Разработка биокаталитических систем для синтеза оптически активных веществ и утилизации эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина

Халимова, Лилия Хамитяновна

Разработка биокаталитических систем для синтеза оптически активных веществ и утилизации эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.13 ВАК РФ

Халимова, Лилия Хамитяновна АВТОР

кандидата технических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Уфа МЕСТО ЗАЩИТЫ

2000 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.13 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Разработка биокаталитических систем для синтеза оптически активных веществ и утилизации эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина»

Автореферат диссертации на тему "Разработка биокаталитических систем для синтеза оптически активных веществ и утилизации эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина"

На правах рукописи

5 0,1

ХАЛИМОВА Лилия Хамитяновна

РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЛЯ СИНТЕЗА ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И УТИЛИЗАЦИИ ЭПИХЛОРГИДРИНА И ХЛОРГИДРИНОВ ГЛИЦЕРИНА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата технических наук

Уфа - 2000

Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор В.В. Зорин

кандидат биологических наук, доцент Н.И. Петухова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Чураев Р.Н.

кандидат технических наук Прищепов Ф.А.

Ведущая организация: Башкирский республиканский

экологический центр

Защита состоится б июля 2000 года в 11часов на заседании диссертационного совета К063.09.06 при Уфимском государственном нефтяном техническом университете по адресу: 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1, ауд. 1- 359. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Уфимского государственного нефтяного технического университета

Автореферат разослан 6 июня 2000 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Н.И. Петухова

Д <СО.вЧ?0 /\262,%0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эпихлоргидрин (ЭПХГ) и хлоргидрины глицерина: 1,3-дихлорпропанол-2 (1,3-ДХП), 2,3-дихлорпропанол-1 (2,3-ДХП), З-хлор-1,2-пропандиол (3-ХПД) относятся к токсичным соединениям, которые широко используются в химической промышленности.

Перспективным подходом для детоксикации промышленных выбросов, содержащих эти ксенобиотики, может служить использование локальной биологической очистки с применением специализированных микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованных па инертных носителях.

Основная сложность в реализации такого подхода связана с отсутствием высокоактивных микроорганизмов-деструкторов, устойчивых к высоким концентрациям хлорорганических соединений (ХОС).

Для синтеза таких соединений требуются оптически активные синтоны, с целью получения которых в последние годы интенсивно развиваются биокаталитические методы с применением ферментов и клеток микроорганизмов. В этом плане микроорганизмы-деструкторы ЭПХГ и хлоргидринов глицерина могут служить источником уникальных ферментов, обладающих высокой активностью и стереоселективностью, синтезирующихся в больших количествах.

Наиболее интересными ферментами, участвующими в деградации указанных соединений являются галогидрин-дегалогеназы и эпоксидгидролазы, которые в настоящее время рассматриваются как весьма перспективные инструменты для получения в промышленных масштабах различных оптически активных эпоксидов, вицинальных диолов и галогидринов - важнейших синто-нов ряда биологически активных веществ и жидких кристаллов.

Цслыо работы является поиск микроорганизмов-деструкторов ЭПХГ 1! хлоргидринов глицерина и оценка возможности их использования в биокатализе для синтеза оптически активных продуктов и очистке воды от хлорорганических ксенобиотиков.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов-деструкторов эпихлоргндрина и хлоргидринов глицерина;

• идентификация продуктов метаболизма хлорорганических соединений;

• поиск микроорганизмов для синтеза оптически активных ЭПХГ и 3-ХПД;

• создание консорциума микроорганизмов для обезвреживания хлорорганических соединений в сточной воде;

• исследование очистки иммобилизованным консорциумом модельной сточной воды от ЭПХГ на проточной лабораторной установке;

• оценка возможности использования консорциума микроорганизмов 'для очистки стоков производства эпоксидных смол;

• исследование морфологических, хемотаксономических и физиолого-биохимических свойств практически важных микроорганизмов.

Научная новизна. Выделены новые эффективные ш гаммы-деструкторы ЭПХГ и хлоргидринов глицерина, исследованы пути биодеградации этих ксенобиотиков и получены данные, указывающие на их отличи с от известных путей.

Найдены новые биокатализаторы для синтеза оптически активных эпок-сидов и диолов (в том числе галогенсодержаших), путем разделения их рацемических смесей или трансформацией нрохирального предшественника. Впервые разработаны методы синтеза (R)- и (8)-ЭПХГ, а также (R)- и (8)-3-ХПД путем кинетического разделения рацемических смесей с помощью штаммов Rhodococcus sp. 18-19, Pseudomonas sp. 28-12 и Pseudomonas sp. 31-3, позволяющие получать продукты высокой энантиомерной чистоты (97 и 98 % ее).

Научно обосновано создание консорциума на основе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Microbacterium laevuniformans R27-33, Arthrobacter sp. 22-11 и Nocnrdioides simplex R50-5 для обезвреживания ЭПХГ и хлоргидринов глицерина в промышленных выбросах.

Практическая значимость. Разработаны стереоселективные биокатализаторы (Pseudomonas sp. 31-3, Rhodococcus sp. 18-19 и Pseudomonas sp. 28-12) для получения оптически активных синтонов биологически активных веществ путем кинетического разделения рацемических смесей ЭПХГ и 3-ХПД. С помощью этих микроорганизмов созданы препаративные методы синтеза высокочистых (R)- и (8)-энантиомеров этих соединений (97 - 98 % ее) с выходом более 95 % (в расчете на конвертированный субстрат).

Создан новый эффективный консорциум микроорганизмов на основе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Microbacterium lae-vanifonnans R27-33, Arthrobacter sp. 22-11 и Nocnrdioides simplex R50-5 для очистки сточных вод от эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина.

Разработана установка локальной очистки сточной воды от ЭПХГ с помощью консорциума микроорганизмов, иммобилизованного на поликапроа-мидном носителе. Проведены производственные испытания установки для очистки сточных вод производства эпоксидных смол ОАО "Уфахимпром" от ЭПХГ. Показано, что иммобилизованные микроорганизмы консорциума полностью разрушают ксенобиотик, содержащийся в воле в концентрации до 4 г/л. подвергнутой предварительной нейтрализации до pH 7,0-7,2 и разбавлению в два раза. При этом достигается снижение концентрации сопутствующих веществ (глицерина и хлоргидринов глицерина) на 97.1 % и уровня ХПК воды на 91.3 %.

1999), V международной конференция по интенсификации нефтехимических процессов "Нефтехимия-99" (Нижнекамск, 1999), II Международной конференции молодых ученых "Актуальные тенденции в органическом синтезе на пороге новой эры" (г. Санкт - Петербург, 1999), Международной научно-технической конференции, посвященной 50-летию УГНТУ (Уфа, 1998), Международной научно-практической конференции "Сервис большого города" (Уфа, 1999), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пушимо, 1990), Всероссийской научно-технической конференции "Проблемы нефтегазового комплекса России" (Уфа, 1995), VII Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Екатеринбург, 1997), научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых (Уфа, 1989, 1990, 1994- 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), описание объектов и методов исследования (2 глава), экспериментальную часть и обсуждение результатов (3 глава), выводы и список цитируемой литературы, содержащей 159 ссылок. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит 26 рисунков и 27 таблиц.

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили микроорганизмы-деструкторы хлорорганических соединений (ЭПХГ, 1,3-ДХП, 2,3-ДХП, 3-ХПД). выделенные из природных источников.

Для выделения, выращивания, исследования фнзиолого-биохимических, морфологических и хемотаксономических свойств микроорганизмов и проведения трансформации органических соединений использовались известные микробиологические и биохимические методы. Идентификацию микроорганизмов осуществляли на основании 9 издания "Определителя бактерий Берджи".

Для количественного определения концентраций органических субстратов и продуктов реакции, их идентификации и оценки оптических свойств применяли методы газо-жидкостной хроматографии и хроматомасс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, поляримегрии. При выделении и исследовании ферментов из клеточных экстрактов пользовались методами фракционирования белков осаждением сульфатом аммония, хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, адсорбции на гидроксилапатите, электрофореза в нативных условиях.

Статистическую обработку результатов осуществляли на персональном компьютере с использованием программы Matlab 5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг .микроорганизмов - деструкторов ХОС

Из накопительных культур микроорганизмов, ассимилирующих ЭПХГ, 3-ХПД, 1,3-ДХП или 2,3-ДХП были выделены 137 бактериальных штаммов, способных трансформировать исследуемые ХОС. Наиболее активные штаммы, трансформирующие субстрат более чем на 40 % за время реакции, представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Конверсия ХОС микроорганизмам«

с с Штамм Субстрат те с с Штамм Субстрат

1— 1,3-ДХП ЭПХГ 3-ХПД 2.3-ДХП п. [_ 1,3-ДХП ЭПХГ з-хид 2Л-ДХП

18-21 100 100 100 83,4 15-4 100 100 48.4 -

18-27 100 100 100 72,6 .18-16 100 100 53,1 -

22-1 100 100 100 84,1 20-22 100 100 42.1 -

22-11 100 100 100 98,3 27-10 100 100 52.9 -

27-33 100 100 100 91,4 27-12 100 100 49,8 -

28-1 100 100 100 85,5 > 27-15 100 100 47,4 -

28-21 100 100 100 98,6 30-5 100 100 55.2 -

28-22 100 100 100 79,7 32-1 100 100 49.1 -

30-6 100 100 100 100 32-2 100 100 50.5 -

31-7 100 100 100 100 32-4 100 100 48,3 -

41-4 100 100 100 92,9 32-8 100 100 49.4 -

50-5 100 100 100 93,5 15-41 100 48,3 48.7 -

15-19 100 100 100 - 18-10 100 47,0 48.3 -

16-5 100 100 100 - 18-25 100 45,7 41.4 -

16-32 100 100 100 - > 20-20 100 51,0 46.8 -

18-20 100 100 100 - 20-24 100 46,2 47.2 -

20-2 100 100 100 - 31-3 100 46,5 49.1 -

27-3 100 100 100 - 31-5 100 43,4 49.5 -

27-4 100 100 100 - 18-19 - 50,0 48.8 -

28-9 100 100 100 - > 27-11 - 40,9 49.5 -

41-5 100 100 100 - 28-12 - 47,0 49.2 -

50-20 100 100 100 - 50-1 - - 95.3 -

15-23 100 41,7 100 - 50-3 - - 89.7 -

20-11 100 61,6 100 - > 50-29 - - 93.1 -

г: 20-14 100 57,0 100 - 50-28 - - 97.2 -

20-18 30-3 100 100 40,8 55,3 100 100 - > 20-3 ' - 92,8 - -

Примечание: время реакции в случае ЭПХГ составляло - 3 ч, 3-ХПД и 1,3-ДХП - 12 ч, 2.3-ДХП -24 ч.

В зависимости от субстратной специфичности и полноты конверсии ХОС представленные штаммы подразделяются на 8 групп. Микроорганизмы дв\т< первых групп обладают широкой субстратной специфичностью и способностью полностью трансформировать субстрат. Штаммы последних двух групп проявляют узкую специфичность, но также полностью конвертируют используемые соединения.

Микроорганизмы промежуточных групп (III - VI) осуществляют превращение двух или трех соединений, некоторые из которых трансформируются неполностью. Такими соединениями являются 3-ХПД и ЭПХГ, в молекулах которых имеются хиральные центры.

Изменение условий реакции, как в сторону увеличения ее продолжительности, так и в сторону снижения исходной концентрации субстрата позволило выявить, что штаммы III и IV группы все же способны осуществлять полную конверсию ЭПХГ и 3-ХПД, но делают это более медленно по сравнению со штаммами i и ¡1 группы.

