Кинетические закономерности связывания лигандов в системе опиатных рецепторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. ИОДЫ МАТЕМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДАННЫХ ПО КОМПЛЕКСО

0БРА30ВАНИЮ ЛИГАНДОВ С ЦЕНТРАМИ СВЯЗЫВАНИЯ.

I.I. Идентификация кинетических моделей а. Графические подходы б. Методы математической статистики в. Методы имитационного моделирования г. Другие подходы.

1.2. Определение физико-химических параметров комплексообразования лигандов с центрами связывания по экспериментальным данным а. Графические подходы б. Способы прямого решения системы уравнений, связывающих параметры комплексов с экспериментальными данными в. Статистические методы определения параметров

2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ СИСТЕМ С ШСКОЛЬКИМИ ТИПАМИ РЕЦЕПТОРОВ.

2.1. Концепция множественности рецепторов

2.2. Использование зависимостей типа доза-ответ для дифференциации рецепторов

2.3. Изучение связывания лигандов с биологическими препаратами как способ количественного анализа множественности рецепторов

3. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ .:.

- 3

3.1. Характеристики различных классов опиатных рецепторов

3.2. Модели опиатных рецепторов

4. ЭКСПЕНМЕНТАЛШАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Исходные вещества

4.2. Составы буферных растворов

4.3. Составы сцинтилляционных смесей

4.4. Посуда и вода.

4.5. Получение препарата мембран головного мозга крыс

4.6. Получение лиофилизованных препаратов мембран головного мозга крыс

4.7. Измерение уровня равновесного связывания меченых соединений с препаратами мембран.

4.8. Изучение кинетики связывания лигандов с рецепторами

4.9. Определение концентрации мембраносвязанного белка

4.10.Математическая обработка экспериментальных данных 79 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ИМИТАЦИОННОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА ЛИГАНД-РЕЦЕПГОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ.

6. РАЗНОСТНЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА ЛИГАНД-РЕЦЕПТОНШХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

7. ДОКАЗАТЕЛЬСТВО СУЩЕСТВОВАНИЯ СУПЕРЗЫСОКОАФШННЫХ ЦЕНТРОВ СВЯЗЫВАНИЯ ОПИАТНЫХ ЛИГАНДОВ КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

8. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СВОЙСТВА ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

9. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА ЛИОШИЗСВАННЫХ

МЕМБРАН ГОЛОВНОГО МОЗГА.

ВЫВОДЫ.

Интерес к проблеме взаимодействия экзогенных регуляторов центральной нервной системы и, в частности, наркотических веществ - алкалоидов опия и их антагонистов - с головным мозгом проявлялся уже давно. Он обусловлен важностью физиологических последствий действия опиатов на организм - влияние на сон, память, болевые ощущения. В 70-х годах после открытия рецепторов экзогенных опиатов и обнаружения и выделения эндогенных лигандов опиатных рецепторов (энкефалинов, эндорфинов и некоторых других нейропептидов) интерес к данной проблеме резко возрос.

Исследования последних лет позволили предположить, что в основе действия опиатов и опиоидных пептидов лежит включение этих соединений в существующую систему межнейронных взаимодействий, которая и обеспечивает разнообразие психической деятельности мозга. Первичным актом действия опиатов и опиоидных пептидов на процессы сияаптической передачи является их комплексообразование со специфическими к ним рецепторами. Многими группами исследователей показано существование различных типов опиатных рецепторов в центральной нервной системе .

Проникновение методов и подходов физической химии в изучение нейрохимических процессов открывает возможность выяснения детального механизма действия физиологически активных веществ. Анализ экспериментальных данных в таких сложных системах, как опиатные рецепторы мозга, содержащих несколько связывающих центров, требует развития соответствующих методов и подходов к выявлению числа рецепторных мест и оценке их физико-химических параметров.

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия опиатов и опиоидных пептидов с системой опиатных рецепторов различных типов, при этом основное внимание уделено развитию методов анализа экспериментальных данных и получению на этой основе кинетических и равновесных параметров комплексообразо-вания лигандов с опиатными рецепторами.

I. МЕТОДЫ МАТЕМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДАННЫХ ПО КОМПЛЕКСО-0БРА30ВАНИЮ ЛИГАНДОВ С ЦЕНТРАМИ СВЯЗЫВАНИЯ.

Целый ряд биохимических процессов, протекающих в биологических системах, идет через предварительное образование комплексов лигандов со специфическими к ним центрами связывания. Это, в первую очередь, взашлодействия типа: лиганд-реце-птор, лежащие в основе передачи нервного и гормонального сигналов клетке [1,2,3], антиген-антитело [1,4.], фермент-субстрат [5,61, многие транспортные процессы [I] и т.д. Процессы комплексообразования лигандов с центрами связывания положены в основу высокочувствительных и специфических методов анализа -рецепторного, ферментного и иммуноанализа [I].

Достигнутые в последние годы успехи в изучении природы различных типов взаимодействий лигандов с центрами связывания в значительной мере обусловлены не только привлечением современных физических, физико-химических, кинетических методов исследования [1,5-8], но и совершенствованием математического аппарата, используемого для обработки результатов эксперимента

9 - 22]. Развитие математического описания кинетики и равновесия процессов комплексообразования лигандов с центрами связывания открывает возможность определения кинетических и равновесных констант, физико-химических параметров образующихся комплексов в данном эксперименте. Знание этих физико-химических параметров является основой при изучении механизмов химических и биологических явлений.Кроме того, развитие математических методов анализа эксперимента позволяет объективно решать проблему идентификации кинетических моделей, являющейся одной из кардинальных в любой области химии - физической, органической, биологической. Это объясняется, в частности, тем, что решение данной проблемы во многом определяет состояние и уровень развития теории реакционной способности химических соединений, которая позволяет, в свою очередь, выявлять механизмы и прогнозировать протекание различных процессов.

Таким образом, математическая обработка экспериментальных данных: выбор и дискриминация модели процесса, определение параметров системы, является необходимым звеном при физико-химическом, кинетическом изучении объекта. Рассмотрим те общие принципы и методы, используемые в физической химии, химической кинетике при анализе экспериментальных данных.

I.I. Идентификация кинетических моделей.

В настоящее время наряду с развитием традиционных классических методов идентификации кинетических моделей [1,5-8, 23-25], быстрое развитие вычислительной математики, средств вычислительной техники открывает принципиально новые возможности для решения проблемы идентификации кинетических моделей. В последние годы в этом направлении выполнен ряд теоретических работ [26-33]. Применение новых методов идентификации моделей открывает принципиально новые возможности при изучении сложных физико-химических явлений, так как позволяет эффективно выявлять более тонкие детали механизма протекания реакции, чем при использовании традиционных классических методов.

Первым этапом решения проблемы идентификации кинетических моделей является построение системы конкурирующих гипотез [28-31,34,351. В литературе описаны формализованные методы построения системы конкурирующих гипотез, базирующейся на сте-хиометрическом анализе реагирующей системы [34]. Для процессов комплексообразования основой построения системы конкурирующих гипотез и методов обработки результатов эксперимента лежат следующие соотношения [9,15-18,24,36-39]: I) уравнение, связывающее измеряемое свойство раствора или осадка с параметрами компонентов равновесной смеси и их концентрациями; 2) уравнение закона действующих масс; 3) уравнение материального баланса.

Экспериментально измеряемое физико-химическое свойство системы (оптическая плотность, диэлектрическая проницаемость, радиоактивность, интенсивность флуоресценции), содержащей либо смесь исходных компонентов и образовавшихся комплексов, либо отдельно комплексы и исходные компоненты, является, с хорошим приближением, аддитивной функцией параметров и концентраций компонентов смеси [1,5,9]:

X = Х2 + М (&ACA + Х&С& + Z Х(СС ) с где X - измеряемое свойство, хА, хв ,••-Х£ - коэффициенты, свяI зывающие физические параметры исходных соединений с концентрациями А, В. с-ого комплексов соответственно; СА, их равновесные концентрации (моль/л); М - константа, величина и размерность которой зависят от используемого физического метода и условий эксперимента; Хг- соответствующее свойство среды (растворителя). Для определения констант равновесия часто используют методы, основанные на измерении коллигативных свойств системы. Эти свойства не зависят от физических параметров компонентов смеси, что позволяет принять £A = Xg = .X{ =1, в таком случае

Х = Xs + /1 (сд + св + С;)

Концентрации компонентов равновесной смеси связаны с кинетическими и равновесны!,® константами уравнениями закона

- 10 действующих масс. В предположении идеальности исследуемых растворов, константа равновесия реакции p/U^B М* кр\ (I) записывается в виде ка = [ApB^/mW

Наиболее общим и удобным способом представления подобных схем является запись их с помощью числовых матриц стехиометрических коэффициентов [9,26].

Таким образом, проблема идентификации моделей комплексообразования в рамках схемы (I) сводится к определению величин а также степени зависимости констант равновесия от заселенности комплекса ApBq. При решении задач, связанных с выяснением механизма ряда биохимических процессов таких, как: взаимодействие гормона с рецептором, взаимодействие антиген-антитело, транспортные процессы в клетке, реакция фермент-субстрат, можно использовать несколько более простую схему. Рассмотрим случай взаимодействия одного несамоассоциирующего-ся одновалентного лиганда L с я-центрами связывания (схема 2): l + QL В. L*i,2,.n (2)

-с где ki - константа скорости ассоциации комплекса В>i , /сг константа скорости диссоциации комплекса 8г. В качестве лиганда L может выступать: гормон, лекарственное соединение, антиген, субстрат и т.д. В роли QL может быть: центр связывания на мембране или другой поверхности, рецептор, антитело, фермент и т.д. Для схемы (2) константа диссоциации комплекса лиганд- -й центр связывания будет определяться выражением

Kt = . (з) где [Т.] - равновесная концентрация лиганда, СФЗ - равновесная концентрация £-го центра, СВс*] - концентрация лиганда, связанного с 6-ым центром.

Если К- не зависят от того, заняты или не заняты остальные центры связывания - мы имеем дело с системой независимых центров связывания. Если же зависят от заселенности других центров, то это значит, что в рассматриваемой системе существуют кооперативные взаимодействия.

