Комбинаторная химия и биологическая активность 2-амино-5-арил-1-метилимидазолов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правахрукописи

СМИРНОВА Татьяна Аркадьевна

КОМБИНАТОРНАЯ ХИМИЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 2-АМИНО-5-АРИЛ-1-МЕТИЛИМИДАЗОЛОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Лаборатории комбинаторной химии Института реактивов и особо чистых веществ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор П.Б. Курапов.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор В.Л. Русинов, кандидат химических наук, доцент Н.М. Пржевальский.

Ведущая организация — Московская государственная академия тонкой химической технологии.

Защита диссертации состоится «_• марта 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета К 220.043.04 при Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан февраля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета МСХА

ГЛ. Токмаков

г"

2004-4

27883 .

Общая характеристика работы

В современной медицинской химии поиск новых биологически активных препаратов осуществляется путем биоскрининга огромных массивов химических соединений, так называемых комбинаторных химических библиотек. Первичный скрининг позволяет выделить вещества-«лидеры», которые обладают биологической активностью. Направленная модификация этих соединений может довольно быстро привести к соединению, которое имеет определенный вид биологической активности и удовлетворяет строгим требованиям, предъявляемым к лекарственным средствам.

В настоящей работе мы предприняли попытку применить методологию создания новых лекарств для поиска новых регуляторов роста и развития растений.

Согласно современным представлениям, любое росторегулирующее воздействие на растение приводит к изменению его гормонального баланса. Целенаправленно управляя фитогормональным комплексом можно активировать рост и развитие растений, вызывать в них перераспределение питательных веществ, что и может служить основой для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Таким образом, проблема поиска новых синтетических регуляторов роста актуальна.

Цель нашей работы состояла в том, чтобы на примере одной синтезированной нами оригинальной комбинаторной библиотеки пройти начальные стадии создания регулятора роста растений и, таким образом, разработать общую методологию поиска новых фитоактивных препаратов.

Эти стадии следующие: 1) синтез обширной комбинаторной библиотеки; 2) первичный скрининг синтезированных соединений на гормональную активность, с использованием ферментных систем имитаторов гормон-рецепторного взаимодействия (отбор вещ еств-лид еров); 3) исследование активности отобранных веществ на рост растительной клетки (пыльца

РОС.НАЦКО БИБЛНО С. Петер ОЭ ТОО

растений); 4) проведение испытаний веществ, показавших активность на клеточном уровне, в условиях лабораторных опытов на целых растениях.

Для создания комбинаторной библиотеки нами была выбрана структура 1-метил-2-амино-5-арилимидазола. Небольшие по молекулярной массе, эти производные имидазола имеют три альтернативных центра для проведения химических модификаций, т.е. по принятой в комбинаторной химии терминологии представляют из себя многоточечный темплейт (template) -матрицу для построения комбинаторной библиотеки. Следует также отметить, что в настоящее время этот класс потенциально биологически активных соединений мало изучен и в литературе нами не было найдено приемлемых методов его синтеза.

Научная новизна и практическая значимость работы состоит в создании ступенчатой системы, позволяющей значительно сократить сроки поиска новых препаратов - регуляторов роста растений.

Разработан метод синтеза ранее неизвестных 1-метил-2-амино-5-арилимидазолов.

Изучена реакционная способность синтезированных темплейтов в реакциях по аминогруппе (1), по атому азота пиридинового типа (2) и по единственному незамещенному атому углерода в положении 4 имидазольного ядра (3).

Варьированием заместителей синтезирована обширная и разнообразная комбинаторная библиотека, содержащая несколько сотен соединений.

Проведен первичный биоскрининг всех синтезированных соединений.

На основе данных первичного скрининга установлены вещества-лидеры и проведены их дальнейшие испытания на клеточном уровне и на целых растениях в условиях лабораторных опытов.

Проведенные биологические испытания синтезированной нами комбинаторной библиотеки выявили четыре соединения, обладающих значительной ретардантной активностью на яровой пшенице.

Публикации и апробации работы. Результаты диссертационного исследования были представлены на международных и российских конференциях; Молодежной научной школе-конференции "Актуальные проблемы- органической химии" (Новосибирск, 2001); III Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва,2001); First Symposium of the European Society for Combinatorial Sciences Eurocombi-1 (Budapest, Hungary, 2001); V Молодежной научной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2002); 9Л Blue Danube Symposium on Heterocyclic Chemistry (Tatancka Lomnica, Slovak Republic, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 5-ти докладов.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах, содержит 20 таблицы. Библиография включает литературные ссылки на 100 научных публикаций.

Основное содержание работы

1. Синтез 1-метил-5-арил-2-аминоимидазолов.

Из литературы известны всего два основных способа получения 1-алкил-2-аминоимидазолов: первый - исходя из цианамида и а-аминоацеталя и второй - из 2-Li (Na)-N-зaмещенных имидазолов. Также известны примеры синтеза 4,5-дизамещенных 1-алкил-2-аминоимидазолов на основе 2-галогенимидазолов. Нет нужды обсуждать очевидные трудности этих методов.

Но нами не были найдены литературные данные о синтезе именно 1-метил-5-арил-2-аминоимизазолов. Таким образом, с точки зрения химика,

разработка методов получения этого абсолюта) не изученного класса органических соединений представляет особый интерес.

С целью получения новых биологическа активных соединений, содержащих 2-аминоимидазольный фрагмент, нами был осуществлен оригинальный синтез ряда 2-амино-1-метил-5-арилимидазолов, исходя из 2-аминопиримидина 1 по схеме 1.

1-Метил-2-аминопиримидиний йодид 2 был получен взаимодействием 2-аминопиримидина 1 с йодистым метилом в смеси бензола и ацетонитрила. Рециклизация соли 2 под действием щелочи в этаноле приводила с количественным выходом к 2-(№метиламино)пиримидину 3, получение которого прямым алкилированием без соответствующей защиты амино группы практически невозможно.

