Синтез и исследование биологического действия N-ацилированных биогенных аминов и их аналогов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Кромова Татьяна Александровна

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ N-АЦИЛИРОВАННЫХ БИОГЕННЫХ АМИНОВ И ИХ АНАЛОГОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Л*'

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор

доктор химических наук, профессор

Евстигнеева Рима Порфирьевна

Миронов Андрей Федорович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Швачкин Юрий Петрович Ковалев Игорь Ефимович

Ведущая организация:

Федеральное государственное унитарное предприятие Институт химических реактивов и особо чистых веществ

Защита состоится «•/ » >""С"2004 г в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, д 1

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета: кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Лютик А.И.

Ш5-Ц 46399

3

смогоо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что низкомолекулярные N-ацильные производные биогенных аминов широко распространены в растительном и животном мире, но при этом недостаточно изучены. Ранее в нашей лаборатории было синтезировано природное соединение этого ряда у-глутамилгистамин. Для него были обнаружены разнообразные виды биологической активности, исследованы механизмы его действия и показана перспективность биомедицинского использования. Кроме у-глутамильных производных биогенных аминов, в нервных тканях животных происходит биосинтез семейства родственных N-ацетиласпартилсодержащих пептидоаминов, исследование которых также представляет большой интерес.

Расширение числа объектов исследования в настоящей работе связано и с эволюционным аспектом, заключающимся в изучении действия древних метаболитов биогенных аминов из растений и беспозвоночных на организм млекопитающих. В связи с этим нами было предпринято исследование еще одной группы природных фенилсодержащих N-ацильных производных различных биогенных аминов из растений.

N-Ацильные производные биогенных аминов выгодно отличаются от веществ антибиотического ряда или химических соединений из других групп биологически активных соединений низкими эффективными дозами, отсутствием токсичности, простотой структуры, что повышает их привлекательность в качестве основы для создания лекарственных средств. Модификация структуры этих природных соединений дает потенциальную возможность создавать вещества с более высокой биологической активностью и без побочных эффектов. В данной работе продолжены исследования у-глутамилгистамина, а также предпринят синтез и изучение свойств двух семейств природных пептидоаминов и их аналогов.

Настоящая работа выполнена при технической и финансовой поддержке ООО "Фарминтерпрайсез", фанта РФФИ по поддержке ведущих научных школ № 0015-97866 и фанта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2013.2003.3.

СОД - супероксиддисмутаза; ПГ - простагландин; ТХ - тромбоксан; АА - арахидоновая кислота; DCC - М,Ы'-дициклогексилкарбодиимид; DMF - N.N-диметилформамид; НА - гистамин; HETE -гидроксиэйкозатетраеновая кислота; 5-НТ - серотонин; HO-PhPr - 3-(4-гидроксифенил)пропионовая кислота; PfpOH - пентафторфенол; PEA- фенилэтиламин; Pd/C - палладий на угле; ТА - тирамин, ТгрА-триптамин. ,

Цель работы.

1. Разработка способов получения аспартильных производных гистамина различного строения и исследование их антиоксидантных и антигипоксических свойств в сравнении с у-глутамилгистамином.

2. Отработка условий N-ацилирования биогенных аминов и аминокислот.

3. Синтез природных фенилсодержащих N-ацильных производных биогенных аминов - триптамина, тирамина, фенилэтиламина и их аналогов, исследование их влияния на метаболизм арахидоновой кислоты и биологических свойств (анальгетическое, противовоспалительное действие).

Научная новизна. Впервые синтезированы и полностью охарактеризованы а- и р-аспартильные производные гистамина, в том числе N-ацетилированные, а также соответствующие циклические производные Исследована и минимизирована побочная реакция необычно легкой внутримолекулярной циклизации. С использованием различных модельных систем в ряду

синтезированных глутамильных и аспартильных производных гистамина выявлены вещества, воздействующие на ферменты антиоксидантной защиты организма и активные формы кислорода, а также обладающие антигипоксическими свойствами. С использованием двухфазной системы синтезированы новые аналоги у-глутамилгистамина, содержащие остаток дикарбоновой кислоты. Получен ряд природных N-ацильных производных биогенных аминов из растений и их аналогов, содержащих индольные, фенильные и л-гидроксифенильные группы. Показано, что эти соединения способны модулировать метаболизм арахидоновой кислоты и проявлять анальгетическое и противовоспалительное действие. Практическое значение работы. Результаты исследования расширяют представления о биологических функциях и молекулярных механизмах действия природных N-ацильных производных биогенных аминов. Получены новые аналоги этих пептидоаминов с биологическими эффектами, позволяющими использовать их в качестве основы для создания новых лекарственных средств. Данные по изучению взаимосвязи структуры и функции в ряду полученных соединений могут быть использованы для конструирования пептидоаминов с заданными свойствами. Основные положения, выносимые на защиту:

- синтез новых аналогов природного соединения у-глутамилгистамина;

- синтез семейства естественных метаболитов эндогенной N-ацетиласпарагиновой кислоты и их дезацетилированных аналогов;

- синтез природных фенилсодержащих N-ацильных производных биогенных аминов;

- изучение анальгетического и антигипоксического действия полученных соединений, а также механизма их действия в качестве антиоксидантов и соединений, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты.

Публикации. По материалам диссертации опубликован обзор. Результаты работы отражены в 1 статье и 8 тезисах докладов на Международных и Российских конференциях, симпозиумах и съезде; 1 статья находится в печати. Апробация. Результаты диссертационной работы частично доложены на VII Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии-200Г (Ярославль, 2001); на XIV зимней Международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002); на VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002); на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); на VII конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных (Калининград, 2003); на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003); на X Международной научно-технической конференции "Наукоемкиехимические технологии-2004" (Волгоград, 2004). Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на -^-^"стр. машинописного текста, содержитрисунков, таблиц, схем, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве объектов исследования были выбраны низкомолекулярные эндогенные пептидоамины, обнаруженные в нервных тканях млекопитающих: глутамилгистамин, N-ацетиласпартильные производные гистамина, а также фенилсодержащие N-ацильные производные других биогенных аминов - тирамина, фенилэтиламина, триптамина, серотонина, обнаруженные в различных растениях, а также их структурные аналоги, соответствующие общей формуле (I) (табл. 1).

Ri-CONH-CH-CHi-Rs (I)

В формуле представляет радикал,

замещенный одной или двумя функциональными группами; фенил- или п-

гидроксифенил-, Я2 - атом водорода или карбоксил; Я3 - имидазолил-, индолил или его гидроксильное производное (5-гидроксииндолил-); фенил-, п-гидроксифенил- или Сг-Сз-углеводородный радикал, замещенный функциональной группой.

Таблица 1

Синтезированные пептидоамины и их аналоги

№ соед. название соединения 1*2 1*3

1 2 3 4

II НООС-СН-СН2-СН2- мн2 у-глутамилгистамин "ь н о" в н , -4-1т

III НООС-(СНг)3-глутарилгистамин6 н -4-1т

IV ж2-сн- ¿Нг-СНг-СООН а-глутамилтриптамин н Т£> н , -3-1пс1

V ^мн-сн-со- СН2-СН2 пироглутамилтриптамин н -3-1пс1

VI НООС-(СН2)3-№-глутариллизина -соон -(СНг)3-1ЧН2

VII СНз-СОМН-СН- ¿нгсоон К1-ацетил-а-аспартилгистамина н -4-1т

VIII СНгСОЫН-СН-СНг-¿ООН 1Ч-ацетил-3-аспартилгистамина н -4-1т

IX -О Я,-СОМН- = СНгС01ЧН-СН - сг о М-ацетиламиносукцинимидогистамин' н -4-1т

X тг-сн- ¿Нг-СООН а-аспартилгистамин н -4-1 т

XI ИНг-СН-СНг ¿ООН 3-аспартилгистамин н -4-1т

XII ^-ССМН- = МНуСН - С' 1 СНг-СС аминосукцинимидогистамин н -4-1т

1 2 3 4

XIII Q-CH-CH. циннамоилтриптаминаЬ н -3-lnd

XIV ^ ^-СНг-СНу 3-фенилпропионилтриптамин н -3-lnd

XV ^^-СНгСНг- 3-фенилпропионипсеротонин н VT н

XVI ^-СНг-СНг- 3-фенилпропионилфенилэтиламина,ь н О

XVII ^-СНг-СН;- 3-фениллропионилтирамин н 0~°н

XVIII /жумароилтирамин8 ь н О"

XIX 3-(/7-гидроксифенил)пропионил-тираминь н о»

XX 3-(л-гидроксифенил)пропионил-фенилэтиламинь н о

XXI 3-(л-гидроксифенил)пропионил-тироэин -соон о*

XXII но-^сн, л-гидроксифенилацетилтирамин н

XXIII НО-^ ^-СНг- л-гидроксифенилацетилфенилэтиламин н о

' • природные соединения " - синтезированные ранее

Ранее в нашей лаборатории был осуществлен синтез некоторых природных соединений этого ряда, в том числе - у-глутамилгистамина (II) и его близких аналогов, в частности N-глутарилгистамина (III). Для этих соединений были выявлены многочисленные полезные фармакологические эффекты, некоторые механизмы действия и влияние на важнейшие регуляторные системы организма.

