Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование ДНК-метилтрансфераз SssI (Spiroplasma) и Dnmt3a (мыши) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Мальцева Диана Васильевна

ВЛИЯНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ОСТАТКОВ ГУАНИНА В ДНК НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ ввв! {Бр1гор1мта) И Бпп^За (МЫШИ)

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003473157

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Громова Елизавета Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Демидкина Татьяна Викторовна

доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна

Ведущая организация'.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 26 мая 2009 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 24 апреля 2009 г.

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клеточная ДНК постоянно повергается воздействию веществ, содержащихся в окружающей среде или образующихся в процессе естественного метаболизма, способных вызывать её повреждение. Это способствует возникновению мутаций и нарушению функционирования различных систем клетки.

Мишенями для повреждающих агентов во многих случаях служат остатки гуанина. Основным источником эндогенных повреждений гуанина являются активные формы кислорода, приводящие преимущественно к образованию 7,8-дигидро-8-оксогуанина (8-охоО) — биомаркера окислительного стресса. Взаимодействие ДНК с некоторыми продуктами катаболизма, а также метилирующими агентами, содержащимися в окружающей среде, приводит к появлению в ДНК очень токсичного для клетки (/'-метилгуанина (06те0). Среди загрязнителей окружающей среды одним из наиболее распространённых является бензо[а]пирен (В[а]Р). В процессе метаболизма в эукариотических клетках В[а]Р активируется до реакционноспособных диолэпоксидов, которые ковалентно присоединяются к ДНК по экзоциклической аминогруппе гуанина с преимущественным образованием (+)-г/ис- и (+)-«;рй,нс-стереоизомерных ВИР-Л^-сЮ-аддуктов.

Действие окислительных и метилирующих агентов и В[о]Р на остатки гуанина в ДНК клеток млекопитающих может нарушить процесс ферментативного метилирования СО-последовательностей ДНК по атому углерода С5 остатков цитозина. Метилирование ДНК играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов, в том числе транскрипции генов. Изменение активности генов, часто ассоциированное с аберрантным метилированием ДНК, является фактором, запускающим развитие многих заболеваний, в числе которых рак, диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы. В клетках животных и человека метилирование СО-последовательностей в ДНК осуществляется С5-ДНК-метилтрансферазами (МТазами) Ботли, ОппиЗа и БгнтпЗЬ. Эти ферменты обладают сложной структурой, а молекулярные механизмы их действия ещё мало изучены. Показано, что все три МТазы важны как для установления, так и для поддержания нормального уровня метилирования ДНК. Представляется важным изучение влияния повреждений ДНК, приводящих к образованию 8-охоО, О'гаеО и ВИР-У-сЮ, на функционирование МТаз.

Объектом исследования в настоящей работе стал каталитический домен БппиЗа мыши (ВппйЗа-СО). В качестве второго объекта была выбрана прокариотическая МТаза Бээ! (М.8з51), которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую СО-последовательность и традиционно используется в качестве модельного фермента при изучении эукариотических МТаз.

Цель работы. Определение влияния повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование каталитического домена БпгтЗа мыши и МБвв! из 8р1горШта.

В работе решались следующие задачи: 1) исследование влияния 8-охоО, (/'тей и (+)-»/г/с-В[а]Р-Л^-сЮ на различные стадии реакции метилирования ДНК каталитическим доменом БпгЩЗа и М.8з51 и 2) определение возможных молекулярных механизмов действия повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование Опш13а-СО и М^вТ

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые изучено взаимодействие ОппиЗа-СО и М^БвГ с ДНК, содержащей 8-охоО, ОбшеО и (+)-цис-В[а]Р-Л^-сЮ. Замена остатков гуанина в ДНК на 8-охоО и 06те0, в зависимости от локализации повреждённых остатков относительно участка узнавания и метилируемого цитозина, приводит к снижению/блокированию или увеличению степени метилирования ДНК МТазами ОпгшЗа-СО и вез!. Впервые показано, что связывание ОпггиЗа-СО с ДНК носит кооперативный характер. Предложенная модель связывания позволила определить значения констант диссоциации фермент-субстратных комплексов, на основании которых было установлено, что замена остатков гуанина на 8-охоО и 06ше0 приводит к снижению сродства ОпггиЗа-СО к ДНК и увеличению кооперативности связывания. При изучении кинетики метилирования в условиях «одного оборота» обнаружено, что ОппйЗа-СО наряду с каталитически компетентными образует непродуктивные комплексы с ДНК. Введение в ДНК 8-охоО и 06те0 практически не влияет на константу скорости реакции метилирования, однако приводит к изменению соотношения продуктивного и непродуктивного комплексов, что объясняет наблюдаемое влияние повреждённых остатков гуанина на метилирование ДНК МТазой ОштиЗа-СО. Обнаружено, что наличие (+)-г/ис-В[я]Р-Л'2-бО в ДНК практически не изменяет эффективность связывания и метилирования ДНК МТазой ЗввТ Сравнение данных для (+)-цис- и (+)-транс-изомеров показало, что степень воздействия В[а]Р-повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование М^э! определяется стереохимией ВМР-Л^-сЮ-аддуктов. Сделаны предположения о молекулярных механизмах действия повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование БштиЗа-СВ и М.ЗэзТ Таким образом, представленные данные позволяют предположить, что вредное воздействие повреждений остатков гуанина в ДНК может быть обусловлено не только их мутагенным действием, но и изменением статуса метилирования ДНК (эпигенетическим нарушением).

Полученные в работе результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях для выяснения взаимосвязи между повреждением ДНК, эпигенетическими изменениями и развитием различных заболеваний.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано три статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов,

аспирантов и молодых учёных по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (Москва, 2005 г.) и международном симпозиуме FEBS-CNRS «Ферменты, модифицирующие ДНК и РНК: сравнение структуры, механизм, функции и эволюция» (Оссуа, Франция, 2007 г.).

Структура н объём работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (226 ссылок). Материал иллюстрирован 29 рисунками и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Взаимодействие каталитического домена Dnmt3a и M.SssI с ДНК, содержащей 8-oxoG и 06meG

Первая часть работы была посвящена изучению влияния 8-oxoG и 06meG на функционирование МТаз Dnmt3a мыши и Sssl из Spiroplasma. Эти МТазы переносят метильную группу с кофактора З-аденозил-ь-метионина (AdoMet) на атом углерода С5 остатка цитозина в CG-последовательности, образуя 5-метилцитозин (ш5С). В качестве субстрата оба фермента могут использовать как ещё не метилированную ДНК, превращая её в полуметилированную, так и ДНК, уже содержащую метильную группу, превращая её в полностью метилированную. В структуре Dnmt3a выделяют регуляторный N-концевой домен и каталитический С-концевой домен, содержащий десять консервативных мотивов, характерных для МТаз, метилирующих атом углерода С5 остатка цитозина (turnar et al, 1994; Xie et al., 1999; Jeltsch, 2006). В работе использовался каталитический домен Dnmt3a (Dnrat3a-CD), который в отсутствие N-концевого домена обладает каталитической активностью, сравнимой с активностью полноразмерного фермента (Gowher & Jeltsch, 2002).

В качестве аналогов субстратов были использованы производные 30-ти звенных неметилированного (GCGC/CGCG) и полуметилированного (GCGC/CGMG) ДНК-дуплексов, содержащих один участок узнавания МТаз (выделен жирным шрифтом, метилируемое основание подчеркнуто):

5'-CTGAATACTACTTGCGCTCTCTAACCTGAT 5' -CTGAATACTACTTGCGCTCTCTAACCTGAT 3 ' - GACTTATGATGAACGCGAGAGATTGGACTA 3 ' - GACTTATGATGAACGMGAGAGATTGGACTA

GCGC/CGCG GCGC/CGMG

Повреждённый остаток гуанина (8-oxoG или 06raeG, N) вводился в одну из цепей в участок узнавания МТаз (GCNC/CGMG, GCGC/CNMG и GCNC/CGCG), с 5'-стороны от участка узнавания (NCGC/CGMG, GCGC/CGMN и NCGC/CGCG) и на расстоянии двух или четырёх нуклеотидных остатков от него (GCGCTC/CGMGAN или GCGCTCTC/CGMGAGAN) (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Параметры взаимодействия Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими 8-oxoG

ДНК-дуплекс" Dnmt3a-CD M.SssI

Kix (HM) Kd2 (HM) KaKi2 (HM2) v°™ (Vof ksx (ч■')* R (%)' v°™ (%f

GCGC CGMG 25 ±8 33 ±11 830 100 4.1 ±0.3 30 ±3 100

NCGC CGMG 14000 ±4000 26 ±5 3.0 ±0.6 23 ±4 140 ± 10

GCNC CGMG 9000 ±1400 4 ± 2 3.1 ±0.3 4 ± 1 <0.4

GCGC CGMN 21 ±3 13 ± 3 270 20 ±2 2.2 ±0.1 14 ±2 130±4

GCGC CNMG 11 ± 1 15 ± 1 165 180 ± 10 5.4 ± 0.6 31 ±4 150 ±30

GCGCTC CGMGAN 14 ± 1 12 ± 2 170 70 ± 10 3.0 ±0.1 30 ±5 90 ±5

GMGC CGMG 2400 ±250

GCGC CGCG 60 ± 10

Неспецифический" ДНК-дуплекс 31 ±3 28 ±7 870

" Участок узнавания МТаз и метилируемый цитозин выделены жирным шрифтом и подчёркиванием соответственно; N — 8-oxoG; М — т5С.

° Относительная скорость метилирования. v0 для GCGC/CGMG принята за 100% (0.7 нМ/мин для Dnmt3a-CD; 14 нМ/мин для M.SssI).

"Константа скорости реакции метилирования в условиях «одного оборота» (single turnover). г Отношение концентрации метилированной ДНК в конечной точке реакции (рис. 4А) к общей концентрации ДНК в реакционной смеси.

д 5'-CTGATTACTACTTCCTACCCCTTACCTGAT-3'/5'-ATCAGGTAAGGGGTAGGAAGTAGTAATCAG-3'

Начальные скорости метилирования БштиЗа-СО повреждённых ДНК-дуплексов. Для

того чтобы оценить влияние 8-охоО и ОбтеО на способность РпгМЗа-СО метилировать ДНК, были определены начальные скорости метилирования, у0, ДНК-дуплексов, содержащих 8-охой или О^тев, каталитическим доменом Опш13а в условиях 1.7-кратного избытка ДНК по отношению к ферменту. Уровень метилирования определяли по включению тритиевой метки в ДНК, происходящему в процессе переноса метальной группы от [СНз-3Н]Ас1оМе1 в ходе ферментативной реакции. На основании полученных линейных зависимостей количества метилированной ДНК от времени (рис. 1) были определены у0 и рассчитаны значения относительных начальных скоростей метилирования (у0™) (табл. 1 и 2).

Время, мин бремя, мин

Рис. 1. Метилирование Бшт^За-СВ полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих 8-охов (А) или 06те0 (Б), в условиях избытка ДНК. Сднк1-5мкМ, Сощтза-сэ 0.88 мкМ, С[СН-'Н]Ас1оМс1 2мкМ.

8-охой. Для полуметилированных субстратов, содержащих 8-охоО, в большинстве случаев наблюдалось снижение эффективности метилирования по сравнению с неповреждённым субстратом ОСвС/ССМО (табл. 1). Наибольшее уменьшение скорости метилирования (в 25 раз) наблюдалось для дуплекса ОС^ЧС/СОУЮ, содержащего 8-охоО в участке узнавания с З'-стороны от цитозина-мишени. Однако скорость метилирования дуплекса ОСвСД^МО, содержащего 8-охоО напротив метилируемого цитозина, увеличивалась в 1.8 раза по сравнению с неповреждённым ОССС/ССМО.

Скорость метилирования неметилированных субстратов ИССС/СССО и ССГЧ'С/СССО была снижена в 2 и 1.3 раз соответственно по отношению к у0 для дуплекса ОССС/СвСО. Поскольку у0 полуметилированного дуплекса С С N С/С С МО значительно снижена, можно предположить, что в случае дуплекса ОСКС/СвСО ОппиЗа-СО предпочтительно метилирует цитозин в неповреждённой цепи.