Таблица 2 - Конверсия ЭПХГ и 3-ХПД при повышенной продолжи тельности реакции и различных концентрациях субстратов

Субстрат Субстрат

LT Штамм ЭПХГ. 1 г/л ЭПХГ. 2 г/1 '•ХПЛ. 1 г/л 3-ХПД. 2 г/л с CL U ПЬа.мм ЭПХГ. 1 г/л *)пхг. 3-Х] щ. 1 i/i 3-ХПД. 2 г/л

15-23 100 82,4 - - 32-2 - - 90,2 70,9

20-11 100 94,2 - - > 32-4 - - 83.1 67,4

— 20-14 100 78,5 - - 32-8 - - 95,7 72,8

20-16 100 86,3 - - 15-43 55.2 53.1 51.2 50,5

30-3 98,5 82,1 - - 18-10 51.6 50.8 52.4 52,0

15-4 - - 85.6 65,1 18-25 49,1 48.5 50,7 50,3

18-16 - - 78,7 60.8 > 20-20 50.4 51.6 53.6 53,1

20-22 - - 95,4 73.3 20-24 55,8 54.0 58.0 56,4

> 27-10 - - 88.3 61,4 31-3 50.9 50.5 50,6 50,1

27-12 - - 97.5 78.7 31-5 53.4 53.0 52.0 50,7

27-15 - - 99.1 84,7 18-19 50.5 50.3 50.8 50.0

30-5 - - 98.6 74,9 > 27-11 56.0 58.8 52.2 50.8

32-1 - - 88.5 70,4 1 28-12 50,4 49.2 52.8 51,5

Примечание: продолжительность реакции в случае ЭПХГ составляла - 6 ч. в случае 3-ХПД - 20 ч; прочерк - не проверяли.

В то же время было установлено, что микроорганизмы V и VI групп, сохраняют конверсию, близкую к 50 %, независимо от длительности реакции и начальной концентрации субстрата, что указывает на наличие у них стереосе-лективных ферментов, ответственных за деградацию ЭПХГ и/или 3-ХПД.

2. Исследование продуктов трансформации ХОС микроорганизмами

С целью выявления каталитических возможностей микроорганизмов были изучены продукты подготовительного метаболизма ХОС. Было обнаружено, что за исключением штаммов 50-1 и 50-3 все микроорганизмы осуществляют дегалогенирование субстратов с высвобождением ионов хлора в среду. При этом методом хроматомасс-спектрометрии было установлено, что большинство штаммов трансформирует ХОС в глицерин, используя путь, предполагающий участие эпоксидобразующих галогидрин-дегалогеназ и эпоксидгид-ролаз / \Vijngaard, 1989 /.

CI I CI

OH ^

U-ДХП T IICI

V о

ЭИХГ

н2о

1 L_

IICI

23-ДХП

OH OH

Глицерин

Исключение составили штаммы 20-3, 18-20, 50-20 и микроорганизмы VII группы, в реакционной смеси которых глицерин не обнаруживался. В случае штамма 20-3, способного деградировать ЭПХГ, был выявлен хлорацетон, что указывает на возможность функционирования у него пути, ведущего к образованию ацетона / Small,1995 /.

ЭПХГ Хлорацетон "CI Ацетон

У микроорганизмов VII группы, деградирующих 3-ХПД, обнаружен окислительный путь, в ходе которого субстрат сначала превращается в 3-хлормолочную кислоту через образование карбонилсодержащего соединения (вероятно, 2-окси-З-хлорпропаналя), а затем подвергается дегалогениро-ванию (штаммы 50-19 и 50-28) или окислению (штаммы 50-1 и 50-3) до 3-хлорпировиноградной кислоты.

он

он 3-ХПД

сно

он

2-окси-З-хлор-проланаль

COOH

соон

он

З-хлормолочпая кисло га

З-Хлорпировино-грашал кислота

В случае штаммов 18-20 и 50-20, выявлен путь деградации 1,3-ДХП, предполагающий участие нового фермента, осуществляющего дехлорирование субстрата с образованием не ЭПХГ, а хлорацетона, который уже затем изоме-рнзуется в ЭПХГ. В дальнейшем эпоксид подвергается гидролизу с образованием 3-ХПД, который превращается в уксусную кислоту, по-видимому, при

участии окислительной дегалогепазы, трансформирующей 3-ХПД в уксуснук и муравьиную кислоты / Suzuki, 1992/.

/ CI

он 1,3 -Д XII

HCI

С1

Хлоранетои

СII3С О О Н •*— у к су с п aii кислота

[Hcooi!] IIC1

муравьиная кислота

эпхг

н,о

С1 I он он

3-Х ид

Наиболее интересными с практической точки зрения среди изученных нами микроорганизмов являются глицеринобразующие штаммы. Во-первых, их подготовительный метаболизм позволяет деградировать широкий круг исследуемых ХОС, без образования дополнительных хлорированных продуктов, что важно для очистки промышленных выбросов от этих ксенобиотиков. Во-вторых, в деградации должны принимать участие эиоксидгидролазы и дегало-гепазы, среди которых могут быть стереоселективные ферменты - перспективные биокатализаторы для получения оптически активных эпоксидов и диолов, в частности ЭПХГ и 3-ХПД.

3. Разработка биокатализаторов для синтеза оптически активных веществ путем кинетичекого разделения рацемических смесей

Одним из подходов, широко используемых для получения оптически активных веществ, является кинетическое разделение рацемических смесей с помощью энантиоселективных ферментов, конвертирующих преимущественно один из стереоизомеров субстрата. Исходя из представленных выше результатов можно полагать, что потенциальными биокатализаторами для синтеза оптически активных веществ таким способом мо1ут служить микроорганизмы V и VI групп, для которых характерна кинетика трансформации рацематов ЭПХГ и 3-ХПД, типичная для энантиоселективных ферментов.

С целыо поиска стереоселективных эпоксидгидролаз и дегалогеназ у этих микроорганизмов была исследована их способность трансформировать оптически чистые изомеры ЭПХГ и 3-ХПД. Было установлено, что все штаммы проявляют высокую избирательность к онантиомерам указанных соединений (Рис. 1)

г,

Рисунок 1 - Дегалогеназная (А) и эиоксидгидролазпаи (Б) активность штаммов V и VI групп в отношении эпантиомеров ЭИХГ и

3-хпд

При этом большинство штаммов обнаруживали активность преимущественно с Б-изомерами ХОС, что указьтает на наличие у них исследуемых ферментов Б-типа, и только два штамма (28-12 и 18-19) отдавали предпочтение (11)-изомерам, вероятно, вследствие функционирования ферментов Я-типа. Наиболее активным среди штаммов, обладающих тандемом ферментов Б-типа оказался штамм 31-3, тогда как среди штаммов, синтезирующих ферменты

R-типа в случае трансформации 3-ХПД наибольшую активность показал штамм 18-19, а в случае ЭПХГ два штамма (28-12 и 18-19) проявили высокую активность. В результате морфологических, физиолого-биохимических и хе-мотаксономических исследований штаммы 31-3 и 28-12 были отнесены к роду Pseudomonas, а штамм 18-19 -- к роду Rhodococcus.

При трансформации рацемических смесей 3-ХПД и ЭПХГ покоящимися клетками этих штаммов были получены высокочистые оптически активные продукты, представленные в табл.3.

Таблица 3 - Оптическая чистота и выход продуктов трансформации раце-мнческих смесей 3-ХПД и ЭПХГ_

Штаммы

Остаточный субстрат**

Продукт"

— о

Pseudomonas sp. 28-12

Rhodococcus ! sp. 18-19

Pseudomonas sp. 31-3

Rhodococcus sp. 18-19

Pseiiilomouas sp.31-3

(R,S)-ЭПХГ

(R.S)-ЭПХГ

(R.S)-

эпхг

(R.S)-3-ХПД

енр

(S)-3nxr

CHJC1

V ""

(5)-ЭПХГ

cibci

Cl / OH H OH

(S)-3-Xim

Ън

OH 11

(П)-з-хпд

Cl / OH OH H (Rj-3-ХПД

Cl / . oil

OH II

(Rj-3-ХПД

Cl / . OH H OH

(SJ-3-ХПД

Oll

r.nim:i'iiii

Oll

r.iii iu:i'iiii

Примечание: время реакции составляло в сл\"чае разделения ЭПХГ - 4 ч. а в случае 3-ХПД —12 4:" — выход рассчитан от исходного субстрата: ** - абсолютную конфигурацию соединения определяли по результатам полярнметрии. осноиыиаясь на данных работы .'Suzuki. 199]. 1992 /; прочерк - не проверяли.

При этом достигался высокий выход остаточного изомера субстрата, близкий к 50 %-ному уровню, теоретически возможному для процессов кинетического разделения. В то же время выход оптически активных продуктов в случае разделения ЭПХГ оказался низким из-за быстрого дальнейшего превращения микроорганизмами, а в случае разделения 3-ХПД вместо оптически активного глицидола накапливался продукт его гидролиза - глицерин.

Исследование условий синтеза оптически активного диола путем кинетического разделения рацемического 3-ХПД с помощью Rhodococcus sp. 18-19 и Pseudomonas sp. 31-3 показало, что этот процесс может быть реализован в ростовых условиях с использованием конвертируемого изомера субстрата в качестве единственного источника углерода.

В то же время было установлено, что использование такого ассимиляционного подхода для получения энантиомеров ЭПХГ путем гидролиза его рацемической смеси с помощью штаммов Pseudomonas spp. 31-3 и 28-12 и Rhodococcus sp. 18-19 оказалось нецелесообразным, поскольку рост микроорганизмов ограничивался низкими концентрациями эпоксида (не более 1 г/л). В последнем случае более предпочтительной оказалась трансформация густыми суспензиями покоящихся клеток, позволяющая конвертировать субстрат в концентрации 2 г/л в течение 4-5 циклов.

Осуществлена интенсификация этого процесса, направленная на увеличение выхода продукта реакции. При работе со штаммом Pseudomonas sp. 28-12 было обнаружено, что многократные пересевы его на среды с суслом без добавления ХОС привели к потере им дехлорирующей активности, в то время как эпоксидгидролазная активность сохранилась практически на прежнем уровне.

Потеря микроорганизмами способности деградировать ксенобиотики в результате пересевов на неселективных средах хорошо известна и обычно связана с элиминированием плазмид, детерминирующих ферменты деградации / Hardman,19S6 /. Эта причина наиболее вероятна и в данном случае, поскольку ферменты, ответственные за дегалогенирование галогенсодержащих органических соединений могут детерминироваться плазмидами / Fetzner,1984; \Vijngaard,1989 /.

С целью блокирования процесса деградации оптически активного 3-ХГ1Д штаммами Pseudomonas sp. 31-3 и Rhodococcus sp. 18-19 была осуществлена обработка клеток акридиновым оранжевым, способным вызывать элиминирование плазмид у бактерий. В результате этого был получен вариант штамма Pseudomonas sp. 31-3, лишенный 3-ХПД-дегалогеназной активности, но сохранивший эпоксидгидролазную активность.

Установлено, что с помощью модифицированных биокатализаторов Pseudomonas sp. 28-12 и Pseudomonas sp. 31-3 путем трансформации рацемического ЭПХГ можно получать наряд}' с оптически активным остаточным субстратом также и (R)- и (5)-3-ХПД с выходом близким к теоретически возможному (более 48 %).

4. Разработка биокатализаторов для синтеза оптически агстивных веществ из прохнральиых соединений

Более эффективным способом получения оптически активных синтонов по сравнению с кинетическим разделением рацемических смесей является биотрансформация прохиральных предшественников, позволяющая синтезировать продукт со 100 % теоретическим выходом.