Будем считать, что экспериментально мы можем измерить величину общей концентрации связанного со всеми I центрами лиганда L и обозначим ее СБ]. В случае системы независимых центров связывания для СБ] справедливо следующее соотношение [1,16,24]: где [QJo ~ °бщая концентрация L-ото центра связывания, с = п~ число независимых центров связывания. А для системы с кооперативными взаимодействиями [24]: го-| f {№ollf"'Z (5) t=i,Z,. т , т- число независимых групп центров связывания, Кн,г- коэффициент Хилла (при пн>I - положительная кооператив-ность, пн< I - отрицательная кооперативность,/гн=1 - коопера-тивность отсутствует). Задача идентификации модели для систем, описываемых схемой (2),состоит: I) в определении степени зависимости констант диссоциации от заселенности других центров, т.е. фактически в определении типа уравнения, описывающего процесс комплексообразования, - (4) или (5), 2) в определении числа членов (величин п и г ) в уравнении (4) или (5). Здесь следует сделать некоторое замечание. Для ряда систем, например, в иммунохимии (взаимодействие антиген-антитело), гетерогенном катализе для описания процессов образования комп

- 12 лексов используют не уравнения типа (4) с конечным набором мест связывания, а уравнения типа [40-47]: си= 7тл7Гт)с//{ (6) где P(K)dK - вероятность того, что реакция между лигандом и центром связывания имеет константу диссоциации в диапазоне /Г, K+dK и J P(/i)dК - 1 . В этом случае на основании экспериментальных данных пытаются установить вид функции Р(К), другими словами, вид распределения констант диссоциации, описывающий изучаемую систему. Для иммунохимии [40-45] и исследований явлений адсорбции на различных твердых катализаторах [46,47] предположение о существовании непрерывной функции плотности распределения констант связывания лигандов является вполне обоснованным, поскольку существование непрерывного распределения сродства как бы заложено в самом процессе получения связывающих центров. Так, для антител необходим максимально широкий спектр сродства и специфичности, а для катализатора максимально развитая поверхность. Тогда как для гормон-рецеп-торных [1,14,48], фермент-субстратных [1,5-8], трансмембранных транспортных процессов [49] в настоящее время наиболее обоснованным является предположение, гипотеза о дискретном наборе констант диссоциации, описывающих комплексообразова-ние.

Рассмотрим подходы, используемые при идентификации моделей, описываемых общей схемой (2) и уравнениями (4), (5).на основе экспериментальных зависимостей концентрации связанного лиганда от концентрации свободного лиганда.

I.I.a. Графические подходы.

Традиционным и классическим методом идентификации кинетических моделей является представление экспериментальных данных в различных координатах и анализ вида получаемых кривых. Отметим, что не смотря на бурное развитие вычислительной техники и ее применение при анализе данных, графическое представление остается мощным эвристическим инструментом при исследовании химических и биологических систем.

Обычно при анализе экспериментальных данных по равновесному исследованию комплексообразования используют следующие графические представления: Лайнуивера-Еерка ) [о,6],

Йди-Хофсти (М/С*],СБ] ) [19,20], Скэтчарда ([В],Й>|Ы)[ 15, 241 Вульфа ([А],[Л]/[6]) [5,50], Хилла (^Ш, Ц [-[^/[а]^1^ Все перечисленные графические представления используются для идентификации моделей комплексообразования на основе линеаризации уравнения (4) при /г=1. Прямая линия в указанных координатах свидетельствует о корректности модели с одним центром. Отклонение от линейности является индикатором на то, что в рассматриваемой системе либо более одного центра, либо существует кооперативное взаимодействие, либо неверна рассматриваемая схема (2). Реже используются координаты, предложенные Клотцем {Ц [^.],[В]) [48,51]. В координатах Клотца даже в самом простом случае с одним центром наблюдается кривая линия, поэтому их использование при дискриминации моделей менее предпочтительно. Практически не используется метод, предложенный в работе [25], основанный на совместном анализе кривых в координатах ( Ц [&]+[/■] , [Щ}) и ( (f tB>[Z] , Ц^ц). Большинство исследователей, изучающих взаимодействие лигандов с центрами связывания в биохимии, молекулярной биологии, химии, приходит к заключению, что координаты Скэтчарда и Йди-Хофсти являются наиболее чувствительными к любым отклонениям от линейности, а также к любым изменениям в рамках схемы (2) [1,16,18

20,24,52-56]. Поэтому использование координат Скэтчарда и Иди-Хофсти при идентификации моделей комплексообразования является более предпочтительным перед использованием других упомянутых координат. На рисунке I приведены изотермы комплексообразования и их представление в координатах Скэтчарда для различных моделей, описываемых уравнениями (4) и (5) [24]. Хорошо видно, что кривые в координатах Скэтчарда довольно чувствительны к типу модели. Однако ряд моделей, например, отрицательная кооперативность, два или более независимых центра связывания, имеют гиперболический вид в этих координатах (рис.1,6,г). Это говорит о том, что применение координат Скэтчарда не всегда однозначно указывает нам тип модели. Так, гиперболический вид кривой (рис.2,а) в координатах Скэтчарда может быть обусловлен целым рядом причин [1,16]: I) существованием нескольких независимых центров связывания; 2) отрицательной кооперативностью мест связывания; 3) образованием тройного комплекса с неким эффектором (модель мобильного рецептора); 4) некорректным определением специфического связывания; 5) лиганд-лигандными взаимодействиями; 6) гетерогенностью лиганда. Остановимся на причинах нелинейности указанного типа в представлениях Скэтчарда более подробно.

Отрицательная кооперативность. Проблема анализа кооперативных взаимодействий вообще и отрицательной кооперативности в частности подробно проанализирована в работах [6,12,56-64], при этом подчеркивается высокая чувствительность представления Скэтчарда к различным типам кооперативных взаимодействий [56]. Остановимся на подходах, применяемых при дискриминации моделей отрицательной кооперативности и связывания с несколькими независимыми центрами. Используемые подходы можно услов

Bl

В]

К,Жг Ш

В] ш

Рис. I. Различный вид изотерм комплексообразования лигандов с центрами связывания и их представление в координатах Скэтчарда [24]. но разделить на два типа: равновесные [65,66] и кинетические [1,67]. Рассмотрим равновесный метод, предложенный в работе [65]. Сущность метода заключается в использовании подходящего конкурентного ингибитора связывания (ферментативной реакции). Автор рассматривает два случая: А) - 2 независимых центра с различными константами связывания; Б) - 2 центра на одной молекуле белка взаимодействуют с отрицательной коопера-тивностью. Проводится анализ зависимости отношения тангенсов углов наклона асимптот к кривой в координатах Лайнуивера-Бер-ка (1). Показано, что случаи А и Б при определенных соотношениях констант имеют различные зависимости z от концентрации ингибитора. Определены условия, дискриминирующие модели А и Б. Наиболее ярким результатом этой работы является определение условий, когда вид кривых в координатах Лайнуивеpa-Берка или Скэтчарда (или Йди-Хофсти) для случаев А и Б становится различным (рис.3,4). Из рис.3,4 видно, что в случае отрицательной кооперативности при изменении концентрации ингибитора меняется характер изгиба кривых в координатах Скэтчарда (Иди) и Лайнуивеpa-Берка, тогда как в случае А этого не происходит. Это означает, что в системе Б при определенных концентрациях ингибитора будет наблюдаться не отрицательная, а положительная кооперативность связывания лиганда (субстрата). И, следовательно, кривые связывания будут иметь сигмоидный характер.

Другим равновесным подходом является способ, предложенный в работе [66] . Рассматривается связывание /г.-валентного лиганда с линейным биополимером. Предполагается, что известно общее число мест связывания. Вводятся величины: ^ - отношение числа связанных молекул лиганда к общему числу мест связывания; с - концентрация свободного лиганда; /Сд,- константа связыва

TO U1 свз

Рис. 2. Различный характер кривых в координатах Скэтчарда.

Б-1

Рис. 3. Использование координат Лайнуивера-Берка для дискриминации моделей с двумя независимыми центрами (А) и с отрицательной кооперативностыо (Б) методом конкурентного ингибирования[65}.

Л £

Рис. 4. Использование координат Иди-Хофсти для дискриминации моделей с двумя независимыми центрами (А) и с отрицательной кооперативностью (Б) методом конкурентного ингибирования[б5^ ния; = (i-n^/li - Тогда в координатах (^л , или ( Хп, с ) в случае отсутствия кооперативности -прямая (тангенс угла наклона равен/Г), при кооперативности -кривые (см. рис.5). Заметим, что координаты ( хп , l)/с) при уь=I (одновалентный лиганд) в точности совпадают с координатами Скэтчарда, а при я > I не совпадают. В координатах Скэтчарда при п >1 (многовалентный лиганд) всегда будет наблюдаться кривизна, даже в отсутствие кооперативности, а в предлагаемых [66] координатах кривизна наблюдается только в случае кооперативных взаимодействий.

Одним из самых мощных и универсальных инструментов исследования комплексообразования является изучение кинетики процесса. Для разделения отрицательной кооперативности и случая нескольких независимых центров связывания чрезвычайно информативно и эффективно изучение кинетики комплексообразования. Ее анализ позволяет надежно идентифицировать модель связывания. Подробный анализ кинетических подходов и методов, используемых для идентификации моделей комплексообразования приведен в работах [1,67]. На рис.6 приведены зависимости показателей экспонент и предэкспоненциальных множителейот концентра-, ции лиганда. Рис.6 четко демонстрирует качественно различное поведение предэкспонент и показателей экспонент при независимом характере центров связывания, отрицательной и положительной кооперативности. При исследовании возможных кооперативных связей в системе полезным является также изучение процесса диссоциации комплекса лиганд-рецептор при различных концентрациях лиганда [I].