2-(К-Метиламино)пиримидин 3 алкилировали при кипячении в ацетонитриле фенацилбромидами 4 по одному из циклических атомов азота с образованием четвертичных аммониевых солей 5 а-о, которые под действием ортофосфорной и хлорной кислот гладко и с высокими выходами (85-97%) циклизуются в имидазопиримидиний перхлораты 6 а-о. Можно предположить, что механизм образования соединений 6 а-о аналогичен ранее описанному в литературе механизму получения перхлоратов оксазолопиридиния и тиазолопиридиния.

Под действием нуклеофилов (в частности, пиеридина) в ацетонитриле пиримидиновый цикл перхлоратов 6 а-о раскрывается с образованием 1-метил-5-арил-2-аминоимидазолов 7 а-о. Аналогично происходит раскрытие пиридинового цикла оксазолопиридиниевых солей, однако в этом случае реакция останавливается на стадии образования соответствующих аминодиенов (схема 2)*.

*) Синтез сопряженных аминодиенов по схеме 2 выполнен нами в Центре комбинаторной химии МГУ им. М.В.Ломоносова, сотрудникам которого автор выражает глубокую благодарность.

Используя различные фенацилбромиды 4, мы синтезировали пятнадцать 1-метил-5-арил-2-аминоимидазолов 7 а-о, структура которых была подтверждена спектрами ЯМР 'Н и данными элементного анализа. В спектрах ЯМР 'Н соединений 7 присутствуют характерные сигналы протонов метильной группы при атоме азота имидазольного ядра в области 3.30-3.40 м.д., протона имидазольного кольца в области 6.35-6 80 мд. и протонов аминогруппы в области 5.20-5.70 м д.

Схема 1

N1*

М^ =пиперидине,

4-фенилпиперазнно

Схема 2

Следует отметить, что наличие заместителей в мета-положении фенильного ядра исходного фенацилбромида несколько снижает общий выход как реакции циклизации, так и раскрытия цикла. Наилучшие результаты получены нами в случае электроноакцепторных заместителей в пара-положении фенильного ядра.

2. Реакционная способность 1-метил-5-арил-2-амгагаимидазолов. Создание комбинаторной библиотеки.

Синтезированные нами производные 2-аминоимидазола 7 представляют собой чрезвычайно интересный новый фармакофорный фрагмент, позволяющий перейти к синтезу многокомпонентной комбинаторной библиотеки. С целью разработки методов синтеза такой комбинаторной библиотеки нами была детально изучена реакционная способность 2-амино-5-арил-1-метилимидазольного ядра по трем основным реакционным центрам:

атому азота аминогруппы, атому азота пиридинового типа имидазольного кольца и подвижному атому водорода при углероде в 4-м положении имидазольного фрагмента.

2.3.1. Реакционная способность аминогруппы 1-метил-5-арил-2-аминоимидазолов.

1-Метил-2- (К-ациламино)-5-арилимидазолы ^^ и 13а-е мы синтезировали в параллельном режиме путем прибавления 1-метил-2-амино-5-арилимидазолов 7 к кипящим растворам в бензоле ангидридов уксусной и пропионовой кислот соответственно с выходами от 37 до 89% (схема 3).

Строение соединений ^^ и 13а-е доказано методом ЯМР 'н и подтверждено данными элементного анализа. Характерной чертой 1-метил-2-(К-ациламино)-5-арилимидазолов ^^ является наличие в спектрах ЯМР этих соединений сигналов протонов ацильной группы СОСНЗ в области 2.042.06 м.д. и протона амидной группы КИСО в области 10.06-10.20 м.д., а для N1-[5-арил-1-метил-1Я-2-имидазолил]пропионамидов 13а-е наличие сигналов протонов группы СОСЬЪСИЪ в области 1.14-1.15 м.д. и СОСН?СН< в области 2.34-2.36 м.д. и сигнала протона амидной группы КИСО в области 9.96-10.10

М.Д..

Схема 3

Для получения 2-арилкарбоксамидо-5-арил-1-метилимидазолов А в параллельном режиме к смеси соответствующих хлорангидридов 14 и триэтиламина в диоксане при комнатной температуре добавляли 1-метил-2-амино-5-арилимидазолы 7. Соединения А выделили в виде кристаллических веществ с выходами 62-97% при выливании реакционной массы в воду. Хлорангидриды карбоновых кислот 14 получали кипячением соответствующей карбоновой кислоты с избытком тионилхлорида в тетрахлорметане.

Все соединения, полученные по схеме 4, были охарактеризованы спектрами ЯМР 'Н. Строение этих соединений было подтверждено данными элементного анализа. В спектрах ЯМР 1Н соединений А присутствуют характерные сигналы протона амидной группы в области 12.10-12.50 м.д. и протонов 2-арилкарбоксамидной части молекулы.

К = Н, 4-СН,, 4-Е, 3-С1,4-С1,3,4-С!,, 4-Вг, З-Вг,

4-ОСН,, З-ОСН,, 3,4-0СН20 И' = II, 4-Р, 3-Х02

Схема 4

Кипячение в бензоле фталевого и янтарного ангидридов с аминоимидазолом 7а привело к образованию кислот 15 с выходом 57% и 16 с выходом 84% (схема 5).

Структура соединений 15 и 16 доказана методом ЯМР 'Н и подтверждена данными элементного анализа. Спектр ЯМР кислоты 15 содержит

характерные сигналы протона амиднои группы. В спектре ЯМР "Н кислоты 16 имеются сигналы протона амидной группы и протонов -СН2СН2СООН-группы в области 2.40-2.90 м.д..

7а 16

Схема 5

Реакции восстановительного аминирования мы проводили в параллельном режиме по схеме 6.

К растворам аминоимидазолов 7 а-п и альдегидов 17 в дихлорэтане, выдержанным сутки при комнатной температуре, добавляли триацетоксиборгидрид натрия. Альдегиды брали в избытке 20%, чтобы амин прореагировал как можно полнее. Полученные соединения RA после обработки раствором поташа и очистки методом колоночной хроматографии представляли

собой масла. Поэтому образцы выделяли в солевой кристаллической форме - в виде оксалатов - что являлось дополнительным методом очистки от исходных альдегидов.

Соединения, синтезированные по схеме 6, были охарактеризованы спектрами ЯМР 'Н. Отличительной особенностью имидазоламинов &А. является наличие в их спектрах сигналов протонов метиленовой группы в области 4.30-4.65 м.д. и иминогруппы в области 7.55-8.34 м.д..