Изучение кинетики синтеза продуктов трансформации прохирального 1,3-ДХП штаммами I - V группы, способными конвертировать это соединение, показало, что в этом случае у 17 штаммов образуется 3-ХПД с выходом, превышающим 50 % уровень, свойственный процессам кинетического разделения. Это обусловило поиск стереоселективных биокатализаторов для синтеза оптически активного 3-ХПД из 1,3-ДХП среди этих штаммов.

Исследование оптических свойств препаратов 3-ХПД, полученных из 1,3-ДХП с помощью этих микроорганизмов, показало, что многие штаммы образуют рацемический продукт, и только 7 штаммов, представленных в табл. 4, синтезируют оптически активный диол. Однако, следует отметить, что качество образующихся продуктов не соответствует требованиям, предъявляемым к современным оптически активным синтонам биологически активных веществ.

Таблица 4 - Характеристика препаратов 3-ХПД, синтезированных био-

трансформацией 1,3-ДХП

Штаммы Максимальный выход 3-ХПД. % Оптическая чистота 3-ХПД, % ее Конфигурация Содержание основного энантио.чера,%

18-21 62 46,2 Я 73.1

18-27 68 32.6 Э 66,3

28-22 67 58,7 Я 79.3

28-9 66 68.6 я 84.3

15-4 86 82.8 я 91,4

20-22 82 64.2 я 82,1

27-12 80 56.4 Б 78.2

Причиной низкой энантомерной чистоты продуктов трансформации 1,3-ДХП может служить наличие у микроорганизмов-трансформаторов изо-ферментов, отличающихся друг от друга стереоселсктивностью / Х'акагпига, 1992 /. Для получения высокочистых продуктов на базе генов высокостереосе-лективных ферменов могут быть созданы эффективные рекомбинантные биокатализаторы/ К'акатига, 1994 /.

В связи с этим был осуществлен поиск изофермептов у наиболее эффективного штамма 15-4, идентифицированного как АгИ/гоЬис/ег 5р. При фракционировании клеточных экстрактов этого штамма в соответствии со схемой, представленной в таблице 5, на стадии хроматографии белковых препаратов на ДЕАЕ-целлюлозе в ступенчатом градиенте сульфата аммония были выявлены две фракции (Е, и Е;), осуществляющие дегалогсиирование 1,3-ДХП с образованием ЭПХГ (Рис. 2).

Таблица - 5 Результаты фракционирования экстракта клеток Ап11гоЬас1ег ¡р. 15-4_■ _

Стадии о К 1 Гч £ а . Н Г- А А 5 Н РЗ о , 2 е г § £ ~ к - о

выделения - фракция Н О ю чг, О о 1 I 3 £ ^ 4 р о >. § а V — Н у О О

Клеточный экстракт 300,0 47,9 0,16 100 1

Фракционирование сульфатом аммо-

ния -фракция при 45-60% от насы-

щения (N114)2804 117,1 45,5 0,39 95,0 2,4

Хроматография на Д£4Е-целлюлозе:

- фракция Е: 17,7 7,7 0,44 16,1 2,8

- фракция Е2 11,4 6,86 0,66 14,3 3,8

Адсорбция ; на гидроксилапатнтс

фракции Е1—лрепарат 1 ' 0,33 2,77 8,4 5,8 52,5

Адсорбция на гндроксилапатите

фракции Е: - препарат 2 '■ 0,68 0,74 1,09 1,54 6,8

Путем дополнительной очистки фракций адсорбцией на гидроксилапа-тите были получены два препарата, которые в условиях нативного электрофореза характеризовались различными коэффициентами подвижности (К] = 0,53 иК2=0,86).

60 80 100 120 140 160 . Номер фракции

Рисунок 2 - Профиль элюировапня белкои Ап11го!>ас1ег 15-4 на О ЕЛ Е-11 ел л юл о > с

Полученные данные позволяют рассматривать штамм ЛгМгоЬаМег 5/7. 15-4 как потенциальный источник генов ферментов, ответственных за трансформацию 1,3-ДХП, для клонирования с целью создания высокостерео-

селективных рекомбинантных биокатализаторов. Однако пока неясно, какой из ферментов обладает нужной селективностью, поскольку получить этот ответ на ферментном уровне не представляется возможным, вследствие быстрой инактивации фермента в процессе реакции in vitro, возможно из-за накопления эпоксида в реакционной смеси.

5. Создание консорциума для обезвреживания ХОС

Для решения проблемы детоксикации ЭПХГ и хлоргидринов глицерина в выбросах промышленных предприятий был создан консорциум микроорганизмов на базе глицеринобразующих штаммов I и II групп, способных ассимилировать ХОС в минеральной среде в отсутствии органических факторов роста. В качестве компонентов консорциума отбирались штаммы, обладающие наибольшей устойчивостью и обезвреживающей активностью в отношении исследуемых ксенобиотиков, способные иммобилизоваться на поликапроа-мидном носителе.

5.1. Селекция штаммов, устойчивых к повышенным

концентрациям ХОС

Устойчивость штаммов к высоким концентрациям ксенобиотиков является важным критерием при выборе микроорганизмов для использования в процессах биоочистки. Это позволяет не только снизить затраты на разбавление стоков, но и противостоять залповым выбросам, которые могут привести к гибели неустойчивой микрофлоры в реакторе.

Исследование способности микроорганизмов расти на рыбном агаре в присутствии ХОС позволило выявить 11 штаммов, выдерживающих концентрации ксенобиотиков не менее 2 г/л (Табл. 6).

Таблица 6 - Рост микроорганизмов на рыбном агаре с ХОС

Штамм Концентрация г/л 1,3-дхп, Концентрация ЭПХГ. г/л Концентрация 2,3-г/л ДХП,

1 2 I 3 5 7 1 1 1 3 5 " 1 1 2 3 1 4 1 5

27-33 4 4 4 1 0 4 4 4 1 0 4 4 1 0 -

28-21 4 4 з -> 0 4 4 4 4 0 4 4 2 0 -

41-4 4 4 3 2 0 4 4 4 3 0 4 3 0 0 -

28-22 4 4 3 2 0 4 4 4 4 0 4 3 1 0 -

50-5 4 3 ? 0 - 4 3 2 0 0 4 4 0 0 -

27-3 4 3 2 1 0 4 4 3 2 0 4 2 0 0 -

22-11 з 2 1 - 4 3 3 1 0 4 3 2 0 -

22-1 3 3 3 0 - 3 3 3 0 - 3 2 1 0 -

28-1 3 2 1 0 - 4 3 2 2 0 3 2 0 - -

2S-9 3 2 1 0 - 3 1 0 - 3 2 0 0 -

18-21 3 -> 1 0 - 3 2 1 0 - 3 1 0 - -

R27-33 4 4 4 4 1 4 4 4 4 1 4 4 3 1 0

R50-5 4 4 3 2 0 4 4 3 2 0 4 4 3 1 0

R18-21 3 3 3 2 0 3 3 3 2 0 3 2 1 Q -

Примечание: 0 - отсутствие роста; 1 - слабый рост; 2 - средний рост; 3 - хороший рост; 4 - обильный рост: прочерк - не проверяли

Путем выращивания микроорганизмов на градиентном агаре с ЭПХГ в качестве мутагена и фактора селекции были получены Я-варианты штаммов 50-5, 27-33, 18-21, обладающие повышенной устойчивостью к ХОС (Табл. 6). При этом наиболее резистентный штамм 1127-33 проявлял способность расти в присутствии 7 г/л ЭПХГ или 1,3-ДХП и 4 г/л 2,3-ДХП.

5.2 Оценка обезвреживающей активности микроорганизмов

Скорость обезвреживания ксенобиотиков в значительной степени определяет эффективность биоочистки промышленных выбросов. В случае га-логенсодержащих органических соединений основной стадией детоксикации является дегалогенирование ксенобиотика, а в случае ЭПХГ важнейшей из обезвреживающих стадий является гидролиз эпоксидного кольца.

Определение эпоксидгидролазной активности устойчивых штаммов в отношении ЭПХГ и глицидола показало, что наиболее активным в случае ЭПХГ является штамм 28-21, а в случае глицидола - штамм 1150-5 (Рис. 3).

Рисунок 3 - Эпоксндгндролазная активность устойчивых микроорганизмов

В результате исследования дегалогенирования ХОС устойчивыми микроорганизмами было установлено, что все штаммы могут полностью дехлорировать ксенобиотики, о чем свидетельствует 100 % выход ионов хлора (от теоретически возможного). Оценка дехлорирующей активности этих штаммов в отношении тех ХОС, биодеградация которых начинается со стадии дегалогенирования, показала, что наибольшую активность с 1,3-ДХП проявляет штамм 28-1, с 3-ХПД - штамм 28-21, а с 2,3-ДХП - штамм 22-11 (Рис 4).

Рисунок 4 - Дегалогеназиая активность устойчивых микроорганизмов

На основании полученных результатов были отобраны 5 штаммов, которые были идентифицированы как Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Nocardioidcs simplex R50-5. Arthrobacter sp. 22-11 и Microbacterium laevaniformans R27-33.

В результате исследования антагонистических свойств микроорганизмов было установлено, что они не подавляют рост друг друга и, следовательно, могут быть использованы в смешанной культуре.

Испытания штаммов на гттогенность показали, что они не обладают патогенными для человека и животных свойствами.

5.3. Исследование иммобилизации микроорганизмов па полпкапроамндных волокнах

При работе в непрерывных условиях для обеспечения эффективной работы реактора необходимо создать высокую концентрацию клеток, что может быть достигнуто иммобилизацией микроорганизмов на поверхности твердого носителя. Перспективными носителями являются поликапроамидные волокна которые можно размещать в реакторе, натягивая на различные каркасы или формируя пакеты / Гвоздяк, 1985 /.

Исследование кинетики сорбции микроорганизмов при концентрации живых клеток в контактной суспензии (5-8 х10' кл/мл) показало, что все штаммы могут сорбироваться на поликапроамидном волокне (Рис. 5).

100 Время, мин

150

200

—*— Nocardioides simplex R50-5

-в- Arthrobacter sp. 22-11

--Pseudomonas sp.

28-21

—Pseudomonas sp. 28-1

—Microbacterium lacvaniformans R27-33

Рисунок 5 - Кинетика адгезии микроорганизмов на полнкапроамидиом волокне

При этом основная часть биомассы иммобилизуется за 10-20 мин контакта с носителем. Далбе процесс замедляется и максимальное заполнение клетками поверхности носителя наступает после 100 мин адгезиии. Наибольшая концентрация иммобилизованной биомассы, в этих условиях достигает 8-10 мг/г.

6. Исследование условий очистки модельных стоков, содержащих ЭПХГ

Созданный консорциум микроорганизмов был апробирован в процессах очистки модельных от ЭПХГ - наиболее токсичного из исследуемых соединений - на лабораторной установке непрерывного действия, основным узлом которой являлся десятисекционный проточный биореактор с рабочим объемом 6 л (Рис. 6).

Исследование влияния концентрации ЭПХГ на работу реактора при скорости разбавления 0,04 ч"1 показало, что очистка может быть эффективно реализована только в области концентраций ксенобиотика в неочищенном стоке до 2 г/л (Рис. 7). При этом в случае концентрации ЭПХГ 0,75 г/л, он уже не обнаруживается в пятой секции, тогда как в случае начальной концентрации 1,5 и 2,0 г/л ЭПХГ отсутствует соответственно в 7 и 9 секциях. При концентрации ЭПХГ 2,5 г/л и выше биореактор не успевает полностью деградировать это соединение.

в канализацию

Iii - емкость для по/шчи питательных солей; Ег - емкость для подачи воды; К; - емкость для приема очищенной сточной воды; К-1 компрессор; Н-1, Н-2, Н-3 - насосы, Ф- фильтр.

