Катализ окисления дигидропридинов на углях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

?Г6 ОД

: ' АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИНШЕХИМИИ

На правах рукописи ШЩШЮ Ирина Николаевна КАТАЛИЗ ОМСЛЕШИ ДЙГИДРОШРИЩОВ НА УГЛЯХ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

, , ; Г- /"-Г-П

КИЕВ - 1993

Работа выполнена в отделе химии фотосинтеза Института Сиоорганической химии и нефтехимии Академии наук Украины

Научные руководители: член-кор. АН Украины, д. х. н.

А. А. Ясников кандидат химических наук

А. В. Уаиенко

Официальные оппоненты: д. х. н., профессор

К И. Станинец

д. х. н., профессор

Е А. Тёртых

Ведущая организация: Институт колоидной химии и химии воды

Академия наук Украины

Защита состоится "Л/" ¿¿¿СМ* 1993г. в ^ часов на заседании Специализированного Совета Д 016.65.01 в Институте биоорганической химии и нефтехимии АН Украины ( 252660, Киев, ул. Мурманская, 1 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии и нефтехимии АН Украины.

Автореферат разослан Съп^ЛЛ 1993г.

Учёный секретарь Специализированного Совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Никотинамидные коферменты ЙАД(Р)Ш)

мн,

о» он ¿н <к

Н (Ы А1>+) , РО(ОН)г(МАОР*)

являются основными переносчиками электронов и водорода в биологических окислительно-восстановительных процессах. В этих реакциях происходит обратимый перенос эквивалента гидрид-иона от восстановленного кофермента на подходящий акцептор или от донорного субстрата на окисленный коферменг, что сопровождается редокс-превра-цениями окисленного и восстановленного коферментов:

0м""-I

Я.

Два электрона и прогон могут переноситься в разной последовательности: е", Н+, е"; е~, Н'; 1Г, т.е. перенос может быть радикальным (первые два случая) или гидридным. Выяснение механизма этого переноса является одной из фундаментальных задач биооргани-?еской химии.

Исследования, входящие в диссертацию, выполнены в рамках пла-юв научных работ отдела химии фотосинтеза Института органической (имии АН Украины (до 1986 г.) и Института биоорганической химии и 1ефтехимии АН'Украины, а танке Общесоюзной научно-технической программы ПИТ 0.69.07 "Разработать и внедрить в практику методы и средства диагностики и коррекции нарушений внутренней среды орга-1изма" (Постановление ГКНТ СССР N Ь55 от 30.10.85).

Ц Н

[И'З

соы^

- г -

Цель работы. Изучение модельных окислительно-восстановительных реакций с участием никотинамидных коферментов, выяснение механизма переноса протона и электронов в этих реакциях. Дня решения этой задачи проведены исследования:

1. Окисление 1,4-дигидропиридинов на активных углях.

2. Разработка модели супероксиддисмутаэы с участием активных углей и макрогетероциклов.

3. Влияние активных углей на ферментативные реакции (на примере алкогольдегидрогеназы).

Научная новизна4. Впервые исследовано окисление 1,4-дигидропи-ридшов на активных углях, сопровождаемое окислением этанола. Акцепторной группировкой является положительно заряженная поверхность угля СИН или хинонная группа на поверхности угля АУА.

Показано, что металлокомплексы макрогетероциклов ингибируют эти реакции. На основе исследований предложена модель фермента -супероксиддисмутаэы, уничтожающая супероксид-радикалы, состоящая из активного угля СКН и макрогетероциклов.

Изучение алкогольдегидрогеназной реакции на активном угле позволило сделать заключение о том, что активные угли могут воздействовать на ферментативные реакции в живом организме.

Научно-практическая значимость. Исследование модельных реакций 1,4-дигидропиридинов на гетерогенных катализаторах раздвинуло рамки представлений о механизмах этих реакций.Кроме чисто теоретических достижений, некоторые результаты могут представить научно-практический интерес. В частности, активные угли могут быть использованы для биомиметических реакций 1,4-дигидропиридинов. В связи с воздействием углей на ферментативные реакции, открываются перспективы их использования совместно с дигидроникотинамидами для лечения различных заболеваний. Найденная модель супероксиддисмутаэы может найти применение в медицинской практике для устранения супероксид-радикалов, возникающих при различных патологиях.

Апробация работы. По результатам работы сделаны доклады на III и 1У Украинских конференциях по сорбентам медицинского назначения (Днепропетровск, 1985; Донецк, 1988), ХУ Украинской республиканской конференции по органической химии (Ужгород, 1986), УН Всесоюзном совещании "Комплексы с переносом заряда и ион-радикальные соли" (Черноголовка," 1988), ХУ Всесоюзном симпозиуме по ин-. женерной энзимологии (Вильнюс, 1988), III Всесоюзной конференции по химии и биохимии макроциклических соединений (Иваново, 1988).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 13 работ, в том числе 6 научных статей и 7 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ИЗ страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, включающих 5 таблиц и 29 рисунков, выводов и списка литературы, содержащего 121 наименование. Первая глава представляет собой литературный обзор по механизмам окисления 1,4-дигидроникотшамидов. Во второй главе изложены методы исследований. В 3-5 главах представлены результаты исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. ОКИСЛЕНИЕ 1,4-дигидропираднов НА УГЛЯХ СШ

1.1. Окисление Ц-бензил-1,4-дигидроникотинамида. Синтетические гемо- и энтеросорбенты широко используются в медицинской практике для лечения различных заболеваний. Наряду со способностью поглощать различные ксенобиотики, они могут катализировать различные окислительно-восстановительные реакции, а также иммобилизо-вывать ферменты. Обладая универсальными лечебными свойствами, углеродные сорбенты влияют на метаболические процессы в различных органах, в частности, активируют ряд ферментов энергетического обмен, в том числе дегидрогеназ, коферментами которых являются производные никотинамида.