С целью изучения взаимосвязи между структурой и активностью и получения потенциально более эффективных соединений в данной работе были осуществлены модификации структуры у-глутамилгистамина (II) (рис. 1).

1 - дезаминирование, ацетилирование; 2 - декарбоксилирование; 3 - изменение длины этиленового мостика; 4 - введение дополнительных заместителей; 5 - замена имидазольного остатка

Рис. 1. Основные направления модификации структуры молекулы у-глутамилгистамина (II)

На первом этапе работы нами был осуществлен синтез у-глутамилгистамина (II), а также его аналогов пироглутамилтриптамина (V) и а-глутамилтриптамина (IV).

у-Глутамилгистамин (II) был синтезирован методом активированных пентафторфениловых эфиров по методике, разработанной ранее в лаборатории. При синтезе а-глутамилтриптамина (IV) успешно применен другой метод - метод смешанных ангидридов.

Синтез других новых аналогов у-глутамилгистамина (II), соответствующих общей формуле (I), осуществляли классическими методами пептидной химии с применением активированных пентафторфениловых и Ы-оксисукцинимидных эфиров, а также хлорангидридным методом. В качестве активированных производных дикарбоновых кислот применяли их внутренние ангидриды.

С целью выявления биологической активности, а также установления взаимосвязи между структурой и функцией в ряду природных производных биогенных аминов, обнаруженных в мозге млекопитающих, нами впервые синтезированы и охарактеризованы аспартильные производные гистамина, представляющие собой семейство эндогенных метаболитов Ы-ацетиласпарагиновой кислоты. Поскольку физиологическое значение этих соединений пока не ясно, то установление их биологической активности является актуальной задачей. Эти

N11^ - СН - СН2 - СН2 СО.\Н - СН2 - СН2 -Г-N

1.1. Синтез аспартильных производных гистамина

соединения представляют собой М"-ацетилированные ct-/ß- производные аспартилгистамина или их циклический сукцинимидный аналог.

На первом этапе синтеза были получены незамещенные по аминогруппе аналоги этих соединений (X, XII, XII). Известно, что при синтезе пептидов, включающих аминокислотную последовательность Asp-His, может протекать реакция образования циклического сукцинимидного производного, например, при действии кислот и оснований. С целью исключения подобных воздействий в ходе синтеза на пептидоамин AspHA, представляющий собой декарбоксилированный пептид AspHis, а также для сокращения числа стадий, нами для защиты NH2- и а-или р-СООН групп аспарагиновой кислоты были выбраны соответственно бензилоксикарбонильная (Z-) и бензильная (Bzl-) защитные группы. Для создания амидной связи использовались активированные пентафторфениловые эфиры аспарагиновой кислоты. Реакция пептидообразования с эквивалентным количеством гистамина в безводном диметилформамиде протекала с высоким выходом. При этом, судя по ТСХ, наряду с целевыми продуктами Z-X(OBzl) или Z-XI-OBzl наблюдалось образование побочного соединения - циклического сукцинимидного производного Z-XII, строение которого подтверждено масс-спектрометрически, (m/z 342.7) (схема 1). В соответствии с результатами масс-спектрометрии неочищенной смеси соединений Z-X(OBzl) или Z-XI-OBzl с Z-XII, содержание в ней циклического производного Z-XH составляло около 30% от количества соответствующего линейного аналога. В ходе хроматографирования на колонке для разделения смеси линейного и циклического продуктов и даже при хранении этой смеси содержание побочного продукта увеличивалось практически до 100 %.

Вследствие такой необычно легкой циклизации защищенных производных AspHA разделение соединений Z-X(OBzl) или Z-XI-OBzl и Z-XII на этой стадии представляется нецелесообразным. Поэтому нами была подобрана схема синтеза соединений -AspHA (X) и -AspHA (XI), минимизирующая какие-либо воздействия на соответствующие защищенные производные. При этом смесь Z-X(OBzl) или Z-XI-OBzl с Z-XII без разделения подвергалась каталитическому гидрогенолизу. Отделение линейных продуктов X и XI от циклического производного XII проводилось на конечной стадии, используя их различную растворимость в изопропаноле. В результате использования такой схемы выходы -AspHA (X) и AspHA (XI), считая на исходные удалось повысить почти

до 40 %.

Схема 1

Синтез а-АзрНА (X), р-АврНА (XI) и аминосукцинимидогистамина (XII)

При синтезе ^ацетильных производных аспартилгистамина в качестве исходных соединений были использованы p-AspOBzl или a-AspOBzl, которые ацетилировали уксусным ангидридом. Активация карбоксильной группы и создание пептидной связи проводились в условиях, описанных выше для Z-защищенных производных. При синтезе Ас-производных Asp-HA также наблюдалось образование циклического производного IX. Последнее было успешно выделено в индивидуальном состоянии, используя различную растворимость в хлороформе защищенного линейного аналога До-УП(ОВ21) и дебензилированного IX. Из сравнения ИК-Фурье-спектров соединений До-УП-ОВ21 и IX, видно, что в случае циклического сукцинимидного производного IX появляется сильная полоса поглощения при 1700 см"1 и слабая - при 1779 см"1, соответствующие валентным колебаниям карбонильных групп в составе пятичленных циклических имидов. В то

же время в области, характерной для карбонила сложноэфирной связи (1736 см"1), наблюдается поглощение в ИК-спектре соединения Ac-VII(OBzl), и оно отсутствует в спектре циклического производного IX. Существенное снижение поглощения в области амида I (1660-1650 см"1) и амида II (1580-1550 см"1) также указывает на отсутствие протона, входящего в состав пептидной связи. Анализ масс- и ПМР спектров продемонстрировал отсутствие бензильной защиты у соединения IX. Аналогично схемам получения смесь соединений Ac-VIII(OBzl) и

IX также подвергалась каталитическому гидрированию. Линейное соединение VIII из полученной смеси отделяли от циклического производного IX переосаждением из метанола ацетоном. Данная схема синтеза (схема 2) и в случае N-Ac-производных позволила повысить выход линейных продуктов до 54 %, считая на исходные Asp(OBzl) или Asp-OBzl.

Для целенаправленного синтеза циклических соединений XII и IX реакционную смесь, после окончания пептидообразования, обрабатывали триэтиламином (рН 8) в течение 15 мин.

Схема 2

Синтез Ac-a-AspHA (VII), Ac-p-AspHA (VIII)

и N-ацетиламиносукцинимидогистамина (l)Q

Строение и индивидуальность синтезированных соединений подтверждены физико-химическими методами анализа: ВЭЖХ, 1Н-ЯМР, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, данными элементного анализа, удельными углами оптического вращения.

Таблица 2

Физико-химические характеристики соединений X, XI, XII

№ соединения Масс-спектр, m/z (MALDI-MS) ТСХ, Rf1 [a]DM, метанол-вода(1:1) Тпл, °

X [М+НГ 227.0 0.71 - 7.47° (С 0.35) 207-209

XI [M+Hf 227.1 0.67 -10.52° (С 0.29) 196-198

XII [М+НГ 209.0 0.76 -42.72° (С 0.32) 150-152

- пластины Kieselgel 60 F2s4, изопропанол - вода - 25% аммиак (6:1:3)

1.2 Синтез соединений III и VI, содержащих остаток дикарбоновой кислоты

Ранее в нашей лаборатории были получены N-ацильные производные различных биогенных аминов, включающие остатки дикарбоновых кислот. В ряду синтезированных соединений было выявлено соединение глутарилгистамин (III), обладающие интересными фармакологическими свойствами. Поэтому одной из задач данной работы явилась отработка методов синтеза этого соединения. Кроме того, с целью выявления важности остатка биогенного амина для проявления биологической активности нами получен его новый аминокислотный аналог - Na-глутариллизин (VI).

Синтез соединений подобной структуры, например глутарилгистамина (III), ранее проводился в среде безводного DMF. Нами данная реакция проводилась в двухфазной среде, состоящей из воды и подходящего органического растворителя, путем N-ацилирования внутренним ангидридом дикарбоновой кислоты в соответствии со схемой 3. При этом оказалось возможным использование избытка ацилирующего агента, что позволило добиться практически полной конверсии дорогостоящего аминокомпонента - гистамина, и получить соединение III с достаточно высоким выходом (70%).

Схема 3

Схема синтеза глутарилгистамина (III)

В ходе синтеза №-глутариллизина (VI) исходное защищенное производное NeZ-Lys растворяли в смеси вода - диоксан (1:1) при рН 8-9. При действии 2-х эквивалентов глутарового ангидрида при рН 8 реакция протекала практически нацело в течение 2 часов. После подкисления реакционной смеси до рН 4 и экстракции этилацетатом был получен с высоким выходом 78 % без

дополнительной очистки, так как глутаровая кислота, образующаяся из непрореагировавшего ангидрида, переходит в водную фазу. После удаления бензилоксикарбонильной защиты каталитическим гидрогенолизом и очистки перекристаллизацией целевой продукт -глутариллизин (VI) получали с выходом 54%.