Рисунок 6 - Схема лабораторной установки очистки сточных вод

Изучение зависимости деградации ЭПХГ в реакторе от скорости разбавления позволило выявить, что увеличение скорости подачи воды до 0,05 - 0,06 ч приводит к ускорению очистки стока. Об этом свидетельствует тот факт, что при данной скорости разбавления ЭПХГ отсутствует уже в третьей секции, тогда как при исходном коэффициенте разбавления степень деструкции в этой секции не превышает 54,3% (Рис. 8). Однако дальнейшее увеличение скорости потока приводит к замедлению деградации ЭПХГ.

Для оценки эффективности обезвреживания модельных сточных вод от ЭПХГ в оптимальном режиме (начальная концентрация ксенобиотика -2,0 г/л, скорость разбавления 0,06 ч"1) было сопоставлено токсическое действие неочищенной и очищенной воды на активный ил очистных сооружений МП "Уфаводоканал". Токсичность воды оценивали по изменению дегидрогс-назной активности ила по сравнению с контрольным вариантом (дистиллированная вода).

3,5л

X 3- /

с т 2,5-

к 5 ^ 2- X /

5 н 1,5- л\

й 1- 'Щ

'X 0,50-

СЧ'КИШ)

Исходили копненIранни ОПХГ: □ 0,75 г/л □ 1,5 г/л 02,0 г/.. 02,5 1/.1 Ш,26 г/л

Рисунок 7 — Профиль концентраций )П\Г в реакторе при различном его содержании в стоке

Рисунок 8 - Распределение концентраций ЭПХГ по секциям реакюра при различных скоростях разбавления

Как видно из результатов, представленных в табл. 7, неочищенная вода, содержащая 2,0 г/л ЭПХГ, полностью подавляет активность неадаптированного к этому соединению активного ила, тогда как очищенная вода, не содержащая ЭПХГ, ингибирует данную активность только на 42 %.

Таблица 7 - Влияние модельного стока на дегилрогеназпую активность активного ила

Модельный сток Относительная дегиярогеназпая активность, % Расход свежей поды для детоксикации 1 л стока, л

Неочищенный 0 1274

Очищенный 58 1,0

Контроль(дистил- 100 -

лированная вода)

Установлено, что для полной детоксикации очищенной воды, позволяющей полностью восстановить дегидрогеназную активность ила, требуется разведение свежей водой в 2 раза, тогда как для полного снятия токсического действия неочищенной воды требуется разведение в 1275 раз. Таким образом, использование консорциума микроорганизмов для полного обезвреживания сточных вод, содержащих 2 г/л ЭПХГ, позволит сэкономить более 1200 л свежей воды в расчете на 1л неочищенного стока.

7. Исследование работы биофильтра

Использование аэрации в процессе очистки стоков от эпихлоргидрина приводит к загрязнению ксенобиотиком воздуха, выходящего из реактора. Установлено, что в отсутствие микроорганизмов в реакторе и биофильтре при пропускании через установку модельной сточной воды, содержащей 2 г/л ЭПХГ, при скорости разбавления 0,06 ч"' за 10 ч улетучивалось около 1,2 г ксенобиотика. В присутствии микроорганизмов в реакторе этот уровень существенно снижался (до 0,26 г), вследствие быстрой деградации ЭПХГ в первых секциях реактора. При наличии активной биопленки микроорганизмов на биофильтре эпихлоргидрин в ловушке не обнаруживался.

8. Исследование очистки сточных под производства эпоксидных

смол

Исследована очистка сточных вод, образующихся при производстве эпоксидных смол на ОАО "Уфахимпром" на стадии промывки продукта.

Установлено, что в отличие от модельной воды, реальные стоки должны пройти предварительную предобработку, поскольку имеют высокий показатель рН (10-12), а также содержат сопутствующие вещества (хлористый натрий - 100 -120 г/л, глицерин и хлоргидрины глицерина - 10,0 - 10,5 г/л,

толуол - 0,2 - 0,25 г/л, дифенилолпропан - 0,07 - 0,1 г/л), которые могут снижать эффективность работы консорциума. Предобработка включает нейтрализацию воды до рН 7,2 - 7,4 и разбавление минеральной средой или водой, не содержащей токсические соединения, в два раза. Показано, что при этой кратности разбавления сопутствующие вещества не оказывают ингибируюндего действия на рост и деградацию ЭПХГ консорциумом микроорганизмов.

Анализ качества воды, прошедшей очистку на лабораторной установке показал, что данный консорциум микроорганизмов может быть использован для обезвреживания стоков, содержащих до 4 г/л ЭПХГ (Табл. 8).

Таблица 8 - Результаты очистки сточной воды на

лабораторной установке

Показатели Сточные воды Степень очистки.%

Неочищенные ] (неразбавленные) Очищенные

ЭПХГ', г/л 4,0 0 100

ХПК, г/л 73,48 6,4 91,3

Глицерин, г/л ¡0.0 0,35 96.5

Относительная

де гидрогеназная .■0 100 -

а гивность ила*, %

Примечание: * - адаптированный активный ил очистных сооружений ОАО "Уфахим-

про.ч"

В результате очистки полностью разрушается ЭПХГ, более чем на 90 % снижается ХПК сточной воды и содержание глицерина, а также полностью снимается токсическое действие стока на дегидрогеназную активность ила очистных сооружений ОАО "Уфахимпром".

Выводы

!. Из природных источников выделены и идентифицированы штаммы Pseudomonas spp. 31-3, 28-12, 28-1, 28-21, Rhodococcus sp. 18-19, iVocardioides simplex 50-5, Arthrobacter spp. 22-11, 15-4, Microbucteriiini laevaiti-formans 27-33 способные деградировать эпихлоргидрин и хлоргидрины глицерина. Показано, что в ходе подготовительного метаболизма этих штаммов ХОС превращаются в глицерин.

2. Установлено, что деградация 3-ХПД штаммами Pseudomonas sp. 28-12, Pseudomonas sp. 31-3 и Rhodococcus sp. 18-19 осуществляется с помощью стереоселективной 3-ХПД-дегалогеназы. Показана возможность получения высокочистых энантиомеров (S)- или (И)-З-ХПД (более 97 % ее) путем кинетического разделения рацемической смеси этого соединения с помощью клеток микроорганизмов.

3. Выявлено, что штаммы Pseudomonas sp. 28-12, Pseudomonas sp. 31-3 и R/todococcus sp. 18-19 осуществляют стереоселективный гидролиз ЭПХГ с образованием оптически активных соединений - остаточного энантиомера (R)- или ($)-эпоксида и (R)- или (5)-3-ХГ1Д соответственно. Показано, что дикие штамм),I катализируют синтез диола с низким выходом, вследствие дальнейшей конверсии этого соединения. Получены мутанты бактерий Pseudomonas sp. 31-3 и Pseudomonas sp. 28-12, потерявшие способность дехлорировать 3-ХПД, синтезирующие (И)-З-ХПД из ЭПХГ с выходом, близким к теоретически возможному.

4. Обнаружено, что штамм Arthrobacter sp. 15-4, трансформируют про-хиратьный 1,3-ДХП в 3-ХПД, содержащий около 91 % (К)-изомера. Показано, что в клетках этого штамма присутствуют два фермента с 1,3-ДХП-дегалогеназной активностью, что может служить причиной снижения чистоты получающегося продукта.

5. Установлено, что штаммы Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21. Л'ocardioides simplex 50-5, Arthrobacter sp. 22-11, Microbacterium laevaniformans 27-33 проявляют высокую эпоксидгидролазную и дегалогеназ-ную активность и устойчивость к ХОС и способны полностью их деградировать. Осуществлена селекция штаммов Nocardioides simplex R50-5, Microbacterium laevaniformans R27-33, обладающих сверхустойчивостью к ХОС. Показана способность микроорганизмов иммобилизоваться на поликапроамид-ных волокнах, достигая концентрации 8-10 мг(асв) на грамм носителя.

6. IIa базе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, JWocardioitlcs simplex R50-5, Arthrobacter sp. 22-11, Microbacterium laevaniformans R27-33. создан консорциум для детоксикации ЭПХГ и хлоргидринов глицерина в промышленных выбросах. Определены условия очистки модельного стока, содержащего ЭПХГ, на лабораторной установке с помощью иммобилизованною консорциума. Показано, что эффективная детоксикания стока достигается при концентрации ксенобиотика не более 2 г/л и скорости разбавления 0.05 - 0,06 ч"1.

7. Установлено, что микроорганизмы консорциума способны расти и деградировать ЭПХГ даже в условиях высоких концентраций хлористого натрия (60 г/л) в присутствии глицерина (5,0 г/л), толуола (0,1 г/л) и дифенилол-пропана (0.05 г/л).

8. Показана возможность использования иммобилизоБй-шого консорциума для локальной очистки сточных вод производства эпоксидных смол, содержащих до 4 мг/л ЭПХГ.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. Хатимова Л.Х., Петухова H.H. Дегалогеназная активность бактерий, деградирующих хлорорганические соединения // Тез. докл. научн.-техн. конф. "Химия, нефтехимия и нефтепереработка" - Уфа, 1989. - с. 86.

2. Халимова Л.Х., Петухова Н.И. Бактериальная деструкция эпихлоргид-рина и хлоргидринов глицерина // Тез. докл. всесоюзн. конф."Новые направления биотехнологии"- Пущино,1990. - с.139-140.

3. Халимова JI.X., Лысова O.A., Петухова Н.И. Подготовительный метаболизм утилизации эпихлоргидрина // Тез. докл. научи.-техн. конф. "Химия, нефтехимия и нефтепереработка" - Уфа, 1990. - с.39.

4. Кулдавлетова Э.В., Халимова JI.X., Петухова Н.И. Генетический контроль деградации эпихлоргидрина // Тез. докл.. научн.-техн. конф. "Химия, нефтехимия и нефтепереработка" - Уфа, 1990.- с.47.

5. Шамакина Н.В., Кузолова Е.В., Халимова Л.Х., Петухова Н.И. Утилизация эпихлоргидрина смешанной культурой бактерий // Тез. докл. респ. конф. "Химия, нефтехимия и нефтепереработка" - Уфа, 1990.-с.53.

6. Петухова Н.И., Халимова Л.Х. Микробиологическая детоксикация эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина // Тез. докл. межд. симп. "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и северного Прикаспия" - Оренбург,! 991,- с. 124.

7. Халимова Л.Х., Лысова O.A., Петухова Н.И. Микробиологическая деградация эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина // Сб. статей БНЦ УрО АН СССР "Основные направления биотехнологии в решении народнохозяйственных задач" - Уфа, 1991- с. 93-102.

8. Петухова Н.И.,"Халимова Л.Х, Зорин В.В. Биодеградация хлорорга-нических ксенобиотиков, содержащихся в промышленных стоках нефтехимических производств // Тез. докл. всеросс. научн.-техн. конф. "Проблемы нефтегазового комплекса России" - Уфа, 1995.- С. 214.

9. Петухова Н.И., Халимова Л.Х., Зорин В.В. Консорциум микроорганизмов для очистки сточных вод от а-дихлоргидрина глицерина // Тез. докл. межд. научн.-техн. конф."Проблемы нефтегазового комплекса России" -Уфа, 1998 - т.2. - с.48-49.

10. Зямилева U.C., Халимова Л.Х., Петухова H.H., Зорин В.В. Поиск штаммов, утилизирующих 2,3-дихлорпропанол // Тез. докл. межд. научн.-практ. конф. "Сервис большого города", УТИС -Уфа, 1999. - с. 106.