Дня моделирования алкогольдегидрогеназной реакции нами научено окисление И-бензил-1,4-дигидроникотинамида (ВНАН) на энтеро-сорбентах типа СКН.

Скорость окисления ВЦ АН на угле подчиняется кинетическому уравнению первого порядка. Результаты измерений представлены в табл.1. По логарифмической зависимости начальных скоростей окисления ВНАН от навесок угля определен порядок реакции по углю: Л=0,5, что типично для гетерогенного каталитического радикально-цепного механизма.

Наблюдаемая (кажущаяся) энергия активации, рассчитанная по данным таблД, Е = 14 кДж/моль. Процесс окисления В* АН на угле не может контролироваться внешней диффузией, т.к. для нее энергия активации меньше 4-8 кДя/моль. Предположение о том, что низкое значение активации определяет диффузионный процесс, следует отвергнуть, т.к. для процессов, лимитированных внутренней диффузией, скорость реакции должна' быть пропорциональна навеске угля.

- 4 -

....... Таблица I.

Окисление ВЦ АН и этанола на активном угле СНН-К

[вшЗло3, Ш1-К, мг 1, °С к. Ю2, .:. Окислившийся

моль/л мин-* этанол, моль/л

_ 100 37 _ 0,37

0,5 100 37 6,70 1,77

■ 0,75 100 37 - 2,88

I 100 37 8,40 3,24

100 37 8,87 3,74

100 37 6,05 -

I 25 37 3,14 -

50 37 3,58 2,75

I 100 37 9,20 -

200 37 11,70 5,90

I 300 37 16,70 -

100 20 6,64 —

I 100 70 15,20 -

I 10 37 - 2,43

I 100 . 50 16,80 -

Примечания: 50 %-чыЯ этанол ( 8,7 моль/л); фосфатный буфер 0,05 моль/л, рН 7,55; общий объем 10 мл; газохроматографическое определение этанола проводилось через 48 ч после начала реакции; средняя квадратичная ошибка среднего арифметического * 5 %.

Вероятно, каталитический и адсорбционный процессы накладываются -друг на друга. Адсорбционные (поверхностные) процессы проявляются и в том,что скорость реакции увеличивается при измельчении угля и перемешивании. Большая отрицательная энтропия активации (йБ = = -253 Дк/моль.К), вероятно, означает, что на поверхности угля имеется небольшое количество активных центров.

Окисление ВНАН на угле сопровождается поглощением кислорода и окислением этанола, присутствующего в реакционной смеси в качестве растворителя или специально добавленного в раствор. Из рис.1 и табл.1 видно, что окисление этанола и скорость поглощения кислорода увеличиваются с повышением концентрации ВЦ АН. Скорость поглощения кислорода возрастает также с увеличением концентрации кислорода или навесок угля (данные не представлены).' 1Ьк, при взаимодействии на угле ЗЛО"7 моля ВНАН с 3 мл 50 %-ного этанола по-

глощается 3.10 моля кислорода. Р-ю",1 Па Моо

300

zoo

100

Рис.1. Кинетические кривые поглощения кислорода. 50 %-ный этанол; уголь 100 мг; общий объем 3 мл. ВЯАИ, моль/л: 1-0; 2 - 1,5. КГ5; 3 - 2,25. Ю"5; 4 - ЗЛО-5.

¡to so но но t; чип.

- Для более точного определения окислившегося спирта была проведена реакция s ацетснитриле (ацетонитрил 8 мл; фосфатный буфер в воде 0,1 моль/л, рН 7,17 - 8 мл; этанол-0,16 мл; уголь 500 мг; 37°С). При отом в присутствии BNAH (1.ПГ3 моль/л) окисляется 38 % спирта, а в его отсутствие - лишь 15 %. Рассчитано, что в присутствии 0,01 % (мол.) BNАН по отношению к этанолу окисление последнего увеличивается в 10 раз, а всего на один моль окислившегося В,S АН окисляется до 3.I03 моля этанола.

Продуктом окисления ВаАН является четвертичная соль ВЦА+, а этанол окисляется в ацетальдегид, образование которого доказано методом газо-жидкостной хроматографии и элементным анализом полу- • ченного 2,4-динитрофенилгидразона.

