Кинетические закономерности конверсии азокрасителей и продуктов их распада анаэробным и аэробным консорциумами микроорганизмов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи %

Емашова Наталия Александровна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ КОНВЕРСИИ АЗОКРАСИТЕЛЕЙ И ПРОДУКТОВ ИХ РАСПАДА АНАЭРОБНЫМ И АЭРОБНЫМ КОНСОРЦИУМАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ

02.00.15-катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Калюжный Сергей Владимирович кандидат биологических паук, доцент Котова Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ножевникова Алла Николаевна кандидат химических наук, главный спепи&чист Скляр Владимир Ильич

Ведущая организация:

Институт водных проблем РАН, Москва

Защита состоится «\?Ь » 2006 года в 1600 часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан марта 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

goo £ A

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Основной источник синтетических загрязнений окружающей среды - химическая и нефтехимическая промышленности. Хотя в сравнении с остальными классами органических соединений азокрасители составляют относительно небольшую часть (3-4%) загрязнений, попадающих в окружающую среду, существует несколько причин, по которым азокрасители считаются опасными поллютантами. Во-первых, азокрасители и продукты их разложения, в зависимости от концентрации и времени воздействия, могут оказывать ярко выраженное токсичное и/или канцерогенное влияние на живые организмы. Во-вторых, азокрасители способны окрашивать сточные воды, что вызывает негативный эстетический эффект (интенсивность окрашивания сточных вод зависит от цвета азокрасителей, коэффициента молярного поглощения и прозрачности воды, но в среднем человеческий глаз способен различить присутствие азокрасителя в концентрации до 1 мг-л'). И, в-третьих, азокрасители поглощают солнечный свет и тем самым снижают эффективность фотосинтеза водных организмов. Существуют различные технологии удаления азокрасителей из сточных вод, из которых наиболее экономичными признаны биологические методы. Недавние исследования подтвердили возможность полной минерализации ряда азокрасителей под действием микроорганизмов. Следует, однако, отметить, что не существует однозначного мнения относительно механизма и локализации процесса микробиологического расщепления азокрасителей, невыясненной остается роль отдельных микроорганизмов, участвующих в обесцвечивании азокрасителей, а также недостаточно ясным представляется влияние химического строения азокрасителей на возможность и скорость их биологической конверсии.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование механизма и кинетических закономерностей анаэробной конверсии четырех азокрасителей (Acid Orange 6, Acid Orange 7, Methyl Orange и Methyl Red), изменения токсичности в процессе их конверсии, а также возможности их полной минерализации под действием анаэробного и аэробного сообществ микроорганизмов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) оценить токсичность исследуемых азокрасителей стандартным методом определения ацетокластической метаногенной активности и сравнить ее с токсичностью продуктов распада азокрасителей; _ ___

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ. БИБЛИОТЕКА I

2) исследовать биоразлагаемость азокрасителей и продуктов их распада под действием аэробного и анаэробного сообществ микроорганизмов;

3) варьируя условия культивирования азокрасителей в присутствии анаэробного сообщества микроорганизмов, определить кинетические параметры конверсии азокрасителей;

4) с помощью методов световой и сканирующей электронной микроскопии изучить особенности воздействия азокрасителей и продуктов их распада на состояние анаэробного сообщества микроорганизмов.

Научная новизна работы. В результате выполнения работы была впервые предложена общая кинетическая модель для обесцвечивания четырех исследованных азокрасителей под действием анаэробного сообщества микроорганизмов, учитывающая влияние таких параметров проведения процесса, как электрохимический потенциал восстановления азокрасителей, начальная концентрация азокрасителей, концентрация анаэробного инокулята, температура и значение pH культивирования. Кроме того, был выяснен и подтвержден с помощью экспериментов с бесклеточной культуральной средой и абиотических экспериментов с сульфидом и НАДН механизм анаэробного обесцвечивания азокрасителей, согласно которому оно осуществляется внеклеточными восстановителями, генерируемыми анаэробными микроорганизмами. Впервые была показана возможность полной минерализации под действием анаэробного сообщества микроорганизмов таких продуктов обесцвечивания азокрасителей, как сульфаниловая кислота, 1-амино-2-нафтол и 1,4-аминорезорцин.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований была показана возможность полной минерализации двух азокрасителей (Acid Orange 6 и Acid Orange 7), присутствующих в сточных водах текстильных производств, и продуктов их распада под действием анаэробного сообщества микроорганизмов. Анаэробная обработка растворов, содержащих Methyl Orange и Methyl Red, привела к полному обесцвечиванию азокрасителей и минерализации одного из продуктов их распада, а применение нитратвосстанавливающих условий позволило удалить второй ароматический амин и, таким образом, очистить раствор от загрязнений ароматическими веществами. Данные, полученные в работе, могут служить основой для будущих исследований биологической минерализации азокрасителей в лабораторных и пилотных реакторных установках.

Апробаиия работы. Результаты работы были доложены на конференциях: II

Московский Международный Конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003, Москва; Всероссийский Симпозиум «Биотехнология микробов», 20-23 октября 2004, Москва; Ш Московский Международный Конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005, Москва; The Eighth International In Situ and On-Site Bioremediation Symposium, June 6-9 2005, Baltimore, Maryland, USA; The IWA International Conference Sustainable Development of Chemical industries With the Environment "Waste and Wastewater Management", July 14-16, 2005, Tsukuba&Kashima City, Japan; Международная Конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005, Саратов; VIII Latin American Workshop and Symposium on Anaerobic Digestion, October 2-5, 2005, Punta del Este, Uruguay, Всероссийский симпозиум с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (памяти акад. РАН Е.Н.Кондратьевой), 21-24 декабря, 2005, Москва.

Публикаиии. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 132 источника. Общий объем работы - 127 страниц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение и литературный обзор

Красители используются людьми с древнейших времен и делают мир прекраснее и счастливее. На сегодняшний день в мире ежегодно производится около 1 млн. тонн красителей, а объем Российского рынка красителей составляет около 23 тыс. тонн. Самой большой (70% от всего производства красителей) и наиболее важной группой красителей, в основном благодаря простоте синтеза и устойчивости, являются азокрасители. В процессе производства и использования азокрасителей примерно 1015% попадает в окружающую среду. Присутствие азокрасителей, а особенно продуктов их распада, ароматических аминов, в сточных водах является нежелательным из-за выраженного токсичного и/или канцерогенного влияния на живые организмы. Методы удаления азокрасителей и ароматических аминов из сточных вод можно условно разделить на физико-механические, химические и биологические. Физические и химические методы обработки сточных вод имеют ряд ограничений, связанных с большими энергозатратами, образованием токсичных побочных продуктов и высокой стоимостью технологий, поэтому широкое распространение получили более

экономичные и экологически приемлемые методы обработки с использованием аэробных и анаэробных микроорганизмов. По литературным данным в аэробных условиях азокрасители довольно устойчивы, и только некоторые аэробные микроорганизмы способны к ферментативному окислению (лакказы и пероксидазы грибов) или внутриклеточному восстановлению (азоредуктаза бактерий) азокрасителей с образованием ароматических аминов. В присутствии кислорода некоторые ароматические амины (содержащие гидроксильную группу, или фенилендиамины) подвергаются автоокислению с образованием нерастворимых бионеразлагаемых продуктов полимерной природы. С другой стороны, в анаэробных условиях азокрасители легко подвергаются конверсии, однако, многие ароматические амины в присутствии анаэробных микроорганизмов устойчивы.

В работе были использованы четыре кислотных азокрасителя, широко используемых в текстильной промышленности (рис. 1), а также микробиологический материал двух видов:

1) анаэробный метаногенный гранулированный ил из EGSB (Expanded Granular Sludge Bed) реактора, обрабатывающего стоки пивоваренного производства (Эфес-Москва);

2) активный аэробный ил с Курьяновской станции аэрации (Москва), обрабатывающей бытовые стоки.

Минеральная среда содержала (мг-л'1): NH,C1 - 280, СаС12х2Н20 - 10, К2НР03 - 250, MgS04x7H20 - 100, NaHC03 - 5000, дрожжевой экстракт-100, Н3В03 - 0.05, FeCl3x4H20 -2, ZnCl2 - 0.05, МпС12х4Н20 - 0.05, CuCl2*2H20 - 0.03, А1С13*6Н20 - 2, NiCl2*6H20 - 0.05, Na2Se03x5H20 - 0.1 и 36% HCl -100 мкл-л"1, pH 7.0

Объекты исследования

но

но

Acid Orange 6

Acid Orange 7

COONa

Methyl Orange

Methyl Red

Рисунок 1 Структурные формулы используемых в работе азокрасителей

Результаты исследования и их обсуждение

Конверсия азокрасителей в аэробных и анаэробных условиях. Исследование биоразлагаемости азокрасителей в присутствии аэробного и анаэробного сообществ микроорганизмов показало, что из четырех исследованных азокрасителей только Methyl Red подвергся полному обесцвечиванию в аэробных условиях, в то время как Acid Orange 6, Acid Orange 7 и Methyl Orange не разлагались в течение 25 суток культивирования. В то же время, в анаэробных условиях, все четыре исследуемые азокрасителя подверглись полному обесцвечиванию (рис. 2).

Во всех случаях обесцвечивание в анаэробных условиях проходило практически без лаг-периода и подчинялось законам кинетики первого порядка по отношению к концентрации азокрасителя (уравнение 1).

С = С0 х е'*" (1),

где С - концентрация азокрасителя в момент времени t, мМ; С0 - начальная концентрация красителя,

в

S оз 1

* 0.25 I -0—

__

О 10 20

врем«, суг

Рисунок 2. Обесцвечивание азокрасителей Acid Orange 6 (a), Acid Orange 7 (б), Methyl Orange (в) и Methyl Red (г) под действием аэробного и анаэробного сообществ микроорганизмов.

Для того чтобы определить продукты, образовавшиеся в результате обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях, был проведен анализ культуральных жидкостей с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Было показано, что

обесцвечивание азокрасителей произошло в результате восстановления азосвязи и образования бесцветных ароматических аминов. В качестве продукта восстановления Acid Orange 6 в анаэробных условиях была обнаружена только сульфаниловая кислота (уравнение 2). Второй ароматический амин, 4-аминорезорцин, подвергался полной минерализации, о чем свидетельствовало накопление метана в газовой фазе. Продуктами разложения Acid Orange 7 являлись сульфаниловая кислота и 1-амино-2-нафтол (уравнение 3), в случае восстановления Methyl Orange были обнаружены сульфаниловая кислшы и М,М-диметил-1,4-фенилендиамин (уравнение 4), а продуктами восстановления Methyl Red были также М,КГ-диметил-1,4-фенилендиамин и антраниловая кислота (уравнение 5), как в случае аэробного, так и в случае анаэробного обесцвечивания.

