Зондирование контактов ДНК-метилтрансфераз EcoRII и SssI с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

\

г

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

КУДАН Елизавета Валерьевна

ЗОНДИРОВАНИЕ КОНТАКТОВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ ЕсоКП И вввГ С ДНК С ПОМОЩЬЮ ФОТОАКТИВНЫХ АНАЛОГОВ СУБСТРАТА И МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Громова Елизавета Сергеевш

Официальные оппоненты доктор химических наук

Туницкая Вера Леонидовна

кандидат физико-математических наук Алексеевский Андрей Владимирович

Ведущая организация Институт биоорганической химии

им М М Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН

Защита состоится «22» апреля 2008 года в 17 00 часов на заседании совета Д 501.001 41 по химическим наукам при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико-химической биологии им АН Белозерского,аудитория501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им MB Ломоносова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Метилирование ДНК, осуществляемое ДНК-метилтрансферазами (МТазами), играет важную роль в регуляции многих биологических процессов, таких, как репарация ДНК, защита клетки от проникновения чужеродной ДНК, регуляция транскрипции некоторых генов, конденсация хроматина и др Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метальную группу от кофактора 5-аденозил-1,-метионина (АсЬМеЦ на атом углерода С5 остатка цитозина, образуя 5-метилцитозин В процессе реакции Ас1оМеС превращается в 5-аденозил-ь-гомоцистеин (Ас1оНсу) К настоящему времени большая часть информации о структуре С5-МТаз и их комплексов с ДНК, а также о механизме реакции метилирования, получена при изучении двух прокариотических С5-МТаз - МНЬа1 и М НаеШ Информация о других прокариотических МТазах и эукариотических ферментах ограничена В связи с этим, актуальной задачей является изучение механизма метилирования ДНК и структуры комплексов расширенного круга прокариотических МТаз с ДНК Кроме того, учитывая гомологию аминокислотных последовательностей эукариотических и прокариотических МТаз, целесообразным представляется использовать последние в качестве моделей для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами

Объектом исследований в настоящей работе явились МТазы Бы.ч Г и EcoR.II, которые

т

узнают в ДНК последовательности СО и СС /двО, соответственно, и метилируют в них остатки цитозина © по атому углерода в 5-ом положении М Бее! является уникальной прокариотической МТазой, узнающей ту же нуклеотидную последовательность, что и эукариотичские МТазы Имеются данные, что эукариотические ферменты также могут т т

метилировать С /д или СС /дОО участки Для обеих МТаз данные рентгеноструктурного анализа (РСА) отсутствуют, и практически неизвестно, какие аминокислотные остатки ферментов обеспечивают узнавание ДНК и принимают участие в катализе

Метод фотоаффинной модификации (ФМ) фермента модифицированными ДНК-дуплексами, содержащими фотоактивные группы, - один из наиболее перспективных методов, позволяющих определять аминокислотные остатки или участки фермента, ответственные за связывание ДНК или осуществление катализа.

В тех случаях, когда информация о ферменте ограничена, однако имеются данные РСА для родственных ферментов, широкое применение находит метод моделирования по гомологии, позволяющий предсказать пространственную структуру фермента на основании известных структур родственных ферментов Существует два основных метода распознавания укладки белка Один из них основан на анализе аминокислотных последовательностей моделируемого белка и белков с известными структурами В основе

другого метода, получившего название «протягивание нити» (threading), лежит идея о том, что одинаковую упаковку могут иметь белки и с негомологичными аминокислотными последовательностями Существует много программ для распознавания укладки белков и поиска шаблонов для моделирования, работа которых основана на одном из этих двух методов Каждая из программ имеет свои сильные и слабые стороны В последнее время в области моделирования белков по гомологии был достигнут значительный прогресс, связанный с развитием метасерверов, позволяющих получать более точные предсказания за счет комбинирования результатов, полученных несколькими независимыми программами Модели белков, построенные с использованием метасерверов, обладают достаточно высоким качеством На основании модели фермента и его комплекса с ДНК, можно сделать предположение о том, какие аминокислоты участвуют в связывании ДНК и катализе

Цель работы. Целью работы явилось изучение ДНК-белковых контактов в комплексах М EcoRII и М SssI с ДНК и определение функционально значимых областей М EcoRII с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования

В задачи работы входило 1) получение конъюгатов М EcoRII с фотоактивными аналогами ДНК-субстрата, 2) определение участков М EcoRII, к которым происходит ковалентное присоединение фотоактивных ДНК-дуплексов, 3) моделирование комплексов М Есо[Ш-ДНК-Ас1оНсу и М Sssi^HK-AdoHcy и предсказание аминокислотных остатков М EcoRII и М SssI, вовлеченных во взаимодействие с ДНК, 4) сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными для выявления наиболее вероятных контактов между ферментами и ДНК

Научная новизна и практическая ценность.

Изучено взаимодействие М EcoRII с ДНК-дуплексами, содержащими фотоакгивные остатки 5-иодурацила или диазиринового производного урацила в различных положениях участка узнавания EcoRII Субстратные свойства модифицированных ДНК-дуплексов и выходы конъюгатов М EcoRII-ДНК зависят от природы модификации и ее локализации в участке узнавания В случае 5-иодурацилсодержащих ДНК-дуплексов наиболее прочные комплексы М EcoRII-ДНК и наибольшие выходы фотохимической реакции наблюдаются при модификации метилируемых остатков цитозина Полученные данные косвенно подтверждают «выпетливание» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК в процессе метилирования М EcoRII и позволяют сделать предположение, что метилируемый цитозин сближен с одним из остатков М EcoRII (Туг, Phe, Trp, His или Met)

Проведено расщепление химическими реагентами продуктов фотоприсоединения фотоактивных ДНК-дуплексов к М EcoRII Показано, что метилируемый цитозин сближен с областью Leu84-Met251 в каталитическом домене М EcoRII, а центральное основание

метилируемой цепи участка узнавания - с областью 01и339-'Ггр389 в ДНК-узнающем домене

Построена модель М ЕсоМ! в комплексе с ДНК и АйоНсу Согласно модели некоторые петли в большом домене М ЕсоЫ1 (в том числе и каталитическая петля) длиннее соответствующих петель в больших доменах М Н1га1 и М НаеШ Предсказаны аминокислотные остатки М ЕсоЯИ, взаимодействующие с ДНК На основании сопоставления результатов моделирования с экспериментальными данными выявлены наиболее вероятные контакты М ЕсоМ1 с ДНК

Построена модель М вээ! в комплексе с ДНК и А<1оНсу Согласно модели структура малого домена М Без! в целом аналогична структуре малого домена ССвС-узнающей М НЪа1, однако одна из петель в М Бее!, аминокислотные остатки которой непосредственно взаимодействуют с ДНК, более похожа на соответствующую петлю в малом домене Сй-узнающей метилтрансферазы Опли2 Это связано с более коротким участком узнавания М Зяв! и Опт12 по сравнению с участком узнавания М НЬа1 Предсказано, что консервативные остатки 01и186, Arg232 и ТЪгЗ 13 участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина Особое значение имеет предсказание функции вариабельного остатка С1п147, который совместно с БегЗОО занимает пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина, и участвует во взаимодействии с ДНК Экспериментальные данные, полученные Дарий МВ, подтверждают необходимость 01п147, 01и186, А^232 и ТЪг313 для функционирования М БэвГ

Полученные в работе результаты уже были использованы {Дарий и др, 2007) и будут использованы в дальнейшем для планирования экспериментов по изучению МЕсоЫ1 и М Эзэ!, а также в целом расширяют наши знания о механизме функционирования С5-МТаз, в том числе СС-узнающих МТаз млекопитающих

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано три статьи Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001» (Москва, 2001) и Ш-ем съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002)

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114-ти страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (115 ссылок) Материал иллюстрирован 23-мя рисунками, 2-мя таблицами и 12-ю схемами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами нашего исследования явились М ЕсоЫ1 и М БввГ В аминокислотных последовательностях обеих МТаз можно выделить десять консервативных мотивов (1-Х),

5

характерных для С5-МТаз Предполагается, что в случае С5-МТаз аминокислотные остатки в составе мотивов I-LLI, V и X участвуют в связывании кофактора, а остатки из мотивов IV, VI-VIII - в катализе Между мотивами VIII и IX расположен вариабельный участок (TRD, Target Recognition Domain), обеспечивающий сиквенс-специфичность МТаз

1. Зондирование контактов ДНК-метилтрансферазы EcoRII с ДНК методом фотоаффинной модификации 1.1. Дизайн аналогов субстрата

Для зондирования функционально значимых областей М EcoRII в ДНК-дуплексы были введены фотоактивные остатки 5-иод-2'-дезоксиуридина (iU) или 5-[4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил]-2'-дезоксиуридина (daU) iU является реагентом нулевой длины Радиус иода равен 2 15 А, что практически эквивалентно радиусу метальной группы (2 О А)

Использование iU if

позволяет с помощью Jj

облучения ДНК- но-,°0 |

белковых комплексов \ /

,, . , пи 8-иоп-У-л«зов!«тош1ин 1Ш) он Ч4ЧЗ-(тр«фтормвт1|П)-ЗНлдиазирин-3-ил)феН1Ш]-

УФ-светом с А>300 нм °н д 2 я"а™ур'я'"он 2-т*,%с«19,т«(<1м\ изучить взаимодействие модифицированных нуклеозидных остатков с близко расположенными аминокислотными остатками фермента (наиболее благоприятными мишенями являются остатки Туг, Phe, Trp, His и Met) В daU расстояние от реагирующей группы до пиримидинового кольца составляет 7А Это дает возможность проследить взаимодействие модифицированных нуклеозидных остатков с более удаленными аминокислотными остатками Облучение daU проводится УФ-светом с к -350-360 нм, когда исключено фотоповреждение биомолекул При облучении daU образуется высокореакционноспособный карбен, поэтому ковалентное присоединение ДНК-дуплексов, содержащих daU, может происходить к любому аминокислотному остатку фермента

В работе нами были использованы полуметилированные ДНК-дуплексы 2, 4-8, содержащие фотоактивную группу в одной из цепей и остаток 5-метил-2'-дезоксицитидина (М) в другой цепи (табл 1) Для того чтобы локализовать области М EcoRII, принимающие участие в связывании ДНК или катализе, были введены модификации в разные положения участка узнавания iU или daU в центр участка узнавания, iU вместо «внешнего» С и вместо метилируемого С Кроме того, наличие целого ряда модифицированных ДНК-дуплексов позволяло выбрать для дальнейшей работы те из них, которые образуют коныогаты с М EcoRII с наибольшими выходами

Для оценки влияния вводимых модификаций на устойчивость двойной спирали ДНК были определены температуры плавления (Тщ,) для ДНК-дуплексов 2, 4, 5, 7 и 8 (табл 1) Замена Т на (1а1[ или III (ЦНК-дуплексы 2 или 4) практически не влияет на стабильность двойной спирали ДНК (снижение Тщ, на 1-2 градуса) Введение ЛГ вместо С и А (ДНК-дуплексы 5, 7 и 8) приводит к их дестабилизации по сравнению с немодифицированным субстратом на 7-9 градусов за счет введения некомплементарной пары оснований

Таблица 1 Свойства ДНК-дуплексов, содержащих остатки 5-иодурацила или диазиринового производного урацила, как субстратов М ЕсоЫ1 Фотоаффинная модификация М ЕсоШ1 ДНК_ дуплексами 2-9__

№ ДНК-дуплекс" Тщт б с ДНК-дуплексы как субстраты М ЕсоЫ! Фотоаффинная модификация М ЕсоЕШ ДНК-дуплексами

Относительная эффективность метилирования ДНК М ЕсоМГ, %' Относительная эффективность связывания МЕсоЫ1сДНКг Выход конъюгата МЕсоЫ1-ДНК,%д

АйоМй А(1оНсу А(1оМе1

/ 5'-С,ССАА-С-С-Т--С-а- СТСТ З'-СОСТТ-С-С-А-М-С-ОАОА 65 100 1 1 -

2 5'-ОССАА-С-С-</я£/-С-С-СТСТ З'-СООТТ-С-С- А- М- С-вАОА 63 0 1 5 0 63 13

3 5'-ТАОАОССОО«Гя£/ТООС З'-АТСТСООСС А АССО - - - - 3

4 5' -ОСС А А-С-С-1(М5-С-СТСТ З'-СОСТТ-С-С-А-М-С-ОАОА 64 100 1 2 1 1

5 5'-ОССАА-С-М-Т- (5-С-СТСТ 3'-СОСТТ-С!-С- ¡и-С-С-ОАОА 56 и 34 02 8

6 5 '-С-СС А А-С-|(/-Т-С-С-СТСТ З'-СОСТТ-С-С- А-М-С-ОАОА - 0 86 0 13

7 5'-ОССАА-С-М-Т-С-С-СТСТ З'-СООТТ-С-С-А-да-С-ОАСА 58 0 114 0 16

8 5'-СССАА-<{/-С-Т-С-С-СТСТ З'-СООТТ-С-С-А-С-М-ОАОА 56 25 24 04 1 5

9 5'-ТАСАОСССС1{УТООС З'-АТСТСООСС ААССв - - - - 03

* - формулы ЛГ и (1аи см на стр 6, М - 5-метил-2'-дезоксицитидин Участок узнавания М Есо1Ш выделен жирным шрифтом, модифицированные нуклеозиды - курсивом 6- точность определения Тщ, равна ± 1 °С,

"-отношение эффективности метилирования ДНК-дуплексов 2,4-8 к эффективности метилирования дуплекса 1 СМЕсоЕп 3 5 1(Г7М, С6 3 5 10 7М, 1 мкКюри [С[3Н]3]-А<1оМе1

г - отношение эффективности связывания М Есо1Ш с ДНК-дуплексами 2, 4-8 к эффективности связывания М ЕсоЯН с дуплексом 1 СМЕооМ| 1 75 10*М, С< 3 5 10'7М, 103м, СдсЮНоу 10"3М