На скорость окисления ENАН влияют различные добавки. Реакцию ингибируют пара-динитробензол и другие нитросоединения, 2,5-диме-тилхинон, орто-нафтохинон, имидазол, ио!ш железа (III). Реакция ускоряется при УФ-облучении, а также в присутствии перекиси водорода, триптофана, триэтиламина. Специфически влияет ацетальдегид, добавка которого в начале реакции существенно ее ускоряет и не оказывает влияния при введении в развиютйся процесс. Ингибитор альдегиддегидрогеназы - тетраэтилтиурамдисульфид (антабус) не влияет на окисление дипидропиридина и этанола. Добавки иона в глициновом буфере приводят к тому, что наряду с четвертичной солью образуется продукт гидратации - И-бенэил-6-окси-1,4,5,6-тетрагидроникотинамид, поглощающий при 290 ни.

Широка известный активированный уголь - карболен такие ускоряет совместное окисление ВМАН и этанола.

Приведенные данные о влиянии добавок свидетельствуют о радикальном механизме окисления ВЦ АН.

Для выяснения вопроса о природе акцепторных группировок на по-' верхности угля изучено окисление ВИЛИ и этанола на различных сорбентах (табл.2).

Таблица 2

Окисление ВНАН и этанола на различных сорбентах

Марка сорбента СОЕ, мг- экв/г Фено-льные группы, мг-экв/г Размер мезо-пор, А0 Удельная поверхность, м2/г Поглощение о2, см3 Время поглощения, мин к,Ю2, мин-* Окисление этанола, %

СКН-2М 0,2 0 700-720 1000 1,2. Ю-1 60 3,28 18

CKH-aioK 1,5 0,4 700-720 1000 9,0.10~2 180 1,92 28

СКС-3 ОД 0 350 800 1,6.I0"1 200 2,60 24

CKG-3 ок 1,4 0,4 350 800 1,1. Ю-1 200 2,57 II

Примечания: Фосфатный буфер - 0,05 моль/л, рН 7,55; уголь - 100 кг; 37°С. Окисление BNAH и поглощение кислорода: ВН АН - 1,5. Ю-5 моль/л; 50 %-ный этанол; общий объем - 3 мл. Окисление этанола: BNAH -1.10"^ моль/л; 50 %-ный ацетонитрил в воде с.добавлением I % этанола; общий объем - 8 мл.

Из табл.2 видно, что поглощение кислорода и окисление ВИАН и этанола мало зависят от марки угля: окисленные и неокйсленные угли катализируют реакцию примерно одинаково! Это означает, что в катализе участвуют определенные, одинаковые для различных углей участки.

.1.2. Окисление 1.4-дигидроникотинамидоБ феррицианид-ионом на угле. Изучение реакции окисления ВЦ АН феррицианид-ионом на угле отвечает на вопрос о лимитирующей стадии реакции. Обычно окисление дигидроникотинамидов феррицианид-ионом протекает по уравнению:

- н н

0С0М, (ХЧг-СОЮНд . +

* ¿Ре(С<-- (Л ♦ 1НЫ)1 + Н

N ^М

I 1

* И

Эта реакция подчиняется кинетическому уравнению второго порядка (по ВШ и феррицианид-иону). Однако, окисление на угле имеет свою особенность: наблюдается только первый порядок (по ВйАЮ.т.е. скорость реакции не зависит от концентрации феррицианид-иона (табл. 3).

Таблица 3

Окисление ВНАН феррицканид-ионом на активном угле

[ВНАН]Х X 103 [Щ]'Ю3 Уголь, мг к.Ю2, -I мин [вш]х X 105 Уголь, мг *ло2, мин-*

моль/л моль/л

I _ 50 25 3,96 I 2 100 25 6,08

I I 50 25 3,57 I 4 100 25 6,67

I 2 50 25 3,78 0,5 2 100 25 6,66

I 4 50 25 3,57 2 2 100 25 7,34

0,5 2 50 25 3,59 I - 100 37 7,98

I 2 50 25 4,06 I 2 100 37 8,43

2 2 50 25 . 4,26 I - 200 37 14,00

I - 100 25 6,30 I 2 200 37 15,00

I I 100 25 5,77

Примечания: Фосфатный буфер - 0,05 моль/л, рН 7,5; 50 %-ный этанол; общий объем - 20 мл.

Помимо гетерогенно-каталитического окисления В*АН феррициа-нид-ионом на угле, имеют место окисление В*АН кислородом и ферри-цианид-иоком без участия, угля. Последняя реакция существенна при малых навесках угля.

Вторая важная особенность этой реакции - феррицианид-ион тормозит окисление этанола. В присутствии феррицианид-иона спирта окисляется на порядок меньше, чем без феррицианид-иона: соответственно 0,26 и 3,24 моля (концентрация, ноль/л: ИАН - 1.10-3, феррицианид - 2.10**^, этанол - 6,7; уголь - 100 мг; общий объем -10 мл; 37°С; 48 ч).

Специфическое действие оказывает феррицианид-ион и на окисление 1АДН на угле: без феррицианид-иона реакция идет крайне медленно и не до конца, а в присутствии феррнцианид-иона вначале ускоряется, а затем замедляется.