О тей. Как видно из табл. 2, снижение скорости метилирования в 3.2 раза по сравнению с неповреждённым субстратом ОСвС/ССМО наблюдается только для дуплекса ОС1ЧС/СС\Ю, содержащего (УтеО в участке узнавания в метилируемой цепи. При этом у„ для дуплексов, содержащих ОбшеО рядом с СО-сайтом (МССС/СИУЮ) и в участке узнавания напротив цитозина-мишени (ОСвСД^Мв) были соответственно в 2 и 3 раза больше по отношению к скорости метилирования ОССС/ССМЮ. Введение (У'теО на расстоянии четырёх нуклеотидных остатков от участка узнавания (ОСССТСТС/СС1УЮАОА1Ч) практически не оказывало влияния на способность БштиЗа-СО метилировать цитозин в Св-сайте.

Таблица 2. Параметры взаимодействия ОппиЗа-СП и

л i с™1 л 1111** .................... ..........—___________! ...../ '

ДНК-дуплекс" ОшШЗа-СО

v0™ (%)" к* (ч'1) Я (%)" v0™ (%)й

ссвс с&\ю 100 2.5 ±0.1 25 ±2 100

иссс свмю 198 ± 17 2.7 ±0.3 33 ±2 101 ±14

ОСМС семе 31 ± 8 2.1 ±0.2 7.8 ±0.1 4 ± 1

вссс CNMO 330 ±38 5.3 ± 1.7 25 ±6 67 ±6

оссстстс ССМОАОАЫ 92 ± 11 2.6 ±0.4 22 ±2 105 ± 18

Относительная скорость метилирования. у0 для дуплекса ОССС/СОУЮ принята за 100% (0.7 нМ/мин для ОшШЗа-СО; 11 нМ/мин для М^э^. ' Отношение концентрации метилированной ДНК в конечной точке реакции (рис. 4Б) к общей концентрации ДНК в реакционной смеси.

Изменения скорости метилирования ДНК Отт^За-СБ при замене остатков гуанина на 8-охоО или 06шс0 прежде всего могут быть связаны с изменением сродства Опт13а-СО к повреждённым субстратам. Чтобы это проверить, была изучена устойчивость комплексов ОппиЗа-СЭ с ДНК-дуплексами, содержащими повреждённые остатки. Связывание Впш13а-СП с повреждёнными ДНК-дуплексами. Изучение образования комплексов проводили методом прямого титрования фиксированного количества флуоресцентно-меченной ДНК аликвотами Ошт^За-СВ, измеряя значение поляризации флуоресценции реакционной смеси. Флуоресцентная метка вводилась на 5'-конец одной из цепей ДНК-дуплексов. Реакционные смеси содержали аналог кофактора 8-аденозил-ь-гомоцистеин (АбоНсу), который способствует образованию специфического комплекса

С5-МТаз с ДНК {УУуьгутЫ еI а!., 1993) и предотвращает побочную реакцию дезаминирования цитозина (БИепею!.. 1992;Ип^е1а1. 1996).

В случае дуплексов ОССС/ССМЮ, СССС/ССМИ, ОССС/С^Ю, ССССТС/ССМОЛЫ и ОСС,СТСТС/ССМОЛСЛN кривые связывания были похожи на гиперболические кривые (рис. 2), обычно наблюдаемые при связывании белков с ДНК в соотношении 1:1. Однако в случае дуплексов ЫССС/ССМС и ОСМС/СвМв кривые связывания носили чётко выраженный сигмоидапьный характер, что указывало на наличие положительной кооперативное™. Были рассчитаны значения коэффициента Хилла (вставка на рис.2А), которые в случае 8-охоО-содержащих дуплексов варьировались от 1.2 для СССС/ССМЫ и ОСвС/С^О до 1.8 для ИССС/ССМО и бС^/ССМО.

Рис. 2 Кривые связывания флуоресцентно-меченных ДНК-дуплексов (10 нМ), содержащих 8-охоО (А) и ОбтеО (Б), с Опп^За-СБ в присутствии Ас1оНсу (0.1 мМ). Р — значение поляризации флуоресценции. Сплошные линии — теоретические кривые, полученные при обработке экспериментальных данных по уравнениям 1-5. Вставка: данные по связыванию трёх ДНК-дуплексов, представленные в координатах Хилла. Обозначения: бССС/ССМО; о, МССС/ССМС; А, ОСлЧС/СО.МО; СССС/ССМЫ; ▲ , ОСвС/СМЮ; и, ССССГС/ССМОАК или ССССТСТС/ССМОЛОЛЫ.

Однако при расчёте констант диссоциации (К<д фермент-субстратных комплексов модель Хилла имеет серьёзные ограничения, так как не учитывает изменение равновесной концентрации свободного фермента в результате его связывания с субстратом. Поэтому далее для определения К^ были использованы несколько других моделей связывания. 1) Модель связывания фермента с ДНК со стехиометрией 1:1 в двух вариантах, в которых за связывающую белковой единицу принят мономер или димер Отт^За-СБ. В обоих случаях данная модель давала значительную систематическую погрешность даже в случае неповреждённого дуплекса ОСвС/ССМО и была отклонена. 2) Модель, предполагающая независимое связывание двух белковых единиц с одной молекулой ДНК, также не улучшила ситуацию. 3) Значительное снижение систематической погрешности было достигнуто при

использовании модели последовательного связывания двух белковых единиц (двух гомодимеров ОпгШЗа-СО) с одной молекулой ДНК (схема 1).

—* Е2о , где Е — гомодимер Опш13а-СО, Б — флуоресцентно-меченная ДНК, ЕБ и ЕгБ — фермент-субстратные комплексы.

Схема 1

Данная модель связывания описывается системой уравнений 1-5, позволяющей рассчитать Кл\ и Ка (табл. 1).

Р = /'„ + (Рии-/'„)(0.5[Е8] + [Е28])/[8]0 (1) > где рд и _ значения поляризации [Е][8]/[Е8] = Ка1 (2) флуоресценции свободной и полностью

гтгпе-1/т СП ^ связанной ДНК соответственно; [Е]0 — общая

[Е][Е8]/[Е28] = (3)

концентрация ОпгЩЗа-СО; [Б] и [Э]о — [Е] + [Ев] + 2[Е28] = [Е]0 (4) концентрации свободной и связанной ДНК.

[Э] + [ЕЭ] + [Е28] = [Б],, (5)

Предполагается, что значение Р комплекса Е28 в два раза больше значения Р для Е8, а объём Е2 приблизительно в два раза больше объёма, занимаемого Е. Важно отметить, что обработка экспериментальных данных в соответствии с уравнениями 1-5, в отличие от модели Хилла, позволяет учесть уменьшение равновесных концентраций свободных ДНК и фермента при образовании комплекса.

Для дуплексов ИССС/ССЛЮ и ОС^/СвМО

значение превышало К¿2 по крайней мере в десять раз, что свидетельствовало о снижении содержания в системе комплекса Ев до стехиометрически незначимых количеств и не позволяло определить точные значения индивидуальных констант. Однако значения произведений КцКц в этих случаях были рассчитаны с хорошей точностью (табл. 1). Из расчётов также следовало, что значения Кц и Кц зависят друг от друга. Это предполагает, что связывание БптЙа-СО с ЫССС/СОМО и ОС!ЧС/ССМО носит характер кажущейся кооперативное™. Для субстрата ОССС/СвЛЮ и дуплексов, содержащих повреждённый остаток гуанина (8-охоО или 06шеС) в метилированной цепи (вССС/СОМЫ, вСССЛ^МО, ОСССТС/ССМОАЫ и ОСССТСТС/'ССМОАОАМ), значения Кц и Кц были близки. Близость значений Кц и Кц свидетельствует о том, что связывание ОттиЗа-СБ в этих случаях также носит характер кажущейся кооперативности, так как в случае реализации независимого связывания двух димеров фермента с ДНК отношение макроскопических констант (К&/Кц) равнялось бы четырём (Диксон и Уэбб, 1982).

Таким образом, в процессе формирования фермент-субстратного комплекса два димера БппИЗа-СО последовательно связываются с разными участками 30-ти звенного ДНК-

дуплекса. При локализации повреждённого остатка гуанина (8-охоО или (/'шей) в метилированной цепи, а также в случае неповреждённого субстрата сродство ОпгЩЗа-СЭ к каждому из участков связывания ДНК-дуплекса практически одинаково. Присутствие 8-охоО или 06те0 в метилируемой цепи в участке узнавания или рядом с ним способствует снижению сродства ОппиЗа-СБ к первому участку связывания (Кц увеличивается), при этом МТаза связывается с первым участком связывания хуже, чем со вторым (Кц > К^). Реализация такого поведения возможна, когда первый связавшийся димер ОппиЗа-СБ образует контакты со вторым димером и облегчает его связывание. Предложенная интерпретация хорошо согласуется с данными моделирования комплекса ДНК с БштиЗа-СО в присутствии регуляторного фактора БппиЗЬ, проведённого на основании РСА комплекса Ошт^За-СО-БпгтЗЬ (Ла е1 а!., 2007). Из этих данных следует, что с одной молекулой ДНК могут связываться два гетеродимера БпггйЗа-СО'ОппиЗЬ, при этом непосредственно с ДНК взаимодействует только Опп^За-СБ, тогда как БштиЗЬ не образует контактов с ДНК. В соответствии с этой моделью, БштИЗа может метилировать два СО-сайта на расстоянии одного поворота спирали ДНК. Поскольку ЭппйЗЬ обладает гомологией в первичной структуре с БпгтЗа (Уе/йсА, 2006), в нашей модели (схема 1) в отсутствие Опп^ЗЬ гетеродимеры ОппиЗа-СО'БпггиЗ!. имитируются гомодимерами ОппиЗа-СО'ОпгтЗа-СО, при этом непосредственно с ДНК связывается только одна из молекул, входящих в состав гомодимера (рис. ЗА). Первый гомодимер, по-видимому, связывается с СО-участком 30-ти звенного субстрата, а второй гомодимер взаимодействует с неспецифической нуклеотидной последовательностью, однако его связывание с ДНК облегчается за счёт взаимодействия с уже связавшимся димером ВштиЗа-СО'ОшШЗа-СО. В рамках предложенного механизма локализация повреждённых остатков гуанина в участке узнавания или рядом с ним может ослаблять связывание первого димера фермента (приводить к увеличению /^л), не оказывая влияния на связывание второго димера (на К£>), и в результате приводить к увеличению кажущейся кооперативное™ связывания и, как следствие, к увеличению К&\Ка, что и наблюдается при введении в ДНК 8-охоО или О^шеб (рис. 2, табл. 1) А Б В

-св--«зм-

-св-— "" 5'-;-Сй-

-еМ^гт-г-5' . ч ,, -:-рМ-

Рис. 3. Связывание ОшшЗа-СБ с ДНК в продуктивной (А) и непродуктивных (Б и В) ориентациях.

Отметим, что использование модели, в которой за связывающую белковую единицу в схеме 1 принят мономер ЭппНЗа-СБ, а не димер, привело лишь к увеличению значений Кц и в 2-3 раза и не изменило выявленных зависимостей и сделанных выводов.

Хотя введение в ДНК 8-охоО или ОбшеО и приводит к снижению стабильности фермент-субстратных комплексов, концентрация субстратов, использованная для рис. 1 (1500 нм), является насыщающей для всех субстратов (рис.2). Отсюда следует, что изменения \>0, вызванные заменой в ДНК остатков гуанина на 8-охоО и 0ЛтсС, не обусловлены изменением сродства ОппйЗа-СО к повреждённой ДНК.

Интегральная кинетика метилирования ОппиЗа-СО повреждённых ДНК-дуплексов.

Было исследовано метилирование ДНК-дуплексов, содержащих повреждённые остатки гуанина, в условиях 10-кратного избытка Отт^За-СБ по отношению к ДНК (условия «одного оборота») (рис. 4). Значения констант скорости реакции метилирования (£5,) были рассчитаны на основании представления о псевдопервом порядке реакции (в условиях насыщения по ДНК и Ас1оМе1) в соответствии с экспоненциальной зависимостью, учитывающей возможное неполное превращение субстрата в продукт {репЫ, 1999): [МБ] = [МБ]г (1 - е'к"'), где [МБ] и [МБ^ — концентрации [СН3-3Н]-ДНК в момент времени / и в конечной точке реакции соответственно.