л- отношение радиоактивности (32Р) конъюгата МЕсо1Ш-ДШС к суммарной радиоактивности конъюгата М ЕсоКН-ДНК и ДНК СМе»и1 1 75 Ю^М, Сл 3 5 10 7М, САЛММ Ю'3М, время облучения 30 мин

Все эксперименты проводились в условиях, при которых ДНК-дуплексы 5, 7 и 8 термодинамически стабильны

1.2. Взаимодействие М.£соШ1 с фотоакт ивными аналогами ДНК-субстрата и анализ

продуктов ковалентного присоединения М.ЕсоШ1 к ДНК-дуплексам 2,5-7

Метилирование. Использование модифицированных ДНК-дуплексов 2 и 4-8 для ФМ

МЕсоЬШ потребовало оценки их субстратных свойств Введение ски в ДНК-дуплекс 2

т

вместо центрального Т участка СС /АСО приводит к потере его способности метилироваться М ЕсоКП (табл 1) Метилирование М EcoR.II ДНК-дуплексов, содержащих ЛГ, зависит в большой степени от локализации модификации в субстрате (табл 1) ДНК-дуплексы 6 и 7, содержащие остаток вместо метилируемых С в одной или другой цепи, не способны метилироваться Это связано с присутствием остатка иода в метилируемом положении при атоме углерода С5 ДНК-дуплекс 4. в котором остаток 1и введен вместо центрального Т в участке узнавания, полностью сохраняет способность к метилированию Введение остатка 1и вместо центрального А или «внешнего» С в участке узнавания в ДНК-дуплексы 5 и в приводит к уменьшению эффективности метилирования М ЕсоШ1 по сравнению с немодифицированным субстратом в 9 и 4 раза, соответственно Образование комплексов. Для ответа на вопрос, сохраняют ли способность связываться с МТазой те аналоги субстрата, которые не метилируются, было изучено образование комплексов МЕсоЫ1 с аналогами субстрата 2, 4-8 в присутствии А(1оМе1 и АёоНсу Показано, что введение (1аи практически не влияет на способность ДНК-дуплекса 2 образовывать комплекс с М EcoR.II (табл 1) Учитывая, что дуплекс 2 не метилируется МЕсоШ1, можно предположить, что введенная модификация не мешает на стадии связывания, однако препятствует перестройке каталитической петли фермента для образования переходного комплекса с ДНК, необходимого для осуществления катализа

Все ^-содержащие ДНК-дуплексы образуют комплексы с МЕсоЫ1 в присутствии Ас1оМе1 Однако наилучшее связывание наблюдается для ДНК-дуплексов 6 и 7, в которых на заменены остатки метилируемых С в одной или другой цепи Можно предположить, что для MEcoR.II реализуется «выпетливание» метилируемого остатка цигозина из двойной спирали ДНК, характерное для других МТаз (КЬтазаизкая, е1 а1, 1994, Кетмск е1 а!, 1995) В таком случае замена метилируемых С на IV, приводящая к дестабилизации III-содержащего ДНК-дуплекса, облегчает выведение основания из состава двойной спирали ДНК и улучшает связывание аналога субстрата с ферментом В присутствии Ас1оНсу ДНК-дуплексы б и 7 не образуют комлексов с М ЕсоЫ1, в то время как ДНК-дуплексы 4, 5 и 8 сохраняют способность связываться с М EcoR.II (табл 1) Возможно, в присутствии АёоНсу фермент воспринимает остаток 111 в метилируемой позиции в ДНК-дуплексах б и 7 как остаток 5-метилцитозина, и соответствующие комплексы нестабильны Сохранение способности ДНК-дуплексов 5 и 8 связываться с МЕсоИН позволяет предположить, что

снижение эффективности метилирования этик ДНК-дуплексов происходит благодаря нарушению контактов фермента с ДНК на стадии катализа.

Фотоаффинная модификация M.EcoRII ДНК-дуплексами 2-9. ФМ MEcoRII ДНК-дуплексами 2-9 проводили в присутствии AdoMet Была исследована зависимость выхода конъюгата MEcoRII с daU-содержэщим ДНК-дуплекеом 2 от концентрации AdoMet Установлено, что оптимальной является концентрация 1 мМ (данные не приведены) Дальнейшее увеличение концентрации AdoMet приводит к уменьшению выхода конъюгата

Для ФМ MEcoRII аналогами субстрата 4-8, содержащими iU, использовали 1мМ AdoMet Была исследована зависимость образования конъюгатов MEcoRII с iU-содержащими ДНК-дуплексами от места локализации модификации (табл 1) Установлено, что наибольшие выходы продуктов ковалентного присоединения наблюдаются при замене на iU метилируемого С в обеих цепях (дуплексы 6 и 7) Следовательно, метилируемый С сближен с одним из остатков MEcoRII, являющихся наиболее благоприятными мишенями для фотоприсоединения к iU (Туг, Trp, Phe, His или Met) Выход конъюгатов М EcoRII с ДНК-дуплексами 4 и 8 очень низкий (табл 1) Следовательно, в ближайшем окружении центрального Т и «внешнего» С нет вышеперечисленных аминокислотных остатков

При замене центрального А на iU (ДНК-дуплекс 5) наблюдается более высокий выход конъюгата MEcoRII-ДНК, чем при замене центрального Т на iU (ДНК-дуплекс 4) Возможно, при замене А на iU происходит локальное разрушение системы водородных связей, основание приобретает некоторую лабильность, и фотоактивная ¡группа может сблизиться с одним из вышеупомянутых аминокислотных остатков фермента

При замене центрального Т на daU (ДНК-дуплекс 2) также наблюдается более высокий выход конъюгата MEcoRII-ДНК, чем при замене центрального Т на iU (ДНК-дуплекс 4) Вероятно, daU образует ковалентную связь не с одним из вышеперечисленных остатков MEcoRII, а с каким-либо другим остатком, или остаток, к которому происходит ковалентное присоединение ДНК, более удален от гетероциклического основания

ФМ MEcoRII ДНК-дуплексами 3 и 9 без участка узнавания, содержащими daU и iU, соответственно, приводила к образованию конъюгатов с низкими выходами (табл 1), что говорит о специфичности ковалентного присоединения ДНК-дуплексов 2,4-8 к MEcoRII

Для определения фрагментов М EcoRII, ковалентно связанных с модифицированными олигонуклеотидами, были выбраны продукты взаимодействия MEcoRII с ДНК-дуплексами 2, 5-7. так как в этих случаях реакция ковалентного присоединения идет с наибольшим выходом ДНК-дуплексы 2 и 5 содержали в центре участка узнавания метируемой цепи daU и iU, соответственно, а ДНК-дуплексы 6 и 7 содержали iU вместо метилируемых С

Было проведено расщепление химическими реагентами белковой части конъюгатов М.ЕсоГШ с модифицированными олигонуклеотидами - продуктами ФМ tvt.EcoR.il ДНК-дуплексами 2, 5-7, за которым следовал анализ полученных олигонуклеотидопептидов. Были использованы два химических реагента: ВгСЫ, который специфично гидролизует пептидные связи с С-конца от остатков метионина, и ВЫР8-скатод, гидролизующий пептидные связи с С-конца от остатков триптофана (рис. 1). А

Ы-КОнец |ш_М83_МЩ М267_М391 М420-I С.конец

Мг, кДа ГГ74 17з ПГ1?9 ' 5 1 // 47?1 Б . ,

Ы-конец ^54 у« \V125 УУ137_Ш38 \V389-I С.конец

1111 II I I 4771

Рис. 1. Схематическое представление расщепления М.ЕсоГШ с помощью ВгСЫ (А) и ЕШРЗ-скатола (Б). Указаны остатки метионина и триптофана, по которым происходит расщепление. Цифрами курсивом указаны молекулярные массы олигонуклеотидопептидов (кДа), получающихся при исчерпывающем расщеплении ВгСЫ.

При исчерпывающем расщеплении ВгСЫ продуктов ФМ МЕсоЫ1 ДНК-дуплексом 2,

содержащим <1аи вместо Т, и ДНК-дуплексом 5, содержащим ¡и вместо А, на

радиоавтографе наблюдается один олигонуклеотидопептид с молекулярной массой 19 кДа

(рис. 2). Это говорит о ковалентном «и

^ 8Е 8а

присоединении ДНК-дуплексов 2 « 5 к У а«1о

участку МТазы 01у268-Ме1391, так как д

ш 2 5 6 7 ДНК-дуплекс

все другие участки отличаются по мг, кДа 1 2 3-13

67 0 — ~ конъюгат

молекулярной массе (рис. I А). 57м — 401 ^— М.ЕсоЯИ-олигонуклеотид

45 0 — '

Рис. 2. Набор олигонуклеотидопептидов, полученных при исчерпывающем гидролизе

продуктов фотоприсоединения М.ЕсоЫ1 к 2б.б -

32Р-меченным ДНК-дуплексам 2 (дор. 2), 5 24.0 -(дор. 3), 6 (дор. 4) и 7 (дор. 5) с помощью

ВгСЫ. Радиоавтограф 12%-ного ПААГ с 20.4 —

ДСН, содержащего 4 М мочевину. 18.0 —

продукт неполного расщепления

продукт исчерпывающего расщепления

При частичном гидролизе ВЫРв-скатолом продуктов фотоприсоединения М.ЕсоЯП к ДНК-дуплексам 2 (рис. ЗБ) и 5 (данные не приведены) получается семь олигонуклеотидопептидов. На рис. ЗА приведен один из возможных теоретических наборов олигонуклеотидопептидов, получающихся при частичном расщеплении по остаткам Тгр. Сравнение полученной картины распределения набора олигонуклеотидопептидов на радиоавтографе геля с теоретической картиной позволило предположить, что ковалентная связь находится между остатками С1и339 иТгр389.

В случае ДНК-дуплексов 6 и 7, содержащих ¡и вместо метилируемых С, при исчерпывающем расщеплении белковой части конъюгатов M-EcoR.Il с модифицированными

олигонуклеотидами с помощью ВгСЫ на радиоавтографе наблюдаются две полосы с массами 19 кДа и >27 кДа (рис. 2). Полоса 19 кДа, как уже упоминалось выше, соответствует району МТазы 01у268-Ме1391. Верхняя полоса не является продуктом исчерпывающего расщепления. Эта полоса может соответствовать продукту, образующемуся, если не произошло расщепление либо по Ме183 (область Меи-Ме1251), либо по Ме1391 и Ме1420 (область С1у268-11е477).

Рис. 3. Частичный гидролиз продукта фотоприсоединения М.ЕсоЯН к "Р-меченному ДНК-дуплексу 2,

содержащему <1а11 вместо центрального Т в участке узнавания, с помощью ВЫРв-скатола.

(А) Один из возможных теоретических наборов

олигонуклеотидопептидов, который мог быть получен при расщеплении конъюгата М.Есо1И1-олигонуклеотид ВЫРЗ-скатолом, если бы олигонуклеотид был ковалектно связан с областью М.Есо!Ш С1и339-Тгр389. Цифры обозначают номера аминокислотных остатков; ? пР-меченный олигонуклеотид.

(Б) Набор олигонуклеотидопептидов, полученных при частичном гидролизе продукта фотоприсоединения МЕсоЯН к ДНК-дуплексу 2 с помощью ВОТ8-скатола в течение 120 мин (дор. 1) и 0 мин (дор. 2). Радиоавтограф 12%-ного ПААГ с ДСН, содержащего 4 М мочевину.

С нашей точки зрения, маловероятно, получение в ходе эксперимента продукта

исчерпывающего расщепления и продукта, образованного из-за не произошедшего

расщепления по двум связям. Более вероятно образование продукта, получившегося из-за не

произошедшего расщепления по одной связи (область МеП-Ме1251). Следует отметить, что

М.ЕсоЯИ обладает двумя функциями: авторегуляторной и каталитической. За

взаимодействие с промотором отвечает район МеП-Ме183. Следовательно, данный район не

т

принимает участия во взаимодействии с узнаваемой последовательностью СС I£¡0. Таким образом, второй областью М.Есо1Ш, взаимодействующей с ДНК, является Ьеи84-Ме1251. Каким же образом возможна пришивка к двум разным областям? Мы предполагаем, что возможно образование двух видов комплексов М.ЕсоЯП с ДНК-дуплексами 6 и 7: комплекса, в котором выпетлен ¡и, и комплекса, в котором выпетлен остаток 5-метилцитозина. В первом случае пришивка идет к области МТазы Ьеи84-Ме1251, а во втором случае - к области МТазы 01у268-Ме1391.

Таким образом, установлено, что область 01и339-Тгр389, расположенная в ТЩЗ, сближена с центральным остатком участка узнавания метилируемой цепи. Можно предположить, что остатки этой области участвуют в связывании ДНК. Область Ьеи84-

Ме1251 (консервативные мотивы [-VI) сближена с метилируемым С, а область 01у268-Ме1391 (консервативный мотив VIII и часть ТЫ)) сближена с «внутренним» С неметилируемой цепи Можно предположить, что остатки области 1хи84-Ме125} принимают участие в катализе, а остатки области СИу268-Ме1391 - в связывании ДНК

2. Моделирование по гомологии ДНК-метилтрансферазы ЕсоКП и ее комплекса с ДНК и АёоНсу 2.1. Общав стратегия моделирования

Для того чтобы сделать предположение о том, какие именно аминокислотные остатки М EcoR.II могут участвовать во взаимодействии с ДНК, и, в частности, образовывать ковалентную связь с фотоактивными аналогами ДНК-субстрата, было проведено моделирование по гомологии М ЕсоКП и ее комплекса с ДНК и Ас1оНсу В связи с тем, что общая стратегия моделирования М ЕсоШ1 и М Бээ! (раздел 3) и их комплексов с ДНК и Ас1оНсу была одна и та же, рассмотрим ее на примере МЕсоЬШ в данном разделе (рис 4)

При моделировании комплексов М ЕсоМ1 и М Звэ! с ДНК мы исходили из

МЕГАОЕРВЕР.