ноч

» NaOjS—NH; + „„ИД)—ОН NH,

(2)

(3)

СИ,

(4)

(5)

Ь2СН4

' NeOjS---+ H;N—

COONa COONa

o-'-'-o-c — d- • -oc

После завершения процессов HiC^n'CH3

обесцвечивания азокрасителей Methyl Orange и Methyl Red под действием

анаэробного метаногенного сообщества в NHj N"2 (6)

системе было зафиксировано образование метана. Как показал анализ культуральной жидкости, накопление метана было связано с деметилированием Ы,Ы-диметил-1,4-фенилендиамина с образованием 1,4-фенилендиамина (уравнение 6) в случае азокрасителя Methyl Orange, и также с деметилированием К,М-диметил- 1,4-фенилендиамина и с минерализацией антраниловой кислоты в случае азокрасителя Methyl Red. Исследованию биодеградации ароматических аминов, образовавшихся в результате обесцвечивания азокрасителей, была посвящена отдельная часть работы.

Механизм обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях. Обесцвечивание азокрасителей в присутствии анаэробного консорциума происходило практически без

б

лаг-периода, то есть для расщепления азокрасителей не требовалось адаптации микробного сообщества. Анаэробное обесцвечивание азокрасителей не являлось следствием адсорбции последних на частицах метаногенного ила, о чем свидетельствовало отсутствие обесцвечивания азокрасителей при инкубации с меганогенным консорциумом, подвергнутым автоклавированию (рис. 3). Кроме того, при культивировании азокрасителей в присутствии аэробного консорциума в анаэробных условиях произошло их полное обесцвечивание. Проведенный анализ культуральной жидкости после полного обесцвечивания азокрасителей показал, что обесцвечивание также произошло благодаря восстановлению азосвязи и образованию ароматических аминов (согласно уравнениям 2, 3, 4 и 5). Таким образом, можно сделать вывод, что обесцвечивание азокрасителей является свойством, характерным для анаэробно культивируемых микробных сообществ.

5 10 IJ время, суг

Рисунок 3. Обесцвечивание азокрасителей Acid Orange 6 (a), Acid Orange 7 (б), Methyl Orange (в) и Methyl Red (г) анаэробной культуральной жидкостью, освобожденной от клеток фильтрованием, и анаэробным консорциумом, простерилизованным автоклавированием.

Очевидным является то, что молекулам красителя сложно проникнуть внутрь живых клеток, поскольку они заряжены. Из всего вышесказанного можно сделать предположение, что восстановление азокрасителей происходит опосредованно, за счет веществ-восстановителей, неизбежно присутствующих в среде, где происходит

культивирование анаэробных микроорганизмов. Для того чтобы подтвердить это предположение был проведен эксперимент с анаэробной культуральной жидкостью, пропущенной через стерильный микрофильтр с размером пор 0.2 мкм. Такая культуральная жидкость, не содержащая клеток, но содержащая их метаболиты, полностью обесцветила все исследуемые азокрасители с образованием ароматических аминов (рис 3). Следует отметить, что восстановители, участвующие в обесцвечивании азокрасителей, отличаются термонестабильностью, как показал эксперимент с анаэробным консорциумом, подвергнутым автоклавированию (рис. 3).

Для исследования механизма анаэробного обесцвечивания азокрасителей была проведена серия экспериментов по их химическому восстановлению в отсутствии микроорганизмов. Одним из предполагаемых анаэробных восстановителей может быть сульфид, который является продуктом сульфатвосстанавливающих бактерий, присутствующих практически в любом анаэробном микробном сообществе, поэтому в

Рисунок 4 Химическое восстановление Methyl Orange сульфидом в концентрации 0 5 мМ (а) и НАДН(б).

Также было исследовано восстановление азокрасителей в присутствии восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (рис. 46). НАДН является известным восстановительным эквивалентом, участвующим в метаболизме клеток. Хотя НАДН не проникает через клеточные мембраны, в анаэробной культуральной жидкости он может появляться вследствие лизиса части микробной популяции - процесса, обычного для любого сообщества микроорганизмов. Под действием сульфида и НАДН все исследуемые азокрасители подверглись обесцвечиванию, как показано на рис. 4 на примере азокрасителя Methyl Orange. Следует отметить, что в анаэробной культуральной жидкости концентрация сульфида и НАДН составляла небольшую величину (менее 20 мкМ). Таким образом, можно предположить, что анаэробное обесцвечивание

азокрасителей связано с совместным действием различных окислительно-восстановительных медиаторов, вюм числе сульфида и НАДН.

Для того чтобы подтвердить важность участия окислительно-

восстановительных медиаторов в обесцвечивании азокрасителей под действием анаэробного микробного сообщества, был проведен эксперимент с культивированием азокрасителя Acid Orange б в присутствии анаэробного ила и рибофлавина (широко

распространенного витамина, входящего в состав многих ко-факторов). Сам по себе рибофлавин не способен обесцвечивать азокрасители, как было показано при инкубации рибофлавина и азокрасителя в отсутствии микроорганизмов (рис. 5), однако добавление рибофлавина в очень малой концен грации в жидкую фазу привело к увеличению скорости обесцвечивания азокрасителя под действием анаэробного консорциума в десять раз за счет участия рибофлавина как эффекшвною переносчика восстановительных эквивалентов.

Рисунок 5 Обесцвечивание Acid Orange 6 в присутствии анаэробного консорциума (•) в присутствии рибофлавина в концентрации 15 мкМ (и) и в присутствии как анаэробного консорциума, так и 15 мкМ рибофлавина (о)

Азокраситель

х

Бесцветные амины

Окислительно- Окислительно-

восстановительный восстановительный медиатор (вост.) медиатор (ок.)

Рисунок б Предполагаемый механизм анаэробного обесцвечивания азокрасителей

На основании полученных данных, был предложен гипотетический механизм анаэробного восстановления азокрасителей (рис. 6). Азосвязь красителей под действием восстановителей, присутствующих в анаэробной среде, подвергается расщеплению и в результате образуются бесцветные ароматические амины. При этом роль микробной клетки заключается в постоянном пополнении запаса восстановителей за счет ферментативного восстановления окисленной формы медиаторов.

Факторы, оказывающие влияние на скорость обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях. Как было показано выше, обесцвечивание азокрасителей под действием анаэробного ила сводится к восстановлению азосвязи и образованию двух аминогрупп. При этом в одинаковых условиях (при одинаковом составе среды, температуре, концентрации ила и начальной концентрации азокрасителя) все четыре исследованных азокрасителя обесцвечивались с разной скоростью. Процессы обесцвечивания исследуемых азокрасителей анаэробным метаногенным микробным сообществом различались значениями электрохимических потенциалов иолу-реакций восстановления четырех азокрасителей.

Для того чтобы оценить электрохимические потенциалы восстановления азокрасителей, были сняты циклические вольтамперограммы азокрасителей и соответствующих ароматических аминов, как показано на примере азокрасителя Methyl Orange на рис. 7. В циклических вольтамперограммах всех четырех исследованных азокрасителей присутствовал необратимый пик восстановления (Пв) и необратимый пик окисления (П0). Также в полученных вольтамперограммах присутствовали полуобратимые пики окисления (10) и восстановления (1в), связанные с обратимым процессом окисления и восстановления ароматических аминов, образующихся в результате электрохимического восстановления азокрасителя. Это подтверждают снятые циклические вольтамперограммы растворов чистых ароматических аминов (рис. 7), в которых наблюдаются полу-обратимые пики окисления и восстановления при значениях потенциала, сравнимых с пиками 1<, и I,. Необратимый восстановительный пик П„ в циклических вольтамограммах азокрасителей связан с процессом восстановления азосвязи и образованием двух ароматических аминов. Появление необраггамого пика окисления П0 может быть связано как с процессом окисления, приводящим к расщеплению азокрасителя, так и с необратимым окислением одного из образовавшихся ароматических аминов (рис. 7). Значения потенциалов, соответствующих пикам I и II циклических вольтамограмм азокрасителей, приведены в табл. 1.

-500 -400 -300 -200 -100 0

Е,мВ

Рисунок 7 Циклические волътамперограммы Рисунок 8 Зависимость константы первого азокрасителя Methyl Orange (—) и соответ- порядка обесцвечивания азокрасителей от ствующих ароматических аминов ДМФ (—) значения потенциала их восстановления (II,), и сульфаниловой кислоты концентрация азокрасителей 0.18-0.33 мМ.

Полученные экспериментальные данные позволяют выявить линейную корреляцию между значением потенциала пика восстановления азосвязи красителей (П,) и константами первого порядка скорости их обесцвечивания (рис. 8). Таким образом, определение электрохимических потенциалов восстановления азокрасителей может являться методом оценки скорости их анаэробного биообесцвечивания. Таблица 1. Значения потенциалов пиков окисления и восстановления азокрасителей.

HaHMeHOBaHHe a30KpacHTejifl II», мВ I„MB I«,MB Но, мВ

Acid Orange 6 -425 -464 +64 +85 +260 +265 +979 +1038

Acid Orange 7 -411 -428 +71 +82 +255 +273 +1080 +1115

Methyl Orange -250 -261 +222 +240 +459 +465 +1020 +1075

Methyl Red -93 -133 +76 +105 +270 +276 +949 +961

На скорость анаэробного обесцвечивания азокрасителей оказывает влияние не только собственный потенциал восстановления, но и окислительно-восстановительный потенциал среды. Как известно из литературы, окислительно-восстановительный потенциал среды метаногенного сообщества составляет -430 мВ, создание сульфатвосстанавливающих условий приводит к повышению потенциала до -200 мВ, а в нитратвосстанавливающих условиях поддерживается потенциал среды +433 мВ. Используемый в работе анаэробный консорциум обладал как метаногенной, так сульфатвосстанавливающей и нитратвосстанавливающей активностями, определенные в ходе работы значения которых составили, соответственно, 190 мгХПК-СН4тБВБ"1-сут'1,

48 мг8-Н28тБВБ"'-сут1 и 620 мгЫ-М)зтБВБ"1-сут"Проведенные эксперименты по обесцвечиванию азокрасителей анаэробным сообществом микроорганизмов в присутствии дополнительных акцепторов электронов сульфата и нитрата в концентрации 2 мМ показали, что самая высокая скорость обесцвечивания была достигнута в метаногенных условиях (табл. 2), а самая низкая - в нитратвосстанавливающих, в которых даже не произошло полного обесцвечивания азокрасителей. Это объясняется ¡ем, что нитрат является лучшим, чем азогруппа, акцептором электронов и конкурентом за восстановительные эквиваленты.

