regulatory DNA sequences, Biochemistry 35, 7308-7315.

65. Pradhan, S., Talbot, D., Sha, M., Benner, J., Hornstra, L., Li, E., Jaenisch, R., and Roberts, R. J. (1997) Baculovirus-mediated expression and characterization of the full-length murine DNA methyltransferase, Nucleic Acids Res. 25, 4666-4673.

66. Vilkaitis, G., Suetake, I., Klimasauskas, S., and Tajima, S. (2005) Processive methylation of hemimethylated CpG sites by mouse Dnmtl DNA methyltransferase, J. Biol. Chem. 280,64-72.

67. Hermann, A., Goyal, R., and Jeltsch, A. (2004) The Dnmtl DNA-(cytosine-C5)-methyltransferase methylates DNA processively with high preference for hemimethylated target sites, J. Biol. Chem. 279,48350-48359.

68. Lorincz, M. C., Schubeler, D., Hutchinson, S. R., Dickerson, D. R., and Groudine, M. (2002) DNA methylation density influences the stability of an epigenetic imprint and Dnmt3a/b-independent de novo methylation, Mol. Cell. Biol. 22, 7572-7580.

69. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., and Jeltsch, A. (2002) Dnmt3a and Dnmtl functionally cooperate during de novo methylation of DNA,£zvr. J. Biochem. 269,$981-4984.

70. Rhee, I., Bachman, К. E., Park, В. H., Jair, K. W., Yen, R. W., Schuebel, К. E., Cui, H., Feinberg, A. P., Lengauer, C., Kinzler, K. W., Baylin, S. В., and Vogelstein, B. (2002)

71. DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells, Nature 416, 552-556.

72. Zimmermann, C., Guhl, E., and Graessmann, A. (1997) Mouse DNA methyltransferase (MTase) deletion mutants that retain the catalytic domain display neither de novo nor maintenance methylation activity in vivo, Biol. Chem. 378,393-405.

73. Margot, J. В., Aguirre-Arteta, A. M., Di Giacco, В. V., Pradhan, S., Roberts, R. J., Cardoso, M. C., and Leonhardt, H. (2000) Structure and function of the mouse DNA methyltransferase gene: Dnmtl shows a tripartite structure, J. Mol. Biol. 297,293-300.

74. Okano, M., Xie, S., and Li, E. (1998) Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells, Nucleic Acids Res. 26,2536-2540.

75. Yoder, J. A., and Bestor, Т. H. (1998) A candidate mammalian DNA methyltransferase related to pmtlp of fission yeast, Hum. Mol. Genet. 7, 279-284.

76. Hung, M. S., Karthikeyan, N., Huang, В., Koo, H. C., Kiger, J., and Shen, C. J. (1999) Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltransferases, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96,11940-11945.

77. Tang, L. Y., Reddy, M. N., Rasheva, V., Lee, T. L., Lin, M. J., Hung, M. S., and Shen, C. K. (2003) The eukaryotic DNMT2 genes encode a new class of cytosine-5 DNA methyltransferases, J. Biol. Chem. 278,33613-33616.

78. Goll, M. G., Kirpekar, F., Maggert, K. A., Yoder, J. A., Hsieh, C. L., Zhang, X., Golic, K. G., Jacobsen, S. E., and Bestor, Т. H. (2006) Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2, Science 311, 395-398.

79. Foster, P. G., Nunes, C. R., Greene, P., Moustakas, D., and Stroud, R. M. (2003) The first structure of an RNA m5C methyltransferase, Fmu, provides insight into catalytic mechanism and specific binding of RNA substrate, Structure 11,1609-1620.

80. Lee, Т. Т., Agarwalla, S., and Stroud, R. M. (2005) A unique RNA Fold in the RumA-RNA-cofactor ternary complex contributes to substrate selectivity and enzymatic function, Cell 120, 599-611.

81. Jeltsch, A., Nellen, W., and Lyko, F. (2006) Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases, TIBS in press.

82. Kunert, N., Marhold, J., Stanke, J., Stach, D., and Lyko, F. (2003) A Dnmt2-like protein mediates DNA methylation in Drosophila, Development 130, 5083-5090.

83. Okano, M., Xie, S., and Li, E. (1998) Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases, Nat. Genet. 19,219-220.

84. Bird, A. (1999) DNA methylation de novo, Science 286,2287-2288.

85. Newell-Price, J., Clark, A. J., and King, P. (2000) DNA methylation and silencing of gene expression, Trends Endocrinol. Metab. 11,142-148.

86. Turker, M. S. (1999) The establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mouse somatic cells, Semin. Cancer Biol. 9,329-337.

87. Pascual, J., Martinez-Yamout, M., Dyson, H. J., and Wright, P. E. (2000) Structure of the PHD zinc finger from human Williams-Beuren syndrome transcription factor, J. Mol. Biol. 304, 723-729.

88. Fuks, F., Burgers, W. A., Godin, N., Kasai, M., and Kouzarides, T. (2001) Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription, EmboJ. 20,2536-2544.