/

Независимость скорости окисления ВН АН на угле от концентрации феррицианид-иона предполагает, что лимитирующей стадией реакции является взаимодействие ВИАН с поверхностью угля, а не с молекулой феррицианид-иона. В случае ИДВД этот эффект не наблюдается, очевидно, вследствие меньшей реакционной способности КЛДН по сравнению с В*АН. Ингибирование окисления НДВД и зтанола феррицианид-ионом указывает на взаимодействие промежуточных радикальных частиц:

Ингибирование окисления НАДН избытком феррицианид-иона может быть связано со значительным повышением адсорбции феррицианид-иона.

1.3. Окисление эфира Ганча на угле СКН. Использование эфира Ганча (2,6-диметил-3,5-дикарбэтокси-1,4-дигидропиридин) на активных углях открывает возможности для биомиметических синтезов в кислых средах, в которых эфир Ганча, в отличие от других 1,4-дигид-ропирвдинов, не подвергается гидратации.

Эфир Ганча без углей не окисляется кислородом. Типичные условия опытов: эфир Ганча - (0,25 ♦ I). Ю-^ моль/л; ацетатный или фосфатный буфер - 0,05 моль/л (рН соответственно 3,55 и 7,50); уголь - 25 - 200 мг; общий объем - 10 мл; 37°С. Окисление эфира Ганча на угле протекает по уравнении:

Эта реакция подчиняется- кинетическому уравнению первого порядка. Значение константы'скорости, в зависимости от количества угля," находится в пределах 1.10"^ - 1.1СГ* мин"*. Окисление эфира Ганча ускоряется в присутствии перекиси бензоила (молярная доля 50 г 100 % по отношению .к дигидропиридину) в полтора раза. На скорость, окисления не влияют добавки феррицианид-иона (молярная доля 100 - 200 %). Добавки (молярная доля 10 - 20 Í по отношению к эфиру Ганча) орто-нафтохинона* 2,5-диметилхиноня, триптофана и

ИАЛН+ + о27 -- К+ о2

Ре(СЮ63- + 02т--ГеССПб4"

»ДН* + FeWHJe4-^^ NАДН +

Fe(CN)63"

+ о2

н н

н

дибенэо-18-крауна-6 замедляют окисление эфира Ганча соответственно в 2; 4; 2 и 1,3 раза.

При рассмотрении механизма окисления 1,4-дигэдрони1(о\.'штыи-дов необходимо ответить на вопроси о природе акцепторной группировки на поверхности угля и лкчмткрующей стадии реакция. Мснно било предположить, что первичной стадией реакции является перзнос электрона на карбонильную или хиноидную группировку' на поверхности сорбента. Однако, окисление ВЦАН и этанола не зависит от марки угля и степени его окисления (табл. 2). Вопрос о природе акцепторных групп решается, если исходить из электрохимических представлений о поверхности угля, поверхность которого при контакте с воздухом заряжается положительно:

Л

„ и,--_

о:

Общая схема окисления ВНАН на угле имеет вид:

И Н

сопи.

Ю' С«АНг

н н

сомн,

10

снгсьнг

-н*

- I I -А

СОШ+0' СНАНГ

Первая стадия реакции - перенос электрона на положительно заряженную поверхность угля и образование катион-радикала ВйАН* -является лимитирующей, поскольку скорость окисления ВНАН на угле не зависит от концентрации феррицианид-иона, на нее влияют тол" чо концентрация ВНАН и навески угля. Участие пиридиновых радикалов в процессе доказывается ингкбированием реакции хинонами, нитросо-• единениями и т.. д. и ускоряющим действием УФ-облучения, перекиси водорода.тризтилаыина и др. Триэтилашн, очевидно, способствует депротонированию катион-радикала ВЦ АН"'', а перекись' водорода - образованию сильного окислителя, например, гидроксильного радикала ОН*, аналогично реакции Хабера-ВаЯсса.

Н2°2 + °Z~ -02 + Ш" + НО-

Супероксид-радикал образуется не только на поверхности угля, но и при окислении пиридинильиого радикала:

BKA' + 02 -— ВНА+ + Ог~

Окисление этанола кислородом протекает по суммарному уравнению:

сн3сн2он + о2 —- сн3сно + н2о2

Исходя из окислительно-восстановительных потенциалов кислорода и ацетальдегида (соответственно -0,74 и -0,18 В при pH 7), супероксид-радикал не может быть окислителем этанола. Таким окислителем является, очевидно, протонированная форма супероксид-радикала Н02* (Е0 = +1,08 В). В цепном механизме окисления этанола возможно также участие супероксид-радикала и перекисных соединений.

1.4. Окисление BNАН на угле CKH в присутствии макрогетероцик-лов. Макрогетероциклы металлов (мономерные и полимерные фталоциа-нины кобальта и марганца, а также галогенсодержащий комплекс кобальта тридентатного строения), например,

снижают скорость окисления В*АН. Макрогетероциклы вносились в реакционную смесь в количестве I - 2 % по отношению к массе угля. Результаты расчетов констант скорости первого порядка (средняя квадратичная ошибка среднего арифметического не превшает 5 %) представлены в табл. 4.

- II -

• . - Таблица 4

Скорость окисления BN АН на угле С№ в присутствии макрогетероциклов

Макроге-тероцикл Окислитель C.I04, моль/л кЛО, мин"* Макроге-тероцикл Окислитель ело4, моль/л кЛО, мин"*

К МГЦ Масса, мг N МГЦ Масса, мг

I .