Н

7

К= II, 4-СН3,4-¥, 3-С1,4-С1,3,4-С12,4-Вг, З-Вг, 4-ОМе, 3,4 0СН20,

4-С6Н5,3-ОСН3

К' = 4-Вг; 2,4-ё5-ОСН3; 2-ОН, 5-С1; 3,4,5-1гМ)СН3; 2-К, б-Вг; 3-С1; 2-ОСН3;

3-ОСН2С6Н5; 2-ОН; 3,4-аьОСН3; 4-С1; 4-ОСН2С6Н5,3-ОСН3;

2-ОН, 3-ОСН3; 2-С1; 2-Г, 6-С1; 2,3-С12

Схема 6

2.3.2. Реакционная способность 2-амино-5-арил-1-метилимидазолов атома азота пиридинового типа имидазольного кольца.

Анализ литературных данных позволил выявить нам два основных подхода к синтезу производных имидазо[1,2-а]имидазолов.

Первый подход включает в себя взаимодействие 1-алкил-2-аминоимидазола с а-галогенкетонами с последующей циклизацией в минеральной - кислоте, что приводит к образованию 2,5,6-тризамещенных имидазо[1,2-а]имидазолов.

Второй метод синтеза представляет собой реакцию "в одном горшке". Так, 5,6-дифенилзамещенные имидазо[1,2-а]имидазолы синтезируют из 2-бром-4,5-дифенилимидазола и первичных аминов в автоклаве, при этом происходит замена атома брома на остаток амина и одновременная дегидратация промежуточный циклических продуктов.

Исходя из вышесказанного и проведенный нами ранее опытов по циклизации-рециклизации солей пиридо[1,2-а]оксазола и пиридо[1,2-^оксазегшна, а также используя разработанную нами оригинальную схему синтеза 1-метил-5-арил-2-аминоимидазолов 7, мы предположили, что взаимодействие соединений 7 а^ с фенацилбромидами 4 должно приводить к образованию 2,6-диарилзамещенных имидазо[1,2-а]имидазолов.

Получение 2,6-диарил-1-метилимидазо[1,2-а]имидазолов Z мы осуществляли в параллельном режиме в две стадии по схеме 7.

7

4

К

И'

Ъ

К =11'= Н, 4-СН3,4-Р, 3-С1,4-С1,3,4-С^, 4-Вг, З-Вг, 4-ОСН, 3,4-0 СН20,4-С6Нб, 3-ОСН3

Схема 7

Схема 8

На первой стадии аминоимидазолы 7 а^ прибавляли порциями к растворенным в диоксане фенацилбромидам 4 и выпавшие в процессе реакции соли отфильтровывали, промывали диоксаном и сушили на воздухе. Вторая стадия - непосредственно циклизация - заключалась в том, что полученные осадки растворяли при кипении в смеси спирт-вода и обрабатывали мягким циклизующим агентом - гидрокарбонатом натрия.

Структура 2,6-дизамещенных имидазоимдазолов Z доказана методом ЯМР 'Н и подтверждена данными элементного анализа В спектрах этих

соединений характерно присутствие двух синглетов в области 7.17-7.67 м.д. и 7.43-7.96 м.д. соответсвующих сигналам протонов имидазоимидазольной системы соответсвенно С(3) иС(5).

2.3.3. Реакционная способность атома водорода при атоме углерода в 4-м положении имидазольного фрагмента 2-амино-5-арил-1-метилимидазолов.

Имидазолилацетамиды 18-20 были получены по реакции Манниха (схема 8) из соответствующих аминов и 2-ацетамидоимидазолов 12 в ледяной уксусной кислоте.

Строение соединений 18-20 подтверждено спектрами ЯМР 'Н и данными элементного анализа. Для имидозолилацетамидов 18-20 характерно наличие в спектрах ЯМР 'Н сигнала протонов метиленовой группы, связанной с имидазольным кольцом, в области 3.32-3.42 м д..

2.4. Биотестирование синтезированных соединений на росторегулирующую активность на растениях.

Регуляция роста растений осуществляется комплексом фитогормонов, включающим гиббереллины, ауксины, цитокинины, абсцизовую кислоту, этилен и брассины. Изменение соотношение между фитогормонами в комплексе приводит к определенным изменениям в росте и развитии растений. Любое росторегулирующее воздействие на растение связано с воздействием на его гормональный баланс. Многообразие реакций растения на внешнее воздействие определяется изменением всего фитогормонального комплекса, компоненты которого активно взаимодействуют.

Общий принцип реализации гормональной активности включает биосинтез фитогормона, образование гормон-рецепторного комплекса и непосредственно действие этого комплекса, вызывающего определенные биохимические и физиологические изменения.

Фитогормоны ускоряют развитие растений, активируют их рост и вызывают перераспределение питательных веществ, что служит основой для повышения урожайности, сельскохозяйственный культур.

Направленно воздействуя на комплекс фитогормонов, можно регулировать в желаемую сторону процессы жизнедеятельности растений. Такое воздействие обеспечивается введением в растение экзогенный регуляторов, подавляющее большинство который - либо физиологические аналоги эндогенных фитогормонов, либо их антагонисты, которые изменяют общий гормональный статус растений.

Для первичного скрининга больших комбинаторнык библиотек необходимы чрезвычайно выюокопроизводительные биотесты. К сожалению, в настоящее время разработаны всего лишь несколько высокопроизводительных тест-систем. В основном для поиска новый веществ, обладающих росторегулирующей активностью, используют тестирование либо на уровне клеток (изолированные культуры органов, тканей и клеток), либо высечки из листьев, проростки и целые растения. Традиционным тест объектом служит также одноклеточная зеленая водоросль - хлорелла. Широкое применение находят биотестирование на простейших растениях (например, на ряске), а также на проростках злаков (ячмень, пшеница), крестоцветных (редис), бобовых (горох), тыквенных (огурец) и салате.

Специальные биотесты для определения пестицидной активности сводятся к оценке степени изменения морфометрических, физиологических и биохимических показателей. Подобные нарушения проявляются в изменении энергии прорастания, всхожести семян, размеров корней, в повреждении растений под воздействием загрязнителей.

