Изучение взаимодействия фермента репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы E. coli с фосфатными группами ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РОГАЧЕВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ ФОРМАМИДОПИРИМИДИН-ДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ Е. COLI С ФОСФАТНЫМИ ГРУППАМИ ДНК

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, .

Кузнецова Светлана Александровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

Михайлов Сергей Николаевич

доктор биологических наук, Вейко Наталья Николаевна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится 28 ноября 2006 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, д. 1, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 27 октября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Клеточная ДНК в процессе своего функционирования постоянно подвергается воздействию различных экзогенных и эндогенных факторов, приводящих к ее повреждениям. Одним из наиболее агрессивных факторов окружающей среды является активный кислород, образующийся в качестве побочного продукта клеточного метаболизма, в результате окислительного стресса или под действием ионизирующей радиации. Он индуцирует окислительные повреждения ДНК, которые являются причинами преждевременного старения, заболеваний иммунной системы,

л

кардиологических, онкологических и ряда других. Наиболее распространенным окислительным повреждением является 7,8-дигидро-8-оксогуанин (oxoG), обладающий высокой мутагенной активностью как in vitro, так и in vivo. Наличие oxoG в ДНК вызывает G:C->T:A трансверсии, поскольку в процессе репликации oxoG может образовывать стабильную хугстиновскую пару с аденином. Кроме того, oxoG в составе нуклеозидтрифосфата встраивается в ДНК напротив аденина ДНК-матрицы, вызывая тем самым A:T->C:G трансверсии. Такие повреждения эффективно корректируются клеткой с помощью репарационных механизмов, обеспечивающих стабильность и целостность генетической информации. Ключевую роль в этом процессе играют специфические ферменты ДНК-Л^-гликозилазы, распознающие и удаляющие повреждения в ДНК. Изучение взаимодействия таких ферментов с ДНК является актуальной задачей современной биоорганической химии и молекулярной биологии.

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия фермента эксцизионной репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы (Fpg) Escherichia coli с ДНК. Этот фермент удаляет из ДНК остатки oxoG и является удобной моделью для исследования механизма действия репарирующих ферментов данного класса, поскольку аминокислотные последовательности прокариотических гомологов этого белка имеют высокую степень консервативности и общие мотивы третичной структуры. Настоящая работа планировалась и была начата в отсутствие структурных данных для Fpg.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса. Для решения этой задачи было необходимо: (1) синтезировать новые аналоги субстратов Fpg Е. coli, содержащие модифицированные фосфатные группы; (2) изучить влияние введенных модификаций на структуру ДНК; (3) изучить связывание и каталитическое расщепление синтезированных аналогов субстратов ферментом и определить их количественные характеристики; (4) осуществить дизайн и синтез oxoG-содержащих обратимых и необратимых ингибиторов Fpg Е. coli и изучить их взаимодействие с

ферментом; (5) определить контакты Fpg Е. coli с фосфатными группами охоО-содержащей ДНК в растворе; (6) на базе полученных экспериментальных данных в совокупности с данными литературы построить модель взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК.

Научная новизна и практическая значимость. До настоящего времени основное внимание исследователей было направлено на изучение взаимодействия Fpg Е coli с окисленными гетероциклическими основаниями ДНК и практически не уделялось внимания исследованию контактов с фосфатными группами ДНК. Вместе с тем эти контакты играют важнейшую роль в функционировании фермента. Так, при взаимодействии Fpg Е. coli с поврежденной ДНК происходят значительные конформационные изменения в ее структуре, включающие расширение малой бороздки, частичное плавление и изгиб в месте модификации, выпетливание окисленного основания из спирали. Такие фермент-зависимые изменения структуры ДНК осуществляются в основном за счет образования специфических контактов аминокислот из активного центра Fpg Е. coli с фосфатными группами ДНК в составе продуктивного фермент-субстратного комплекса. Важным обстоятельством является то, что в отличие от слабых неспецифических аддитивных взаимодействий Fpg Е. coli с фосфатными группами неповрежденной ДНК, в специфическом фермент-субстратном комплексе такие контакты многократно усиливаются, приобретают кооперативный характер и реализуются по типу взаимодействия отдельных непосредственно контактирующих групп (Невинский, 2004).

В настоящей работе впервые изучены контакты фосфатных групп oxoG-содержащей ДНК с Fpg Е. coli в составе специфического фермент-субстратного комплекса. С помощью реакционноспособных аналогов субстратов выявлено семь специфических контактов аминокислот активного центра фермента с фосфатными группами ДНК. Определена аминокислота, которая непосредственно взаимодействует с фосфатной группой в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом. С этой целью разработан масс-спектрометрический подход, основанный на использовании фермента, меченного стабильным изотопом азота. Впервые получены обратимые и необратимые oxoG-содержащие ингибиторы Fpg Е. coli и его эукариотического аналога - 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы человека (hOggl), что открывает возможность проведения структурных исследований комплексов этих ферментов с oxoG-содержащей ДНК. Синтезированные соединения представляют интерес как потенциальные терапевтические препараты для лечения заболеваний, вызванных окислительными повреждениями ДНК. Полученные в работе результаты в совокупности с данными других исследований пополняют сведения о

процессах репарации ДНК, что позволяет направленно влиять на эти процессы в борьбе со многими опасными заболеваниями.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic acids" (Leuven, 10-14 сентября 2002 г.), "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 5-9 июля 2004 г.), "Биология - наука XXI века" (Пущино, 7-21 мая 2004 г. и 18-22 апреля 2005 г.), "Ломоносов 2004" и "Ломоносов 2005" (Москва, 10-13 апреля 2004 г. и 12-15 апреля 2005 г), "Computational Molecular Biology" (Москва, 18-21 июля 2005 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы "Ферменты, участвующие в репарации 8-оксогуанина", результаты и обсуждение, экспериментальная часть, выводы, список литературы и приложение. Материал иллюстрирован 70 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 244 цитированные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Одним из наиболее эффективных подходов к исследованию структуры и функций ферментов нуклеинового обмена является изучение их взаимодействия с синтетическими аналогами субстратов, содержащими направленные модификации — замены отдельных атомов или групп атомов в молекуле нуклеиновой кислоты (НК). Этот подход позволяет выявить субстратную базу, зондировать контакты белка и НК, определить положение субъединиц белка относительно друг друга и их позиционное расположение на молекуле НК. В отличие от метода рентгеноструктурного анализа, позволяющего получать данные о строении активных центров белков и взаимодействии отдельных групп белка с НК в кристаллическом фермент-субстратном комплексе, подход, основанный на использовании синтетических аналогов субстратов и включающий возможность вариации структуры субстрата при его синтезе, дает возможность изучать молекулярные аспекты НК-белкового узнавания в физиологических условиях и, соответственно, получать более точные данные о функционировании белков и НК.

В настоящей работе для изучения взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами поврежденной ДНК были использованы синтетические модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие пирофосфатные и О-этилзамещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы (Kuznetsova et. al., 2003). Выбор таких модификаций был обусловлен тем, что они обладают рядом существенных преимуществ по сравнению с другими. Так, природа модифицированных фрагментов родственна природе заменяемых элементов субстрата, метод введения модификаций достаточно прост, эффективен и позволяет ввести

модифицированную группу в любое заданное положение углеводофосфатного остова ДНК. Кроме того, замещенная пирофосфатная группа в составе ДНК-дуплексов является реакционноспособной и может образовывать ковалентную связь со сближенными нуклеофильными группами аминокислот НК-связывающих белков без каких-либо внешних воздействий. Это позволяет идентифицировать такие аминокислоты и получать сведения о строении НК-связывающих и каталитических центров белков, а также о механизме их действия в целом.

1. Дизайн и синтез новых аналогов субстратов фермента Fpg Е. coli

Конструирование модифицированных ДНК-дуплексов проводили на основе 29/22-звенных синтетических ДНК-дуплексов гетерогенного состава, содержащих в середине одной из цепей остаток oxoG, поскольку ранее было установлено, что эффективность взаимодействия таких дуплексов с Fpg Е. coli аналогична эффективности взаимодействия с природными ДНК (Castaing et. al., 1993). Структура ДНК-дуплексов I-XII и IV', VII'-X', использованных в работе, приведена на рисунке 1.

IV' IV

V VI

I II III

i +1 +-1 +-2 +-Э

5'AGCTTGCATGCp—Ср —Тр (8-oxoG)р гАр 2Gp GTCGACTCTAGAG 3'

3' GAACGTACGp<-3) Gp<-2> Ар<-1>---С—р(0)Т—С—CAGCTGAG 5'

+ + t IX VIII VII

X' IX' VIII' vir

Ic

XI

AGCTTGCATGCCTGp-1AGGTCGACTCTAGAG GAACGTACGGAC—TCCAGCTGAG

Xll AGCTTGCATGCCT(8-oxoG)AGGTCGACTCTAGAG GAACGTACGGA----С---TCCAGCTGAG

HN iT \

1 I

pn =

N' 8-oxoG

О О

11 32"

o^N^N

осгн6 о-

P 32n

o^N^N

O- O-

Рис. 1. (А) Структура модифицированных ДНК-дуплексов 1-ХН и IV*, УН'-Х', синтезированных в работе. ДНК-дуплексы, содержащие О-этилзамещенные пирофосфатные и пирофосфатные группы, обозначены 1-Х1 и IV', УН'-Х', соответственно. Стрелками указаны положения модифицированных межнуклеотидных групп р". (Б) Структура 8-оксогуанина и модифицированных межнуклеотидных групп.

Каждый модифицированный дуплекс, содержал только одну модифицированную межнуклеотидную группу в положении, указанном стрелкой. Выбор таких позиций для модификации позволяет выявить роль каждой отдельной фосфатной группы внутри связываемого ферментом участка поврежденной ДНК в процессе функционирования Fpg Е. coli.

Олигонуклеотиды, содержащие модифицированные межнуклеотидные группы, получали в результате матрично-зависимой конденсации (химического лигирования) 5'-концевого фосфата одного олигонуклеотида с 3 -О-этилфосфатом (либо с 3'-фосфатом) смежного олигонуклеотида, ориентированных на комплементарной матрице, в соответствии со схемой:

0

1

о=р—ох

А.

но < о-т-о*

СЛ

N

г

(СНЛ

NH* а* кди

о=р-ох ¿Г

Л

о=р—о—с!+

I ^

т

(снл

NH® С

я/ \н.

\

г

nh* а*

Hj/VH,

X = Н или С2Н5, КДИ - 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид, вертикальными линиями обозначены олигонуклеотиды, горизонтальными линиями - водородные связи между комплементарными парами оснований.

Выходы продуктов химического лигирования приведены в таблице 1.

Химическое лигирование модифицированных ДНК-дуплексов

Таблица 1.

Фосфатная группа р2 Р1 рО pi Р2 рЗ р(0) рИ) р(-2) р(-3)

ДНК- дуплекс I II III IV V VI VII VIII IX X

Выход*, % 20 43 60 54 44 35 46 29 34 43

ДНК- дуплекс IV' VII* VHT IX' X'

Выход*, % 95 94 89 82 85

'Ошибка измерений не превышала 5%.

Эффективность химического лигирования зависела от природы нуклеотидов в узле образования модифицированной связи и наличия заместителя у 3'-концевого фосфата. Так, при введении дизамещенных пирофосфатных групп, не содержащих ненуклеотидных заместителей, эффективность лигирования была значительно выше и достигала 95% (ДНК-дуплекс IV'). Это связано с различием в нуклеофильности дианион- и моноанионфосфатов,

участвующих в реакции. При введении О-этилзамещенных пирофосфатных групп более высокие выходы были получены при реализации контакта5 T-^oxoG3 (ДНК-дуплекс III).

2. Исследование структуры ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатную и

0-этилзамещенную пирофосфатную группы

Для оценки влияния пирофосфатной и О-этилзамещенной пирофосфатной групп на структуру ДНК был использован комбинированный метод квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), являющийся одним из самых современных и перспективных методов теоретического моделирования больших биомолекулярных систем {Thiel et. al., 1996). Основная идея данного подхода заключается в комбинировании неэмпирических методов квантовой химии высокого уровня точности для моделирования наиболее важной части исследуемой системы с классическими методами описания остальной части рассматриваемой системы. Метод КМ/ММ позволяет явно учитывать взаимодействие рассматриваемой системы с окружением. Это особенно важно в случае биологических процессов, происходящих исключительно в растворах, в значительной степени определяющих их протекание и влияющих на свойства исследуемых систем.