11. Петухова H.H., Халимова Л.Х., Зорин В.В. Некоторые подходы к биодеградации опасных хлорорганических экотоксикантов // Тез. докл. V межд. конф. "Нефтехимия-99" - Нижнекамск, 1999.-т. 1 - с.258-259.

12. Галеева A.C., Глейх И.Г., Халимова Л.Х., Петухова Н.И. Трансформация эпихлоргидрина иммобилизованными клетками бактерий // Тез. докл. научн.-техн. конф. "Химия, нефтехимия и нефтепереработка" - Уфа, 1990. - с. 42.

13. Завесина Ю.М., Халимова Л.Х., Петухова Н.И. Биотрансформация функционально замещенных эпоксидов // Тез. докл.. 45 научн.-техн. конф. -Уфа, 1994 - с.71.

14. Саранова Л.В., Халимова Л.Х., Петухова Н.И. Окисление диолов микроорганизмами //Тез. докл.45 научн.-техн.конф.-Уфа, 1994-с. 69.

15. Яцык Н.В., Зинпурова Г.Д., Халимова JI.X., Петухова Н.И. Исследование условий биотрансформации эпихлоргидрина в 3-хлорпропандиол. // Тез. докл.46 научн.-техн. конф. - Уфа, 1995. - с. 179.

16. Петухова Н.И., Халимова Л.Х., Зорин В.В. Микробиологическая трансформация хлоргидринов глицерина с целью получения оптически активных соединений // Тез. докл.46 научи.-техн. конф. - Уфа,1995. - с.181.

17. Халимова Л.Х, Петухова Н.И., Зорин B.R. Биотрансформация эпихлоргидрина и 1,3-дихлоргидрина глицерина в оптически активные синтоны низкомолекулярных биорегуляторов // Тез. докл. всеросс. науч.-техн. копф. "Проблемы нефтегазового комплекса России"-Уфа, 1995,- с. 213.

18. Пруцких О.Г., Баджугинов A.B., Халимова Л.Х., Петухова Н.И. Регуляция синтеза галогидрингидроген-голидлиазы и эпоксидгидролазы у микроорганизмов-трансформаторов 1,3-дихлоргидрина глицерина // Тез. докл. 47 научн.-техн. конф. - Уфа,1996. -с.115-] 16.

19. Сафарова Г.О., Сафина P.C., Халимова Л.Х.., Петухова Н.И. Выделение и исследование свойств эпоксидгидролазы из Arthrobacter sp. штамм ПХ20 // Тез. докл. 47 научн.-техн. конф. - Уфа, 1996 - с.116.

20. Халимова Л.Х., Зайцев С.К., Коновалов A.A., Петухова Н.И. Биохимический синтез оптически активного глицидола // Тез. докл. VII всеросс. научи. конф."Проблемы теоретической и экспериментальной химии" - Екатеринбург, 1997,- с.151

21. Петухова Н.И., Халимова Л.Х., Лысухин A.B., Митрофанов Д.В. Файфер Л.В., Зорин В.В. Новый подход к синтезу D-3-хлормолочной кислоты микробиологической трансформацией 2,3-дихлорпропанола-1 // Тез. докл. XII межд.. конф."Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии"- Москва-Уфа, 1999. - с.68.

22. Митрофанов Д.В., Халимова Л.Х., Петухова Н.И., Зорин В.В. Скрининг новых бактериальных эшжсндгидролаз для кинетического растепления эпихлоргидрина // II межд. конф. "Актуальные тенденции в органическом синтезе на пороге повой эры" - Санкт-Петербург, 1999,- с. 1 76

23. Петухова Н.И., Халимова Л.Х., Зорин В.В. Исследование эпоксид-гидролазной активности почвенных микроорганизмов //Материалы XII межд. конф." Перспективные процессы и продукты малотоннажной химии" - Москва-Уфа. 1999,-с. 131-136

Соискатель

Халимова Л.Х.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата технических наук, Халимова, Лилия Хамитяновна

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Экологический и биокаталитический потенциал микроорганизмов-деструкторов ЭПХГ и хлоргидринов глицерина 1О

1.1. Микробиологическая деградация ЭПХГ и хлоргидринов глицерина 1О

1.2. Микроорганизмы-деструкторы ЭПХГ и хлоргидринов глицерина - новые инструменты для получения оптически активных соединений

1.2.1. Применение микроорганизмов-деструкторов ХОС в синтезе оптически активных соединений. Альтернативные методы синтеза

1.2.2. Кинетическое разделение рацемических смесей 3-ХПД и 2,3-ДХП (или 2,3-дибромпропанола)

1.2.3. Трансформация 1,3-ДХП

1.2.4. Кинетическое разделение эпоксидов ■

1.3. Биотехнологические способы обезвреживания низкомолекулярных ХОС и эпоксидов

1.3.1. Использование локальных установок для детоксика-ции хлорорганических ксенобиотиков

1.3.2. Иммобилизация микроорганизов-деструкторов в процессах очистки сточных вод от ксенобиотиков

1.3.3. Биотестирование очищенных сточных вод

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Материалы исследования

2.2.1. Синтез (Я)- и/или (8)-ЭПХГ

2.2.2. Синтез (Я)- и/или (Б )-3-ХПД

2.3. Методы исследования

2.3.1. Культивирование микроорганизмов

2.3.2. Получение накопительных культур

2.3.3. Выделение чистых культур микроорганизмов-деструкторов ХОС

2.3.4. Идентификация микроорганизмов

2.3.5. Определения совместимости штаммов

2.3.6. Иммобилизация микроорганизмов на ПКА-волокне

2.3.7. Выделение и очистка ферментов

2.3.7.1. Получение клеточных экстрактов

2.3.7.2. Выделение и очистка ферментов из клеточных экстрактов АнЬ/оЬаМег яр. 15

2.3.7.3. Электрофорез клеточных экстрактов АпкоЬаМег Бр. 15-4 в агарозном геле

2.3.7.4. Определение концентрации белка

2.3.7.5. Определение концентрации ионов хлора 48 23.1 .в. Определение дегалогеназной и эпоксидгидролазной активности клеточных экстрактов

2.3.8. Обработка клеток микроорганизмов акридиновым оранжевым

2.3.9. Трансформация хлорорганических соединений покоящимися клетками микроорганизмов

2.3.9.1. Определение концентрации биомассы

2.3.9.2. Определение дегалогеназной активности клеток

2.3.9.3. Определение эпоксидгидролазной активности клеток

2.3.9.4. Определение концентрации хлорорганических субстратов и продуктов трансформации

2.3.9.4.1. Обнаружение 3-хлормолочной кислоты

2.3.9.4.2. Определение карбонилсодержащих соединений

2.3.9.5. Идентификация продуктов трансформации хлорорганических соединений

2.3.10. Определение оптической чистоты продуктов биотрансформации

2.3.11. Селекция устойчивых к повышенным концентрациям ХОС микроорганизмов

2.3.12. Определение ЭПХГ в отходящих газах из биореактора 53 2.3.1.3 Определение показателей качества воды (сточных вод производства эпоксидных смол)

2.3.13.1. Определение ХПК

2.3.13.2. Количественное определение натрия хлористого ( хлорид-ионов) в воде

2.3.13.3. Определение глицерина и хлоргидринов глицерина в воде

2.3.13.4. Определение токсичности воды 54 2.3.14. Математическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Скрининг микроорганизмов - деструкторов ХОС

3.1.1. Выделение микроорганизмов из природных источников

3.1.2. Исследование конверсии ХОС покоящимися клетками микроорганизмов

3.1.3. Исследование продуктов трансформации ХОС микроорганизмами

3.2. Разработка биокатализаторов для синтеза оптически активных веществ путем кинетичекого разделения рацемических смесей

3.2.1. Поиск стереоселективных эпоксидгидролаз и дега-логеназ

3.2.2. Идентификация штаммов ^продуцентов стереоселективных ферментов

3.2.3. Исследование продуктов трансформации рацемического 3-ХПД и ЭПХГ энантиоселективными штаммами

3.2.4. Исследование ассимиляции рацемического 3-ХПД и ЭПХГ энантиоселективными микроорганизмами

3.2.5. Генетическая модификация биокатализаторов синтеза оптически активного 3-ХПД из ЭПХГ

3.2.6. Исследование возможности многократного использования биокатализатора при трансформации ЭПХГ

3.2.7. Разработка биокатализаторов для синтеза оптически активных веществ из прохиральных соединений

3.3. Создание консорциума микроорганизмов для обезвреживания ХОС

3.3.1. Отбор прототрофных штаммов, ассимилирующих ХОС

3.3.2. Селекция штаммов, устойчивых к повышенным концентрациям ХОС

3.3.3. Оценка обезвреживающей активности микроорганизмов

3.3.4. Исследование совместимости и патогенности микроорганизмов консорциума

3.3.5. Исследование иммобилизации микроорганизмов консорциума на полиакриламидных волокнах

3.3.6. Исследование морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических свойств микроорганизмов - компонентов консорциума

3.4. Иммобилизация консорциума в биореакторе

3.5. Исследование условий очистки модельных стоков, содержащих ЭПХГ

3.6. Исследование работы биофильтра

3.7. Исследование очистки сточных вод производства эпоксидных смол

ВЫВОДЫ

Введение диссертация по химии, на тему "Разработка биокаталитических систем для синтеза оптически активных веществ и утилизации эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина"

Актуальность проблемы. Сложная экологическая ситуация во многих регионах страны определяется отсутствием эффективных, надежных технологий обезвреживания выбросов промышленных предприятий, использующих или производящих хлорорганические соединения, а также длительным применением высокотоксичных хлорированных гербицидов в сельском хозяйстве.

Многолетнее воздействие хлорорганических соединений, многие из которых помимо токсического действия обладают еще и канцерогенным действием, приводит к значительному росту заболеваний, в том числе и онкологических. В связи с этим остро стает вопрос: как защитить природу от дальнейшего загрязнения хлорорганикой со стороны многочисленных предприятий.

Перспективным подходом для решения этого чрезвычайно сложного вопроса может служить использование биотехнологических методов деток-сикации вредных соединений. Однако применение традиционных технологий биологической очистки от хлорорганики, используемых на заводских биологических очистительных станциях, не дает требуемого качества. Снижение концентрации хлорорганических соединений в стоках зачастую происходит вследствие "отдувки" воздухом (для низкомолекулярных, летучих соединений), а также сорбции активным илом, что в свою очередь ведет к загрязнению воздушного пространства и образованию высокотоксичных свалок.

Весте с тем во многих странах (США, Япония, Германия, Финляндия, Россия, Казахстан, Украина и др.) ведутся работы по разработке современных технологий локальной детоксикации токсичных соединений с участием специализированных микроорганизмов-деструкторов. Создание высоких концентраций микроорганизмов за счет иммобилизации клеток на носителях, правильное сочетание аэробных и анаэробных стадий, а также реализация принципа "пространственной суксцессии" в прямоточной системе позволяет реализовать эффективную очистку сточной воды от токсичных соединений при образовании значительно меньшего избытка активного ила по сравнению с действующими биологическими очистными сооружениями.

Основная сложность в разработке эффективных методов локальной очистки связана с отсутствием высокоактивных микроорганизмов-деструкторов, устойчивых к высоким концентрациям хлорорганических соединений.

Вместе с тем такие микроорганизмы представляют интерес для решения экологических проблем не только путем детоксикации ксенобиотиков, но и путем замены устаревших токсичных биоцидов (гербицидов, инсектицидов, пестицидов) на современные средства защиты растений, а также путем перехода на лекарственные препараты нового поколения. Такие вещества зачастую представляют собой хиральные молекулы, у которых физиологической активностью обладает только один из возможных стереоизомеров изомеров. Для синтеза таких соединений требуются оптически активные синтоны, с целью получения которых в последние годы интенсивно развиваются биокаталитические методы с применением ферментов и клеток микроорганизмов.

