Кинетика лизиса фибрина плазмином и его производными тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИЙ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИИ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УЖ 577.15.07;022

ПОПОВА Галина Юрьевна

КИНЕТИКА ЛИЗИСА ФИБРИНА ПЛАЗМИНОМ И ЕГО ПРОИЗВОДНЫМИ 02.00.15 - химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1991

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

. . доктор химических наук Н.Ф.Казанская

научный консультант:

кандидат химических наук Р.Б.Айсина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук с.м.струкова кандидат химических наук Т.В.Ротанова

Ведущая организация:

Всесоюзный гематологический научный центр Министерства здравоохранения СССР.

Зашита состоится " 25 " UtCtfJ? 1991 г. в 17 час.30 мин. на заседании специализированного совета Д 053.05.76 в Московском государственном университете им. м.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, ленинские горы, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан - /Г " Л{СГ& 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Тромболитическая терапия при эмболиях, инфарктах, окклюзии сосудов и других заболеваниях заключается в лизисе фибриновых сгустков. Чтобы свести к минимуму нарушения системы'гемостаза при введении тром-болитиков (в основном протеолитических ферментов и активаторов плазми-ногена), используются различные способы их направленной доставки. Среди новых препаратов направленного действия, помимо комплексов тромбо-литиков с моноклональными антителами к фибрину или к коллагену, предложены обратимо ацилированные по активному центру п'-анизоильной группой производные плазмина и активаторного комплекса плазмин(оген).стре-птокиназа, устойчивые к действию антипротеиназ и более длительно циркулирующие в кровотоке. Ацилирование фермента (или активаторного комплекса) не затрагивает лизкн-связывающих участков молекулы плазминоге-на, за счет которых происходит специфическое взаимодействие тромболи-тика с фибриновым сгустком. Тромб лизируется под действием сорбированного активного фермента, образующегося в результате реактивации ацил-фермента. Большой интерес представляют ацилированные производные плазмина и активаторного комплекса, содержание и другие ацильные заместители, которые покидают активный центр с требуемой для успешного тром-болизиса скоростью и тем самым обеспечивают непрерывное поддержание оптимальной концентрации активного тромболитика на тромбе.

Цель и задачи исследования. Цель работы - создание ацилировакных производных плазмина и активаторного комплекса ПЛ.ск с заданными скоростями реактивации и изучение их свойств. Для этого необходимо выделить плазминоген из плазмы крови человека, подобрать ацилируюшие агенты, получить обратимо инактивированные производные фермента и- активаторного комплекса, изучить их физико-химические характеристики, а также разработать методы измерения и исследования реакции фибринолиза свободными и ацилированными производными плазмина и активаторного комплекса 1п у11:го и 1п

Научная новизна и практическое значение работы, разработаны методы синтеза ашшфованных производных плазмина и активаторного комплекса с различными скоростями реактивации, которые предназначены для использования в качестве пролонгированных тромболитических средств. Синтезированы п'-анизоил-, п'-гуанидинбензоил- и транс-п'-(И.Н.К- триме-тиламинощиннамоил-производные плазмина к активаторного комплекса ПЛ.СК (последний синтезирован впервые).

- г -

Для анализа фибринолитических свойств ацилированных и неацилиро-ванных производных плазмина и комплекса ПЛ.СК предложено два метода непрерывного измерения кинетики фибринолиза, обладающих высокой чувствительностью и позволяющие варьировать концентрацию тромболитиков .на несколько порядков. На модельной системе in vitro, содержащей компоненты плазмы крови (плазминоген и ингибиторы плазмы крови человека), показана большая фибринолитическая эффективность активаторного комплекса ПЛ.СК по сравнению с плазмином и ацилированных активаторных комплексов по сравнению с неацилированными. В опытах на животных с экспериментальным тромбозом показано, что ацил-активаторы, в отличие от немодифицированных комплексов, вызывают меньшую системную активацию фибринолиза, меньший фибриногенолиз и обладают пролонгированным- тром-. болитическим эффектом.