Таблица 2 Сравнение кинетических параметров обесцвечивания азокрасителей* в анаэробных условиях

наименова- нитратвосстанавли- сульфатвосстанавли- метаногенные

ние вающие условия вающие условия условия

азокрасителя k, сут"1 k, сут"1 (в к, сут"1 к, сут'1 (в к, сут'1 к, сут"1 (в

присутствии присутствии присутствии

этанола) этанола) этанола)

Acid Orange 0,007± 0.045± 0.13± 0.16± 0.24± 0.44±

6 0.002 0.004 0.02 0.02 0.03 0.04

Acid Orange 0.0039± 0.16± 0.201± 0.313± 0.45± 1.69±

7 0.0007 0.03 0.008 0.009 0.03 0.05

Methyl 0.009± 0.17± 0.94± 3.49± 1.4± 2.35±

Orange 0.001 0.03 0.05 0.08 0.3 0.08

Methyl Red 0.006± 0.082± 0.71± 4.82± 1.0± 3.4±

0.002 0.008 0.07 0.01 0.1 0.2

* Начальная концентрация азокрасителей составила: Acid Orange 6, Acid Orange 7 и Methyl Red - 0.5 мМ и Methyl Orange - 0.1 мМ.

Использование этанола в концентрации 4 мМ в качестве дополнительного субстрата при анаэробной биоконверсии азокрасителей увеличило скорость их обесцвечивания, как в метаногенных, так в сульфат- и в нитратвосстанавливающих условиях (табл. 2). Ускорение процесса обесцвечивания азокрасителей происходила за счет того, что в результате потребления этанола анаэробным сообществом образовались дополнительные восстановительные эквиваленты. Самые высокие значения констант скорости обесцвечивания азокрасителей в присутствии этанола были достигнуты в метаногенных условиях (для красителей Acid Orange 6 и Acid Orange 7) и в сульфатвосстанавливающих

условиях (для Methyl Orange и Methyl Red). Возможно, такое значительное ускорение процессов обесцвечивания двух последних азокрасителей в сульфатвосстанавливающих условиях связано со значительным увеличением роли сульфида как основного восстановителя азосвязи, отсутствующего в метаногенных условиях.

Как было отмечено выше, обесцвечивание четырех исследуемых азокрасителей в присутствии анаэробного метаногенного сообщества происходило без лаг-периода и описывалось уравнением 1 кинетики первого порядка по отношению к концентрации азокрасителей. Эта закономерность сохранялась при варьировании начальной концентрации азокрасителей от 0.09 до 1.7 мМ. Согласно уравнению 1 константа первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителей не должна зависеть от концентрации азокрасителя, однако, было выявлено снижение значение константы первого (псевдопервого) порядка скорости обесцвечивания азокрасителя с увеличением его начальной концентрации (рис. 9). Этот факт можно объяснить токсическим воздействием азокрасителей и/или продуктов их восстановления, ароматических аминов, на анаэробное сообщество. Согласно предложенному механизму анаэробной конверсии азокрасителей, клетки непосредственно не участвуют в обесцвечивании азокрасителей (рис. 6), однако, состояние сообщества прямым образом влияет на присутствие и концентрацию его метаболитов во внешней срсде, а ингибирование активности анаэробных микроорганизмов выражается в снижении концентрации восстановителей в жидкой фазе. Зависимости констант скорости от начальной концентрации азокрасителя были описаны экспоненциальным уравнением (7), используемым, по литературным данным, для отображения токсического влияния различных веществ на микробную активность. С использованием уравнения 7 для каждого из исследуемых азокрасителей были рассчитаны величины IC50 - концентрации азокрасителей, при которых значения констант псевдо-первого порядка скоростей их анаэробного обесцвечивания снижались на 50% (см. табл. 3).

к = кк1хе"с> (7),

где, к- константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителя анаэробным илом, сут'1; кщI - максимальная константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания, сут1; Со -исходная концентрация азокрасителя, мМ; а - коэффициент, связанный с токсичностью азокрасителей, мМ"1.

Исследование влияния концентрации анаэробного метаногенного инокулята на скорость обесцвечивания азокрасителей было проведено в присутствии 5, 10, 15 и 20%

посевного материала от объема жидкой фазы. Как видно из рис. 10 константы скорости обесцвечивания азокрасителей увеличиваются с увеличением концентрации анаэробного инокулята, однако эти зависимости не являются линейными, а описываются функцией с насыщением (уравнение 8).

• Acid Orange 6 о Acid Orange 7 AMcthyl Orange ¿Methyl Red

0 05 1 1.5 2 концентрация изо красителя, мМ

14 -

12-

1 -1

'S. OS -

J 06-

04 -

02-

0

• Acid Orange б о Acid Orange? A Meftyl Orange л Methyl Red

0 05 1 15

концеитраввя инокулята, гБВБ л'1

Рисунок 9 Влияние начальной концентрации азокрасителя на константу псевдопервого порядка скорости обеспечивания азокрасителей (30"С, рН 7, концентрация анаэробного инокулята 0 4 гБВБ л')

Рисунок 10 Влияние концентрации анаэробного инокулята на константу псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителей (30°С, рН 7, концентрация азокрасителей 0 2-0.5мМ)

Этот факт можно объяснить, приняв во внимание участие анаэробного сообщества в процессе обесцвечивания азокрасителей в качестве источника внеклеточных восстановительных эквивалентов для разрыва азосвязи. При увеличении концентрации анаэробного ила возрастает количество его метаболитов в культуральной жидкости и, таким образом, влияние концентрации восстановительных эквивалентов постепенно уменьшается.

* = *.ах БВБ (8),

3 К ,+БВБ К '

где к - константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителя анаэробным илом, сут'1; к„2 - максимальная константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания, сут"'; К, -константа насыщения, гл"1; БВБ-концентрация анаэробного инокулята, гБВБ-Л"1.

Температурная зависимость скорости обесцвечивания азокрасителей была изучена в интервале от 24 до 40 °С. Для четырех исследованных азокрасителей значения констапт псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания увеличивались с увеличением температуры, по-видимому, из-за увеличения скорости образования и диффузии восстановительных эквивалентов, необходимых для этого процесса, а также ускорения процессов клеточного лизиса, способствующего увеличению концентрации окислительно-восстановительных медиаторов в жидкой среде. Температурные

зависимости констант скорости приобретали линейный вид в координатах 1п(к) - 1/Т (рис. 11) и подчинялись уравнению Аррениуса (9).

_Еа

к = Ахе кт (9),

где к - константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителя анаэробным илом, сут"'; А - предэкспоненциальный множитель, сут"'; Еа - энергия активации процесса восстановления азосвязи красителя, Джмоль"'; Я - универсальная газовая постоянная, Дж-моль ' К'; Т - температура проведения эксперимента, К.

Хотя оптимальные значения рН культивирования используемого анаэробного ича лежат в нейтральной области, определение рН- оптимума процессов восстановления азокрасителей проводили в диапазоне значений рН от 4.0 до 9.0. Зависимости констант псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания четырех азокрасителей от значения рН культивирования имели вид кол околообразных кривых (рис. 12) и описывались уравнением 10.

к = и [нт"3, к" (10)'

К, [Н*]'

где к - константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителя анаэробным илом, сут"1; к„3 - максимальная константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания, сут"1; К(1 и К4 -константы кислотной и основной диссоциации, мМ"'; [Н4] - концентрация ионов водорода, мМ; а,р -коэффициенты.

14 12 -1

08 -

06 04 -0.2 \

4—4

• Ас«] Опиф 6 о дай Опшде 7 А МеАуЮгаее й М«Ьу| М _

рН

Рисунок 12 рН-зависимость констант псевдопервого порядка скорости обесцвечивания азокрасителей (30°С, концентрация инокулята 0 4 гБВБл', концентрация азокрасителей 015-0 6мМ)

Рисунок 11. Температурная зависимость констант псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителей (рН 7, концентрация инокулята 0 4 гБВБ-л'1, концентрация азокрасителей 0,1-0 3 мМ)

В табл. 3 приведены основные кинетические константы, рассчитанные с использование приведенных уравнений (7-10). На основании анализа зависимостей констант псевдо-первого порядка скоростей обесцвечивания азокрасителей от начальной

концентрации азокрасителей (Со), концентрации анаэробного инокулята (БВБ), температуры (Т) и рН проведения эксперимента, а также учитывая влияние значения потенциала восстановления азосвязи (Ев) для каждого азокрасителя, может быть предложена общая формула, описывающая константу псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания азокрасителей как произведение общей для четырех азокрасителей константы кт и множителей, ответственных за каждый из параметров С0, БВБ, Т, рН и Ев (уравнение 11) в области их варьирования: С0-от0.1 до1.7мМ, БВБ-от 0.05 до 1.01 п', Т - от 293 до 313 К и рН - от 4 до 9. Использование всего набора экспериментальных данных, а также констант, приведенных в табл. 3, позволило вычислить методом наименьших квадратов значение общей для четырех исследованных азокрасителей константы кт уравнения 11, составившее 2.6±1.3 сут"'.