Описанные подходы к синтезу могут быть использованы для синтеза глутарильных производных других аминокислот.

Структура синтезированных соединений была подтверждена данными 1Н-ЯМР, ИК- спектроскопией и масс-спектрометрией, а их индивидуальность - ВЭЖХ.

1.3. Синтез природных фенилсодержащие N-ацильных производных различных биогенных аминов (ТгрА, 5-НТ, ТА, PEA) и их аналогов

Расширяя исследования в области природных производных биогенных аминов, нами был предпринят синтез других природных N-ацильных производных биогенных аминов (XIII-XXIII, табл. 1). Известно, что в растениях распространены производные разнообразных биогенных аминов (гистамина, триптамина, серотонина, тирамина, фенилэтиламина), аминогруппа которых модифицирована ацильным остатком, содержащим ароматический заместитель (фенильный, фенольный, в том числе дополнительно замещенный метокси группой), причем N-ацильный заместитель может содержать двойную связь. Эти соединения обнаружены только в высших растениях, в отличие от производных биогенных аминов, содержащих гидрофильный N-ацильный заместитель, и рассмотренных в первой части работы (соединения II-XII, табл. 1).

Предпосылкой для изучения данных соединений в настоящей работе послужили немногочисленные литературные данные об антиоксидантной активности циннамоильных и п-кумароильных производных биогенных аминов триптамина, серотонина, тирамина, фенилэтиламина и их способности ингибировать ферменты каскада арахидоновой кислоты.

С целью создания новых селективных ингибиторов биосинтеза простагландинов нами были получены и охарактеризованы природные соединения

(XIII, XVI, XVIII) и их аналоги (XIV, XV, XVII, Ж-ШО, соответствующие общей формуле (I), где ^-СО- представляет собой остаток циннамовой, п-кумаровой, 3-фенилпропионовой, 3-(п-гидроксифенил)пропионовой, л-гидроксифенилуксусной кислоты, а -МН-СН-СНгСКгИ^з - остаток тирамина, фенилэтиламина, тирозина, триптамина, серотонина (табл. 1).

Создание амидной связи осуществлялось методом активированных N оксисукцинимидных эфиров (для соединений XVI, XVIII-XXIII), а также хлорангидридным методом (для XIII-XV, XVII) (схема 4). Выходы целевых соединений XIII-XV, содержащих остатки триптамина и серотонина, не превышали 50 %, в то время как фенилпропионилтирамин (XVII) был получен с выходом 80 %. Ранее синтез подобных соединений, например XIII, XVIII и XIX, проводили методом DCC. Однако в этом случае выходы были значительно снижены из-за необходимости применения хроматографических способов очистки целевых соединений. В противоположность этому, применение нами метода активированных ^оксисукцинимидных эфиров было более успешным. Реакция получения последних с применением DCC проходила с высокими выходами (около 90 %), несмотря на наличие в них фенольного гидроксила. В DMF реакция образования амидной связи с применением ^оксисукцинимидных эфиров приводила к целевому продукту быстро (за 1-2 часа) с высокими выходами 70-80 % и без хроматографической очистки.

Схема 4

Общая схема синтеза соединений XVI, XVI11 -XXI11

НОМви

РСС

я-

о

(СН2)п -СОСШи

К I*! » Н или ОН п = 1 или 2

Я-

о

Все полученные соединения (XIII-XXIII) охарактеризованы с помощью ТСХ и ВЭЖХ; 1Н-ЯМР, ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, данными элементного анализа.

2. Изучение биологических свойств синтезированных соединений

2.1. Влияние синтезированных природных фенилсодержащих N-ацильных производных биогенных аминов и их аналогов на метаболизм арахидоновой

кислоты

Фармакологическое действие многих лекарственных препаратов обусловлено регуляцией биосинтеза метаболитов арахидоновой кислоты.

В настоящее время поиск веществ природного происхождения, проявляющих специфическую ингибирующую активность по отношению к ферментам каскада арахидоновой кислоты остается актуальным.

Учитывая литературные данные о способности амидов циннамовой и п-кумаровой кислот и соответствующих биогенных аминов (тирамин, фенилэтиламин) ингибировать биосинтез простагландинов и различные виды липоксигеназ, нами было предпринято исследование возможного влияния синтезированных соединений (XIII-XXIII) на каскад арахидоновой кислоты

Изучение профиля эйкозаноидов в бесклеточном гомогенате легочной ткани мыши in vitro позволило выявить ингибиторы разной степени эффективности и селективности (табл. 3, 4). Соединения, содержащие ТгрА и 5-НТ (XIII - XV), практически не оказывают влияния на метаболизм арахидоновой кислоты. Видно, что соединения XIX и XX, включающие остатки ТА и PEA, в наибольшей степени ингибируют биосинтез циклооксгеназных метаболитов ТХВ2, ПГЕ и в меньшей степени - б-кето^^, П^2а. При этом воздействие на биосинтез метаболитов липоксигеназы несущественно (табл. 3).

Таблица 3

Влияние соединений XVI, XIX, XX на метаболизм [14С]арахидоновой кислоты (в % к контролю) в бесклеточном гомогенате легочной ткани мыши in vitro*

№ соед. 6-кето-ntfio гптга ТХВ2 пге2 аа Простаноиды Л/о метаболиты

XIX" -9 -15 -42 -38 +27 -22 -1

XX" -30 -27 -40 -38 +47 -33 0

XV! м -9 -6 -33 -23 +24 -15 +4

XIX-C -7 0 -30 +18 -12 -33

ХХ-С -2 +5 +4 +9 +2 -28

XIX-C - смесь 3-(п-гидроксифенил)пропионовой кислоты и тирамина,

XX-С- смесь 3-(п-гидроксифенил)пропионовой кислоты и фенилэтиламина

Соединения XVII, XXII и XXIII оказались неселективными ингибиторами как циклооксигеназного, так и липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты (табл.4).

Таблица 4

Влияние соединений XVII, XXII, XXIII на метаболизм [14С]арахидоновой кислоты (в % к контролю) в бесклеточном гомогенате легочной ткани мыши in vitro*

№ соед. 6-кето- ,-г™, пгт1в пгр2п тхв2 пге2 аа Простаноиды Л/о метаболиты

XVII -42 -47 +42 -44 -45

XXII -45 -32 +22 -40 -22

XXIII -45 -33 +40 -40 -35

Из результатов, приведенных в таблице 4, видно, что уменьшение длины N ацильного заместителя на один углеродный атом в соединениях XXII, XXIII, являющихся новыми аналогами соединений XIX, XX, приводит к снижению селективности ингибирования биосинтеза циклооксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты.

Способность отдельных представителей синтезированных нами фенилсодержащих ^ацильных производных биогенных аминов ингибировать преимущественно биосинтез простагландинов подобно большинству типичных НПВП, послужила предпосылкой для изучения возможных анальгетических и противовоспалительных свойств данных соединений.

2.2. Анальгетическая и противовоспалительная активность фенилсодержащих №ацильных производных биогенных аминов

Анальгетический эффект синтезированных соединений оценивали в различных моделях на мышах: по способности уменьшать число болевых реакций -"корчей", при внутрибрюшинном введении 0,75% раствора уксусной кислоты и в тесте "горячая пластина".

Оказалось, что соединения (XX, XIX) в тесте "корчи" проявляют анальгетическую активность, сравнимую с диклофенаком - препаратом сравнения. Кроме того, наблюдается корреляция между степенью ингибирования биосинтеза метаболитов арахидоновой кислоты (табл. 3) и величиной проявляемого анальгетического эффекта (рис. 2). Поскольку смеси 3-(п-гидроксифенил)пропионовой кислоты и тирамина или фенилэтиламина не действуют на метаболизм арахидоновой кислоты и не обладают анальгетическим

•Исследования проводили в НИИ Канцерогенеза ОНЦ им. Н Н. Блохина РАМН.

действием при исследовании на данной модели, то, по-видимому, наличие ковалентной связи необходимо для проявления данных свойств.

фенакЮ мг/кг

Рис. 2. Результаты изучения анальгетической активности исследуемых

**

соединений в тесте" корчи" (доза 10 мг/кг).

Предварительные данные по исследованию анальгетического действия некоторых синтезированных веществ в тесте "горячая пластина" (рис. 3) показали, что соединения XIX, XX, XXI достоверно увеличивают порог болевой чувствительности, причем для достижения сравнимого эффекта их действующие дозы, по крайней мере, на порядок ниже доз препарата сравнения - парацетамола, обладающего преимущественно болеутоляющим и жаропонижающим действием.