Апробация работы, основные результаты и отдельные положения диссертационной работы докладывались на международной конференции "Химическая физика ферментативного катализа" (Таллинн, 1937), на VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Вильнюс,1988), на конференции молодых ученых МГУ (1988), IV Всесоюзной научной конференции "Противотромболитическая терапия в клинической практике. Вопросы фибринолиза и тромболиза" (Ялта, 1988), на Всесоюзной научно-практической конференции "Ферменты - народному хозяйству (Черновцы, 1990), на XIмеждународном конгрессе по тромболизу (Любляна, 1990).

Публикации, по материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /fpстраницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, изложенных в III главах, заключения, выводов, списка основной использованной литературы ( 166 наименований ). Работа иллюстрирована 4S рисунками и 12 таблицами.

ж/Автор считает своей приятной обязанностью поблагодарить проф. Г.В. Андреенко за привлечение внимания к данной проблеме и большой интерес, проявленный ев к работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

i. выделение и очистка плазминогена человека

Плазминоген человека был выделен по модифицированной методике Deutch'a и Mertz'a аффинной хроматографией на L-Лизин-Сефарозе 4В из различных источников ( свежей цитратиой плазмы донорской крови человека, III Фракции осаждения белков по Кону и осадков, полученных при спиртовом осаждении плацентарной и абортной плазмы крови ). Показано, что наибольшей потенциальной активностью обладает плазминоген, полученный из свежей цитратной плазмы крови человека или из ее III фрак-зиии. Как видно из таблицы 1, выделенный нами плазминоген по своей ак тивности превосходит ряд коммерческих и лабораторных препаратов зимо-гена.

Таблица 1. Сравнительная характеристика некоторых коммерческих и лабораторных препаратов плазминогена

Источник Содержание Потенциальная активность

белка,ж Казеинолити-ическая К.Е./мг Зстеразная ■ АА/МИН.мг Амидазная АА/МИН.МГ

фирма "SIGMA" 2,0 3,0 11,0 14,0

(США)

"Д1агностикум" 5,0 18,0 28,0 28,0

(Львов)

ин-т Биохимии 58,0 11,0 18,6 19,2

(.Киев ) настоящая работа

80-90 20-25 35-45 35-45

2. Активация плазминогена

С целью выбора подходящего активирующего агента активация плазминогена человека в активный плазмин была проведена различными активаторами: иммобилизованными к сефарозе трипсином и урскиназой ( их пре-

имущество - возможность многократного использования ), а также сгреп-токиназоя, взятой в каталитических количествах,

эквимолярный аетиваторный комплекс пл.ск получен смешением экви-молярных количеств плазминогена и стрептокиназы.

Во всех перечисленных способах контроль за полнотой активации был проведен по скорости гидролиза сложноэфирного или амидного субстратов. Показано, что удельная активность плазмина, полученного, с помощью иммобилизованных трипсина и урокиназы, а также каталитических количеств стрептокиназы, была одинаковой.

3. Кинетические свойства плазмина

Для определения, числа активных молекул плазмина использованы методы титрования активного фермента панкреатическим ингибитором трипсина, а также п-нитрофениловши эфирами п'-гуанидинбензойной и транс-п*-(К,Ы,К-триметиламиио)- коричной кислот. Содержание активных молекул в плазмине, определенное различными способами, составляло 70-80« в зависимости от партии.

Плазмин способен гидролизовать широкий набор субстратов: природный твердофазный субстрат фибрин и другие белки, а также ряд синтетических низкомолекулирных субстратов. Концентрация плазмина при .изучении различных процессов { активации зимогена, ацилировании фермента и реактивации ацилированных производных и др. ) оценивалась по скорости гидролиза некоторых сложных эфяров I-дизина и L-аргинина на основе знания кинетических констант реакций, определенных нами в отдельных экспериментах. В таблице 2 представлены найденные значения К^ и , для реакций гидролиза плазмином некоторых эфирных субстратов, вычисленные на основании истинной концентрации активного фермента.