Образование тройного комплекса (модель мобильного рецептора) . Двухстадийная реакция с образованием тройного комплек

Рис. 5. Новые координаты для выявления кооперативных поненциальных множителей (С) для моделей: 2 незвисимых центра (а,а'),с положительной кооперативностью (б,б'), с отрицательной кооперативностью (в,в', г,г', )[lj. са также дает гиперболическое искривление в координатах Скэтчарда. Образование тройного комплекса обычно описывается в литературе моделью "мобильного рецептора" 16,37,38,68,69 : Q + i QI

3EQ + IJ^eql (7) где Е - эффектор; К1, Kz, К3> К,\ - константы диссоциации соответствующих комплексов. Аффинность гормон-рецепторного комплекса QL для эффектора Е предполагается выше, чем аффинность незанятого рецептора Q , т.е. /Г2</Г3 и, следовательно, К^ < /Г, (поскольку = fi1 . Предполагается также, что QL и £ независимо диффундируют в плоскости мембраны. Если /Г2= Къ, то зависимость общего связывания от концентрации лиганда в координатах Скэтчарда будет прямолинейной, если + то - гиперболической и степень кривизны будет зависеть от величины отношения /Т3 //г (рис.7а), кривизна тем больше, чем больше К2/Кг • При заданных значениях констант диссоциации вид кривой определяется концентрациями CQ10 и ЕЕ]0(ЕЕ]о- общая концентрация эффектора). Если 1Е10 =[610» К^ либо tEl0 = lQl0« то в координатах Скэтчарда будет наблюдаться прямая линия. Степень кривизны графика Скэтчарда также определяет величина отношения концентрации эффектора к концентрации рецептора [E1/CQ] (рис.7б). Чем меньше[El/[Q], тем выше степень кривизны, при больших же значениях СЕl/[QJ > 5 наблюдается прямая. В этой связи одним из способов идентификации модели "мобильного рецептора" является сравнение вида кривых, описывающих процесс комплексообразования при различных концентрациях эффектора. Следует отметить, что модель"мобильного рецептора" можно отделить от модели с несколькими независимыми центрами связывания и на основании исследования кинетики диссоциации комплекса скорость диссоциации не будет зависеть от концентрации лиганда в случае независимых центров), но на основании этих исследований нельзя отличить ее от модели с отрицательной коопера-тивностью [68] .

Неправильное определение специфического связывания. При изучении процессов комплексообразования гормонов, лекарственных препаратов наряду со связыванием специфическим, которое и определяет действие лиганда (обычно специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью #<200нМ), существует связывание неспецифическое, характеризующееся низкой аффинностью ( К> ЮООнМ) и сравнительно высокой концентрацией мест связывания. Специфическое связывание при использовании радиоактивных лигандов определяют как разницу между уровнями связывания меченого лиганда в отсутствие и в присутствии примерно 1000-кратного избытка немеченого лиганда. Неверный выбор концентрации немеченого лиганда может привести к ложному искривлению графика в координатах Скэтчарда [1,16].

Другими причинами гиперболического характера кривой могут быть лиганд-лигандные взаимодействия [15,16,52,70-72] (стерическое, электростатическое отталкивание) и гетерогенность лиганда, например, смесь стереоизомеров [16,18,73,74]. Эти явления при исследовании взаимодействий гормонов и различных лекарственных соединений с клеточной мембраной встречаются довольно редко [16].

Помимо вогнутых кривых гиперболического вида в координатах Скэтчарда на практике часто встречаются выпуклые кривые в этих координатах. На рис.26 изображена выпуклая кривая в координатах Скэтчарда, вид которой может,подобно гиперболической кривой, определяться несколькими причинами: I) положительной кооперативностыо центров связывания [56].; 2) рецептор диссоциирует и Kq мономера « /Г^ димера [54,75]; 3) лиганд и рецептор бивалентны [54,76]; 4) лиганд радиохимически не чист (проблема может возникнуть, например, при химической деструкции лиганда) [54, 75]; 5) при представлении кривых конкурентного вытеснения в координатах Скэтчарда не учитывается, что аффинность меченого лиганда меньше, чем немеченого [54,77]; 6) препарат, содержащий центры связывания, инактивирует лиганд по кинетике нулевого порядка [54,78]; 7) не достигнуты условия равновесия [54,77]. Учет указанных причин необходим при корректной интерпретации экспериментальных данных.

При использовании графических подходов к решению проблемы идентификации моделей необходимо иметь ввиду также статистические аспекты различных графических представлений. Характер распределения ошибки в большинстве используемых координат отличен от вида распределения ошибки исходных экспериментальных данных. На рис.8 изображен характер разброса экспериментальных данных в наиболее часто используемых координатах в предположении постоянства относительной ошибки и учетом того, что значение уровня связанного лиганда получаются после вычитания из уровня общего связывания уровня неспецифического связывания (неспецифическое связывание при больших концентрациях лиганда становится значительно больше специфического) [6, 13,55,79-81]. Заметим, что максимальный разброс наблюдается как раз там, где должно наблюдаться отклонение от линейности (если оно есть), служащее основой при выборе модели. Это накладывает определенные ограничения на использование графических подходов в целях идентификации модели.

В]

Рис. 7. Влияние отношения аффинностей комплексов: рецептор-эффектор и рецептор с лигандом-эффектор ( -(а), и отношения концентраций эффектора (Е) и рецептора (GO - (б),в рамках модели мобильного рецептора, на представления изотерм связывания в координатах Скэтчарда[68].

СЫ ш

СВ]

1 [8]

Ш [В] 1Ш

ГЛ

Рис. 8. Характер распределения ошибок в различных координатах.

I.I.6. Методы математической статистики.

Применение методов математической статистики открывает принципиально новые возможности при изучении сложных физико-химических явлений, так как позволяет эффективно выявлять более тонкие детали механизма реакции, чем при использовании традиционных графических подходов. Использование идей и методов математической статистики, кроме того, резко сокращает объем экспериментальных исследований и, что самое главное, увеличивает четкость суждения исследователя об эксперименте. В качестве критериев наилучшей модели, на основании которых проводят процедуру идентификации, обычно используют следующие положения [30]: I) наименьшее число коэффициентов, совместимое с разумной ошибкой; 2) простейшая форма, совместимая с разумной ошибкой; 3) разумные физические основания; 4) минимальная сумма квадратов отклонений между предеказанными и эмпирическими значениями откликов модели; 5) минимальная дисперсия. Первым этапом при любом оценивании моделей является проверка адекватности модели набору экспериментальных данных. Рассмотрим основные методы проверки адекватности кинетических моделей. Один из методов базируется на приемах дисперсионного анализа [34]. Дисперсионный анализ моделей используется для сравнения между собой величин отклонений экспериментальных данных от предсказанных на основании модели, с величинами, характеризующими ошибку измерений. Посредством подобного сравнения можно установить как общую адекватность модели, так и способы ее дальнейшего упрощения путем выбрасывания из модели статистически незначимых отдельных ее членов или кинетических параметров. Для достижения этой цели вычисляют величины, характеризующие разброс экспериментальных данных и разброс рассчитанных по модели значений откликов. Разности между экспериментальными значениями откликов ft и откликов, рассчитанных по модели fi , называются остатками и представляют собой меру неспособности модели точно описать экспериментальные данные. Очевидно, что если испытываемая модель истинна, то остатки фактически есть оценки ошибки измерений. Ввиду этого общую меру SS(1) несоответствия модели результатам эксперимента можно представить в виде:

SS(i) • I (9i -hf (8) i- t , где 6- число экспериментальных точек. Вся необходимая информация об ошибках измерений содержится в сумме SS (2) , получаемой при реализации нескольких Ы повторных измерений при одинаковых условиях эксперимента:

W2) - (9) л/ где у = Е^ /и/ . Тогда величина

SS(*) = SS(t) - SS(2) (10) будет определять меру неспособности испытываемой модели отражать результаты эксперимента. Адекватность модели определяют L33], как отношение величин S5(3) и SS(2) (F -статистика). Известно, что так называемая F -статистика определяется как отношение сумм квадратов независимых нормальных случайных величин. Следовательно, испытание адекватности модели фактически сводится к проверке справедливости неравенства

SS[ъ)!(k-f>~i) > р [ic-o-1 А/-1) (Ц)

ТЩЩТ^ТГ ( р где р - число параметров, el - заданный уровень значимости, T^(k-p-if^Ai)- F -критерий Фишера при заданном d и степенях свободы к-р-1 Изложенная выше процедура проверки адекватности модели еще не гарантирует статистической значимости отдельных ее членов. Для более детального анализа составляющих модели проводится разложение суммы квадратов, обусловленных регрессией, на ряд составляющих. Условие fS(4)/SS(3) > ^ (df л-р) (is) где 3S(40 - средний квадрат, обусловленный испытываемым компонентом модели, SS{3) - средний квадрат остатков, определяет значимость испытываемого компонента модели.

F -критерий Фишера широко используют при оценивании моделей взаимодействий гормонов с рецепторами, ферментов с субстратами £13,14,79,82-85]. Однако, если говорить строго, то использование F -критерия при оценивании адекватности нелинейных по параметрам моделей является некорректным С.30,31,34,35, 823. Для корректного применения F -критерия необходимо выполнение условий: линейность модели по параметрам, нормальный характер распределения ошибки, независимость сравниваемых величин сумм квадратов. Все эти условия на практике часто не выполняются. Во-первых, при анализе процессов комплексообразования, описываемых схемой (2) и уравнениями (4), (5), модели нелинейны по параметрам и поэтому проверка гипотез относительно параметров носит сугубо приближенный характер. Во-вторых, реальный объем эксперимента как правило невелик и применение асимптотических формул нормального распределения, приводящих к F -распределению, некорректно. В-третьих, сравниваемые величины сумм квадратов, очевидно,являются зависимыми, поскольку, например, 5S(3) выражается через SS(2) (см.уравнение (10)), а величины SS(3) и SS(4) из выражения (12) зависимы хотя бы потому, что получены с использованием одного и того же набора случайных величин. Все это указывает на непригодность F -критерия при анализе моделей комплексообразования. Кроме того, неадекватность даже линейной модели может иметь место и в том случае, если критерий Фишера указывает на соответствие модели экспериментальным данным. Очевидно также, что установление адекватности модели только по какой-либо одной характеристике функции распределения (для Б -критерия это дисперсия) не может дать полной гарантии адекватности модели. Поэтому требуется более детальное испытание моделей, которое осуществляется с помощью метода анализа остатков ( ^ -/<•).

Метод анализа остатков имеет следующие характерные моменты [30]: I) обнаружение выбросов; 2) обнаружение тренда в остатках; 3) обнаружение резкого сдвига уровня процесса; 4) обнаружение изменений в дисперсии ошибки; 5) исследование остатков с целью проверки нормальности распределения. На рис.9 изображен возможный характер распределения остатков в зависимости от какой-либо переменной (время, концентрация, и т.п.).