В этом плане микроорганизмы-деструкторы хлорорганических соединений могут служить источником уникальных ферментов, обладающих высокой активностью и стереоселективностью, которые могут синтезироваться в сверхколичествах.

Эпихлоргидрин (ЭПХГ) и хлоргидрины глицерина: 1,3-дихлорпропанол-2 (1,3-ДХП), 2,3-дихлорпропанол-1 (2,3-ДХП), 3-хлорпропандиол (3-ХПД), широко используются в химической промышленности. Эти соединения, в особенности ЭПХГ, хотя и не обладают кумулятивным действием, но в силу своей реакционной способности относятся к числу наиболее опасных ксенобиотиков, воздействующих на генетический аппарат человека.

Микроорганизмы, ассимилирующие эти соединения могут быть использованы для их обезвреживания в сточных водах и газо-воздушных выбросах промышленных предприятий, а также могут служить источником стереоселективных ферментов, в частности галогидрин-дегалогеназ и эпоксидгидролаз. Эти ферменты считаются наиболее перспективным инструментом для синтеза оптически активных эпоксидов, вицинальных диолов и галогидринов, являющихся важнейшими синтонами в синтезе ряда биологически активных веществ и жидких кристаллов.

Целью работы является поиск микроорганизмов-деструкторов ЭПХГ и хлоргидринов глицерина и оценка возможности их использования в биокатализе для синтеза оптически активных продуктов и очистке воды от хлорорганических ксенобиотиков.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов-деструкторов эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина;

• идентификация продуктов метаболизма хлорорганических соединений;

• поиск микроорганизмов для синтеза оптически активных ЭПХГ и 3-ХПД;

• создание консорциума микроорганизмов для обезвреживания хлорорганических соединений в сточной воде;

• оценка возможности использования консорциума микроорганизмов для очистки стоков производства эпоксидных смол;

Научная новизна. Выделены новые эффективные штаммы-деструкторы ЭПХГ и хлоргидринов глицерина, исследованы пути биодеградации этих ксенобиотиков и получены данные, указывающие на их отличие от известных путей.

Найдены новые биокатализаторы для синтеза оптически активных эпоксидов и диолов (в том числе галогенсодержащих), путем разделения их рацемических смесей или трансформацией прохирального предшественника. Впервые разработаны методы синтеза (R)- и (8)-ЭПХГ, а также (R)- и (8)-3-ХПД путем кинетического разделения рацемических смесей с помощью штаммов Rhodococcus sp. 18-19, Pseudomonas sp. 28-12 и Pseudomonas sp. 31-3, позволяющие получать продукты высокой энантиомер-ной чистоты (97 и 98 % ее).

Научно обосновано создание консорциума на основе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Microbacterium laevanifor-mans R27-33, Arthrobacter sp. 22-11 и Nocardioides simplex R50-5 для обезвреживания ЭПХГ и хлоргидринов глицерина в промышленных выбросах.

Практическая значимость. Разработаны стереоселективные биокатализаторы (.Pseudomonas sp. 31-3, Rhodococcus sp. 18-19 и Pseudomonas sp. 28-12) для получения оптически активных синтонов биологически активных веществ путем кинетического разделения рацемических смесей ЭПХГ и 3-ХПД. С помощью этих микроорганизмов созданы препаративные методы синтеза высокочистых (R)- и (8)-энантиомеров этих соединений (97 - 98 % ее) с выходом более 95 % (в расчете на конвертированный субстрат).

Создан новый эффективный консорциум микроорганизмов на основе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Microbacterium laevaniformans R27-33, Arthrobacter sp. 22-11 и Nocardioides R50-5 для очистки сточных вод от эпихлоргидрина и хлоргидринов глицерина.

Разработана установка локальной очистки сточной воды от ЭПХГ с помощью консорциума микроорганизмов, иммобилизованного на полика-проамидном носителе. Проведены производственные испытания установки для очистки сточных вод производства эпоксидных смол ОАО "Уфахим-пром" от ЭПХГ. Показано, что иммобилизованные микроорганизмы консорциума полностью разрушают ксенобиотик, содержащийся в воде в концентрации до 4 г/л, подвергнутой предварительной нейтрализации до pH 7,0-7,2 и разбавлению в два раза. При этом достигается снижение концентрации сопутствующих веществ (глицерина и хлоргидринов глицерина) на 96,5 % и уровня ХПК воды на 91,3 %. 9

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Международном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), XII Международной конференции по производству и применению химических реагентов "Ре-актив-99" (Москва, 1999), V международной конференции по интенсификации нефтехимических процессов "Нефтехимия-99" (Нижнекамск, 1999), II Международной конференции молодых ученых "Актуальные тенденции в органическом синтезе на пороге новой эры" (г. Санкт - Петербург, 1999), Международной научно-технической конференции, посвященной 50-летию УГНТУ (Уфа, 1998), Международной научно-практической конференции "Сервис большого города" (Уфа, 1999), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1990), Всероссийской научно-технической конференции "Проблемы нефтегазового комплекса России" (Уфа, 1995), VII Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Екатеринбург, 1997), научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых (Уфа, 1989, 1990, 1994- 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 научные работы.

Заключение диссертации по теме "Нефтехимия"

Выводы

1. Из природных источников выделены и идентифицированы штаммы Pseudomonas spp. 31-3, 28-12, 28-1, 28-21, Rhodococcus sp. 18-19, No-cardioides simplex 50-5, Arthrobacter spp. 22-11, 15-4, Microbacterium lae-vaniformans 27-33, способные деградировать эпихлоргидрин и хлоргидри-ны глицерина. Показано, что в ходе подготовительного метаболизма этих штаммов ХОС превращаются в глицерин.

2. Установлено, что деградация 3-ХПД штаммами Pseudomonas sp. 28-12, Pseudomonas sp. 31-3 и Rhodococcus sp. 18-19 осуществляется с помощью стереоселективной 3-ХПД-дегалогеназы. Показана возможность получения высокочистых энантиомеров (S)- или (Я)-З-ХПД (более 97 % ее) путем кинетического разделения рацемической смеси этого соединения с помощью клеток микроорганизмов.

3. Выявлено, что штаммы Pseudomonas sp. 28-12, Pseudomonas sp. 31-3 и Rhodococcus sp. 18-19 осуществляют стереоселективный гидролиз ЭПХГ с образованием оптически активных соединений - остаточного энантиомера (R)- или (8)-эпоксида и (R)- или (8)-3-ХПД соответственно. Показано, что дикие штаммы катализируют синтез диола с низким выходом, вследствие дальнейшей конверсии этого соединения. Получены мутанты бактерий Pseudomonas sp. 31-3 и Pseudomonas sp. 28-12, потерявшие способность дехлорировать 3-ХПД, синтезирующие (Я)-З-ХПД из ЭПХГ с выходом, близким к теоретически возможному.

4. Обнаружено, что штамм Arthrobacter sp. 15-4, трансформирует прохиральный 1,3-ДХП в 3-ХПД, содержащий около 91 % (Я)-изомера. Показано, что в клетках этого штамма присутствуют два фермента с 1,3-ДХП-дегалогеназной активностью, что может служить причиной снижения чистоты получающегося продукта.

5. Установлено, что штаммы Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Nocardioides simplex 50-5, Arthrobacter sp. 22-11, Microbacterium laevaniformans 27-33 проявляют высокую эпоксидгидролазную и дегало-геназную активность и устойчивость к ХОС и способны полностью их деградировать. Осуществлена селекция штаммов Nocardioides simplex R50-5, Microbacterium laevaniformans R27-33, обладающих сверхустойчивостью к ХОС. Показана способность микроорганизмов иммобилизоваться на по-ликапроамидных волокнах, достигая концентрации 8-10 мг (асв) на грамм носителя.

6. На базе штаммов Pseudomonas sp. 28-1, Pseudomonas sp. 28-21, Nocardioides simplex R50-5, Arthrobacter sp. 22-11, Microbacterium laevaniformans R27-33, создан консорциум для детоксикации ЭПХГ и хлоргид-ринов глицерина в промышленных выбросах. Определены условия очистки модельного стока, содержащего ЭПХГ, на лабораторной установке с помощью иммобилизованного консорциума. Показано, что эффективная

111 детоксикация стока достигается при концентрации ксенобиотика не более 2 г/л и скорости разбавления 0,05 - 0,06 ч"1.

8. Показана возможность использования иммобилизованного консорциума для локальной очистки сточных вод производства эпоксидных смол, содержащих до 4 г/л ЭПХГ.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата технических наук, Халимова, Лилия Хамитяновна, Уфа

1. Промышленные хлорорганические продукты. Справочник / под ред. Ошина JI.A. М: Химия - 1978. - 654 с.

2. Goldman, P., G.W.A. Milne, and D.B. Keister. Carbon-halogen bond cleav age. III. Studies on bacterial halidohydrolases. // J. Biol. Chem. -1968.-v.243 -p.428-434.

3. Ehrenberg L., and S. Hussain. Genetic toxicity of some important epoxides //. Mutat. Res. 1981. - v. 86, № 1 - p. 113.

4. Wade, D.R., S.C. Airy, and J.E. Sinsheimer. Mutagenicity of aliphatic epoxides. // Mutat. Res. 1978. - v. 58. - p. 217-223.

5. Neilson, A. H. The biodégradation of halogenated organic compounds // J. Appl. Bacteriol.- 1990. v.69 - p. 445-470.

6. Chaudhry C.R. and Shapalamadugu. Biodégradation of halogenated organic compounds. // Microbiol. Rev. 1991. v.55 - p.59- 79.

7. Hardman, D.J. Biotransformation of halogenated compounds. // Crit. Rev. Biotechnol. 1991. - v. 11 - p. 1 - 40.

8. Leisinger T., and R. Bader. Microbial dehalogenation of synthetic organohalogen compounds: hydrolytic dehalogenases. // Chimia.- 1993. -v. 47 p.116-121.

9. Van den Wijngaard, A. J. Prins, A. C. Smal, and D.B. Janssen. Degradation of 2-chloroethylvinylether by Ancylobacter aquaticus AD25 and AD27. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - v.59 - p.2777-2783.

10. Janssen. D.B., J. Gerritse, J. Brackman, C. Kalk, D. Jager, and B. Witholt. Purification and characterization of a bacterial dehalogenase with activity toward halogenated alkanes, alcohols and ethers. // Eur. J. Biochem. -1988. v.171 -p.67-72.

11. Fetzner S., F. Lingens. Bacterial dehalogenases ¡Biochemistry, Genetics and Biotechnological Application. // Microbiol. Rev. 1994. - v.58,4 p.641- 685.

12. Hardman, D. J., and J. H. Slater. Dehalogenases in soil bacteria. // J. Gen. Microbiol. 1981. - v. 123 - p. 117-128.

13. Nakamura T., F. Y.W. Mizunashi, and L. Watanabe. Microbial transformation of prochiral 1.3-dichloro-2-propanol into optically active 3-chloro-1.2-propanediol. // Agric. Biol. Chem.- 1991. v.55 - p.1931-1933.

14. Assis H. M. S, Sallis P. J., Bull A. T., Hardman D. J. Biochemical characterization of a Haloalcohol dehalogenase from Arthrobacter erithii HlOa. // Enz. And Microbiol. Tech. 1998. - v.22. - p.568 - 574

15. Suzuki, T., N. Kasai. R. Vamamoto. and N. Minamiura. Isolation of a bacterium assimilating (R)-3-chloro-l,2-propanediol and production of (S)-3-chloro-l,2-propanediol using microbial resolution. // J. Ferment. Bioeng. -1992. v.73 - p. 443-448.