4. Фйбринолитические свойства плазмина и активаторного комплекса ПЛ.СК

способность плазмина и комплекса ПЛ.СК гидролизовать фибриновые сгустки устанавливалась с помощью трех методов определения фибриноли-тической активности in vitro. Первый метод основан на регистрации на-

Таблица 2. Кинетические параметры реакций гидролиза сложкозфирных субстратов плазмином человека

субстрат рн ккат* с 1СМ, ММ 1скат/кМ' мм~1с"1

БАЭЗ 8 20,7510,3 0,8+0.1 26

ТАМЭ 8 12,310,1 1,210,1 10

АГЛМЭ 7,8 79,311,2 0,2910,06 203

Кбз-Лиз-НФ 6,2 13,61:0,4 0,01710,006 800

БАЗЗ - Ш-бензоил-1-аргинина этиловый эфир, ТАМЭ - Иа-р-тозил-Ь-арги-нина метиловый эфир, АГЛМЭ - Ка-ацегил- глицял- 1-лизина метиловый эфир, Кбз-Лиз-НФ - карбобензокси- I-лизина п-нитрофениловый эфир.

копления азокрасителя в супернатанте при гидролизе суспензии азофибри-на. Зтот метод позволяет определять концентрацию ллазмина в интервале 0,5-5 мкМ. Второй, модифицированный нами метод, основан на использовании в качестве субстрата плазмина флуоресцеиктиоцианат-фибрина (ФТЦ-фибрина). Увеличение интенсивности Флуоресценции в надгелевой жидкости, связанное с накоплением в ней растворимых ФТЦ-меченых продуктов деградации фибрина, прямо пропорционально скорости лизиса геля у: у = где i? - интенсивность флуоресценции в супернатанте. преимущества метода: короткое время анализа (20-40 мин), автоматизация измерения на ТДХ-анализаторе и высокая чувствительность (до 0,01 мкМ). Метод был использован для измерения фибринолитической активности разбавленных биологических жидкостей.

ч Третий метод, предложенный нами, состоит в измерении убыли фибри-нозого сгустка под действием фермента. Для этой цели фибриновый гель формируется в виде цилиндра. Тогда скорость реакции фибринолиза как изменение массы субстрата в единицу времени, Судет пропорциональна уменьшению высоты, столба геля, которая может быть измерена с помощью катетометра: V = - где 1 - высота столба фкбрикового геля,-

Кетод позволяет измерять скорость фибринолиза при с плазмином в интервале 0,6 - 12 мкМ (Рис.1, кривая 1) и актяваторным комплексом ПЛ.СК в интерзале концентраций 0,004 - 0,7 ыкИ (ркс.1, кривая 2). Чув-

ствительность метода к плазмину (до 0,006 мкМ) ыохет быть повышена увеличением температуры до зт°с и времени реакции.

Метод свободен от фоновых помех (мутность или окраска среды не влияют на процесс измерения) и был использован нами.для измерения скорости Фибринолиза как в очищенных системах (фибриновый гель/буфер), так и в системах, приближенных к физиологическим (гель из плазмы/плазма), изучения влияния различных эффекторов на тромболизис и моделирования процессов, происходящих в организме.

V.10 , мм/мин 2

1е[Е], мкм

Рис Л. Зависимость скорости лизиса Фибринового геля плазмином ( 1 ) и и комплексом ПЛ.СК ( 2 ) от концентрации тромболитика

-3 -2 -1

1

Данные рис.1 демонстрируют более высокую эффективность фибринолиза комплексом ПЛ.СК по сравнению с плазмином (на два порядка), что объясняется, вероятно, активацией активатбрным комплексом примеси бычьего плазминогена, содержащегося в фибриновоы геле, который не активируется плазмином человека.

Для выявления совместного влияния ингибиторов плазмы крови и эндогенного плазминогена на щибринолиз изучена кинетика лизиса геля плазмином и комплексом ПЛ.СК в обеих системах. При измерении скоростей фибринолиза в системе гель из плазма/плазма использована концентрация плазыина, также на два порядка превышающая концентрацию активаторного комплекса ПЛ.СК, б и 0,06 мкМ, соответственно (см.рис.2). Показано, что при концентрации плазыина 0,06 мкм лизис геля не происходит. Плаз-мин, как известно из литературных данных, на пять порядков лучше связывается с основным ингибитором плазмы крови а2_антиплазш1н0м по сравнению с акткваторным комплексом ПЛ.СК (константа скорости ассоциации этого ингибитора с плазмином а с комплексом ПЛ.СК 1С?