БВБ , 1

£ = £ х (1 + 0.0018£,)хе~"г» х——хАхе лт х-^--(11),

К, + БВБ [Н »]' Кь

К, [Н *]'

где к„ - максимальная константа псевдо-первого порядка скорости обесцвечивания, сут1, Е,

потенциал восстановления азокрасителей, мВ; к, Со, а, К,, БВБ, А, Еа, Я, Т, К„, К;,, [Н"]( а, р - см обозначения в уравнениях 7-10

Табтца 3 Основные кинетические константы обесцвечивания азокрасителей под действием анаэробного сообщества микроорганизмов

"" --^азокраситель параметр Ас1сЗ Ога^е 6 Ас1(3 Огап§е7 МеИ1у1 Огаг^е Ме%1 Яеё

ка!, сут"' 0.25 0.73 2.5 2.5

а, мМ"' 0.21 1.6 6.4 1.8

1С50, мМ 2.7 0.73 0.20 0.74

Кг, сут'1 0.24 0.34 0 75 1 74

Киг-л"' 0.06 0.02 0.04 0.49

А, сут'1 1.1x10® 3.1х105 1.2x10'° 1.2х106

Еа, кДж-моль' 56.2 28.9 56.4 34.9

Кь сут"1 0.34 0.28 1.12 0.73

К«,, мМ'1 8.0x10"' 50x10" 3.5х10"5 1 0*Ю"5

КА, мМ*' 1.0х10'8 5.0хЮ"1и 3.0x10'" 9.0x10"

а 1 1 0.97 0.80

Р 1 1 1 0.88

Изменение токсичности в процессе конверсии азокрасителей в анаэробных условиях. В результате восстановления азокрасителей в анаэробных условиях образовались бесцветные ароматические амины: сульфаниловая кислота, антраниловая кислота, 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол, Н,]Ч-диметил-1,4-фенилендиамин и 1,4-фенилендиамин. Ароматические амины (по литературным данным) часто являются токсичными, а также имеют канцеро1 енную активность по отношению к человеку. По изменению ацетокластичсской мстаногснной активности анаэробного сообщества была проведена оценка токсического влияния исходных азокрасителей и образовавшихся в результате их обесцвечивания ароматических аминов (табл. 4).

Таблица 4 Токсичность азокрасителей и образовавшихся в результате их восстановления ароматических аминов

A30KpacHTejib IC50 азо-красителя, мМ Log Po/w азо-красителя IC50 соответствующих ароматических аминов, мМ

Acid Orange 6 2.50 0.735 Сульфаниловая кислота Не токсична* 4-аминорезорцин Не токсичен*

Acid Orange 7 0.90 1.093 Сульфаниловая кислота Не токсична* 1 -амино-2-нафтол 0.54

Methyl Orange 0.25 1.673 Сульфаниловая кислота Не токсична* N.N-диметил-1,4- фенилен-диамин 2.02 1,4-фенилен-диамин 0.51

Methyl Red 0.99 1.673 Антраниловая кислота Не токсична* N,N-диметил-1,4- фенилен-диамин 2.02 1,4-фенилен-диамин 0.51

* Токсическое воздействие ароматических аминов оценивалось вплоть до концентрации 2 мМ.

Токсичность азокрасителей по отношению к анаэробному илу уменьшается в ряду Methyl Orange, Acid Orange 7, Methyl Red и Acid Orange 6. Как известно из литературы, механизм токсичности ароматических веществ заключается в проникновении последних

в клеточную мембрану и изменении ее свойств, при этом коэффициент распределения ароматических веществ между мембраной и внешней средой сопоставим с коэффициентом распределения в системе октанол/вода. Как видно из табл. 4, наблюдается корреляция между коэффициентом распределения азокрасителей в системе октанол/вода (Log Po/w) из литературных источников и определенными нами значениями IC50 (концентрациями токсиканта, при которых ацетокластическая активность анаэробного консорциума снижается на 50%). При этом было показано, что Methyl Red обладает меньшей токсичностью, чем Methyl Orange, несмотря на одинаковый коэффициент распределения. Этот факт может быть объяснен тем, что сульфоазокрасители по литературным данным являются более токсичными для анаэробных микроорганизмов, чем азокрасители, не имеющие сульфогруппы.

Поскольку причиной токсического воздействия азокрасителей является нарушение клеточных мембран, удаление азокрасителя должно привести к восстановлению свойств мембран и исходной клеточной активности, что и было подтверждено в эксперименте по культивированию анаэробного консорциума в присутствии самого токсичного из четырех исследованных азокрасителей Methyl Orange в концентрации 2 мМ, почти в 10 раз превышающей уровень IC50, с последующим отмыванием анаэробного ила от токсиканта. Таким образом, токсичность азокрасителей при их кратковременном воздействии на анаэробное сообщество микроорганизмов является обратимой.

Сравнение ингибирующего влияния азокрасителей и ароматических аминов, образовавшихся в результате их обесцвечивания, показало (табл. 4), что только два из шести исследованных ароматических аминов, 1-амино-2-нафтол и 1,4-фенилендиамин, оказались более токсичными по отношению к метаногенам анаэробного ила, чем исходные азокрасители. Таким образом, в результате анаэробной обработки растворов, содержащих азокрасители, происходит частичное уменьшение токсичности для анаэробного микробного сообщества.

Биодеградация ароматических аминов в аэробных и анаэробных условиях. Проведенный эксперимент по инкубации ароматических аминов в присутствии активного аэробного ила показал (табл. 5), что только один из шести исследованных ароматических аминов, антраниловая кислота, полностью разложился под действием аэробного консорциума. Сульфаниловая кислота при культивировании в присутствии аэробного микробного сообщества оставалась устойчивой к разложению в течение 25 суток проведения эксперимента, хотя по литературным данным сульфаниловая кислота

разлагается в аэробных условиях. В течение первых часов культивирования 4-аминорезорцина, 1-амино-2-нафтола, М,М-диметил-1,4-фенилендиамина и 1,4-фенилендиамина вместе с аэробным консорциумом наблюдалось образование темного бионеразлагаемого осадка, вызванное, по всей видимости, процессом автоокисления ароматических аминов в растворе, в присутствии кислорода. Поэтому особое внимание было уделено биодеградации таких ароматических аминов в анаэробных условиях.

20 30 40 время, сут

- 4-аминорезориии

31 б Т5

2 5 1 г ^ 4.5 г * I!5

0 10 20 30 Тремя, сут 40 50

! —о—СН4 —антраниловая к-та

Рисунок 13 Минерализация 4-аминорезорцина (а) и антраниловой кислоты (б) анаэробным сообществом микроорганизмов в отсутствии внешних источников азота.

Под действием анаэробного метаногенного ила 4-аминорезорцин, антраниловая кислота и 1-амино-2-нафтол полностью подверглись минерализации с образованием углекислого газа, метана и аммония (табл. 5). Использование минеральной среды, в которой отсутствовали внешние источники азота, для культивирования 4-аминорезорцина, антраниловой кислоты и 1-амино-2-нафтолав присутствии анаэробного метаногенного консорциума привело к различным последствиям для каждого из используемых аминов. С одной стороны, в случае минерализации 4-аминорезорцина и антраниловой кислоты в отсутствии солей аммония значительно сократился лаг-период в начале процессов. По-всей видимости, недостаток аммония стимулировал разложение этих ароматических аминов, в результате которого концентрация аммония в минеральной среде увеличивалась (рис. 13). С другой стороны, в безаммонийной среде разложения 1-амино-2-нафтола не происходило в течение 120 суток культивирования. Из литературы известно, что использование безазотной среды может приводить как к индуцированию, так и к ингибированию минерализации ароматических аминов. Количество образовавшихся метана и аммония было сопоставимо с теоретически рассчитанным по уравнениям 13 и 14 полной минерализации антраниловой кислоты и 4-аминорезорцина.

N1%

ОН

+ 8Н2О -

-5 5СН, + 4 5С0г+№

(12)

,N112

^5H20

3 5СН4+3.500г+КН,

(В)

Х.0"

+ 4Н2Р-

X

• 30^+3002+^3

(14)

КЬН

♦ 4Н;0 + Н* •

. 2.5сн,+э5с02+(Ш<*+н£

(15)

При анаэробном культивировании сульфаниловой кислоты в концентрации 1 мМ после прохождения определенного лаг-периода (25 суток) была достигнута ее 60% конверсия, а затем процесс остановился. Было проведено исследование анаэробного разложения сульфаниловой кислоты в концентрации 0.5 мМ в безаммонийной среде (рис. 14). В условиях проведения эксперимента сократилась длительность лаг-периода в

Рисунок 14. Минерализация сульфаниловой кислоты анаэробным сообществом микроорганизмов в отсутствии внешних источников азота

начале процесса разложения сульфаниловой кислоты, а степень ее минерализации составила 98%. О практически полном разложении сульфаниловой кислоты свидетельствовало также накопление в газовой и жидкой фазе конечных продуктов ее минерализации - метана, сульфида и аммония (уравнение 15).

5 10 15 20 25 30 __треми,суг_

-М^1-димсшл-1,4^|енилвндиаыин

Ц| о

0.4 -0-21

О А * * —*—*л-*

35

3

• 2.3 I I

- 2 й

1.5 ■е.

-■ 1 й

- 0.5

-1- 0

20 40 время, сут

60

- 1,4-фенилендиамин

-N03-

-N02-

Рисунок 15 Конверсия КМ-диметил-1,4-фенилендиамина (а) и 1,4-фенилендиамина (б) в нитратвостанавливающих условиях.

N.N-димети л-1,4-фенилендиамин и 1,4-фенилендиамин оказались устойчивыми к разложению под действием анаэробного ила в течение 360 суток культивирования (табл.5). При этом N.N-диметил-1,4-фенилендиамин не подвергался деметилированию, как это наблюдали в случаях конверсии красителей Methyl Orange и Methyl Red, что может быть связано с токсическим воздействием этого амина, использованного для эксперимента по его биодеградации в более высокой концентрации, чем исходный азокраситель, на микроорганизмы, осуществляющие деметилирование.

Применение сульфатвосстанавливающих условий культивирования не привело к минерализации устойчивых аминов, однако, в нитратвосстанавливающих условиях эти вещества подвергались конверсии, которая, однако, не заканчивалась их минерализацией, а привела к образованию нерастворимых продуктов (рис. 15). Таким образом, при использовании нитратвосстанавливающих условий было достигнуто удаление данных компонентов из водной фазы.

Таблица 5 Биоразлагаемость ароматических аминов.