Для случая (рис.9а) характерно непостоянство дисперсии (растет вместе с переменной), следовательно необходимо использовать метод оценивания параметров (например, метод наименьших квадратов - МНК) с использованием весов.

При линейности тренда остатков (рис.96) в модель следует включить линейный член от используемой переменной (время, концентрация и т.п.).

Характер распределения остатков, изображенный на рис.9в, указывает на то, что в модель следует включить линейный и квадратичный члены от переменной (время, концентрация и т.п.).

При использовании метода анализа остатков следует помнить, что по мере того, как все новые независимые переменные вводятся в модель, остатки становятся все менее информативными [30].

В литературе описаны и другие методы и критерии, используемые для отбора моделей. Так для линейных моделей можно применять графический метод Гормэна и Томэна [30], а для нелинейных моделей применим критерий Вильямса и Клуга [30]. Согласно критерию Вильямса и Клуга проверка осуществляется путем оценивания углового коэффициента ji уравнения линии, проходящей через начало координат:

2 = f (13)

Смысл проверки в следующем. Пусть имеются две модели: и Pz'Pz ^ ~ вект0Р переменных, Д - вектор параметров.

И пусть верна модель I, так что экспериментальный отклик Y равен Y-fa + б, где £- случайная ошибка. Тогда г.^♦ i) (14)

А Л где Y, и Yzотклики по первой и второй модели соответственно. л

Из предположения, что верна модель I, следует, что У1 близок

Л Л . . Л Л i ч , тогда if~ (Yz ~ Y1) и график зависимости (Y^Y^jl

А А от У2 - Yn будет тлеть наклон ~ -1/2, если гипотеза о том, что модель I корректна, справедлива. Таким образом, значимые отрицательные значения J указывают на то, что оценка модели I лучше модели 2. Если справедлива модель 2, то jf? +1/2 и значимые положительные значения J говорят о справедливости модели 2. При / , незначимо отличным от нуля, никакого выбора между двумя моделями сделать нельзя.

Иногда перед заключительным этапом установления вероятного механизма протекания процесса оказывается, что несколько кинетических моделей соответствуют имеющимся экспериментальным данным,.и поэтому возникает задача их дискриминации [33]. Существует два основных метода проверки кинетических моделей -метод отношения правдоподобия и байесовский метод. Эти подходы подробно описаны в литературе [33,86]. Указанные процедуры проверки моделей корректны, когда испытуемые модели линейны по параметрам и правильны основные статистические предпосылки относительно характера плотности распределения ошибок измерений и справедливости использования методов регрессионного анализа. Поэтому применение подобных процедур для дискриминации существенно нелинейных моделей правомерно лишь в случае достаточно хорошей аппроксимации нелинейных моделей линеаризованными.

В заключение рассмотрим один полезный метод дискриминации на основе % -критерия [34}. Идея рассматриваемого метода состоит в тому что отношение взвешенной суммы квадратов остатков к соответствующему числу степеней свободы для одноотк-ликовых моделей является несмещенной оценкой ошибки воспроизводимости только для истинной модели; для всех остальных моделей эта оценка смещена. Метод проверяет однородность оценок дисперсий воспроизводимости для всех конкурирующих моделей с использованием распределения Бартлетта: т о

Г* (blitzes,

- VlP'l где т - число конкурирующих моделей; S*- оценка дисперсий воспроизводимости, вычисленная по с -ой модели; ps. - число сте

- 2. пеней свободы оценки; S - усредненная ошибка воспроизводимости. Если при проверке т гипотез окажется, что "j/L Zпревышает табличное значение, то модель, дающая наибольшую величину дисперсии ошибки воспроизводимости, отбрасывается. Количество гипотез сокращается на единицу, а % вычисляется вновь. При использовании этого критерия для решения задач дискриминации гипотез следует тлеть ввиду, что % -критерии весьма чувствителен к отклонению данных от нормальности и требует статистической независимости оценок дисперсии, относительно которых проверяется гипотеза однородности. Установить, насколько точно выполняются подобные предположения, часто не представляется возможным.

I.I.B. Методы имитационного моделирования.

Трудности математического анализа результатов исследований, связанные с чувствительностью применяемых методов к исходным, часто идеализированным предпосылкам, а также сложность изучаемых систем, заставляют широко использовать машинный эксперимент, методы имитационного моделирования [21,22,28].

Имитационное моделирование в широком смысле слова можно определить как экспериментирование с моделью или моделями во времени [21]. Первым методом экспериментирования на математических моделях с помощью ЭВМ оказался метод Монте-Карло, использующий случайные числа. В этих исследованиях модель служит для генерирования данных, а к данным применяют различные методы регрессионного анализа для оценки параметров предполагаемой модели; для нахождения распределения оценок параметров, которые в итоге сравниваются между собой [21,87]. В настоящее время методы Монте-Карло широко используются при исследовании процессов комплексообразования: оценки доверительных областей, построение оптимальных планов эксперимента, расчета изотерм связывания и т.д. [49,51,69,78,83-87]. Особенно эффективно применение этих методов при малых объемах эксперимента [84]. В настоящее время в литературе не описано использование какого -либо метода имитационного моделирования для идентификации и дискриминации моделей комплексообразования.

I.I.r. Другие подходы.

В работе [92] предложен оригинальный подход к анализу процессов комплексообразования с использованием так называемого теста на инвариантность лямбда-функции. Согласно предлага- , емому методу рассматривается уравнение типа (4). Для системы с двумя независимыми центрами связывания можно записать: гв 1 = ^ f + j 2 (15) где f = tLl flL 3 m , Л/, = U (CQln/K, + WW) . rtz = UlZm([Q 110 t [Qlzo )/(K1 tiMi

В качестве Cllm можно выбрать, например, макс шальную концентрацию лиганда). Далее вводятся экспоненциально уменьшающиеся моменты данных:

Ak-f."' (16) пгк = f е-^' ft (17) где L - номер экспериментальной точки, J - параметр, называемый степенью депрессии. Умножив выражение (15) на ^ ехр(-Л%), можно получить уравнение

Mk+h/*k+i (18)

Любые четыре уравнения типа (18) при различных значениях к могут быть использованы для оценки /Vj, А^ и, следовательно, К1 , К2 ,[Q]f0,CQJ26. При использовании четырех уравнений с индексами k , к+{, к+2,к+3 говорят, что решение получено при мд= к.

Аналогичные выражения можно записать и для систем с одним, тремя и более центрами связывания. Авторами работы [92] показано, что в присутствии реального разброса экспериментальных данных оценки параметров зависят от выбранного значения лямбда. В случае справедливости выбранной модели зависимости оценок параметров от лямбда тлеют экстремумы. Как правило, экстремумы оценок параметров наблюдаются при одних и тех же значениях лямбда. В случае необоснованного упрощения модели (модель с одним центром, а система имеет два центра связывания), экстремумы на зависимостях оценок параметров от лямбда не наблюдаются. При более сложной, чем реальный объект, модели (например, рассматривается три центра, а реальный объект тлеет два центра связывания) будут получаться значения параметров одного из центров, не тлеющие физического смысла.

Существенно, что существование экстремумов наблюдается лишь для определенных значений МД. Для системы с двумя центрами наилучшим значением МД является МД=-2.

Существенным недостатком рассмотренного метода является полное отсутствие теоретических основ выбора значений лямбда и МД.

Заслуживает внимания подход к идентификации моделей каталитических процессов, получивший свое развитие в работах Пряхина [93,94]. Основная идея этого подхода заключается в сравнении соотношений стационарных констант каталитических процессов, полученных из эксперимента с соотношениями, найденными в работе [93]. Пряхиным предлагается процедура нахождения уравнения связи стационарных параметров (констант) с константами равновесия промежуточных комплексов, а также уравнений, отражающих взаимосвязь стационарных параметров. Таким образом, обработав экспериментальные данные с использованием той или иной модели, можно найти стационарные константы, далее, проверив для найденных значений стационарных констант соответствие уравнениям взаимосвязи, можно получить дополнительные сведения о справедливости либо несправедливости выбранного механизма. Полученные соотношения между стационарными константами носят общий характер. Они специфичны только для вида уравнения. В этой связи предлагается [93] все кинетические механизмы разобрать на классы механизмов. К одному и тому же классу следует отнести все механизмы каталитических реакций, которые приводят к одинаковым уравнениям скорости реакции, а также равновесные свойства которых описываются одинаковыми концентрационными зависимостями. Далее для правильного выбора механизма реакции целесообразно [93,94] сравнивать константы равновесия, найденные из стационарной кинетики с константами, определенными из изучения равновесных свойств системы (эффективность подобного сравнения обсуждается и в работе [!]). Существует определенная связь между показателями экспонент (в уравнении стационарной скорости) и некоторым многочленом, связывающим концентрации субстратов и равновесные константы. Определенны.! ограничением предлагаемого подхода, также как и графических методов идентификации моделей, является игнорирование реального экспериментального разброса точек, который может оказать влияние на правильность выводов о характере модели.

- 153 -ВЫВОДЫ

1. Впервые показано существование супервысокоаффинных центров jj- и -лигандов -//j и бГт, доказано их различие, получены кинетические и термодинамические параметры.

2. Кинетическими и равновесными методами доказано различие высоко- и низкоаффинных центров связывания JU- и сГ-лигандов, получены кинетические и термодинамические параметры связывания лигандов с этими центрами.

3. Доказано отсутствие кооперативных эффектов при связывании опиатных лигандов с препаратами мембран клеток головного мозга.

4. Предложен новый метод дискриминации моделей комплексообразования лигандов сцентрами связывания и получения эмпирических функций распределения оценок параметров, содержащий в своей основе метод имитационного моделирования.

5. Разработан новый разностный подход к анализу изотерм комплексообразования и кривых конкурентного вытеснения лигандов, позволяющий выделять процессы высокоаффинного связывания лигандов и выявлять более двух независимых связывающих центров.

6. Впервые предложен способ получения препарата лиофилизованных мембран, обладающего высокой стабильностью и неизмене- ■ нными свойствами опиатных рецепторов, что позволяет предложить этот препарат для целей радиорецепторного анализа и исследовательской практики.