180 160 140

* 120

I 100

£

£ 80

40 20 0

парацетамол XVI XVIII XIX XX XXI XXII XXIII

200 мг/кг

Рис. 3. Анальгетическое действие соединений XVI, XVIII, XIX - XXIII (10 мг/кг) и препарата сравнения парацетамола в тесте "горячая пластина" через 2 часа после введения.**

Таким образом, синтетические аналоги XX и XIX представляют наибольший интерес, поскольку в обоих тестах болевой чувствительности продемонстрировали выраженное анальгетическое действие.

** Исследования синтезированных соединений в соответствии с главами 2.2 и 2.4 были проведены в ВНЦ БАВ (Купавна, Моск. обл.).

В результате модификации структуры природного соединения фенилпропионилфенилэтиламина (XVI) был выявлен его искусственный аналог - 3-(п-гидроксифенил)пропионилтирамин (XIX), обладающий в 4 раза более высокой активностью, чем прототип в тесте "горячая пластина". Получены данные о взаимосвязи структуры и активности в исследуемом ряду соединений.

Предварительные исследования показали, что 3-(л-

гидроксифенил)пропионилфениэтиламин (XX) проявляют также и противовоспалительное действие in vivo, сравнимое с индометацином - препаратом сравнения при действующей дозе на порядок ниже, чем у последнего. При изучении ульцерогенного действия соединения XX при внутрижелудочном введении в дозе 10 мг/кг язвенного поражения слизистой оболочки желудка крыс не обнаружено.

2.3. Поведение N-ацильных производных гистамина в модельных системах, продуцирующих и утилизирующих активные формы кислорода

С целью дальнейшего изучения механизмов биологического действия и фармакологических эффектов эндогенных N - ацильных производных гистамина из мозга млекопитающих нами было проверено влияние у-глутам ил гистамина (II) и его аналогов на ферменты антиоксидантной защиты и на протекание реакции Фентона. В интервале концентраций от 10"14 до 10"4 М ни у одного из исследуемых соединений не было выявлено заметного эффекта (более 10%) на генерацию ОН' радикала в условиях реакции Фентона. Таким образом, можно прогнозировать, что, скорее всего, N-ацильные производные гистамина из мозга млекопитающих (II, VII-IX), а также их аналоги (III, X-XII) не обладают способностью усиливать генерацию ОН' радикала in vivo.

Влияние эффектора на протекание реакции Фентона может быть обусловлено непосредственным взаимодействием вещества с ОН' радикалом или снижением конверсии Н2О2. Для у-глутамилгистамина (II) первое ранее было продемонстрировано радиационно-химическими методами, а влияние на скорость конверсии явилось следующей задачей настоящего исследования.

Экспериментальная проверка возможного второго механизма проводилась в системе Фентона при тех же концентрациях

соответственно, со спектрофотометрическим измерением количества перекиси водорода. Оказалось, что у-глутамилгистамин (II) в концентрациях Ю^-Ю"3 М тормозит конверсию перекиси водорода на 10-25% (рис. 5). Интересно, что при низких концентрациях М данного вещества наблюдался второй максимум

торможения конверсии перекиси водорода.

* -14 -12 -10 -8 -6 -4

Ig концентрации исследуемых соединений, моль/л

-соединение II -соединение III

Рис. 5. Влияние соединений II, III на конверсию перекиси водорода в системе Фентона, содержащей FeSC>4 1 8 10"3 М, Н202 1.1-10"2 М, буфер 50 тМ трис-HCI, рН 7.4*".

Таким образом, у-глутамилгистамин (II) тормозит конверсию перекиси водорода в условиях реакции Фентона в широком интервале концентраций (10"1,-10"3 М) и в то же время эффективно взаимодействует с ОН' радикалом (константа скорости взаимодействия 7.5-109 М'1секи), что может суммарно обеспечить его антирадикальный эффект, особенно при низких концентрациях

На следующем этапе работы было исследовано влияние соединения II на изолированные ферменты антиоксидантной защиты организма: Zn/Cu СОД и каталазу В физиологическом интервале концентраций (около 10'® М) оказалось, что у-глутамилгистамин (II) умеренно активирует СОД, что in vivo может выражаться в понижении содержания и переводе его в менее опасную перекись водорода (рис. 6) Отсутствие воздействия на активность каталазы обеспечивает утилизацию H202 и предотвращает ее накопление

о-}-1-.-1-1-1-

-10 -9 -8 -7-6-5-4 1д концентрации исследуемых соединений, моль/л

Рис 6 Влияние соединений II, III на активность Zn/Cu СОД (из бычьих

-•-соединение II —*г- соединение III

эритроцитов).

Таким образом, основной механизм антиоксидантного действия у-глутамилгистамина (II), может в определенной степени быть обусловлен прямым антирадикальным действием самого вещества, так и способностью его комплексов с ионами металлов каталитически влиять на превращение активных форм кислорода.

Пептидоамин у-глутамилгистамин (II) можно охарактеризовать как биорегулятор двойного действия, который, в зависимости от концентрации может выступать по отношению к СОД и как активатор, и как ингибитор. Отсутствие ЫИ2-группы в ближайшем аналоге глутарилгистамине (III) нивелирует двухфазность действия и превращает это соединение исключительно в ингибитор СОД (рис. 6).

Таким образом, соединение II демонстрирует умеренные антиоксидантные (антирадикальные) эффекты в химических и ферментативных модельных системах при весьма низких концентрациях, близких к физиологическим (Ю-9 М).

Таблица 5

Поведение аспартильных производных гистамина в модельных системах, продуцирующих и утилизирующих активные формы кислорода***

Соединения гп/си сод Каталаза Реакция Фентона, регистрация Н202

10Н10"9М 10В-103М 101+10® М 10*-10'аМ 10'1410'8М 10"8- Ю^М

VII 1...444-4- и 14- Т

VIII ТТ - - 4- 4-...4-1 4-4-

IX - - т ТТТ ■ 1

X - - и 4-1 4»Т Т4

XI т - - ТТ 4--Т 1-Т

4- - ингибирования на 20 %; 4-1 - ингибирование на 40 %; 4-4-4-4- ингибирование на 80 %; 1° активация на 20 %; ТТ - активация на 40 %, ТТТ - активация на 60 %; - - отсутствие влияния

Для изучения взаимосвязи между структурой и функцией в ряду синтезированных соединений нами были исследованы в данных системах аналоги -глутамилгистамина (II). Оказалось, что глутарилгистамин (III) сильнее ингибирует СОД, каталазу и конверсию перекиси водорода (рис. 5, 6). Среди эндогенных метаболитов Ы-ацетиласпарагиновой кислоты, отличающихся меньшей длиной бокового заместителя (на одну метиленовую группу) и наличием Ы-ацетильной группы, был выявлен Ы-ацетил-р-аспартилгистамин (VIII), основные черты антиоксидантного действия которого совпадают с таковыми у у-глутамилгистамина (II). Ы-Ацетиламиносукцинимидогистамин (IX) не оказывает влияния на скорость конверсии Н2О2 в реакции Фентона и на активность 7п/Си СОД, однако, в том же

*** Исследования выполнены на базе РГМУ.

большом интервале концентраций (10"14- 10"4 М) значительно активирует каталазу. Интересно, что все три представителя семейства эндогенных метаболитов N ацетиласпарагиновой кислоты оказывают разнонаправленное действие на ферменты антиоксидантной защиты организма. Модификация структуры этих эндогенных соединений, как правило, приводит к снижению антиоксидантной активности, к появлению селективности действия или обращению эффекта. Так, а-аспартилгистамин (X) оказывает селективное ингибирующее действие на каталазу во всем исследованном интервале концентраций

Таким образом, нами впервые изучено поведение семейства аспартильных производных гистамина (VII-XII) в модельных системах, продуцирующих и утилизирующих активные формы кислорода. В ряду исследованных соединений обнаружены ингибиторы конверсии перекиси водорода в условиях реакции Фентона (VII, VIII) и СОД (X), а также выявлены селективный активатор (IX) и ингибитор (X) каталазы.

2.4. Антигипоксическое действие у-глутамилгистамина и его ближайших

В настоящее время продолжается активный поиск новых соединений и разработка лекарственных средств, способных повышать резистентность организма к гипоксии. Известно, что антигипоксическими свойствами могут обладать вещества с различной химической структурой и механизмами действия, в том числе антиоксиданты и индукторы системы цитохрома Р-450.

Ранее было показано, что у-глутамилгистамин (II) индуцирует систему цитохрома Р-450 печени и обладает антиоксидантными свойствами, вследствие чего может оказывать протективное действие при гипоксии.

-3,6 -2,5 -1,5 -0,5 0,5 1,5 lg концентрации, мг/кг

Рис. 7, Антигипоксическое действие соединений у-глутамилгистамина (II), глутарилгистамина (III), а-аспартилгистамина (X), fJ-аспартилгистамина (XI).**

аналогов

Результаты биологических испытаний, представленные в табл. 6 и на рис. 7, свидетельствуют о том, что природное соединение у-глутамилгистамин (II) действительно обладает антигипоксической активностью.