А Б

Рис. 4. Метилирование БпгтЗа-СО ДНК-дуплексов, содержащих 8-охоО (А) или ОбтеО (Б), в условиях «одного оборота». Сднк 0.3 мкм, СошйЗа-сб 3 мкМ, С^н^-'щлаоМе! 1-2 мкМ.

Выход продукта в конечной точке реакции, Я, варьировал, но во всех случаях, включая неповреждённые субстраты, был ниже предполагаемых 100% (рис.4; табл. 1 и 2). Неполное превращение субстрата могло быть обусловлено неспецифической дезактивацией фермента или субстрата в процессе реакции метилирования. Однако проведённые контрольные эксперименты исключили такую возможность, так как показали, что в условиях избытка фермента лимитирующим фактором накопления продукта реакции является ДНК, а в условиях избытка ДНК — фермент. Таким образом, неполное превращение субстрата, по-видимому, обусловлено тем, что ОппиЗа-СО кроме продуктивного комплекса с ДНК (рис. ЗА) образует прочный, медленно диссоциирующий непродуктивный комплекс. Это

согласуется с данными, полученными методом поверхностного плазмонного резонанса, показывающими, что высвобождение ДНК из комплекса с ОппиЗа-СО происходит крайне медленно (бом'Аег е/ а/., 2005).

В случае полуметилированных субстратов образование непродуктивных комплексов может быть обусловлено связыванием ОшгйЗа-СО с ДНК со стороны уже метилированной цепи (рис. 3Б). Данное предположение подтверждается тем, что ОппиЗа-СО образует комплекс с полностью метилированным субстратом (табл. 1). Более того, при метилировании неметилированного субстрата значение Л увеличивается до 60% по сравнению с 30% для полуметилированного неповреждённого субстрата (табл. 1). Возможен также ещё один вид непродуктивного связывания ОппИЗа-СО, когда оба димера фермента связываются неспецифически, т.е. ни один из димеров не взаимодействует с Срв-участком (рис. 35). Данное предположение подтверждается тем, что ОпииЗа-СО образует комплекс с 30-ти звенным ДНК-дуплексом, не содержащим участок узнавания (табл. 1). Это также объясняет только 60%-ный выход продукта реакции в случае неметилированного субстрата. Соотношение всех возможных типов связывания зависит от сродства фермента к участку ДНК, который связывается первым, а также, вероятно, от относительной скорости связывания, поскольку образовавшийся комплекс ДНК с ферментом диссоциирует очень медленно и перераспределения БштиЗа-СО во время реакции метилирования, по-видимому, не происходит.

8-охоО. Как видно из табл. 1, присутствие 8-охоО в участке узнавания или рядом с ним увеличивает вероятность непродуктивного связывания фермента с ДНК (значение Я уменьшается). Важно, что изменения Я хорошо соотносились с изменениями V0™ (табл. 1). Наибольшее уменьшение значений Я и наблюдалось в случае дуплекса ОСКС/СвМО. Значения для всех ДНК-дуплексов отличались не более, чем в два раза (табл. 1). Это свидетельствует о том, что в продуктивном фермент-субстратном комплексе реакция метилирования протекает с постоянной скоростью, и практически не зависит от присутствия 8-охоО в ДНК и его локализации. Таким образом, снижение скорости метилирования 8-охоО-содержащей ДНК обусловлено уменьшением количества продуктивного фермент-субстратного комплекса.

ОбтеО. Изменение значения Л наблюдалось только для дуплексов, содержащих 06теС в метилируемой цепи (табл. 2). Так, в случае дуплекса ООЧС/С&УЮ, в котором повреждённый остаток гуанина расположен в участке узнавания рядом с цитозином-мишенью, значение Я уменьшалось (в 3.2 раза), что соответствовало снижению у0. А в случае дуплекса ЫССС/ССМО, содержащего 06те0 рядом с участком узнавания, наблюдалось увеличение у0, при этом Я также увеличивалось в 1.4 раза. Значения для всех

дуплексов практически не отличались, кроме дуплекса ОССС/Х^МО, содержащего (/'тей напротив цитозина-мишени, для которого наблюдалось увеличение значения ка в 2.1 раза. По-видимому, изменения у0, наблюдаемые при локализации 06те0 в метилируемой цепи, обусловлены изменениями соотношения количеств продуктивного и непродуктивного фермент-субстратных комплексов, а при локализации 06теС напротив цитозина-мишени — увеличением кл (ускорением самой реакции метилирования).

Начальные скорости метилирования \l.SssI повреждённых ДНК-дуплексов. Чтобы оценить влияние повреждений остатков гуанина на функционирование М^б!, было изучено метилирование МТазой полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих 8-охоО или ОбтеО, в условиях стационарной кинетики. Из полученных линейных зависимостей степени метилирования ДНК от времени (рис. 5) были рассчитаны у0 и значения V0™ (табл. 1 и 2).

Время, мин

Время, мин

Рис. 5. Метилирование М^э! ДНК-дуплексов, содержащих 8-охоО (А) или ОбшеО (В), в стационарной кинетики ДНК. Сднк 0.5 мкМ, См^э! 20 нМ, С [сн,-'Н]А<1оШ мкМ.

8-охоС. Как видно из рис. 5А и табл. 1, присутствие 8-охоО в участке узнавания с 3'-стороны от цитозина-мишени (ОСКС/ССМО) приводило к блокированию метилирования. Скорость метилирования ДНК-дуплексов, содержащих 8-охов в других положениях, либо практически не изменялась (ОСОСТС/ССМОАЫ), либо увеличивалась в 1.3-1.5 раза (МСвС/ССМО, СССС/ССМЫ и ОСвС/С^О) по сравнению с неповреждённым ССвС/ССМО.

О^тев. Скорость метилирования дуплекса О^С/СвМО, содержащего ОбтеО в участке узнавания рядом с цитозином-мишенью, была в 25 раз меньше по сравнению с у0 для неповреждённого субстрата ОССС/'СОМО. Замена на ОстеО остатка гуанина, расположенного напротив цитозина-мишени (GCGC/CNMG), приводила к снижению

степени метилирования в 1.5 раза (табл.2). Введение 06ше0 вне участка узнавания (ЫССС/ССМО и ОСССТС/'ССМОЛОЛЫ) практически не оказывало влияния на скорость метилирования. Таким образом, степень воздействия 8-охоО и (У'теО на способность М.Звэ! метилированить ДНК зависит от локализации повреждённого остатка относительно участка узнавания и метилируемого цитозина. Можно также сказать, что М.Зэв! демонстрирует большую чувствительность к локализации 8-охоО и О'пиЮ, чем ОппиЗа-СО. Молекулярные основы влияния 8-охоС и 06теС на взаимодействие Опш13а-СО и М^г с ДНК. Согласно данным РСА комплекса прокариотической С5-МТазы М.Н11а1 с ДНК и АсЗоНсу, М.Н11а1 состоит из двух доменов — малого и большого, в полости между которыми связывается ДНК-субстрат (КИтазамказ е! а1, 1994). Малый домен МТазы, отвечающий за узнавание специфической последовательности (вСвС), образует контакты с ДНК со стороны большой бороздкой, а большой домен, содержащий каталитический центр, взаимодействует с ДНК со стороны малой бороздки. При формировании фермент-субстратного комплекса цитозин-мишень выводится из состава двойной спирали («выпетливается») и попадает в активный центр М.НЬа1 для сближения с кофактором Ас1оМе1. «Выпетливание» метилируемого цитозина сопровождается коформационными изменениями в самом ферменте, в котором каталитическая петля из большого домена сдвигается в сторону ДНК-связывающей полости и образует контакты с малой бороздкой ДНК {уоип^Ыоос! е1 а!., 2006), т.е. происходит переход каталитической петли из «открытой» конформации в «закрытую». Остаток гуанина, оставшийся неспаренным после «выпетливания» цитозина-мишени (гуанин-«сирота»), стабилизируется за счёт взаимодействия его функциональных групп с аминокислотными остатками М.НЬаГ Основываясь на высокой гомологии первичных структур С5-МТаз (Рол/а; е1 а!., 1989; ВгутсЫ & НасШтка, 1999) и данных компьютерного моделирования (Коийап е/ а!., 2004), предполагается, что комплекс М.БззЬДНК'АсЬНсу имеет похожую структуру.

По данным ЯМР, РСА, кругового дихроизма и молекулярной динамики, введение 8-охоО в ДНК не приводит к значительным нарушениям В-формы ДНК. Схема водородных связей, образуемых 8-охоО с остатком цитозина, идентична схеме водородных связей в паре Св (рис. 6А и Б). Возможны лишь незначительные изменения в конформации углеводофосфатного остова и угла поворота спирали вблизи повреждённого гуанина (Ос1а еI а!., 1991; ЬЫйа, 2002). Однако замена гуанина в паре С-й на 8-охоО может привести к изменению рисунка водородных связей, образуемых остатком гуанина с ДНК-связывающими ферментами при формировании фермент-субстратных комплексов. Так, в положении ¿V7 остатка гуанина находится акцептор водородных связей (атом азота), а в положении И1 остатка 8-охов — донор (иминогруппа) (рис. 6А и Б). Кроме того, в

положении С8 остатка гуанина слабый донор водородной связи заменяется на атом кислорода (сильный акцептор протонов) в 8-охоО. Можно предположить, что уменьшение стабильности комплекса ОппиЗа-СБ с 8-охоО-ДНК и увеличение количества непродуктивного комплекса могут быть обусловлены нарушением «сети» правильных водородных связей МТазы с 8-охоО-ДНК и образованием новых «неправильных» контактов.

А Б В

Рис. 6. Структуры нуклеотидных пар: CG (А), C-8-oxoG (Б) и C06meG (В). Функциональные группы в положениях N1 и С8 остатков гуанина и 8-oxoG, являющиеся донорами или акцепторами водородных связей, отмечены стрелками, направленными соответственно вверх или вниз.

Наибольшее снижение степени метилирования ДНК Dnmt3a-CD, как и в случае M.SssI, наблюдалось при введении 8-oxoG в участок узнавания рядом с цитозином-мишенью (GÇNC/CGMG). В случае M.SssI методами компьютерного моделирования (Koudan et al., 2004) и мутационного анализа (М.В. Дарий, неопубликованные данные) показано, что при образовании фермент-субстратного комплекса Ser317 взаимодействует с атомом азота N7 остатка гуанина участка узнавания, расположенного рядом с метилируемым цитозином. Поскольку при замене данного остатка гуанина на 8-oxoG в положении N1 вместо атома азота (акцептора водородных связей), располагается иминогруппа, являющаяся донором водородных связей (рис. 6А и Б), блокирование метилирования M.SssI дуплекса GÇNC/CGMG, по-видимому, обусловлено нарушением этого контакта. Учитывая, что Dnmt3a-CD и M.SssI обладают одинаковой сиквенс-специфичностью, а также то, что в узнавании короткой CG-последовательности МТазами остаток гуанина играет особенно важную роль (Boldert et а!., 1984), можно предположить, что ухудшение метилирования дуплекса GÇNC/CGMG МТазой Dnmt3a-CD также обусловлено нарушением контакта фермента с атомом азота N7 остатка гуанина.

Замена остатка гуанина в CG паре на 06meG приводит к нарушению структуры ДНК: остатки цитозина и 06meG смещаются в малую и большую бороздки соответственно, изменяется структура углеводофосфатного остова, в паре c-oWg между основаниями образуется только две водородные связи (рис. 65) (Swann, 1990; Spratt & Levy, 1997). Известно, что M.SssI образует контакты с межнуклеотидными фосфатами участка узнавания

и нуклеотидной последовательности с 5'-стороны от него {ЯепЬаит & Кагт, 1995; КошЗап е1 а!., 2004). Также в нашей лаборатории Е.В. Кудан и М.В. Дарий было показано, что в комплексе М^б! с ДНК гуанин-«сирота», располагающийся напротив «выпетленного» цитозина, стабилизируется за счёт взаимодействия его функциональных групп, в том числе атома кислорода Об карбонильной группы, с аминокислотами МТазы. Снижение способности М.Збб! метилировать дуплекс ССвС/СКМО, содержащий ОбшеО напротив цитозина-мишени, подтверждает участие атома кислорода Об гуанина-«сироты» в стабилизации последнего. Значительное уменьшение степени метилирования МТазой Эзб! дуплекса ССГЧС/С&ИО, содержащего 06ше0 в участке узнавания рядом с метилируемым цитозином, может быть связано с нарушением контактов М.Эзв! с атомом азота N7 остатка 06те0 в результате изменения структуры двойной спирали и смещения повреждённого остатка гуанина в большую бороздку, а также с нарушением контактов МТазы с межнуклеотидными фосфатами.