- 154

1. Варфоломеев С.Д., Зайцев С.В. Кинетические методы в биохимических исследованиях. - М.: Изд-во Моск.ун-та, 1982. - 345 с.

2. Hollenberg M.D. Hormone Receptor Interactions at the Cell Membrane. Pharmacol.Rev., 1978, v.30, N 4, p.393-410.

3. Леви Дж. Взаимодействие гормонов с рецепторами: Молекулярные аспекты. М.: Мир, 1979. - 432 с.

4. Фримель X. Иммунологические методы. М.: Мир, 1979. - 518 с.

5. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977.

6. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир,1979. 280 с.

7. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир,1980. 432 с.

8. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. Биокинетика. М.: Наука, 1979, - 311 с.

9. Щербакова Э.С., Гольдштейн И.П., Гурьянова Е.Е. Методы математической обработки результатов физико-химического исследования комплексных соединений. Усп.химии, 1978, т.47, вып.12,с.2134-2159.

10. Tallarid R.J., Cowan A., Adler M.W. рА£ and receptor differentiation: a statistical analysis of competitive antagonism. -Life Sci., 1979, v.25, N 8, p.637-654.

11. Kenakin T.P. The Schild regression in the process of receptor classification. Can.J.Physiol.Pharmacol., 1982, v.60, N 3, p.249-265.

12. Neet K.E. Cooperativity in enzyme function: equilibrium and kinetic aspects. In: Methods in Enzymology. N.Y.: Acad. Press, 1980, v.64, part B, p.139-192.- 155

13. Cleland W.W. The statictical analysis of enzyme kinetic data.- In: Advances in Enzymology. N.Y.: Acad.Press, 1967, v.29, p.1-32.

14. Munson P.J., Rodbard D. LIGAND: A versatile computerized approach for characterization of ligand-binding systems.- Anal.Biochem., 1980,VU07, N 1, p.220-239.

15. Scatchard G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann.N.Y. Acad.Sci., 1949, v.51, p.660-672.

16. Molinoff P.В., Wolfe B.B., Weiland G.A. Quantitative analysis of drug-receptor interactions: II. Determination of the properties of receptor subtypes. Life Sci., 1981, v.29, N5, p.427-443.

17. Klotz A.M., Hunston D.L. Protein interactions with small molecules. J.Biol.Chem., 1975, v.250, N 8, p.3001-3009.

18. Weiland G.A., Molinoff P.B. Quantitative analysis of drug-receptor interactions: I. Determination of the kinetic and equilibrium properties. Life Sci., 1981, v.29, N 4, p.313-330.

19. Hofstee B.H.J. On the evaluation of the constants V and Кm min enzyme reactions. Science, 1952, v.116, N 3013, p.329-331.

20. Eadie G.S. On the evaluation of the constants V„ and К inm menzyme reactions. Science, 1952, v.116, N 3025, p.688.

21. Клейнен Дж. Статистические методы в имитационном моделировании.- М.: Статистика, вып.2, 1978. 334 с.

22. Шеннон Р. Имитационное моделирование систем искусство и наука. - М.: Мир, 1978. - 418 с.

23. Вржещ П.В. Кинетика и механизм действия РСН-синтетазы. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.- М.: 1983.- 156

24. Schwarz G. Some general aspects regarding the interpretationof binding data by means of a Scatchard plot. Biophys.Struct. Mechanism, 1976, v.2, N 1, p.1-12.

25. Baulien E.E., Raynaud J.-P. A "proportiona graph" method for measuring binding systems. Eur.J.Biochem., 1970, v.13, N 2, p.293-304.

26. Эмануэль H.M., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. М.: Высшая школа, 1974. - 400 с.

27. Кафаров В.В. Методы кибернетики в химии и химической технологии. М.: Химия, 1976. - 463 с.

28. Наумов В.В. Теория эксперимента. М.: Наука, 1971. - 207 с.

29. Федоров В.В. Теория оптимального эксперимента. М.: Наука, 1971. - 312 с.

30. Хеммельблау Д. Анализ процессов статистическими методами. -М.: Мир, 1973. 957 с.

31. Дрейнер Н., Смит Г. Прикладной регрессионный анализ. М.: Статистика, 1973. - 392 с.

32. Жилинская Е.Н., Товмаченко Н.Н., Федоров В.В. Методы регрессионного анализа при наличии ошибок в предикторных переменных. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1979. - 34 с.

33. Delforge J. New Results on the problem of identifiability of a linear system. Math.Biosci., 1980, v.52, N 1-2, p.73-96.

34. Кафаров В.В., Писаренко В.Н. Современное состояние проблемы идентификации кинетических моделей. Усп.химии, 1980, т.49, вып. 2, с.193-222.

35. Спаговский Ю.С., Островский Г.Н. Моделирование кинетики гетерогенных каталитических процессов. М.: Химия, 1976. - 248 с.

36. Klotz J.M., Hunston D.L. Properties of graphical representations of multiple classes of binding sites. Biochemistry, 1971, v.10, N 16, p.3065-3069.

37. Haen С. The non-stoichiometric floating receptor model for hormone sensitive adenylyl cyclase. J.Theor.Biol., 1976, v.58, N 2, p.383-400.

38. Heidenreich K.A., Weiland G.A., Molinoff P.B. Characterization of radiolabeled against binding to beta-adrenergic receptors in mammalian tissues. J.Cyclic Nucl.Res., 1980, v.6, N 3, p.217-230.

39. Vassent G., Multi-random binding molecular interactions: a general kinetic model. J.Theor.Biol., 1974, v.44, N 2, p.241-270.

40. Bowman J.D., Aladjem F. A method for the determination of heterogeneity of antibodies. J.Theor.Biol., 1963, v.4, N 2, p.242-253.

41. Werblin T.P., Siskind G.W. Distribution of antibody affinities: technique of measurement. Immunochemistry, 1972, v.9, N 10, p.987-1011.

42. Sips R. Structure of a catalyst surface. J.Chem.Phys., 1948, v.10, p.490-495.

43. Minton A.P. On the interpretation of binding isotherms in complex biological systems. Biochem.Biophys.Acta, 1979, v.558, N 2, p.179-186.

44. Erwin P.M., Aladjem F. The heterogeneity of antibodies with respect to equilibrium constants. Calculation by a new method using delta functions and analysis of the results. Immunochemistry, 1976, v.13, N 11, p.873-883.

45. Gandolfi A., Strom R. Analysis of binding curves in multivalent antigen-heterogeneous antibody systems. J.Theor.Biol. 1981, v.92, N 1, p.57-84.

46. Боресков Г.К. Катализ. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1971, ч.1-2. - 267 с.

47. Дамаскин Б.Б., Петрий О.А.Основы теоретической электрохимии.- М.: Высшая школа, 1978. 239 с.

48. Klotz J.M. Ligand-receptor interactions: what we can and cannot learn from binding measurements. Trends in Pharma-colog. Sci., 1983, v.4, N 6, p.253-255.

49. Gross W., Geek P., Burkhardt K.-L., Ring K. Kinetic analysis of two component systems in transmembrane transport (Multiple forms of transport system). Biophysik, 1972, v.8, N 4, p.271-279.

50. Cressie N.A.C., Keightle у D.D. Analysing data from hormone-receptor assays. Biometrics, 1981, v.37, N 6,- p.235-249.

51. Klotz J.M. Numbers of receptor sites from Scatchard graphs: facts and fantasies. Science, 1982, v.217, N 4566, p.1247-1249.

52. Stankowski S. Large-ligand adsorption to membranes. 1. Linear ligands as a limiting case. Biochim. Biophys.Acta, 1983,v. 735, N 3, p.341-351.

53. Zivin J.A., Wand D.R. How to analyze binding, enzyme and uptake data: the simplest case, a single phase. Life Sci., 1982,v.30, N 17, p.1407-1422.

54. Bonifacino J.S., Paladini A.C. Effect of the incomplete separation of bound and free ligand on binding measurement. Anal. Biochem., 1981, v.118, N 2, p.213-222.

55. Feldman H.A. Mathematical theory of complex ligand-binding systems at equilibrium some methods for parameter fitting.- Anal. Biochem., 1972, v.48, N 2, p.317-338.

56. Jose M.V., Larralde C. Alternative interpretation of unusual Scatchard plots: contribution of interactions and heterogeneity. Math.Biosci., 1982, v.58, N 2, p.159-170.

57. Whitehead E.P. Conditions for the various types of cooperati-vity allowed by the adair equation and their relation with the algebraic character of binding polynomials. J.Theor. Biol., 1981, v.93, N 3, p.547-587.

58. Briggs W.E. A new measure of cooperativity in protein-ligand binding. Biophys.Chem., 1983, v.18, N 1, p.67-71.

59. Nagelkerke N.J.D., Strackee J. Fitting the Hill equation to data: a statistical approach. IEEE Transactions Biomed. Engineer., 1982, BME-29, N 6, p.467-469.

60. Kuo L.C. Allosteric cofactor-mediated enzyme cooperativity: a theoretical treatment. Proc. Nat1.Acad.Sci.USA, 1983, v.80, N 17, p.5243-5247.

61. Laurent M., Kellershohn N. Apparent cooperativity for highly concentrated Michaelian and allosteric enzymes. J. Mol. Biol., 1984, v.174, N 1, p.543-555.

62. Bardsley W.G., Wright A.J. A new approach to the measurement of sigmoid curves with enzyme kinetic and ligand binding data. J.Mol.Biol., 1983, v.165, N 1, p.163-182.

63. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. М.: Наука, 1978. - 247 с.

64. Ackers G.K., Shea М.А., Smith F.R. Free energy coupling within macromolecules. J.Mol.Biol., 1983, v.170, N 1, p.223-242.

65. Harper E.T. Kinetics of the two-sited enzyme. II. A method of distinguishing between anticooperative and independent active sites based on competitive inhibition. J.Theor. Biol., 1973, v.39, N 1, p.91-102.

66. Tsuchiya Т. New-plot showing the existence of cooperativity, anticooperativity and an arbitrary value of the neighbor-exclusion parameter in systems of ligand-binding to linear biopolymes. Biopolymers, 1983, v.22, N 8, p.1967-1978.