Поскольку в структурных базах данных отсутствуют координаты oxoG-содержащего ДНК-дуплекса, в качестве модельной системы был выбран наиболее детально изученный ДНК-дуплекс, имеющий спираль B-типа (Wu et al, 2003) (код в базе данных по белковым структурам 1NAJ):

х,„ 5' CGCGAATTCGCG 3' 3' GCGCTTAAGCGC 5'

Пирофосфатная или О-этилзамещенная пирофосфатная группы были встроены в центральную часть дуплекса XIII вместо одной из фосфодиэфирных связей. В качестве квантовой подсистемы рассматривался фрагмент углеводофосфатного остова, содержащий модифицированную или природную фосфатную группы, их противоион/ны и молекулы воды, входящие в первое сольватное окружение. Оптимизацию геометрической конфигурации водного окружения проводили методом молекулярной динамики. Полную оптимизацию всех геометрических параметров рассматриваемых систем проводили, используя модифицированный квантово-химический пакет программ PC GAMESS и молекулярно-механический пакет TINKER. Квантово-химические расчеты проводили в рамках теории функционала электронной плотности с использованием гибридного функционала РВЕО в базисе 6-3IG** с добавлением диффузных функций на несвязанные атомы кислорода. Остальные фрагменты системы описывались методом молекулярной механики с использованием стандартного силового поля AMBER99.

Полученные геометрические параметры немодифицированного ДНК-дуплекса хорошо согласовывались с экспериментальными данными, что свидетельствовало о том, что выбранный вариант гибридного метода КМ/ММ адекватно описывает строение и свойства исследуемых систем (таблица 2).

Результаты моделирования модифицированных ДНК-дуплексов показали, что пирофосфатная и 0-этилзамещенная пирофосфатная группы встраиваются в структуру ДНК без удлинения межнуклеотидного расстояния и без нарушения стэкинг- и Уотсон-Криковских взаимодействий оснований, фланкирующих модифицированную группу (рис. 2, таблица 2). Это достигается при помощи выпетливания одного фосфата пирофосфатной группировки,

связанного с С5' атомом. Угол спирального вращения в месте пирофосфатной и замещенной пирофосфатной группировок

увеличивается на 2.7 и 5.5 градусов, соответственно. Атомы фосфора пирофосфатной группы, связанные с Сз' и С5' атомами, удалены от атома фосфора немодифицированного

фосфата в той же позиции на расстояния 1.0 А и 2.4 А, соответственно.

Таблица 2.

Локальные параметры спирали оптимизированных структур ДНК-дуплексов.

Дуплекс ЯМР XIII ПФ* ЗПФ" ЯМР XIII ПФ" ЗПФ6

Пара оснований Расстояния между соседними атомами вдоль оси спирали, А

Р-Р СУ-С1»

6 А/Т 6.9 6.8 6.3 6.1 4.8 4.9 4.7 4.9

7 ТУТ 6.7 6.5 7.0 (5.3) 7.8 (5.5) 4.8 4.8 4.9 4.9

Пара оснований Расстояние между парами вдоль оси спирали Ь, А Угол спираль (Г ного вращения рад.)

6 А/Т 3.0 3.1 3.1 3.1 34.8 32.0 32.6 33.2

7 Т/А 3.1 3.0 3.0 3.0 37.8 34.5 37.2 40.0

С1 С24

Рис. 2. Суперпозиция КМ/ММ структур ДНК-дуплекса Х1П (серая) и ДНК-дуплекса, содержащего О-этилзамещенную пирофосфатную группу (черная). Противоионы и молекулы воды опушены.

Для сравнения приведены параметры ЯМР структуры ДНК-дуплекса XIII (№и е{ а1., 2003).

"ДНК-дуплекс, содержащий пирофосфатную группу;

вДНК-дуплекс, содержащий О-этилзамещенную пирофосфатную группу.

Таким образом, результаты моделирования свидетельствуют о том, что структура ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатную или О-этилзамещенную пирофосфатную группы, очень близка к структуре немодифицированиой ДНК. Такие соединения могут быть использованы для выявления роли фосфатных групп в ДНК-белковых взаимодействиях. 3. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с Fpg Е. coli

Важным этапом настоящей работы явилось исследование взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами поврежденной ДНК на стадии образования специфического фермент-субстратного комплекса (Рис. 3). Изучена зависимость степени комплексообразования от концентрации фермента.

комплекс : Fpg с ДНК-

ДНК-

TV - Ш.* ~ ~VJ --V

L я з - *. s ~£7~7~.e Т ^ia tT

«Ьм-. лц шшк цЦь «ш».*

* . 4 \ ,N

По полученным данным рассчитаны константы диссоциации комплексов ДНК-белок. Результаты представлены в таблице 3. Было установлено, что все синтезированные модифицированные ДНК-

дуплексы узнаются ферментом и специфически связываются с ним.

Рис. 3. Радиоавтограф 10%-ного неденатурирующего ПААГ, иллюстрирующий связывание фермента Fpg Е. coli (4 нМ) с 0.5 нМ ДНК-дуплексами I-VI, ГУ' и XII (дорожки с четными номерами). ДНК-дуплексы I-VI, IV' и XII в отсутствие фермента (дорожки с нечетными номерами).

Таблица 3.

ДНК-дуплекс I II III IV V VI VII VIII IX X XII

Ко,(нМ) 0.2 0.7 1.0 3.0 1.1 0.4 0.5 0.7 0.4 0.6 0.4

ДНК-дуплекс IV' VIT VIII' IX' X'

Kd,(hM) 4.1 1.0 2.0 2.0 2.0

Величину Ко определяли по результатам З-б экспериментов, ошибка измерений не превышала 20%.

Эффективность связывания зависела от положения модифицированной межнуклеотидной фосфатной группы и ее природы. Так, модификация Р2 фосфатной группы, расположенной на расстоянии двух нуклеотидов с 5'-конца от 7,8-дигидро-8-оксогуанозина (охосЮ) (ДНК-дуплекс I), приводила к двукратному увеличению эффективности связывания. В то же время введение пирофосфатной и О-этилзамещенной пирофосфатной групп непосредственно в 3'-положение охосЮ (ДНК-дуплексы IV и IV') приводило к уменьшению эффективности связывания примерно на порядок по сравнению с природным субстратом. Модификация фосфатных групп в остальных положениях не оказывала существенного влияния на эффективность связывания. Отсутствие ненуклеотидного заместителя в пирофосфатном остатке приводило к уменьшению эффективности связывания модифицированных ДНК-

дуплексов ферментом Fpg Е. coli, что может быть связано с наличием дополнительного заряда в пирофосфатной группировке.

Специфичность связывания Fpg Е. coli с модифицированными ДНК-дуплексами была подтверждена по результатам двух независимых экспериментов (рис. 4). Так, эффективность связывания всех исследуемых 32Р-меченных ДНК-дуплексов с белком при добавлении избытка субстрата, не содержащего радиоактивную метку, уменьшалась вплоть до его полного ингибирования в случае 150-кратного избытка. В то же время добавление таких же избытков ДНК-дуплекса XI аналогичной структуры, но содержащего остаток гуанина вместо остатка oxoG и не являющегося субстратом этого фермента, не оказывало влияния на эффективность связывания.

Таким образом, синтезированные в работе модифицированные ДНК-дуплексы специфически и с высокой эффективностью связываются с Fpg Е. coli и могут быть использованы в качестве аналогов субстратов этого фермента при изучении его взаимодействия с фосфатными группами ДНК.

4. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов Fpg К coli

Механизм каталитического расщепления субстрата ферментом Fpg Е. coli включает выпетливание и удаление остатка oxoG из двойной спирали ДНК путем разрыва ЛГ-гликозидной связи. На следующей стадии происходит расщепление двух фосфодиэфирных связей ДНК по механизму последовательного Р,6-элиминирования в соответствии со схемой:

О 20 40 60 80 100 120 140 160 избыток ДНК-дуплексов IV (а) и XI (б) Рис. 4. Изменение эффективности связывания 32Р-меченного ДНК-дуплекса IV с Fpg Е. coli при добавлении избытка ДНК-дуплексов IV (а) и XI (б), не содержащих радиоактивной метки.

В результате в ДНК образуется одноцепочечный разрыв, фланкированный 3'- и 5'-концевыми фосфатами, а остаток дезоксирибозы и поврежденное основание удаляются.

Для выявления роли каждой фосфатной группы участка ДНК, специфически взаимодействующего с Fpg Е. coli, в функционировании фермента, было изучено каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов ферментом (таблица 4).

Таблица. 4.

Кинетические параметры каталитического расщепления ДНК-дуплексов 1-Х и IV'

ферментом Fpg Е. coll.

ДНК-дуплекс Ки (нМ) Vmax (нМмин'1) ^кат (МИН'1) ккат/К„ (нМ^мин1) Относительная эффективность, %

I 4.8 0.10 0.48 0.10 170

II 5.2 0.12 0.60 0.12 200

III 5.6 0.09 0.45 0.08 140

IV на 0.0 0.0 0.0 0

IV' на 0.0 0.0 0.0 0

V нв 0.0 0.0 0.0 0

VI 6.0 0.05 0.24 0.04 70

VII 6.3 0.08 0.42 0.07 100

VIII 6.2 0.09 0.43 0.07 110

IX 7.4 0.10 0.49 0.07 110

X 7.0 0.10 0.49 0.08 120

XII 7.3 0.08 0.42 0.06 100

'ДНК дуплексы IV, IV* и V - негидролизуемые аналоги субстратов (н).

Кинетические эксперименты проводились не менее трех раз; ошибка измерений не превышала 15%

Установлено, что все модифицированные ДНК-дуплексы, за исключением дуплексов IV, IV' и V, расщепляются ферментом. Эффективность каталитического расщепления зависела от положения модифицированной группы по отношению к остатку öxoG. Так, введение О-этилзамещенных пирофосфатных групп с 5'-конца от oxodG (ДНК-дуплексы I-III) приводило к увеличению эффективности расщепления в 1.4-2.0 раза по сравнению с расщеплением физиологического субстрата Fpg Е. coli аналогичного строения (ДНК-дуплекс XII). Введение модифицированной группы с 3'-конца от поврежденного нуклеозида приводило к противоположному эффекту. Так, ДНК-дуплекс VI расщеплялся на 30% менее эффективно, чем ДНК-дуплекс XII. ДНК-дуплексы IV, IV' и V не расщеплялись Fpg Е. coli даже в условиях 10-кратного избытка фермента и инкубации реакционной смеси в течение 12 часов. ДНК-дуплексы IV, IV' и V оказались негидролизуемыми аналогами субстратов Fpg Е. coli, поскольку они специфически связывались, но не расщеплялись ферментом. Такого рода соединения могут быть использованы в качестве ингибиторов действия Fpg Е. coli, а также в структурных исследованиях комплексов этого фермента с oxoG-содержащими ДНК.

Введение модифицированных межнуклеотидных фосфатных групп в цепь, комплементарную поврежденной, практически не повлияло на эффективность каталитического расщепления ДНК-дуплексов VII-X Fpg Е. coli (таблица 4).

Таким образом, фосфатные группы, находящиеся с 5'-конца от повреждения в oxoG-содержащей цепи ДНК, важны для эффективного каталитического расщепления субстрата ферментом; их модификация приводит к увеличению эффективности расщепления. Фосфатные группы, расположенные в противоположной цепи ДНК, не играют существенной роли в каталитическом расщеплении субстратов Fpg Е. coli. В то же время две последовательные фосфатные группы ДНК, находящиеся в 3'-положении к остатку oxoG, являются чрезвычайно важными для эффективного каталитического расщепления ДНК ферментом Fpg Е. coli; их модификация приводит к ингибированию действия фермента.

5. Изучение взаимодействия ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные группы с З'-конца от повреждения, с Fpg Е. coli и hOggl

В ходе настоящей работы было установлено, что ДНК-дуплексы IV, IV* и V являются ингибиторами не только Fpg E.coli, но и его эукариотического аналога 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы человека. Этот фермент обладает сходной с Fpg Е. coli субстратной специфичностью, но принадлежит к другому структурному классу. hOggl, в отличие от Fpg Е. coli, не удаляет остаток дезоксирибозы из ДНК, а лишь расщепляет углеводофосфатный остов с З'-конца от апурин/апиримидинового (АР) участка по механизму ß-элиминирования. Было показано, что hOggl специфически связывается с ДНК-дуплексами IV, IV' и V, но не расщепляет их. В то же время этот фермент эффективно расщепляет модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие О-этилзамещенные пирофосфатные группы в других положениях углеводофосфатного остова ДНК (рис. 5).

IV IV' IV' IV 1И XII V

1 2 T^V 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

К Fpg К Fpg К о Kg К Fpg I К Fpg 5 К Fpg g 13 О О о о о

я ja ja ja ja

Рис. 5. Радиоавтограф ПААГ, полученный при изучении взаимодействия Fpg Е. coli и hOggl с ДНК-дуплексами III-V, IV' и XII. Реакции проводили, инкубируя 50 нМ ДНК-дуплексы IV, IV', III, XII и V с 5 нМ Fpg Е. coli (дорожки 2, 4, 10, 13 и 16, соответственно) или с 26 нМ hOggl (дорожки 6, 8, 11, 14 и 17, соответственно). Контрольные ДНК-дуплексы IV, IV'; IV', IV и III, XII, V - дорожки 1, 3; 5, 7 и 9, 12, 15, соответственно.