II

III

IV У

I I I

II 1У У

2 2 2 2 2

2 2 2 2 2 2

Н2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 «2°2 Н2°2 «2°2

Fe'

3+

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 4

1

2 4 I I I

I

I 2 Fe3+ I

Cu2+ 5

1 2 Cu2+ 5

_ Cu+ I

I 2 Cu+ I

— KgFe(CN)g 20

I I I%Fe(CN)6 20

I 2 %Fe(CN)6 20

I 4 %Fe(CN)6 20

II I °2 • 2,5

II 2 °2 2,5

II. . 4 - °2 2,5

1.47 1,13 1,28 1,28 1,32 1,40 2,57 1,65 1,81 1,93 1,60 1,69 1,69

1,63 1,29 2,79

1.48 1,31 1,15 1,47 1,10 0,98 0,75 1;44 1,25 1,13

III I fCjFefCN )g 20 1,31

III 2 f%Fe(CII)6 20 1,12

III 4 HgFe(CII)g 20 0,71

1У 2 KgFeiClDg 20 1,35

У 2 KgFe(СЯ 20 1,23

I I I I

II

II II

II

III III III

III

IV 1У 1У 1У

У У У

BN АН.

2 2 2 2 2

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Н2°2 Н2°2 Н2°2 «2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2

«2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 ¥>2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 Н2°2 »2°2 Н2а2

1

2 4

20

1

2 4

20

1

2 4

20

1

2 4

20

1

2 4

20

1

2 . 4

1,79 1,71 1,81 1,69 0,88 0,94 1,06 0,83 0,98

1,10 1,06 1,19 0,88 1,22 1,29 1,33 0,97 1,29 1,29 1,40 1,15 1,22 1,38

Примечания: Концентрация, моль/л: В*А новый буфер - 0,05: pH 7 50: 50 %-ный уголь - 5,1 г: 37°С; I..- МГЦ Со тридеитагашч х. лоцианян'бо; III - дихлоркооальтфталоцнанин; 1У У - мономерный фталоцианин Со

0,001; фосфатный.или глицк-_ этанол; общий объем - 10 мл; тридентатный; II - полимерный фта-*--------------- ™ , фталопианин Мп ;

Из анализа данных, представленных в табл. 4, вытекает, что макрогетероциклы в наибольшей степени замедляют окисление ВаАН кислородом, несколько меньше - перекисью водорода, ионами Сц?+ и в присутствии кислорода.Металлокомглексы макрогетероциклов (массовая доля 2-5 % по отношению к углю) также ингибируют окисление эфира Ганча кислородом (снижение скорости в 1,5-2 раза). Самая важная особенность макрогетероциклов в том, что они полностью выключают сопряженное с дегидрированием 1,4-дигидрого:ридинов окисление этанола.

Понижение скорости окисления БНАН происходит при сравнительно малых относительно угля добавках макрогетероциклов. Очевидно, эти соединения блокируют активную поверхность угля и затрудняют адсорбцию дигидропиридинов, вытесняя их с поверхности. Но более важно то, ВКАН и продеты его окисления не выключают окисление спирта, проходящее, очевидно, через супероксид-радикал. Отсюда следует, что макрогетероциклы совместно с углем функционируют подобно ферменту - супероксиддисмутаэе:

2 Оп

н Н

П\

ъ

[I и

I

я.

2 Н+

сомн*

сод

0.

2 + Н2°2

о.

? ¿н

ЙхОг

махрогеглеро-% чикл

,Саы по себе макрогетероцикл этими свойствами не обладает. Не проявляет свойств фермента и уголь, но совместно макрогетероцикл и уголь разлагают супероксид-радикалы подобно ферменту.

2. ОКИСЛЕНИЕ II -БЕНЗИЛ-1,4-ДИГВДРОНИКО'МШВДА НА АКТИВНОМ УГЛЕ АУА

Выбор угля АУА обусловлен его большей доступностью и дешевизной по сравнению с сорбентами типа СКН. Его получают из донецкого антрацита путем паро-газовой активации. Уголь АУА может быть

использован в качестве -энтеросорбента в медицине и ветеринарии.

Из логарифмических анаморфоз кинетических кривых расходования ВОЛН при различных начальных концентрациях ВКАН и навесках угля были определены кинетические порядки реакции: по ВИАН - первый, а по углю - дробный (п= 0,7). Значения констант скорости находятся в доверительном интервале (1,42 - 0,Н)Л0~* мин-*; средняя квадратичная ошибка среднего арифметического не превышает б %. Скорость окисления ВНАН не зависит от рН в интервале значений 5 - 9,2.

Продуктом окисления ВНАН является четвертичная соль ВЯА+. Однако, из анализа спектральных данных вытекает, что в каждый момент времени.ВИА+ образуется меньше, чем теоретически ожидается. Исходя из значений молярных экстинкций ВНАН 7300 (355 нм), 2200 (265 нм) и ВИА+ 4300 (265 нм), была рассчитана зависимость количества предположительно образуемого ВИА+ от предположительно расходуемого ВНАН (рис. 2).