16. Kasai, N., K. Tsujimura, K. Unoura, and T. Suzuki. Degradation of 2,3-dichloro-l-propanol by a Pseudomonas sp. // Agric. Biol. Chem-1990,- V.54 p.3185-3190.

17. Faber K. Biotransformations in organic chemistry. / Textbook.-Springer-Verlag.- 1995.- 356 p,

18. Bartnicki E.W. and Castro C.E. Biodegalogenation. The pathway for transhalogenation and the stereochemistry of epoxide formation from halogydrins // Biochemistry.- 1969,- v.8.- p.4677 4680.

19. Assis H.M.S., Bull A.T., Hardman D.J. Synthesis of chiral epihalohydrins using haloalcohol dehalogenase A from Arthrobacter erithii H 10a // Enzyme and Microbial Technology.- 1998.- V. 22.- p. 545 551.

20. Bull, A. T., Hardman, D. J, Sallis P.J. and Stubbs B.M. Dehalogenation of organohalogen containing compounds // U.S. patent P10504 SOL.-1992, April.

21. Семина И.Г., C.B. Беляева Микробиологическая трансформация 1-хлоргидрина глицерина в соокислительных условиях

22. Микробиол. 1997- т.66, № 5,- с.43- 48.

23. Nakamura Т., Nagasava Т., Fujio Yu, Watanabe I.,Yamada H. Purification and characterization of two epoxide hydrolases from Corynebacterium sp. strain TV-1074 // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -p. 4630-4633.

24. Jacobs, M. H. J., A. J. Van den Wijngaard, M. Pentenga, and D. B. Janssen. Characterization of the epoxide hydrolase from an epichlorohydrin-degrading Pseudomonas sp. // Eur. J. Biochem. -1991.-v. 202.-p.1217-1222

25. Kasai, N. K. Process for preparation by (R) -(-)-3-halogeno-l,2-propanedioL by treatment with microorganisms //U.S. patent5246843.-1993, September.

26. Japanese patent application 88/265,838. 20 October 1988./ European patent application EP 365.029 25 April 1990,- / Nakajima, H., M. Onda, R. Tsurutani, and K. Motosugi. Optically active B-halolactic acid or glicidic acid.

27. Small F. J., Tilley J.K., Ensign S. A. Characterization of a new pathway for epichlorohydrin degradation by whole cells of Xanthobacter strain Py2 //Appl. and Environ. Microbiol.- 1995,- 61,№4,-P. 1507 -1513

28. Meyer, D. J., B. Coles, S. E. Pemble, K. S. Gilmore, G. M. Eraser, and B. Ketterer. Theta, a new class of glutathione transferases purified from rat and man.//Biochem. J- 1991.-v.274- p.409-414.

29. Kasai N., Suzuki Т., Furukawa Y. Chiral C3 epoxides and halohydrins: Theie preparation and synthetic application // J. Mol. Cat. B: Enzymatic.- 1998,- V- 4, № 5-6.- P. 237 252

30. Hartmans. S., J. P. Smits, M. J, van der Werf, F. Volkering, and J. A. M. de Bont. Metabolism of styrene oxide and 2-phenylethanol in the styrene-degrading Xanthobacter strain 124X // Appl. Environ. Microbiol-1989 v.55. - p. 2850-2855

31. Haan Ardre de, Smith Mark, Voorhorst Wilfried GB, de Bont Jan A M Cofactor regeneration in the production of 1,2-epoxypropane by Mycobacterium strain E3 :The role of storage material // J. Gen.-Microbiol -1993,- v.139, №12 p.3017-30224

32. Христофоров B.JI., Серебрянный B.A. Методы получения оптически активных промежуточных продуктов для синтеза простагландинов // Хим.-фарм. журн,- 1994.- №6.- С.36 59

33. Cimetiere B., Jacob L. and Julia M. Resolution of oxiranes. Application to the synthesis of the platellet aggregation factor // Tetrahedron Lett.-1986,- V. 27,- P. 6329.

34. Golding B.T. Synthesis and reactions of chiral C3-units // Chemistry and industry.- 1988.- № 3.- P. 615- 621

35. Koden M.,Kuratate F., Funada K., Awane K.,Sakaguchi K., Shiomi Y. and Kitamura K. Ferroelectric liquid crystals incorporating the optically active S-lactone ring // Jpn. J. Applied Physics.- 1989.- V. 29,- P. 981 983

36. Koden M.,Kuratate F., Funada K., Awane K.,Sakaguchi K., Shiomi Y. and Kitamura K. Ferroelectric liquid crystals incorporating the optically active 5-lactone ring // Jpn. J. Applied Physics.- 1989,- V. 29,- P. 981 983

37. Takano S., Yanase M., Takahashi M. and Ogasawara K. Enantiodivergent synthesis of both enantiomers of sulcatol and matsutake alcohol from (R)-epichlorohydrin // Chem. Lett.-1987.p. 2017-2020.

38. Kitamura, M., Ohkuma, T., Takaya, H., and Noyori, N. A practical asymmetric synthesis of carnitine. // Tetrahedr. Lett. -1988 .- v.29 -p.1555-1556

39. Shimizu S./Yfttori S., Hata H., Yamada H. A novel fungal ensyme, NADPH-dependent carbonyl reductase, showing high specificity to conjugated polyketones .'purification and characterization // Eur.

40. J. Biochem. -1988.- V. 174.-P.37-44

41. Kawamura K., Ohta T. and Otani G. An efficient synthesis of the optical isomers of nipradiol // Chem. Pharm. Bull.- 1990.- V. 38.- P. 2092 2096.

42. Mc Clure D.E., Engelholdt E.L., Mensler K., King S., Saari W.S., Huff J.R. and Baldwin J.J. Chiral Heteroaryloxymethyloxiranes // J. Org. Chem.- 1979,- V. 44,- P. 1826 1831

43. Takano S., Yanase M., Sekiguchi Y. and Ogasawara K. Practical synthesis of a-amino-(3-hydroxybutanoic acid (GABOB) from (R)-epichlorohydrin // Tetrahedron. Lett.- 1987,- V. 28,- P. 1783 1784

44. Weijers C.A.G.M., de Bont J.A.M. Epoxide hydrolases from yeasts and other sources: versatile tools in biocatalysis // J. Mol. Cat. B: Enzymatic.- 1999,- V.6, №3. p. 199 214

45. Kagegama, Y., Nihira, T., and Yamada, Y. Lipase-catalyzed synthesis of macrocyclic lactones in organic solvents.// Ann. N. Y. Acad. Sci.1990 v.613 p.681-685

46. Baldwin J.J. et al. Synthesis of (R)-and-(S)-epichlorohydrin // J. Org. Chem.- 1978,- V.43, №25,- P. 4876 4878.

47. Nakamura. Т., F. Yu, W. Mizunashi, and I. Watanabe. Production of (R)-3-chloro-l,2-propanediol from prochiral l,3-dichloro-2-propanol by Corynebacterium sp. strain N-1074. // Appl. Environ. Microbiol.-1993,-v. 59-p.227-230.

48. Kasai, N., K. Tsujimura, K. Unoura, and T. Suzuki. Preparation of (,S)-2,3-dichloro-l-propanol by Pseudomonas sp. and its use in the synthesis of (S)-epiclorohydrin. //J. Ind. Microbiol-1992.- v. 9 p.97-101

49. Nakamura. T., T. Nagasawa, F. Yu, I. Watanabe, and H. Yamada. A new catalytic function of halohydrin hydrogen-halide-lyase, synthesis of p-hydroxynitriles from epoxides and cyanide. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991-V.180 - p. 124 -130

50. Archelas A., Furstoss R. Epoxide hydrolases: new tools for the synthesis of fine organic chemicals // Trends in Biotechnology.-1998.- V. 16, №3. . p. 108 116.

51. Whitesides, G. M. and Wong, C.-H. Enzymes as catalysts in synthetic organic chemistry. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl.- 1985- 24. -617-638

52. Yamada, H. and Shimizu, S. Microbial and enzymatic processes for the production of biologically and chemically useful compounds.// Angew. Chem. Int. Ed. Engl. -1988 v.27 -p. 622 - 642.

53. Best D.J., Floyd N.C., Magalhaes A., Burfield A. and Rhodes P.M. Initial enzymatic steps in the degradetion of a-pinene by Pseudomonas fluorescens NCIMB 11671. //Biocatalysis. 1987.- v. 1,- 147-159.

54. Warhurst A.M., Fewcon C.A. Microbial metabolism and biotransformation of styrene. // J. Appi. Bacteriol.- 1994.-v. 77.-p.597-606.

55. Hartmans S., Microbial degradetion of styrene. In: Biotransformations: Microbial degradetion of health risk compaunds (Singh., V.P. ed.)./ Amsterdam, Elsevier science B.V.- 1995. p.227-238.

56. Griffiths E.T., Harries P.C., Jeffcoat R., Trudgill P.W. Purifications and proptties of a-pinene oxide lyase from Nocardia sp. strain PI8.3.// J. Bacteriol. -1987 v. 169,- p. 4980-4983.

57. Weijers C. de Haan A., de Bont J. Chiral resolution of 2,3-epoxyalcanes by Xanthobacter Py 2 II Appl. Microbiol. Biotechnol.-1988.-V.27.-p. 337-340.

58. Shirai K., Hitsasuka K. Production of 8-phenetyl alcohol from styrene by Pseudomonas 305-STR-1-4 // Agric. Biol. Chem.- 1979.- v. 43,p.1399-1406.

59. Mischits M., Faber К., Willetts A. Isolation of highly enantioselective epoxide hydrolase from Rhodococcus sp. NCIMB 11216// Biotechnol. Lett.- 1995. 17, № 9. - p. 893 - 898.

60. De Bont, J. A. M., J. P. Van Dijken, and C. G. Van Ginkel. The metabolism of 1,2-propanediol by the propylene oxide utilizing bacterium Nocardia A60 // Biochim. Biophys. Acta .- 1982. v.714 .p. 465-470.

61. Nakamura T., Yu F., Watanabe I. and Yamada H. Purification and characterization of two epoxide hydrolases from Corynebacterium sp. strain N-1074 II Appl. and Environ. Microbiol.- 1994.- V. 60.- P. 4630-4633.

62. Barbirato F., Verdoes J.C., J.A. de Bont, M.J. Van der Werf The Rhodococcus erythropolis DCL 14 limonene-l,2-epoxide hydrolase //

63. Furuhashi Keizo, Takagi Motoyoshi. Process for the preparation of epoxides by means of microorganisms: Пат. 5376539 США, МКИ5 C12P 17, C12P 13/00 Заявл.02.10.92, Опубл. 27.12.94.

64. Little, M., and P. A. Williams. A bacterial halidohydrolase: its purification, some properties and its modification by specific aminoacid reagents. // Eur. J. Biochem 1971. - v.21 - p.99-109

65. Hubert, J. В., Jacques, P., Bare, G., Dewulf, O., and Thonart, P. Bioconversion of 1 carnitine precursors by yeast.// Medet. Fac. Landbowwet. Rijuksuniv. Gent-. 1989,-v. 54,-p. 1287-1300.

66. Weijers Botes AL, Van Dyk and A.M. de Bont Enatioselective hydrolysis of unbranched aliphatic 1,2-epoxides by Rhodotorula glutinis // Tetrahedron: Assym. 1998. - v.9. - P. 467-473.

67. Ясикова Л.И. очистка сточных вод от перхлорэтилена // Хим. пром. 1976. - №10. - с.745-746.

68. Киевский М. И., Евстратов В. Н., Семенов В. Д. Очистка сточных вод предприятий хлорной промышленности. M : Химия. - 1978. - 192с.