Поиск шаблонов

Л

Различные парные выравнивания аминокислотной последовательности моделируемого белка с аминокислотными последовательностями шаблонных белков

ь

Построение предварительных моделей

I Создание габрщной модели! Swiss PdbViewer I*-

У

этапЗ

предположения, что для данных МТаз Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей

моделируемого и шаблонных белков

реализуется «выпетливание» метилируемого MODELLER SWISS MODEL

(КЬтаьашках, е1а1, 1994, Нет^ск е/ о/, ¡995)

Рис 4 Общая стратегия моделирования пространственных структур М ЕсоМ1 и М БэзГ и их комплексов с ДНК и А(1оНсу Рядом со стрелками указаны названия программ или пакетов программ, с помощью которых проводился соответствующий этап моделирования Оценку модели М ЕсоКП проводили с помощью МеШМрАР Оценку модели М вйв! проводили с помощью Уег^уЗО

MetaMQAP/Venfy3D

HypetCtem } SCULPT

Вставка ДНК и AdoHcy

Для моделирования был использован разработанный недавно метод "Frankenshtem's monster" (Kosinski et al, 2003) На первом этапе осуществлялся поиск шаблонов для моделирования среди ферментов с известной кристаллической структурой Для этого был проведен анализ аминокислотной последовательности М EcoRII с помощью сервера GeneSihco Metaserver http /Afww eenesilico pl/meta (этап 1) Наилучшими шаблонами были

признаны M.Hhal (PDB код 3mht) и M.HaeHI (PDB код Idct). На основании парных выравниваний аминокислотной последовательности M.EcoRII с аминокислотными последовательностями M.Hhal и М.НаеШ, полученных с помощью различных программ, были построены предварительные модели M.EcoRII (этап 2). Далее было проведено выравнивание всех предварительных моделей по третичным структурам, и из фрагментов предварительных моделей была собрана гибридная модель (этап 3). Гибридная модель была наложена на структуры шаблонных ферментов. На основании выравнивания аминокислотных последовательностей M.EcoRII, M.Hhal и М.НаеШ была построена новая модель в двух версиях - с помощью пакетов программ MODELLER и SWISS-MODEL (этап 4). Качество двух версий модели оценивалось с помощью метода MetaMQAP (этап 5). Далее для улучшения качества построенной модели проводилось изменение выравнивания аминокислотных последовательностей M.EcoRII, M.Hhal и М.НаеШ в проблемных районах (этап 6). После изменения выравнивания была построена новая модель (также в двух версиях), и процедура повторялась до тех пор, пока почти все районы M.EcoRII не стали удовлетворительными. Далее из наилучших районов двух версий модели M.EcoRII была собрана гибридная модель (этап 7). На последнем этапе в модель были вставлены ДНК и AdoHcy из комплекса M.Hhal с ДНК-дуплексом 5 '-TGATAGCGCTATC/3 '-ACTATCGCGATAG и AdoHcy (этап 8). При моделировании ДНК-дуплекса, содержащего участок узнавания M.EcoRII, гетероциклические основания, принадлежащие ДНК-дуплексу, содержащему участок узнавания M.Hhal, постепенно меняли на желаемые, после чего следовала оптимизация стереохимии.

Для построения конечной модели M.EcoRII использовали результат множественного выравнивания аминокислотных последовательностей M.EcoRII, M.Hhal и М.НаеШ (рис. 5).

Рис. 5. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей M.EcoRII, M.Hhal и М.НаеШ. Консервативные аминокислотные остатки закрашены черным цветом, остатки со сходными химическими свойствами закрашены серым цветом. Десять консервативных аминокислотных мотивов обведены в рамки и пронумерованы. TRD находится между мотивами VIII и IX.

При моделировании М EcoRII не учитывали 82 аминокислоты с N-конца, ответственные за регулягорную функцию

2.2. Оценка модели M.EcoRII

Качество предсказанной структуры М EcoRII оценивалось с помощью метода MetaMQAP (https //genesihco pl/toolkit/mqap) (рис б) Параметром, характеризующим качество построенной модели, является MetaMQAP-Bec (MetaMQAP score) Он рассчитывается для каждой аминокислоты Чем ниже значение этого параметра, тем лучше промоделирована соответствующая аминокислота Видно, что модель обладает удовлетворительным качеством (рис б)

Рис 6 Оценка модели М ЕсоКП на основе графика зависимости Ме1аМС>АР-веса от аминокислоты

83 103 123 143 133 183 203 223 243 263 283 303 323 343 363 333 403 423 443 463 483

номер аминокислоты

Функционально важные районы MEcoRII, расположенные в консервативных мотивах (рис 5), характеризуются MetaMQАР-весами от 0 74 до 7 15 (рис 6) Модель также содержит два района (Leu322-Tyr342 и Asn400-Gln404) с очень высокими MetaMQAP-весами Оба этих района не участвуют во взаимодействиях с ДНК (см ниже) Район Asn400-Gln404 отсутствует в шаблонных структурах MHhal и MHaelII и не может быть улучшен посредством изменения выравнивания

2.3. Описание модели M.EcoRH

Согласно построенной модели, М EcoRII обладает двухдоменной структурой, характерной для всех С5-МТаз (рис 7А) Как и ожидалось, структура большого домена (рис 7А) в целом аналогична структуре больших доменов M.HhaI и М HaelII (О 'Gara, el al, 1996, Remisch et al, 1995) Однако некоторые петли в М EcoRII длиннее соответствующих петель в М Hhal и М HaelII Так, петля между a-спиралью в составе консервативного мотива II и Р-цепью в составе консервативного мотива IV в MHhal (Asn52-His72) и M.HaeIII (Ser40-Cys62) состоит из 21-го и 23-х аминокислотных остатков, соответственно, в то время как в MEcoRII (Trpl37-Hisl77) ее длина составляет 41 аминокислотный остаток Каталитическая петля между Э-цеяыо в составе консервативного мотива IV и a-спиралью в составе консервативного мотива V в MEcoRII (Glyl83-Ala210) также длиннее, чем в шаблонных структурах MHhal (Gly78-Tbr99) и М HaelII (Gly68-Asp85) Петля между Р-цепями в составе консервативных мотивов VII и VIII в MEcoRII (Lys269-His284) состоит из 16-ти

аминокислотных остатков, в то время как в М.НИаГ (Ьеи155-Ьуз162) и М.НаеШ (Авп145-Уа1149) ее длина составляет 8 и 5 аминокислотных остатков, соответственно. А Б

AdoHcv

каталитическая

петля метилируемый цитозин

M-EcoRII

Рис.7. А - Структурная модель MEcoRII. Черным цветом выделены петли в большом домене M.EcoRn, которые длиннее соответствующих петель в больших доменах M.Hhal (О'Gara, et al., 1996) и М.НаеШ (Reinisch et al., 1995). Указанные аминокислотные остатки обозначают начало и конец петель. Б - структурная модель тройного комплекса M.EcoRK-JIHK-AdoHcy. Каталитическая петля выделена черным цветом.

Малый домен M.EcoRII отличается от малых доменов M.Hhal и М.НаеШ, что связано с различием узнаваемых этими МТазами нуклеотидных последовательностей.

2.4. Предсказанные взаимодействия M.EcoRII с ДНК.

Для того, чтобы предсказать контакты между M.EcoRII и ДНК, был промоделирован комплекс M.EcoRII с каноническим ДНК-дуплексом 10¡¡, являющимся укороченным на две нуклеотидные пары аналогом ДНК-дуплекса 10 (табл. 2), в присутствии AdoHcy (рис. 7Б). Структура комплекса соответствует стадии метилирования, на которой происходит образование ковалентной связи между консервативным остатком цистеина 186 и атомом углерода С6 метилируемого остатка цитозина (Wyszvnski et al., 1993; Friedman & Artsari., 1992). При формировании комплекса между M.EcoRII и ДНК возможны две ситуации: белок метилирует цитозин:, находящийся в цепи, содержащей последовательность CCAGG (#1) или CCTGG (#2) (нумерация пар начинается с 5'-конца метилируемой цепи).

#1 #2 активный центр 4 3

1 2 34 Г 5'-CCAGG--GGTCC-,

С - метилируемый цитозин

активный центр

Предсказанные взаимодействия между M.EcoRII и ДНК для ситуации #1 показаны на рис. 8. Указаны контакты между донорами (акцепторами) протонов в гетероциклических основаниях и соответствующими группами в боковых радикалах или в основной цепи фермента и контакты МТазы с межнуклеотидными фосфатными группами углеводофосфатного остова ДНК, образованные за счет водородных связей.

Рассмотрим возможные контакты М.ЕсоЯП с ДНК, обеспечивающие ДНК-белковое узнавание и катализ в ситуации #1 (рис. 8) и как они соотносятся с экспериментальными данными (табл. 2). Для сопоставления привлекались экспериментальные данные для субстратов, содержащих модификации в каждой из симметричных пар для обеих ориентации. Эти данные были получены в нашей лаборатории Субач О.М. (ЭиЬасИ е/ а/., 2004) и Бревновым М.Г. (Кудан и др., 2007).

Рис. 8. Схема, показывающая предсказанные контакты между М.ЕсоШ1 и ДНК. Нуклеозидные остатки

представлены в виде прямоугольников, фосфаты - 8 виде кружков. Аминокислоты, взаимодействующие с ДНК, обозначены

посредством однобуквенного кода и соответствующих номеров. В рамки взяты аминокислоты, расположенные в большом домене М.ЕсоЫ1. Контакты между ферментом и ДНК показаны стрелками. Штрих-пунктирными стрелками обозначены контакты, образованные атомами белка, входящими в состав пептидной связи.

Пара С-С (I) участка узнавания. По данным моделирования С этой пары не образует прямых контактов с ферментом. Это подтверждается тем, что при замене данного С на 2Р, когда удаляется экзоциклическая аминогруппа, метилирование модифицированной цепи дуплекса 18 М.ЕсоЯП полностью сохраняется (табл. 2, дуплекс 18). Кроме того, это хорошо согласуется с тем, что при замене данного С на ¡и, выход конъюгата М.ЕсоШ1 с ДНК-дуплексом 8 очень низкий (табл. 1). ЫНг-группа в взаимодействует с карбонильным кислородом пептидной связи в составе Ьеи191. Данный контакт, вероятно, способствует правильному расположению А1а192 из каталитической петли (см. ниже). Пара С-С (2) участка узнавания. «Выпетленный» С взаимодействует с рядом консервативных остатков (РЬе184, 01и233 и А^287). Подобно РЬе79 в М.НЬа1 (КИтаяашказ е1 а1, 1994), карбонильный кислород РЬе184, расположенного в консервативном мотиве IV, образует водородную связь с аминогруппой «выпетленного» С. Боковая цепь \rglbl, расположенного в консервативном мотиве VIII, взаимодействует с атомом кислорода 02 «выпетленного» С. В случае М.НЬа! соотвествующий остаток аргинина (А^165) принимает участие в «выпетливании» метилируемого С, способствуя его правильной ориентации для осуществления метилирования (Же/г е< а!., 2006). Боковая цепь 01и233, расположенной в консервативном мотиве VI, образует водородные связи с атомом азота N3 и аминогруппой

«выпетленного» С В случае М Hhal соответствующий остаток глутаминовой кислоты (Glull9) принимает непосредственное участие в кислотно-основном катализе в процессе метилирования (Shieh et al, 2007) Можно предположить, что в случае М EcoRII функции Phel84, Arg287 и Glu233 аналогичны функциям Phe79, Argl65 и Glull9 в MHhal Ковалентное присоединение ДНК-дуплексов 6 и 7 (табл 1), содержащих iU вместо метилируемого С, происходит к области М EcoRII Leu84-Met251 (см раздел 1) Можно предположить, что Phel84 является наиболее вероятным кандидатом на фотоприсоединение к iU в данном случае NH2-rpynna и атом кислорода Об гуанина взаимодействуют с карбонильным кислородом А1а192 и боковой цепью Туг376, соответственно При удалении этого G (табл 2, дуплекс 15) контакты с ферментом пропадают Однако одновременно пропадают контакты этого G с комплементарным С, что, по-видимому, облегчает «выпетливание» С для осуществления метилирования Благодаря этому, вероятно, сохраняется остаточное метилирование дуплекса 15 (табл 2) При замене данного G на 2АР, когда пропадает связь с Туг376, но сохраняется связь с А1а192, метилирование практически полностью сохраняется (табл 2, дуплекс 12) Можно предположить, что Ala 192 участвует в стабилизации G после «выпетливания» метилируемого С

ПараА-Т (3) участка узнавания Остаток А не образует водородных связей с ферментом Это хорошо согласуется с тем, что при замене А на 2'-дезоксиинозин (I), когда аминогруппа меняется на оксогруппу, сохраняется эффективное метилирование I-содержащего ДНК-дуплекса М EcoRII (Kiss et al, 2001) Блокировка метилирования при замене А на 2АР (табл 2, дуплекс 13) может объясняться тем, что при перемещении ЫНг-группы из положения б в положение 2 возникает сгерический конфликт между аминокислотами из большого домена М EcoRII и аминогруппой 2АР, экспонированной в малую бороздку ДНК (Kiss et al, 2001) Ковалентное присоединение ДНК-дуплекса 5 (табл 1), содержащего iU вместо А, происходит к области М EcoRII Gly268-Met391 (см раздел 1) Наиболее вероятным кандидатом на фотоприсоединение к iU в данном случае является остаток Туг376 Остаток Т не образует контактов с ферментом Это находится в соответствии с тем, что при удалении Т сохраняется остаточное метилирование немодифицированной цепи дуплекса 16 (табл 2) Пара G-C (4) участка узнавания Боковая цепь His377 образует водородную связь с атомом кислорода Об гуанина Это находится в соответствии с тем, что при замене данного G на остаток 2АР, когда удаляется атом кислорода Об, происходит блокировка метилирования модифицированной цепи дуплекса 12 (табл 2) Карбонильный кислород His377 взаимодейстует с ЫИг-группой С Ковалентное присоединение ДНК-дуплексов б и 7 (табл 1), содержащих iU вместо данного С, происходит к области М EcoRII Gly268-Met391 (см