Для проведения биологического тестирования синтезированных нами соединений была избрана многоступенчатая система отбора вещества-лидера. Первичный скрининг проводился для всех синтезированных нами соединений (более 200 штук) в тестах на гормоноподобие. Соединения, показавшие

активность в биохимических тестах, проверялись в биотестах на клеточном уровне (пыльца цветущих растений) и на целых растениях (проростки пшеницы)*.

Тесты на цитокининовую и абсцизовую активность выполнялись на твердой фазе в лунках полистирольного планшета С помощью биохимических реакций отбирались соединения, имеющие такую геометрию молекул, которая взаимодействует с белками с образование гормон-рецепторного комплекса. Тест носит как качественный, так и количественный характер. Сущность метода заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу, моделирующему гормон - рецепторное взаимодействие, особого иммуноглобулина, меченного ферментом. Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется фотометрически. Регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при определенной длине волны. Результат выражают в единицах оптической плотности. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Принципиальная схема анализа представлена на рис. 1.

*) Автор благодарит доктора биологических наук, профессора Вахтенко Е.Ю. за помощь в проведении биологических испытаний.

2.4.1. Первичное биохимическое тестирование.

Рис.1

I. Специфические антигены (2) пришиты к пластику лунок (1) планшета. В лунку добавляется раствор испытуемого соединения, и, если в ней есть вещества (3), способные взаимодействовать с данными антигенами (2), то во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь.

П. После отмывки лунок от не связавшихся субстанций в каждую лунку добавляются антитела (4). Они также узнают антитела определенного типа К этим вторым антителам химически пришит активный фермент (Е). Таким образом, образуется комплексное соединение, которое называют коньюгат.

III. После отмывки не связавшегося коньюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат (5), на который действует фермент (Е), в результате чего субстрат превращается в окрашенный продукт (6).

IV. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны.

Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит, и количеству коньюгата в "сэндвиче". Количество коньюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса -антиген/антитело, которое получается на стадии I анализа. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии III точно коррелирует с наличием специфически связанных комплектах вещество - рецептор.

Данные биохимического- тестирования синтезированных нами соединений приведены на рис. 2 и 3.

На основании полученных нами результатов были отобраны 8 соединений для дальнейшего испытания в биотестах на пыльце и на проростках растений. Результаты биоиспытаний приведены в табл. 1.

2.4.2. Использование пыльцы растений в качестве тест-системы.

Одним из наиболее перспективных нетрадиционных подходов к исследованию комбинаторных химических библиотек на росторегулирующую

активность у растений является метод изучения прорастания пыльцы in vitro. Принципиально важно, что для пыльцы характерны основные морфогенетические процессы, свойственные растению в целом. Кроме того, известна чрезвычайно высокая, по сравнению с другими органами, чувствительность пыльцы к различным химическим воздействиям.

Биотестирование на прорастание пыльцы настурции и скорость роста ее пыльцевой трубки изучали в условиях in vitro на искусственной питательной среде. Испытуемые соединения вносились в эту питательную среду. Проращивали пыльцу в камере Ван-Тингена по методике Э.П.Паушевой (1980). Процент жизнеспособных пыльцевых зерен устанавливали по количеству проросших, причем подсчитывали только те пыльцевые зерна, у которых пыльцевая трубка длшшее, чем диаметр самого зерна. Анализы проводили в 3-4 повторностях. Ошибка методов определения во всех случаях не превышала 20 %.

2.4.3. Испытания производных 2-амино-1-метилимидазола на росторегулирующую активность на целых растениях.

Проростки растений являются традиционным материалом для первичного тестирования химических соединений на росторегуляторную активность. Обзор наиболее активных соединений обычно проводится на семенах или проростках различных культур, это чаще всего овес, ячмень, пшеница, огурцы. В качестве модельного растения мы в своих опытах выбрали яровую пшеницу сорта -Triticum aestivum L. (сорт Русо). Растения выращивали на воде. На седьмые сутки проводили опрыскивание растений растворами исследуемых веществ (конц. 0,1 %). Через четыре дня измеряли высоту проростков и рассчитывали среднесуточные приросты. Опыты проводили в трехкратной биологической повторности.

Таким образом, среди синтезированных нами соединений выявлены структуры, обладающие ярко выраженной ретардантной активностью. Эти

соединения можно вполне обоснованно рекомендовать для проведения тепличных или мелкоделяночных опытов с учетом фенологических, биометрических данных и урожая.

Рис.2 Рис.3

Биотестирование комбинаторной библиотеки Биотестирование комбинаторной библио-на абсцизовую активность теки на зеатиновую активность

Таблица 1.

Результаты биотестирования синтезированных соединений на пыльце и проростках пшеницы.

№ Структурная формула соединения Жизне способ ность пыльцы, %к контролю Средняя длина пыльце вой трубки, % к контролю Тормо жение роста пророст ков пшеницы, %к контролю

7<Г ГУ4^ ^^ сн3 91 42 70

12с ¿н, 65 77

Продолжение табл. 1

ИА 1-16 СИ, С] \ С1 10 12 63

НА 6-12 54

ЯА 10-15 ^^ сн, о Я 37

Ъ 4-4 ОрсКЬ н,с 15 60

Ъ 8-9 9>СЕК> н,с а )6 64

2-хлорэтилфосфоновая кислота (2-ХЭФК) 57 13 52

Контроль, вода 100 100 100

1. Предложен принципиально новый метод синтеза 1-метил-2-амино-5-арилимидазолов на основе последовательных превращений 2-аминопиримидина.

2. Изучена реакционная сюсобность 1-метил-2-амино-5-арилимидазолов в реакциях по аминогруппе (1), по атому азота пиридинового типа (2) и по незамещенному атому углерода в положении 4 имидазольного ядра (3). Показана возможность использования молекулы замещенного 2-аминоимидазола в качестве многоточечного темплейта.

3. На основе замещенного 2-аминоимидазола нами была синтезирована обширная и разнообразная комбинаторная библиотека (порядка 200 соединений).

4. Проведен первичный биоскрининг всех синтезированных соединений на росторегулирующую активность.