69. Но Б. И., Ущенко В.П., Рухаков Г.Г. и др. Очистка сточных вод и газовых выбросов от дихлорэтана // Хим. пром. 1977. - № 4. -с.314-317.

70. Шахов А. И., Душкин С. С., Магнитная обработка промстоков хлорорганического производства / Известия ВУЗов. Химия и хим. технол. 1972,- т. 15, № 2. - с.273 - 275.

71. Карасевич Ю. Н. Основы селекции микроорганизмов,утилизирующих синтетические органические соединения— М.: Наука, 1982— 142 с

72. Могилевич Н.Ф. Микробная деструкция галогенсодержащих органических соединений // Хим. и технол. воды. 1982. - т.4, № 3.-с.264 -273.

73. Wilson В.H. Biorestoration of aquifers contaminated with organic compounds. // Crit. Rev. Environ. Control .-1988. -v. 18- p.29-89.

74. Vogel, T. M., C. S. Criddle, and P. L. McCarty. Transformations of halogenated aliphatic compounds. // Environ. Sci. Technol.- 1987.- v. 21-p.722 736.

75. Попов В.О., Безбородов A.M. Опыт создания промышленной технологии микробиологической очистки газо-воздушных выбросов. // Прикл. биох. и микробиол. 1999.- т.35, № 5,- с.570-577.

76. Goldstein, R. M., L. M. Mallory, and M. Alexander. Reasons forpossible failure of inoculation to enhance biodégradation. // Appl. Environ. Microbiol. -1985.-v.50-p.977-983

77. Печуркин H.C. Популяционная микробиология,- Новосибирск. -1978 г.- с. 36-37.

78. Neidleman, S. L., and J. Geigert. Biohalogenation: principles, basicroles and applications- Ellis Horwood Ltd., Chichester, United Kingdom.- 1986.-p. 156-171.

79. Janssen, D. В., R. Oldenhuis, and A. J. van den Wijngaard. Hydrolytic and oxidative degradation of chlorinated aliphatic compounds by aerobic microorganisms. // Adv. Appl. Biotechnol. Ser. Biotechnol. Biodegrad. -1990 -v.4- p. 105-125.

80. Ramachandra M., D.L.Grawford, G.Hertel Caracterization of an extracellular lignin peroxidase of the lignocellulolitic actinomycete Streptomyces viridosporus // Appl. Envirn. Microbiol.-1988.- v.54 .-p.3057-3063.

81. Hardman. D. J., and J. H. Slater. The dehalogenase complement of a soil pseudomonad grown in closed and open cultures on haloalkanoic acids.//J. Gen. Microbiol. 1981. - v. 127- p.399 - 405.

82. Galli R. Biodégradation of dichloromethane in waste water using a fluidized bed bioreaktor.// Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1987.v. 27, N2.-p.206-213.

83. Zaidi, B. R., Y. Murakami, and M. Alexander. Factors limiting success of inoculation to enhance biodégradation of low concentrations of organic chemicals. // Environ. Sci. Technol. -1988. -v.22- p.1419-1425.

84. И. А. Кривец, Т. Ю. Григорьева, А. Г. Севрук, С. С. Ставская. Получение активной биомассы Pseudomonas rathonii Т -деструктора анионных поверхностно-активных веществ // Химия и технол. воды. -1990- т. 12.- с.78 80.

85. Portier R. Bioreaktor to treat volatieles in ground water //

86. Bioprocess. Technol.-1990.- 12 N 4,- p 491-503.

87. Доронина H.B., В.А. Ежов, Ю.А. Троценко Аэробная биодеградация формальдегида, метанола и метиламина иммобилизированными клетками Methilobacterium extroguens II Прикл. биохим. и микробиол,- 1997.-т.ЗЗ N2.-с.162-165.

88. G.A.Hill, M.E.Tomusiak, B.Qual, К.М. van Cleave Bioreaktor design effects on biodégradation capabilities of VOCs in waste water // Environ.Progr.-l991 .-v. 10 N2.-p. 147-153.

89. Nelson, M. J. К., P. H. Pritchard, and A. W. Bourquin. Preliminary development of a bench-scale treatment system for aerobic degradation of trichloroethylene./ In G. S. Omenn. Environmental biotechnology.-Plenum Press, New York.- 1988,- p. 203-209.

90. Экологическая роль микробных метаболитов /под ред. Д. Г. Звягинцева М: изд-BoMfY, 1986.-е. 166-178.

91. Коваленко Г.А., Кузнецова Е.В., Ленская В.А. Углеродминеральные носители для адсорбционной иммобилизации нерастущих бактериальных клеток // Хим. и технол. воды,- 1996,-т. 18, N 2,-с. 193 195.

92. Никовская Г.Н. Адгезионная иммобилизация микроорганизмов в очистке воды //Химия и технология воды. 1989.- т. 11, №2, с.158-169

93. Боброва М.В., Л.И. Глоба Влияние природы на эффективность очистки // Химия и техн. воды,- 1995.- т. 17, N 4,- с.438 443

94. Истомина Л.П., И.В. Науменко, В.Г. Перевозный Применение плоскостной насадки для кнтесификации биологической очистки сточных вод // Химия и технол. воды 1990. т. 12 , №3. - с.272-275.

95. Гвоздяк П. И., Т. П. Чеховская, В. У. Никоненко, В. И. Рыбникова, M. Н. Закиева, К. С. Адамова .Биологическая очистка от фенола попутных вод газоконденсатных скважин Дмитровского месторождения // Химия и технол. воды 1990.-Т. 12.-С.43-48.

96. Гвоздяк П. И., Чеховская Т. П., Никоненко В. У. Микробное разрушение анилина // Химия и технол. воды.— 1985— т.7,2,—С. 84—87

97. Гвоздяк П. И., Дмитренко Г. Н., Куликов Н. И Очистка промышленных сточных вод прикрепленными микроорганизмами // Химия и технол. воды.— 1985—т. 7, № 1.—С. 64—68.

98. Волченко C.B., И.Н. Сингирцев, А.Ю. Федоров В.Н. Перспективы применения синтетического "Нитрон" как носителя при микробной очистке сточных вод // Химия и технол. воды.- 1996,- т. 18, № 2.1. С.216-220.

99. Friday D.D., R.J. Portier. Development of an immobilized microb bioreaktor for VOC applications // Environm. Progn.-1991.- V.10, №1.- p. 30-39.

100. Гвоздяк П.И., Н.Ф. Мочалевич, H.H. Куликов и др. Очистка фенилсодержащих сточных вод закрепленными микроорганизмами // Химия и технол. воды 1989.- т. 11, № 1,- с. 73 - 75.

101. Ставская С.С., Шамолина H.H., Никовская Г.Н. и др. Иммобилизация бактерий деструкторов на искусственных волокнах для очистки сточных вод от анионных ПАВ // Химия и технол. воды - 1991,- т. 13, № 6.- с. 548-554.

102. Корчак Г.И., М.М. Земляк, JI.B. Григорьева и др. Очистка и доочистка бытовых сточных вод иммобилизированными микроорганизмами // Хим. и техн. воды.-1996,- т. 18 , №2.- с. 187-192.

103. Контроль качества воды.- М.: Стройиздат.-1986.- 159 с.

104. Роговская И.И. Биохимический метод очистки производственных сточных вод // М.: Стройиздат.-1967.- 138 с.

105. Маслов А.П., А.З. Асадуллин, И.Г. Пеньковцева и др.// Химия и технол. воды 1987.- т. 9, № 3.- с. 263-265.

106. Усов Г.П., Тряхова Т.И , Г.Н. Светлакова, Л.И. Розанова Биотестирование промышленных сточных вод производства резины // Химия и техн. воды, 1987 т.9, №3 - с. 182-184

107. Вредные вещества в промышленности т. 1, 2. Органические вещества. -ЛенинградгХимия.- 1976.- 1 т.- 591 с, 2 т. 623 с.

108. Агрономов А.Е., Шабаров Ю.С. Лабораторные работы в органическом практикуме. Изд. 2-е. -М.: Химия 1974,- с.138-140.

109. Методы элементоорганической химии. Хлоралифатические соединения.- М.: Наука.- 1973.- т.2 462 с.

110. Методы получения химических реактивов и препаратов. М.: НИИТЭХИМ. -1970, №. 21.-C.36-37 .

111. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир - 1997. -Т1 -430 с.,Т2 - 800

112. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхардта М.: Мир. - 1984,- Т.1 - с. 54-57, Т.З - с. 263.

113. Практикум по микробиологии. / под ред. Н.С. Егорова. М.:

114. Изд-во МГУ. 1976. - 306 с.

115. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука. - 1989. - с. 287.

116. Нестеренко О.А., Ногина Т.М, Квасников Е.Н. Хемотаксонометрические признаки некоторых коринеподобных бактерий и групп "Rhodochrous" // Микробиол. 1978. - т. 47, № 6 - с.1055-1062.

117. Нестеренко О.А., Квасников Е.Н., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев: Наука думка. 1980.-217 с.

118. И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, JI.B. Зверева, JI.B. Рыбалка, Е.А. Еловикова Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем. // Микробиология. 1995. -т.64, № 4. - с. 507-513.

119. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука - 1984. - 200 с.

120. Смирнова В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. -Киев: Наукова думка. 1990. - 263 с.

121. Lechevalier М.Р. Identification of aerobic actinomycetes of clinical importace // J. Lab. Clin. Med. 1968. - v/74. - p.934-944.

122. Becker B.M.P., Lechevalier R.N/, Gordon H.A., Lechevalier M.P. Rapid differentation betven Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolisates // Appl. Microbiol. -1964. -v.12,5. -p.421-423.

123. Практикум по биохимии / под ред. C.E. Северина, Г.А. Соловьева. М.: изд-во МГУ. - 1989. - с.93-96.

124. Скоупс Р. Методы очистки белков. М : Мир. - 1985. - с.358.

125. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии-М:Высш. школа. 1980. - с. 271.

126. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem 1976. - v.12. - p.248-254

127. Bergman J. G., Sanik J. Determination of frace amount of chlorine in naptha // Anal.Chem.-1957. v.29. - p.241-243

128. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхардта М.: Мир, - 1984,- Т.2-с. 24-25.

129. Mori К. Synthesis of optically active pheromones // Tetrahedron. -1989.- V. 45, № 11,- P. 3233 3298.

130. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод.-М: Химия -1984. 447 с.

131. Методика определения глицерина в сточной воде производства эпоксидиановых смол / Сб. метод, определения орган, соединений,- М : ГосНИИхлорпроект,- 1974,- 26-28 с.123

132. Регламент производства эпоксидиановых смол.-М: ГОСНИИхлорпроект. 1972. - 157 с.

133. Крайнюкова А.И. Обзор копмлексных оценок токсичности сточных вод методом биотестирования // Комплексная оценка качества поверхностных вод.- М:Гидрометеоиздат.-1984. с.61-65

134. Воробьева Л.И. ГТропионовокислые бактерии.- М.:Изд-во МГУ,- 1995.-286 с.

135. Straus U.T., Felfer U., Faber K. Biocatalytic transformation of racematic into chiral building blocks in 100 % chemical yield and 100 % enantiomeric excess // Tetrahedron Assym. 1999.- v. 10. - 107-117.

136. Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека Лаборатория микробиологии1. ПРОТОКОЛ №2исследования патогенности культуры микроорганизма

137. Наименование культуры микроорганизма Nocardioides simplex 50-5

138. В результате выполненных исследований установлено, что исследуемая культура Nocardioides simplex 50-5 авирулентна для млекопитающих, не проявляет инфекционность, инвазивность, токсигенность.л \