Рис. 2.. Зависимость концентрации предположительно образуемого ВЦА+ от концентрации ВНАН.

50 $-ннй этанол; фосфат-0,1 моль/л, рН 7,45; уголь АУА - 100 мг; общий объем-16 мл. ВНАН, моль/л: 0LKT3; к 1,5.10"3; • 2. Ю-3. Прямая-зависимость теоретическая.

юо ШН.молУ.

Из рис. 2 видно, что в начальный период"превращения ВНАН образуется около 50 % ожидаемого количества В11А+." Это" отклонение значительно превышает значение адсорбции ВКА+ на угле (не более 10 %). При дальнейшем окислении ВНАН на угле количество образуемого" ВЦА+-приближается к теоретическому. Отсюда можно сделать вывод, что помимо BIА+ образуются промежуточные продукты, поглощающие в

той же области спектра.

Характерное отличие от аналогичной реакции на угле СКН - отсутствие поглощения кислорода, независимо от условий проведения реакции: при высоких (100 - 200 иг) и малых (I - 5 мг) навесках угля, за время до 4 ч, в кислой, нейтральной и щелочной среде. Несмотря на отсутствие поглощения кислорода, в реакции происходит окисление этанола. Так, в растворе с объемной долей этанола 50 %, содержащимся над углями АУА (100 иг) в течение 5 суток, не происходило окисления этанола. Однако, в присутствии ВНАН (1.10" моль/л) окислилось приблизительно 6 % спирта, что соответствует окислению 0,5 моль/л этанола.

Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу;о механизме окисления ВМАН на угле АУА. Поскольку кислород не используется, следует предположить, что окислителем ВНАН является сам уголь. Уголь АУА не содержит, в частности, ионов а после удаления

содержащихся в нем ионов окисление ВНАН протекает с той же скоростью и кислород не поглощается. Очевидно, каталитическую роль могут играть хинонные группировки на поверхности угля, легко вступающие в реакции с дигидроникотинамидами и в нашем случае играющие роль первичного акцептора при окислении ВНАН.

Учитывая наличие промежуточного продукта, можно сделать вывод, что реакция протекает в две стадии, напоминающие окисление ВНАН феррицианид-ионом и солями меди, йнтермедиат, образующийся вначале, содержит фрагменты дигидропиридиновой и четвертичной структур никотинамида, т.е. является димером. Подтверждением существования димера в реакции ВНАН с феррицианид-ионом является образование в равных количествах ВНА+ и продукта гидратации, поглощающего при 290 им. Образованию димера способствуют недостаток основания и достаточно высокая конце!.грация реагентов (порядка 10"^ моль/л). Попытки выделить димер были безуспешны.

Продукт гидратации наблюдается также при окислении ВНАН на угле АУА, притом тем больше, чем меньше навеска угля. В контрольном опыте (ВНАН + пара-бензохинон без угля) также образуется продукт гидратации. Его образование является, возможно, моделью т.н. НАДН-Х как формы существования 1ДЕН в кислой среде, способной Аер-ментативно превращаться в НАД! и далее НАД1".

Существование димера становится тем более обоснованным, что в ь реакционной среде отсутствует окислитель, способный принять электроны от пиридинильного радикала. Промежуточный димер имеет кван-

тово-химическое подтверждение. Очевидно, образование продуктов реакции является следствием диспропорционирования димера:

+

бМН^м Л

-м-

I

Л

¡Лимер]

сомн.

*

НО ..

Поскольку кислород в реакции не расходуется, то можно предположить, что окислителем этанола на угле АУЛ является сам уголь с участием пиридинильных радикалов.

Такш образом, использование угля АУА в медицинской практике может быть связано не только с его адсорбционными свойствами, но и со способностью катализировать окислительные процессы.

3. МКОГОЛЬДЕГИДРОРЕНАЗНЛЯ РЕАКЦИЯ НА УГЛЕ

На основании того, что модельное соединение ВИАН катализирует окисление этанола на угле, нами исследовано окисление этого спИрта в алкогольдегидрогеназной реакции на угле СКН и на угле с иммобилизованной алкогольдегидрогеназой (АДГ):

АДГ

сн3сн2он

ПАИ*"

'СНдСНО

КАДИ

н+

• Ферментативная реакция с иммобилизованной на угле АДГ замедляется по сравнению с обычными условиями, но по мере увеличения навесок угля происходит смещение равновесия в сторону образования ЙЛДН и увеличение скорости образования этого кофермента. Уменьшение скорости АДГ-реакции по сравнению с нативными условиями происходит вследствие иммобилизации фермента на угле. Из табл.5 видно, что сорбент несколько увеличивает окисление этанола. Меньшее влияние угля на окисление этанола в АДГ-реакции по сравнению с совместным окислением ВН АН и этанола можно объяснить обратимостью ферментативной реакции.

Таблица 5

АДГ-реакция и окисление ИАДД на угле СНН-К

дщ; * [ИАДЯх хю4,м скн-к, МР [Этанол^ ХЮ2,М Алкогольдегидрогеназная реакция Окисление НАДИ, К"3 М

Окисление ЕШ за 5 ч, % (мол.) Образование НАДО, % (мол.) к.10а, мин"* £(мол.)