Сравнивая действие повреждённых остатков на функционирование Опш13а-СО и М.Ээз!, можно сказать, что М.Звз! более чувствительна к присутствию 8-охоО и 06тей в ДНК, а также к их локализации относительно участка узнавания и метилируемого цитозина. Этот факт наталкивает на мысль, что активный центр БштиЗа-СВ обладает большей способностью «подстраиваться» к повреждённой ДНК, чем прокариотическая МТаза. В случае 06ше0, такое «подстраивание» может реапизовываться за счёт уменьшения стерического напряжения в активном центре ОшШЗа-СО вследствие изменения положения ¿/'-метальной группы относительно связи N1—06 повреждённого остатка гуанина.

Из представленных результатов также можно сделать вывод, что, несмотря на то, что 06ше0 значительно в большей степени нарушает структуру ДНК, чем 8-охоО, последний вноснт более серьёзные нарушения в процесс метилирования ДНК МТазами, чем 06те0.

2. Взаимодействие М.ввв! с ДНК, содержащей (+)-<<//с-В[«] Р-Д'2-сЮ

Согласно данным ЯМР, структура ДНК-дуплексов, содержащих (+)-цис- и (+)-транс-изомеры ВМР-Л^-сЮ (рис. 7), сильно различается (йеаЫпШ е1 а!., 1997). В случае (+)-т/инс-изомера остаток В[а]Р располагается в малой борозде ДНК, направлен в сторону 5'-конца повреждённой цепи и не нарушает уотсон-криковские взаимодействия между основаниями и В-форму двойной спирали (рис. 1Б) {Соэтап е/ а/, 1992). В случае (+)-цис-изомера остаток В[а]Р интеркапирует в ДНК, нарушая водородные связи между повреждённым остатком гуанина (смещается в малую бороздку) и комплементарным ему остатком цитозина (смещается в большую бороздку) (Состоя е/ а/, 1993). В связи с этим, особый интерес представляет определение влияния стереохимии В[а]Р-Лг2-ёО-аддуктов на функционирование М^бЬ Для этого было изучено влияние (+)-чг/с-В[а]Р-Л'2-ёО на

17

функционирование М^! и проведено сравнение с данными для (+)-шранс-В[а]Р-ЛГ2-сЮ, полученными в нашей лаборатории ранее (бибасА е/ а!., 2006).

ОН

М-игрдас-ВМР-Л^-сЮ

НО

он

(+)-^г/с-В[а]Р-Л,2-сЮ

§Г

(+)-1/ис-В[вг]Р-ЛГ-сЮ

Рис. 7. (А) Структурные формулы (+)-транс- и (+)-цис-В[а]Р-ЛГ2-сЮ-аддуктов. (Б) Пространственные структуры ДНК-дуплексов, содержащих (+)-транс- и (+)-г/г'с-В[я]Р-,/У2-сЮ-аддукты (данные ЯМР). Вид на малую бороздку.

В качестве аналогов субстрата были использованы В[а]Р-содержащие производные 18-ти звенного неметилированного (ОСС/СвС) и полуметилированного (ОСв/ССМ) ДНК-дуплексов, содержащие один участок узнавания М^вэГ (табл. 3). Повреждённый 2'-дезоксигуанозин вводился в одну из цепей либо в участок узнавания (ОСС/СвС и ОСС*/ССМ), либо с 5'-стороны от него (0*С0/ССС и 0*СС/СС.М).

Определение Кл фермент-субстратных комплексов проводили в присутствии аналога кофактора АёоНсу методом равновесного конкурентного связывания с МТазой В[о]Р-ДНК и 32Р-меченного дуплекса ОССгеГ/ССМгеГ. В[а]Р-содержащие дуплексы конкурировали с 32Р-меченным неповреждённым субстратом за центр связывания фермента, уменьшая тем самым количество комплекса М.8551*32Р-ДНК'АёоНсу. Данный метод позволяет получить отношение констант диссоциации комплексов фермента с вытесняемым дуплексом (Кл) и дуплексом-конкурентом (К/), к (к = К<?!Ка). В качестве вытесняемого был использован дуплекс ОССгеГ/ССМгеГ (табл. 3).

Анализ образования комплексов при постепенном увеличении концентраций ДНК-конкурентов проводили в неденатурирующем 8%-ом ПААГ (рис. 8).

M.SssI »ДНК« AdoHcy

ДНК-конкурент

ДНК ш

Рис. 8. Равновесное конкурентное | связывание 32Р-меченного дуплекса 6,09 СССгеГ/ССМгеГ (100 нМ) и немеченого дуплекса ССв/ССС с М^ (50 нМ) в присутствии AdoHcy (0.1 мМ). Радиоавтограф 8%-ного ПААГ.

Сднк -конкурента (ССС/ССС) 0, 10, 20,

т » «. 1« 50, 100, 200, 300, 400, 500 нМ в дорожках 1-9 соответственно.

Далее строили зависимость степени образования комплекса M.SssI* Р-ДНК*Ас1оНсу от концентрации ДНК-конкурента (рис. 9) и определяли значение к. С помощью полученной методом прямого титрования Ki комплекса M.SssI с дуплексом G£Gref/CGMref (Subach et al., 2006) были рассчитаны Ki комплексов МТазы с В[а]Р-ДНК (табл. 3).

ДНК-конкурент, нМ

Рис. 9. Кривые равновесного конкурентного связывания 32Р-меченного ССС,сГ/ССАГ"' (100 нМ) и дуплексов ССС/ССС, С*СС/ССС, ССС*/ССС, СССССМ, С*СС/С(,\1 и ССС*/ССМ с М^в! (50 нМ) в присутствии AdoHcy (0.1 мМ). у — отношение степени связывания Э2Р-меченного дуплекса ОССгеГ/ССМгеГ в присутствии ДНК-конкурента к степени связывания 32Р-меченного дуплекса ОССеГ/ССМгеГ в отсутствие ДНК-конкурента.

Таблица 3. Параметры взаимодействия M.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими (+)-»»с-В[д11'-Л"2-с1С___

ДНК-дуплекс" Обозначение Кл (нМ) £Cal (МИН"')

5'-CACAATTGCGCTCTCTCA 3'-GTGTTAACGCGAGAGAGT GÇG/CGÇ 6.8 ± 1.2 0.9 ± 0.4

5'-CACAATTG*CGCTCTCTCA 3'-GTGTTAAC GCGAGAGAGT G*£G/CGÇ 3.0 ±0.3 0.7 ±0.3

5'-CACAATTGCG* CTCTCTCA 3'-GTGTTAACGC GAGAGAGT GÇG*/CGÇ 3.8 ±0.6 0.7 ± 0.2

5'-CACAATTGCGCTCTCTCA 3'-GTGTTAACGMGAGAGAGT GÇG/CGM 4.1 ±0.8 0.4 ±0.2

5'-CACAATTG*CGCTCTCTCA 3'-GTGTTAAC GMGAGAGAGT G*£G/CGM 4.2 ±0.5 0.13 ±0.05

5'-CACAATTGCG*CTCTCTCA 3 ' -GTGTTAACGM GAGAGAGT G£G*/CGM 1.9 ±0.2 0.5 ±0.1

5'-GAGCCAAGCGCACTCTGA 3'-CTCGGTTCGMGTGAGACT GÇGref/CGMref 5.3 ±0.3"

" G* — (+)-1/г/с-В[а]Р-Лг -dG. " Значение Ki определено методом прямого титрования ДНК МТазой SssI {Subach et al., 2006).

Как видно из табл. 3, M.SssI практически одинаково связывается с неповреждёнными и В[а]Р-содержащими ДНК-дуплексами.

В условиях стационарной кинетики были получены зависимости степени метилирования ДНК-дуплексов от времени (рис. 10) и определены значения v0 и каталитических констант (Аса1) (табл. 3). Как видно из табл. 3, степень метилирования полуметилированных и неметилированных В[а]Р-содержащих дуплексов и соответствующих неповреждённых субстратов отличалась незначительно: значение кса1 уменьшалось не более, чем в 3 раза.

Рис.10. Метилирование M.SssI (17 нМ) ДНК-дуплексов, содержащих (+)-цис-B^P-N^dG, в условиях стационарной кинетики. Сднк (GCG/CGC, G*CG/CGC, GCG*/CGC и GCG/CGM) 250 нМ, Сднк (G*CG/CGM и GCG*/CGM) 350 нМ, C[CH,-'H]AdaMcl 1-3 мкм.

Таким образом, можно сделать вывод, что введение (+)-г/«с-В[а]Р-Л'2-ёО в ДНК практически не влияет на способность М.Бэз! связывать и метилировать ДНК, независимо от локализации (+)-г/г/с-изомера относительно участка узнавания и метилируемого цитозина. Сравнение влияния (+)-цис- и (+)-/нрш;с-В[я]Р-Л'2-11С-аддуктов на функционирование \l.SssI и ОппПЗа-СБ. Введение в ДНК (+)-транс-В[а]Р-Ы~-<Ю ($иЬасН е/ а/., 2006), так же как и введение (+)-г/!/с-В[о]Р-Л^О, не оказывает значительного влияния на сродство М.8зз1 к ДНК. Однако влияние (+)-транс- и (+)-г/«с-изомеров на метилирование ДНК этим ферментом значительно различается. Так, расположение с 5'-стороны от участка узнавания ^-/^аяс-ВИР-Л^-сЮ приводит к блокированию метилирования, тогда как расположение практически не влияет на эффективность метилирования ДНК. Таким образом, стереохимия В^Р-Л^-сЮ-аддуктов определяет степень нарушения метилирования ДНК М^эГ и практически не влияет на прочность образуемых ферментом комплексов с В[а]Р-повреждённой ДНК.

Таким образом, в случае (+)-транс-изомера остаток В[а]Р, расположенный в малой бороздке, по-видимому, препятствует образованию контактов каталитической петли М^в! с малой бороздкой ДНК, а в случае (+)-цис-изомера остаток В[а]Р интеркалирует в двойную

Время, мин

спираль и практически не нарушает контакты МТазы с ДНК. Небольшое снижение степени метилирования, наблюдаемое при введении (+)-z/!ic-B[a]P-iV2-dG с 5'-стороны от участка узнавания (табл. 3), может быть обусловлено смещением повреждённого остатка гуанина в малую бороздку (рис. 7).

Недавно в нашей лаборатории было показано (В.Б. Баскунов и Е.Л. Тамьяр), что, в отличие от M.SssI, степень воздействия (+)-iiuc- и (+)-транс-изомеров на метилирование ДНК Dnmt3a-CD практически одинакова, при этом блокирования метилирования не происходит, и наблюдается лишь уменьшение скорости метилирования в 2-5 раз. По данным РСА (Jia et al, 2007), структура Dnmt3a-CD в комплексе с регуляторным фактором Dnmt3L (комплекс без ДНК) очень похожа на структуру M.Hhal в комплексе с ДНК и AdoHcy. При моделировании комплекса ДНК с Dnmt3a-CD и Dnmt3L было показано, что каталитическая петля Dnmt3a-CD, так же как и каталитическая петля M.Hhal, сближенна с «выпетленным» цитозином со стороны малой бороздки (находится в «закрытой» конформацин) (Jia et al., 2007; Cheng & Blumenthal, 2008). В отсутствие Dnmt3L каталитическая петля Dnmt3a-CD может быть более лабильной и обуславливать меньшую чувствительность Dnmt3a-CD к присутствию объёмного остатка В[о]Р в малой бороздке по сравнению с M.SssI. Как было показано нами в предыдущих разделах, M.SssI оказывается более чувствительной к присутствию и других повреждённых остатков гуанина в ДНК (8-oxoG и 06meG), что подтверждает данное предположение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя все данные, можно заключить, что повреждение остатков гуанина оказывает существенное влияние на функционирование CG-узнающих МТаз SssI и Dnmt3a-CD. Для обеих МТаз более критичной является замена остатков гуанина в ДНК на 8-oxoG, обуславливающая значительное снижение степени метилирования ДНК или его блокирование. Введение (+)-z/«c-B[a]P-iV2-dG в участок узнавания и рядом с ним практически не влияет на способность M.SssI связывать и метилировать ДНК. Сравнение данных для (+)-ty!ic-B[o]P-JV2-dG и (+)-m/wwc-B[a]P-./V2-dG показало, что степень воздействия повреждений гуанина бензоа[я]пиреном на эффективность метилирования ДНК МТазой SssI зависит от стереоизомерии B[a]P-jV2-dG-a;myKTOB. Замена гуанина на Of'meG значительно снижает способность M.SssI метилировать цитозин, примыкающий к повреждённому гуанину, тогда как для Dnmt3a-CD наблюдается небольшое уменьшение, а в некоторых случаях и увеличение в 2-3 раза скорости метилирования ДНК, содержащей O'meG. Выявленные различия, по-видимому, обусловлены особенностями структуры активного центра M.SssI и Dnmt3a-CD.