Ингибирование каталитической активности обеих ДНК гликозилаз Fpg Е. coli и hOggl возможно как на стадии удаления поврежденного основания (ДГ-гликозилазной активности), так и расщепления углеводофосфатного остова ДНК (ß-лиазной активности). При изучении механизма взаимодействия модифицированных ДНК-дуплексов IV, IV' и V с ферментами Fpg Е. coli и hOggl было установлено, что модификация фосфатных групп, расположенных непосредственно с З'-конца от поврежденного нуклеозида и на расстоянии одного нуклеотида от него, приводит к ингибированию ДГ-гликозилазной активности обоих ферментов, и окисленное гетероциклическое основание oxoG не удаляется из ДНК.

Поскольку в составе ДНК пирофосфатная группа является химически стабильной, а замещенная пирофосфатная группа обладает реакционной способностью, то ДНК-дуплекс IV' является специфическим обратимым ингибитором, а ДНК-дуплексы IV и V — необратимыми ингибиторами 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз Fpg Е. coli и hOggl. Так как эти ферменты имеют различную пространственную организацию и являются представителями разных суперсемейств ДНК гликозилаз, возможно, что пирофосфатные/замещенные пирофосфатные группы, введенные в ДНК с З'-конца от повреждения, будут также ингибировать iV-гликозвлазную активность других ДНК гликозилаз. В пользу этого предположения свидетельствуют полученные в работе данные об ингибировании ДНК-дуплексом IV ДНК гликозилазы человека Neill.

В последние годы достигнуты определенные успехи в кристаллизации ковалентных комплексов ДНК гликозилаз с аналогами субстратов, содержащими AP-участки, а также комплексов ДНК, содержащих поврежденные гетероциклические основания, с мутантными каталитически неактивными формами ферментов. Однако знание структурных аспектов специфического узнавания и удаления поврежденного основания ДНК гликозилазами "дикого" типа ограничено тем обстоятельством, что до настоящего времени не удается получить кристаллы комплексов каталитически активных форм ферментов с ДНК, содержащими окисленное основание. Это связано с тем, что ферменты "дикого" типа расщепляют свои субстраты намного быстрее, чем протекает процесс кристаллизации и сбор данных. Найденные в работе специфические обратимые и необратимые ингибиторы могут быть использованы для структурных исследований комплексов oxoG-содержащих ДНК с каталитически активными формами 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз. Кроме того, данные соединения представляют интерес как потенциальные терапевтические препараты для лечения различных генетических заболеваний, поскольку поврежденные ДНК, образующиеся под действием лекарственных препаратов, используемых в химиотерапии, являются субстратами ферментов репарации, в частности, ДНК гликозилаз. Ингибирование процесса эксцизионной репарации оснований к настоящему времени является наименее изученным подходом генной терапии (Laval et. al., 2005).

6. Регноспсцнфическое ковалентное связывание Fpg Е. coli с ДНК-дуплексами,

содержащими О-этилзамсщенные пирофосфатные межнуклеотидныс группы -

Важной задачей настоящей работы явилось зондирование активного центра Fpg Е. coli и определение контактов белка с фосфатными группами ДНК. Для этого в работе использовали ДНК-дуплексы 1-Х, содержащие реакционноспособные О-этилзамещенные пирофосфатные группы. Как было установлено ранее, в составе специфического фермент-субстратного комплекса замещенные пирофосфатные группы взаимодействуют с пространственно сближенными нуклеофильными группами аминокислотных остатков белка с образованием ковалентной связи (Kuznetsova et. al., 1996). Образование ковалентной связи протекает по механизму нуклеофильного замещения у дизамещенного атома фосфора в соответствии со схемой:

5' О — Р—О 0=Р—О- 3'

3'

горизонтальными линиями обозначены олигонукпеотиды; вертикальными линиями - водородые связи между комплементарными парами оснований; v/w« - боковой радикал нуклеофильной аминокислоты.

Преимуществом такого подхода является то, что реакция протекает без какой-либо дополнительной активации в условиях, близких к физиологическим.

Региоспецифическое ковалентное связывание Fpg Е. coli с ДНК-дуплексами 1-Х, проводили в условиях существования специфических фермент-субстратных комплексов. Оптимальные условия реакции подбирали, варьируя температуру, время инкубации и концентрацию реагирующих веществ. Поскольку ранее было показано, что наличие в реакционной смеси jV-метилимидазола (W-Melm) может приводить к увеличению эффективности реакции ковалентного связывания (Shabarova et. al., 1996), реакции проводили в присутствии и в отсутствие N-Melm. Результаты представлены на рисунке 7 и в таблице 5.

Ковалентное связывание наблюдали в семи из десяти исследуемых ДНК-дуплексов. Максимальная эффективность ковалентного связывания во всех случаях, за исключением дуплексов IV и V, достигалась при температуре 21°С и составила 30% (ДНК-дуплекс I). Для ДНК-дуплексов IV и V максимальные выходы ДНК-белковых комплексов наблюдали при температуре 37°С в присутствии 0.05 М JV-Melm (50 и 35%). Это связано с тем, что указанные соединения являются негидролизуемыми аналогами субстрата Fpg Е. coli, и

повышение температуры не приводит к их каталитическому расщеплению, а приводит к увеличению выходов ковалентных комплексов.

I II Ш

IV V VI vn vm X IX XI ДНОК-дуплекс (Р2) (Р1) (Р°) (Р-1) (Р-2) (Р-3) Л (PO) (РЩ (Р^) (Р1) фосфатная группа _+* + _ + _+ _ + _+ - + - + _+.+ .+ Fpg

ковалснтный — комплекс Fpg-ДНК

несвязанная ' ДНК

1 2 3 4 ,5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 7. Радиоавтографы электрофореза в 12% SDS-ПААГ реакционных смесей, образующихся при выдерживании ДНК-дуплексов I-XI в присутствии (дорожки с четными номерами) и в отсутствие (дорожки с нечетными номерами, соответственно) Fpg Е. coli.

Таблица 5.

Ковалентное связывание Fpg К coli С ДНК-дуплексами 1-Х, содержащими

Выходы ковалентных ДНК-белковых комплексов*, %

я 2 я 2 Условия реакции**

5 е ев В •в" Ъ » * и ** 0°С 21°С 37°С

g £• е - + - + - +

р2 I 0 3 15 30 4 10

Р1 II 0 0 0 0 0 0

рО Ш 8 10 8 10 8 10

р-1 IV 20 25 40 45 43 50

р-2 V 3 10 8 20 7 35

р-3 VI 3 10 5 18 1 10

р(0) vn 0 0 0 0 0 0

р(-1) vin 1 10 3 20 15 17

р(-2) IX 2 20 5 22 10 20

р(-3) X 0 0 0 0 0 0

♦Реакции проводили в течение 14 часов в отсутствие (-) и в присутствии (+) 0.05М Л^-Ме1т, соотношение компонентов субстрат: фермент =«1:10.

•♦Указанные значения выходов коньюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов. Ошибка измерений не превышала 10%.

Жирным шрифтом отмечены максимальные выходы ковалентных комплексов для каждого из исследуемых ДНК-дуплексов.

Следует отметить, что ковалентное связывание является специфическим, поскольку в случае нековалентного связывания наблюдалось образование одного специфического комплекса ДНК с белком. Кроме того, отсутствие продуктов ковалентного связывания Fpg Е. coli с ДНК-дуплексом XI, содержащим О-этилзамещеную пирофосфатную группу и остаток гуанина вместо oxoG (т.е. не способным образовывать специфический ДНК-белковый комплекс), также подтверждает специфичность ковалентного связывания.

Установлено, что ковалентная связь между олигонуклеотидами и Fpg Е. coli в случае всех полученных ковалентных комплексов имеет фосфоамидную природу.

Образование ковалентных комплексов ДНК-дуплексов I, III-VI, VIII и IX с ферментом Fpg Е. coli является первым прямым экспериментальным доказательством наличия семи специфических контактов нуклеофильных аминокислот из активного центра белка с межнуклеотидными Р2, Р°, Р"1, Р"2, Р'3 фосфатными группами oxoG-содержащей цепи и Р(_1) и Р('2) фосфатными группами противоположной цепи ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса.

7. Определение природы аминокислоты Fpg Е. coli, ковалентно связанной с фосфатной группой в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом

Высокая эффективность и специфичность ковалентного связывания (кросслинкинга) открыли возможность определения природы аминокислотных остатков Fpg Е. coli, взаимодействующих с фосфатными группами поврежденной ДНК методом масс-спектрометрии. В качестве объекта исследования был выбран продукт ковалентного связывания Fpg Е. coli с ДНК-дуплексом IV, содержащим реакционноспособную О-этилзамещенную пирофосфатную группу в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом. Анализ проводили по следующей схеме:

фсрМСЫ! ^цдалцпиппу-

способная ДНК

ДНК-белковый не связанный комплекс с дак

•* —j-----~

пептидный коньюгвт

3

Выделение коньюгата Анионообменная хроматография на Q-сефарозс

мы

МС/МС

анализ

5

TICLFI >4^) »»«-j»——»—. аминокислоту,

ами! обр

UIÜUMIWIUIJ',

яда

^SSÄT0- пептиды

коньюгат

После ковалентного связывания ДНК-дуплекса IV с Fpg Е. coli, проводимого в препаративных количествах, протеолиза белковых компонентов смеси и выделения олигонуклеотидо-пептидного коньюгата проводили селективное расщепление фосфоамидной связи между олигонуклеотидным и пептидным фрагментами коньюгата (декросслинкинг). Полученный образец анализировали методом электроспрей масс-спектрометрии. Были детектированы сигналы m/z 504.3, 768.4, и 531.6, соответствующие двузарядным ионам 50SVQRRAKY57, 157LMNDKLVVGVGNIY170 и 207RSIEQGGTTL217 пептидов фермента Fpg Е. coli, соответственно. Для доказательства структуры пептидов использовали МС/МС анализ. В качестве примера на рисунке 8 приведен МС/МС спектр 50SVQRRAKY57 пептида.

RT30.61-30.61 NL 5.Й2ЕЗ

S-V-

Y—!•

-К--А-

-R-

-R-

-R-i-

»1-? : yi-э 30Э.7; 381.2

Ь1-5 »27. 3

Ы-в 698 5

Я-в 693.8:

1 У1-' 18?:

М-2 187.1

ы-з 314 7

М-4

«72.0 «37.6

I I I I * | 10«

г 200

Jli i,

»1-е ! «М-7 1827.0

»1-8 1008.1

XU

»1-7 821.1

500 600 m/z

700

TT 900

■ ■

1000

Рис. 8. MC/MC спектр 50SVQRRAKY57 пептида Fpg E. coli.

Согласно результатам расщепления химотрипсином ковалентного комплекса Fpg Е. coli с ДНК-дуплексом IV, только один пептид был ковалентно связан с ДНК. С помощью специально разработанного масс-спектрометрического подхода, основанного на использовании в качестве контроля фермента, меченного стабильным изотопом азота было установлено, что наличие 157LMNDKLVVGVGNIY170 и 207RSIEQGGTTL216 пептидов в образце вызвано их неспецифической сорбцией на Q-сефарозе и их чрезвычайно высокой ионизационной способностью. Полученные результаты свидетельствовали о том, что фосфатная группа ДНК, связанная с З'-ОН oxodG, контактирует с нуклеофильной аминокислотой из s0SVQRRAKY57 пептида. Потенциальными кандидатами для образования ковалентной связи с ДНК были Arg-53, Arg-54 и Lys-56.

Для того чтобы определить, какой из этих трех аминокислотных остатков участвует в образовании ковалентной связи с ДНК-дуплексом IV, было проведено изучение взаимодействия этого дуплекса с мутантными формами Fpg Е. coli, содержащими замены Arg-53->Gly, Arg-54->Gly, Lys-56->Arg и Lys-56->GIy. Известно, что эти мутации не

изменяют вторичную структуру Брд Е. соП, но частично дестабилизируют

взаимодействия, обуславливающие его третичную структуру гкта е/. а!., 1998). Предварительно было установлено, что все исследуемые мутантные белки специфически связываются с ДНК-дуплексом IV (таблица б, рис. 9 А). Методом региоспецифического

ковалентного связывания было показано, что РрвК56Я, РрдЯ540 и Рре11530 формируют ковалентные комплексы с ДНК-дуплесом IV (рис. 9 Б). В отличие от них Рр§К560 не образовывал ковалентного комплекса с ДНК-дуплексом IV.

ДНК-белковый - нековалентный комплекс

-ДНК-дуплекс IV

-ДНК-белковый ковалентный комплекс

_ —ДНК-дуплекс IV

1 2 3 4 5 6 Рис. 9. Нековалентное (А) и ковалентное (Б) связывание ДНК-дуплекса IV с Fpg Е. coli "дикого" типа и FpgK56R, FpgK56G, FpgR53G, FpgR54G (дорожки 2-6, соответственно). Дорожка 1 на каждом геле соответствует ДНК-дуплексу IV в отсутствие белка.

Таким образом, в совокупности полученные результаты однозначно свидетельствуют о

том, что ковалентную связь с фосфатной группой, расположенной с З'-конца от oxodG,

формирует аминокислота Lys-56 фермента Fpg Е. coli.

Таблица 6.