ароматический амин биодеградация в аэробных условиях биодеградация в анаэробных условиях

в присутствии аммонийной соли без дополнительных источников азота

4-аминорезорцин автоокисление разлагается разлагается

антраниловая кислота разлагается разлагается разлагается

сульфаыиловая кислота пе разлагается разлагается разлагается

1-амино-2-нафтол автоокисление разлагается не разлагается

Ы,Ы-диметил- 1,4-фенилендиамин автоокисление не разлагается не разлагается

1,4-фенилендиамин автоокисление не разлагается не разлагается

Изменение состояния микробного сообщества под действием азокрасителей и ароматических аминов. Если сравнивать морфологические особенности сообществ, изначально адаптированных к компонентам сточной воды пивоваренного производства и инкубируемых с исследуемыми ароматическими субстратами, можно отметить, что при воздействии азокрасителей и ароматических аминов исходная микробная ассоциация подвергалась значительным изменениям. Среди общих черт воздействия как азокрасителей, так и ароматических аминов, можно выделить обеднение состава микробного сообщества, а также увеличение численности некоторых морфотипов,

представленных в исходном сообществе в небольшом количестве. В то же время в сообществах, подвергнутых воздействию азокрасителей, были выявлены корреляции между скоростью обесцвечивания азокрасителей, т.е. временем их воздействия на сообщество, и морфологическим разнообразием сообщества, а также общей численностью клеток. Влияние ароматических аминов на анаэробное сообщество отличалось от влияния азокрасителей, в частности было отмечено снижение общей численности клеток и уменьшение морфологического разнообразия сообщества с увеличением токсичности и ухудшением биоразлагаемосш аминоароматических субстратов.

Выводы

1) Показано, что все исследованные азокрасители полностью обесцвечивались в анаэробных условиях, в ю время как в аэробных условиях разложению подвергался только Methyl Red.

2) Установлено, что анаэробное обесцвечивание азокрасителей осуществляется внеклеточными восстановителями, генерируемыми анаэробными микроорганизмами.

3) Скорость обесцвечивания азокрасителей под действием анаэробного консорциума подчинялась законам кинетики первого (псевдо-первого) порядка. Выявлена линейная корреляция между значением потенциала необратимого пика восстановления азокрасителей и константами псевдо-первого порядка скорости их анаэробного обесцвечивания.

4) Показано, что для всех исследованных азокрасителей константы псевдо-первого порядка скорости их анаэробного обесцвечивания имеют экспоненциальную зависимость от начальной концентрации азокрасителя, гиперболическую (с насыщением) зависимость от концентрации анаэробного инокулята, колоколообразную зависимость от значения pH и Аррениусовскую зависимость от температуры.

5) Установлено, что продуктами восстановления азокрасителей являются сульфаниловая кислота и 4-аминорезорцин - для Acid Orange 6; сульфаниловая кислота и 1-амино-2-нафтол - для Acid Orange 7; N,N-димети л-1,4-фени лен диамин и сульфаниловая кислота - для Methyl Orange; ]Ы,К-диметил-1,4-фенилендиамин и антраниловая кислота - для Methyl Red.

6) Показано, что под действием аэробного консорциума разложению подвергалась только антраниловая кислота, а сульфаниловая кислота оставалась устойчивой. 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол и N,N-димети л-1,4-фенилендиамин претерпевали автоокисление в этих условиях, давая окрашенные полимерные продукты. Напротив, в присутствии анаэробного консорциума 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол, антраниловая и сульфаниловая кислоты были полностью конвертированы в биогаз, в то время как Ы^-диметил-1,4-фенилендиамин остался устойчивым.

7) В присутствии азокрасителей и ароматических аминов анаэробное микробное сообщество подвергалось изменениям, при этом ключевыми факторами, влияющими на морфологическую структуру сообщества, разлагающего ароматический амин, являлись его биоразлагаемость и токсичность, в то время как состояние сообщества, обесцвечивающего азокраситель, зависело только от времени его воздействия на микроорганизмы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Савельева О.В., Емашова Н.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. и Калюжный С.В. Анаэробная биоконверсия аминоароматических соединений // Успехи современной биологии. - 2003. - т. 123, № 4, с. 336-349.

2) Емашова Н.А., Телегина А.Ф., Котова И.Б. и Калюжный С.В Разложение азокрасителей метаногенным консорциумом микроорганизмов // Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», часть 2, 10-14 ноября 2003, Москва, с. 216-217.

3) Yemashova N.A., Telegina A.F., Kotova I.B., Kalyuzhnyi S.V. Degradation of azo dyes by methanogenic sludge // In Biocatalytic Technology and Nanotechnology. Ed.: G.E. Zaikov, Nova Science Publisher. - 2004. - p. 41-50.

4) Емашова H.A., Телегина А.Ф., Котова И.Б., Нетрусов А.И. и Калюжный С.В Конверсия N-замещённых ароматических веществ метаногенным консорциумом микроор1 анизмов // Материалы Всероссийского симпозиума «Биотехнология микробов», 20-23 октября 2004, Москва, С. 28.

5) Yemashova N., Telegina A., Kotova I., Netrusov A. and Kalyuzhnyi S. Decolorization and partial degradation of selected azo dyes by methanogenic sludge // Applied Biochemistry and Biotechnology, - 2004. - V. 119(1), p. 31-40.

6) Емашова H.A. и Калюжный С.В. Анаэробная и аэробная биоконверсия азокрасителей и продуктов их распада // Материалы III Московского международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», часть 2,14-18 марта 2005, Москва, с. 42-43.

7) Yemashova N.A. and Kalyuzhnyi S.V. Conversion of selected azo dyes and aromatic amines by microorganisms // Abstract book of the Eighth International In Situ and On-Site Bioremediation Symposium, 6-9 June 2005, Baltimore, Maryland, USA.

8) Yemashova N. and Kalyuzhnyi S. Microbial conversion of selected azo dyes and their breakdown products // Abstract book of the IWA International Conference Sustainable Development of Chemical industries With the Environment "Waste and Wastewater Management", 14-16 July 2005, Tsukuba&Kashima City, Japan, p. 134-137.

9) Емашова H.A. и Калюжный С.В. Конверсия азокрасителей под действием анаэробных микроорганизмов // Успехи современной биологии. - 2005. - т. 125, № 4, с. 379-389.

10) Емашова Н.А. и Калюжный С.В. Микробная конверсия азокрасителей // Материалы Международной Конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005, Саратов, С. 18

11) Sergey Kalyuzhnyi, Natalia Yemashova and Vyacheslav Fedorovich. Kinetics of anaerobic biodecolourisation of azo dyes // In Proceedings of VIII Latin American Workshop and Symposium on Anaerobic Digestion, 2-5 October 2005, Punta del Este, Uruguay, p. 109-114.

12) Емашова H.A., Телегина А.Ф., Котова И.Б., Калюжный С.В. и Нетрусов А.И. Разрушение азокрасителей и их ароматических производных метаногенными микробными сообществами II Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (памяти акад. РАН Е.Н.Кондратьевой), 21-24 декабря 2005, Москва, С.90.

к исполнению 06/03/2006 Исполнено 07/03/2006

Заказ № 132 Тираж 80 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

JtoOSA

- 53 4t

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Источники загрязнений азокрасителями и ароматическими аминами

3.2. Токсичность азокрасителей и ароматических аминов

3.3. Основные методы удаления азокрасителей и ароматических аминов из 13 сточных вод

3.3.1. Физико-механические методы удаления азокрасителей и 14 ароматических аминов

3.3.2. Химические методы удаления азокрасителей и ароматических 15 аминов

3.3.3. Биологические методы удаления азокрасителей и ароматических 17 аминов

3.4 Биологическое обесцвечивание азокрасителей. Аэробные условия

3.5 Биологическое обесцвечивание азокрасителей. Анаэробные условия

3.5.1. Микроорганизмы, обеспечивающие разложение азокрасителей в 20 анаэробных условиях

3.5.2. Механизмы восстановления азокрасителей в анаэробных 22 условиях

3.5.2.1. Ферментативное восстановление красителей

3.5.2.2. Непрямое биологическое восстановление азокрасителей 24 с помощью окислительно-восстановительных медиаторов

3.5.2.3. Химическое восстановление азокрасителей

3.5.2.4. Непрямое химическое восстановление азокрасителей с 26 помощью окислительно-восстановительных медиаторов

3.5.3. Кинетика обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях

3.5.4. Условия, влияющие на разложение азокрасителей в анаэробных 29 условиях

3.5.4.1. Температура и значение рН

3.5.4.2. Присутствие дополнительных доноров и акцепторов 30 электронов

3.5.4.3. Присутствие окислительно-восстановительных 31 медиаторов

3.6. Биодеградация ароматических аминов в аэробных условиях

3.7. Биодеградация ароматических аминов в анаэробных условиях 33 3.8 Анаэробно/аэробная минерализация азокрасителей

3.8.1. Последовательная анаэробно/аэробная система обработки

3.8.2. Интегрированная анаэробно/аэробная система обработки

3.8.3. Анаэробно/аэробная система обработки в SBR реакторах 39 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Объекты исследования

4.1.1. N-замещенные ароматические субстраты

4.1.2. Источник биомассы 45 4.2 Среды и условия культивирования 45 4.3. Аналитические методы

4.3.1. Спектрофотометрическое определение концентрации 47 ароматических веществ

4.3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

4.3.3. Определение концентрации метана, СО2 и водорода

4.3.4. Определение концентрации летучих жирных кислот и спиртов

4.3.5. Определение концентрации аммония методом Фосетта и Скотта

4.3.6. Определение концентрации нитрат-ионов

4.3.7. Определение концентрации нитрит-ионов

4.3.8. Определение концентрации сульфид-ионов

4.3.9. Определение показателя общего химического потребления 51 кислорода

4.3.10. Определение количества беззольного вещества биомассы

4.3.11. Электрохимические измерения 52 4.4 Микроскопические методы

4.4.1. Световая микроскопия

4.4.2. Сканирующая электронная микроскопия 53 4.5. Условия проведения основных экспериментов

4.5.1. Определение токсичности азокрасителей и ароматических 53 аминов в анаэробных условиях

4.5.2. Определение биоразлагаемости азокрасителей и ароматических 54 аминов под действием анаэробного метаногенного консорциума

4.5.3. Определение возможного восстановления азокрасителей 55 продуктами метаболизма анаэробного метаногенного консорциума

4.5.4. Химическое восстановление азокрасителей под действием 55 сульфида

4.5.5. Химическое восстановление азокрасителей под действием 56 НАДН

4.5.6. Определение биоразлагаемости азокрасителей и ароматических 56 аминов под действием аэробного консорциума

4.5.7. Определение биоразлагаемости азокрасителей под действием аэробного консорциума в анаэробных условиях

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Биоразлагаемость азокрасителей в аэробных условиях