М"1с~1). Этим можно объяснить наблюдаемую низку» тромболитическую эффективность плазмина по сравнению с комплексом ГШ.СК в присутствии

ингибитора: зависимость А1 лизиса геля из плазмы в плазме от г (рис.2) для активаторного комплекса имеет линейный вид (кривая 1) по крайней мере в течение четырех часов реакции, в то время как лизис геля плазмином прекращается через один час реакции (кривая 2), что можно объяснить ингибированием добавленного в систему плазмика а2-энтиплазмином, содержащимся как в твердой, так и в кидкой фазе, а также отсутствием активаторннх свойств у плазмина. Величина первоначального выброса на кинетической кривой лизиса геля из плазмы плазмином пропорциональна' количеству введенного фермента (кривая 2 и 3, до выхода на плато). Добавление в эту же систему новой порции плазмина приводит к идентичной кинетической кривой (кривая 2, после выхода на плато), в то время как после введения в такую систему комплекса ПЛ.СК начинается Фибрино-лиз (кривая 3, после выхода на плато), скорость которого равна скорости фибринолиза комплексом ПЛ.ск, введенным в исходную систему (кривая 1 >.

Рис.2, кинетика лизиса фибрина комплексом ПЛ.СК и плазмином в системе гель из плазмы крови человека/плазма крови человека, i - [ПЛ.СК1=0,Об мкМ, 2 - [ПЛ]=2,05 мкМ, через 150 мин добавлен [ГШ=2.05 МКМ, 3 - тл]=1,1 МКМ, через 150 мин добавлен ШЛ.скз=о,об мкМ.

По-видимому, в случае плазмина протекают два конкурентных процесса: Фибринолиз плазмином и его инактивация ингибиторами плазмы. В случае активатсрного комплекса имеет место и третий процесс - активация эндогенного плазминогена комплексом ПЛ.СК, благодаря чему происходит увел чекие концентрации активного фибркнолиткка, причем ускорение фибринолиза за счет этого процесса значительно превосходит его торможение ингибиторами плазмы. Таблица з иллюстрирует влияние ингибиторов плазмы крови человека, содержащихся в жидкой, твердой или в обеих фазах на скорость фибринолиза комплексом ПЛ.СК. Как видно, основной вклад в торможение фибринолиза вносит ингибитор, включенный в гель.

Меньшее влияние на фибринолиз оказывает ингнбитор, содержащийся только в жидкой фазе. Как следует из рис.3, добавление панкреатическо-

Таблица з. Фибринолиз активаторнш комплексом ПЛ.СК в различных системах.

скорость фибринолиза, «

-—.надгелевая жидкость: буфер плазма крови человека

гель сформирован~йзГ"--

бычьего фибриногена 100 64,3

плазмы крови человека 47,6 40,4

го ингибитора трипсина ( ПИТ ) после 25 мин инкубации плазыина с фиб-риновым гелем приводит к полной потере эстеразной активности плазмина в надгелевой жидкости ( рис.З(А), кривая 2 >, в то время как фибрино-литическая активность снижается лишь на ЗМ по сравнению с исходным уровнем (рис.З(А), кривая 1). при добавлении плазмина к фибриновому гелю после предварительной инкубации его с ПИТ, эстеразкая активность в растворе, как и в предыдущем случае, падает до нуля, а фибринолити-ческая активность составляет лишь 332 от контрольного уровня (рис.з (Б)). Следовательно,.фермент, сорбированный на геле, значительно меньше янактивируется белковым ингибитором, чем фермент, находящийся в растворе.

100

активность,г

100

50

активность,«

'2 г, шн

20

40

60

Рис.З. Изменение скорости фибринолиза (1) и эстеразной активности плазмина в надгелевой жидкости (2) в системе фибриновкй гель/ буфер (37 С). А - через 25 мин инкубации плазмина с гелем добавлен ПИТ Б - через 25 шн инкубации ПИТ с гелем добавлен плазмин ( СПЛ]=2 мкМ, 1ПИТ]=1,2 мкМ ).