Константы диссоциации комплексов Fpg Е. coli "дикого" типа (wtFpg) и

мутантных ( >орм Fpg Е. coli с ДНК-дуплексом IV.

Белок wtFpg FpgK56R FpgK56G FpgR54G FpgR53G

KD, нМ 3.0 7.0 48 35 20

Величину KD определяли по результатам 3-6 экспериментов, ошибка измерений не превышала 20%.

8. Схема взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами охоС-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе

К настоящему времени в литературе отсутствуют сведения о структуре комплекса Fpg Е. coli с oxoG-содержащей ДНК. Существуют данные рентгеноструктурного анализа ковалентного комплекса Fpg Е. coli с ДНК, содержащей AP-участок (Zharkov et. al, 2002). В этой структуре разупорядочен фрагмент полипептидной цепи, содержащий аминокислоты, ответственные за взаимодействия с окисленным гетероциклическим основанием. Согласно этим данным, высококонсервативный остаток Lys-56 контактирует с фосфатной группой, расположенной непосредственно с З'-конца от oxodG, что согласуется с результатами, полученными в настоящей работе. Базируясь на данных настоящего исследования, а также учитывая данные рентгеноструктурного анализа комплекса Fpg Е. coli с АР-ДНК, предложена модель взаимодействия Fpg Е. coli с oxoG-содержащей ДНК в растворе (рис. 10).

ШЭ-^у Л

Н89

О P17хГ

Е5

Н70

водородные связи

псевдо Уотсон-Криковские взаимодействия ван дер Ваальсовы взаимодействия

Vs

ÄECE3—

Sä

«У

\

Рис. 10. Схематическое изображение взаимодействий между фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК и ферментом Fpg Е. coli. Жирным шрифтом выделены фосфатные группы, для которых было обнаружено образование ковалентной связи с нуклеофильными аминокислотами.

Представленная схема дополнена сведениями о контактах фермента с поврежденной ДНК, полученными в результате анализа литературных данных. При построении этой схемы основывались на том, что образование водородных связей возможно, если доноры и акцепторы водорода в ДНК находятся на расстоянии не более 3.2 А от соответствующих атомов в белке. Ван дер Ваальсовы взаимодействия считали возможными, если взаимодействующие группы находятся на расстоянии не более 4.5 А. Был учтен тот факт, что ковалентное связывание идет по дизамещенному атому фосфора О-этилзамещенной пирофосфатной группировки, который, по данным наших исследований, смещен в сторону Cs' атома на 2.3 А. Было учтено также, что углеводофосфатный остов ДНК в месте модификации обладает повышенной конформационной подвижностью за счет большей подвижности пирофосфатного остатка по сравнению с природным фосфатом. При сделанных допущениях выводы, основанные на результатах ковалентного связывания Fpg Е. coli с ДНК-дуплексами 1-Х, содержащими О-этилзамещенную пирофосфатную группу, правомерно использовать для определения контактов белка с фосфатными группами природного субстрата.

Согласно этой модели, специфические контакты с нуклеофильными аминокислотами из активного центра Fpg Е. coli формируют пять фосфатных групп oxoG-содержащей цепи Д11К и две фосфатные группы противоположной цепи ДНК. В эти контакты вовлечены высококонсервативные остатки Lys-56, Arg-109, Lys-254 и Arg-258.

Из литературных данных известно, что Lys-56 является высококонсервативным аминокислотным остатком во всех прокариотических ферментах Fpg и играет важную роль в расщеплении фосфодиэфирной связи, образованной с участием фосфатной группы в 3'-положении oxodG (Laval et. al., 1998). Аминокислотные остатки Lys-254 и Arg-258 входят в состав ДНК-связывающего мотива "цинковый палец". Lys-88 и Arg-109 входят в состав структурного элемента, так называемой "читающей головки", используемой ферментом при поиске повреждений в ДНК, а неконсервативный остаток Arg-33 участвует в поддержании измененной структуры ДНК в специфическом фермент-субстратном комплексе.

Построение и анализ этой схемы сделали возможным объяснение экспериментальных данных, полученных в настоящей работе. Так, увеличение эффективности нековалентного связывания ДНК-дуплекса I с ферментом может быть следствием образования дополнительных водородных связей между Lys-254 и дизамещенной фосфатной группой О-этилзамещенной пирофосфатной группировки в положении Р2. Ингибирование вьпцепления остатка oxoG из ДНК-дуплексов IV, IV и V и уменьшение эффективности их связывания с ферментом может быть следствием изменения локализации аминокислотных остатков Thr-214, GIu-2 и Arg-258, принимающих непосредственное участие в каталитическом расщеплении поврежденной ДНК, а также нарушения специфических контактов Agr-258 и Asn-168 с модифицированными Р"1 и Р° фосфатными группами, фланкирующими oxoG. Увеличение эффективности каталитического расщепления модифицированных ДНК-дуплексов 1-1П может быть объяснено перестройкой сети водородных связей между Р'1 и Р° фосфатными группами и аминокислотными остатками Arg-258 и Lys-56.

Таким образом, девять фосфатных групп oxoG-содержащей ДНК из участка, специфически взаимодействующего с ферментом, образуют специфические контакты с аминокислотами из активного центра Fpg Е. coli, что подтверждает важнейшую роль этих контактов в функционировании фермента. Семь из них обнаружены в настоящей работе при изучении взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами ДНК в составе фермент-субстратного комплекса в растворе. Установлено, что эти фосфатные группы контактируют с нуклеофильными группами аминокислот активного центра фермента.

Результаты проведенного исследования позволяют пополнить представления о каталитическом механизме действия, строении активного центра и структурно-функциональных особенностях 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы Fpg Е. coli и ее про- и эукариотических гомологов.

выводы

1. Осуществлен дизайн и синтез серии новых аналогов субстратов фермента репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Escherichia coli - ДНК-дуплексов, содержащих одновременно остаток 7,8-дигидрб8-оксо-2'-дезоксигуанозина и пирофосфатную либо О-этилзамещенную пирофосфатную межнуклеотидные группы в различных положениях углеводофосфатного остова.

2. Впервые комбинированным методом квантовой и молекулярной механики изучено влияние введенных модификаций на структуру двойной спирали ДНК. Установлено, что введение пирофосфатных и Оэтилзамещенных пирофосфатных межнуклеотидных групп не оказывает влияния на стэкинг- и Уотсон-Криковские взаимодействия фланкирующих пар оснований и не приводит к увеличению расстояния между соседними нуклеотидами.

3. Изучено специфическое связывание и каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов ферментом Fpg Е. coli. Определены константы диссоциации и кинетические параметры ферментативных реакций. Выявлена значимость каждой фосфатной группы участка ДНК, покрываемого белком, в функционировании фермента.

4. Впервые синтезированы обратимые и необратимые oxoG-содержащие ингибиторы Fpg Е. coli и его эукариотического аналога hOggl; изучен механизм их взаимодействия с ферментами.

5. Методом региоспецифического ковалентного связывания проведено зондирование активного центра Fpg Е. coli с помощью реакционноспособных аналогов субстратов, содержащих О-этилзамещенные пирофосфатные группы. Выявлено семь специфических контактов нуклеофильных аминокислот фермента с фосфатными группами ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса.

6. С использованием метода масс-спектрометрии и набора мутантных форм Fpg Е. coli определена аминокислота Lys-56 из активного центра фермента, которая непосредственно взаимодействует с фосфатной группой, связанной с З'-ОН 7,8-дигидрв 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом).

7. В результате анализа полученных экспериментальных данных и данных литературы предложена модель взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Maria У. Roeacheva. Murât К. Saparbaev, Ivan M. Afanasov, Svetlana A. Kuznetsova. (2005) Two sequential phosphates 3' adjacent to the 8-oxoguanosine are crucial for lesion excision by E. coli Fpg protein and human 8-oxoguanine-DNA glycosylase. Biochimie, 87, 1079-1088.

2. M.B. Тараненко, E.M. Волков, M.K. Сапарбаев, С.А. Кузнецова. (2004) Новые негидролизуемые аналоги субстратов 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз. Молекулярная биология, 38, 859-869.

3. Svetlana Kuznetsova, Anna Rykhlevskaya, Maria Taranenko. Olga Sidorkina, Tatiana Oretskaya, Jacques Laval. (2003) Use of crosslinking for revealing the DNA phosphate groups forming specific contacts with the E. coli Fpg protein. Biochimie, 85, 511-519.

4. Maria V. Rogacheva. A.N. Bochenkova, S.A. Kuznetsova, A.V. Nemukhin. (2005) Theoretical study of the double-stranded DNA structures with modified phosphate groups. Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 332-333.

5. Рогачева M.B., Кузнецова С.А. (2005) Определение контактов фосфатных групп ДНК с аминокислотами фермента репарации Fpg E. coli. 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века ", 47.

6. Рогачева М.В.. Боченкова А.В. (2005) Теоретическое моделирование структуры ДНК-дуплекса, содержащего пирофосфатную группу. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов — 2005", Москва, 1, 102.

7. Maria Taranenko. Murât Saparbaev, Svetlana Kuznetsova. (2004) Two sequential phosphates 3' adjacent to the 8-oxoguanine are crucial for lesion excision by 8-oxoguanine-DNA glycosylases. International Conference "Chemical & Biological Problems of Proteomics", Novosibirsk, 36.

8. Тараненко М.В.. Кузнецова С.А. (2004) Новые специфические ингибиторы 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз. 8-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология — наука XXI века ",35.

9. Афанасов И.М., Тараненко М.В.. Кузнецова С.А. (2004) Определение роли фосфатных групп ДНК в функционировании фермента репарации Fpg E. coli. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов -2004", 1, 83.

Принято к исполнению 23/10/2006 Исполнено 24/10/2006

Заказ № 769 Тираж: ЮОэкз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕПАРАЦИИ

8-ОКСОГУАНИНА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Системы репарации 8-оксогуанина в клетках про- и эукариот.

1.2. 8-Оксогуанин-ДНК гликозилазы.

1.2.1. 8-Оксогуанин-ДНК гликозилазы прокариот.

1.2.1.1. Структура Fpg прокариот.

1.2.1.2. Субстратная специфичность Fpg прокариот.

1.2.1.3. Каталитический механизм Fpg прокариот.

1.2.1.4. Конформационные перестройки комплексов Fpg прокариот с ДНК.

1.2.1.5. Взаимодействие Fpg прокариот с остатком охо С поврежденной ДНК.

1.2.1.6. Взаимодействие ¥р% прокариот с цепью ДНК, комплементарной поврежденной.

1.2.1.7. Поиск охоС в структуре ДНК прокариотическими ¥р% ферментами

1.2.2. 8-Оксогуанин-ДНК гликозилазы эукариот.

1.2.2.1. Структура /^Oggl.

1.2.2.2. Субстратная специфичность Oggl эукариот.

1.2.2.3. Каталитический механизм Oggl эукариот.

1.2.2.4. Конформационные перестройки в комплексе к

§§1-охоС-ДНК.

1.2.2.5. Поиск в геноме остатков охоС ферментом hOggl.

1.3. Аденин-ДНК гликозилазы.

1.3.1. Аденин-ДНК гликозилазы прокариот.

1.3.1.1. Структура Ми(Упрокариот.

1.3.1.2. Субстратная специфичность МШУ прокариот.

1.3.1.3. Каталитический механизм МШУ прокариот.

1.3.1.4. Конформационные перестройки в комплексах МШУ прокариот с охо С:А-содержащей ДНК.

1.3.1.5. Взаимодействие МШУ прокариот с остатком охо (7 ДНК-субстрата

1.3.2. Аденин-ДНК гликозилазы эукариот.

1.4. 8-Оксогуанозинтрифосфатазы.

1.4.1. 8-Оксогуанозинтрифосфатазы прокариот.

1.4.1.1. Структура MutTE. coli.

1.4.1.2. Субстратная специфичность MutTE. coli.

1.4.1.3. Каталитический механизм MutTE. coli.

1.4.2. 8-Оксогуанозинтрифосфатазы эукариот.

1.4.2.1. Структура 8-оксогуанозинтрифосфатаз эукариот.

1.4.2.2. Субстратная специфичность 8-оксогуанозинтрифосфатаз эукариот.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ ФОРМАМИДОПИРИМИДИН-ДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ Е. COLIC ФОСФАТНЫМИ ГРУППАМИ ДНК (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ).

2.1. Экспрессия и выделение формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Е. coli.

2.2. Дизайн и синтез модифицированных ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатные и замещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы

2.3. Исследование структуры модифицированных ДНК-дуплексов комбинированным методом квантовой и молекулярной механики.

2.3.1. Выбор модельной системы.

2.3.2. Оптимизация геометрических параметров.

2.3.3. Сравнение теоретических и экспериментальных данных для структуры немодифицированного ДНК-дуплекса.

2.3.4. Влияние пирофосфатной и реакционноспособной О-этилзамещенной пирофосфатной групп на структуру ДНК-дуплексов.

2.3.5. Электронное строение пирофосфатной и О-этилзамещенной пирофосфатной групп в составе ДНК.

2.4. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с формамидопиримидин-ДНК гликозилазой Е. coli.