5.2. Токсичность азокрасителей по отношению к анаэробному консорциуму

5.3. Биоразлагаемость азокрасителей в анаэробных условиях

5.4. Механизм обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях

5.5. Факторы, влияющие на скорость восстановления азокрасителей в 74 анаэробных условиях

5.5.1. Электрохимический потенциал восстановления азокрасителей

5.5.2. Окислительно-восстановительный потенциал среды и 77 присутствие ко-субстрата

5.5.3. Концентрация азокрасителя

5.5.4. Концентрация анаэробного инокулята

5.5.5. Температура инкубации

5.5.6. Значение рН

5.6. Влияние азокрасителей на состояние анаэробного микробного 87 сообщества

5.6.1. Морфологические особенности исходного метаногенного 88 сообщества микроорганизмов

5.6.2. Морфологические особенности анаэробного микробного 90 сообщества, разлагающего азокрасители

5.7. Биоразлагаемость ароматических аминов в аэробных условиях

5.8. Токсичность ароматических аминов по отношению к анаэробному 96 консорциуму

5.9. Биоразлагаемость ароматических аминов в анаэробных условиях

5.10. Влияние ароматических аминов на состояние анаэробного микробного 104 сообщества

5.10.1. Морфологические особенности анаэробного микробного 104 сообщества разлагающего, ароматические амииы

5.10.2. Сравнение состояния анаэробных микробных сообществ, 112 разлагающих азокрасители и ароматические амины

6. ВЫВОДЫ

Развитие современной цивилизации влечет как возникновение новых технологий, таки рост народонаселения планеты. Оба этих фактора сопровождаются, в том числе, иувеличением количества отходов, которые сбрасываются в окружающую среду в видесточных вод, газовых выбросов и твердых осадков. Увеличение количества топлива,промышленных химикатов, удобрений, пестицидов, лекарственных средств способствуетулучшению качества жизни всего человечества. Однако образующиеся в результатезагрязнения могут серьёзно повлиять как на животный и растительный мир, так и наздоровье людей.Химическая и нефтехимическая промышленность является основным источникомтоксичных устойчивых к биоразложению загрязнений. Химическое производствоиспользует разнообразное исходное сырье и синтезирует огромное количество продуктовразличной нрироды. Сейчас химическая промышленность производит около 100 тыс.химических веществ, при этом ароматические вещества составляют треть от 91 млн. тосновных химикатов, производимых ежегодно в США [1]. В настоящее время большоевнимание исследователей привлекает влияние на окружающую среду углеводородов ихлорароматических веществ [2-6]. Менее изучены в этом контексте N-замещённыеароматические вещества, которые играют очень важную роль в химическойпромышленности.Азо- и аминозамещённые ароматические соединения широко используются впроизводстве красителей, полимерных материалов, взрывчатых веществ, пестицидов ит.д. [7]. Хотя в сравнении с остальными классами органических соединений азокрасителисоставляют относительно небольщую часть (3-4%) загрязнений [8], понадающих вокружающую среду, существует несколько причин, но которым азокрасители считаютсяонасными поллютантами. Во-нервых, азокрасители и продукты их разложения, взависимости от концентрации и времени воздействия, могут оказывать ярковыраженноетоксичное и/или канцерогенное влияние на живые организмы. Во-вторых, азокраеителиспособны окрашивать сточные воды, что вызывает негативный эстетический эффект(видимость азокрасителей зависит от их цвета, молярного коэффициента поглощения ипрозрачности воды, но в среднем человеческий глаз способен различить нрисутствиеазокрасителя в концентрации до 1 мг-л''). И, в-третьих, азокрасители поглощаютсолнечный свет и тем самым снижают эффективность фотосинтеза водных организмов.Следовательно, соответствующие сточные воды должны быть очищены перед сбросом вприродные водоемы.Недавние исследования подтвердили возможность полной минерализации ряда Nзамещенных ароматических соединений под действием микроорганизмов в анаэробныхусловиях [1, 7, 9, 10]. Однако механизмы биодеградации подобных соединений остаются взначительной степени невыясненными, поэтому в рамках данной работы былиисследованы механизм и кинетические закономерности биодеградации азокрасителей ипродуктов их восстановления (ароматических аминов) в анаэробных условиях. Длясравнения в работе также изучены некоторые закономерности их аэробнойбиодеградации.

6. выводы

1. Показано, что все исследованные азокрасители полностью обесцвечивались в анаэробных условиях, в то время как в аэробных условиях разложению подвергался только Methyl Red.

2. Установлено, что анаэробное обесцвечивание азокрасителей осуществляется внеклеточными восстановителями, генерируемыми анаэробными микроорганизмами.

3. Скорость обесцвечивания азокрасителей под действием анаэробного консорциума подчинялась законам кинетики первого (псевдо-первого) порядка. Выявлена линейная корреляция между значением потенциала необратимого пика восстановления азокрасителей и константами псевдо-первого порядка скорости их анаэробного обесцвечивания.

4. Показано, что для всех исследованных азокрасителей константы псевдо-первого порядка скорости их анаэробного обесцвечивания имеют экспоненциальную зависимость от начальной концентрации азокрасителя, гиперболическую (с насыщением) зависимость от концентрации анаэробного инокулята, колоколообразную зависимость от значения рН и Аррениусовскую зависимость от температуры.

5. Установлено, что продуктами восстановления азокрасителей являются сульфаниловая кислота и 4-аминорезорцин - для Acid Orange 6; сульфаниловая кислота и 1-амино-2-нафтол - для Acid Orange 7; Ы,Ы-диметил-1,4-фенилендиамин и сульфаниловая кислота - для Methyl Orange; Ы,Ы-диметил-1,4-фенилендиамин и антраниловая кислота - для Methyl Red.

6. Показано, что под действием аэробного консорциума разложению подвергалась только антраниловая кислота, а сульфаниловая кислота оставалась устойчивой. 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол и Ы,Ы-диметил-1,4-фенилендиамин претерпевали автоокисление в этих условиях, давая окрашенные полимерные продукты. Напротив, в присутствии анаэробного консорциума 4-аминорезорции, 1-амино-2-нафтол, антраниловая и сульфаниловая кислоты были полностью конвертированы в биогаз, в то время как Ы,Ы-диметил-1,4-фенилендиамин остался устойчивым.

7. В присутствии азокрасителей и ароматических аминов анаэробное микробное сообщество подвергалось изменениям, при этом ключевыми факторами, влияющими на морфологическую структуру сообщества, разлагающего ароматический амин, являлись его биоразлагаемость и токсичность, в то время как состояние сообщества, обесцвечивающего азокраситель, зависело только от времени его воздействия на микроорганизмы.

1. Dutta Т. K. Origin, occurrence and biodegradation of long-side chain alkyl compounds in the environment: a review // Environ. Geochem. Health. 2005. - V. 27. -N. 3.- P. 271-284.

2. Murygina V.P., Markarova M.Y, Kalyuzhnyi S.V. Application of biopreparation "Rhoder" for remediation of oil polluted polar matshy wetland in Komy Republic // Environ. Int. 2005. - V. 31. - N. 2. - P. 163-166.

3. Pieper D.H. Aerobic degradation of polychlorinated biphenyls // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 67.- N. 2. - P. 170-191.

4. Zhang C., Bennett G.N. Biodegradation of xenobiotics by anaerobic bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 67. -N. 5. - P. 600-618.

5. Pinheiro H.M., Touraud E., Thomas O. Aromatic amins from azo dye reduction: status review with emphasis on direct UV spectrophotometric detection in textile industry wastewarers // Dyes and Pigments. 2004. - V. 61. - P. 121-139.

6. Slokar Y. M., Majcen Le Marechal A. Methods of decoloration of textile wastewaters // Dyes and Pigments. 1998. - V. 37. -N. 4. - P. 335-356.

7. Савельева O.B. Разложение аминоароматических соединений метаногенными сообществами. Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: МГУ. 2003. - 23с.

8. Котова И.Б., Савельева О.В., Дьяконова А.Т., Скляр В.И., Калюжный С.В., Стамс А., Нетрусов А.И. Анаэробные микробные сообщества, разлагающие аминоароматические кислоты // Прикл. Биохим. Микробиол. 2005. - Т. 41. - № 4. - С. 422-428.

9. Razo-Flores Е., Donlon В., Lettinga G., Field J. A. Biotransformation and biodegradation of N-substituted aromatics in methanogenic granular sludge // FEMS Microbiol. Rev. 1997. - V. 20. - P. 525-538.

10. Tan N. C. Integrated and Sequential Anaerobic/Aerobic Biodegradation of Azo Dyes. Ph.D. Thesis. Wageningen University, Wageningen, The Netherlands. - 2001. -104 p.

11. Карпов В.В., Белов А.Е. Современное состояние производства и потребления красителей // Рос. Хим. Ж. 2002. - Т. XLVI - № 1. - С. 67-71

12. Гордон П., Грегори П. Органическая химия красителей. М.: Мир - 1987. -344с.15. dos Santos А.В. Reductive decolonisation of dyes by thermophilic anaerobic granular sludge. Ph.D. Thesis. Wageningen University, Wageningen, The Netherlands. -2005. - 176 p.

13. Grimmer G., Dettbarn G., Seidel A., Jacob J. Detection of carcinogenic aromatic amines in the urine of non-smokers // Sci. Tot. Environ.- 2000. V. 247. -P. 81-90.

14. Snyderwine E.G., Sinha R., Felton J.S., Ferguson L.R. Highlights of eight international conference on carcinogenic/mutagenic N-substituted aryl compounds // Mutat. Res. 2002. - V. 506-507.- P. 1-8.

15. Weisburger J.H. A perspective on the history and significance of carcinogenic and mutagenic N-substituted aryl compounds in human health // Mutat. Res. 1997. - V. 376. -P. 261-266.

16. Hildenbrand S., Schmahl F.W., Wodarz R., Kimmel R., Dartsch P.C. Azo dyes and carcinogenic aromatic amines in cell cultures // Int. Arch. Occup. Environ. Health. -1999. V. 72. - N. 3. - P. M52-M56.

17. Matsushita Т., Sakuma S., Nakamuro K., Matsui Yo. The variation of the mutagenicity of CNP during anaerobic biodegradation // Water Res. 2001. - V. 35. - N. 11.-P. 2589-2594.

18. Gottlieb A., Shaw C., Smith A., Wheatley A., Forsythe S. The toxicity of textile reactive azo dyes after hydrolysis and decolourisation // J. Biotechnol. 2003. - V. 101 -P. 49-56.