Б

5. Синтез ацилированных производных плазмина и

активаторного комплекса пл.ск и изучение их свойств синтезированы три ацилированных производных плазмина и активатор ного комплекса: п'-анизоил- (АН-), п'-гуанидинбензоил- (ГБ-) и транс-п•-(N. N,И-триметиламино)циннамоил- (ТМАЦ-) плазмин и комплекс ПЛ.СК. Синтез осуществлялся инактивацией плазмина или комплекса ПЛ.СК избытком соответствующих ацилируюиих агентов: п-амидинофениловым эфиром п*-анисовой кислоты и . двумя п-нитрофениловыми эфирами Л'-гуанидинбензоаной и транс-п'-(Н,К,И-триметиламино)коричной кислот. Все три агента быстро и эффективно ацилируют плазмин (и комплекс ПЛ.СК) и через 40 мин реакцш остаточная активность составляет 1-42. Кинетика деацилирования ацил-Ферментов и ацил-активаторов изучена в присутствии конкурентного обратимого ингибитора плазмина (Ь-лизина) по возрастанию ферментативной активности проб, взятых из реакционней смеси. Найденные константы деацилирования приведены в таблице 4. ■

Таблица 4. Значения констант деацилирования трех ацил-плазминов и ацил-активаторных комплексов ПЛ.СК ( 0,05 м трис-НС1 буфер, рн 7,4, содержащий 0,2 М 1-лизин ).

препарат к^.с-1 11/?,мин

АН-Плазмин (АН-ПЛ.СК) (4,210,11.10~4 28

ТМАЦ-Плазмин (ТМАЦ-Ш1.СК) (2,0±0,1 ).10~4 58

ГБ-Плазмин (ГБ-ПЛ.СК) (0,601:0,04).Ю-4 193

Кинетика деацилирования ацилированных производных, активаторного комплекса ПЛ.СК идентична кинетике реактивации соответствующих ацил-ПЛ23МИН03. Как видно из таблицы, наиболее быстрое высвобождение активного фибринолитика происходит в случае АН-производных, а наиболее медленно реактивируются ГБ-производные. значения констант деацилирования Гк3> для АН- и тМАЦ-плаз'минов (или активаторных комплексов ПЛ.СК) различается лишь в 2,1 раза, поэтому можно ожидать, что ТМАЦ-плазмин (и ТМАЦ-ПЛ.СК) будут иметь фибринолитическую активность, близкую соответствующим АН-производным.

Сравнение кинетики фибринолиза неацилированными и аудированными

- го -

плазмином и комплексом ПП.СК в присутствии ингибиторов плазмы крови человека показало, что. в отличие от плазмина, кинетика лизиса геля АН-плазмином линейна и продолжается по крайней хере несколько часов, но, как и в случае неацилированных препаратов, ацил-активаторный комплекс (на примере АН-ПЛ.сю более эффективен, чем АН-плазмин, как в присутствии (система гель из плазмы/плазма) , так и в отсутствие ингибиторов (система гель из фибрина/буфер). Следовательно, ацил-актива-торные комплексы - более эффективные тромболитические агенты, чем ацил-плазмины.

Сравнение фибринолитической активности неацилированного и двух ацилкрованных. ( АН- и ТКАН- ) комплексов ПЛ.СК также проведено в двух системах (рис.4 (А) и (Б)). Как и следовало ожидать, в отсутствие ингибитора скорость лизиса геля немодифодшрованным активаторным комплексом выше, чем обоими ацилированными производными (в 1,7 и 2,5 раза, для АН- и ТМАЦ-ПЛ.СК, соответственно), а разница в начальных скоростях фибринолиза двумя ацилированными активаторными комплексами незначительна, несмотря на двухкратное различие в их скоростях деацилирова-ния. В присутствии же ингибиторов плазмы АН- и ТМАЦ-ПЛ.СК проявляли более высокую фабринолитическую эффективность, чем неацилированный акгиваторньй комплекс (рис.4,(5)). Следовательно, в системе гель из плазмы / плазма ацилированные активаторные комплексы остаются запшиен-ными от инактивации ингибиторами плазмы и они успевают сорбироваться на фибриновый сгусток, пока их активные центры не демаскируются.

Рис.4. Кинетика лизиса фибрина ПЛ.СК ( 1 ), АН-пл.ск ( 2 ), ' ТМАЦ-ПЛ.СК ( з ) и ск ( 4 ) в системах фибриновый гель /буфер ( А ) и гель из плазмы / плазма ( Б ). ( рН 7.4, 37ис, концентрация фибринолитиков - 0,041 мкм ).