раздел 1) Можно предположить, что Нк377 является наиболее вероятным кандидатом на фотоприсоединение к в данном случае

Пара О-С (5) участка узнавания Боковая цепь кх%У1Ь образует водородную связь с атомом кислорода Об гуанина Это хорошо согласуется с тем, что при замене данного в на 2АР происходит блокировка метилирования (табл 2, дуплекс 11) Остаток С предположительно не образует контактов с ферментом Это находится в соответствии с тем, что при замене данного С на 2Р метилирование практически полностью сохраняется (табл 2, дуплекс 18)

Таблица 2 Влияние аналогов гетероциклических оснований на метилирование каждой из _цепей ДНКМВсоЫ!_

Относительная

№ ДНК-дуплекс X" эффективность метилирования, % Ссылка

10 5' АСАСССА«ЗТТСОС 3' ТСТС®5ТССААСС6 - 100 100

11 5' АОАСССАвХТТОСС 2АР 0 {Кудан и

3'ТСТСветССААССС 0 др, 2007)

12 5' АвАСССАХвТТОСС 2АР 0 (Кудан и

3' ТСТС»5ТССААСС0 74 др 2007)

13 5' АСАСССХввТТСЙС 2АР 0 (Кудан и

3' ТСТС«5ТССААССС 0 др, 2007)

14 5'АбАСССАвХТТССС 0 (Кудан и

3' ТСТС«5ТССААССО 0 др, 2007)

15 5' АСАСССАбвТТСОС СМИ. 20 (Кудан и

3' ТСТСвХТССААССС 0 др, 2007)

16 5' АСАСССАЖЗТТСвС С1(Ж 26 (Кудани

3' ТСТС®ЗХССААСС6 0 др, 2007)

17 5'АСАСССАОвТТвОС 2Р 20 (ЗиЬасИ е/

3'ТСТСввХССААССС 20 а1, 2004)

1» 5'А0А6ССАСеТТССС 2Р 74 (ЗиЬасИ е1

3'ТСТС«5ТСХААССС 100 а1, 2004)

Нр| 1р Нр1

ОН 2АР ОН <Ш ОН 2Р

Контакты М ЕсоБШ с ДНК для симметричных пар 1, 2, 4 и 5, предсказанные для ситуации #2, ничем не отличаются от контактов в случае ситуации #1 Согласно построенной модели (данные не приведены) остаток Т, расположенный в метилируемой цепи, не образует водородных связей с ферментом Это хорошо согласуется с тем, что при замене данного Т на 1и выход конъюгата MEcoR.II с ДНК-дуплексом 5 очень низкий (табл 1) Значительное ухудшение метилирования при замене Т на 2Р (табл 2, дуплекс 17) может объясняться дестабилизацией ДНК-дуплекса 17 за счет введения некомплементарной пары оснований Ковалентное присоединение ДНК-дуплекса 2 (табл 1), содержащего с!аи вместо Т в метилируемой цепи, происходит к участку М ЕсоШ! 01и339-Тгр389 Согласно построенной модели в окружении Т (в пределах 10 А) находится участок фермента Т1п'371-1!е383

Следовательно, аминокислотные остатки района Glu339-Trp389 действительно могут принимать участие во взаимодействии с ДНК. Остаток А также не образует водородных связей с ферментом. Как и для ситуации #1, когда А находится в метилируемой цепи, блокировка метилирования при замене А на 2АР (табл. 2, дуплекс 13) может объясняться тем, что при перемещении ЫНг-группы из положения 6 в положение 2 возникает стерический конфликт между аминокислотами из большого домена M.EcoRII и аминогруппой 2АР, экспонированной в малую бороздку ДНК.

3. Моделирование по гомологии ДНК-метилтрансферазы SssI и ее комплекса с ДНК и AdoHcy

Следующим этапом работы было моделирование пространственной структуры M.SssI и ее комплекса с ДНК и AdoHcy. Основная процедура моделирования была аналогична процедуре моделирования M.EcoRII (рис. 4, стр. 12). Единственное отличие заключалось в том, что для оценки качества промежуточных моделей и конечной модели M.SssI был использован метод Verify3D (Luethy et ai, 1992).Наилучшими шаблонами для моделирования также были признаны M.Hhal (PDB код 3mht) и М.НаеШ (PDB код ldct). Для построения конечной модели M.SssI использовали результат множественного выравнивания аминокислотных последовательностей M.SssI, M.Hha! и М.НаеШ, представленный на рис. 9. M.SssI длиннее M.Hhal и М.НаеШ благодаря присутствию вставки Lys65-Lysl10, отсутствующей в шаблонных белках. При моделировании данный район не учитывался.

Рис. 9. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей M.SssI, M.Hhal и М.НаеШ. Обозначения как на рис.5.

3.1. Оценка модели M.SssI

Качество предсказанной структуры M.SssI оценивалось с помощью метода Verify3D (рис. 10). Параметром, характеризующим качество построенной модели, является Verify3D-вес (Verify3D score). Он рассчитывается для каждой аминокислоты. Чем выше значение

данного параметра, тем лучше промоделирована данная аминокислота. Значение Уеп1уЗП-веса ниже 0.1 свидетельствует о высокой вероятности неправильного моделирования соответствующего района белка. Из рис. 10 видно, что модель обладает удовлетворительным качеством. Функционально важные районы М.8$з1, расположенные в консервативных мотивах I, IV, V, УП-Х (рис. 9), характеризуются Уеп1уЗО-весами от 0.3 до 0.6. Модель также содержит несколько районов с очень низкими или отрицательными УепЛ'ЗВ-весами.

йа ад

С

> 1

0,5

Рис. 10. Оценка § °'4

модели М.Ээз! на а ад основе графика зависимости УелГуЗБ-веса от номера

аминокислоты. номер аминокислоты

Некоторые из них (Ьу832-Туг35, А8п57-11е118 и С1у350-РЬе358) отсутствуют в шаблонных структурах М.НЬа1 и М.НаеШ и не могут быть улучшены посредством изменения выравнивания. Другие районы (Туг182-Азп196, являющийся частью консервативного мотива VI, и 8ег264-РЬе280, являющийся частью ЖО, рис. 9) соответствуют районам шаблонных структур, которые также характеризуются низкими VerifyЗD-вecaми.

3.2. Описание модели М.88в1

Согласно построенной модели, М.8:»1 обладает двухдоменной структурой,

характерной для всех С5-Мтаз (рис. 11 А). А

каталитическая

метилируемый цитозин

М^!

Рис.11. А - Структурная модель М.Звз! Черным цветом выделена петля, которая присутствует в малых доменах М.Язк! и М.НЬа! и отсутствует в малом домене Шт12. Указанные аминокислотные остатки обозначают начало и конец петли. Б - структурная модель тройного комплекса М.8зз1-ДНК-АйоНсу. Каталитическая петля выделена черным цветом.

Структура большого домена М.8зв1 в целом аналогична структуре больших доменов М.НЬа1 и М.НаеШ. Сравнение структуры малого домена М.Ээв! со структурами малых доменов М.НЬа! (участок узнавания вСвС) и Сй-узнающей эукариотической метилтрансферазы

Оппи2 (РОВ код ^55) показывает, что, несмотря на общее сходство, в строении малых доменов этих ферментов имеются и некоторые отличия. Петли Рго307-8ег321 в М.Бзя! и С1п284-Туг300 в ОппЦ2 состоят из 15-ти аминокислотных остатков, в то время, как в М.НЬа1 аналогичная петля ТЬг244-01у263 состоит из 20-ти аминокислотных остатков. Большая длина петли в М.НЬа!, по сравнению с петлями в М-Бэв! и Опш12 связана с более длинным участком узнавания этой МТазы. С другой стороны петля Ьуз282-С1и301 в М.5эз1 и Азп216-01у238 в М.НЬа! отсутствует в Эпш12. Однако в ОштП2 есть петли, отсутствующие в М^в! и М.НЬаГ

Таким образом, в целом структура малого домена Св-узнающей прокариотической МТазы ЗвяГ подобна структуре малого домена прокариотической МТазы НЬа1. Однако одна из петель в ТЯГ) М^в!!, аминокислотные остатки которой принимают участие в непосредственных взаимодействиях с ДНК, больше похожа на соответствующую петлю в ТЕШ Св-узнающей эукариотической метилтрансферазы Опт12.

3.3. Предсказанные взаимодействия М.вззГ с ДНК.

Для предсказания контактов между М^вэ! и ДНК был промоделирован комплекс М.Бвв! с каноническим ДНК-дуплексом 5'-САОТОСССТТОО/3'-СТСАСССОААСС (19) в присутствии АёоНсу (рис. 11Б). Структура комплекса соответствует стадии метилирования, на которой должна образоваваться ковалентная связь между консервативным остатком Суз 141 и атомом углерода С6 метилируемого остатка цитозина. Предсказанные взаимодействия между М.Зэв! и ДНК показаны на рис. 12.

Ш 3-

^ТштГ^

э317

о

Рис. 12. Схема,

показывающая предсказанные контакты между М.ЕсоМ1 и ДНК. Обозначения как на рис. 8.

с и

А И О с в

® ®

к2

(£)©5'

К333 К362

«Выпетленный» С образует контакты с рядом консервативных аминокислот из большого домена М^э! (РЬе139, ОЫ186 и Аг§232). Подобно РЬе79 в М.НЬа1 (КИтазаиякаэ е/ Ы„ 1994), карбонильный кислород основной цепи РЬе139, расположенного в консервативном мотиве IV, образует водородную связь с аминогруппой «выпетленного» С. Боковая цепь А^232, расположенного в консервативном мотиве VIII, взаимодействует с атомом кислорода 02 «выпетленного» С. Боковая цепь 01и186, расположенной в консервативном мотиве VI,

взаимодействует с атомом азота N3 и аминогруппой С Как уже упоминалось, в случае М М1а1 было показано, что соответствующие остатки аргинина и глутаминовой кислоты (Аг§165 и 01и119) принимают участие в катализе (Зйге/г е( а1, 2006, $ЫеЪ. е/ а1, 2007) Остатки ЯпШ и С1п146, расположенные в консервативном мотиве IV, образуют водородные связи с экспонированными в малую бороздку ДНК аминогруппами гуанинов участка узнавания неметшшруемой цепи и фланкирующей нуклеотидной последовательности метилируемой цепи, соответственно Два сериновых остатка (ЗегЗОО и ЭегЗ 17), расположенные в ТМ), образуют контакты с ДНК со стороны большой бороздки Атомы кислорода и азота основной цепи вегЗОО образуют водородные связи с аминогруппой цитозина и атомом кислорода Об гуанина неметшшруемой цепи, соответственно Боковая цепь 5егЗ 17 взаимодействует с атомом азота N7 гуанина метилируемой цепи, что хорошо согласуется с результатами футпринтинга комплекса М вей! с ДНК (КепЬаит е1 а1, 1995)

Помимо контактов М Збэ! с гетероциклическими основаниями участка узнавания предсказаны контакты М Эвз! с межнуклеотидными фосфатными группами, образованные за счет водородных связей (рис 12) Эти контакты распространяются в направлении 5'-концов от участка узнавания, что хорошо согласуется с данными по футпринтингу комлпекса М Зээ! с ДНК (КепЬаит е/ а\, 1995) Одним из аминокислотных остатков, взаимодействующих с углеводофосфатным остовом, является Т11г313 из консервативного дипептидаТЬг313Ьеи314, расположенного в ТЫ) ТЬг313 образует водородную связь с 5'-фосфатом остатка гуанина с 5'-конца от «выпетленного» остатка цитозина В случае МН11а1 соответствующий остаток треонина (ТЬг250) участвует в стабилизации «выпетленного» цитозина в процессе реакции метилирования (УйкаНи е1 а1, 2000)

Для проверки функциональной значимости ряда аминокислотных остатков М Бвэ! (С1п147, 01и186, Ал^32, БегЗОО и ТЬг313) в нашей лаборатории Дарий М В были получены мутантные формы М ЗБв! по этим аминокислотным остаткам, и изучена их каталитическая активность и способность образовывать комплексы с ДНК (Дарий и др, 2007, Дарий и др, неопубл данные) Согласно построенной модели консервативные остатки 01и186, А^32 и ТЪг313 взаимодействуют с ДНК (рис 12) и с высокой вероятностью принимают участие в катализе, осуществляемом М Экспериментальные данные, полученные Дарий М В, подтверждают необходимость 01и186, А^32 и Т1гг313 для каталитической активности МБзэ!