Из представленных данных также можно сделать вывод, что канцерогенное действие повреждений остатка гуанина в ДНК может быть обусловлено не только их известным мутагенным действием, но и эпигенетическими изменениями (изменением степени метилирования ДНК).

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что связывание ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a-CD с ДНК имеет кооперативный характер. Замена остатка гуанина в метилируемой цепи в участке узнавания или рядом с ним на 8-oxoG или 06meG вызывает снижение сродства Dnmt3a-CD к ДНК и увеличение кооперативное™ связывания.

2. Скорость метилирования ДНК МТазой Dnmt3a-CD зависит от локализации и характера повреждения остатка гуанина: в случае 8-oxoG наблюдается значительное замедление метилирования, а в случае 06meG — незначительное замедление или даже ускорение.

3. Dnmt3a-CD образует с ДНК как продуктивный, так и непродуктивный комплексы. Введение 8-oxoG и 06meG в ДНК практически не влияет на константу скорости реакции метилирования в условиях «одного оборота», однако приводит к изменению соотношения продуктивного и непродуктивного комплексов, что и объясняет наблюдаемое влияние повреждений на метилирование ДНК МТазой Dnmt3a-CD.

4. Замена остатка гуанина в участке узнавания на 8-oxoG или 06meG приводит к замедлению или блокированию метилирования ДНК МТазой Sssl.

5. Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК бензо[о]пиреном на функционирование M.SssI определяется стереохимией В[а]Р-^2-сЮ-аддуктов. В случае (+)-цис-изомера, когда остаток В[о]Р интреркалирует в двойную спираль, способность МТазы Sssl связывать и метилировать ДНК практически не изменяется, тогда как в случае (+)-транс-изомера, когда остаток В[а]Р расположен в малой бороздке, наблюдается блокирование метилирования.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Subach О.М., Baskunov V.B., Darii M.V., Maltseva D.V.. Alexandrov D.A., Kirsanova O.V., Kolbanovskiy A., Kolbanovskiy M., Johnson F., Bonala R., Geacintov N.E., Gromova E.S. (2006) Impact of benzo[a]pyrene-2'-deoxyguanosine lesions on methylation of DNA by SssI and Hhal DNA methyltransferases, Biochemistry, 45, 6142-6159.

2. Subach O.M., Maltseva D.V.. Shastry A., Kolbanovskiy A., Klimasauskas S., Geacintov N.E., Gromova E.S. (2007) The stereochemistry of benzo[n]pyrene-2'-deoxyguanosine adducts affects DNA methylation by SssI and Hhal DNA methyltransferases. FEBS J., 274, 2121-2134.

3. Maltseva D.V., Baykov A.A., Jeltsch A., Gromova E.S. (2009) Impact of 7,8-dihydro-8-oxoguanine on methylation of the CpG site by Dnmt3a. Biochemistry, 48,1361-1368.

4. Мальцева Д.В.. Субач O.M., Громова E.C. (2005) Введение г/г(с-онти-бензо[а]пирен-dG в ДНК не влияет на её связывание с ДНК-метилтрасферазами SssI и Hhal. Материалы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2005», Москва, т. 1, стр. 87.

5. Maltseva D.У.. Subach О.М., Kolbanovskiy A., Shastry A., Geacintov N.E., Gromova E.S. (2007) Comparison of effects of (+)-cis- and (+)-/ra«i-benzo[a]pyrene-dG adducts on DNA methylation by M.SssI and M.Hhal. FEBS-CNRS Workshop. DNA and RNA Modification enzymes: comparative structure, mechanism, function and evolution. Aussois, France, Abstract book, p.90.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Повреждения остатков гуанина в ДНК (Обзор литературы).

1.1. Повреждение ДНК активными формами кислорода.

1.1.1. Структура ДНК, содержащей 8-oxoG.

1.1.2. Репарация 8-охоО-ДНК.

1.1.3. Влияние 8-oxoG на процессы, протекающие в клетке.

1.2. Повреждение ДНК метилирующими агентами.

1.2.1. Структура ДНК, содержащей 06meG.

1.2.2. Ответ клетки на присутствие 06meG в ДНК.

1.2.3. Цитотоксичность 06meG.

1.3. Действие на ДНК бензо[а]пирена — канцерогенного полициклического ароматического углеводорода.

1.3.1. Структура ДНК, содержащей (+)-транс- и (+)-^ис-В[а]Р-Д,'2-сЮ-аддукты.

1.3.2. Репарация В[а]Р-ДНК.

1.3.3. Взаимодействие В[а]Р-ДНК с ДНК-связывающими ферментами.

Глава 2. Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование ДНК-метилтрансфераз SssI (Spiroplasma) и Dnmt3a (мыши) (Обсуждение результатов).

2.1. Взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК, содержащей 8-oxoG.

2.1.1. Выделение Dnmt3a-CD и M.SssI.

2.1.2. Дизайн и характеристика аналогов субстратов.

2.1.3. Начальные скорости метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG.

2.1.4. Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 8-oxoG.

2.1.5. Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG.

2.1.6. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG.

2.1.7. Молекулярные основы влияния 8-oxoG на взаимодействие

Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК.

2.2. Взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК, содержащей 06meG.

2.2.1. Используемые ДНК-дуплексы.

2.2.2. Начальные скорости метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 06meG.

2.2.3. Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 06meG.

2.2.4. Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 06meG.

2.2.5. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 06meG.

2.2.6. Молекулярные основы влияния 06meG на взаимодеиствие

Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК.

2.3. Взаимодействие M.SssI с ДНК, содержащей (+)-цис- B[«]P-iV2-dG.

2.3.1. Связывание M.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими (+)-i{uc-B[a]P-N -dG.

2.3.2. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих (+)-цис- B[a]P-./V -dG.

2.3.3. Сравнение влияния (+)-цис- и (+)-трсшс-В[а\Р-Аг -dG-аддуктов на функционирование M.SssI.

Клеточная ДНК постоянно повергается воздействию веществ, содержащихся в окружающей среде или образующихся в процессе естественного метаболизма, способных вызывать её повреждение. Это способствует возникновению мутаций и нарушению функционирования различных систем клетки.

Мишенями для повреждающих агентов во многих случаях служат остатки гуанина. Основным источником эндогенных повреждений гуанина являются активные формы кислорода, приводящие преимущественно к образованию 7,8-дигидро-8-оксогуапипа (8-oxoG) — биомаркера окислительного стресса. Взаимодействие ДНК с некоторыми продуктами катаболизма, а также метилирующими агентами, содержащимися в окружающей среде, приводит к появлению в ДНК очень токсичного для клетки О -метилгуанина (06meG). Среди загрязнителей окружающей среды одним из наиболее распространённых является бензо[а]пирен (В[а]Р). В процессе метаболизма в эукариотических клетках В[д]Р активируется до реакционноспособных диолэпоксидов, которые ковалентно присоединяются к ДНК по экзоциклической аминогруппе гуанина с преимущественным образованием (+)-цис- и (+)-/ирш;с-стереоизомерных B[a]P-A^-dG-аддуктов.

Действие окислительных и метилирующих агентов и В[а]Р на остатки гуанина в ДНК клеток млекопитающих может нарушить процесс ферментативного метилирования CG-последовательностей ДНК по атому углерода С5 остатков цитозина. Метилирование ДНК играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов, в том числе транскрипции генов. Изменение активности генов, часто ассоциированное с аберрантным метилированием ДНК, является фактором, запускающим развитие многих заболеваний, в числе которых рак, диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы. В клетках животных и человека метилирование CG-последовательностей в ДНК осуществляется С5-ДНК-метилтрансферазами (МТазами) Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b. Эти ферменты обладают сложной структурой, а молекулярные механизмы их действия ещё мало изучены.

Показано, что все три МТазы важны как для установления, так и для поддержания нормального уровня метилирования ДНК. Представляется важным изучение влияния повреждений ДНК, приводящих к образованию 8-oxoG, 06meG и на функционирование МТаз.

Объектом исследования в настоящей работе стал каталитический домен Dnmt3a мыши (Dnmt3a-CD). В качестве второго объекта была выбрана прокариотическая МТаза SssI (M.SssI), которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую CG-последовательность и традиционно используется в качестве модельного фермента при изучении эукариотических МТаз.

Целью работы явилось определение влияния повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование каталитического домена Dnmt3a мыши и M.SssI из Spiroplasma.

В работе решались следующие задачи: 1) исследование влияния 8-oxoG, 06meG и (+)-цис-В [a] P-A^-dG на различные стадии реакции метилирования ДНК каталитическим доменом Dnmt3a и M.SssI и 2) определение возможных молекулярных механизмов действия повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование Dnmt3a-CD и M.SssI.

Выводы

1. Впервые показано, что связывание ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a-CD с ДНК имеет кооперативный характер. Замена остатка гуанина в метилируемой цепи в участке узнавания или рядом с ним на 8-oxoG или 06meG вызывает снижение сродства Dnmt3a-CD к ДНК и увеличение кооперативности связывания.

2. Скорость метилирования ДНК МТазой Dnmt3a-CD зависит от локализации и характера повреждения остатка гуанина: в случае 8-oxoG наблюдается значительное замедление метилирования, а в случае 06meG — незначительное замедление или даже ускорение.

3. Dnmt3a-CD образует с ДНК как продуктивный, так и непродуктивный комплексы. Введение 8-oxoG и 06meG в ДНК практически не влияет на константу скорости реакции метилирования в условиях «одного оборота», однако приводит к изменению соотношения продуктивного и непродуктивного комплексов, что и объясняет наблюдаемое влияние повреждений на метилирование ДНК МТазой Dnmt3a-CD.

4. Замена остатка гуанина в участке узнавания на 8-oxoG или 06meG приводит к замедлению или блокированию метилирования ДНК МТазой SssI.

5. Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК бензо[а]пиреном на функционирование M.Sssl определяется стереохимией В[я]Р-/У2-сЮ-аддуктов. В случае (+)-г/нс-изомера, когда остаток В[а]Р иптреркалирует в двойную спираль, способность МТазы SssI связывать и метилировать ДНК практически не изменяется, тогда как в случае (+)-транс-изомера, когда остаток В[а]Р расположен в малой бороздке, наблюдается блокирование метилирования.

1. Cline S.D., Hanawalt Р.С. (2003) Who's on first in the cellular response to DNA damage? Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4, 361-372.

2. Lindahl T. (1993) Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 362, 709715.

3. Wyatt M.D., Pittman D.L. (2006) Methylating agents and DNA repair responses: methylated bases and sources of stand breaks. Chem. Res. Toxicol, 19, 1580-1594.

4. Beranek D.T. (1990) Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents. Mutat Res. 231, 11-30.

5. Hurley L.H. (2002) DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer., 2, 188-200.

6. Luch A. (2005) Nature and nurture lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer, 5, 113-125.

7. Cooke M.S., Evans M.D., Dizdaroglu M., Lunec J. (2003) Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation and disease. FASEB J., 17, 1195-1214.

8. Lindahl Т., Wood R.D. (1999) Quality control by DNA repair. Science, 286, 1897-1905.

9. Valko M., Izakovic M., Mazur M., Rhodes C.J., Telser J. (2004) Role of radicals in DNA damage and cancer incidence. Mol. Cell Biochem., 266, 37—56.

10. Marnett L.J., Riggins J.N., West J.D. (2003) Endogenous generation of reactive oxidants and electrophiles and their reactions with DNA and protein.J. Clin. Invest., Ill, 583-593.

11. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M., Mazur M. (2006) Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem. Biol. Interact., 160, 1-40.