89. Chen, Т., Tsujimoto, N. and Li, E. (2004) The PWWP domain of Dnmt3a and Dnmt3b is required for directing DNA methylation to the major satellite repeats at pericentric heterochromatin, Mol. Cell. Biol. 24,9048-9058.

90. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., and Li, E. (1999) DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development, Cell 99,247-257.

91. Hansen, R. S., Wijmenga, C., Luo, P., Stanek, A. M., Canfield, Т. K., Weemaes, С. M., and Gartler, S. M. (1999) The DNMT3B DNA methyltransferase gene is mutated in the ICF immunodeficiency syndrome, Proc Natl Acad Sci USA 96,14412-14417.

92. Bourc'his, D., Xu, G. L., Lin, C. S., Bollman, В., and Bestor, Т. H. (2001) Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints, Science 294,2536-2539.

93. Aoki, A., Suetake, I., Miyagawa, J., Fujio, Т., Chijiwa, Т., Sasaki, H., and Tajima, S.2001) Enzymatic properties of de novo-type mouse DNA (cytosine-5) methyltransferases, Nucleic Acids Res. 29,3506-3512.

94. Deplus, R., Brenner, C., Burgers, W. A., Putmans, P., Kouzarides, Т., de Launoit, Y., and Fuks, F. (2002) Dnmt3L is a transcriptional repressor that recruits histone deacetylase, Nucleic Acids Res. 30,3831-3838.

95. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2001) Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG correction of non-CpA. sites, J Mol Biol 309,1201-1208.

96. Suetake, I., Miyazaki, J., Murakami, C., Takeshima, H., and Tajima, S. (2003) Distinct enzymatic properties of recombinant mouse DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b, J. Biochem. (Tokyo) 133,1Ъ1-1АА.

97. Gowher, H., Liebert, K., Hermann, A., Xu, G., and Jeltsch, A. (2005) Mechanism of stimulation of catalytic activity of Dnmt3A and Dnmt3B DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases by Dnmt3L,J. Biol. Chem. 280,13341-13348.

98. Hsieh, C. L. (2005) The de novo methylation activity of Dnmt3a is distinctly different than that of Dnmtl, BMC Biochem. 6,6.

99. Handa, V., and Jeltsch, A. (2005) Profound flanking sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyltransferases shape the human epigenome, J. Mol. Biol. 348,1103-1112.

100. Oka, M., Rodic, N., Graddy, J., Chang, L. J., and Terada, N. (2006) CpG sites preferentially methylated by Dnmt3a in vivo, J. Biol. Chem. in press

101. Chedin, F., Lieber, M. R., and Hsieh, C. L. (2002) The DNA methyltransferase-like protein DNMT3L stimulates de novo methylation by Dnmt3a, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16916-16921.

102. Hata, К., Okano, M., Lei, H., and Li, E. (2002) Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice, Development 129,1983-1993.

103. Mi, S., and Roberts, R. J. (1993) The DNA binding affinity of Hhal methylase is increased by a single amino acid substitution in the catalytic center, Nucleic Acids Res. 21,2459-2464.

104. Renbaum, P., and Razin, A. (1992) Mode of action of the Spiroplasma CpG methylase M.SssI, FEBSLett. 313,243-247.

105. Renbaum, P., and Razin, A. (1995) Footprint analysis of M.SssI and M.Hhal methyltransferases reveals extensive interactions with the substrate DNA backbone, J. Mol. Biol 248,19-26.,

106. Pradhan, S., and Roberts, R. J. (2000) Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain, Embo J. 19, 2103-2114.

107. Carvin, C. D., Dhasarathy, A., Friesenhahn, L. В., Jessen, W. J., and Kladde, M. P. (2003) Targeted cytosine methylation for in vivo detection of protein-DNA interactions, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7743-7748.

108. Carvin, C. D., Parr, R. D., and Kladde, M. P. (2003) Site-selective in vivo targeting of cytosine-5 DNA methylation by zinc-finger proteins, Nucleic Acids Res 31,6493-6501.

109. Дарий, M. В., Кирсанова, О. В., Друца, В. JI., Кочетков, С. Н., and Громова, Е. С. (2006) Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы SssI, Молекулярная биология, отправлена в печать.

110. Friedman, S., and Ansari, N. (1992) Binding of the EcoRII methyltransferase to 5-fluorocytosine-containing DNA. Isolation of a bound peptide, Nucleic. Acids. Res. 20,1. Ф 3241-3248.

111. Kiss, A., Posfai, G., Zsurka, G., Rasko, Т., and Venetianer, P. (2001) Role of DNA minor groove interactions in substrate recognition by the M.SinI and M.EcoRII DNA (cytosine-5) methyltransferases, Nucleic Acids Res. 29,3188-3194.

112. Subach, О. M., Khoroshaev, A. V., Gerasimov, D. N., Baskunov, V. В., Shchyolkina, A. K., and Gromova, E. S. (2004) 2-Pyrimidinone as a probe for studying the EcoRII DNA methyltransferase-substrate interaction, Eur. J. Biochem. 271, 2391-2399.