0,1 5 _ 0,5 62 16 _ _

0,1 5 I 0,5 72 - - -

0,1 5 1,4 0,5 - 57 - -

0,1 5 - 4 12 19 - -

0,1 5 I 4 13 - - -

0,1 5 1.4 4 - 60 - -

0,1 5 - 5 23 21 - -

0.1 5 I 5 26 - - -

0,1 Б 1.4 5 - 61 - -

- - - 5 ■ - - 0,23 8

- - 0,6 5 - 0,60 16

- - I 5 - - 1,13 28

- - 1.8" 5 - - 1,80 40

Примечания: Фосфатный буфер - 0,1 моль/л, рН 7,55; общий объем -3 мл; 25°С

В табл. 5 представлены также данные по окислению НАДН на угле без участия фермента.

Если АДГ не иммобилизована, то наблюдается несколько иная картина: с увеличением концентрации НАД4" или этанола ферментативная реакция ускоряется не только в обычных условиях, но и на угле (данные не представлены). При этом наблюдается увеличение количества и скорости образования восстановленного кофермента. По кинетическим кривым образования ИДЦН, пользуясь методом Лайнуивера-Бэрка, были рассчитаны константы Ыихаэлиса К^-для ферментативной реакции как без угля, так и с участием угля, соответственно: по *АД*-5,80.10~4 М и 8,89. Ю~4 М; по этанолу - 3,57. Ю-2 М и

2,9.10 К. ............................ -

Кинетика образования НАДН в алкогольдегидрогеназной реакции

с иммобилизованным ферментом зависит от времени протекания реакции (рис. 3 и 4).

Рис. 3. Образование НАДО в АДГ-реакции. АДГ - 3,33. Ю-3 %\ концентрация, моль/л: НАД1" - 7,5. Ю"3; этанол -0,33; фосфатный буфер - 5. Ю~2, рН 7,55; общий объем - 3 мл;25°С; I - без угля; 2 - 4 - 0,5; 1,2; 2,2 мг сорбента соответственно.

Рис. 4. Образование НДЦН в АДГ-реакции в зависимости от концентрации этанола при продолжительном протекании реакции. АДГ - 0,1 %; концентрация, моль/л: IIАД + - 5.10"4; фосфатный буфер - 0,1, рН 7,55; общий объем 3 мл; 25°С. I - 4 - без угля; этанол, ммоль/л: I - 5; 2 - 25; 3 - 40; 4 - 50. 5 - 8 - уголь 1,4 мг; концентрация этанола соответствует 1-4.

При длительном проведении реакции (несколько часов) образование НАД! протекает по сложному графическому закону, причем реакция еще больше сдвигается в сторону образования ИАДН (рис. 4). ■ . Вследствие обратимости АДГ-реакции, окисление этанола в ней на 5 - 10 % меньше, чем в реакции, индуцированной НДЩ1. С помощью манометрического и других методов доказано выделение ацетальдеги-да в реакции на угле.' Точное количество его определить не удалось, т.к. ацетальдегид исчезает из сферы реакции, превращаясь в продукты конденсации. Фермент на угле не выполняет альдегиддегидроге-назной функции,- и возможное появление НАДН в АДГ-реакции не связано ни с ацетальдегидом, ни с продуктами его конденсации. Прямыми опытами показанот что альдоль и кротоновый альдегид быстро сорбируются на угле, превращаясь в продукты конденсации.

ю но зо т, пин.

■Г *0 го т -гос.

Сложный характер .кривых образования НДЦН (рис. 4) объясняется следующим образом: вслед за достижением равновесия в ферментативной реакции происходит медленная химическая стадия окисления НАДН (уменьшение концентрации НАД$; дальнейшее исчезновение ацет-альдегида и продуктов его конденсации из сферы реакции приводит к возрастанию концентрации НАДО- Следовательно, благодаря углю АДГ работает более продолжительное время по сравнению с обычными условиями, а смещение равновесия увеличивает выход реакции по НАД! в 4 раза.

Таким образом,показана возможность углей воздействовать на ферментативные реакции в живом организме.

вывода

1. Изучено каталитическое окисление кислородом 1,4-дигидропи-ридинов (К-бензил-1,4~дигидроникотинамид, эфир Ганча, НАДО) на углеродных энтеросорбентах типа СШ. Окисление дигидропиридинов ускоряется на угле и усиливается при действии УФ-облучении, в присутствии перекиси водорода, триэтиламина, ацетальдегида, триптофана, а при действии нитросоединений, хинонов, имидазола, ионов Ре замедляется.

2. Окисление 1,4-дигидропиридинов описывается кинетическим уравнением первого порядка (по дигидролиридинам) и дробным (по углю). Изучение окисления в присутствии феррицианид-иона показало, что лимитирующей стадией реакции является перенос электрона от ди-гидропиридина на поверхность угля.

3. Исследование окисления на разных марках углей показало, что акцепторной группой является положительно заряженная поверхность угля.

4. 1,4-Дигидро. [ридины совместно с углем промотируют окисление этанола, которое осуществляется супероксид-радикалами, возникающими при окислении пиридинильных радикалов кислородом и при адсорбции кислорода на утле.