67. Boeynaems J.M., Cauntraine F.D. Comparison between the kinetics of heterogeneous and sequentially cooperative binding systems. J.Theor.Biol., 1980, v.83, N 3, p.447-456.

68. Jacobs S., Cuatrecases P. The mobile receptor hypothesis and "cooperativity" of hormon binding. Application to insulin.- Biochim.Biophys.Acta, 1976, v.433, N 3, p.482-495.

69. Dwyer J.D., Bloomfield V.A. Binding of multivalent ligands to mobile receptors in membranes. Biopolymers, 1981, v.20, N 11, p.2323-2336.

70. Pincus M.R., DeLisi C., Rendell M. Ligand binding to multiple equivalent sites with steric hindrance. Biochim.Biophys. Acta, 1981, v.675, N 3-4, p.392-396.

71. Sturm J. Binding of ligands to one-dimensional heterogeneous lattice. I. General model for the calculation of binding isotherms by a Monte Carlo approach. Biopolymers, 1981,v.20, N 3, p.753-763.

72. Pollet R.J., Standaer M.L., Haase В.A. Insulin binding to human lymphocyte receptor evaluation of negative cooperativity model. - J.Biol.Chem., 1977, v.252, N 16, p.5828-5834.

73. Burgisser E., Hancock A., Lefkowitz R.J., DeLean A. Anomalous equilibrium binding properties of high-affinity racemic radioligands. Mol.Pharmacol., 1981, v.19, N 2, p.205-216.

74. Burgisser E., Lefkowitz R.J., DeLean A. Alternative explanation for the apparent "two-step" binding kinetics of hight-affinity racemic antagonist radioligands. Mol.Pharmacol., 1981, v.19, N 3, p.509-512.

75. Builder S.E., Segel I.H. In equilibrium lugand-binding assays using labeled substrates. Nature of errors introduced by radiochemical impurities. Anal.Biochem., 1978, v.85, N 2, p.413-424.

76. Nichol L.W., Winzor D.J. Ligand-induced polymerization. Biochemistry, 1976, v.15, N 14, p.3015-3019.

77. Taylor S.I. Binding of hormones to receptors alternative explanation of nonlinear Scatchard plots. - Biochemistry, 1975, v.14, N 11, p.2357-2361.

78. Boeynaems J.M., Dumont J.E. Quantitative analysis of binding of ligands to their receptors. Review. J.Cyclic Nucl.Res., 1975, v.1, N 3, p.123-142.

79. Knack I., Rohm K.-H. Microcomputers in enzymology. A versatile BASIC program for analysing kinetic data. Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem., 1981, v.362, p.1119-1130.

80. Peters F., Pingaud V.A. A critical interpretation of experiments on binding of peptide hormone to specific receptors by computer modelling. Biochim.Biophys.Acta, 1982, v.714, N 3, p.442-447.

81. Munson P.J., Rodbard D. Number of receptor sites from Scatchard and Klotz graphs: a constructive critique. Science, 1983, v.200, N 4600, p.979-981.

82. Burguillo F.J., Wright A.J., Bardsley W.G. Use of the F-test for determining the degree of enzyme-kinetic and ligand-bin-ding data. Biochem.J., 1983, v.211, N 1, p.23-34.

83. Humrich A., Richardson A. By hand curve fitting program for the analysis of multiple site radioligand binding data. Br. J.Pharm. (Proc.Suppl.), 1983, v.80, 582P.

84. Richardson A., Humrich A. A microcomputer program for the ama-lysis of radioligand binding curves and other dose-response data. Trends in Pharmacol.Sci., 1984, v.5, N 2, p.47-49.

85. Reilly P.M. Statistical methods in modeling discrimination. Canad.J.Chem.Eng., 1970, v.48, N 2, p.168.

86. Bard Y. Non-linear parameter estimation. N.Y.: Plenum Press, 1981. - 341 p.

87. Endrenyi L. Kinetic data analysis. N.Y.: Plenum Press, 1981. - 427 p.

88. Johnson D.B., Berthouex P.M. Using multiresponse data to estimate biokinetic parameters. Biotechnol.Bioeng., 1975, v.17, N 4, p.571-583.

89. Johnson D.B., Berthouex P.M. Efficient biokinetic experimental designs. Biotechnol.Bioeng., 1975, v.17, N 4, p.557-570.

90. Lutchan K.R., Saidelt G.M. Sensitivity analysis and experimental design techniques: application to non-linear, dynamic Lung models. Сотр.Biomed.Res., 1982, v.15, N 5, p.434-454.

91. Tibbitts Т., Isenberg I. Analysis of ligand binding data by lambda invariance testing. Anal.Biochem., 1984, v.138, N 2, p.472-480.

92. Пряхин A.H. Методы определения механизма процесса, равновесных и кинетических констант в ферментативном, гетерогенном и гомогенном катализе. Ж.физ.химии, 1984, т.58, № 1, с.20-32.

93. Пряхин А.Н. Об обратных задачах физической химии. Ж.физ. химии, 1983, т.57, № 10, с.2627-2630.

94. Березин В.И., Клёсов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: Изд-во Моск.ун-та,1976. - 243 с.- 163

95. Еремин Е.Н. Основы химической кинетика. М.: Высшая школа, 1976.- 541 с.

96. Norby J.G., Ottolenghi P., Jensen J. Scatchard plot: common misinterpretation of binding experiments. Anal.Biochem., 1980, v.102, N 2, p.318-320.

97. Feldman H.A. Statistical limits in Scatchard analysis. J. Biol.Chem., v.258, N 21, p.12865-12867.

98. Light K.E. Analyzing nonlinear Scatchard plots. Science, 1984, v.223, N 4631, p.76-77.

99. Burgisser E. Radioligand-receptor binding studies: what's wrong with the Scatchard analysis. Trends in Pharmacol. Sci., 1984, v.5, N 4, p.142-144.

100. Ketelslegers J.-M. The choice of erroneous models of hormone-receptor interactions: a consequence of illegitimate utilization of Scatchard graphs. Biochem.Pharmacol., 1984, v.33, N 5, p.707-710.

101. Klotz I.M. Discation after article of Munson P.J., Rodbard D.- Science, 1983, v.220, N 4600, p.981.

102. Siiteri P.K. Receptor binding studies. Science, 1984, v.223, N 4632, p.191-193.

103. Paul S.M., Hanger R.L., Hulian-Giblin B.A., Skolnick P. Discation after article of light KE. Science, 1984, v.223,1. N 4631, p.77-78.

104. Сергеев Г.Б., Баток В.А., Романов В.В., Ростовщиков Н.В. Определение параметров комплексообразования на основе двухволновой спектроскопии. Ж.физ.химии, 1974, т.48, № 11, с.2662-2665.

105. Boninsegna A., Baggio С., Scutari G. A new procedure for calculating the kinetic parameters of enzyme reactions. Enzyme, 1983, v.30, N 2, p.77-82.

106. Спивак С.И., Ахундов И.Р., Ахмадишин З.Ш., Шмелев А.С. Роль ограничений в обратных кинетических задачах сложных реакций жидкофазного окисления. Ж.физ.химии, 1983, т.57, № 4,с.1032-1033.

107. Спивак С.И., Горский Г.К. Неединственность решения задачи восстановления кинетических констант. Докл. АН СССР, 1981, т.257, № 2, с.412-415.

108. Bates D.M., Watts D.G. Relative curvature measures of non-linearity. J.Roy.Stat.Soc., 1980, B42, N 1, p.1-25.

109. Squire W. A new approach for calculating association constants from macromolecule-ligand binding isotherms. Mathe-mat.Al.Biosci., 1982, v.58, N 1, p.83-92.

110. Monot C., Netter P., Stalars M.C., Martin J., Royer R.J., Caucher A. Difficulties in applying the Scatchard model of ligand binding to proteins proposal of new mathematical tools - application of salicylates. - J.Pharm.Sci., 1983, v.72, N 1, p.35-41.

111. Endrenyi L., Chan F.-Y. Optimal design of experiments for the estimation of precise hyperbolic kinetic and binding parameters. J.Theor.Biol., 1981, v.90, N 2, p.241-263.

112. Snyder S.H., Goodman R.R. Multiple neurotransmitter receptors. J.Neurochem., 1980, v.35, N 1, p.5-15.

113. Tallarida R.J. The use of drug-receptor affinity measuresin the differentiation of receptors. Fed.Proc., 1982, v.41, N 1, p.2323-2327.

114. Olson R.W., Bergman M.O., Van Ness P.C., Lummis S.C., Wat-kins A.E., Napias C., Creenlee D.V. Gamma-aminobutyric acid receptor binding in mammalian brain. Heterogeneity of binding sites. Mol.Pharmacol., 1981, v.19, N 2, p.217-227.

115. Rosenbaum J.S., Sadee W. Demonstration of opiate receptors sub-types in vivo. Life Sci., 1982, v.31, N 12-13, p.1299-1301 .

116. Rosenbaum J.S., Holford N.H.G., Richards M.L., Aman R.A., Sadee W. Discrimination of three tz types of opioid binding sites in rat brain in vivo. Mol.Pharmacol., 1984, v.25,1. N 2, p.242-248.

117. Gaddum J.H. The quantitative effects of antagonistic drugs. J.Physiol. (London), 1937, v.89, 7P-9P.

118. Clark A.J., Raventos J. The antagonism of acetylcholine and of quaternary ammonium salts. Q.J.Exp.Physiol., 1937, v.26, p.375-391 .

119. Borstlap A.C., Doucet P.G. The double Michaelis-Menten equation: estimation of parameters. Z.Naturforsch., 1983, v.38, N 1, p.268-272.

120. Ашмарин И.П., Еропкин М.Ю., Ковалева Т.А., Рожанец В.В. Оли-гопептиды мозга анальгетики, стимуляторы памяти и сна. -Мол.биол., 1978, т.12, вып.5, с.965-979.

121. Ашмарин И.П. Малые пептиды в норме и патологии. Журн.эвол. биох.физиол., 1979, т.15, № 3, с.278-290.

122. Кусень С.И. Интернализация и внутриклеточные превращения биологически активных полипептидов и их рецепторов. Усп.совр. биологии, 1982, т.94, вып.З, с.376-392.

123. Ведерников Н.Н., Майский А.И. Опиаты и эндогенные морфинопо-добные пептиды. Усп.совр.биологии, 1981, т.91, вып.З,с.380-392.