12. Beckman K.B., Ames B.N. (1997) Oxidative decay of DNA. J. Biol. Chem., 272, 1963319636.

13. Asami S., Hirano Т., Yamaguchi R., Tomioka Y., Itoh H., Kasai H. (1996) Increase of a type of oxidative DNA damage, 8-hydroxyguanine, and its repair activity in human leukocytes by cigarette smoking. Cancer Res., 56, 2546-2549.

14. Asami S., Manabe H., Miyake J., Tsurudome Y., Hirano Т., Yamaguchi R., Itoh H., Kasai H. (1997) Cigarette smoking induces an increase in oxidative DNA damage, 8-hydroxydeoxyguanosine, in a central site of the human lung. Carcinogenesis, 18, 1763-1766.

15. Xue W., Warshawsky D. (2005) Metabolic activation of polycyclic and heterocyclic aromatic hydrocarbons and DNA damage: a review. Toxicol. Appl. Pharmacol., 206, 73-93.

16. Greenberg M.M. (2004) In vitro and in vivo effects of oxidative damage to deoxyguanosine. Biochem. Soc. Trans., 32, 46-50.

17. Margolin Y., Cloutier J.F., Shafirovich V., Geacintov N.E., Dedon P.C. (2006) Paradoxical hotspots for guanine oxidation by a chemical mediator of inflammation. Nat. Chem. Biol, 2, 365-366.

18. Poulsen H.E., Weimann A., Loft S. (1999) Methods to detect DNA damage by free radicals: relation to exercise. Proc. Nutr. Soc., 58, 1007-1014.

19. Loft S., Poulsen H.E. (1998) Estimation of oxidative DNA damage in man from urinary excretion of repair products. Acta Biochim. Pol, 45, 133-144.

20. Loft S., M0ller P., Cooke M.S., Rozalski R., Olinski R. (2008) Antioxidant vitamins and cancer risk: is oxidative damage to DNA a relevant biomarker? Eur. J. Nutr., 47, 19-28.

21. Cooke M.S., Evans M.D. (2007) 8-Oxo-deoxyguanosine: reduce, reuse, recycle? Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104, 13535-13536.

22. Gackowski D., Rozalski R., Siomek A., Dziaman Т., Nicpon K., Klimarczyk M., Araszkiewicz A., Olinski R. (2008) Oxidative stress and oxidative DNA damage is characteristic for mixed Alzheimer disease/vascular dementia. J. Neurol. Sci., 266, 57-62.

23. Fraga C.G., Shigenaga M.K., Park J.W., Degan P., Ames B.N. (1990) Oxidative damage to DNA during aging: 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat organ DNA and urine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87,4533-4537.

24. Cerda S., Weitzman S.A., (1997) Influence of oxygen radical injury on DNA methylation. Mutat. Res., 386, 141-152.

25. Lipscomb L.A., Peek M.E., Morningstar M.L., Verghis S.M., Miller E.M., Rich A., Essigmann J.M., Williams L.D. (1995) X-ray structure of a DNA decamer containing 7,8-dihydro-8-oxoguanine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 719-723.

26. Oda Y., Uesugi S., Ikehara M., Nishimura S., Kawase Y., Ishikawa H., Inoue H., Ohtsuka E. (1991) NMR studies of a DNA containing 8-hydroxydeoxyguanosine. Nucleic Acids Res., 19, 1407-1412.

27. Plum G.E., Grollman A.P., Johnson F., Breslauer K.J. (1995) Influence of the oxidatively damaged adduct 8-oxodeoxyguanosine on the conformation, energetics, and thermodynamic stability of a DNA duplex. Biochemistry, 34, 16148-16160.

28. Ishida H. (2002) Molecular dynamic simulation of 7, 8-dihydro-8-oxyguanine DNA. J. Biomol. Struct. Dyn., 19, 839-851.

29. Culp S.J., Cho B.P., Kadlubar F.F., Evans F.E. (1989) Structural and conformational analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol., 2, 416-422.

30. Jayanth N., Ramachandran S., Puranik M. (February 3, 2009) Solution Structure of the DNA Damage Lesion 8-Oxoguanosine from Ultraviolet Resonance Raman Spectroscopy. J. Phys. Chem. A., advance online publication, doi: 10.1021/jp8071519.

31. Lukin M., de los Santos C. (2006) NMR structures of damaged DNA. Chem. Rev., 106, 607689.

32. Hazra Т.К., Izumi Т., Kow Y.W., Mitra S. (2003) The discovery of a new family of mammalian enzymes for repair of oxidatively damaged DNA, and its physiological implications. Carcinogenesis, 24, 155-157.

33. Hazra Т.К., Izumi Т., Maidt L., Floyd R.A., Mitra S. (1998) The presence of two distinct 8-oxoguanine repair enzymes in human cells: their potential complementary roles in preventing mutation. Nucleic Acids Res., 26, 5116-5122.

34. Ishibashi T, Hayakawa H, Sekiguchi M. (2003) A novel mechanism for preventing mutations caused by oxidation of guanine nucleotides. EMBO Rep., 4, 479-483.

35. Le Page F., Kwoh E.E., Avrutskaya A., Gentil A., Leadon S.A., Sarasin A., Cooper P.K. (2000) Transcription-coupled repair of 8-oxoguanine: requirement for XPG, TFIIH, and CSB-and implications for Cockayne syndrome. Cell, 101, 159-171.

36. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. (1993) Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 7915-7922.

37. Shibutani S., Takeshita M., Grollman A.P. (1991) Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature, 349, 431-434.

38. Haracska L., Yu S.L., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S. (2000) Efficient and accurate replication in the presence of 7,8-dihydro-8-oxoguanine by DNA polymerase r|. Nat. Genet., 25, 458-461.

39. Brown J.A., Duym W.W., Fowler J.D., Suo Z. (2007) Single-turnover kinetic analysis of the mutagenic potential of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine during gap-filling synthesis catalyzed by human DNA polymerases X and p. J. Mol. Biol., 367, 1258-1269.

40. Krahn J.M., Beard W.A., Miller H., Grollman A.P., Wilson S.H. (2003) Structure of DNA polymerase P with the mutagenic DNA lesion 8-oxodeoxyguanine reveals structural insights into its coding potential. Structure, 11, 121-127.

41. Broyde S., Wang L., Rechkoblit O., Geacintov N.E., Patel D.J. (2008) Lesion processing: high-fidelity versus lesion-bypass DNA polymerases. Trends Biochem. Sci., 33, 209-219.

42. Brieba L.G., Eichman B.F., Kokoska R.J., Doublie S., Kunkel T.A., Ellenberger T. (2004) Structural basis for the dual coding potential of 8-oxoguanosine by a high-fidelity DNA polymerase. EMBO J., 23, 3452-3461.

43. Kuraoka I., Suzuki K., Ito S., Hayashida M., Kwei J.S., Ikegami Т., Handa H., Nakabeppu Y., Tanaka K. (2007) RNA polymerase II bypasses 8-oxoguanine in the presence of transcription elongation factor TFIIS. DNA Repair (Amst.), 6, 841-851.

44. Tornaletti S., Maeda L.S., Kolodner R.D., Hanawalt P.C. (2004) Effect of 8-oxoguanine on transcription elongation by T7 RNA polymerase and mammalian RNA polymerase II. DNA Repair (Amst.), 3, 483-494.

45. Larsen E., Kwon K., Coin F., Egly J.M., Klungland A. (2004) Transcription activities at 8-oxoG lesions in DNA. DNA Repair (Amst.), 3, 1457-1468.

46. Charlet-Berguerand N., Feuerhahn S., Kong S.E., Ziserman H., Conaway J.W., Conaway R., Egly J.M. (2006) RNA polymerase II bypass of oxidative DNA damage is regulated by transcription elongation factors. EMBO J., 25, 5481-5491.

47. Ghosh R., Mitchell D.L., (1999) Effect of oxidative DNA damage in promoter elements on transcription factor binding. Nucleic Acids Res., 27, 3213-3218.

48. Ramon O., Sauvaigo S., Gasparutto D., Faure P., Favier A., Cadet J. (1999) Effects of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine on the binding of the transcription factor Spl to its cognate target DNA sequence (GC box). Free Radic. Res., 31, 217-229.

49. Muller C.W., Rey F.A., Sodeoka M., Verdine G.L., Harrison S.C. (1995) Structure of the NF-кВ p50 homodimer bound to DNA. Nature, 373, 311-317.

50. Lesher D.T., Pommier Y., Stewart L., Redinbo M.R. (2002) 8-oxoguanine rearranges the active site of human topoisomerase I. PNAS, 99, 12102-12107.

51. Sabourin M., Osheroff N. (2000) Sensitivity of human type II topoisomerases to DNA damage: stimulation of enzyme-mediated DNA cleavage by abasic, oxidized and alkylated lesions. Nucleic Acids Res., 28, 1947-1954.

52. Weitzman S.A., Turk P.W., Milkowski D.H., Kozlowski K. (1994) Free radical adducts induce alterations in DNA cytosine methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1261-1264.

53. Turk P.W., Laayoun A., Smith S.S., Weitzman S.A. (1995) DNA adduct 8-hydroxyl-2'-deoxyguanosine (8-hydroxyguanine) affects function of human DNA methyltransferase. Carcinogenesis, 16,1253-1255.

54. Xiao W., Samson L. (1993) In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 2117-2121.

55. Povey A.C., Badawi A.F., Cooper D.P., Hall C.N., Harrison K.L., Jackson P.E., Lees N.P., O'Connor P.J., Margison G.P. (2002) DNA alkylation and repair in the large bowel: animal and human studies. J. Nutr., 132 (11 Suppl), 3518S-3521S.

56. Saffhill R., Margison G.P., O'Connor P.J. (1985) Mechanisms of carcinogenesis induced by alkylating agents. Biochim. Biophys. Acta., 823, 111-145.

57. Georgiadis P., Samoli E., Kaila S., Katsouyanni K., Kyrtopoulos S.A. (2000) Ubiquitous presence of 06-methylguanine in human peripheral and cord blood DNA. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 9, 299-305.

58. Kang H., Konishi C., Kuroki Т., Huh N. (1993) A highly sensitive and specific method for quantitation of O-alkylated DNA adducts and its application to the analysis of human tissue DNA. Environ. Health Per sped., 99, 269-271.

59. Tricker A.R. (1997) TV-nitroso compounds and man: sources of exposure, endogenous formation and occurrence in body fluids. Eur. J. Cancer Prev., 6, 226-268.

60. Lehmann A.R., Karran P. (1981) DNA repair. International review of cytology., pp. 116-117, Academ Press.

61. Topal M.D. (1988) DNA repair, oncogenes and carcinogenesis. Carcinogenesis, 9, 691-696.

62. Dolan M.E., Oplinger M., Pegg A.E. (1988) Sequence specificity of guanine alkylation and repair. Carcinogenesis, 9, 2139-2143.

63. Sendowski K., Rajewsky M.F. (1991) DNA sequence dependence of guanine-O6 alkylation by the yV-nitroso carcinogens iV-methyl- and TV-ethyl-iV-nitrosourea. Mutat. Res., 250, 153-160.

64. Dunn W.C., Tano K., Horesovsky G.J., Preston R.J., Mitra S. (1991) The role of O6-alkylguanine in cell killing and mutagenesis in Chinese hamster ovary cells. Carcinogenesis, 12, 83-89.

65. Souliotis V.L., Kaila S., Boussiotis Y.A., Pangalis G.A., Kyrtopoulos S.A. (1990) Accumulation of 06-methylguanine in human blood leukocyte DNA during exposure to procarbazine and its relationships with dose and repair. Cancer Res., 50, 2759-2764.

66. Swann P.F. (1990) Why do 06-alkyguanine and 04-alkylthymine miscode? The relationship between the structure of DNA containing 06-alkylguanine and 04-alkylthymine and the mutagenic properties of these bases. Mutation Res., 233, 81-94.

67. Spratt Т.Е., Levy D.E. (1997) Structure of the hydrogen bonding complex of O6-methylguanine with cytosine and thymine during DNA replication. Nucleic Acids Res., 25, 33543361.

68. Leonard G.A., Thomson J., Watson W.P., Brown T. (1990) High-resolution structure of mutagenic lesion in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 9573-9576.

69. Loechler E.L. (1991) Rotation about the C6-06 bond in 06-methylguanine: the syn and anti conformers can be of similar energies in duplex DNA as estimated by molecular modeling techniques.Carcinogenesis, 12, 1693-1699.