Рассмотрим контакты вариабельных аминокислотных остатков М с ДНК (рис 12) Согласно построенной модели комплекса М ЗэзЬДНК-АёоНсу можно предположить, что 01п147 в М ЗввГ подобно 8ег87 в М НЬа! и ЗегЗОО в М Бээ! подобно 01п237 в М НЬа1 занимают пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого С

(Klimasauskas et al, 1994) Но в отличие от Ser87 в М Hhal, который не взаимодействует с ДНК по данным РСА, Glnl47 в М Sssl предположительно взаимодействует с неспаренным G со стороны малой бороздки ДНК по данным моделирования Экспериментальные данные, полученные Дарий МВ, подтверждают важность Glnl47 для каталитической активности М Sssl Согласно построенной модели Ser300 взаимодействует с гетероциклическими основаниями неметилируемой цепи участка узнавания В случае М Hhal было установлено, что Gln237 не важен для связывания и метилирования ДНК, однако участвует в стабилизации неспаренного гуанина после «выпетливания» метилируемого цитозина В случае MSssI замена Ser300 на другие аминокислотные остатки не приводила к значительному ухудшению связывания или блокировке метилирования (Дарий и др, 2007) На основании теоретических и экспериментальных данных можно предположить, что в случае М Sssl роль Ser300 также заключается в стабилизации неспаренного гуанина

Подводя итог, можно отметить, что предсказания, сделанные на основе построенных моделей М Есо1Ш-ДНК-А(1оНсу и М SssI^HK-AdoHcy, обладают достаточно высокой точностью В случае модели М EcoRII-ДИК-AdoHcy предсказанные контакты М EcoRII с ДНК хорошо согласуются с экспериментальными данными, полученными с помощью ФМ М EcoRII фотоактивными ДНК-дуплексами, а также данными, имеющимися в литературе В случае модели М SssI-flHK-AdoHcy предсказанные контакты консервативных аминокислотных остатков (Glul86, Arg232 и Thr313) с ДНК были подтверждены путем изучения свойств мутантных форм М Sssl Также, что особенно важно, была подтверждена необходимость Glnl47, не являющегося консервативной аминокислотой, для функционирования М Sssl

ВЫВОДЫ

1 Получены конъюгаты М EcoRII с ДНК-дуплексами, содержащими остатки 5-иодурацила и 5-[4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил]-2-урацила в различных

т

положениях участка узнавания EcoRII (СС /aGG) Выходы конъюгатов зависят от типа модификации и ее локализации в участке узнавания

2 Проведено расщепление химическими реагентами продуктов фотоприсоединения фотоактивных ДНК-дуплексов к М EcoRII Установлено, что метилируемый цитозин сближен с областью L84-M251 (мотивы I-VI), а центральное основание метилируемой цепи участка узнавания - с областью E339-W389 (TRD)

3 Построена модель комплекса М EcoRII с ДНК и аналогом кофактора AdoHcy Согласно модели остатки F184 (мотив IV), Е233 (мотив VI) и R287 (мотив VIII) участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина, а А192 (мотив IV) участвует в стабилизации

неспаренного гуанина Остаток LI91 (мотив IV) взаимодействует с «внешним» гуанином

неметшшруемой цепи участка узнавания Остатки R375, Y376 и Н377 (TRD) участвуют в т

узнавании СС /aGG, при этом R375 и Н377 взаимодействуют с «внешним» и «внутренним» гуанинами метилируемой цепи, соответственно, Н377, кроме того, образует контакт с «внутренним» цитозином неметшшруемой цепи, Y376 взаимодействует с «внутренним» гуанином неметилируемой цепи Контакты R375 и Н377 с гуанинами подтверждены экспериментально

4 Построена модель комплекса MSssI с ДНК и аналогом кофактора AdoHcy Согласно модели остатки F139 (мотив IV), Е186 (мотив VI), R232 (мотив VIII) и Т313 (TRD) участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина Остатки Q147 (мотив IV) и S300 (TRD) занимают пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина и взаимодействуют с неметилируемой цепью участка узнавания Остаток S317 (TRD) участвует в узнавании CG Роль остатков Q147, Е186, R232 и Т313 подтверждена экспериментально

Освовные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1) Кудан Е В . Бревнов M Г, Субач О M, Речкоблит О А, Буйницкий Я M, Громова Е С Зондирование контактов ДНК-метилтрансферазы EcoRII с ДНК с помощью аналогов субстрата и молекулярного моделирования //Молекуляр биология, 2007, т 41, стр 885899

2) Koudan Е V. Bujnicki J M, Gromova E S Homology modelmg of the CG-specific DNA methyltransferase Sssl and its complexes with DNA and AdoHcy // J Biomol Struct Dyn, 2004, v 22, p 339-345

3) Koudan. E V. Subach, О M, Korshunova, G A, Romanova, E A, Entja, R, Gromova, E S DNA Duplexes Containing Photoactive Derivatives of 2'-Deoxyundme as Photocrosslinking Probes for EcoRII DNA Methyltransferase-Substrate Interaction // I Biomol Struct Dyn, 2002, v 20, p 421-428

4) Кудан EВ. Гриценко ОМ Исследование метилазы EcoRII методом фотоафинной модификации // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001", с 180, 2001, Москва, Россия

Подписано в печать 14.03 2008 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п л. Тираж 100 экз. Заказ № 705 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к. А-102

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. С5-ДНК-метилтрансферазы ЕсоШ! и Збб!

Обзор литературы).

1.1. Общие'сведения о прокариотических С5-ДНК-метилтрансферазах.

1.2. Моделирование С5-МТаз по гомологии.

1.3. ДНК-метилтрансфераза Бээ!.

1.3.1. Общие сведения о ферменте.

1.3.2. Изучение механизма взаимодействия М.8зз1 с ДНК.

1.3.3. Применение М^б! в молекулярной биологии.

1.4. ДНК-метилтрансфераза ЕсоШ1.

1.4.1. Общие сведения о ферменте.

1.4.2. Изучение механизма взаимодействия М.ЕсоШ1 с кофактором.

1.4.3. Изучение механизма взаимодействия М.ЕсоКП с ДНК.

1.4.4. М.ЕсоШ1 как регулятор гена М.Есо1Ш.

1.4.5. Применение М.ЕсоШ1 в молекулярной биологии.

1.5. Дезаминирование метилируемого остатка цитозина.

Глава 2. Зондирование контактов ДНК-метилтрансфераз ЕсоШ! и Збб! с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования (Обсуждение результатов).

2.1. Зондирование контактов ДНК-метилтрансферазы ЕсоШ1 с ДНК методом фотоаффинпой модификации.

2.1.1. Дизайн аналогов субстрата.

2.1.2. Взаимодействие М.ЕсоМ1 с аналогами субстрата, содержащими остаток 5-[4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазиринЗ-ил)фенил]-2-урацила.

2.1.3. Взаимодействие М.ЕсоМ1 с аналогами субстрата, содержащими остаток 5-иодурацила.

2.1.4. Анализ продуктов ковалентного присоединения М.ЕсоШ к ДНК-дуплексам II, У-УН.

2.2. Моделирование по гомологии ДНК-метилтрансферазы EcoR.II и ее комплекса с ДНК и АёоНсу.

2.2.1. Общая стратегия моделирования.

2.2.2. Оценка модели М.Есо1Ш.

2.2.3. Описание модели М.ЕсоЫ1 и ее комплекса с ДНК и А(1оНсу.

2.2.4. Предсказанные взаимодействия М.ЕсоКП с ДНК.

2.2.5. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными.

2.3. Моделирование по гомологии ДНК-метилтрансферазы SssI и ее комплекса с ДНК и AdoHcy.

2.3.1. Общая стратегия моделирования.

2.3.2. Оценка модели M.SssI.

2.3.3. Описание модели M.SssI и ее комплекса с ДНК и AdoHcy.

2.3.4s. Предсказанные взаимодействия M.SssI с ДНК.

2.3.5. Предсказанные взаимодействия M.SssI с аналогом кофактора (AdoHcy).

2.3.6. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными.

Метилирование ДНК, осуществляемое ДНК-метилтрансферазами (МТазами), играет важную роль в регуляции многих биологических процессов, таких, как репарация ДНК,, защита клетки от проникновения чужеродной ДНК, регуляция транскрипции некоторых генов, конденсация хроматина и др. Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метальную группу от кофактора' ^-аденозил-ь-метионина (АёоМе!) на атом углерода С5 остатка цитозина, образуя 5-метилцитозин. В процессе реакции Ас1оМе[ превращается в ^-аденозил-ь-гомоцистеин (АёоНсу). К настоящему времени большая часть информации о структуре С5-МТаз и их комплексов с ДНК, а также о механизме реакции метилирования, получена при изучении двух прокариотических С5-МТаз - М.НЬа1 и М.НаеШ. Информация о других прокариотических МТазах и эукариотических ферментах ограничена. В связи с этим, актуальной задачей является изучение механизма метилирования ДНК и структуры комплексов расширенного круга прокариотических МТаз с ДНК. Кроме того, учитывая гомологию аминокислотных последовательностей эукариотических и прокариотических МТаз, целесообразным представляется использовать последние в качестве моделей для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами.

Объектом исследований в настоящей работе явились МТазы ЗббГ и ЕсоШ1, которые т узнают в ДНК последовательности СО и СС /дСС, соответственно, и метилируют в них остатки цитозина (С) по атому углерода в 5-ом положении. М^бГ является уникальной прокариотической МТазой, узнающей ту же нуклеотидную последовательность, что и эукариотичские МТазы. Имеются, данные, что эукариотические ферменты также могут т т метилировать С /д или СС /дбО участки. Для обеих МТаз данные рентгеноструктурного анализа (РСА) отсутствуют, и практически неизвестно, какие аминокислотные остатки ферментов обеспечивают узнавание ДНК и принимают участие в катализе.

Метод фотоаффинной модификации (ФМ) фермента модифицированными ДНК-дуплексами, содержащими фотоактивные группы, — один из наиболее перспективных методов, позволяющих определять аминокислотные остатки или участки фермента, ответственные за связывание ДНК или осуществление катализа.

В тех случаях, когда информация о ферменте ограничена, однако имеются данные РСА для родственных ферментов, широкое применение находит метод моделирования по гомологии, позволяющий предсказать пространственную структуру фермента на основании известных структур родственных ферментов. Существует два основных метода распознавания укладки белка. Один из них основан на анализе аминокислотных * последовательностей моделируемого белка и белков с известными структурами. В основе другого метода, получившего название «протягивание нити» (threading), лежит идея о том, что одинаковую упаковку могут иметь белки и с негомологичными аминокислотными последовательностями. Существует много программ для распознавания укладки белков и поиска шаблонов для моделирования, работа которых основана на одном из этих двух методов. Каждая из программ имеет свои'Сильные и слабые стороны. В последнее время в области моделирования белков по гомологии был достигнут значительный прогресс, связанный с созданием и развитием метасерверов, позволяющих получать более точные предсказания за счет комбинирования результатов, полученных несколькими независимыми программами. Модели белков, построенные с использованием метасерверов, обладают достаточно высоким качеством. На основании модели фермента и его комплекса с ДНК, можно сделать предположение о том, какие аминокислоты участвуют в связывании ДНК и катализе.

Целью настоящей работы явилось изучение ДНК-белковых контактов в комплексах M.EcoRII и M.SssI с ДНК и определение функционально значимых областей M.EcoRII с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования.

В задачи работы входило: 1) получение конъюгатов M.EcoRII с фотоактивными аналогами ДНК-субстрата; 2) определение участков M.EcoRII, к которым происходит ковалентное присоединение фотоактивных ДНК-дуплексов; 3) моделирование комплексов M.EcoRII-ДНК-AdoHcy и M.SssI-ДНК-AdoHcy и предсказание аминокислотных остатков М.ЕсоШ1 и М^ээ!, вовлеченных во взаимодействие с ДНК; 4) сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными для выявления наиболее вероятных контактов между ферментами и ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Получены конъюгаты M.EeoRII с ДНК-дуплексами, содержащими остатки 5иодурацила и 5-[4-(Э-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил]-2-урацила в различных т положениях участка узнавания EcoRII (СС /aGG). Выходы конъюгатов зависят от типа модификации и ее локализации в участке узнавания.

2. Проведено расщепление химическими реагентами продуктов , фотоприсоединения фотоактивных ДНК-дуплексов к M.EeoRII. Установлено, что метилируемый цитозин сближен с областью L84-M251 (мотивы I-VI), а центральное основание метилируемой цепи участка узнавания — с областью E339-W389 (TRD).

3. Построена модель комплекса M.EeoRII с ДНК и аналогом кофактора AdoHcy.

Согласно модели остатки F184 (мотив IV), Е233 (мотив VI) и R287 (мотив VIII) участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина, а Al92 (мотив IV) участвует в стабилизации неспаренного гуанина. Остаток L191 (мотив IV) взаимодействует с «внешним» гуанином неметилируемой цепи участка узнавания. Остатки R375, Y376 и Н377 (TRD) участвуют в т узнавании СС /aGG, при этом R375 и Н377 взаимодействуют с «внешним» и «внутренним» гуанинами метилируемой цепи, соответственно, Н377, кроме того, образует контакт с «внутренним» цитозином неметилируемой цепи, Y376 взаимодействует с «внутренним» гуанином неметилируемой цепи. Контакты R375 и Н377 с гуанинами подтверждены экспериментально.

4. Построена модель комплекса M.SssI с ДНК и аналогом кофактора AdoHcy. Согласно модели остатки F139 (мотив IV), Е186 (мотив VI), R232 (мотив VIII) и Т313 (TRD) участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина. Остатки Q147 (мотив IV) и S300 (TRD) занимают пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина и взаимодействуют с неметилируемой цепью участка узнавания. Остаток S317 (TRD) участвует в узнавании CG. Роль остатков Q147, Е186, R232 и Т313 подтверждена экспериментально.

2.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с тем, что сходство и различия в механизме действия С5-МТаз связывают, во многом, со сходством и различием их участков узнавания в ДНК, представлялось интересным проанализировать и сравнить механизмы взаимодействия с ДНК трех С5-МТаз: М.Ша1, М^в! и М.ЕсоЯН. Как уже упоминалось в гл. 1, для МТаз, узнающих похожие последовательности, можно выделить гомологичные фрагменты внутри ТИХ) [17, 18]. Участок узнавания М.Бяз! (СО) входит в состав участка узнавания М.НЬа! (вСОС). Сравнение пространственных структур ДНК-узнающих доменов М.НЬа! и M.SssI показывает, что они содержат похожие элементы. Также можно отметить сходство и в механизме взаимодействия этих МТаз с ДНК. На рис. 23 представлено сравнение контактов M.SssI и M.Hhal с последовательностью GCGC. Остановимся подробнее на контактах между каждой из цепей ДНК (метилируемой и неметилируемой) и аминокилотными остатками ферментов. В случае M.SssI наблюдаются контакты гетероциклических оснований неметилируемой цепи участка узнавания с Ser300 и Gin 147. В случае M.Hhal наблюдаются контакты гетероциклических оснований неметилируемой цепи участка узнавания с Gln237 и Gly257.

119

J 46

R240„E « Q252 р79 S v2S4 гад Y

ГП пы G у G Н 0 cl G га G

3' ®V®y® ® 5' t

300

4®^®A® 5'

Q237 0 257

Рис. 23. Схемы, показывающие контакты между М.Бзб! (А, по данным моделирования) или М.НЬа! (Б. по данным РС А, [31 ]) и гетероциклическими основаниями в составе участков узнавания в ДНК. Обозначения как на рис. 17.