5. Макрогетероциклы металлов ингибируют окисление дигидропиридинов и сопряженное с ним окисление этанола. "

' 6. Предложена модель фермента супероксиддисмутазы, состоящая из активированного угля и макрогетероциклов,. устраняющая супероксид-радикалы.

7. Окисление N-бензил-I,4-дигидроникотинамида на активном угле АУА протекает по кинетическому уравнению первого порядка (по

BN АН) и дробному - по углю. Несмотря на отсутствие поглощения кислорода, происходит окисление этанола. Сделан вывод, что окисление этанола происходит с участием пиридинильных радикалов.

8. Окислителем BNAH на угле АУА является сам уголь, а именно хинонные группировки, на поверхности. Окисление BN АН протекает <• участием промежуточного димерного соединения.

9. Продукт окисления этанола в алкогольдегидроррназной реак-, ции на угле - ацетальдегид превращается в продукты конденсации.

что приводит к смещению равновесия ферментативной реакции и увеличении выхода реакций по НАДИ в 4 раза.

10. Сделан вывод о возможности углей воздействовать на ферментативные реакции в живом организме.

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Ясников A.A., Стрелко В.В., Мищенко H.H. и др. Сопряженное окисление этанола и Н-бензил-1,4-дигидроникотинамида на активном угле СНН // Докл.АН УССР..Сер.В.- 1985.- N 12.- С.45-48.

2. Узиенко А.Б., Мищенко И.Н., Ясников A.A. Изучение механизма действия углеродного гемосорбента СНН на окисление этанола // Тез.докл. на III Украинской конференции "Новые средства и сферы клинического применения сорбционной детоксикации организма".-Днепропетровск: 1985.- С.-130-131.

3. Узиенко А.Б., Бойко Т.С., Мищенко И.Н. и др. Гомогенный и гетерогенный катализ реакций присоединения и окисления дигидронико-тинамидов // Тез.докл. ХУ Украинской республиканской конференции по органической химии.- Ужгород: 1986.- С.115.

4. Мищенко И.Н., Узиенко А.Б., Ясников A.A. Исследование алкоголь-, дегидрогенпзной реакции на активных углях СНН // Тез.докл. 9 ' конференции молодых ученых Института органического, синтеза АН ■ Латвийской ССР "Синтез и исследование биологически активных соединений",- Рига: 1987.- С.87.

5. Мищенко И.Н., Узиенко А.Б,, Ясников A.A. и др. Кинетика и механизм окисления производных никотинамида и этанола на активных углях // Укр.хим.журн,- 1989.- 55, II 3.- С.279-282.

6. Узиенко А.Б., Бойко Т.С., Мищенко И.Н., Ясников "А. А. Окисление дигидроникотинамидов феррицианид-ионом на активном угле //

Там же.- 1988,- 54, N 12.- C.I303-I305.

7. Узиенко А.Б..Мищенко И.Н., Михаловсний C.B. и др. Механизм окисления дигидроникотинамидов и этанола на углеродных гемосор-

бейтах // Тез.докл. 1У Украинской республиканской конференции "Сорбенты медицинского назначения и механизмы их лечебного действия".- Донецк: 1988.- С.35-36.

8. Узиенко А.Б., Мищенко H.H., Бойко Т.С. и др. Ион-радикалы и перенос электрона в реакциях окисления дигидроникотинамидов на активных углях // Тез.докл. УН Всесоюзного совещания "Комплексы с переносом заряда и ион-радикальные соли".- Черноголовка: 1988.- С.239.

9.Узиенко А.Б., Ясников A.A., Мищенко И.Н. и др. Алкогольдегидро-геназная реакция на углеродных гемосорбентах // Тез.докл. на

У1 Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии "Получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине".-Вильнюс: 1988.- Ч.1.- С.47-48.

10. Узиенко A.B., Бойко Т.С., Мищенко И.Н. и др. Окисление дигид-роникотинамидов на активных углях в присутствии моталлокомплек-сов макрогетероциклов // Тез.докл. на III Всесоюзной конференции по химии и биохимии макроциклических соединений".- Иваново: 1988.- С.300.

11. Мищенко И.Н., Узиенко А.Б., Ясников А.А и др. Алкогольдегидро-геназная реакция на активных углях П Укр.биохим.журн.- 1989.61, N 5.- С. 99гЮ2.

12. Узиенко А.Б., Мищенко И.Н., Бойко Т.С. и др. Окисление дигид-роникотинамидов на активных углях в присутствии металлокомплек-сов макрогетероциклов // %рн. общ. химии,- 1990.- 60, N 4,-

С. 891-895.

13. Мищенко И.Н.,Узиенко А.Б,, Ясников A.A., Головко Л.В. Окисление К-бензил-I,4-дигидроникотинамида на активном угле АУА // Докл. АН Украины. Сер.Б.- 1992.- И Ю-- C.I30 - 133.

Соискатель

Подп. кпеч. 6 ич. уз Формат бсчч/^ Бума! аГ,«.,

Печ. офс. Усл. печ. л. f,/6 Уч-изд. i о, gj Гири. ti>ä Za,*..i-3Slt .

Киевская книжная типографа ночной книги. Киеи, Репина 4.