5. На основе данных первичного скрининга установлены вещества-лидеры и проведены их дальнейшие испытания на клеточном уровне и на целых растениях в условиях лабораторных опытов.

6. Проведенные биологические испытания выявили четыре соединения, обладающих значительной ретардантной активностью на яровой пшенице.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. ТА Смирнова, Е.В. Бабаев, Реакции солей 1-фенацил-2-феноксипиридиния с нуклеофилами, Молодежной научной школе-конференции "Актуальные проблемы органической химии ", Тезисы докладов, Новосибирск, 2001,245.

2. ТА Смирнова, А.А. Цисевич, Е.В. Бабаев, В.Б. Рыбаков, А.В. Аракчееева, А. Шснлебер, Рентгеноструктурное исследование

сопряженных диенов, III Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений нейтронов иэлектронов для исследованияматериалов, Тезисы докладов, Москва, 2001, 215.

3. Т. Смирнова, Е. Ветрова, А. Басс, П. Курапов, Е. Бабаев, Новые гетероциклические библиотеки, Первого симпозиума Европейского общества комбинаторной химии Еврокомби-1, Тезисы докладов, Будапешт, Венгрия, 2001,63.

4. Т.А. Смирнова, Е.В. Бабаев, Соль пиридо[1,2-Ь]оксазепина в реакциях с нуклеофилами, V Молодежной научной школе-конференции по органическойхимии. Тезисы докладов, Екатеринбург, 2002,44.

5. Е. Бабаев, А. Басс, И. Длинных, П. Курапов, Н. Ткач, Т. Смирнова, Е. Ветрова, Н. Звонкова, Imidazole Libraries: Reductive Amination versus Mannich Reaction, 9-ый Симпозиум по гетероциклической химии "Голубой Дунай", Тезисы докладов, Тартранская Ломница, Словакия, 2002, 57.

6. Т.А. Смирнова, Н.Л. Нам, Синтез сопряженных аминодиенов, Известия ТСХА, 2003, 3, 150-152.

7. Т.А. Смирнова, Н.Л. Нам, Спопоб получения и реакционная способность

1-метил-5-арил-2-аминоимидазолов,Известия 7СХА, 2003,4, 132-134.

Усл. печ. л. 1,16 Зак. 41 Тираж 100 экз. АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

•-2328

РНБ Русский фонд

2004-4 27883

ВВЕДЕНИЕ

I. СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 2- АМИНО- 9 ИМИДАЗОЛОВ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Биологическая активность производных 2-аминоимидазола 9 и его аналогов

1.2. Синтез 2-аминоимидазола и его 1-алкил производных

1.3. Химические свойства производных 2-аминоимидазола

1.4. Особенности реакции восстановительного аминирования 49 слабоосновных ароматических и гетероароматических аминов.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1. Прогнозирование биологической активности производных 51 2-аминоимидазола

2.2. Синтез 1-метил-5-арил-2-аминоимидазола

2.3. Реакционная способность 2-амино-5-арил-1-метилимида- 60 золов. Создание комбинаторной библиотеки.

2.3.1. Реакционная способность аминогруппы 1-метил- 60 5-арил-2-аминоимидазолов

2.3.2. Реакционная способность атома азота пиридинового 66 типа имидазольного кольца

2.3.3. Реакционная способность атома водорода при атоме 68 углерода в 4-м положении имидазольного фрагмента 2-амино-5-арил-1 -метилимидазолов

2.3.4.Неудачная попытка формулирования по Вильсмайеру

2.4. Биотестирование синтезированных соединений на росто- 71 регулирующую активность на растениях

2.4.1. Первичное биохимическое тестирование

2.4.2. Использование пыльцы растений в качестве тест- 75 системы

2.4.3. Испытания производных на росторегулирующую 75 активность на целых растениях

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

В современной медицинской химии поиск новых биологически активных препаратов осуществляется путем биоскрининга огромных массивов химических соединений, так называемых комбинаторных химических библиотек. Первичный скрининг позволяет выделить вещества «лидеры», которые обладают биологической активностью. Направленная модификация этих соединений может довольно быстро привести к соединению, которое имеет определенный вид биологической активности и удовлетворяет строгим требованиям, предъявляемым к лекарственным средствам (эффективность, низкая токсичность, фармакокинетика и метаболизм, отсутствие побочных эффектов, удобные лекарственные формы и многое другое).

Создание комбинаторных химических библиотек для агрохимических целей требует совершенно иного подхода. Во-первых, на сегодняшний день разработаны всего лишь несколько высокопроизводительных тест-систем для поиска новых веществ, обладающих росторегулирующей активностью (тестирование либо на уровне клеток, либо высечки из листьев, проростков и целых растений).

Во-вторых, масса образца для агрохимических испытаний должна составлять 350 - 500 мг (для проведения первичного фармацевтического биоскрининга -1-2 мг).

В настоящей работе мы предприняли попытку применить идеологию создания новых лекарств для поиска новых регуляторов роста и развития растений.

Согласно современным представлениям, регуляция роста растений осуществляется комплексом гормонов, включающим гиббереллины, ауксины, цитокинины, абсцизовую кислоту и брассины. Любое росторегулирующее воздействие на растение приводит к изменению его гормонального баланса, что, в свою очередь, вызывает определенные изменения в росте и развитии растений. Гормональный баланс оказывает существенное влияние на темпы, направленность и локализацию ростовых функций, качественные и количественные изменения в метаболизме.

Многообразие реакций растения на внешнее воздействие определяется изменением всего фитогормонального комплекса, компоненты которого активно взаимодействуют. Изменение уровня одного фитогормона приводит к изменению содержания других. Молекулярные механизмы этих взаимодействий в настоящее время не ясны, хотя они занимают важное место в регуляции ростовых процессов.

Гормональную систему растений следует рассматривать как связующее звено между генетическим аппаратом и зонами роста в растительном организме. Общий принцип реализации гормональной активности включает биосинтез фитогормона, образование гормон-рецепторного комплекса и непосредственное действие этого комплекса, вызывающее определенные биохимические и физиологические изменения.

Целенаправленно управляя фитогормональным комплексом можно активировать рост и развитие растений, вызывать в них перераспределение питательных веществ, что и может служить основой для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Таким образом, проблема поиска новых синтетических регуляторов роста актуальна.