2.4.1. Определение констант диссоциации комплексов модифицированных аналогов субстратов с ферментом.

2.4.2. Доказательство специфичности связывания.

2.5. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов формамидопиримидин-ДНК гликозилазой Е. coli.

2.5.1. Определение кинетических констант каталитического расщепления модифицированных аналогов субстратов ферментом.

2.5.2. Изучение взаимодействия ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы, с 8-оксогуанин-ДНК гликозилазой человека (hOggl).

2.5.3. Изучение механизма взаимодействия ферментов Fpg Е. coli и hOggl с ДНК-дуплексами, содержащими модифицированные межнуклеотидные группы в 3'- и 5'-положениях остатка 8-оксогуанозина.

2.6. Региоспецифическое ковалентное связывание Fpg Е. coli с ДНК-дуплексами, содержащими 0-этилзамещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы.

2.7. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу, с мутантными формами Fpg Е. coli.

2.8. Определение аминокислоты Fpg Е. coli, ковалентно связанной с фосфатной группой ДНК в положении, каталитически расщепляемом ферментом.

2.9. Схема взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и материалы.

3.1.1. Реактивы

3.1.2. Среды для культивирования клеток.

3.1.3. Буферные растворы.

3.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды.

3.1.4.1. Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды.

3.1.4.2. Анализ синтезированных олигонуклеотидов.

3.1.5. Ферменты.

3.2. Методы.

3.2.1.Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях.

3.2.2. Электрофорез в полиакриамидном геле в неденатурирующихусловиях.

3.2.3. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле.

3.2.4. Радиоавтография.

3.3. Общие методики.

3.3.1. Экспрессия FpgE.coli и hOggl.

3.3.2. Выделение Fpg Е. coli.

3.3.3. Выделение hOggl.

3.3.4. 5'-[ PJ-Фосфорилирование олигонуклеотидов.

3.3.5. Синтез этиловых эфиров олигонуклеотидов.

3.3.6. Синтез модифицированных ДНК-дуплексов методом химического лигирования.

3.3.7. Получение модифицированного ДНК-дуплекса, содержащего АР-участок

3.3.8. Аминолиз и гидролиз ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы.

3.3.9. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с

Fpg Е. coli, hOggl и мутантными формами Fpg Е. coli.

3.3.10. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов

Fpg Е. coli и hOggl.

3.3.11. Расщепление межнуклеотидной фосфодиэфирной связи в ДНК-дуплексах, содержащих АР-участки.

3.3.12. Ковалентное связывание реакционноспособных аналогов субстратов с

Fpg Е. coli.

3.3.13. Протеолиз ковалентного комплекса ДНК-дуплекса IV с Fpg Е. coli.

3.3.14. Выделение олигонуклеотидо-пептидного коньюгата и расщепление ковалентной связи между олигонуклеотидным и пептидным фрагментами коньюгата.

3.3.15. Масс-спектрометрия.

3.3.16. Компьютерное моделирование.

ВЫВОДЫ.

Репарация ДНК является фундаментальным биологическим процессом, обеспечивающим стабильность и целостность генетической информации клетки. Нарушения в системе репарации могут являться причинами преждевременного старения, заболеваний иммунной системы, кардиологических, онкологических и ряда других. Всесторонние фундаментальные исследования систем репарации ДНК и, в частности, ферментов, принимающих участие в этом процессе, ведутся в настоящее время во многих научных центрах. Особое внимание уделяется изучению ферментов, удаляющих повреждения ДНК, вызванные воздействием активного кислорода.

Активный кислород, образующийся в клетках в качестве побочного продукта метаболизма или в результате гамма-, УФ-излучения или действия химических агентов, является одним из наиболее агрессивных факторов окружающей среды, индуцирующих повреждения во всех основных клеточных компонентах, таких как ДНК, липиды, углеводы и белки. В ДНК свободные радикалы кислорода могут повреждать гетероциклические основания и углеводофосфатный остов как в результате непосредственного воздействия, так и опосредовано, например, в результате воздействия продуктов окисления мембранных липидов. Высокореакционноспособные гидроксильные радикалы и синглетный кислород способны вызывать делеционные дефекты в ДНК и приводить к летальным и мутагенным повреждениям. Целостность ДНК после таких модификаций чаще всего восстанавливается путем эксцизионной репарации оснований. На ранних этапах этого процесса участвуют специфические ферменты ДНК-А^-гликозилазы, распознающие и удаляющие повреждения в ДНК. Изучение механизма действия этих ферментов, их структуры, субстратной специфичности, особенностей взаимодействия с ДНК на разных стадиях функционирования является актуальной задачей.

Настоящая работа посвящена изучению фермента эксцизионной репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы (Fpg) Escherichia coli. Этот фермент удаляет остатки 8-оксогуанозина из ДНК и играет ключевую роль в репарации повреждений ДНК, вызванных воздействием активного кислорода. Fpg Е. coli является удобной моделью для исследования механизма действия репарирующих ферментов данного класса, поскольку аминокислотные последовательности прокариотических гомологов этого белка имеют высокую степень консервативности и общие мотивы третичной структуры.

До настоящего времени основное внимание исследователей уделялось изучению взаимодействия Fpg из различных прокариотических источников с окисленным гетероциклическим основанием и крайне мало внимания уделялось исследованию контактов с фосфатными группами поврежденной ДНК. Вместе с тем эти контакты играют важнейшую роль в функционировании фермента. Так, известно, что в результате взаимодействия Fpg Е. coli с поврежденной ДНК происходят значительные конформационные изменения в ее структуре, включая расширение малой бороздки, частичное плавление и изгиб в месте повреждения, выпетливание окисленного основания из спирали ДНК. Такие фермент-зависимые изменения структуры ДНК осуществляются в основном за счет образования специфических контактов аминокислот из активного центра Fpg Е. coli с фосфатными группами ДНК в составе продуктивного фермент-субстратного комплекса. Важным обстоятельством является то, что в отличие от слабых неспецифических аддитивных взаимодействий Fpg Е. coli с фосфатными группами неповрежденной ДНК, в специфическом фермент-субстратном комплексе такие контакты многократно усиливаются, приобретают кооперативный характер и реализуются по типу взаимодействия отдельных непосредственно контактирующих групп. Детального исследования таких взаимодействий ранее не проводили.

Целью настоящей работы явилось изучение взаимодействия фермента репарации Fpg Е. coli с фосфатными группами поврежденной ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса.

В ходе работы был осуществлен дизайн и синтез серии ДНК-дуплексов, содержащих одновременно остаток 8-оксо-2'-дезоксигуанозина и пирофосфатную либо реакционноспособную О-этилзамещенную пирофосфатную межнуклеотидные группы в различных положениях углеводофосфатного остова. С использованием комбинированного метода квантовой и молекулярной механики изучено влияние введенных модифицированных групп на структуру двойной спирали ДНК.

Изучено связывание и каталитическое расщепление синтезированных аналогов субстратов ферментом Fpg Е. coli. Определена значимость каждой фосфатной группы участка ДНК, взаимодействующего с белком, в функционировании фермента. Найдены новые специфические обратимые и необратимые ингибиторы Fpg Е. coli.

Проведено зондирование активного центра Fpg Е. coli с помощью реакционноспособных аналогов субстратов фермента - синтетических ДНК-дуплексов, содержащих О-этилзамещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы. С использованием метода масс-спектрометрии и набора мутантных форм Fpg Е. coli определена аминокислота Lys-56 из активного центра фермента, которая непосредственно взаимодействует с фосфатной группой в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом.

В результате анализа полученных в ходе работы экспериментальных данных предложена схема взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами поврежденной ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе.

Работа содержит литературный обзор, в котором суммированы сведения о ферментах, играющих ключевую роль в репарации 8-оксогуанина.

выводы

1. Осуществлен дизайн и синтез серии новых аналогов субстратов фермента репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы (Fpg) Escherichia coli -ДНК-дуплексов, содержащих одновременно остаток 8-оксо-2'-дезоксигуанозина и пирофосфатную либо О-этилзамещенную пирофосфатную межнуклеотидные группы в различных положениях углеводофосфатного остова.

2. Впервые комбинированным методом квантовой и молекулярной механики изучено влияние введенных модификаций на структуру двойной спирали ДНК. Установлено, что введение пирофосфатных и О-этилзамещенных пирофосфатных межнуклеотидных групп не оказывает влияния на стэкинг- и уотсон-криковские взаимодействия фланкирующих пар оснований и не приводит к увеличению расстояния между соседними нуклеотидами.

3. Изучено специфическое связывание и каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов ферментом Fpg Е. coli. Определены константы диссоциации и кинетические параметры ферментативных реакций. Выявлена значимость каждой фосфатной группы участка ДНК, покрываемого белком, в функционировании фермента.

4. Впервые синтезированы обратимые и необратимые охоО-содержащие ингибиторы Fpg Е. coli и его эукариотического аналога hOggl; изучен механизм их взаимодействия с ферментами.

5. Методом региоспецифического ковалентного связывания проведено зондирование активного центра Fpg Е. coli с помощью реакционноспособных аналогов осубстратов, содержащих О-этилзамещенные пирофосфатные группы. Выявлено семь специфических контактов нуклеофильных аминокислот фермента с фосфатными группами ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса.

6. С использованием метода масс-спектрометрии и набора мутантных форм Fpg Е. coli определена аминокислота Lys-56 из активного центра фермента, которая непосредственно взаимодействует с фосфатной группой, связанной с З'-ОН 7,8-дигидре8-оксо-2'-дезоксигуанозина в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом.

7. В результате анализа полученных экспериментальных данных и данных литературы предложена модель взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами охоО-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе.

1. Shibutani S., Takeshita M., Grollman A.P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature (1991) 349,431-434.

2. Moriya M., Ou C., Bodepudi V., Johnson F., Takeshita M., Grollman A.P. Site-specific mutagenesis using a gapped duplex vector: a study of translesion synthesis past 8-oxodeoxyguanosine in E. coli. Mutat. Res. (1991) 254,281-288.

3. Maki H., Sekiguchi M. MutT protein specifically hydrolyses a potent mutagenic substrate for DNA synthesis. Nature (1992) 355, 273-275.

4. Tajiri T., Maki H., Sekiguchi M. Functional cooperation of MutT, MutM, and MutY proteins in preventing mutations caused by spontaneous oxidation of guanine nucleotide in Escherichia coli. Mutat. Res. (1995) 336, 257-267.

5. Yanofsky C., Cox E.C., Horn V. The unusual mutagenic specificity of an E. coli mutator gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1966) 55,274-281.

6. Akiyama M., Maki H., Sekiguchi M., Horiuchi T. A. Specific role of MutT protein: to prevent dG- dA mispairing in DNA replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86,3949-3952.

7. Michaels M. L., Tchou J., Grollman A. P., Miller J. H. A repair system for 8-Oxo-7,8-dihydrodeoxyguanine. (1992) Biochemistry 31,10964-10968.

8. Michaels M.L., Miller J.H. The GO system protects organisms from the mutagenic effect of the spontaneous lesion 8-hydroxyguanine (7,8-dihydro-8-oxoguanine). J. Bacteriol. (1992) 174, 6321-6325.

9. Michaels M.L., Cruz C., Grollman A.P., Miller J.H. Evidence that MutY and MutM combine to prevent mutations by an oxidatively damaged form of guanine in DNA. -Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89, 7022-7025.

10. Sekiguchi M., Tsuzuki T. Oxidative nucleotide damage: consequences and prevention. Oncogene (2002) 21, 8895-8904.

11. Bessho T., Tano K., Kasai H., Ohtsuka E., Nishimura S. Evidence for two DNA repair enzymes for 8-hydroxyguanine (7,8-dihydro-8-oxoguanine) in human cells. J. Biol. Chem. (1993) 268,19416-19421.

12. Yeh Y.C., Chang D.Y., Masin J., Lu A.L. Two nicking enzyme systems specific for mismatch-containing DNA in nuclear extracts from human cells. J. Biol. Chem. (1991)266, 6480-6484.

13. Kremer T.M., Rinne M.L., Xu Y., Chen X.M., Kelley M.R. Protection of pulmonary epithelial cells from oxidative stress by hMYH adenine glycosylase. Respiratory Research (2004) 5,1-16.

14. Nakabeppu Y. Prog. Regulation of intracellular localization of human MTH1, OGG1, and MYH proteins for repair of oxidative DNA damage. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. (2001) 68, 75-94.

15. Chetsanga C.J., Lindahl T. Release of 7-methylguanin residues whose imidazole rings have been opened from damaged DNA by a DNA glycosylase from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. (1979) 6, 3673-3684.

16. Chetsanga C.J., Lozon M., Makaroff C., Savage L. Purification and characterization of Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase that excises damaged 7-methylguanine from deoxyribonucleic acid. Biochemistry (1981) 20, 5201-5207.

17. O'Connor T.R., Boiteux S., Laval J. Ring-opened 7-methylguanine residues in DNA are a block to in vitro DNA synthesis. Nucleic Acids Res. (1988) 16, 5879-5894.