- и -

Данные, полученные In Yitro, показывают, что в системе, не содержащей ингибиторов плазмы, исследуемые тромболитические агенты по Фиб-рино.татической активности можно расположить в ряд: ПЛ.СК > АН-ПЛ.СК > ТМАЦ-пл.СК > СК. Однако в системе, содержаией ингибиторы плазмы крови человека и другие компоненты, эта последовательность меняется: АН-ПЛ.СК > ТМАЦ-пл.СК > ПЛ.СК > СК. Таким образом, в реальной системе, приближенной к естественным условиям, ацилированные активаторные комплексы обладают максимальной эффективностью, которая, в свою очередь, определяется значением константы.скорости реактивации к3.

б. " Тромболизис свободным и ацилированным активаторнами комплексами в экспериментах на животных

С целью подбора определенного вида животных с особенностями фиб-ринолиза и характером его изменений под влиянием исследуемых препаратов близким таковым у человека проведено сравнение кинетики лизиса фи-бриновых сгустков из плазмы крови человека и животных свободным и ацилированным активаторным комплексом ПЛ.СК. Рис.5 иллюстрирует кинетику Фибринолиза ТМАЦ-ПЛ.СК в системах: сгусток из плазмы крови животного или человека / плазма кролика (1),юрской свинки (2) и человека (3).

¿1, мм

Рис.5, кинетика Фибринолиза 0,35 мкМ ТМАЦ-ПЛ.СК комплекса в системе гель из плазмы/плазма, кролика (1), морской свинки (2). человека (3).

Как видно из рис.5, наблюдаются более низкие скорости лизиса и торможение фибринолиза сгустков из плазмы морской свинки и кролика по сравнению с лизисом геля из плазмы человека. Возможно, это связано с более низкими скоростями активации эндогенных плазминогенов этих видов животных по сравнению со скоростью активации плазминогена человека ком-

плексом плазкин человека.стрептокиназа. Тем не менее, судя по величине начальной скорости реакции, кинетика лизиса сгустков из плазмы морской свинки наиболее близка к скорости лизиса сгустков из плазмы крови человека. В экспериментах in vitro продемонстрирована также зависимость скорости фибринолиза от дозы ацил-активатора, что свидетельствует о его высокой специфической каталитической активности в отношении плаз-миногена морской свинки.

кинетика лизиса сгустков из плазмы морской свинки немодифициро-ванкым комплексом (1) и двумя его ацилированныыи производными тмац-пл.СК (2) и ан-пл.СК (3) при одинаковой дозе всех тромболитических агентов представлена на рис.6. Эффективность фибринолиза ацил-активаторами значительно выше, чем' немодифицированным комплексом ПГ.ск, как и в случае лизиса геля из плазмы крови человека (см. рис.4 сб)), причем ан-пл.СК, имеющий более высокую константу скорости деаци-лирования, чем ТМАЦ-пл.СК, вызывает большую скорость лизиса геля.

i ¿I, ш

Уз

Рис.6. Кинетика фибринолиза сгустков из плазмы морской свинки 0,35 мкМ ПЛ.СК (1), АН-ПЛ.СК (3) и ТМАЦ-ПЛ.СК CZ) комплексами.

60 120 .

Справедливость данного положения была подтверждена в серии .экспериментов in vi yo на морских свинках с модельным венозным тромбозом, сгусток, сформированный m vitro с добавлением ФТЦ-меченого фибриногена, был введен через катетер в яремную вену животного. Через другой катетер, установленный в сонной артерии, вводились тромболитические препараты и отбирались пробы крови. Степень лизиса сгустка определялась по накоплению ФТН-меченых продуктов деградации фибрина (ФТЦ-ГЩФ). Кривые накопления меченого субстрата, (рис.Т(А)) указывают-на относительно низкую активность стрептокиназы (кривая 2) по сравнению с акти-ваторным комплексом (кривая 3). В обоих случаях флуоресценция плазмы не отличалась от исходной через 3 часа, что связано с выведением пре-

Рис.7. Изменение концентрации ФТЦ-меченых ■ продуктов деградации Фибрина (А), концентрации фибриногена (Б) и фибринолитической активности активаторов плазминогена (В) в плазме крови морских свинок после введения 0,05 М трис-НС1 буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М №01 (1), стрептокиназы (2), комплекса ПЛ.СК (3), АН-ПЛ.СК (4) и ТМАЦ-ПЛ.СК (5) комплексов ( 50000 ЕдЛСЮ/кг веса животных)