Цель нашей работы состояла в том, чтобы на примере одной синтезированной нами оригинальной комбинаторной библиотеки пройти начальные стадии создания регулятора роста растений и, таким образом, разработать методологию поиска новых регуляторов роста растений.

Эти стадии следующие:

1. Синтез обширной комбинаторной библиотеки.

2. Первичный скрининг синтезированных соединений на гормональную активность с использованием ферментных систем имитаторов гормон-рецепторного взаимодействия. Отбор веществ-лидеров.

3. Исследование активности отобранных веществ на рост растительной клетки (пыльца растений).

4. Проведение испытаний веществ, показавших активность на клеточном уровне, в условиях лабораторных опытов на целых растениях.

Для создания комбинаторной библиотеки нами была выбрана структура 1 -метил-2-амино-5-арилимидазола.

Небольшие по молекулярной массе, эти производные имидазола имеют три альтернативных центра для проведения химических модификаций, т.е. по принятой в комбинаторной химии терминологии представляют из себя многоточечный темплейт (template) - матрицу для построения комбинаторной библиотеки. Следует также отметить, что в настоящее время этот класс потенциально биологически активных соединений мало изучен и в литературе нами не было найдено приемлемых методов его синтеза.

Практическая значимость работы состоит в создании ступенчатой системы, позволяющей значительно сократить сроки поиска новых препаратов — регуляторов роста растений.

Введение в растение синтетического препарата, способного взаимодействовать с рецептором и замещать природный фитогормон на стадии образования гормон-рецепторного комплекса, должно вызывать определенные изменения в биохимическом и физиологическом поведении растения. Поэтому, первичная задача создания новых регуляторов роста (первичный скрининг) состоит в поиске химических соединений, способных взаимодействовать с рецепторами, имитируя гормон-рецепторное взаимодействие. Выявив среди большого числа химических соединений эти вещества — лидеры, можно приступать к их детальному скринингу сначала на клеточном уровне, а затем и на целых растениях в лабораторных, вегетационных и полевых опытах.

Научная новизна заключается в том, что нами:

1. Разработан метод синтеза ранее неизвестных 1-метил-2-амино-5-арилимидазолов.

2. Изучена реакционная способность синтезированных темплейтов в реакциях по аминогруппе (1), по атому азота пиридинового типа (2) и по единственному незамещенному атому углерода в положении 4 имидазольного ядра (3).

3. Варьированием заместителей синтезирована обширная и разнообразная комбинаторная библиотека.

4. Проведен первичный биоскрининг всех синтезированных соединений.

5. На основе данных первичного скрининга установлены вещества-лидеры и проведены их дальнейшие испытания на клеточном уровне и на целых растениях в условиях лабораторных опытов.

6. Проведенные биологические испытания синтезированной нами комбинаторной библиотеки выявили четыре соединения, обладающих значительной ретардантной активностью на яровой пшенице.

Публикации и апробации работы.

Результаты диссертационного исследования были представлены на международных и российских конференциях: Молодежной научной школе-конференции "Актуальные проблемы органической химии" (Новосибирск, 2001); III Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва,2001); First Symposium of the European Society for Combinatorial Sciences Eurocombi-1 (Budapest, Hungary, 2001); V Молодежной научной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2002); 9th Blue Danube Symposium on Heterocyclic Chemistry (Tatrancka Lomnica, Slovak Republic, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 5-ти докладов.

выводы w 1. Предложен принципиально новый метод синтеза 1 -метил-2-амино-5арилимидазолов на основе последовательных превращений 2-аминопиримидина.

2. Изучена реакционная способность 1 -метил-2-амино-5-арилимидазолов в реакциях по аминогруппе (1), по атому азота пиридинового типа (2) и по незамещенному атому углерода в положении 4 имидазольного ядра

Ф (3). Показана возможность использования молекулы замещенного 2аминоимидазола в качестве многоточечного темплейта.

3. На основе замещенного 2-аминоимидазола нами была синтезирована обширная и разнообразная комбинаторная библиотека.

4. Проведен первичный биоскрининг всех синтезированных соединений т на росторегулирующую активность.

5. На основе данных первичного скрининга установлены вещества-лидеры и проведены их дальнейшие испытания на клеточном уровне и на целых растениях в условиях лабораторных опытов.

6. Проведенные биологические испытания выявили четыре соединения, обладающих значительной ретардантной активностью на яровой

Ф пшенице.

1. А.Т. Солдатенков, Н.М. Колядина, И.В. Шендрик, Основы органической химии лекарственных веществу Химия, Москва, 2001.

2. А.Ф. Пожарский, А.Т. Солдатенков, Молекулы перстни, Химия, Москва, 1993.

3. М.Д. Машковский, Лекарственные средства. В двух частях. Ч. 1, Медицина, Москва, 1993.

4. JJ. Kaminski, J.A. Bristol, С. Puchalski, R.G. Lovey, A.J. Elliot, H. Guzik, D.M. Solomon, D.J. Conn, M.S. Domalski, S.C. Wong, E.H. Gold, J.F. Long, P.J.S. Chiu, M. Steinberg, A.T. McPhail, J. Med. Chem., 28, 876-892 (1985).

5. Y. Katsura, S. Nishino, H. Takasugi, Chem. Pharm. Bull., 39, 11,2937-2943 (1991).

6. G. Georges, D.P. Vercauteren, D.J. Vanderveken, R. Horion, G.H. Evrard, F.V. Durant, P. Georg, A.E. Wick, J. Med. Chem., 28,323-335 (1993).

7. J. Auta, E. Romeo, A. Kozikowski, D. Ma, E. Costa, A. Guidotti, J. Pharm. and Exp. Ther., 265, 2,649-656 (1993).

8. Y. Katsura, S. Nishino, H. Takasugi, Y. Inoue, M. Tomor, Chem. Pharm. Bull., 40,2,371-380 (1992).

9. A.O. Iivespaa, R. Jarumilinta, Indian Journal of Chemistry, 21B, 10,923927 (1982).

10. R.T. Mulcahy, J.J. Gipp, G.A. Ublacker, R.A. McClelland, Biochem. Pharmacol, 40,12, 2671-2676 (1990).

11. K. Nagarajan, R. Gowrishankar, V.P. Arja, T. George, M.D. Nair, S.J. Shenoy, V. Sudarsanam, Indian J. Exp. Biol., 30,3,193-200 (1992).