70. Dosanjh M.K., Loechler E.L., Singer B. (1993) Evidence from in vitro replication that O6-methylguanine can adopt multiple conformations. Proc. Natl Acad. Sci. USA., 90, 3983-3987.

71. Margison G.P., Santibanez-Koref M.F. (2002) C6-alkylguanine-DNA alkyltransferase: role in carcinogenesis and chemotherapy. Bioessays, 24, 255-266.

72. Huang J.C., Hsu D.S., Kazantsev A., Sancar A. (1994) Substrate spectrum of human excinuclease: repair of abasic sites, methylated bases, mismatches, and bulky adducts. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 91, 12213-12217.

73. Margison G.P., Santibanez Koref, M.F., Povey A.C. (2002) Mechanisms of carcinogenicity/chemotherapy by 06-methylguanine. Mutagenesis, 17, 483-487.

74. York S.J., Modrich P. (2006) Mismatch repair-dependent iterative excision at irreparable O6-methylguanine lesions in human nuclear extracts. J. Biol Chem., 281, 22674-22683.

75. Hidaka M., Takagi Y., Takano T.Y., Sekiguchi, M. (2005) PCNA-MutSa-mediated binding of MutLa to replicative DNA with mismatched bases to induce apoptosis in human cells. Nucleic Acids Res., 33, 5703-5712.

76. Voigt J.M., Topal M.D. (1995) (36-methylguanine-induced replication blocks. Carcinogenesis, 16, 1775-1782.

77. Pauly G.T., Moschel R.C. (2001) Mutagenesis by <96-methyl-, C6-ethyl-, and O6-bezylguanine and 04-methylthymine in human cells: effects of 06-alkylguaninc-DNA alkyltransferase and mismatch repair. Chem. Res. Toxicol, 14, 894-900.

78. Mitra G., Pauly G.T., Kumar R., Pei G.K., Hughes S.H. (1989) Molecular analysis of O6-substituted guanine-induced mutagenesis of ras oncogenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 8650-8654.

79. Bignami M., Lane D.P. (1990) 06-methylguanine in the SV40 origin of replication inhibits binding but increases unwinding by viral large T antigen. Nucleic Acids Res., 18, 3785-3793.

80. Dimitri A., Burns J.A., Broyde S., Scicchitano D.A. (2008) Transcription elongation past O6-methylguanine by human RNA polymerase II and bacteriophage T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res., 36, 6459-6471.

81. Yamini В., Yu X., Dolan M.E., Wu M.H., Kufe D.W., Weichselbaum R.R. (2007) Inhibition of nuclear factor-кВ activity by temozolomide involves 06-methylguanine induced inhibition of p65 DNA binding. Cancer Res., 67, 6889-6898.

82. Tamatani M., Che Y.H., Matsuzaki H., Ogawa S., Okado H„ Miyake S., Mizuno Т., Tohyama M. (1999) Tumor necrosis factor induces Bcl-2 and Bcl-x expression through NFkappaB activation in primary hippocampal neurons. J. Biol. Chem., 274, 8531-8538.

83. Ochs K., Kaina B. (2000) Apoptosis induced by DNA damage 06-methylguanine is Bcl-2 and caspase-9/3 regulated and Fas/caspase-8 independent. Cancer Res., 60, 5815-5824.

84. Bonfanti M., Broggini M., Prontera C., D'lncalci M. (1991) 06-methylguanine inhibits the binding of transcription factors to DNA. Nucleic Acids Res., 19, 5739-5742.

85. Voigt J.M., Topal M.D. (1990) 06-methylguanine in place of guanine causes asymmetric single-strand cleavage of DNA by some restriction enzymes. Biochemistry, 29, 1632-1637.

86. Boehm T.L, Drahovsky D. (1981) Hypomethylation of DNA in Raji cells after-treatment with iV-methyl-iV-nitrosourea. Carcinogenesis, 2, 39-42.

87. Hepburn P.A., Margison G.P., Tisdale M.J. (1991) Enzymatic methylation of cytosine in DNA is prevented by adjacent Oe-methylguanine residues. J Biol Chem., 266, 7985-7987.

88. Tan N.W., Li B.F. (1990) Interaction of oligonucleotides containing 6-O-methylguanine with human DNA (cytosine-5-)-methyltransferase.5iocftem/sfry, 29, 9234-9240.

89. Mattes W.B., Hartley J.A., Kohn K.W., Matheson D.W. (1988) GC-rich regions in genomes as targets for DNA alkylation. Carcinogenesis, 9, 2065-2072.

90. Kriek E., Rojas M., Alexandrov K., Bartsch H. (1998) Polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts in humans: relevance as biomarkers for exposure and cancer risk. Mutat. Res., 400; 215-231.

91. Pfeifer G.P., Denissenko M.F., Olivier M., Tretyakova N., Hecht S.S., Hainaut P. (2002) Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutations in smoking-associated cancers. Oncogene, 21, 7435-7451.

92. Alexandrov K., Rojas M., Rolando C. (2006) DNA damage by benzo(a)pyrene in human cells is increased by cigarette smoke and decreased by a filter containing rosemary extract, which lowers free radicals. Cancer Res., 66, 11938-11945.

93. Geacintov N.E., Cosman M., Hingerty B.E., Amin S., Broyde S., Patel D.J. (1997) NMR solution structure of stereoisomeric covalent polycyclic aromatic carcinogen-DNA adducts: principles, patterns, and diversity. Chem. Res. Toxicol., 10, 111-146.

94. Jiang G. J., Jankowiak R., Grubor N., Banasiewicz M., Small G.J., Skorvaga M., Houten

95. B.V., States J.C. (2004) Supercoiled DNA promotes formation of intercalated cis-N2-deoxyguanine and base-stacked /ra/zv-yV2-dcoxyguanine adducts by (+)-7R,8S-dihydrodiol-9S, 10R-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzoa.pyrene. Chem. Res. Toxicol., 17, 330-339.

96. Gunter M.J., Divi R.L., Kulldorff M., Vermeulen R., Haverkos K.J., Kuo M.M., Strickland P., Poirier M.C., Rothman N., Sinha R. (2007) Leukocyte polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adduct formation and colorectal adenoma. Carcinogenesis, 28, 1426-1429.

97. Alexandrov K., Rojas M., Geneste O., Castegnaro M., Camus A.M., Petruzzelli S., Giuntini

98. C., Bartsch H. (1992) An improved fluorometric assay for dosimetry of benzo(tf)pyrene diol-epoxide-DNA adducts in smokers' lung: comparisons with total bulky adducts and aryl hydrocarbon hydroxylase activity .Cancer Res., 52, 6248-6253.

99. Izzotti A., De Flora S., Petrilli G.L., Gallagher J., Rojas M., Alexandrov K., Bartsch H., Lewtas J. (1995) Cancer biomarkers in human atherosclerotic lesions: detection of DNA adducts. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 4, 105-110.

100. Tretyakova N., Guza R., Matter B. (2008) Endogenous cytosine methylation and the formation of carcinogen carcinogen-DNA adducts. Nucleic. Acids Symp. Ser. (Oxf)., 52, 49-50.

101. Matter В., Wang G., Jones R., Tretyakova N. (2004) Formation of diastereomeric benzoa.pyrene diol epoxide-guanine adducts in p53 gene-derived DNA sequences. Chem. Res. Toxicol., 17, 731-741.

102. Denissenko M.F., Chen J.X., Tang M.S., Pfeifer G.P. (1997) Cytosine methylation determines hot spots of DNA damage in the human P53 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 3893-3898.

103. Weisenberger D.J., Romano L.J. (1999) Cytosine methylation in a CpG sequence leads to enhanced reactivity with benzoa.pyrene diol epoxide that correlates with a conformational change. J. Biol. Chem., 274, 23948-23955.

104. Chen J.X., Zheng Y., West M., Tang M.S. (1998) Carcinogens preferentially bind at methylated CpG in the p53 mutational hot spots. Cancer Res., 58, 2070-2075.

105. Xu R., Мао В., Amin S., Geacintov N.E. (1998) Bending and circularization of site-specific and stereoisomeric carcinogen-DNA adducts. Biochemistry, 37, 769-778.

106. Xie X., Geacintov N.E., Broyde S. (1999) Origins of conformation differences between cis and trans DNA adducts derived from enantiomeric a«//-benzoa.pyrene diol epoxides. Chem. Res. Toxicol., 12, 597-609.

107. Huang W., Amin S., Geacintov N.E. (2002) Fluorescence characteristics of site-specific and stereochemically distinct benzoa.pyrene diol epoxide-DNA adducts as probes adducts conformation. Chem. Res. Toxicol., 15, 118-126.

108. Cosman M., Hingerty B.E., Geacintov N.E., Broyde S., Patel D.J. (1995) Structural alignments of (+)- and (-)-^ra/w-a«ft'-benzo|>.pyrene-dG adducts positioned at a DNA template-primer junction. Biochemistry, 34, 15334-15350.

109. Feng В., Gorin A., Hingerty B.E., Geacintov N.E., Broyde S., Patel D.J. (1997) Structural alignment of the (+)-/ra«5-a«//-benzoa.pyrene-dG adduct positioned opposite dC at a DNA template-primer junction. Biochemistry, 36, 13769-13779.

110. Liu Т., Xu J., Tsao H., Li В., Xu R., Yang C., Amin S., Moriya M., Geacintov N.E. (1996) Base sequence-dependent bends in site-specific benzoa.pyrene diol epoxide-modified oligonucleotide duplexes. Chem. Res. Toxicol., 9, 255-261.

111. Tsao H., Мао В., Zhuang P., Xu R., Amin S., Geacintov N.E. (1998) Sequence dependence and characteristics of bends induced by site-specific polynuclear aromatic carcinogen-deoxyguanosine lesions in oligonucleotides. Biochemistry, 37, 4993-5000.

112. Braithwaite E., Wu X., Wang Z. (1998) Repair of DNA lesions induced by polycyclic aromatic hydrocarbons in human cell-free extracts: involvement of two excision repair mechanisms in vitro. Carcinogenesis, 19, 1239-1246.

113. Hess Т. M., Gunz D., Luneva N., Geacintov N.E., Naegeli H. (1997) Base pair conformation-dependent excision of bcnzo«.pyrene diol epoxide-guanine adducts by human nucleotide excision repair enzymes. Mol Cell Biol, 17, 7069-7076.

114. Muheim R., Buterin Т., Colgate K.C., Kolbanovsij A., Geacintov N.E., Naegeli H. (2003) Modulation of human nucleotide excision repair by 5-methylcytosines. Biochemistry, 42, 32473254.

115. Friedberg E.C. (2001) How nucleotide excision repair protects against cancer. Nat. Rev. Cancer., 1, 22-33.

116. Wu J., Gu L., Wang H., Geacintov N.E., Li G.M. (1999) Mismatch repair processing of carcinogen-DNA adducts triggers apoptosis. Mol. Cell. Biol., 19, 8292-8301.

117. Xu P., Oum L., Beese L.S., Geacintov N.E., Broyde S. (2007) Following an environmental carcinogen A^-dG adduct through replication: elucidating blockage and bypass in a high-fidelity DNA polymerase. Nucleic Acids Res., 35, 4275-4288.

118. Lipinski L.J., Ross H.L., Zajc В., Sayer J.M., Jerina D.M., Dipple A. (1998) Effect of single benzoa.pyrene diol epoxide-deoxyguanosine adducts on the action of DNA polymerases in vitro. Int. J. Oncol., 13, 269-273.

119. Hruszkewycz A.M., Canella K.A., Peltonen K., Kotrappa L., Dipple A. (1992) DNA polymerase action on benzoa.pyrene-DNA adducts. Carcinogenesis, 13, 2347-2352.

120. Choi D.J., Marino-Alessandri D.J., Geacintov N.E., Scicchitano D.A. (1994) Site-specific benzoa.pyrene diol epoxide-DNA adducts inhibit transcription elongation by bacteriophage T7 RNA polymerase. Biochemistry, 33, 780-787.

121. MacLeod M.C., Powell K.L., Kuzmin V.A., Kolbanovskiy A., Geacintov N.E. (1996) Interference of benzoa.pyrene diol epoxide-deoxyguanosine adducts in a GC box with binding of the transcription factor Spl. Mol. Carcinog., 16, 44-52.