паратов из организма, лизис сгустка ацилированными комплексами продолжался несколько часов (кривые 4 и 5), причем ТМАЦ-ПЛ.СК комплекс, реактивирующий с меньшей скоростью (см. табл.4), проявляет литическую активность более длительное время,- чем-АН-пл.ск и свободный пл.ск. Аналогичные результаты получены также иммунохимическим методом по накоплению в кровотоке продуктов деградации фибрина и фибриногена.

Ацилированнке производные активаторного комплекса ПЛ.СК оказывают менее выраженное влияние на фибриноген плазмы крови: концентрация Фибриногена снижалась не более, чем на 20 % (см. кривые 4 и 5, рис.7 (Б)), в то время, как под действием стрептокиназы и комплекса ПЛ.СК уровень фибриногена снижался соответственно на 38 и 50 % (кривые 2 и 3, рис.7(Б)). Можно предположить, что системная деградация белков плазмы крови (в данном случае фибриногена), в основном зависит от скорости активации эндогенного плазминогена в плазмин после введения активаторов. Обратимое ацилирование активаторов плазминогена позволяет снизить системную генерацию плазмина в кровотоке и уменьшить фибриногено-лиз и протеолиз других важных белков плазмы крови.

Анализ изменения активаторной активности эуглобулиновой фракции плазмы крови морской свинки под действием данных тромболитиков (см. рис.7(В)) показал, что ацил-активаторы (кривые 4 и 5), как и отдалось, не вызывают столь резкого, кратковременного повышения активности, как стрептокиназа и комплекс ПЛ.СК (кривые 2 и 3). Напротив, постепенное увеличение активаторов активности наблюдалось лишь через зо и 90 мин после введения АН-ПЛ.ск и ТМАЦ-ПЛ.СК. соответственно.

таким образом, ацил-активаторные комплексы по сравнению со стреп-токиназой и комплексом ПЛ.СК обеспечивают постепенное нарастание активаторной активости и сохранение ее в течение длительного времени. Это объясняется тем, что ацил-активаторы до их реактивации остаются защи-иенными от взаимодействия' с ингибиторами крови, в то время как комплекс ПЛ.СК, образующийся в кровотоке- при введении стрептокиназы или введенный в преформированном виде, быстро нейтрализуются ингибиторами.

ВЫВОДЫ

1. Выделены препараты плазминогена из различных образцов плазмы крови человека ( плацентарной, абортной и незамороженной донорской ) и ее Фракций. Показано, что плазминоген, выделенный из нативной донорской плазмы крови, обладает максимальной потенциальной ферментативной активностью ( удельная активность 60-7Os ). Препарат электрофо-ретически гомогенен ( Mp=850G0 Да, Лиз-форма !.

2. Изучена кинетика активации плазминогена различными активаторами: иммобилизованными трипсином и урскиназой, а также каталитическими и сте хиомет ричес к ими концентрациями стрептокиназы. оптимизированы условия получения плазмина и эквишлярного комплекса плазмин.стрепто-киназа.

3. Разработаны методы измерения кинетики фибринолиза по нарастанию интенсивности Флуоресценции раствора с использованием флуоресцеин-тиоцианат-фибрина и по уменьшению высоты столба фибринового геля . Диапазон детектируемых концентраций'плазмина весьма широк: от 0,005 до 10 мкМ. Благодаря отсутствию фоновых.помех в последнем методе, он позволяет моделировать различные системы in Yltro и исследовать влияние компонентов плазмы крови на кинетику фибринолиза различными тромболитиками.

4. Оптимизированы условия получения ацил-Ферментов и ацил- актива-торных комплексов плазмин.стрепокиназа: n'-анизоил-, п'-гуанидинбен-

■ зоил- и транс-п'-(Н.Я.Н-триметиламино)-циннамоил-производных. Исследована кинетика реактивации этих производных в присутствии стабилизирующих фермент эффекторов, и определены их константы скоростей деацилирования: 0.6Л0"4, 2,0.10~4 и 4,2.10~4 с-1, соответственно.