Наиболее значительный эффект, составивший 150 % от контрольных значений, у-глутамилгистамин (II) проявил в весьма низкой дозе - 0,01 мг/кг, что на 4 порядка ниже сред неэффективной дозы препарата сравнения - оксибутирата натрия. Замечательно, что этот эффект достигнут в действующей концентрации, близкой к физиологической (10~9 М), и при пероральном введении.

Таблица 6

Изменение продолжительности жизни мышей в условиях гипоксии с гиперкапнией под влиянием у- глутамилгистамина (II) и его аналогов при пероральном введении**

Соединение Доза, мг/кг Продолжительность жизни

Минуты % к контролю

у-глутамилгистамин (II) 0,01 38,0 ±2,1**' 150,5"

контроль 1 25,3 ±0.9 100

N- ацетил-а-аспартилгистамин VII 1 35,8 ± 2,5 107,2

0,1 36,3 ± 2,6 108,7

контроль 2 33,4 ±1,7 100

N-ацетиламиносукцинимидагистамин IX 1,0 31,1 ±1,6 99,7

0,1 33,7 ±1,2 108,0

контроль 3 31,2 ±0,7 100

(3-аспартилгистамин XI 0,1 34,4 ±2,12** 121*

контроль 4 28,4 ±1,2 100

1,0 29,2 ± 0,9 115

контроль 5 25,3 ±1,2 100

оксибутират натрия 200 46,5 ± 3.7*6 176*

контроль 6 26,4 ±1,7 100

*, ** - достоверность различий по отношению к контрольным группам, номера которых указаны, * - р < 0,05; ** - р < 0,01.

Учитывая короткое время, предшествующее гипоксии после введения у-глутамилгистамина (II), а также слабую дозозависимость его эффекта, более вероятным представляется предположение о регуляторном и каталитическом механизмах его действия, что подкрепляется весьма низкими действующими концентрациями соединения II.

В группе родственных аспартильных производных гистамина только неприродные соединения - а- и (5- аспартилгистамин (X, XI) оказывают заметное антигипоксическое действие. Таким образом, как и в случае глутамильных производных биогенных аминов, уменьшение количества полярных групп в соответствующих аспартильных производных снижает их антигипоксическое действие.

ВЫВОДЫ:

1. Осуществлен синтез семейства аспартильных производных гистамина -эндогенных метаболитов ^ацетиласпарагиновой кислоты. В ходе синтеза исследована и минимизирована побочная реакция необычно легкой внутримолекулярной циклизации.

2. С применением различных схем синтеза получены новые аналоги у-глутамил гистамина.

3. Установлена способность глутамильного и аспартильных производных гистамина модулировать активность ферментов антиоксидантной защиты организма и регулировать скорость конверсии перекиси водорода в условиях реакции Фентона.

4. Обнаружена способность у-глутам ил гистамина проявлять антиоксидантную и антигипоксическую активность в низких концентрациях, соответствующих физиологическим.

5. В препаративных количествах получены природные фенилсодержащие N ацильные производные различных биогенных аминов растительного происхождения и их аналоги.

6. Показано, что фенилсодержащие ^ацильные производные биогенных аминов обладают анальгетическим и противовоспалительным действием, а также способностью модулировать биосинтез метаболитов арахидоновой кислоты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кржечковская В.В., Желтухина ГА., Небольсин В.Е., Евстигнеева Р.П., Гмошинский И.В., Кондратов С.Ю., Наумов Ю.И., Кромова ТА Изучение антианафилактической активности и механизмов действия у-1_-глутамилгистамина. //Патогенез. 2003. Т. 1. №2. С. 60-64.

2. Кржечковская В.В., Небольсин В.Е., Желтухина Г.А., Кромова Т.А., Евстигнеева Р.П., Наумов Ю.И. Биологическая роль у-глутамилирования белков аминами. // Патогенез. 2003. Т. 1. №2. С. 26-33.

3. Кромова Т.А., Небольсин В.Е., Крысин Е.П., Желтухина ГА. Усовершенствованный способ синтеза у-глутамилгистамина. Тезисы докладов VII международной научно-технической конференции "Наукоемкие-химические технологии - 2001". Ярославль. 19-22 ноября 2001. С.105-106.

4. Кромова ТА, Небольсин В.Е., Желтухина ГА, Евстигнеева Р.П. Синтез пептидных и псевдопептидных аналонов эндогенных производных биогенных

аминов. Тезисы докладов XIV зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 11-15 февраля 2002. С.36.

5. Кромова ТА, Небольсин В.Е., Желтухина ГА, Саприн А.Н., Калинина Е.В. Влияние ряда синтетических имидазолсодержащих пептидов и псевдопептидов на активность супероксиддисмутазы. Тезисы докладов VI международной конференции "Биоантиоксидант". Москва. 16-19 апреля 2002. С.308-309.

6. Кромова ТА., Небольсин В.Е., Желтухина ГА., Евстигнеева Р.П. Синтез и свойства эндогенных производных биогенных аминов и их аналогов. Тезисы докладов III съезда Биохимического общества. Санкт-Петербург. 26 июня-1 июля 2002. С.547-548.

7. Кромова ТА., Небольсин В.Е., Желтухина ГА Подходы к синтезу эндогенных производных N-аминоацильных производных гистамина. Тезисы докладов VIII международной научно-технической конференции по проблемам наукоемких химических технологий "Наукоемкие-химические технологии - 2002" Уфа. 7-10 октября 2002. С.91-92.

8. Kromova Т., Zheltukhina G., Nebolsin V. Synthesis and biological effects of y-glutamylamines from nervous system of Aplysia Californica. Abstracts of the VII East European conference of the international society for invertebrate neurobiology. Kaliningrad. 12-16 September 2003. P.71.

9. Кромова ТА., Небольсин В.Е., Ковалева В.Л., Желтухина ГА. Биологическая активность и синтез природных псевдопептидов и их аналогов. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Москва. 17-19 ноября 2003. С.31.

10. Кромова ТА, Небольсин В.Е., Желтухина ГА., Ковалева В.Л. Поиск подходов к синтезу и изучению свойств N-ацильных производных аминокислот и биогенных аминов. Тезисы докладов X международной научно-технической конференции "Наукоемкие-химические технологии - 2004я. Волгоград. 6-10 сентября 2004. С.267-269.

11. Кромова ТА., Желтухина ГА., Небольсин В.Е., Ковалева В.Л., Кржечковская В.В., Евстигнеева Р.П. Синтез и исследование антигипоксической активности y-L-глутамилгистамина и его аналогов. // Хим. Фарм. журнал. 2004 (в печати).

Результаты биоиспытаний принадлежат ООО "Фарминтерпрайсез" и приведены с ее разрешения.

Принято к исполнению 29/09/2004 Исполнено 30/09/2004

Заказ № 347 Тираж. 90 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat га

»180 6 9

РНБ Русский фонд 2005-4

16399

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. у-Глутамильные производные биогенных аминов.

1. у-Глутамилирование биогенных аминов в организме низших животных.

2. Процесс у-глутамилирования у млекопитающих.

2.1 у-Глутамилирование биогенными аминами белков плазмы и форменных элементов крови.

2.2. Влияние у-глутамилирования белков биогенными аминами на процессы оплодотворения.

2.3. Роль процесса у-глутамилирования в центральной нервоной системе.

2.4. у-Глутамилирование биогенными аминами белков в различных органах и тканях.

2.5. Изменение содержания у-глутамильных производных аминов в условиях патологии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1 Синтез производных биологически активных аминов и их аналогов.

1.1 Синтез аспартильных производных гистамина.

1.2 Синтез соединений III и VI, содержащих остаток дикарбоновой кислоты.

1.3 Синтез природных фенилсодержащих N-ацильных производных различных биогенных аминов (TrpA, 5-НТ, ТА, PEA) и их аналогов.

2. Изучение биологических свойств синтезированных соединений.

2.1 Влияние синтезированных природных фенилсодержащих N-ацильных производных биогенных аминов и их аналогов на метаболизм арахидоновой кислоты.

2.2. Анальгетическая и противовоспалительная активность фенилсодержащих N-ацильных производных биогенных аминов.

2.3. Ульцерогенное действие на примере 3-(и-гидроксифенил)-пропионилфенилэтиламина (XX).

2.4. Поведение N-ацильных производных гистамина в модельных системах, продуцирующих и утилизирующих активные формы кислорода.

2.5. Антигипоксическое действие у-глутамилгистамина и его ближайших аналогов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

Низкомолекулярные производные биогенных аминов (пептидоамины) широко распространены в растительном и животном мире, однако они мало изучены. Эти соединения обнаружены в разных частях растений, в нервных тканях безпозвоночных, во многих органах и тканях млекопитающих, а также в организме млекопитающих и человека в связанном с белками состоянии. В нашей лаборатории был осуществлен синтез и исследование одного из наиболее распространенных представителей этой группы соединений - у-глутамилгистамина. Было установлено регуляторное действие у-глутамилгистамина и его ближайших аналогов на важнейшие биохимические системы организма, а также выявлены некоторые полезные фармакологические свойства [55-58]. Полученные результаты определяют актуальность дальнейших исследований других родственных групп природных пептидоаминов, в частности, аспартилсодержащих, биосинтез которых происходит в мозге млекопитающих.