122. Persson A.E., Ponten I., Cotgreave I., Jernstrom B. (1996) Inhibitory effects on the DNA binding of AP-1 transcription factor to an AP-1 binding site modified by benzoa.pyrene 7,8-dihydrodiol 9,10-epoxide diastereomers. Carcinogenesis, 17, 1963-1969.

123. Johnson D.G., Coleman A., Powell K.L., MacLeod M.C. (1997) High-affinity binding of the cell cycle-regulated transcription factors E2F1 and E2F4 to benzoa.pyrene diol epoxide-DNA adducts. Mol Carcinog., 20, 216-223.

124. Denissenko M.F., Pao A., Tang M., Pfeifer G.P. (1996) Preferential formation of" ~ benzoa.pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in P53. Science, 274,' 430-432.

125. Wilson V.L., Smith R.A., Longoria J., Liotta M.A., Harper C.M., Harris C.C. (1987) Chemical carcinogen-induced decreases in genomic 5-methyldeoxycytidine content of normal human bronchial epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 3298-3301.

126. Wojciechowski M.F., Meehan T. (1984) Inhibition of DNA methyltransferases in vitro by benzoa.pyrene diol epoxide-modified substrates. J. Biol. Chem., 259, 9711-9716.

127. Sadikovic В., Rodenhiser D.I. (2006) Benzopyrene exposure disrupts DNA methylation and growth dynamics in breast cancer cells. Toxicol. Appl. Pharmacol., 216, 458-468.

128. Ruchirawat M., Becker F.F., Lapeyre J.N. (1984) Mechanism of rat liver DNA methyltransferase interaction with anti-benzoa.pyrenediol epoxide modified DNA templates. Biochemistry, 23, 5426-5432.

129. Edwards T.M., Myers J.P. (2007) Environmental exposures and gene regulation in disease etiology. Environ. Health. Perspect., 115, 1264-1270.

130. Jirtle R.L., Skinner M.K. (2007) Environmental epigenomics and disease susceptibility. Nat. Rev. Genet., 8, 253-262.

131. Jeltsch A. (2006) Molecular enzymology of mammalian DNA methyltransferases. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 301, 203-225.

132. Goll M.G., Bestor Т.Н. (2005) Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu. Rev. Biochem., 74, 481-514.

133. Smith S.S., Kan J.L., Baker D.J., Kaplan B.E., Dembek P. (1991) Recognition of unusual DNA structures by human DNA (cytosine-5)methyltransferase. J. Mol. Biol., 217, 39-51.

134. Hermann A., Goyal R., Jeltsch A. (2004) The Dnmtl DNA-(cytosine-C5)-methyltransferase methylates DNA processively with high preference for hemimethylated target sites. J. Biol. Chem., 219, 48350-48359.

135. Leonhardt H., Page A.W., Weier H.U., Bestor Т.Н. (1992) A targeting sequence directs DNA methyl transferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell, 71, 865-873.

136. Rountree M.R., Bachman K.E., Baylin S.B. (2000) Dnmtl binds HDAC2 and a new compressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat. Genet., 25, 269-277.

137. Ко Y.G., Nishino K., Hattori N., Arai Y., Tanaka S., Shiota K. (2005) Stage-by-stage change in DNA methylation status of Dnmtl locus during mouse early development. J. Biol. Chem., 280, 9627-9634.

138. Okano M., Xie S., Li E. (1998) Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nat. Genet., 19, 219-220.

139. Gowher H., Jeltsch A. (2001) Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG sites. J Mol. Biol., 309, 1201-1208.

140. Zardo G., Fazi F., Travaglini L., Nervi C. (2005) Dynamic and reversibility of heterochromatic gene silencing in human disease. Cell Res., 15, 679-690.

141. Xie S„ Wang Z., Okano M., Nogami M., Li Y„ He W.W., Okumura K., Li E. (1999) Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene, 236, 87-95.

142. Feng J., Chang H., Li E., Fan G. (2005) Dynamic expression of de novo DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b in the central nervous system. JNeurosci. Res., 79, 734746.

143. Rhee I., Jair K.W., Yen R.W., Lengauer C., Herman J.G., Kinzler K.W., Vogelstein В., Baylin S.B., Schuebel K.E. (2000) CpG methylation is maintained in human cancer cells lacking DNMT1. Nature, 404, 1003-1007.

144. Ting A.H., Jair K.W., Schuebel K.E., Baylin S.B. (2006) Differential requirement for DNA methyltransferase 1 in maintaining human cancer cell gene promoter hypermethylation. Cancer Res., 66, 729-735.

145. Zheng D.L., Zhang L., Cheng N., Xu X., Deng Q„ Teng X.M., Wang K.S, Zhang X., Huang J., Han Z.G. (2009) Epigenetic modification induced by hepatitis В virus X protein via interaction with de novo DNA methyltransferase DNMT3A. J. Hepatol., 50, 377-387.

146. Kangaspeska S., Stride В., Metivier R., Polycarpou-Schwarz M., Ibberson D., Carmouche R.P., Benes V., Gannon F., Reid G. (2008) Transient cyclical methylation of promoter DNA. Nature, 452, 112-115.

147. Yamagata Y., Asada H., Tamura I., Lee L., Maekawa R., Taniguchi K., Taketani Т., Matsuoka A., Tamura H., Sugino N. (2009) DNA methyltransferase expression in the human endometrium: down-regulation by progesterone and estrogen. //wm. Reprod., 1, 1-7.

148. Kim G.D., Ni J., Kelesoglu N., Roberts R.J., Pradhan S. (2002) Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBOJ., 21, 4183-4195.

149. Fatemi M., Hermann A., Gowher H., Jeltsch A. (2002) Dnmt3a and Dnmtl functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur. J. Biochem., 269, 4981-4984.

150. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. (1994) The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res., 22, 1-10.

151. Posfai J., Bhagwat A.S., Posfai G. Roberts R.J. (1989) Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res., 17, 2421-2435.

152. Margot J.B., Aguirre-Arteta A.M., Di Giacco B.V., Pradhan S., Roberts R.J., Cardoso M.C., Leonhardt H. (2000) Structure and function of the mouse DNA methyltransferase gene: Dnmtl shows a tripartite structure. J. Mol. Biol., 297, 293-300.

153. Gowher H., Jeltsch A. (2002) Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases. J. Biol. Chem., 211, 20409-20414.

154. Nur I., Szyf M., Razin A., Glaser G., Rottem S., Razin S. (1985) Procaryotic and eucaryotic traits of DNA methylation in spiroplasmas (mycoplasmas). J. Bacteriol., 164, 19-24.

155. Pradhan S., Roberts R.J. (2000) Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain. EMBO J., 19, 21032114.

156. Дарий М.В., Кирсанова О.В., Друца В.Л., Кочетков С.Н., Громова Е.С. (2007) Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы Sssl. Мол. Биол., 41, 121-129.

157. Klimasauskas S., Roberts R.J. (1995) M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base. Nucleic Acids Res., 23, 1388-1395.

158. Zingg J.-M., Shen J.-C., Yang A.S., Rapoport H., Jones P.A. (1996) Methylation inhibitors can increase the rate of cytosine deamination by (cytosine-5)-DNA methyltransferase. Nucleic Acids Res., 24, 3267-3275.

159. Shen J.C., Rideout W.M. 3rd, Jones P.A. (1992) High frequency mutagenesis by a DNA methyltransferase. Cell, 71, 1073-1080.

160. Jia D., Jurkowska R.Z., Zhang X., Jeltsch A., Cheng X. (2007) Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature, 449, 248-251.

161. Cheng X., Blumenthal R. (2008) Mammalian DNA methyltransferases: a structural perspective. Structure, 16, 341-350.

162. Jurkowska R.Z., Anspach N., Urbanke C., Jia D., Reinhardt R., Nellen W., Cheng X., Jeltsch A. (2008) Formation of nucleoprotein filaments by mammalian DNA methyltransferase Dnmt3a in complex with regulator Dnmt3L. Nucleic Acids Res., 36, 6656-6663.

163. Dixon M., Webb E.C., Thome C.J.R., Tipton K.F. (1979) Enzymes, 3rd ed. Longman Group Ltd., London, pp. 140-148.

164. Robertson A.K., Geiman T.M., Sankpal U.T., Hager G.L., Robertson K.D. (2004) Effects of chromatin structure on the enzymatic and DNA binding functions of DNA methyltransferases Dnmtl and Dnmt3a in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun., 322, 110-118.

165. Fellinger K., Rothbauer U., Felle M., Langst G., Leonhardt H. (2009) Dimerization of DNA methyltransferase 1 is mediated by its regulatory domain. J. Cell. Biochem., 106, 521-528.

166. Fersht A. (1999) Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding, second printing. W.H. Freeman and Company, U.S.A., pp. 199-201.

167. Gowher H., Liebert K., Hermann A., Xu G., Jeltsch A. (2005) Mechanism of stimulation of catalytic activity of Dnmt3a and Dnmt3b DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases by Dnmt3L. J. Biol Chem., 280, 13341-13348.

168. Ooi S.K., Bestor Т.Н. (2008) The colorful history of active DNA demethylation. Cell, 133, 1145-1148.

169. Lindstrom W.M. Jr., Flynn J., Reich N.O. (2000) Reconciling structure and function in Hhal DNA cytosine-C-5 methyltransferase. J Biol Chem, 275, 4912-4919.

170. Svedruzic Z.M., Reich N.O. (2004) The mechanism of target base attack in DNA cytosine carbon 5 methylation. Biochemistry, 43, 11460-11473.

171. Renbaum P., Razin A. (1995) Footprint analysis of M.Sssl and M.Hhal methyltransferases reveals extensive interactions with the substrate DNA backbone. J. Mol. Biol., 248, 19-26.

172. Koudan E.V., Bujnicki J.M., Gromova E.S. (2004) Homology modeling of the CG-specific DNA methyltransferase SssI and its complexes with DNA and AdoHcy. J Biomol. Struct. Dyn., 22, 339-345.

173. O'Gara M., Klimasauskas S., Roberts R.J., Cheng X. (1996) Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. J. Mol. Biol., 261, 634-645.

174. Youngblood В., Buller F., Reich N.O. (2006) Determinants of sequence-specific DNA methylation: target recognition and catalysis are coupled in M.Hhal. Biochemistry, 45, 1556315572.

175. Bujnicki J.M., Radlinska M. (1999) Molecular phylogenetics of DNA 5mC-methyltransferases. Acta Microbiol. Pol., 48, 19-30.

176. Bolden A., Ward C., Siedlecki J.A., Weissbach A. (1984) DNA methylation. Inhibition of de novo and maintenance methylation in vitro by RNA and synthetic polynucleotides. J. Biol. Chem., 259, 12437-12443.

177. Jeltsch A. (2008) Reading and writing DNA methylation. Nat. Struct. Mol. Biol., 15, 10031004.

178. Hashimoto H., Horton J.R., Zhang X., Bostick M., Jacobsen S.E., Cheng X. (2008) The SRA domain of UHRF1 flips 5-methylcytosine out of the DNA helix. Nature, 455, 826-829.

179. Arita K., Ariyoshi M., Tochio H., Nakamura Y., Shirakawa M. (2008) Recognition of hemi-methylated DNA by the SRA protein UHRF1 by a base-flipping mechanism. Nature, 455, 818821.

180. Cantor C.R., Warshaw M.M., Shapiro H. (1970) Oligodeoxynucleotide interactions. 3. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligodeoxynucleotides, Biopolymers 9, 1059-1077.

181. Vitzthum F., Bernhagen J. (2002) SYBR Green I: an ultrasensitive fluorescent dye for double-standed DNA quantification in solution and other applications. Recent Res. Devel. Anal. Biochem., 2, 65-93.

182. Zipper H., Brunner H., Bernhagen J., Vitzthum F. (2004) Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res., 32, el03.

183. Воробьева, O.B., Карягина, A.C., Волков, E.M., Вирясов, М.Б., Орецкая, Т.С., Кубарева, Е.А. (2002) Анализ контактов метилтрансферазы SsoII с ДНК в фермент-субстратном комплексе. Биоорган, химия, 28, 402-410.

184. Yokochi Т., Robertson K.D. (2002) Preferential methylation of unmethylated DNA by Mammalian de novo DNA methyltransferase Dnmt3a. J. Biol. Chem., 277, 11735-11745.