124. Kosterlitz H.W. Neuropeptides and neural transmission. ed. Morsen C.A., Traczyk W.Z. N.-Y.s Raven Press, 1980, p.191-197.

125. Snyder S.H., Childers S.R. Opiate receptors and opioid peptides. Ann.Rev.Neurosci., 1978, v.2, p.35-64.

126. Zukin S.R. Differing stereospecificities distinguish opiate receptors subtypes. Life Sci., 1982, v.31, N 12-13, p.1307-1310.

127. Chang K.-J., Cuatrecasas P. Heterogeneity and properties of opiate receptors. Fed.Proceed., 1981, v.40, N 1-3, p.2729-2734.

128. Kosterlitz H.W., Paterson S.J. Characterization of opioid receptors in nervous tissue. Proc.R.Soc.Lond., 1980, v.210, B, p.113-122.

129. Wood P.L., Charieson S.E., Lane D., Hudgin R.L. Multiple opiate receptors: differential binding of mu, kappa and delta agonists. Neuropharmacol., 1981, v.20, 12A, p.1215-1220.

130. Bonnet K.A., Groth J., Gioannini Т., Cortes M., Simon E.J. Opiate receptor heterogeneity in human brain regions. -Brain Res., 1981, v.221, N 2, p.437-440.

131. Buatti M.C., Pasternak G.W. Multiple opiate receptors: phylo-genetic differences. Brain Res., 1981, v.218, N 1-2, p.400-405.

132. Terenius L. Opioid peptides and opiates differ in receptor selectivity. Psychoneuroendocrinology, 1977, v.2, N 1, p.53-58.

133. Martin W.R., Eades C.G., Thompson J.A., Huppler R.E., Gilbert. The effects of morphine- and nalorphine-like drugs in the non-dependent and morphine-dependent chronic spinal dog. J.Pharmacol.Exp.Ther., 1976, v.197, N 3, p.517-532.- 167

134. Lord J.A.H., Waterfield A.A., Hughes J., Kosterlitz H.W. Endogenous opioid peptides: multiple agonists and receptors. Nature, 1977, v.267, N 5611, p.495-499.

135. Martin W.R., Ader Ph.D. The in vivo differentiation of opiate receptors: introduction. Life Sci., 1981, v.28, N 14, p. 1543-1545.

136. Martin W.R. Multiple opioid receptors.- Life Sci., 1981, v.28, N 14, p.1547-1554.

137. Goldstein A., James J.F. Site-directed alkylation of multiple opioid receptors. II. Pharmacological selectivity. Mol. Pharmac., 1984, v.25, N 3, p.343-348.

138. Hayes A.G., Tyers M.B. Determination of receptors that mediate opiate side effects in the mouse. Br.J.Pharmac., 1983, v.79, N 3, p.731-736.

139. Pivovarov A.S., Izmestyev V.I. Different role of opiate mu-, delta, kappa- and sigma-receptors in modification of habituation of orthodromic evoked potential in the turtle1s visual cortex. Brain Res., 1984, v.300, N 2, p.257-273.

140. Pollerberg G.E., Costa Т., Shearman G.T.S., Herz A., Reid L.D. Opioid antinociception and positive reinforcement are mediated by different types of opioid receptors. Life Sci., 1983, v.33, N 16, p.1549-1559.

141. Pasternak G.W., Childers S.R., Snyder S.H. Opiate analgesia: evidence for mediation by a subpopulation of opiate receptors. Science, 1980, v.208, N 4443, p.514-516.

142. Miller L., Shaw J.S. Multiple opiate receptors in the mouse vas deferens. Eur.J.Pharm., 1983, v.90, N 2-3, p.257-261.

143. Shaw J.S. Selective antagonists at the opiate delta-receptors. Life Sci., 1982, v.31, N 12/13, p.1259-1262.

144. Gintzler A.R., Hyde D. Multiple opiate receptors in the guinea pig enteric nervous system: unmasking the copresence of receptors subtypes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1984, v.81, N 7, p.2252-2254.

145. Wamsley J.K. Opioid receptors: autoradiography. Pharm. Reviews., 1983, v.35, N 1, p.69-83.

146. Goodman R.R., Snyder S.H. Kappa-opiate receptors localized by autoradiography to deep layers of cerebral cortex: relation to sedative effects. Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1982, v.79, N 8, p.5703-5708.

147. Ott S., Hietch В., Schulz F., Herz A. Target size analysis of multiple opiate receptors. Naunayn Schmiedeber1s Archives of Pharm., 1983, v.323, suppl.abstr., p.84.

148. Pert C.B., Snyder S.H. Opiate receptor binding of agonists and antagonists affected differentially by sodium. Mol. Pharm., 1974, v.10, N 6, p.868-879.

149. Blume A.J. Interaction of ligands with the opiate receptors of brain membranes: regulation by ions and nucleotides.- Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1978, v.75, N 4, p.1713-1717.

150. Pfeiffer A., Herz A. Different types of opiate agonists interact distinguishably with mu, delta and kappa opiate binding sites. Life Sci., 1982, v.31, N 12-13, p.1355-1358.

151. Pasternak G.W., Wilson H.A., Snyder S.H. Differential effects of protein-modifying reagents on receptor binding of opiate agonists and antagonists. Mol.Pharm., 1975, v.11, N 3,p.340-351 .

152. Blume A.J., Lichtenshtein D., Boone G. Receptors for neurotransmitters and peptide hormones. In: Advances in Biochemical Psychopharmacology. - N.Y., Raven Press, 1980, v.21, p.339-347.

153. Zukin R.S., Walszak S., Makman M.H. GTP modulation of opiate receptors in regions of rat brain and possible mechanism of GTP action. Brain Res., 1980, v.186, N 1, p.238-244.

154. Childers S.R., Snyder S.H. Differential regulation by guanine nucleotides of opiate agonist and antagonist receptor interactions. J.Neurochem., 1980, v.34, N 3, p.583-593.

155. Hiller J.M., Angel L.M., Simon E.J. Characterization of the selective inhibition of the delta subclass of opioid binding sites by alcohols. Mol.Pharm., 1984, v.25, N 2, p.249-255.

156. Charness M.E., Gordon A.S., Diamond I. Ethanol modulation of opiate receptors in cultured neural cells. Science, 1983, v.222, N 4629, p.1246-1248.

157. Tabakoff В., Hoffman P.L. Alcohol interactions with brain opiate receptors. Life Sci., 1983, v.32, N 3, p.197-204.

158. Pfeiffer A., Seizinger B.R., Herz A. Chronic ethanol imbibition interferes with delta-, but not with mu- opiate receptors. Neuropharmacology, 1981, v.20, 12A, p.1229-1232.

159. Chang K.-J., Cuatrecasas P. Multiple opiate receptors. J. Biol.Chem., 1979, v.254, N 8, p.2610-2618.

160. Chang K.-L., Hazum E., Cuatrecasas P. Novel opiate binding sites selective for benzomorphan drugs. Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 1981, v.78, N 7, p.4141-4145.

161. Villiger J.W., Taylor K.M. Buprenorphine: characteristics of binding sites in the rat central nervous system. Life Sci., 1981, v.29, N 26, p.2699-2709.

162. Lutz R.A., Cruciani R.A., Costa Т., Munson P.J., Rodbard D. A very high affinity opioid binding site in rat brain: demonstration by computer modeling. Biochem.Biophys.Res.Com-mun. , 1984, v.122, N 1, p.265-269.

163. Czlonkowski A., Costa Т., Przewlocki R., Pasi A., Herz A. Opiate receptor binding sites in human spinal cord. Brain Res., 1983, v.267, N 2, p.392-396.

164. James I.F., Goldstein A. Site-directed alkylation of multiple opioid receptors. I. Binding selectivity. Mol.Pharm., 1984, v.25, N 3, p.336-342.

165. Pfeiffer A,0 Herz A. Discrimination of three opiate receptor binding sites with the use of a computerized curvefitting technique. Mol.Pharm., 1982, v.21, N 2, p.266-271.

166. Mack K.J. Comparison of mu, delta, and kappa opiate binding sites in rat brain and spinal cord. Life Sci., 1984, v.34, N 3, p.281-285.

167. Meumer J.C. Mu and kappa opiate binding sites in the rabbit CNS. Life Sci., 1982, v.31, N 12/13, p.1327-1330.

168. Huidobro-Toro J.P., Yoshimura K., Way E.L. Application of an irreversible opiate antagonist (j* -FNA, ^-funaltrexa-mine) to demonstrate dynorphin selectivity for kapp-opioid sites. Life Sci., 1982, v.31, N 22, p.2409-2416.

169. Magnan J., Paterson S.J., Kosterlitz H.W. The interaction5 5of Met enkephalin and Leu enkephalin sequences, extendedat the c-terminus, with the mu-, delta- and kappa bindingsites in the guinea-pig brain. Life Sci., 1982, v.31,1. N 12-13, p.1359-1361.

170. James I.F., Chavkin C., Goldstein A. Selectivity of dynorphin for kappa opioid receptors. Life Sci., 1982, v.31, N 12-13, p.1331-1334.

171. Porthe G., Valette A., Cros J. Kappa opiate binding sites in human placenta. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1981, v.101, N 1, p.1-6.

172. McLawhon R.W., West R.E., Miller R.J., Dawson G. Distinct hight-affinity binding sites for benzomorphan drugs and enkephalin in a neuroblastoma brain hydrid cell line. - Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 1981, v.78, N 7, p.4309-4313.

173. Grynne B.H., Maurset A.R., Holman А.Т., Enger M. The effect3of two different buffers on the hight affinity H.EKC and3

174. H.SKF 10.04 7 binding to guinea-pig brain membranes. Acta Pharm. et Toxicol., 1984, v.54, N 3, p.195-200.

175. Pfeiffer A., Herz A. Demonstration and distribution of an opiate binding site in rat brain with hight affinity for EKC and SKF 10.047. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1981, v.101 , N 1, p.38-44.

176. West R.E., Freedman S.B., Dawson G., Miller R.J., Villeread M.L. Delta and sigma sites of clonal NCB20 cells donot modulate calcium uptake. Life Sci., 1982, v.31, N 12-13,p.1335-1338.