18. Tchou J., Kasai H., Shibutani S., Chung M.H., Laval J., Grollman A.P., Nishimura S. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1991) 88,4690-4694.

19. Boiteux S., O'Connor T.R., Lederer F., Gouyette A., Laval J. Homogeneous Escherichia coli FPG protein. A DNA glycosylase which excises imidazole ring-opened purines and nicks DNA at apurinic/apyrimidinic sites. J. Biol Chem. (1990) 265,3916-3922.

20. Boiteux S., O'Connor T.R., Laval J. Formamidopyrimidine-DNA glycosylase of Escherichia coli: cloning and sequencing of the fpg structural gene and overproduction of the protein. EMBOJ. (1987) 6, 3177-3183.

21. Mikawa T., Kato R., Sugahara M., Kuramitsu S. Thermostable repair enzyme for oxidative DNA damage from extremely thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8. Nucleic Acids Res. (1998) 26, 903-910.

22. Fromme J.C., Verdine G.L. Structural insights into lesion recognition and repair by the bacterial 8-oxoguanine DNA glycosylase MutM. Nature Struct. Biol. (2002) 9, 544-552.

23. Serre, L., Jesus P.K., Boiteux S., Zelwer C., Castaing B. Crystal structure of the Lactococcus lactis formamidopyrimidine-DNA glycosylase bound to an abasic site analogue-containing DNA. EMBOJ. (2002) 21, 2854-2865.

24. Gilboa R., Zharkov D.O., Golan G., Fernandes A.S., Gerchman S.E., Maty E., Kycia J.H., GroIIman A.P., Shoham G. Structure of a formamidopyrimidine DNA glycosylase-DNA complex. J. Biol. Chem. (2002) 277,19811-19816.

25. Fromme J.C., Verdine G.L. DNA lesion recognition by the bacterial repair enzyme MutM. J. Biol. Chem. (2003) 278, 51543-51548.

26. Hazra T.K, Kow Y.W., Hatahet Z., ImhoffB., Boldogh I., Mokkapati S.K., Mitra S., Izumi T. Identification and characterization of a novel human DNA glycosylase for repair of cytosine-derived lesions. J. Biol. Chem. (2002) 111, 30417-30420.

27. O'Connor T.R., Graves R.J., Murcia G., Castaing B., Laval J. Fpg protein of Escherichia coli is a zinc finger protein whose cysteine residues have a structural and/or functional role. J. Biol. Chem. (1993) 268, 9063-9070.

28. Tchou J., Michaels M.L., Miller J.H., Grollman A.P. Function of the zinc finger in Escherichia coli Fpg protein. J. Biol. Chem. (1993) 268,26738-26744.

29. Karakaya A., Jaruga P., Bohr V.A., Grollman A.P., Dizdaroglu M. Kinetics of excision of purine lesions from DNA by Escherichia coli Fpg protein. Nucleic Acids Res. (1997) 25, 474-479.

30. Leipold M.D., Muller J.G., Burrows C.J., David S.S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry (2000) 48,14984-14992.

31. Tchou J., Bodepudi V., Shibutani S., Antosheckin I., Millrer J., Grollman A.P., Johnson F. Substrate specificity of Fpg protein. Recognition and cleavage of oxidatively damaged DNA. J. Biol. Chem. (1994) 269, 15318-15324.

32. Rabow L.E., Kow Y.W. Mechanism of action of base release by Escherichia coli Fpg protein: role of lysine 155 in catalysis. Biochemistry (1997) 36,5084-5096.

33. Speina E., Ciesla J.M., Wöjcik J., Bajek M., Kusmierek J.T., Tudek B. The pyrimidine ring-opened derivative of 1 ,A^-ethenoadenine is excised from DNA by the Escherichia coli Fpg and Nth proteins. J. Biol. Chem. (2001)276,21821-21827.

34. Tretyakova N.Y., Wishnok J.S., Tannenbaum S.R. Peroxynitrite-induced secondary oxidative lesions at guanine nucleobases: chemical stability and recognition by the Fpg DNA repair enzyme. Chem. Res. Toxicol. (2000) 13,658-664.

35. Duarte V., Gasparutto D., Jaquinod M., Cadet J. In vitro DNA synthesis opposite oxazolone and repair of this DNA damage using modified oligonucleotides. Nucleic Acids Res. (2000) 28, 1555-1563.

36. Duarte V., Gasparutto D., Jaquinod M., Ravanat J.-L., Cadet J. Repair and mutagenic potential of oxaluric acid, a major product of singlet oxygen-mediated oxidation of 8-oxo-7,8-dihydroguanine. Chem. Res. Toxicol. (2001) 14,46-53.

37. Li Q., Laval J., Ludlum D.B. Fpg protein releases a ring-opened N-l guanine adduct from DNA that has been modified by sulfur mustard. Carcinogenesis (1997) 18, 1035-1038.

38. Coste F., Ober M., Carell T., Boiteux S., Zelwer C. Structural basis for the recognition of the FapydG lesion (2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine)by formamidopyrimidine-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. (2004) 279, 4407444083.

39. Chetsanga C.J., Frenette,G.P. Excision of aflatoxin B1-imidazole ring opened guanine adducts from DNA by formamidopyrimidine-DNA glycosylase. Carcinogenesis (1983) 4, 997-1000.

40. Boiteux S., Bichara M., Fuchs R.P.P., Laval J. Excision of the imidazole ring-opened form of iV-2-aminofluorene-C(8)-guanine adduct in poly(dG-dC) by Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase. Carcinogenesis (1989) 10,1905-1909.

41. Purmal A.A., Lampman G.W., Bond J.P., Hatahet Z., Wallace S.S. Enzymatic processing of uracil glycol, a major oxidative product of DNA cytosine. J. Biol. Chem. (1998)273,10026-10035.

42. Gasparutto D., Ait-Abbas M.,. Jaquinod M, Boiteux S., Cadet J. Repair and coding properties of 5-hydroxy-5-methylhydantoin nucleosides inserted into DNA oligomers. Chem. Res. Toxicol (2000) 13,575-584.

43. Zhang Q.M., Miyabe I., Matsumoto Y., Kino K., Sugiyama H., Yonei S. Identification of repair enzymes for 5-formyluracil in DNA. Nth, Nei, and MutM proteins of Escherichia coli. J. Biol. Chem. (2000) 275, 35471-35477.

44. Jurado J., Saparbaev M., Matray T.J., Greenberg M.M., Laval J. The ring fragmentation product of thymidine C5-hydrate when present in DNA is repaired by the Escherichia coli Fpg and Nth proteins. Biochemistry (1998) 37, 7757-7763.

45. Purmal A.A., Rabow L.E., Lampman G.W., Cunningham R.P., Kow Y.W. A common mechanism of action for the iV-glycosylase activity of DNA N-glycosylase/AP lyases from E. coli and T4. Mutat. Res. (1996) 364,193-207.

46. Laval J., Jurado J., Saparbaev M., Sidorkina 0. Antimutagenic role of base-excision repair enzymes upon free radical-induced DNA damage. Mut at. Res. (1998) 402, 93102.

47. David S.S., Williams S.D. Chemistry of glycosylases and endonucleases involved in base-excision repair. Chem. Rev. (1998) 98,1221-1261.

48. Castaing B., Fourrey J.-L., Hervouet N., Thomas M., Boiteux S., Zelwer C. AP site structural determinants for Fpg specific recognition. Nucleic Acid Res. (1999) 27, 608-615.

49. Castaing B., Boiteux S., Zelwer C. DNA containing a chemically reduced apurinic site is a high affinity ligand for the E. coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. (1992) 20, 389-394.

50. Baily V., Verly W.G., O'Connor T.R., Laval J. Mechanism of DNA strand nicking at apurinic/apyrimidinic sites by Escherichia coli formamidopyrimidine.DNA glycosylase. Biochem. J. (1989) 262, 581-589.

51. Seeberg E., Eide L., Bjoras M. The base excision repair pathway. TIBS. (1995) 20, 391-397.

52. Graves R.J., Felzenszwalb I., Laval J., O'Connor T.R. Excision of 5'-terminal deoxyribose phosphate from damaged DNA is catalyzed by the Fpg protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. (1992) 267,14429-14435.

53. Tchou J., Grollman A.P. The catalytic mechanism of Fpg protein. Evidence for a Schiff base intermediate and amino terminus localization of the catalytic site. J. Biol. Chem. (1995) 270,11671-11677.

54. Sidorkina O.M., Laval J. Role of lysine-57 in the catalytic activities of Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase (Fpg protein). Nucleic Acids Res. (1998) 26, 5351-5357.

55. Zharkov D.O., Shoham G., Grollman A.P. Structural characterization of the Fpg family of DNA glycosylases. DNA repair (2003) 2, 839-862.

56. Bruner S.D., Norman D.P.G., Verdine G.L. Structural basis for recognition and repair of the endogenous mutagen 8-oxoguanine in DNA. Nature (2000) 403, 859866.

57. Fedorova O.S., Nevinsky G.A., Koval V.V., Ishchenko A.A., Vasilenko N.L., Douglas K.T. Stopped-flow kinetic studies of the interaction between Escherichia coli Fpg protein and DNA substrates. Biochemistry (2002) 41,1520-1528.

58. Buchko G.W., Wallace S.S., Kennedy M.A. Base excision repair: NMR backbone assignments of Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase. J. Biomol. NMR (2002) 22, 301-302.

59. Zaika E.I., Perlow R.A., Matz E., Broyde S., Gilboa R., Grollman A.P., Zharkov D.O. Substrate discrimination by formamidopyrimidine-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. (2004) 279, 4849-4861.

60. Amara P., Serre L., Castaing B., Thomas A. Insights into the DNA repair process by the formamidopyrimidine-DNA glycosylase investigated by molecular dynamics. Protein Science (2004) 13, 2009-2021.

61. Lavrukhin O.V., Lloyd R.S. Involvement of phylogenetically conserved acidic amino acid residues in catalysis by an oxidative DNA damage enzyme formamidopyrimidine glycosylase. Biochemistry (2000) 39, 15266-15271.

62. Plum G.E., Grollman A.P., Johnson F., Breslauer K.J. Influence of the oxidatively damaged adduct 8-oxodeoxyguanosine on the conformation, energetics, and thermodynamic stability of a DNA duplex. Biochemistry (1995) 34,16148-16160.

63. Lipscomb L.A., Peek M.E., Morningstar M.L., Verghis S.M., Miller E.M., Rich A., Essigmann J.M., Williams L.D. X-ray structure of a DNA decamer containing 7,8-dihydro-8-oxoguanine. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1995) 92, 719-723.

64. Oda Y., Uesugi S., Ikehara M., Nishimura S., Kawase Y., Ishikawa H., Inoue H., Ohtsuka E. NMR studies of a DNA containing 8-hydroxydeoxyguanosine. Nucleic Acids Res. (1991)19,1407-1412.

65. Rosenquist T.A., Zharkov D.O., Grollman A.P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A. (1997) 94, 7429-7434.

66. Murphy T.M., George A. A comparison of two DNA base excision repair glycosylases from Arabidopsis thaliana. BBRC (2005) 329, 869-872.

67. Dany A.L., Tissier A. A functional Oggl homolog from Arabidopsis thalidna. Mol. Genet. Genom. (2001)265,293-301.

68. Garcia-Ortiz M.V., Ariza R., Roldan-Arjona T. An Oggl ortholog encoding a functional 8-oxoguanine DNA glycosylase/lyase in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. (2001) 47, 795-804.

69. Lu R., Nash H.M., Verdine G.L. A mammalian DNA repair enzyme that excises oxidatively damaged guanines maps to a locus frequently lost in lung cancer. Curr. Biol. (1997) 7, 397-407.

70. Radicella J.P., Dherin C., Desmaze C., Fox M.S., Boiteux S. Cloning and characterization of hOGGl, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997) 94, 8010-8015.

71. Arai K., Morishita K., Shinmura K., Kohno T., Kim R.-S., Nohmi T., Taniwaki M., Ohwada S., Yokota J. Cloning of a human homolog of the yeast OGG1 gene that is involved in the repair of oxidative DNA damage. Oncogene (1997) 14,2857-2861.

72. Boiteux S., Radicella J.P. The human OGG1 gene: structure, functions and its implication in the process of carcinogenesis. Arch. Biochem. Biophys. (2000) 377,18.

73. Scharer O.D., Jiricny J. Recent progress in the biology, chemistry and structural biology of DNA glycosylases. BioEssays (2001) 23,270-281.

74. Nash H.M., Lu R., Lane W.S., Verdine G.L. The critical active-site amine of the human 8-oxoguanine DNA glycosylase, hOggl: direct identification, ablation and chemical reconstitution. Chem. Biol. (1997) 4, 693-702.

75. Girard P.M., Guibourt N., Boiteux S. The Oggl protein of Saccharomyces cerevisiae: a 7,8-dihydro-8-oxoguanine DNA glycosylase/AP lyase whose lysine 241 is a critical residue for catalytic activity. Nucleic Acids Res. (1997) 25, 32043211.