19. Donlon B.A., Razo-Flores E., Field J.A., Lettinga G. Toxicity of N-substituted aromatics to acetoclastic methanogenic activity in granular sludge // Appl. Environ. Microbiol. 1995.- V. 61.-N. 11.-P. 3889-3893.

20. Kalyuzhnyi S., Sklyar V., Mosolova Т., Kucherenko K., Russkova J., Degtyaryova N. Methanogenic biodegradation of aromatic amines // Water Sci. Technol. 2000. - V. 42. - N. 5-6. - P. 363-370.

21. Ren Sh., Schultz T.W. Identifying the mechanism of aquatic toxicity of selected compounds by hydrophobicity and electrophilicity descriptors // Toxicol. Lett. 2002. -V. 129. - P. 151-160.

22. Sikkema J., de Bond J.A.M., Poolman B. Interaction of cyclic hydrocarbons with biologycal membranes // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - N. 11. - P. 8022-8028.

23. Sikkema J., de Bond J.A.M., Poolman B. Mechanisms of menbrane toxicity of hydrocarbons // Microbiol. Rev. 1995. - V. 59. -N. 2 - P. 201-222.

24. Baughman G. L. Fate of dyes in aquatic systems. Part 3: The role of suspended sediments in adsorption and reaction of acid and direct dyes // Dyes and Pigments. -1995.-V. 27.-N. 3.-P. 197-210.

25. Rao R.A., Ajmal M., Ahmad M., Siddigui B.A. Adsorption behaviour of some aromatic amines on pyrolusite and activated carbon and recovery of beta napthylamine from water sample // Environ. Monit. Assess. 2001. - V. 68. - N. 3. - P. 235-247.

26. Bes-Pia A., Mendoza-Roca J.A. Reuse of wastewater of textile industry after its treatment with a combination of physico-chemical treatment and membrane technologies //Desalination.-2002.-V. 149.N. 1-3.-P. 169-174.

27. Chakraborty S., Purkait M. K. Nanofiltration of textile plant effluent for color removal and reduction in COD // Separation and Purification Technol. 2003. - V. 31. N. 2. - P. 141-151.

28. Burleson G.R., Chambers T.M. Effect of ozonation on the mutagenicity of-carcinogens in aqueous solution // Environ. Mutagen. 1982. - V. 4. - N. 4. - P. 469476.

29. Bolduc L., Anderson W.A. Enhancement of the biodegradability of model wastewater containing recalcitrant or inhibitory chemical compounds by photocatalytic pre-oxidation // Biodegradation. 1997. - V. 8. - N. 4. - P. 237-249.

30. Yoshida Y., Ogata S., Nakamatsu S., Shimamune Т., Kikawa K., Inoue H., Iwakura C. Decoloration of azo dye using atomic hydrogen permeating through a Pt-modified palladized Pd sheet electrode // Electrochimica Acta. 1999. - V. 45. - P. 409414.

31. Nam S., Renganathan V. Non-enzymatic reduction of azo dyes by NADH // Chemosphere. 2000. - V. 40. - P. 351-357.

32. Seguchi К., Iwata M., Machida Т., Tanaka S. Fading of azo dyes with sodium sulphite // JSDC. 2000. - V. 116. - P. 16-22.

33. Zhu C., Wang L., Kong L., Yang X., Wang L., Zheng S., Chen F., MaiZhi F., Zong H. Photocatalytic degradation of azo dyes by supported ТЮ2 + UV in aqueous solution // Chemosphere. 2000. - V. 41. -N. 3. - P. 303-309.

34. Kanazawa H., Onami T. Mechanism of the degradation of Orange G by sodium hypochlorite // Color. Technol. 2001. - V. 117. - P. 323-327.

35. Ledakowicz S., Soleska M., Zylla R. Biodegradation, decolorisation and detoxification of textile wastewater enhanced by advanced oxidation processes // J. Biotechnol. -2001.- V. 89.-P. 175-184.

36. Bechtold Т., Mader C., Mader J. Cathodic decolourization of textile dyebaths: Test with full scale plant // J. App. Electrochem. 2002. - V. 32. - P. 943-950.

37. Antharjanam S., Philip R., Suresh D. Photocatalytic degradation of wastewater pollutants: titanium dioxide mediated degradation of methyl orange and beta-naphthol orange // Ann. Chem. 2003. - V. 93. - N. 9-10. - P. 719-728.

38. Bozzi A, Yuranova T, Lais P, Kiwi J Degradation of industrial waste waters on Fe/C-fabrics. Optimization of the solution parameters during reactor operation // Water Res. 2005. - V. 39. -N. 8. - P. 1441-1450.

39. Isik M., Sponza D. T. A batch kinetic study on decolorization and inhibition of Reactive Blak 5 and direct Brown 2 in an anaerobic mixed culture // Chemosphere. -2004.-V. 55.-P. 119-128.

40. Pearce C.I., Lloyd J.R., Guthrie J.T. The removal of colour from textile wastewater using whole bacterial cells: a review // Dyes and Pigments. 2003. - V. 58. -P. 179-196.

41. Bumpus J.A. Microbial degradation of azo dyes // Prog. Ind. Microbiol. 1995. -V. 32. P. 157-176.

42. McMullan G., Meehan C., Conneely A., Kirby N., Robinson Т., Nigam P., Banat I.M., Marchant R. Microbial decolourisation and degradation of textile dyes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 56. - P. 81-87.

43. Stolz A. Basic and applied aspects in the microbial degradation of azo dyes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 56. - P. 69-80.

44. Knackmuss H.-J. Basic knowledge and perspective of bioelimination of xenobiotic compounds // J. Biotechnol. 1996. - V. 51. - P. 287-295.

45. Chang J.-S., Chou C., Lin Y.-C., Lin P.-J., Ho J.-Y., Hu T.L. Kinetic characteristics of bacterial azo-dye decolorization by Pseudomonas luteola II Water Res. 2001. -V. 35.-N. 12.-P. 2841-2850.

46. Zissi U., Lyberatos G., Pavlou S. Biodegradation of p-aminoazobenzene by Bacillus subtilis under aerobic conditions // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1997. — V. 19.-P. 49-55.

47. Hu T.-L. Color removal ability of a streptomycin resistant decolorizing strain Rhodococcus erythropolis (ATCC 4277.1) // Water Sci. Technol. 2003. - V. 47. - N. 10.-P. 169-174.

48. An S.-Y., Min S.-K., Cha I.-H., Choi Y.-L., Cho Y.-S., Kim C.-H., Lee Y.-C. Decolorization of triphenylmethane and azo dyes by Citrobacter sp. // Biotechnol. Lett. -2002.-V. 24.-P. 1037-1040.

49. Coughlin M.F., Kinkle B.K., Bishop P.L. Degradation of azo dyes containing aminonaphthol by Sphingomonas sp. strain 1CX // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 23.-N. 4-5.-P. 341-346.

50. Zille A., Ramalho P., Tzanov Т., Millward R., Aires V., Cardoso M.H., Ramalho M.T., Gubitz G.M., Cavaco-Paulo A. Predicting dye biodegradation from redox potentials // Biotechnol. Prog. 2004. - V. 20. - P. 1588-1592.

51. Ramalho P.A., Cardoso M.H., Cavaco-Paulo A., Ramalho T. Characterization of azo reduction activity in novel ascomycete yeast strain // Appl. Environ. Microbiol. -2004. V. 70. - N. 4. - P. 2279-2288.

52. Parikh A. Madamwar D. Textile dye decolorisation using cyanobacteria // Biotechnol. Lett. 2005. - V. 27. - N. - 5. - P. 323-326.

53. Dubin P., Wright K. L. Reduction of azo food dyes in cultures of Proteus vulgaris II Xenobiotica. 1975. - V. 5. - N. 9. - P. 563-571.

54. Rafii F., Cerniglia C.E. Comparison of the azoreductase and nitroreductase from Clostririum perfringens //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - N. 6. - P. 17311734.

55. Rafii F., Ruseler J.G.H., van Embden R., Asad Y. F. Azoreductase and nitroreductase activity of bacteria in feces from patients with an ileal reservoir // Degestive Diseases and Sciences. 1997.-V. 42.-N. l.-P. 133-136.

56. Chang J.-S., Kuo T.-S., Chao Y.-P., Ho J.-Y., lin P.-J. Azo dye decolorization with a mutant Escherichia coli strain // Biotechnol. Lett. 2000. - V. 22. - P. 807-812.

57. Russ R., Rau J., Stolz A. The function of cytoplasmic flavin reductases in the reduction of azo dyes by bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - N. 4. -P. 1429-1434.

58. Soozandehfar S. H., Braggr J. L., Martin G. P., Lloyd A. W. Synthesis and bacterial degradation of azopolymer // Int. J. Pharm. 2000. - V. 198. - N. 1. - P. 71-82.

59. Yoo E. S., Libra J., Wiesmann U. Reduction of azo dyes by Desulfovibrio desulfuricans II Water Sci. Technol. 2000. - V. 41. - N. 12. - P. 15-22.

60. Kalyuzhnyi S., Sklyar V. Biomineralization of azo dyes and their breakdown products in anaerobic-aerobic hybrid and UASB reactors // Water Sci. Technol. 2000. -V. 41. - N. 12.-P. 23-30.

61. O'Neill C., Hawkes F.R., Hawkes D.L., Esteves S., Wilcox S. J. Anaerobic-aerobic biotreatment of simulated textile effluent containing varied ratios of starch and azo dye // Water Res. 2000. - V. - 34. - N. 8. - P. 2355-2361.

62. O'Neill C., Lopez A., Esteves S., Hawkes F.R., Hawkes D.L., Wilcox S.J. Azo-dye degradation in anaerobic-aerobic treatment ststem operatiog on simulated textile effluent // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 53. - P. 249-254.

63. Panswad Т., Luangdilok W. Decolorization of reactive dyes with different molecular structures under different environmental conditions // Water Res. 2000. - V. 34.-N. 17.-P. 4177-4184.

64. Yemashova N., Telegina A., Kotova I., Netrusov A., Kalyuzhnyi S.

65. Decolourization and partial degradation of selected azo dyes by methanogenic sludge // Appl. Biochem. Biotechnol. 2004. - V. 119. - N. 1. - P. 31 -40.

66. Rajaguru P., Kalaiselvi K., Palanivel M., Subburam V. Biodegradation of azo dyes in sequential anaerobic-aerobic system // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 54.-P. 268-273.