12. Ger. Pat. 2,600,538; Chem. Abstr., 85,160099 (1976).

13. Israeli Pat. 44,282; Chem. Abstr., 92,163965 (1980).

14. L.F. Miller, R.E. Bambury, J. Med. Chem., 14,1217-1218 (1971).

15. Ger. Pat. 2,518,032; Chem. Abstr., 84, 44066 (1976).

16. J.P. Maffrand, J.M. Pereillo, F. Eloy, D. Aubert, F. Rolland, G. Barthelemy, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther13(5), 469-474 (1978).

17. B. Cavalleri, G. Volpe, V. Arioli, F. Parenti, Arzneim.-Forsch., 27,10, 1889-1895 (1977).

18. A. Matschay, D. Skawarski, S. Sobiak, Polish. J. Chem., 74,1707-1712 (2000).

19. J.J. Kaminski, C. Puchalski, D.M. Solomon, D.J. Conn, R.K. Rizvi, A.J. Elliot, R.G. Lovey, H. Guzik, P.J.S. Chiu, J.F. Long, J. Med. Chem., 32, 1686-1700 (1989).

20. Ikemoto Т., Kawamoto Т., Tomimatsu K., Takatani M., Wakimasu M., Tetrahedron, 56, 7915-7921 (2000).

21. EP 656,210; Chem. Abstr., 123,40980 (1995).

22. WO 98 27,108; Chem. Abstr., 129,95714 (1998).

23. US Pat. 4,302,464; Chem. Abstr., 96,104242 (1982).

24. J.C. Boehm, J.C. Gleason, J. Pendrak, H.M. Sarau, D.B. Schmidt, J.J. Foley, W.D. Kingsbury, J. Med. Chem., 36,3333-3340 (1993).

25. K.A. Alvi, P. Crews, D.G. Loudhhead, J. Nat. Prod., 54, 6, 1509-1515 (1991).

26. Ger. Pat. 2,259,160; Chem. Abstr., 81, 63628 (1974).

27. US Pat. 4,182,865; Chem. Abstr., 92,181189 (1980).

28. В.Г. Граник, Лекарства. Фармокологический, биохимический и химический аспекты, Вузовская книга, Москва, 2001.

29. Т. Jen, H.V. Hoeven, W. Groves, R.A. McLean, В. Loev, J. Med. Chem., 18,90-99 (1975).

30. C. Burcholder, W.R. Dolbier, M. Medebielle, S. Ait-Mohard, Tetrahedron Letters, 42,3077-3080 (2001).

31. C. Hamdouchi, J. De Bias, M. Del Prado, J. Gruber, B.A. Heins, L.J. Vance, J. Med. Chem., 42,50-59 (1999).

32. A. Gueiffier, S. Mavel, M. Lhassani, A. Elhakmaoui, R. Snoeck, G. Andrei, O. Chavignon, J.C. Teulade, M. Witvrouw, J. Balzarini, E. De Clercq, J.P. Chapat, J. Med. Chem., 41, 5108-5112 (1998).

33. G.R. Rewankar, J.R. Matthews, R.K. Robins, J. Med. Chem., 18,1253 (1975).

34. Y. Abe, H. Kayariki, S. Satoh, T. Inoue, Y. Sawada, K. Imai, N. Inamura, M. Asano, et. al., J. Med. Chem., 41, 564-578 (1998).

35. WO 93 08,168; Chem. Abstr., 119,225951 (1993).

36. G. Georges, D.P. Vercauteren, D.J. Vanderveken, R. Horion, F.V. Durant, G.H. Evrard, P. Georg, A.E. Wick, J. Med. Chem., 28, 323-335 (1993).

37. R.C. Rush, S. Madakasira, N.H. Goldman, W.L. Woolverton, J.K. Rowlett, J. Pharm. and Exp. Ther., 280, 1, 174-188 (1997).

38. G. Puia, S. Vichini, P.H. Seeburg, E. Costa, Mot. Pharm., 39,691-696 (1991).

39. J.K. Rowlett, R.D. Spealman, S. Lelas, J. Pharm. and Exp. Ther., 291, 3, 1233-1241 (1999).

40. P.S. Malwinder, S.W.L. Sonjita, N.C. Manashi, Synthesis, 10,1380-1390 (2000).

41. J.H. Richard, W.M. Richard, P. John, K.R. Harshad, P. Wardman, J. Med. Chem., 35,1920-1926 (1992).

42. Japan. Pat. 7635,430; Chem. Abstr., 85,138620 (1976).

43. EP 315,826; Chem. Abstr., Ill, 194766 (1989).

44. R.G. Fargher, F.L. Pyman, J.Chem.Soc., 115, 217-260 (1919).

45. R.G. Fargher, J.Chem.Soc., 117, 668-680 (1920).

46. F.L. Pyman, L.A. Ravald, J.Chem.Soc., 117,1426-1429 (1920).

47. R. Burtles, F.L. Pyman, J.Chem.Soc., 127,2012-2018 (1925).

48. A. Kreutzberger, J.Org. Chem., 27, 886-91 (1962).

49. T. Pyl, H. Lahmer, H. Beyer, Chem.Ber., 94,3217-3223 (1961).

50. T. Pyl, S. Melde, H. Beyer, Ann., 663,108-112 (1963).

51. A. Lawson, J.Chem.Soc., 307-310 (1956).

52. Т.О. Norris, R.L. McKee, J.Am.Chem.Soc., 77,1056 (1955).

53. K. Odo, К. Kono, K. Sugino, J. Org. Chem., 23,1319-1321 (1958).

54. Б.А. Тертов, B.B. Бурыкин, Химия гетероцикл. соединений, 1,180-181 (1969).

55. Б.А. Тертов, В.В. Бурыкин, А.В. Коблик, Химия гетероцикл. соединений, 11, 1552-1554 (1972).