76. Norman D.P.G., Bruner S.D., Verdine G.L. Coupling of substrate recognition and catalysis by a human base-excision DNA repair protein. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123, 359-360.

77. Fromme J.C., Bruner S.D., Yang W., Karplus M., Verdine G.L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat. Struct. Biol. (2003) 10, 204-211.

78. Bjoras M., Seeberg E., Luna L., Pearl L.H., Barrett T.E. Reciprocal "flipping" underlies substrate recognition and catalytic activation by the human 8-oxo-guanine DNA glycosylase. J. Mol. Biol. (2002) 317,171-177.

79. Zharkov D.O., Rosenquist T.A., Gerchman S.E., Grollman A.P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. (2000) 275, 28607-28617.

80. Girard P.M., D'Ham C., Cadet J., Boiteux S. Opposite basedependent excision of 7,8-dihydro-8-oxoadenine by the Oggl protein of Saccharomyces cerevisiae. Carcinogenesis (1998) 19,1299-1305.

81. Shinmura K., Kasai H., Sasaki A., Sugimura H., Yokota J. 8-Hydroxyguanine (7,8-dihydro-8-oxoguanine) DNA glycosylase and AP lyase activities of hOGGl protein and their substrate specificity. Mutat. Res. (1997) 385, 75-82.

82. Bjoras M., Luna L., Johnsen B., Hoff E., Haug T., Rognes T., Seeberg E. Opposite base-dependent reactions of a human base excision repair enzyme on DNA containing 7,8-dihydro-8-oxoguanine and abasic sites. EMBO J. (1997) 16, 63146322.

83. Hazra T.K., Izumi T., Maidt L., Floyd R.A., Mitra S. The presence of two distinct 8-oxoguanine repair enzymes in human cells: their potential complementary roles in preventing mutation. Nucleic Acids Res. (1998) 26, 5116-5122.

84. Sandigursky M., Yacoub A., Kelly M.R., Xu Y., Franklin W.A., Deutsch W.A. The yeast 8-oxoguanine DNA glycosylase (Oggl) contains a DNA deoxyribophosphodiesterase (dRpase) activity. Nucleic Acids Res. (1997) 25, 45574561.

85. Bruner S.D., Nash H.M., Lane W.S., Verdine G.L. Repair of oxidatively damaged guanine in Saccharomyces cerevisiae by an alternative pathway. Curr. Biol. (1998) 8, 393-403.

86. Scott A.D., Neishabury M., Jones D.H., Reed S.H., Boiteux S., Waters R. Spontaneous mutation, oxidative DNA damage and the roles of base and nucleotide excision repair in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast (1999) 15, 205-218.

87. Norman D.P.G., Chung S.J., Verdine G.L. Structural and Biochemical exploration of a critical amino acid in human 8-oxoguanine glycosylase. Biochemistry (2003) 42, 1564-1572.

88. Verdine G.L., Bruner S.D. How do DNA repair proteins locate damaged bases in the genome? Chem. Biol. (1997) 4, 329-334.

89. Banerjee A., Yang W., Karplus M., Verdine G. Structure of a repair enzyme interrogating undamaged DNA elucidates recognition of damaged DNA. Nature (2005) 434,612-618.

90. Blainey P.C., van Oijen A.M., Banerjee A., Verdine G.L., Xie X.S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. Proc. Natl Acad. Sei. U. S. A. (2006) 103,5752-5757.

91. Bulychev N.V., Varaprasad C.V., Dorman G., Miller J.H., Eisenberg M., Grollman A.P., Johnson F. Substrate specificity of Escherichia coli MutY protein. Biochemistry (1996) 35,13147-13156.

92. Zhang Q.-M., Ishikawa N., Nakahara T., Yonei S. Escherichia coli MutY protein has a guanine-DNA glycosylase that acts on 7,8-dihydro-8-oxoguanine:guanine mispair to prevent spontaneous G:C->C:G transversions. Nucleic Acids Res. (1998) 26, 4669-4675.

93. Guan Y, Manuel R.C., Arvai A.S., Parikh S.S., Mol S.D., Miller J.H., Lloyd R.S., Tainer J.A. MutY catalytic core, mutant and bound adenine structures define specificity for DNA repair enzyme superfamily. Nature Struct. Biol. (1998) 5, 10581064.

94. Noll D.M., Gogos A., Granek J.A., Clarke N.D. The C-terminal domain of the adenine-DNA glycosylase MutY confers specificity for 8-oxoguanine-adenine mispairs and may have evolved from MutT, an 8-oxo-dGTPase. Biochemistry (1999) 38, 6374-6379.

95. Volk, D.E., House P.G., Thiviyanathan V., Luxon B.A., Zhang S, Lloyd R.S., gorenstein D.G. Structural similarities between MutT and the C-terminal domain of MutY. Biochemistry (2000) 39, 7331-7336.

96. Fromme J.C., Banerjee A., Huang S.J., Verdine G.L. Structural basis for removal of adenine mispaired with 8-oxoguanine by MutY adenine DNA glycosylase. Nature (2004) 427, 652-656.

97. Porello S.L., Leyes A.E., David S.S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry (1998) 37,14756-14764.

98. Lu A.L., Tsai-Wu J.-J., Cillo J. DNA determinants and substrate specificities of Escherichia coli MutY. J. Biol. Chem. (1995) 270, 23582-23588.

99. Manuel R.C., Lloyd R.S. Cloning, overexpression, and biochemical characterization of the catalytic domain of MutY. Biochemistry (1997) 36,11140-11152.

100. Porello S.L., Williams S.D., Kuhn H., Michaels M.L., David S.S. Specific recognition of substrate analogs by the DNA mismatch repair enzyme MutY. J. Am. Chem. Soc. (1996) 118,10684-10692.

101. Kamiya H., Kasai H. 2-Hydroxyadenine in DNA is a very poor substrate of the Escherichia coli MutY protein. J. Radiat. Res. (2000) 41, 349-354.

102. Williams S.D., David S.S. Evidence that MutY is a monofunctional glycosylase capable of forming a covalent Schiff base intermediate with substrate DNA. Nucleic Acids Res. (1998)26, 5123-5133.

103. Dodson M.L., Michaels M.L., Lloyd R.S. Unified catalytic mechanism for DNA glycosylases. J. Biol. Chem. (1994) 269, 32709-32712.

104. Manuel R.C., Hitomi K., Arvai A.S., House P.G., Kurtz A.J., Dodson M.L., McCullough A.K., Tainer J.A., Lloyd R.S. Reaction intermediates in the catalytic mechanism of Escherichia coli MutY DNA glycosylase. J. Biol. Chem. (2004) 279, 46930^16939.

105. Tsai-Wu J., Liu H., Lu A. Escherichia coli MutY protein has both N-glycosylase and apurinic/apyrimidinic endonuclease activities on A-C and A-G mispairs. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1992) 89, 8779-8783.

106. Chepanoske C.L., Porello S.L., Fujiwara T., Sugiyama H., David S.S. Substrate recognition by Escherichia coli MutY using substrate analogs. Nucleic Acids Res. (1999)27,3197-3204.

107. McAuley-Hecht K.E., Leonard G.A., Gibson N.J., Thomson J.B., Watson W.P., Hunter W.N., Brown T. Crystal structure of a DNA duplex containing 8-hydroxydeoxyguanine-adenine base pairs. Biochemistry (1994) 33,10266-10270.

108. Bernards A.S., Miller J.K., Bao K.K., Wong I. Flipping duplex DNA inside out: a double base-flipping reaction mechanism by Escherichia coli MutY adenine glycosylase. J. Biol. Chem. (2002) 277,20960-20964.

109. McGoldrick J.P., Yeh Y.C., Solomon M., Essigmann J.M., Lu A.L. Characterization of a mammalian homolog of the Escherichia coli MutY mismatch repair protein. Mol. Cell Biol. (1995) 15, 989-996.

110. Ushijima Y., Tominaga Y., Miura T., Tsuchimoto D., Sakumi K., Nakabeppu Y. Afunctional analysis of the DNA glycosylase activity of mouse MUTYH protein excising 2-hydroxyadenine opposite guanine in DNA. Nucleic Acids Res. (2005) 33, 672-682.

111. Bessman M.J., Bullions L.C., Bhatnagar S.K., Braden B.C., Love W.E. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies on the mutT nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase of Escherichia coli. J. Biol. Chem. (1991) 266, 9055-9056.

112. Akiyama M., Horiuchi T., Sekiguchi M. Molecular cloning and nucleotide sequence of the mutT mutator of Escherichia coli that cause A:T to C:G transversion. Mol. Gen. Genet. (1987)206, 9-16.

113. Abeygunawardana C., Weber D.J., Gittis A.G., Frick D.N., Lin J., Miller A.-F., Bessman M.J., Mildvan A.S. Solution structure of the MutT enzyme, a nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase. Biochemistry (1995) 34,14997-15005.

114. Nakamura T., Doi T., Sekiguchi M., Yamagata Y. Crystallization and preliminary X-ray analysis of Escherichia coli MutT in binary and ternary complex forms. Acta Cryst. (2004) D60,1641-1643.

115. Lin J., Abeygunawardana C., Frick D.N., Bessman M.J., Mildvan A.S. Solution structure of the quaternary MutTM2+- AMPCPP-M2+ complex and mechanism of its pyrophosphohydrolase action. Biochemistry (1997) 36,1199-1211.

116. Massiah M.A., Saraswat V., Azurmendi H.F., Mildvan A.S. Solution structure and NH exchange studies of the MutT pyrophosphohydrolase complexed with Mg2+ and 8-Oxo-dGMP, a tightly bound product. Biochemistry (2003) 42,10140-10154.

117. Frick D.N., Weber D.J., Gillespie J.R., Bessman M.J., Mildvan A.S. Dual divalent cation requirement of the MutT dGTPase. J. Biol. Chem. (1994)269, 1794-1803.

118. Taddei F., Hayakawa H., Bouton M., Cirinesi A., Matic I., Sekiguchi M., Radman M. Counteraction by MutT protein of transcriptional errors caused by oxidative damage. Science (1997) 278,128-130.

119. Ito R., Hayakawa H., Sekiguchi M., Ishibashi T. Multiple enzyme activities of Escherichia coli MutT protein for sanitization of DNA and RNA precursor pools. Biochemistry (2005) 44, 6670-6674.

120. Weber D.J., Bhatnagar S.K., Bullions L.C., Bessman M.J., Mildvan A.S. NMR and isotopic exchange studies of the site of bond cleavage in the MutT reaction. J. Biol. Chem. (1992) 267,16939-16942.

121. Saraswat V., Massiah M.A., Lopez G., Amzel L.M., Mildvan A.S. Interactions of the products 8-oxo-dGMP, dGMP, and pyrophosphate with the MutT nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase. Biochemistry (2002) 41,15566-15577.

122. Xia Z., Azurmendi H.F., Mildvan A.S. Transient state kinetic studies of the MutT-catalyzed nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase reaction. Biochemistry (2005) 44,15334-15344.

123. Kamath A.V., Yanofsky C. Sequence and characterization of mutT from Proteus vulgaris. Gene (1993) 134, 99-102.

124. Kakuma T., Nishida J., Tsuzuki T., Sekiguchi M. Mouse MTH1 protein with 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphatase activity that prevents transversion mutation. cDNA cloning and tissue distribution. J. Biol. Chem. (1995) 270, 2594225948.

125. Sakumi K., Furuichi M., Tsuzuki T., Kakuma T., Kawabata S., Maki H., Sekiguchi M. Cloning and expression of cDNA for a human enzyme that hydrolyzes 8-oxodGTP, a mutagenic substrate for DNA synthesis. J. Biol. Chem. (1993) 268, 2352423530.

126. Nakabeppu Y. Molecular genetics and structural biology of human MutT homolog, MTH1. Mutat. Res. (2001) 477, 59-70.

127. Hayakawa H., Taketomi A., Sakumi K., Kuwano M., Sekiguchi M. Generation and elimination of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate, a mutagenic substrate for DNA synthesis, in human cells. Biochemistry (1995) 34, 89-95.

128. Mclennan A.G. The mutT motif family of nucleotide phosphohydrolases in man and human pathogens, Int. J. Mol. Med. (1999) 4, 79-89.

129. Sakai Y., Furuichi M., Takahashi M., Mishima M., Iwai S., Shirakawa M., Nakabeppu Y. A molecular basis for the selective recognition of 2-hydroxy-dATP and 8-oxo-dGTP by human MTH1. J. Biol. Chem. (2002) 277, 8579-8587.

130. Fujii Y., Shimokawa H., Sekiguchi M., Nakabeppu Y. Functional significance of the conserved residues for the 23-residue module among MTH1 and MutT family proteins. J. Biol. Chem. (1999)274,38251-38259.

131. Mo J.-Y., Maki H., Sekiguchi M. Hydrolytic elimination of a mutagenic nucleotide, 8-oxodGTP, by human 18-kilodalton protein: Sanitization of nucleotide pool. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89,11021-11025.

132. Hayakawa H., Hofer A., Thelander L., Kitajima S., Cai Y., Oshiro S., Yakushiji H., Nakabeppu Y., Kuwano M., Sekiguchi M. Metabolic fate of oxidized guanine ribonucleotides in mammalian cells. Biochemistry (1999) 38, 3610-3614.