Теоретический эволюционный аспект настоящей работы заключается в изучении действия древних метаболитов биогенных аминов из беспозвоночных и растений на организм млекопитающих. Этим также определяется расширение числа объектов исследования и включение в него еще одной группы соединений растительного происхождения -фенилсодержащих N-ацильных производных биогенных аминов.

N-Ацильные производные биогенных аминов выгодно отличаются от других биологически активных соединений низкими эффективными дозами, отсутствием токсичности, простотой структуры, что повышает их привлекательность в качестве основы для создания лекарственных средств. Модификация их структуры дает потенциальную возможность создавать аналоги, которые могут обладать усиленным и пролонгированным биологическим действием, измененной фармакологической специфичностью и будут пригодны для орального введения.

В данной работе продолжено изучение у-глутамилгистамина, а также предприняты синтез и исследование свойств двух упомянутых выше семейств природных пептидоаминов и их аналогов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР у-Глутамильные производные биогенных аминов

В течение многих лет исследователями уделяется большое внимание процессу у-глутамилирования в организме животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы [1]. у-Глутамильные производные биогенных аминов и полиаминов обнаружены как в растениях и грибах, так и у моллюсков, червей и млекопитающих (схема 1) [2-5]. Многие авторы считают, что образование у-глутамильных соединений различных аминов имеет большое значение у низших организмов, тогда как у млекопитающих этот путь их метаболизма является атавизмом. Однако приведенные ниже данные дают основание полагать, что у-глутамилирование белков при участии аминов, в том числе гистамина, таурина, путресцина и других, также играет важную роль и у млекопитающих.

В данном обзоре основное внимание обращено на работы, посвященные образованию у-глутамильных производных аминов у различных видов животных. Однако следует упомянуть, что в нерастворимых белках хлоропластов земляной груши (Helianthus tuberosus) выявлено наличие как связанных с белками у-глутамилпутресцина, N1 ,Ы4-Ы8-у-глутамил путресцина, Nl,N8-bis-y-глутамилспермидина, так и в свободной форме [6]. Процесс у-глутамилирования белковых молекул авторы считают важным этапом биосинтетических и функциональных процессов в хлоропластах.

Синтез у-глутамильных соединений в организме животных просходит при участии различных ферментов. Образование у-глутамилгистамина в организме Aplysia californica осуществляется при участии специфического фермента - у-глутамилгистаминсинтетазы [7]. У млекопитающих у-глутамильные производные различных моноаминов гистамина, серотонина, норадреналина, дофамина, тирамина) и полиаминов (путресцина, спермидина) синтезируются в присутствии глутамилсинтетазы (6.3.1.2), трансглутаминазы (2.3.2.13) и у— глутамилтранспептидазы (у-глутамилтрансфераза, 2.3.2.2) [4, 8, 9].

Трансглутаминаза, кальций-зависимый фермент, встречается в различных органах и катализирует образование глутамильных производных различных белковых молекул. В настоящее время выделяют три основные формы фермента - тканевая (цитозольная и мембран-связанная) и внеклеточная (фактор свертывания крови Xllla). Показано, что по ряду характеристик молекулы фермента отличаются друг от друга в зависимости от локализации.

Внеклеточная трансглутаминаза (фактор свертывания крови Xllla) активируется тромбином и помимо плазмы крови определяется в цитозоле тромбоцитов, моноцитов и макрофагов [10, 11]. Фактор свертывания крови ХШа является одним из ключевых звеньев процессе свертывания крови. В присутствии данного фермента осуществляется у-глутамилирование тромбоспондина путресцином. Обнаружено образование у-глутамильных производных винкулина, миозина и актина при участии фактора свертывания крови ХШа, а также - фибрином и ингибитором а2-плазмина, фибрином и фибронектином, фибронектином и коллагеном. Выявлено, что фактор Вилленберга также является субстратом фактора свертывания крови ХШа [12, 13,14,15].

При исследование образования у-глутамильных производных путресцина и спермидина в лимфоцитах человека и семенной жидкости крыс показано, что под влиянием внутриклеточной (в лимфоцитах) и экстрацеллюлярной (в семенной жидкости) трансглутаминаз образуются различные соединения. После протеолитического расщепления белковых фракций в лимфоцитах выявлены у-глутамилпутресцин, Nl-yглутамилспермидин и Ы8-у-глутамилспермидин, а в семенной жидкости -Nl-у-глутамилспермидин, Ш-у-глутамилспермидин, Nl,N8-bis-y-глутамилспермидин, Nl-у-глутамилспермин и Nl,N8-bis-y-глутамилспермин. Авторы считают, что существует определенная специфичность действия трансглутаминазы, локализованной в клетке и внеклеточного фермента [16].

Схема 1 у-Глутамильные производные биогенных аминов в природе

В связанном с белками состоянии: y-Glu-путресцин y-Glu-спермидин клетки эпидермиса, эритроциты, фибропласты мозг y-Glu-HA крыса y-Glu-TA бык y-Glu-5-НТ Y-Glu-путресцин у-глутамилированные биогенные амины y-Glu-путресцин y-Glu-спермидин земляная груша

Helianthus tuberosus нервная система y-Glu-HA y-Glu-TrpA y-Glu-5-НТ y-Glu-DA y-Glu-TA y-Glu-PEA краб улитка моллюск червь

выводы

1. Осуществлен синтез семейства аспартильных производных гистамина - эндогенных метаболитов N-ацетиласпарагиновой кислоты. В ходе синтеза исследована и минимизирована побочная реакция необычно легкой внутримолекулярной циклизации.

2. С применением различных схем синтеза получены новые аналоги у-глутамилгистамина.

3. Установлена способность глутамильного и аспартильных производных гистамина модулировать активность ферментов антиоксидантной защиты организма и регулировать скорость конверсии перекиси водорода в условиях реакции Фентона.

4. Обнаружена способность у-глутамилгистамина проявлять антиоксидантную и антигипоксическую активность в низких концентрациях, соответствующих физиологическим.

5. В препаративных количествах получены природные фенилсодержащие N-ацильные производные различных биогенных аминов растительного происхождения и их аналоги.

6. Показано, что фенилсодержащие N-ацильные производные биогенных аминов обладают анальгетическим и противовоспалительным действием, а также способностью модулировать биосинтез метаболитов арахидоновой кислоты.

1. Горленко В.А., Филиппович Ю.Б. у-Глутамилтрансфераза, свойства и роль в обмене веществ. // Успехи современной биологии. 1979. Т.88. вып. 3(6). С.367-386.

2. Aoyagi Y., Sugahara Т., Hasegawa Т., et. al. y-glutamyl derivatives of basic amino acids in Lentinus edodes. II Agric. Biol.Chem. 1982. V.46. №7. P.1939-1940.

3. Weinreich D. y-Glutamylhistamine: a major product of histamine metabolism in ganglia of marine mollusk Aplysia califomica. II J.Neurochemistry. 1979. V.32 P. 363-369.

4. Konishi H., Kakimoto Y. Formation of y-glutamylhistamine from histamine in rat brain. // J. Neurochem. 1976. V.27. P. 1461-1463.

5. Sloley B.D. y-Glutamyl conjugation of 5-hydroxytryptamine (serotonin) in the earthworm (Lumbricus terrestris). // Neurochem.Res. 1994. V.19. №2. P.217-222.

6. Del Duca S, Beninati S., Serafini-Fracassini D. Polyamines in chloroplasts: identification of their glutamyl and acetyl derivatives. // Biochem J. 1995. V.305. № 1. P.233-237.

7. Tsuji M., Matsuoka X., Nakajima T. Studies on formation of y-glutamylamines in rat brain and their synthetic and catabolic enzymes. // J.Neurochem. 1977. V.29. P.633-638.

8. Nakajima Т., Kakijima Т., Tsuji M., et al. Occurrence and formation of gamma-glutamylputrescine in mammalian brain. // J. Neurochem. 1976. V.26. №1. P.l 15-118.

9. Cocuzzi E., Piacentini M., Beninati S. Post-translational modification of apolipoprotein В by transglutaminases. // Biochem. J. 1990. V.265. №3. P.707-713.

10. Lorand L., Hsu L.K., Siefring G.E. et al. Lens transglutaminase and cataract formation. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1981. V.78. № 3. P.1356-60.

11. Lynch G.W., Slayter H.S., Miller B.E. et al. Characterization of thrombospondin as a substrate for factor XIII transglutaminase. // J. Biol. Chem. 1987. V.262. №4. P.1772-1778.

12. Asijee G.M., Muszbek L., Kappelmayer J. et al. Platelet vinculin: a substrate of activated factor XIII. // Biochim. Biophys. Acta. 1988 V.954. №3. P.303-308.

13. Hada M., Kaminski M., Bockenstedt P. et al. Covalent crosslinking of von Willebrand factor to fibrin. // Blood. 1986. V.68. №1. P.95-101.