56. A. Hassner, P. Munger, В.А. Belinka, Tetrahedron Letters, 23, 7, 699-702 (1982).

57. Б.А. Тертов, В.В. Бурыкин, Химия гетероцикл. соединений, 11, 15541555 (1970).

58. D.A. Shirley, P.W. Alley, J. Am. Chem. Soc., 79,4922 (1957).

59. Б.А. Прийменко, П.М. Кочергин, Химия гетероцикл. соединений, 9, 1248-1251 (1971).

60. Т. Nishimura, К. Kitajima, J. Org. Chem., 41, 9, 1590-1593 (1976).

61. L. Citerio, E. Rivera, M.L. Saccarello, R. Stradi, B. Gioia, J. Heterocyclic Chem., 17,97-107 (1980).

62. F. Compernolle, N. Castagnoli, J. Heterocyclic Chem., 19, 1403-1408 (1982).

63. K. Nagarajan, V.P. Aija, T. George, G.A. Bhat, Y.S. Kulkarni, S.J. Shenoy, M.K. Rao, Indian Journal of Chemistry, 2 IB, 10, 949-952 (1982).

64. K. Nagarajan, V.P. Arja, T. George, V. Sudarsanam, R.K. Shah, A. Nagana Goud, S.J. Shenoy,V. Honkan, Y.S. Kulkarni, M.K. Rao, Indian Journal of Chemistry, 21B, 10,928-940 (1982).

65. A. Dalkafouki, J. Ardisson, N. Kunesch, L. Lacombe, J. E. Poisson, Tetrahedron Letters, 32, 39,5325-5328 (1991).

66. O.S. Radchenko, V.L. Novikov, R.H. Willis, P.T. Murphy, G.B. Elyakov, Tetrahedron Letters, 38, 20, 3581-3584 (1997).

67. G. Morel, E. Marchand, A. Foucaud, J. Org. Chem., 54,1185-1191 (1989).

68. А.Е. Wright, S.A. Chiles, S.S. Cross, J. Nat. Prod., 54, 6,1684-1686 (1991).

69. V. Sudarsanam, K. Nagarajan, V.P. Aija, A.P. Kaulgud, S.J. Shenoy,R.K. Shah, Indian Journal of Chemistry, 21B, 11, 989-996 (1982).

70. S.F. Farah, R.A. McClelland, Can. J. Chem., 71,4,427-432 (1993).

71. А.Ф. Пожарский, И.С. Кашпаров, Ю.П. Андрейчиков, А.И. Буряк,

72. А. А. Константинченко, A.M. Симонов, Химия гетероцикл. соединений, 6, 807-813 (1971).

73. А.М Симонов, Ю.П. Андрейчиков, ЖОрХ, 5,4,779-781 (1969).

74. Т.Р. Wunz, R.T. Dorr, D.S. Alberts, J. Med. Chem., 30,1313-1321 (1987).

75. M.J. Bouchet, A. Rendon, C.G. Wermuth, M. Goeldner, C. Mirth, J. Med. Chem., 30, 2222-2227 (1987).

76. F. Fabra, C. Galvez, A. Gonzales, P. Viladoms, J. Vilarrasa, J. Heterocycl. Chem., 15,7,1227-1229 (1978).

77. K.C. Agrawal, K.B. Bears, R.K. Sehgal, J.N. Brown, P.E. Rist, J. Med. Chem., 22, 583-586 (1979).

78. A.G. Beaman, W. Tautz, T. Gabriel, R.J. Duschinsky, J. Am. Chem. Soc., 87,389-391 (1965).

79. B. Cavalleri, R. Ballotta, V. Arioli, Chim. Ther6,5,397-402 (1971).

80. Ger. Pat. 2,151,721; Chem. Abstr., 77, 61998 (1972).

81. R.A. Glennon, M.E. Rogers, M.K. El-Said, J. Heterocyclic Chem., 17,337340 (1980).

82. M.D. Nair, V. Sudarsanam, J. A. Desai, Indian Journal of Chemistry, 2 IB, 11,1030-1032 (1982).

83. Химия гетероцикл. соединений, 475 (1965).

84. Химия гетероцикл. соединений, Сб.1,133 (1967).

85. П.М. Кочергин, Б. А. Прийменко, Химия гетероцикл. соединений, 1, 176-177 (1969).

86. Б.А. Прийменко, П.М. Кочергин, Химия гетероцикл. соединений, 9, 1243-1247 (1971).

87. Н.С. Паталаха, П.Б. Курапов, И.И. Грандберг, Б.А. Прийменко, Изв. ТСХА, 5,145-146 (1983).

88. A.F. Abdel-Magid, K.G. Carson, B.D. Harris, C.A. Maryanoff, R.D. Shah, J. Org. Chem., 61, 3849-3862 (1996).

89. J.T. Welch, Tetrahedron Letters, 43, 3123 (1987).

90. T. Ono, V.P. Kukhar, V.A. Soloshonok, J. Org. Chem., 61, 6563-6569 (1996).

91. A.K. Socsena, P. Mangiaracime, Tetrahedron Letters, 24, 273-276 (1983).

92. B.C. Ranu, A. Majee, A. Sarkar, J. Org. Chem., 63,370-373 (1998).

93. Ю.Д. Смирнова, А.П. Томилов, ЖОрХ, 28,42 (1992).

94. J. Tadanier, R. Hallas, R. Jerry, S. Ruth, Tetrahedron, 37,1309 (1981).

95. А.Ф. Пожарский, Теоретические основы химии гетероциклов, Химия, Москва, 1985.

96. Р.С. Сагитулин, А.Н. Кост,ЖОрХ, 16,658-669 (1980).

97. С.К. Bradsher, L.D. Quin, R.E. LeBlue, J. Org. Chem., 26,3273-3278 (1961).

98. C.K. Bradsher, J.E. Boliek, R.D. Brandau, J. Org. Chem., 35,2495-2497 (1961).

99. E.V.Babaev, A.V.Efimov, D.A.Maiboroda, K.Jug, Eur. J. Chem. 1998,193196

100. H.M. Жирмунская, Агрохимия, 4,119-135 (1984).

101. Л.И. Бойценюк, Д.В. Калашников, Хорхе Рикельме, П.Б. Курапов,

102. Доклады ТСХА, 267,26-40 (1996).