Как уже упоминалось в предыдущем разделе, замены 01п237 в М.НЬа! и ЭегЗОО в М.Ззб! на другие аминокислотные остатки не приводили к значительному ухудшению связывания ферментов с ДНК или блокировке метилирования. Данные остатки не важны для связывания и метилирования. Их роль заключается в стабилизации структуры ДНК после «выпетливания» метилируемого основания. С1у257 в М.НЬа!, взаимодействующий с 5'-концевым остатком цитозина, не входящим в состав участка узнавания М.ЭззЬ расположен в петле, отсутствующей в структуре М-Бээ!. Интересной аминокислотой является С1п147 в М.ЗззГ Показано, что данный аминокислотный остаток необходим для каталитической активности М.5зз1 [102].

Контакты с метилируемой цепью аналогичны для обоих ферментов. Оба фермента взаимодействуют с СО-последовательностью (центральной последовательностью в случае

M.Hhal). Интересно отметить, что в случае M.SssI на основе модели пресказан контакт

Q146 с 5'-концевым остатком гуанина, не входящим в состав участка узнавания M.SssI.

Наличие данного контакта косвенно подтверждается экспериментальными данными [61].

Вероятно, данный контакт необходим для правильного расположения Gin 147. В случае

M.Hhal, кроме того, наблюдается контакт Туг254 с З'-концевым остатком гуанина, не входящим в состав участка узнавания M.SssI. Данный аминокислотный остаток расположен в петле, отсутствующей в структуре M.SssI. т

Узнаваемая последовательность M.EcoRII (СС /aGG) значительно отличается от узнаваемых последовательностей M.HhaI и M.SssI. В связи с этим практически невозможно сравнивать схему контактов данного фермента с ДНК со схемами контактов M.Hhal и M.SssI с ДНК. Отличия наблюдаются и в механизме стабилизации «неспаренного» гуанина после «выпетливания» метилируемого цитозина. В структуре M.EcoRII отсутствует аминокислотный остаток, аналогичный Gln237 в M.Hhal и Ser300 в M.SssI. Возможно, стабилизация «неспаренного» гуанина в данном случае обеспечивается А1а192 (аналог Ser87 в M.Hhal и Glnl47 в M.SssI) и Туг376.

Подводя итог, можно отметить, что предсказания, сделанные на основе построенных моделей М.ЕсоКП-ДНК-Ас1оНсу и M.SssI-^HK-AdoHcy, обладают достаточно высокой точностью. В случае модели М.Есо1Ш-ДНК-А<1оНсу предсказанные контакты M.EcoRII с ДНК хорошо согласуются с экспериментальными данными, полученными с помощью ФМ M.EcoRII фотоактивными ДНК-дуплексами, а также данными, имеющимися в литературе. В случае модели M.SssI^HK-AdoHcy предсказанные контакты консервативных аминокислотных остатков (Glul86, Arg232 и Thr313) с ДНК были подтверждены путем изучения свойств мутантных форм M.SssI по этим аминокислотным остаткам. Также, что особенно важно, была подтверждена необходимость Gin 147, не являющегося консервативной аминокислотой, для функционирования M.SssI.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Реактивы и материалы Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остаток 5-[4-(3-(трифторметил)-3Н-диазиринЗ-ил)фенил]-2'-дезоксиурацила, были синтезированы Романовой Е.А. (Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ). Соответствующий амидофосфит для олигонуклеотидного синтеза был синтезирован Коршуновой Г.А. (Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ).

Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остаток 5-иод-2'-дезоксиурацила, были синтезированы Эритиа Р. (Испания, г. Барселона, Отдел молекулярной генетики, Национальный центр научных исследований).

Ферменты - МТаза EcoRII с активностью 1000 ед. акт./мкл и концентрацией 9 нМ выделена Кирсановой О.В. (химический факультет МГУ). HaN-конце фермента расположено дополнительно двадцать, аминокислотных остатков, из которых шесть являются остатками гистидина. За единицу активности M.EcoRII-принимали количество фермента, которое за 1 час при 37°С защищает 1 мкг ДНК фага X от расщепления эндонуклеазой рестрикции EcoRII. Плазмида для выделения фермента любезно предоставлена Вартапетяном А.Б. (Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ). В работе также использовалась Т4-полинуклеотидкиназа (коммерческий препарат).

Реактивы: 2-меркаптоэтанол, персульфат аммония, этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (Merck, ФРГ), формамид (Fluka, Швейцария), трис-(гидроксиметил)-аминометан, акриламид, мочевина, глицин (Диаэм, Россия), ATP (Fharmacia, США), красители - маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (ХС), N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, BNPS-скатол, 1,4-дитиотреитол,.глицерин, иодацетамид, S-аденозил-ь-гомоцистеин (Sigma, США), (у-32Р)-АТР с удельной радиоактивностью 1000 Юори/ммоль (ВО "Изотоп", Обнинск, Россия), додецилсульфат натрия, Ы,Ы'-метилен-бисакриламид (Life Technologies, Inc., США), ледяная уксусная кислота, муравьиная кислота (ООО "Авогадро", Россия), гуанидинхлорид, BrCN (ICN, США), ^-аденозил-ь-метионин (Serva, ФРГ).

Буферные растворы: А) 0.04 М Tris, рН 7.9, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 М ЭДТА, 5% глицерин; Б) 0.04 М Tris-HCl, рН 7.9, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 М ЭДТА; В) 0.375 М Tris-IIC1, рН 8.8; Г) 0.125 М Tris-HCl, рН 6.8; Д) 0.025 М Tris-глицин, рН 8.6, 0.0035 М ДСН; Е) 0.05 М Tris-борат, рН 8.3, 0.001 М ЭДТА; Ж) 0.025 М Tris-борат, рН 8.3, 0) 0.05 М КН2Р04, рН 7.0; 3) 0.05 М Tris-HCl, рН 9.0, 0.01 М MgCl2, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 спермидин; И) 0.04 М Tris-HCl, рН 7.9, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 М ЭДТА. Используемые кислоты, щелочи, соли и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации "осч".

3.2. Приборы и методы Спектры поглощения водных растворов олигонуклеотидов в УФ-области записывали на спектрофотометре "Hitachi", Model 150-20 (Япония) при комнатной температуре. Концентрацию нуклеотидного материала определяли спектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера. Оптические измерения проводили в кварцевых кюветах (длина опт. пути 1 см) фирмы "Pye unicam" (Англия) и "Hellma" (ФРГ). Молярные коэффициенты экстинкции одноцепочечных олигонуклеотидов общей формулой DpEpFpC.KpL и длиной п расчитывали с точностью

10% по формуле: ff^pfpc kpl =[2-(епрг. + £epf + Sfpc + . + £kpl) - ee - ef - ec - . - ек]/п. £•^=15.4 о.е./мкмоль, s2pdC =7.4 о.е./мкмоль, £^=11.5 о.е./мкмоль, e2pfr=8.7 о.е./мкмоль,

3.7 о.е./мкмоль, £M°píic=l0-6 о.е./мкмоль, £^=12.5 о.е./мкмоль, s™pdl =11.4 о.е./мкмоль, о.е./мкмоль, £™dC =7.3 о.е./мкмоль, e™pda =9-0 о.е./мкмоль, о.е./мкмоль, £^=12.6 о.е./мкмоль, e™pdC =8.8 о.е./мкмоль, ^¡L/G=10.8 о.е./мкмоль, sdGpdT=lO.O о.е./мкмоль, £2J¡°pdA =11.7 о.е./мкмоль, £^,-=8.1 о.е./мкмоль, =9.5 о.е./мкмоль, £™р[ГГ=%-4 о.е./мкмоль. рН растворов измеряли на потенциометре Model 701А фирмы Orion (США) с точностью до 0.005 рН. Препаративное микроцентрифугирование проводили на микроцентрифуге "Eppendorf-5414S" (Германия). Для упаривания микроколичеств водных растворов, а также для удаления следовых количеств этанола и ацетона использовали прибор "Speed Vac" (США). Микрообъемы растворов дозировали микрошприцами фирмы Hamilton (США) и автоматическими дозаторами фирмы Gilson (Франция) с точностью 5%.

Облучение комплексов M.EcoRII с ДНК-дуплексами 2 и 3 проводили с помощью УФ-лампы Mineralight (модель UVGL-58, мощность 6 Вт) со встроенным фильтром, излучающей УФ-свет с максимумом в районе А,~356 нм.

Облучение комплексов M.EcoRII с ДНК-дуплексами 4-9 проводили с помощью ртутной лампы сверхвысокого давления (мощность 10 Вт) с А>300 нм.

Электрофорез а) Электрофорез синтетических олигонуклеотидов проводили в плоском 20%-ном полиакриламидном геле (20% акриламида, 0,66% N,N'-метиленбисакриламида, 7 М мочевина в буфере Е) толщиной 0,75 мм при напряженности поля 50 В/см. Пробы наносили в 2-3 мкл 80%-ного водного раствора формамида, содержащего 1 М ЭДТА и красители-маркеры ХС (0,1%) и ВРВ (0,1%). б) Электрофорез комплексов ДНК-метилтрансферазы EcoRII с синтетическими субстратами в неденатурирующих условиях (метод "торможения в геле") проводили в плоском 18x16x0,075 см ПААГ (8% акриламида, 0.4% N,N'-метиленбисакриламида в буфере Ж) при напряженности поля 8,5 В/см. Пробы наносили в объеме 10 мкл (10 мкл реакционной смеси). в) Электрофорез белково-нуклеиновых комплексов и олигонуклеотидопептидов, полученных после расщепления белково-нуклеиновых комплексов химическими реагентами, проводили в плоском варианте (размер пластин 16x18 см, толщина геля - 0,75 мм или размер пластин 4x6 см, толщина геля - 0,75 мм). Концентрирующий гель — 4% акриламида, 0.104% М,М'-метиленбисакриламида, 0,1% ДСН в буфере Г; разделяющий гель -12.5% акриламида, 0.33% N,N'-метиленбисакриламида, 0,1% ДСН в буфере В. В качестве электродного использовали буфер Д. Напряженность поля в концентрирующем геле 75 В/см, в разделяющем геле - 25 В/см. Пробы наносили в объеме 5-12 мкл (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, 3% ДСН, 5% меркаптоэтанол, 8М мочевина, 5% глицерин, 0.1% ВРВ).

Для прокрашивания Кумасси R-250 гель вымачивали в фиксирующем растворе (100 мл СНзСООН, 200 мл С2Н5ОН, 200 мл Н20) в течение 10 мин, растворе Кумасси R-250 (50 мл СНзСООН, 150 мл С2Н5ОН, 300 мл Н20, 0.75 г Кумасси R-250) в течение 30 мин, после этого гель промывали 10%-ным раствором СНзСООН до обесцвечивания фона. Гели с концентрацией 8-15% сушили на приборе Gel Slab Dryer фирмы Hoefer Scientific Instruments (США).

32

Положение Р-меченных соединений определяли авторадиографией. Для авторадиографии использовали рентгенографическую пленку Retina Х-100 (ФРГ). Р-меченные олигонуклеотиды элюировали из геля 1 M водным раствором перхлората лития в течение 16 час. при комнатной температуре. Нуклеотидный материал осаждали ацетоном (2 раза). Осадок центрифугировали, промывали ацетоном и высушивали в вакууме.

Радиоактивность Р-меченных препаратов измеряли методом счета по Черенкову в импульсах в минуту на счетчике Delta 300 фирмы Тгасог (Нидерланды). Ошибка счета не превышала 2%.

3.3. Общие методики 3.3.1. Ферментативное 5'-фосфорилирование синтетических олнгонуклеотидов

5'-32Р-фосфорилирование 0,01 o.e. при А.=260 нм олнгонуклеотидов Т4-полинуклеотидкиназой (10 ед.акт.) проводили 120 мин при 37°С в буфере 3, содержащем (у- Р)-АТР; объем реакционной смеси 10 мкл. Продукты, содержащие "Р-метку, выделяли методом электрофореза в 20%-ном ПААГ в присутствии 7М мочевины.

3.3.2. Изучение метилирования модифицированных ДНК-дуплексов

Эффективность метилирования оценивали по количеству введенной в ДНК-дуплексы радиоактивной метки (С[3Н]з). ДНК-дуплексы 1,2 и 4-8 (0.35 мкМ) инкубировали с М.ЕсоШ1 (0.35 мкМ) в 10 мкл буферного раствора И, содержащего 1 мкКи [С[ Н]з]-АёоМе1 (15 Ки/ммоль), при 37 °С в течение 30 мин. Реакционные смеси (по 8 мкл) наносили на фильтры БЕ 81. Далее фильтры промывали 50 мМ раствором КН2РО4 (5x150 мл). Фильтры высушивали, помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и определяли радиоактивность 3Н-меченных препаратов. Относительный процент метилирования рассчитывали как отношение включения трития в ДНК-дуплексы 2 и 4-8 к включению трития в ДНК-дуплекс 1.

3.3.3. Изучение связывания модифицированных ДНК-дуплексов с М.ЕсоМ1

Образование комплексов ДНК-дуплекс - МТаза проводили в буферном растворе А, то содержащем 1 мМ Ас1оМе1 (или 1мМ Ас1оНсу). Конечная коцентрация Р-меченных ДНК-дуплексов (20000 имп/мин) составляла 0.35 мкМ. Концентрация М;ЕсоШ1 составляла 1.75 мкМ. Реакционную смесь объемом 10 мкл инкубировали 5 мин при 20°С, 15-20 мин при 0 °С. После электрофоретического разделения (условия см. выше) проводили авторадиографию геля. Выходы комплексов определяли как отношение радиоактивности комплекса фермент - ДНК к суммарному количеству радиоактивности комплекса и ДНК. В опытах по конкурентному ингибированию связывания диазиринсодержащих дуплексов с М.ЕсоШ1 в реакционную смесь, содержащую 32Р-меченный субстрат (0.35 мкМ) и фермент (1.75 мкМ), добавляли избыточное количество немеченного ^модифицированного ДНК-дуплекса в соотношении молярных концентраций немодифицированного дуплекса (ингибитора)/ модифицированного аналога субстрата 1, 4, 16 и 32.