14. Mosher D.F., Schad P.E., Kleinman H.K. Inhibition of blood coagulation factor Xllla-mediated cross-linking between fibronectin and collagen by polyamines. //J. Supramol. Struct. 1979. V.ll. №2. P.227-235.

15. Folk J.E., Park M.H., Chung S.I. et al. Polyamines as physiological substrates for transglutaminases. //J. Biol. Chem. 1980. V.255. №8. P.3695-3700.

16. Mc Caman M. W., Stetzler J., Clark B. Synthesis of y-Glutamyldopamine and Other Peptidoamines in the Nervous System of Aplysia californica. // J. Neurochem. 1985. V.45. № 6. P. 1828-1835.

17. Goton H., Schwarts J.H. Specificity of axonal transport in C2, a histaminergic neuron of Aplysia californica. II Brain Research. 1982. V.242. P.87-98.

18. Hiderigoton, Schwartz J. Specificity of anxonal transport in C2, a histaminergic neuron of Aplysia californica. I I Brain Reseach. 1982. V. 242. P.87-98.

19. Wang R., Pang P.K., Wu L. et al. Neural effects of parathyroid hormone: modulation of the calcium channel current and metabolism of monoamines in identified Helisoma snail neurons. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1993. V.71. №8. P.582-591.

20. Pani A.K., Croll R.P., Distribution of catecholamines, indoleamines, and their precursors and metabolites in the scallop, Placopecten magellanicus СBivalvia, Pectinidae). II Cell. Mol. Neurobiol. 1995. V.15. №3. P.371-386.

21. Battelle B.A., Edwards S.C., Kass L. et al. Identification and function of octopamine and tyramine conjugates in the Limulus visual system. // J. Neurochem. 1988. V.51. №4. P.1240-1251.

22. Battelle B.A., Hart M.K. Histamine metabolism in the visual system of the horseshoe crab Limulus polyphemus. II Comparative Biochemistry and physiology Part A. 2002. V.133. P.135-142.

23. Lynch G.W., Slayter H.S., Miller B.E. et al. Characterization of thrombospondin as a substrate for factor XIII transglutaminase. // J. Biol. Chem. 1987. V.262. №4. P.1772-1778.

24. Haddox M.K., Russell D.H. Differential conjugation of polyamines to calf nuclear and nucleolar proteins. J Cell Physiol 1981. V.109. №3. P.447-452.

25. Romijn J.C. Polyamines and transglutaminase actions. // Andrologia. 1990. V.22. Suppl 1. P.83-91.

26. Bures M., Goldsmith L.A., Stone K.R. Transgluminase activity of culture human prostatic epithelium. // Invest. Urol. 1980. V.17. P.298-301.

27. Piacentini M., Farrace M.G., Imparato M. et al. Polyamine-dependent post-translational modification of proteins in differentiating mouse epidermal cells. // J. Invest. Dermatol. 1990. V.94. №5. P.694-699.

28. Porta R., Esposito C., Gentile V., et al. Transglutaminase-catalyzed modifications of SV-IV, a major protein secreted from the rat seminal vesicle epithelium. // Int. J. Pept. Protein Res. 1990. V.35. №2. P. 117-22.

29. Porta R., Esposito C., Schinina, M.E., et al. Biological activities of CNBr fragments of a major protein secreted from the rat seminal vesicle epithelium. // Int. J. Pept. Protein Res. 1994. V.44. №5. P.507-512.

30. Porta R., Metafora S., Esposito C., et al. Biological activities of a major protein secreted from the rat seminal vesicles after structural modification catalyzed by transglutaminase in vitro. // Immunopharmacology. 1993. V.25. №2. P. 179-88.

31. Konishi H., Nakajima Т., Sano I. Metabolism of putrescine in the central nervous system. // J. Biochem. 1977. V.85. P.355-360.

32. Marnela K.M., Hagen E.A., Aasen A.J., et al. Mass spectrometric studies of some synaptosomal and synthetic peptides. // Int. J. Neurosci. 1984. V.25. №12. P.123-30.

33. Marnela K.M., Morris H.R., Panico M., et al. // Glutamyl-taurine is the predominant synaptic taurine peptide. // J. Neurochem. 1985. V.44. P.752-754.

34. Marnela K.M., Varga V., Dido G., et al. Position of the peptide linkage in glutamyl-taurine from galf brain synaptic vesicles. // J. Neurochem. 1987. V.48. №4. P. 1090-1092.

35. Nakamura К., Higashiura К., Nishimura N., et al. Isolation of glutamyltaurine from bovine brains and proof of its gamma-linkage by the B/E linked scan SIMS technique. // J. Neurochem. 1990. V.55. №3. P.1064-1066.

36. Varga V., Kontro P., Oja S.S. Modulation of GABAergic neurotransmission in the brain by dipeptides. // Neurochem. Res. 1988. V.13. №11. P. 1027-1034.

37. Durlach J., Вас, P., Вага, M et al. Physiopathology of symptomatic and latent forms of central nervous hyperexcitability due to magnesium deficiency: a current general scheme. // Magnes. Res. 2000. V.4. P.293-302.

38. Piacentini M., Martinet N., Beninati S.,et. al.Free and protein-conjugated polyamines in mouse epidermal cells. Effect of high calcium and retinoic acid. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. №8. P.3790-3794.

39. Cordella-Miele E., Miele L. Beninati S. et al. Transglutaminase-catalyzed incorporation of polyamines into phospholipase A2. // J. Biochem. 1993. V.l 13. №2. P.164-173.

40. Cocuzzi E., Kim H.C., Beninati S. Transglutaminase expression in rat parotid gland after isoproterenol stimulation. // J. Dent. Res. 1989. V.68. №11. P. 1474-1478.

41. Fesus L., Szucs E.F., Barrett K.E., et al. Activation of transglutaminase and production of protein-bond y-glutamylhistamine in stimulated mouse mast cells. //J. Biolog. Chem. 1985. V.260. №25. Iss.5. P.13771-13778.

42. Fesus L., Thomazy V., Autuori F. et al. Apoptotic hepatocytes become insoluble in detergents and chaotropic agents as a result of transglutaminase action. //FEBS Lett. 1989. V.245. № 1-2. P.150-154.

43. Toldi J., Feher O. Interactions of acoustic and somatosensory evoked responses in a polysensory cortex of the cat. // Acta. Biol. Hung. 1987. V.38. №3-4. P.33-48.

44. Haddox M.K., Russell D.H. Increased nuclear conjugated polyamines and transglutaminase during liver regeneration. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V.78. №3. P.1712-1716.

45. Martinet N., Beninati S., Nigra T.P. et al. NlN8-bis(gamma-glutamyl)spermidine cross-linking in epidermal-cell envelopes. Comparison of cross-link levels in normal and psoriatic cell. // Biochem. J. 1990. V.271. №2. P.305-308.

46. Kremzner L.T., Roy D., Spector A. Polyamines in normal and cataractous human lenses: evidence for post-translational modification. // Exp. Eye Res. 1983. V.37. № 6. P.649-659.

47. Natta C.L., Kremzner L.T. Polyamines and membrane proteins in sickle cell disease. // Blood Cells. 1982. V.8. № 2. P.273-280.

48. Ballas S.K., Mohandas N., Clark M.R. et al. Reduced transglutaminase-catalyzed cross-linking of exogenous amines to membrane proteins in sickle erythrocytes. //Biochim. Biophys. Acta. 1985. V.812. № 1. P.234-242.

49. Bowness J.M., Tarr A.H. Increase in transglutaminase and its extracellular products in response to an inflammatory stimulus by lipopolysaccharide. // Mol. Cell. Biochem. 1997. V.169. № 1-2. P.157-63.

50. Beninati S., Abbruzzese A., Cardinali M. Differences in the post-translational modification of proteins by polyamines between weakly and highly metastatic B16 melanoma cells. // Int. J. Cancer. 1993. V.53. № 5. P.792-797.

51. Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Огрель C.A. Небольсин B.E. Синтез псевдопептидов на основе биогенных аминов. // ДАН. 1995. Т.345. №4. С.493-495.

52. Небольсин В.Е. Синтез и изучение свойств низкомолекулярных биологически активных пептидов и их производных. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва. 1999.

53. Желтухина Г.А., Небольсин В.Е., Кржечковская В.В., Евстигнеева Р.П. Гепатопротекторная активность у-Ь-глутамилгистамина. // Вопр. Мед. химии. 2002. Т.48. № 5. С.443-449.

54. Носик Н.Н., Небольсин В.Е., Желтухина Г.А. и др. Противовирусная и антистрессорная активность у-Ь-глутамилгистамина и его аналогов. // Вопр. Вирусол. 2003. Т.48. № 1. С.38-42.

55. Boiycz J., Boiycz J.A., Loubani M., Meinertzhagen I.A. Tan and ebony genes regulate a novel pathway for transmitter metabolism at fly photoreceptor terminals // J. Neurosci. 2002. V.22. P.10549-10557.