133. Ishibashi T., Hayakawa H., Ito R., Miyazawa M., Yamagata Y., Sekiguchi M. Mammalian enzymes for preventing transcriptional errors caused by oxidative damage. Nucleic Acids Res. (2005) 33, 3779-3784.

134. Cai J.P., Ishibashi T., Takagi Y., Hayakawa H., Sekiguchi M. Mouse MTH2 protein which prevents mutations caused by 8-oxoguanine nucleotides. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2003)305,1073-1077.

135. Sekiguchi M. MutT-related error avoidance mechanism for DNA synthesis. Genes Cells (1996) 1,139-145.

136. Ishibashi T., Hayakawa H., Sekiguchi M. A novel mechanism for preventing mutations caused by oxidation of guanine nucleotides. EMBO reports (2003) 4, 479483.

137. Fujikawa K., Kamiya H., Yakushiji H., Fujii Y., Nakabeppu Y., Kasai H. The oxidized forms of dATP are substrates for the human MutT homologue, the hMTHl protein. J. Biol. Chem. (1999) 274,18201-18205.

138. Fujikawa K., Kamiya H., Yakushiji H., Nakabeppu Y., Kasai H. Human MTH1 protein hydrolyzes the oxidized ribonucleotide, 2-hydroxy-ATP. Nucleic Acids Res. (2001)29, 449-454.

139. Yoshimura D., Sakumi K., Ohno M., Sakai Y., Furuichi M., Iwai S., Nakabeppu Y. An oxidized purine nucleoside triphosphatase, MTH1, suppresses cell death caused by oxidative stress. J. Biol. Chem. (2003) 278, 37965-37973.

140. Boiteux S., Gellon L., Guibourt N. Repair of 8-oxoguanine in Saccharomyces cerevisiae: interplay of DNA repair and replication mechanisms. Free Radic. Biol. Med. (2002) 32, 1244-1253.

141. Ishchenko A.A., Yang X., Ramotar D., Saparbaev M. The 3'->5' exonuclease of Apnl provides an alternative pathway to repair 7,8-dihydro-8-oxodeoxyguanosine in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol (2005) 25, 6380-6390.

142. Ames B.N., Gold L.S., Willett W.C. The causes and prevention of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1995) 92, 5258-5265.

143. Kasai H., Nishimura S. Oxidative stress: Oxidants and Antioxidants. (1991) 4, 99116.

144. Richter С., Park J.-W., Ames B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNAis extensive. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 6465-6467.

145. Olinski R., Gackowski D., Rozalski R., Foksinski M., Bialkowski K. Oxidative DNA damage in cancer patients: a cause or a consequence of the disease development? Mutat. Res. (2003) 531,177-190.

146. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature (1993) 362,709-715.

147. Gedik C.M., Boyle S.P., Wood S.G., Vaughan N.J., Collins A.R. Oxidative stress in humans: validation of biomarkers of DNA damage. Carcinogenesis (2002) 23,14411446.

148. Hollstein M., Shomer В., Greenblatt M., Soussi Т., Hovig E., Montesano R., Harris C.C. Somatic point mutations in the p53 gene of human tumors and cell lines: updated compilation. Nucleic Acids Res. (1996) 24, 141-146.

149. Kamiya H., Miura K., Ishikawa H., Inoue H., Nishimura S., Ohtsuka E. c-Ha-ras containing 8-hydroxyguanine at codon 12 induces point mutations at the modified and adjacent positions. Cancer Res. (1992)52, 3483-3485.

150. Beckman K.B. Ames B.N. The free radical theory of aging matures. Physiol. Rev. (1998) 78, 547-581.

151. Кузнецова СЛ., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. IX. Направленное введение замещенных пирофосфатных связей в структуру ДНК. Биоорг. химия. (1990) 16,219-225.

152. Shabarova Z.A. Design and applications of single and double stranded DNA analogs. Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1991) 24, 99-102.

153. Ищенко A.A., Булычев H.B., Жарков Д.О., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Выделение 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы из Escherichia coli и исследование субстратной специфичности фермента Мол. биология. (1997) 31,332-337.

154. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72,248-254.

155. Castaing В., Geiger A., Seliger H., Nehls P., Laval J., Zelwer C., Boiteux S. Cleavage and binding of a DNA fragment containing a single 8-oxoguanine by wild type and mutant Fpg proteins. Nucleic Acids Res. (1993) 21, 2899-2905.

156. Sheflyan G.Y., Kubareva Е.А., Volkov Е.М., Oretskaya T.S., Gromova E.S., Shabarova Z.A. Chemical cross-linking of Mval and EcoRII enzymes to DNA duplexes containing monosubstituted pyrophosphate internucleotide bond, Gene (1995) 157, 187-190.

157. Sheflyan G., Kubareva E.A., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya II, Gromova E.S., Shabarova Z.A. Cross-linking of SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. FEBS Lett. (1996) 390, 307-310.

158. Kozlov I.A., Kubareva Е.А., Ivanovskaya M.G., Shabarova Z.A. Design of new reagents on the base of DNA duplexes for irreversible inhibition of transcription factor NF-kappa p. Antisense and Nucleic Acids Drug. Dev. (1997) 7, 279-289.

159. Kubareva E.A., Fedorova O.A., Gottikh M.B., Tanaka H., Malvy C., Shabarova Z.A. NF-kappa P p50 subunit cross-linking to DNA duplexes, containing a monosubstituted pyrophosphate internucleotide bond. FEBS Lett. (1996) 381, 35-38.

160. Каневский И.Э., Кузнецова С.А., Волков Е.М., Шабарова З.А. Синтез и свойства ковалентно связанных ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатную группировку между комплементарными цепями. Мол. биология. (1996) 30,1144-1157.

161. Шабарова З.А. Химия нуклеиновых кислот. Мир, Москва (1994) 133-135.

162. Долинная Н.Г., Пурмаль А.А., Друца B.JL, Шабарова З.А. Синтез и свойства конкатемерных ДНК-дуплексов с модифицированными межнуклеотидными связями. Вестн. Моск. Унт. Сер. 2:Хим. (1986) 27, 520-524.

163. Bakowies D., Thiel W. Hybrid models for combined quantum mechanical and molecular mechanical approaches. J. Phys. Chem. (1996) 100,10580-10594.

164. Wing R., Drew H., Takano Т., Broka C., Tanaka S., Itakura K., Dickerson R.E. Crystal structure analysis of a complete turn of B-DNA. Nature (1980) 287, 755758.

165. Shui X., Mcfail-Isom L., Hu G.G., Williams L.D. The B-DNA dodecamer at high resolution reveals a spine of water on sodium. Biochemistry (1998) 37, 8341-8355.

166. Young M.A., Ravishanker G., Beveridge D.L. A 5-nanosecond molecular dynamics trajectory for B-DNA: analysis of structure, motions, and solvation. Biophys. J., (1997) 73,2313-2336.

167. McConnell K.L., Beveridge D.L. DNA structure: what's in charge? J. Mol. Biol. (2000) 304, 803-820.

168. Nerdal W., Hare D.R., Reid B.R. Solution structure of the ЕсоШ DNA sequence: refinement of NMR-derived distance geometry structures by NOESY spectrum back-calculations. Biochemistry (1989) 28,10008-10021.

169. Lane A.N., Jenkins T.C., Brown Т., Neidle S. Interaction of berenil with the ЕсоШ dodecamer d(CGCGAATTCGCG)2 in solution studied by NMR. Biochemistry (1991)30,1372-1385.

170. Wu Z., Delaglio F., Tjandra N., Zhurkin V.B., Bax A. Overall structure and sugar dynamics of a DNA dodecamer from homo- and heteronuclear dipolar couplings and 31P chemical shift anisotropy. J. Biomol. NMR. (2003) 26, 297-315.

171. Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. (1996) 14, 33-38.

172. Немухин A.B., Григоренко Б.Л., Грановский A.A. Молекулярное моделирование с использованием программы PC GAMES S: от двухатомных молекул до ферментов. Вестн. Моск. У нив. (2004) 45, 75.

173. Lavery R., Sklenar H. The definition of generalized helicoidal parameters and of axis curvature for irregular nucleic acids. J. Biomol. Struct. Dyn. (1988) 6, 63-91.

174. Reed A.E., Weinstock R.B., Weinhold F. Natural population analysis. J. Chem. Phys. (1985) 83,735-,

175. Thorogood H., Grasby J.A., Connolly B.A. Influence of the phosphate backbone on the recognition and hydrolysis of DNA by the EcoRN restriction endonuclease. J. Biol. Chem. (1996)271, 8855-8862.

176. Verdine V.L., Norman D.P.G. Covalent trapping of protein-DNA complexes. Annu. Rev. Biochem. (2003) 72, 337.

177. Ischenko A.A., Saparbaev M.K., Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage. Nature (2002) 415,183-187.

178. Kubareva E.A., Vasilenko N.L., Vorobjeva O.V., Volkov E.M., Oretskaya T.S., Korshunova G.A., Nevinsky G.A. Role of DNA definite structural elements in interaction with repair enzyme uracil-DNA glycosylase. Biochem. Mol. Biol. Int. (1998) 46, 597-606.

179. Speina E., Ciesla J.M., Graziewicz M.A., Laval J., Kazimierczuk Z., Tudek B. Inhibition of DNA repair glycosylases by base analogs and tryptophan pyrolysate, Trp-P-1, Acta Biochim. Pol. (2005) 52,167-178.

180. Wiederholt C.J., Delaney M.O., Greenberg M.M. Interaction of DNA containing Fapy-dA or its C-nucleoside analogues with base excision repair enzymes.1.plications for mutagenesis and enzyme inhibition. Biochemistry (2002) 41,1583815844.

181. Karplus M. Molecular Dynamics of Biological Macromolecules: A Brief History and Perspective. Biopolymers (2003) 68, 350-358.

182. Шефлян Г.Я., Кубарева E.A., Громова E.C. Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам. Успехи химии. (1996) 65, 765-781.

183. Каневский И.Э., Кузнецова С.А. Синтез реакционноспособных аналогов нуклеиновых кислот и их применение для изучения структуры и функций биополимеров. Успехи химии. (1998) 67, 688-704.

184. Зацепин Т.С., Долинная Н.Г., Кубарева Е.А., Ивановская М.Г., Метелев В.Г., Орецкая Т.С. Ковалентное связывание модифицированных НК к белкам как метод изучения специфических белково-нуклеиновых взаимодействий. Успехи химии. (2005) 74, 84-103.

185. Ищенко А.А., Булычев Н.В., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Взаимодействие 8-оксогуанини-ДНК-гликозилазы из Escherichia coli с одноцепочечными дезоксирибоолигонуклеотидами и их комплексами. Мол. биология. (1998)32, 549-558.

186. Zharkov D.O., Ishchenko A.A., Douglas К.Т., Nevinsky G.A. Recognition of damaged DNA by Escherichia coli Fpg protein: insights from structural and kinetic data. Mutat. Res. (2003) 531,141-156.

187. Невинский Г.А. Роль слабых специфических и неспецифических взаимодействий в узнавании и превращении ферментами поврежденных ДНК. Мол. биология (2004) 38, 756-785

188. Harris Т.К., Turner G.J. Structural basis of perturbed pKa values of catalytic groups in enzyme active sites. IUBMB Life (2002) 53, 85-98.

189. Johansen M.E., Muller J.G., Xu X., Burrows C.J. Oxidatively induced DNA-protein cross-linking between single-stranded binding protein and oligodeoxynucleotides containing 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine. Biochemistry (2005) 44, 56605671.

190. Нарышкин Н. Региоспецифическое ковалентное связывание РНК, содержащих активные группы, с регуляторными белками ВИЧ. Диссертация к.х.н. Москва (1996) 107-119.

191. Sidorkina О., Dizdaroglu М., Laval J. Effect of single mutations on the specificity of Escherichia coli FPG protein for excision of purine lesions from DNA damaged by free radicals. Free Radic. Biol. Med. (2001) 31, 816-823.

192. Sidorkina O.M., Laval J. Role of the N-terminal proline residue in the catalytic activities of the Escherichia coli Fpg protein. J. Biol. Chem. (2000) 275, 9924-9929.

193. Back, J. W., de Jong, L., Muijsers, A. O., and de Koster, C. G. Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry for Protein Structural Modeling. J. Mol. Biol. (2003) 331,303-313.

194. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (1970) 227, 680-685.

195. Kubareva E.A., Volkov E.M., Vinogradova N.L., Kanevsky I.A., Oretskaya T.S., Kuznetsova S.A., Brevnov M.G., Gromova E.S., Nevinsky G.A., Shabarova Z.A. Modified substrates as probes for studying uracil-DNA glycosylase. Gene. (1995) 157,167-171.

196. Glendening E.D., Badenhoop J.K., Reed A.E., Carpenter J.E., Bohmann J.A, Morales C.M., Weinhold F. NBO 5.0 Theoretical Chemistry Institute, University of Wisconsin, Madison (2001).