3.3.4. Ковалентное присоединение модифицированных ДНК-дуплексов к М.ЕсоШ1

М.ЕсоШ1 (1.75 мкМ) инкубировали в 10 мкл буферного раствора Б, содержащего 0-2 мМ Ас1оМе1, с 32Р-меченными ДНК-дуплексами (0.35 мкМ) в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 15 мин при 0°С. Далее облучали УФ-светом с длиной волны 366 нм (в случае диазиринсодержащего дуплекса) и >300 нм (в случае иодурацилсодержащего дуплекса) в течение 15-30 мин при 0°С. Затем добавляли 1%-ный раствор ДСН (конечная концентрация в растворе 0,1%) и выдерживали их при 95°С в течение 5 мин для разрушения нековалентных комплексов. Реакционные смеси упаривали на БрееёУас, добавляли к образцам по 5-12 мкл раствора краски для белкового электрофореза и анализировали их методом гель-электрофореза (см. выше). После этого проводили авторадиографию. Выходы продуктов ковалентного присоединения, рассчитывали как отношение радиоактивности ковалентного конъюгата к суммарной радиоактивности ковалентного конъюгата и ДНК.

3.3.5. Картирование конъюгатов М.ЕсоКП с модифицированными ДНК-дуплексами химическими реагентами Расщепление конъюгатов М.ЕсоЯН—ДНК с помощью ВМРБ-скатола: Для проведения частичного расщепления ВЫРБ-скатолом лиофилизованные конъюгаты М.ЕсоШ1 с модифицированными цепями дуплексов 2 и-5 растворяли в 15 мкл 1%-ного раствора ДСН. Добавляли 35 мкл 100 мг/мл раствора ВКРБ-скатола и инкубировали реакционную смесь в течение 2 час при 37°С. Останавливали реакцию, добавляя 5 мкл 2-меркаптоэтанола. Расщепление конъюгатов М.ЕсоЯН — ДНК с помощью ВгСЫ: Для проведения исчерпывающего расщепления ВгСЫ лиофилизованные конъюгаты М.ЕсоЯН с ■ модифицированными цепями-ДНК-дуплексов 2, 5,-6 и 7 растворяли в 70 мкл муравьиной кислоты и добавляли 30 мкл 1 М раствора ВгСЫ в воде. Реакционную смесь инкубировали в течение 48 час при 25°С и в течение этого времени добавляли еще 5 мкл 12 М ВгСЫ. Затем реакционную смесь разбавляли двухкратным объемом воды и упаривали на БрееёУас, добавляли 2 раза по 100 мкл воды и упаривали раствор. Анализ продуктов расщепления ковалентных конъюгатов М.ЕсоИ1 с модифицированными цепями ДНК-дуплексов 2, 5, б и 7 химическими реагентами проводили с помощью гель-электрофореза в 12% ДСН-ПААГ, содержащем 4 М мочевину см. выше). Гель прокрашивали Кумасси R-250, затем проводили авторадиографию. Продукты расщепления идентифицировали, сравнивая с теоретическими массами олигонуклеотидопептидов, которые были вычислены как суммы масс олигонуклеотида и соответствующего пептида, и массами белковых маркеров молекулярного веса.

3.3.6. Моделирование M.EcoRII по гомологии

Для построения модели M.EcoRII использовали метод "Frankenshtein's monster" [98]. Был проведен анализ аминокислотной последовательности M.EcoRII с помощью сервера GeneSilico Metaserver http://www.genesilico.pl/meta [103], используя программы для распознавания упаковки белка: PDB-BLAST, FFAS-03 [104], FUGUE 2.0 [105], SAM-T02 [106], MGENETHREADER [107] и 3DPSSM [108] и предсказания вторичной структуры: PSI-PRED [109], SAM-T02 [106], PROF [110], PSSP [1 И] и SSPRO [112]. Наилучшими шаблонами для моделирования M.EcoRII были признаны структуры M.Hhal и M.HaelII. Были выбраны структуры, соответствующие PDB кодам 3mht [27] и ldct [37]. При моделировании M.EcoRII не учитывали 82 аминокислоты с N-конца, ответственных за регуляторную функцию. На основании парных выравниваний аминокислотной последовательности M.EcoRII с аминокислотными последовательностями M.Hhal и М.НаеШ, полученных с помощью различных программ, были построены предварительные модели M.EcoRII. Было проведено выравнивание всех предварительных моделей по третичным структурам путем совмещения их по полипептидному остову, используя программу Swiss-PdbViewer 3.7. Из фрагментов предварительных моделей создана гибридная модель. Принимали во внимание идентичность выравнивания по аминокислотной последовательности (локальное сходство между моделями). В тех районах, где наблюдались сильные различия в выравнивании по аминокислотной последовательности, выбирали фрагменты с наименьшими весами, рассчитанными с помощью метода MetaMQAP (https://genesilico.pl/toolkit/mqap). Гибридная модель M.EcoRII была наложена на структуры шаблонов, M.Hhal и М.НаеШ. Результат выравнивания аминокислотных последовательностей M.EcoRII и двух структурных шаблонов был использован для построения новой модели в двух версиях — с помощью пакетов программ MODELLER [113] и SWISS-MODEL [114]. Качество двух версий структурной модели M.EcoRII оценивали с помощью метода MetaMQAP. Чтобы улучшить качество модели M.EcoRII, изменяли выравнивание аминокислотных последовательностей M.EcoRII, M.Hhal и М.НаеШ в тех районах, которые характеризовались неудовлетворительными MetaMQАР-весами. Результат полученного выравнивания использовали для построения новой модели в двух версиях (с помощью MODELLER и SWISS-MODEL). Чтобы избежать наложения эффектов от изменения положения разных частей белка, за один раз изменялось выравнивание только в одном районе белка. На этом этапе для оценки достоверности модели принимали во внимание дополнительную информацию о предполагаемой вторичной структуре моделируемого белка и положении аминокислотных "вставок" и "пропусков" в петлях. Улучшенную модель также оценивали с помощью MetaMQAP и всю процедуру (изменение выравнивания в проблемных районах, построение новых моделей с помощью MODELLER и SWISS-MODEL и их оценка с помощью MetaMQAP) повторяли до тех пор, пока почти все районы белка не стали характеризоваться удовлетворительными MetaMQ АР-весами. Таким образом, в процессе построения модели M.EcoRII выравнивание аминокислотных последовательностей M.EcoRII, M.Hhal и М.НаеШ изменяли несколько раз. Результат каждого из выравниваний использовали для построения промежуточных моделей M.EcoRII. На последнем этапе две версии модели M.EcoRII были совмещены в программе Swiss-PdbViewer 3.7, и из фрагментов с лучшими MetaMQ АР-весами построена гибридная модель M.EcoRII.

3.3.7. Моделирование M.SssI по гомологии

Для построения модели M.SssI также использовали метод "Frankenshtein's monster". Основная процедура моделирования была такая же, как в случае моделирования M.EcoRII, за исключением того, что для оценки качества промежуточных моделей и конечной модели M.SssI был использован метод Verify3D [101]. Наилучшими шаблонами для моделирования M.SssI были признаны структуры M.Hhal [27] и М.НаеШ [37]. Были выбраны структуры, соответствующие PDB кодам 3mht и ldct. M.SssI длиннее M.Hhal и М.НаеШ, благодаря присутствию вставки Lys65-Lysll0, отсутствующей в шаблонных белках. При моделировании данный район не учитывался.

3.3.8. Оценка стереохимии моделей M.EcoRII и M.SssI

Стереохимия моделей M.EcoRII и M.SssI была проверена с помощью программы PROCHECK [99]. Было проведено сравнение параметров основной и боковых цепей M.EcoRII и M.SssI в моделях с параметрами основной и боковых цепей, соответственно, известных структур из банка данных PDB, определенных с разрешением 1,5 А.

3.3.9. Моделирование комплекса M.EcoRII (M.SssI) с ДНК и AdoHcy

ДНК и AdoHcy были вставлены в модель M.EcoRII (M.SssI) из комплекса M.Hhal с ДНК-дуплексом 5' -TGATAGCGCTATC/3' -ACTATCGCGATAG и AdoHcy после совмещения ферментов M.EcoRII (M.SssI) и M.Hhal по полипептидному остову в программе Swiss-PdbViewer 3.7. При моделировании ДНК-дуплекса, содержащего участок узнавания M.EcoRII (M.SssI), гетероциклические основания, принадлежащие ДНК-дуплексу, содержащему участок узнавания M.Hhal, постепенно меняли на желаемые, после чего следовала оптимизация стереохимии. На первом этапе оптимизировали геометрию ДНК методом молекулярной динамики в программе HyperChem 7.0 (силовое поле Amber99). При этом молекулы фермента, AdoHcy и воды оставались неподвижны. На втором этапе проводили оптимизацию геометрии всего комплекса M.EcoRII-ДНК-AdoHcy (M.SssI-ДНК-AdoHcy) минимизацией энергии в программе SCULPT 3.0 [115]. На этом этапе в процессе оптимизации все молекулы (ДНК, фермент, AdoHcy и молекулы воды) имели возможность перемещаться.

1. Jeltsch А. 2002. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. Chembiochem. 3, 274-293.

2. Громова E.C., Хорошаев A.B. 2003. Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. Молекуляр. биология. 37, 1-15.

3. Göll M.G., Bestor Т.Н. 2005. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu. Rev. Biochem. 74,481-514.

4. Wilson G.G. 1991. Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res. 19, 2539-2566.

5. Heitman J. 1993. On the origins, structures and functions of restriction-modification enzymes. Genet. Eng. (NY). 15, 57-108.

6. Szyf M., Gruenbaum Y., Urieli-Shoval S., Razin A. 1982. Studies on the biological role of DNA methylation: V. The pattern of E.coli DNA methylation. Nucleic Acids Res. 10, 724759.

7. Лихтенштейн A.B., Киселева Н.П. 2001. Метилирование и канцерогенез. Биохимия. 66, 293-317.

8. Newell-Price J., Clark A.J., King P. 2000. DNA methylation and silencing of gene expression. Trends Endokrinol. Metab. 11, 142-148.

9. Baylin S.B., Herman J.G. 2000. DNA hypermethylation in tumorogenesis: epigenetics joins genetics. Trends Genet. 16, 168-174.

10. Posfai J., Bhagwat A.S., Posfai G., Roberts R.J. 1989. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res. 17, 2421-2435.

11. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. 1994. The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res. 22, 1-10.

12. Kagan R.M., Clarke S. 1994. Widespread occurrence of three sequence motifs in diverse S-adenosylmethyonine-dependent methyltransferases suggests a common structure for these enzymes. Arch. Biochem. Biophys. 310, 417-427.

13. Smith H.O., Annau T.M., Chandrasegaran S. 1990. Finding sequence motifs in groups of functionally related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 826-830.

14. Cheng X. 1995. DNA modification by methyltransferases. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 4-10.

15. Cheng X., Roberts R.J. 2001. AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucleic Acids Res. 29, 3784-3795.

16. Klimasauskas S., Nelson J.L., Roberts R.J. 1991. The sequence specificity domain of cytosine-C5 methylases. Nucleic Acids Res. 19, 6183-6190.

17. Karyagina A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C., Nikolskaya I.I. 1995. The &oII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis. Gene. 157, 93-96.

18. Gopal J., Yebra M.J., Bhagwat A.S. 1994. DsaV methyltransferase and its isoschizomers contain a conserved segment that is similar to the segment in Hhal methyltransferase that is in contact with DNA bases. Nucleic Acids Res. 22, 4482-4488.

19. Vilkaitis G., Dong A., Weinhold E., Cheng X., Klimasauskas S. 2000. Functional roles of -the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase. J. Biol. Chem. 275, 38722-38730.

20. Wu J.C., Santi D.V. 1987. Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase. J. Biol. Chem. 262,4778-4786.

21. Chen, L. MacMillan A.M., Verdine G.L. 1993 .Mutational separation of DNA binding from catalysis in a DNA cytosine methyltransferase J. Am. Chem. Soc. 115, 5318-5319.

22. Lau E.Y., Bruice T.C. 1999. Active site dynamics of the Hhal methyltransferase: insights from computer simulation. J. Mol. Biol. 293, 9-18.

23. Osterman D.G., DePillis G.D., Wu J.C. Matsuda A., Santi D.V. 1988. 5-Fluorocytosine in DNA is a mechanism-based inhibitor of Hhal methylase. Biochemistry. 27, 5204-5210.

24. Cheng; X., Kumar, S., Posfai, J., Pflugrath, J.W., Roberts, RJ. 1993. Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. Cell. 74, 299307.

25. O'Gara, M., Zhang, X., Roberts, R.J., Cheng, X. 1999. Structure of a binary complex of Hhal methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine formed in the presence of a short non. specific DNA oligonucleotide. J. Mol. Biol. 287, 201-209.

26. O'Gara, M., Klimasauskas, S., Roberts, R.J., Cheng, X. 1996. Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. J. Mol. Biol. 261, 634-645.

27. O'Gara, M., Roberts, R.J., Cheng, X. 1996. Astructural basis for the preferential binding of hemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. J. Mol. Biol. 263, 597-606.

28. Shieh F-K., Youngblood B., Reich N.O. 2006. The role of Argl65 towards base flipping, base stabilization and catalysis in M.Hhal. J. Mol. Biol. 362, 516-527.

29. O'Gara, M., Horton, J.R., Roberts, R.J., Cheng, X. 1998. Structures of Hhal methyltransferase complexed with substrates containing mismatches at the target base. Nat. Struct. Biol. 5, 872-877.

30. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R.J., Cheng X. 1994. Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell. 76, 357-369.

31. Kumar, S., Horton, J.R., Jones, G.D., Walker, R.T., Roberts, R.J., Cheng, X. 1997. DNA containing 4'-thio-2'-deoxycytidine inhibits methylation by Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res. 25, 2773-2783.