56. Konishi H., Kakimoto Y. Formation of y-glutamylhistamine from histamine in rat brain. // J. Neurochem. 1976. V.27. P.1461-1463.

57. Kvamme E., Reichelt K.L., Edminson P.D. N-substituted peptides in brain. // Proceedings of the tenth FEBS meeting. 1975. 127-136.

58. Reichelt K.L., Wedege E., Kvamme E. Effect of amines on the level of N-acetyl-aspartate and N-acetyl-aspartyl-glutamate in mouse brain tissue slices. // J. Neurochem. 1971. V.18. P.2129-2136.

59. Reichelt K.L., Kvamme E. Histamine-dependent formation of N-acetyl-aspartyl peptides in mouse brain. // J. Neurochem. 1973. V.21. P.849-859.

60. Reichelt K.L., Fonnum F. Subcellular localization of N-acetyl-aspsrtyl-glutamate, N-acetyl-glutamate and glutathion in brain. // J. Neurochem. 1969. V.16. P.1409-1416.

61. Bodanszky R. P., Levenbook L. Naturally low-molekular-weight peptides from the blowfly Phormia regina. II Biochem. J. 1968. V.l 10. P.771-773.

62. Kakimoto Y., Armstrong M.D. р-L-Aspartyl-L-histidine, a normal constituent of human urine. // J. Biological chemistry. 1961. V.236. № 12. P.3280-3282.

63. Hirata M., Noda K., Izumiya N. Studies on separation of amino asids and releted compounds. VII. Separation of L-aspartyl-(a,p)-L-histidine and of L-glutamyl-(a,y)-L-histidine. // Bulletin of the chemical society of Japan. 1972. V.45. P. 1790-1794.

64. McCaman M.W., Stetzler J. Identification of acidic dipeptide, p-aspsrtylglycine, in the CNS of Aplysia. II J. Neurochem. 1984. V.43. № 5. P.1375-1384.

65. Sandberg M., Li X., Folestad S. et al. Liquid chromatografic determination of acidic р-aspartyl and y-glutamyl peptides in extracts of rat brain. // Analyt. Biochem. 1994. V.217. P.48-61.

66. Bodanszky M., Tolle J.C., Deshmane S. S., Bodanszky A. A reexamination of the benzyl group in the protection of the side chaine of tyrosine and aspartic acid. // Int. J. Peptide and protein research. 1978. V.12. P.57-68.

67. Ondetti M.A., Deer A., Sheehan J.T., Pluscec J., Косу О. Side reaction in the synthesis of peptides containing the aspartylglycyl sequence. // J. Biochemistry. 1968. V.7. № 11. P.4069-4075.

68. Martin-Tanguy J., Cabanne F., Perdrizet E. et al. The distribution of hydroxycinnamic acid amides in flowering plants. // Phytochemistry. 1978. V.17. №11. P.1927-1928.

69. Ishihara I., Kawata N., Matsukawa T. et al. Induction of N-hydroxycinnamoyltyramine synthesis and tyramine Nhydroxycinnamoyltransferase (THT) activity by wounding in maize leaves. // Bioscience. 2000. V.64. №5. P.1025-1031.

70. Atsushi I. Involvement of hydroxycinnamic acid amides in defense mechanisms in gramineous plants. // Baiosaiensu to indasutori. 2001. V.59. №6. P.389-390.

71. Schmidt A., Scheel D., Scheel D. Elicitor-stimulated biosynhesis of hydroxycinnamoyltyramines in cell suspension cultures of Solarium tuberosum. //Planta. 1998. V.205. P.51-55.

72. Watanabe, Mitsuru. Antioxidative phenolic compounds from Japanese barnyard millet (Echinochloa utilis) grains. // J. Agric. Food Chem. (1999), 47(11), 4500-4505.

73. Goda Y., Shibuya M., Sankawa U. Inhibitors of the arahidonate cascade from Allium Chinese and their effect on in vitro platelet aggregation. // Chem. Pharm. Bull. 1987. V.35. P.2668-2674.

74. Goda Y., Shibuya M., Sankawa U. Inhibitors of prostaglandin biosynthesis from Mucuna birdwoodiana. // Chem. Pharm. Bull. 1987. V.35. P.2675-2677.

75. Satoshi I., Masaaki S., Chen Fang T. et al. Inhibition of 5-lipoxygenase by phenolic compaunds. // Chemical & pharmaceutical bulletin. 1986. V.34. №9. P.3960-3963.

76. Hikino H., Ogata M., Konno C. Structure of feruloylhistamine, a hipotensive principle of Ephedra roots. II Journal of Medical Plant Research.1983. V. 48. P.108-110.

77. Chiale C.A., Cabrera J.L., Julian H.R. Isomero cis de N-cinamoilhistamina a partir de Lycium cestroides Schlent (Solanaceas). // An. Asoc. Quim. Argent.1984. V.76. № 6. P.569-571.

78. Maldonado E., Hernandez E., Ortega A. Amides, coumarine and other constituents from Simsia cronquistii. II Phytochem. 1992. P.1413-1414.

79. Jacobson K.A., Kirk K.L. New high-performance liguid chromatographicprocedure for the detection and quantification of (3-phenyletylamine. // J. Chromatography. 1987. V.415. P. 124-128.

80. Cai S.X., Keana J.F., Araldi G.L. et al. Preparation of aromatic and heteroaromatic compounds as subtype-selective NMDA receptor ligands. 1997. WO 9723202.

81. Herbert R.B., Kattah A.E. The biosynthesis of Sceletium alkaloids in Sceletium subvelutinum L. Bolus. // Tetrahedron. 1990. V.46. №20. P.7105-7118.

82. Kunishima M., Kawachi C., Hioki K. et al. Formation of carboxamides by direct condensation of carboxylic acids and amines in alcohols using a new alcohol- and water-soluble condensing agent: DMT-MM. // Tetrahedron. 2001. V.57. №8. P.l551-1558.

83. Rondest J., Das B.C., Polonsky J. Sur un nouvel amide naturel, le N(p-hydroxy-phenyl)-p etyl p-hydroxy-cinnamamide, isole de Evodia Belahe B. (Rutacee). // Bull. Soc. Chim. Fr. 1968. P.2411-2414.

84. Шредер Э., Любке К. // Пептиды. / М. Мир. 1967. 2 т.

85. Гросс Э., Майенхофер И.// Пептиды. Основные методы образования пептидной связи/ Москва. "Мир". 1983г. с.422.

86. Сигидин Я.А., Шварц Г.Я., Арзамасцев Л.П., Либерман С.С. // Лекарственная терапия воспалительного процесса (экспериментальная и клиническая фармакология противовоспалительных препаратов). / Москва. Медицина. 1988. 240с.

87. Балабанова P.M., Запрягаева М.Е. Безопасность ибупрофена в клинической практике. // Русский медицинский журнал. 2003. Т.П. № 22. С.1216-1219.

88. Насонов E.JI. Целекоксиб первый специфический ингибитор циклооксигеназы - 2. // Русский мед. журнал. 1999. Т.7. № 10. С.1-6.

89. Ревина А.А., Зайцев П.М., Федулов Д.М., Желтухина Г.А. и др. Комплексообразование у-Ь-глутамилгистамина с ионами Zn (II) и молекулярным кислородом в водных растворах NaClC>4 и Zn(N03)2. // Биофизическая химия. 2003. Т.77. № 2. С.364-370.

90. Максименко А.В. Антитромботическая значимость и получение конъюгата супероксиддисмуиаза-хондроитинсульфат-каталаза. Тезисы докладов X научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии 2004". Волгоград. 6-10 сентября 2004. С.277-282.

91. Halliwell В. Gutteridge J. // Free radicals in biology and medicine. / 1999. University Press. Oxford. 963 p.

92. Choi S.Y., Know H.Y., Know O.B., Kang J.H. Hydrogen peroxide-mediated Cu, Zn-superoxide dismutase fragmentation: protection by carnosine, homocarnosine and anserine. // Biochem. Biophys. Acta. 1999. V.1472. № 3. P.651-657.

93. Итоги науки и технологии. Фармакология. Химиотерапевтические средства. Т.27. Антигипоксанты. М: 1991. под ред. Лукьяновой Л.Д.

94. Проворнова Н.А. Автореф. дис. канд. биологич. наук. Купавна. 1999.

95. Koster R., Anderson М., de Beer Е. // Fed. Proc. 1959. V.18. P.412.

96. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Москва. Ремедиум. 2000. 398 с.

97. Winter et al. In: De Rosa M., Giroud J.P., Willoughby D.A. Studies of the mediators of the acute inflammatory response induced in rats in different sites by carrageenan and turpentine. // J.Phamacol. 1971. V.104. P. 15-29.

98. McCord J. M., Fridovich I. Superoxide Dismutase. // J.Biol.Chem. 1969. V.244. P.6049-6053.

99. Aebi H. Catalase in vitro. // Methods Enzymol. 1984. V.105. P. 121 -126.

100. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств. // ФК МЗ. Москва. 1990.