177. Chang K.-J., Hazum E., Cuatrecasas P. Possible role of distinct morphine and enkephalin receptors in mediating actions, of benzomorphan drugs (putative kappa and sigma agonists).- Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1980, v.77, N 8, p.4469-4473.

178. Law P.Y., Loh H.H., Li C.H. Properties and localization of betta- endorphin receptor in rat brain. Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 1979, v.76, N 11, p.5455-5459.

179. Ferrara P., Houghten R., Li C.H. Betta-endorphin: characteristics of binding sites in the rat brain. Biochem.Biophys. Res.Communs., 1979, v.89, N 3, p.786-792.

180. Lin-Shian S.-Y., Hammonds R.G., Li C.H. Betta-endorphin: characteristics of binding sites in the mouse brain. Eur. J.Pharm., 1983, v.87, N 2-3, p.297-300.

181. Attali В., Gonarderes C., Mazarguil H., Audigier Y., Cros J. Differential interaction of opiates to multiple "kappa" binding sites in the guinea-pig lumbo-sacrol spinal cord. -Life Sci., 1982, v.31, N 12-13, p.1371-1375.

182. Grevel J., Sadee W. An opiate binding site in the rat brain is highly selective for 4,5-Epoxymorphinans. Science, 1983, v.221, N 4616, p.1198-1200.

183. Wolozin B.L., Pasternak G.W. Classification of multiple morphine and enkephalin binding sites in the central nervous system. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1981, v.78, N 10, p.6181-6185.

184. Zhang A.-Z., Chang J.-K., Pasternak G.W. The actions of haloxazone on the binding and analgesic properties of mor-phiceptin. A. Selective mu-receptor ligand. Life Sci., 1981, v.28, N 25, p.2829-2836.

185. Pasternak G.W., Carrol-Buatti M., Spiegel K. The binding and analgesic properties of a sigma opiate SKF 10.047. J. Pharm.and Exp.Ther., 1981, V.219, N 1, p.192-198.

186. Pasternak G.W. Hight and low affinity opioid binding sites: relationship to mu and delta sites. Life Sci., 1982, v.31, N 12-13, p.1303-1306.

187. Simantov R., Snowman A.M., Snyder S.H. Temperature and ionic influences on opiate receptor binding. Mol.Pharm., 1976, v.12, N 6, p.977-986.

188. Kosterlitz H.W., Paterson S.J., Robson L.E. Characterization of the kappa-subtype of the opiate receptor in the guinea-pig brain. Br.J.Pharm., 1981, v.73, N 4, p.939-949.

189. Pert C.B., Snyder S.H. Properties of opiate receptor binding in rat brain. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1973, v.70, N 8,p.2243-2247.

190. Pryhuber K.G., Roth B.L., Coscia C.J. Demonstration of a slowly dissociating form of bovine hippocampal synaptic membrane opiate receptors. Eur.J.Pharm., 1982, v.83, N 1-2, p.47-53.

191. Nicolas P., Hammonds R.G., Gomez S., Li C.H. Betta-endorphin: thermodynamics of the binding reaction with rat brain membranes. Arch.Biochem.Biophys., 1982, v.217, N 1, p.80-86.

192. Zajac J.M., Rogues B.P. Differential properties of mu- and delta- opiate binding sites studied with highly selective ligands. Life Sci., 1983, v.33, sup. 1, p.155-158.

193. Simon E.J., Hiller J.M., Groth J., Edelman I. Further properties of stereospecific opiate binding sites in rat brain on the nature of the sodium effects. J.Pharm.Exp.Ther., 1975, v.192, N 3, p.531-537.

194. Simantov R., Childers S.R., Snyder S.M. Theo opiate receptor3binding interactions of H-methionine enkephalin an opioid peptide. Eur.J.Pharm., 1978, v.47, N 3, p.319-331.3

195. Leysen J.E., Gommeren W., Niemegeers C.J.E. H-sufentanil a superior ligand for mu-opiate receptors: binding properties and regional distribution in rat brain and spinal cord. -Eur.J.Pharm., 1983, v.87, N 2-3, p.209-225.

196. Blanchard S.G., Chang K.-J., Cuatrecasas P. Characterization of the association of tritiated enkephalin with neuroblastoma cells under conditions optimal for receptor down regulation. J.Biol.Chem., 1983, v.258, N 2, p.1092-1097.

197. Hammonds R.G., Ling N., Puett D. Interaction of tritiated betta-endorphin with rat brain membranes. Anal.Biochem., 1981, v.114, N 1, p.75-84.

198. Schiller P.W., De Maio J. Opiate receptor subslasses differ in their conformational requirements. Nature, 1982, v.297, N 5861, p.74-76.

199. Smith G.D., Griffin J.M. Conformation of Leu -enkephalin from X-ray diffraction: features important for recognition at opiate receptor. -.Science, 1978, v.199, N4334, p.1214-1216.- 175

200. Shimohigashi Y. Importance of the stereo orientation of aromatic groups of enkephalins to opiate receptor recognition.- Biochem.Biophys.Res.Communs., 1984, v.121, N 3, p.966-972.

201. Kosterlitz H.W., Lord J.A.H., Paterson S.J., Waterfield A.A. Effects of changes in the structure of enkephalins and of narcotic analgesic drugs on their interactions with mu- and delta-receptors. Br.J.Pharm., 1980, v.68, N 2, p.333-342.

202. Shimohigashi Y., English M.L., Stammer C.H., Costa T. Dehyd-roenkephalins. IV. Discriminative recognition of delta and mu opiate receptors by enkephalin analog. Biochem.Biophys. Res.Communs., 1982, v.104, N 2, p.583-590.

203. Chavkin C., Goldstein A. Specific receptor for the opioid peptide dynorphin: structure activity relationships.- Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1981, v.78, N 10, p.6543-6547.

204. Mosberg H.I., Hurst R., Hruby V.J., Gee K., Yamamura H.I., Galligan J.J., Burks T.F. Bis-penicillamine enkephalins possess highly improved apecificity toward delta opioid receptors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1983, v.80, N 19, p.5871-5874.

205. Berman J.M., Goodman M., Nguyen T.M.D., Schiller P.W. Cyclic and acyclic partial retro-inverso enkephalinamides: mu receptor selective enzyme resistant analogs. Biochem.Biophys. Res.Communs., 1983, v.115, N 3, p.864-870.

206. Schiller P.W., Eggimann В., Di Maio J., Lemienx C., Nguyen T.M.-D. Cyclic enkephalin analogs containing a cystine bridge. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1981, v.101,N 2, p.337-345.

207. Maigret В., Premilat S., Fournie-Zaluski M.-C., Roques B.P. Proposals for conformation of enkephalins related to opiate mu-pharmacophore. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1981, v.99, N 1, p.267-274.- 176

208. Pasternak G.W., Snyder S.H. Identification of novel hight affinity opiate receptor binding in rat brain. Nature, 1975, v.253, N 5492, p.563-565.

209. Portoghese P.S., Takemori A.E. Different receptor sites mediate opioid agonism and antagonism. J.Med.Chem., 1983, v.26, N 10, p.1341-1343.

210. Rothman R.B., Westfall Т.е. Allosteric coupling between morphine and enkephalin receptors in vitro. Mol.Pharm., 1982, v.21, N 3, p.548-557.

211. Rothman R.B., Westfall Т.е., Morphine allosterically modula3tes the binding of H-leucine enkephaline to a particulate fraction of rat brain. Mol.Pharm., 1982, v.21, N 3, p. 538547.

212. Vaught J.L., Rothman R.B., Westfall Т.е. Mu and delta receptors: their role in analgesia and in the differential effects of opioid peptides in analgesia. Life Sci., 1982, v.30,1. N 17, p.1443-1445.

213. Lee N.M., Smith A.P. A protein-lipid model of the opiate receptor. Life Sci., 1980, v.26, N 18, p.1459-1464.

214. Pert C.B., Taylor D.P. Type 1 and type 2 receptors: subclassi-fication scheme based upon GTP's differential effects on binding. In: Endogeneous and exogenous opiate agonists and antagonists. - ed. Way E.L.: N.Y., Pergamon Press, 1979,p.87-90.- 177

215. Olgiati V., Quirion R., Bowen W.D., Pert C.B. Characterization of type 2 opiate receptors. Life Sci., 1982, v.31,1. N 12-13, p. 1675-1678.

216. Bowen W.D., Pert C.B., Pert A. Nigral 6-hydroxydopamine lesions equally decrease mu and delta opiate binding to striatal patches: further evidence for a conformationally malleable type 1 opiate receptor. Life Sci., 1982, v.31, N 16-17, p.1679-1682.

217. Bowen W.D., Gentleman S., Herkenham M., Pert C.B. Intercon-verting mu and delta forms of the opiate receptor in rat striated patches. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1981, v.78, N 8, p.4818-4822.

218. Туркина E.B., Чепыжева M.A., Коломийцева Г.Я. Использование феноксола 8/10 в жидкостно-сцинтилляционных смесях. Биол. науки, 1980, № 3, с.102-105.

219. Gogstad G.O., Krutnes М.-В. Measurement of protein in cell suspensions using the coomassie brilliant blue dye-binding assay. Anal.Biochem., 1982, v.126, N 2, p.355-359.

220. Zaman Z., Verwilgnen R.L. Dye-binding assay for protein solu-bilized in the presence or absence of sodium dodecyl sulfate. Anal.Biochem., 1980, v.109, N 5, p.454-459.

221. Wood P.L., Pilapil C.H. Kappa-opiate receptor sites: unique heart stability in vitro. Eur.J.Pharm., 1983, v.88, N 2-3, p.281-282.

222. Brase D.A. Studies on brain opiate receptor stability in vitro: inhibition of opiate receptor binding by adenosines' -diphosphate. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1981, v.103, N 1, p.189-195.- 178

223. Groot С., Leene W. The influence of cryoprotectants, temperature, divalent cations and serumproteins on the structure of the plasma membrane in rabbit peripheral blood lymphocytes. Eur.J.Cell.Biol., 1979, v.19, N 1, p.19-25.

224. Рыльцев В.В., Власов JI.Г. Кинетика обратимой инактивации иммобилизованного на диальдегидцеллкшозе трипсина при дегидратации. В сб.: Тезисы докладов 1У Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология". Киев, 1983, ч.П, с.65.