32. Sheikhnejad, G., Brank, A., Christman, J.K., Goddard, A., Alvarez, E., Ford Jr.,

33. H., Marquez, V.E., Marasco, C.J., Sufrin, J.R., O'Gara, M., Cheng, X. 1999. Mechanism of inhibition of DNA (cytosine C5)-methyltransferases by oligodeoxyribonucleotides containing 5,6-dihydro-5-azacytosine. J. Mol. Biol. 285, 2021-2034.

34. Neely, R.K., Daujotyte, D., Grazulis, S., Magennis, S.W., Dryden, D.T., Klimasauskas, S., Jones, A.C. 2005. Time-resolved fluorescence of 2-aminopurine as a probe of base flipping in M.Hhal-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 33, 6953-6960.

35. Zhou, L., Cheng, X., Connolly, B.A., Dickman, M.J., Hurd, P.J., Hornby, D.P. 2002. Zebularine: A novel DNA methylation inhibitor that forms a covalent complex with DNA methyltransferases. J. Mol. Biol. 321, 591-599.

36. Reinisch K.M., Chen L., Verdine G.L., Lipscomb W.N. 1995. The crystal structure of Haelll methyltransferase covalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell. 82, 143-153.

37. Jia D., Jurkowska R.Z., Zhang X., Jeltsch A., Cheng X. 2007. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449, 248-251.

38. Dong A., Yoder J.A., Zhang X., Zhou L., Bestor T.H., Cheng X. 2001. Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA. Nucleic Acid Res. 29, 439-448.

39. Goll M.G., Kirpekar F., Maggert K.A., Yoder J.A., Hsieh C.L., Zhang X., Golic K.G., Jacobsen S.E., Bestor T.H. 2006. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science. 311, 395-398.

40. Shieh F-K., Reich N.O. 2007. AdoMet-dependent methyl-transfer: Glul 19 is essential for DNA C5-cytosine methyltransferase M.Hhal. J. Mol. Biol. 373, 1157-1168.

41. Youngblood B., Shieh F.K., Buller F., Bullock T., Reich N.O. 2007. S-adenosyl-L-methionine-dependent methyl transfer: observable precatalytic intermediates during DNA cytosine methylation. Biochemistry. 46, 8766-8775.

42. Mi S., Alonso D., Roberts RJ. 1995. Functional analysis of Gln-237 mutants of Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res. 23, 620-627.

43. Daujotyte D., Serva S., Vilkaitis G., Merkiene E., Venclovas C., Klimasauskas S. 2004. Hhal DNA methyltransferase uses the protruding Gln237 for active flipping of its target cytosine. Structure. 12, 1047-1055.

44. Estabrook R.A., Lipson R., Hopkins В., Reich N. 2004. The coupling of tight DNA binding and base flipping. J. Biol. Chem. 279, 31419-31428.

45. Bujnicki J.M. 2000. Homology modelling of the DNA 5mC methyltransferase M.BssHII. Is permutation of functional subdomains common to all subfamilies of DNA methyltransferases? Int. J. Biol. Macromol. 27, 195-204. '5

46. Karyagina A.S., Alexeevski A.V., Golovin A.V., Spirin S.A., Vorob'eva O.V., Kubareva E.A. 2003. Computer modeling of complex of (C5-cytosine)-DNA methyltransferase SsoII with target and regulatory DNAs. Biophysics. 48, Suppl.l, 45-55.

47. Schroeder S.G., Samudzi C.T. 1997. Structural studies of £coRII methylase: exploring similarities among methylases. Protein Eng. 10, 1385-1393.

48. Subach O.M., Khoroshaev A.V., Gerasimov D.N., Baskunov V.B., Shchyolkina A.K., Gromova E.S. 2004. 2-Pyrimidinone as a probe for studying the EcoRII DNA methyltransferase-substrate interaction. Eur J Biochem. 271, 2391-2399.

49. Кудан E.B., Бревнов М.Г., Субач O.M., Речкоблит O.A., Буйницкий Я.М., Громова Е.С. 2007. Зондирование контактов ДНК-метилтрансферазы EcoRII с ДНК с помощью аналогов субстрата и молекулярного моделирования. Молекуляр. биология. 41, 885899.

50. Nur I., Szyf M., Razin A., Glaser G., Rottem S., Razin S. 1985. Procaryotic and eukaryotic traits of DNA methylation in Spiroplasmas (Mycoplasmas). J. Bacteriol. 164, 19-24.

51. Pradhan S., Roberts R.J. 2000. Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain. EMBO J. 19, 2103-2114.

52. Дарий M.B., Кирсанова O.B., Друца B.JT., Кочетков С.Н., Громова Е.С. 2006. Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы Sssl. Молекуляр. биология. 40, 1-10.

53. Renbaum P., Razin А. 1992. Mode of action of the Spiroplasma CpG methylase M.SssI. FEBS Lett. 313, 243-247.

54. Matsuo K., Silke J., Gramatikoff K., Schaffner W. 1994. The CpG-specific methylase Sssl has topoisomerase activity in the presence of Mg2+. Nucleic Acid Res. 22, 5354-5359.

55. Renbaum P., Razin A. 1995. Interaction of M.SssI and M.Hhal with single-base mismatched oligodeoxynucleotide duplexes. Gene. 157, 177-179.

56. Renbaum P., Razin A. 1995. Footprint analysis of M.SssI and M.Hhal methyltransferases reveals extensive interactions with the substrate DNA backbone. J. Mol. Biol. 248, 19-26.

57. Marriott G., Ottl J., Heidecker M., Gabriel D. 1998. Light-directed activation of protein activity from caged protein conjugates. Methods Enzymol. 291, 95-116.

58. Rathert P., Rasko T., Roth M., Slaska-Kiss K., Pingoud A., Kiss A., Jeltsch A. 2007. Reversible inactivation of the CG specific Sssl DNA (cytosine-C5)-methyltransferase with a photocleavable protecting group. Chembiochem. 8, 202-207.

59. Gabbara S., Sheluho D., Bhagwat A.S. 1995. Cytosine methyltransferase from Escherichia coli in which active site cysteine is replaced with serine is partially active. Biochemistry. 34, 8914-8923.

60. Reither S., Li F., Gowher H., Jeltsch A. 2003. Catalytic mechanism of DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases revisited: covalent intermediate formation is not essential for methyl group transfer by the murine Dnmt3a enzyme. J. Mol.Biol. 329, 675-84.

61. Buryanov Ya., Shevchuk T. 2005. The use of prokaryotic DNA methyltransferases as experimental and analytical tools in modern biology. Analyt. Biochem. 338, 1-11.

62. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. 1994. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acid Res. 22, 2990-2997.

63. Kladde M.P., Xu M., Simpson R.T. 1996. Direct study of DNA-protein interactions in repressed and active chromatine in living cells. EMBO J. 15, 6290-6300.

64. Kladde M.P., Simpson R.T. 1996. Chromatin structure mapping in vivo using methyltransferases. Methods Enzymol. 274, 214-233.

65. Galm O., Rountree M.R., Bachman K.E., Jair K.W., Baylin S.B., Herman J.G. 2007. Enzymatic regional methylation assay: a novel method to quantify regional CpG methylation density. Genome Res. 12, 153-157.

66. Xu G.L., Bestor T.N. 1997. Cytosine methylation targetted to predetermined sequences. Nat. Genet. 17, 376-378.

67. Carvin C.D., Parr R.D., Kladde M.P. 2003. Site-selective in vivo targeting of cytosine-5 DNA methylation by zinc-finger proteins. Nucleic Acid Res. 31, 6493-6501.

68. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. 1995. Studies on the function of conserved sequence motifs in the T4 Dam-N6-adenine] and EcoRII [C5-cytosine] DNA methyltransferases. Gene. 157, 125-126.

69. Friedman S., Som S., Yang L.F. 1991. The core element of the £coRII methylase as defined by protease digestion and deletion analysis. Nucleic Acid Res. 19, 5403-5408.

70. Веньяминов С.Ю., Косых В.Г., Холодков О.А., Бурьянов Я.И.* 1990. УФ- и КД-спектры рестрикционной эндонуклеазы £coRII и ДНК-метилазы £coRII. Биоорг. химия. 16, 47-51.

71. Venyaminov S.Y., GogiaZ.V. 1982. Optical characteristics of all individual proteins from the small subunit of Escherichia coli ribosomes. Eur. J. Biochem. 126, 299-309.

72. Som S., Friedman S. 1990. Direct photolabeling of the EcoRII methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine. J. Biol. Chem. 266, 2937-2945.

73. Santi D.V., Garrett C.E., Barr P.J. 1983. On the mechanism of inhibition of DNA-cytosine methyltransferases by cytosine analogs. Cell. 33, 9-10.

74. Gabbara S., Bhagwat A.S. 1995. The mechanism of inhibition of DNA (cytosine-5-)-methyltransferases by 5-azacytosine is likely to involve methyl transfer to the inhibitor. Biochem J. 307, 87-92.

75. Zhou L., ChengX., Connolly B.A., Dickman M.J., Hurd P.J., Hornby D.P. 2002. Zebularine: a novel DNA methylation inhibitor that forms a covalent complex with DNA methyltransferases. J. Mol. Biol. 321, 591-599.

76. Friedman S., Ansari N. 1992. Binding of the EcoRII methyltransferase to 5-fluorocytosine-containing DNA. Isolation of a bound peptide. Nucleic Acid Res. 20, 3241-3248.

77. Wyszynski M.W., Gabbara S., Bhagwat A.S. 1992. Substitutions of a cysteine conserved among DNA cytosine methylases result in a variety of phenotypes. Nucleic Acid Res. 20,319-326.

78. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. 1995. Function of Pro-185 in the ProCys of conserved motif IV in the EcoRII cytosine-C5]-DNA methyltransferase. FEBS Lett. 370, 7577.

79. Kiss A., Posfai G., Zsurka G., Rasko T., Venetianer P. 2001. Role of DNA minor groove interactions in substrate recognition by the M.SinI and M.EcoRII DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res. 29, 3188-3194.

80. Som S., Friedman S. 1993. Autogenous regulation of the £coRII methylase gene at the transcriptional level: effect of 5-azacytidine. EMBO J. 12, 4297-303.

81. Som S., Friedman S. 1994. Regulation of .EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. Nucleic Acid Res. 22, 5347-5353. 50].

82. Shevchuk T.V., Buryanov Ya.I. 1999. DNA methyltransferase-based assayfor the cytosine methylation level in the DNA sequence CCWGG. Russian J. Bioorg. Chem. 25, 630-633.

83. Selker E.U. 1990. Premeiotic instability of repeated sequences inNeurospora crassa. Annu. Rev. Genet. 24, 579-613.

84. Zingg J.M., Shen J.C., Yang A.S., Rapoport H., Jones P.A. 1996. Methylation inhibitors can increase the rate of cytosine deamination by (cytosine-5)-DNA methyltransferase. Nucleic Acid Res. 24, 3267-3275.

85. Sharath A.N., Weinhold E., Bhagwat A.S. 2000. Reviving a dead enzyme: cytosine deaminations promoted by an inactive DNA methyltransferase and an S-adenosylmethionine analogue. Biochemistry. 39, 14611-14616.

86. Norris C.L., Meisenheimer P.L., Koch Т.Н. 1996. Mechanistic studies of the 5-iodouracil chromophore relevant to its use in nucleoprotein photo-cross-linking. J. Am. Chem. Soc. 118, 5796-5803.

87. Meisenheimer K.M., Koch Т.Н. 1997. Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 32, 101-140.

88. Коршунова Г.А., Сумбатян H.B., Топин A.H., Мчедлидзе М.Т. 2000. Фотоактивируемые реагенты на основе арил(трифторметил)дназиринов: синтез и использование для изучения нуклеиново-белковых взаимодействий. Молекулярн. биология. 34, 966-983.

89. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. 1993. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, 283291.

90. Morris A.L., MacArthur M.W., Hutchinson E.G., Thornton J.M. 1992. Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins. 12, 345-364.

91. Luthy R., Bowie J.U., Eisenberg D. 1992. Assessment of protein models with three-dimensional profiles. Nature. 356, 83-85.

92. Kurowski M.A., Bujnicki J.M. 2003. GeneSilico protein structure prediction meta-server. Nucleic Acids Res. 31, 3305-3307.

93. Rychlewski L., Jaroszewski L., Li W., Godzik A. 2000. Comparison of sequence profiles. Strategies for structural predictions using sequence information. Protein Sci. 9, 232-241.

94. Shi J., Blundell T.L., Mizuguchi K. 2001. Fugue: sequence-structure homology recognition using environment-specific substitution tables and structure-dependent gap penalties. J. Mol. Biol. 310, 243-257.

95. Karplus K., Karchin R., Barrett C., Tu S., Cline M., Diekhans M., Grate L., Casper J., Hughey R. 2001. What is the value added by human intervention in protein structure prediction? Proteins. 45, 86-91.

96. Jones D.T. 1999. GenTHREADER: an efficient and reliable protein fold recognition method for genomic sequences. J. Mol. Biol. 287, 797-815.

97. Kelley L.A., McCallum C.M., Sternberg M. J. 2000. Enhanced genome annotation using structural profiles in the program 3D-PSSM. J. Mol. Biol. 299, 501-522.

98. Jones D.T. 1999. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices. J. Mol. Biol. 292, 195-202.

99. Ouali M., King R.D. 2000. Cascaded multiple classifiers for secondary structure prediction. Protein Sci. 9, 1162-1176.

100. Raghava G.P.S. 2000. Protein secondary structure prediction using nearest neighbor and neural network approach. CASP4. 75-76.

101. Pollastri G., Przybylski D., Rost B., Baldi P. 2002. Improving the prediction of protein secondary structure in three and eight classes using recurrent neural networks and profiles. Proteins. 47, 228-235.

102. Sali A., Blundell T.L. 1993. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J. Mol. Biol. 234, 779-815.

103. Guex N., Peitsch M.C. 1997. SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis. 18, 2714-2723.

104. Surles M.C., Richardson J.S., Richardson D.C., Brooks F.P. Jr. 1994. Sculpting proteins interactively: continual energy minimization embedded in a graphical modeling system. Protein Sci. 3, 198-210.