67. Beydilli M.I., Pavlostathis S.G. Decolorization kinetics of azo dye Reactive Red2 under methanogenic conditions: effect of long-term culture acclimation // Biodegradation. 2005. - V. 16.-P. 135-146.

68. Khehra M.S., Saini H.S., Sharma D.K., Chadha B.S., Chimni S.S. Comparative studies on potential of consortium and constituent pure bacterial isolates to decolorize azo dyes // Water Res. 2005. - V. 39. - N. 20. - P. 5135-5141.

69. Bromley-Challenor K.C.A., Knapp J.S., Zhang N.C., Gray C., Hetheridge M.J., Evans M.R. Decolorization of an azo dye by unacclimated activated sludge under anaerobic conditions // Water Res. 2000. -V. 34. -N. 18. - P. 4410-4418.

70. Lourenco N.D., Novais J.M., Pinheiro H.M. Effect of some operational parameters on textile dye biodegradation in sequential batch reactor // J. Biotechnol. -2001.-V. 89.-P. 163-174.

71. Sponza D., Isik M. Decolorization and inhibition kinetic of Direct Black 38 azo with granulated anaerobic sludge // Enz. Microb. Technol. 2004. - V. 34. - P. 147-158.

72. Yu J., Wang X., Yue P.L. Optimal decolorization and kinetic modeling of synthetic dyes by Pseudomonas strains // Water Res. 2001. - V. 35. - N. 15. - P. 35793586.

73. Isik M., Sponza D.T. Effects of alkalinity and co-substrate on the performance of an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactor through decolorization of Congo Red azo dye // Bioresour. Technol. 2005. - V. 96. - N. 5. - P. 633-643.

74. Chinwetkitvanich S., Tuntoolvest M., Panswad T. Anaerobic decolorization of reactive dye bath effluent by a two-stage UASB system with Tapioca as a co-substrate // Water Res. V. 34. -N. 8. - P. 2223-2232.

75. Bornick H., Eppinger P., Grischek Т., Worch E. Simulation of biological degradation of aromatic amines in river bed sediments // Water Res. 2001. - V. 35. - N. 3,-P. 619-624.

76. Ekici P., Leupold G., Parlar H. Degradability of selected azo dye metabolites in activated sludge systems // Chemosphere. 2001. - V. 44. -N. 4. - P. 721-728.

77. Fuchs K., Schreiner A., Lingens F. Degradation of 2-methylaniline and chlorinated isomers of 2-methylaniline by Rhodococcus rhodochrous strain CTM // J. Gen. Microbiol. -1991. V. 137. - N. 8. - P. 2033-2039.

78. Nishino S.F., Spain J.C. Degradation of nitrobenzene by a Pseudomonas pseudoalcaligenes II Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - N. 8. - P. 2520-2525.

79. Wong P.K., Yuen P.Y. Decolourization and biodegradation of N,N'-dimethyl-p-phenylenediamine by Klebsiella pneumoniae RS-13 and Acetobacter liquefaciens S-l // J. Appl. Microbiol. 1998.-V. 85.-N. 1.-P. 79-87.

80. Stolz A. Degradation of substituted naphthalenesulfonic acids by Sphingomonas xenophaga BN6 // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 23. - N. 4-5. - P. 391-399.

81. Kahng H.-Y., Kukor J.J., Oh K.-H. Characterization of strain HY99, a novel microorganism capable of aerobic and anaerobic degradation of aniline // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 190. - N. 2. - P. 215-221.

82. Нарде Г.К., Пурохит Х.Д. Влияние фазы роста на утилизацию субстрата штаммом Pseudomonas sp. PHI // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. - Т. 38. - № 6. -С. 653-657.

83. Coughlin M.F., Kinkle В.К., Bishop P.L. High performance degradation of azo dye Acid Orange 7 and sulfanilic acid in a laboratory scale reactor after seeding with cultured bacterial strains II Water Res. 2003. - V. 37. - P. 2757-2763.

84. Schnell S., Schink B. Anaerobic degradation of 3-aminobenzoate by a newly isolated sulfate reducer and a methanogenic enrichment culture // Arch. Microbiol. -1992.-V. 158.-N. 4.-P. 328-334.

85. Schink В. Fermentative degradation of nitrogenous aliphatic and aromatic compounds // Proceedings of the 5th International Symposium on Anaerobic Digestion Held in Bologna, Italy. 22-26 May 1988. - P. 459-464.

86. Schnell S., Schink B. Anaerobic aniline degradation via reductive deamination of 4-aminobenzoyl-CoA in Desulfobacterium anilini II Arch. Microbiol. -1991. V. 155. -N.2.-P. 183-190.

87. O'Connor O.W., Young L.Y. Effect of nitrogen limitation on the biodegradability and toxicity of nitro- and aminophenol isomers to methanogenesis // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1993. - V. 25. - N. 2. - P. 285-291.

88. Song В., Palleroni N.J., Haggblom M.M. Description of strain 3CB-1, a genomovar of Thauera aromatica, capable of degrading 3-chlorobenzoate coupled to nitrate reduction // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - V. 50. - N. 2. - P. 551-558.

89. Shinoda Y., Sakai Y., Ue M., Hiraishi A, Kato N. Isolation and characterization of a new denitrifying spirillum capable of anaerobic degradation of phenol // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. -N. 4. - P. 1286-1291.

90. Савельева О.В., Котова И.Б., Скляр В.И., Калюжный С.В., Нетрусов А.И. Выделение штамма Pseudomonas sp. ASA2 из метаногенного сообщества, расщепляющего аминобензоат и аминосалицилат // Микробиология. 2002. - Т. 71. -№2.-С. 281-285.

91. Сиволодский Е.П., Ровнов Н.В., Петров JI.H. Механизм специфической хромогенной реакции Klebsiella spp. на питательной среде с 5-аминосалициловой кислотой // Микробиология. 1994. - Т. 63. - № 3. - С. 489-494.

92. Altenschmidt U., Oswald В., Fuchs G. Purification and characterization of benzoate-coenzyme A ligase and 2-aminobenzoate-coenzyme A ligase from denitrifying Pseudomonas sp .//J. Bacteriol. -1991. V. 173.-N. 17. - P. 5494-5501.

93. Lochmeyer C., Koch J., Fuchs G. Anaerobic degradaton of 2-aminobenzoic acid (anthranilic acid) via benzoyl-coenzyme A (CoA) and cyclohex-l-enecarboxyl-CoA in a denitrifying bacterium //J. Bacteriol. 1992. -V. 174. -N. 11. - P. 3621-3628.

94. Balba M.T., Evans W. Ch. Methanogenic fermentation of the naturally occurring aromatic amino acid by a microbial consortium // Biochem. Soc. Trans. 1980. - V. 8. -P. 625-627.

95. Balba M. Т., Senior E., Nedwell D. B. Anaerobic metabolism of aromatic compounds by microbial association isolated from saltmarsh sediment // Biochem. Soc. Trans. -1981.-V. 9.-P. 230-231.

96. Gilcrease P.C., Murphy V.C. Bioconversion of 2,4-diamino-6-nitrotoluene to a novel metabolite under anoxic and aerobic conditions // Appl. Environ. Microbiol. -1995.-V. 61.-P. 4209-4214.

97. Noguera D.R., Freedman D.L. Reduction and acetilation of 2,4-dinitrotoluene by a Pseudomonas aeruginosa strain 11 Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 22572263.

98. Скляр В.И. Биокаталитические системы получения водорода и метана: Дисс. канд. хим. наук. Фрунзе: Институт Органической Химии АН Киргизской ССР. -1987. - 154с.

99. Fawcett J.K., Scott J.E. A rapid and precise method for the determination of urea //J. Clin Path. 1960.-V. 13.-P. 156-159.

100. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия. - 1984. -448с.

101. Практикум по микробиологии. Под ред. Нетрусова А.И. М.: Изд. Центр «Академия». - 2005. - С. 56-61, 69-73, 88-92.

102. Калюжный С.В. Высокоинтенсивные анаэробные биотехнологии очистки промышленных сточных вод // Катализ в промышленности. 2004. - Т. 6. - С. 4250.

103. Vijaya P.P., Sandhya S. Decolorization and complete degradation of Methyl red by a mixed culture // The Environmentalist. 2003. - V. 23. - P. 145-149.

104. Калюжный C.B., Данилович Д. А., Ножевникова A.H. Анаэробная биологическая очистка сточных вод // Итоги науки и техники. Серия «Биотехнология». М. - 1991. - 156с.

105. Зарубина Н.П. Взаимосвязь между амфифильностью кислотных красителей и их поведением в процессах крашения шерстяного волокна. Автореф. дис. канд. хим. наук. Иваново: Ивановский Государственный Химико-Технологический Университет. - 2004. - 18с.

106. Heider J., Fuchs G. Microbial anaerobic aromatic metabolism // Anaerobe. 1997. -V. 3.-P. 1-22.

107. Hwu C.-S., Lettinga G. Acute toxicity of oleate to acetate-utilizing methanogens in mesophilic and thermophilic anaerobic sludges // Enz. Microb. Technol. 1997. - V. 21.-P. 297-301.

108. Sponza D.T. Rapid granulation and sludge retention for tetrachloroethylene removal in an upflow anaerobic sludge blanket reactor // Biotechnol. Lett. 2001. - V. 23.-P. 1209-1216.

109. Yin C.-R., Seo D.-I., Baek S.-H., Ohlen S.-H., Lee S.-T. Inhibitory affect of chlotinated guaiacols on methanogenic activity of anaerobic degester sludge // Biotechnol. Lett. 2001. -V. 23. - P. 1379-1383.

110. Faria E.C., Brown B.J.T., Snook R.D. Water toxicity monitoring using Vibrio fischeri: a method free of interferences from color and turbidity // J. Environ. Monit. -2004.-V. 6.-P. 97-102.

111. Botsford J.L. A simple assay for toxic chemicals using a bacterial indicator // World J. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 14. - P. 369-376.

112. Sanders W.T.M. Anaerobic hydrolysis during digestion of complex substrates. Ph.D. Thesis. Wageningen University, Wageningen, The Netherlands. - 2001. - 101р.

113. Morales A., Garland J. L., Lim D. V. Survival of potentially pathogenic human-associated bacteria in the rhizosphere of hydroponically grown wheat // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. - V. 20. - P. 155-162.