5. На модельной системе in vitro, содержащей плазминоген и ингибиторы4 плазмы крови человека, показана большая фибринолитическая активность п'-анизоил- и транс-п•-(н,л,М-триметиламиноШиннамойл -плаз-мин, стрептокиназы по сравнению с неашшрованной формой активаторно-го комплекса и стрептокиназой.

6. Оценена эффективность ацилированных тромболитических агентов в лизисе сгустков из плазмы крови человека и животных различных видов, в экспериментах in vivo на морских свинках с венозным тромбозом показано, что ацил-актнваторные комплексы, в отличие от немодифициро-ванного комплекса шюзмин.стрептокиназа, обладают пролонгированным тромболитическим эффектом и вызывают меньший фибриногенолиз.

основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Р.Б.Айсина, Г.В.Попова, Н.Ф.Казанская. Получение и свойства плаз-мина человека, свободного от активатора.// Вестн.Моск.Ун-та.-Сер.2, ХИМИЯ.-1988. - Т.29. - С.88-92.

2. Р.Б.Айсина, Г.Ю.Попова, Н.Ф.Казанская, синтез и кинетика деацили-рования некоторых ацилплазминов человека.// Вестн.Моск.Ун-та.-Сер.2, ХИМИЯ.-198Т.-.Х28- С.587-591.

3. R.B.Aisina at al. Acylated plazmin derivatives as potential rib rinolytic agents./K.F.Kazanskaya, G.Yu.Popova, r.v.Berezyn.// International conf."cheittcal physics of enzyme catalysis". Abstracts.-Tallinn, 1987.- P.145.

4. Р.Б.Айсина, Г.Ю.Попова, Н.Л.Еремеев. Исследование кинетики фибри-нолиза плазмином in vitro.// VI всесоюзный симпозиум по инженерной энзимологии: тез.докл.- Вильнюс, 1988.- Т.2. - С.50.'

5. Г.Ю.Попова и др. Метод определения плазмина по скорости лизиса фибринового геля./Н.Л.Еремеев, .Р.Б.Айсина, Н.Ф.Казанская. // Бюлл. зксп. биол. и медицины.- 1989.- Т.5.- С.561-564.

6. Г.Ю.попова, Н.Л.Еремеев, Р.Б.Айсина. Методы непрерывного контроля скорости лизиса фибрина m vitro.// IV Всесоюзная научная конференция "Противотромболитическая терапия в клинической практике. Вопросы фибринолиза и тромболкза": Тез.докл.- Ялта, 1988. - С.117.

7. Н.Л.Еремеев, Р.Б.Айсина, Г.Ю.Попова. Вклад активации и ингибиро-вания в кинетику фибринолиза.// Всесоюзная научно-проктическая конференция "ферменты-народному хозяйству: Тез.докл.-Черновцы, 1990.-с. 128

8. G.BashKov et al. Thrombolytic properties of acylated piasmin-streptokinase complexes having different rates of reactivation./ R.Aisina, H.Kazanskaya, V.Makarov, A.SirotenKo, G.Popova, Y.JitKova. // llthInternational congress on Thromboses: Abstracts.- Lubl^ana, 1990,- Fibrinolysis.- 1990.- Vol.4, Suppl.l. - P.29.

9. Р.Б.Айсина и др. ■ Кинетика фибринолиза in vitro плазмином и экви-моляркым комплексом плазмин.стрептокиназа./ю.В.Житкова, Н.Л.Еремеев, Г.Ю.Попова, н.Ф.казанская.// Укр.биохим.журн.-1991.- т.63 - с.20-26. Ю. Р.Б.Айсина и др. Фибринолиз in Yitro ацйлированными производными активаторного комплекса плазмин.стрептокиназа./Г.Ю.Попова, Н.л.Еремеев, Н.Ф.Казанская. // Укр.биохим-.журн. -1991.- т.63, N2.- с.27-31. и. Р.Б.Айсина и др. Оценка эффективности ацилированных тромболити-ческих агентов в лизисе сгустков из плазмы крови человека и животных различных видов./ Г.В.Башков, Н.Л.Еремеев, Г.Ю.Попова, Н.Ф. Казаф>-кая. // Укр. биохим. журн." 1991.- Т.63, N1.. - С.31-37. —J Я