Комплексообразование тетрапиррольных соединений с альбумином и липопротеинами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

005552539

На правах рукописи

Головина Галина Владимировна

КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ТЕТРАПИРРОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С АЛЬБУМИНОМ И ЛИПОПРОТЕИНАМИ

02.00.04 — физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2014 г.

18 СЕН щ

005552539

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук (ИБХФ РАН)

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Кузьмин Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Олейников Владимир Александрович, заведующий лабораторией молекулярной биофизики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института, биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

доктор химических наук, профессор

Горбунова Юлия Германовна, заведующая сектором химии металлокомплексных супрамолекулярных систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита диссертации состоится 19 ноября 2014 г. в 13:30 на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук и на сайте http://ibcp.chph.ras.ru/2014/.

Автореферат разослан « » C&^S" 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 002.039.01,

кандидат химических наук

Мазалецкая Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Фотодинамическая терапия (ФДТ) и борнейтронозахватная терапия (БНЗТ) являются перспективными методами лечения онкологических заболеваний. Терапевтический эффект основан на индуцировании реакционноспособных частиц в ответ на действие света или тепловых нейтронов на очаг поражения, содержащий фото/ радиосенсибилизатор (ФС/РС). Эти частицы вызывают гибель опухолевых клеток.

Важнейшим критерием эффективности ФС/РС является его взаимодействие с компонентами плазмы крови — альбумином (человеческий сывороточный альбумин, ЧСА) и липопротеинами низкой плотности (ЛНП) — переносчиками многих лекарственных препаратов. Связывание ФС/РС с ЧСА и ЛНП может определяться различными факторами, например, наличием заместителей в молекуле сенсибилизатора, природой металла, рН среды и др.

Особый интерес представляют ФС/РС, содержащие борные полиэдры. В случае БНЗТ тетрапиррольный фрагмент определяет преимущественное накопление препарата в опухоли, тогда как карборан обеспечивает необходимую концентрацию бора в клетке. Получены данные об улучшении противоопухолевых характеристик ФС, несущих борные полиэдры, по сравнению с их неборированными аналогами, и для ФДТ.

Объемные карборановые группы могут затруднять взаимодействие ФС/РС с ЧСА за счет возникающих стерических препятствий. Тем не менее, высокое сродство ФС/РС к ЛНП способно компенсировать такой нежелательный эффект. В связи с этим высокий интерес представляет изучение взаимодействия ФС/РС с ЧСА и ЛНП, что является важным аспектом в определении систем переноса этих соединений.

В качестве перспективных ФС для ФДТ нашли свое применение металлокомплексы тетрапиррольных соединений. Так, исследовано

связывание ЧСА и безметального пурпурина-18, однако введение металла в его молекулу может оказывать влияние на величину константы связывания, что, в свою очередь, обусловливает тот или иной фотодинамический эффект.

В опухолях рН нередко снижен, комплексообразование же ФС с макромолекулами и, следовательно, результат фотовоздействия, могут зависеть от кислотности среды. Таким образом, изучение влияния рН среды на комплексообразование ФС с ЧСА и ЛНП — актуальная проблема.

Цель работы - изучение влияния заместителей, природы металла и рН среды на комплексообразование потенциальных ФС/РС с ЧСА и ЛНП физико-химическими методами.

Объектом наших исследований являлись потенциальные ФС/РС: 2.П-, N1- и Р(1-производные пурпурина-18; метилфеофорбид а и два его диборированных аналога; пирофеофорбид а (ПФФ, в качестве ФС широко применяются производные ПФФ).

Предметом исследований являлись количественные изменения параметров связывания испытуемых ФС/РС с белками ЧСА и ЛНП под влиянием заместителей в их молекулах, природы металла или рН среды.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

— исследовать влияние центрального атома металла на процессы комплексообразования ФС с ЧСА на примере металлических производных пурпурина-18, содержащих в качестве центральных атомов Ъл, № и Рс1;

— изучить влияние объемных периферийных заместителей на процессы комплексообразования с белками ЧСА и ЛНП на примере диборированных производных метилфеофорбида а и сравнить полученные значения с данными для незамещенного метилфеофорбида;

— выявить роль кислотности среды в процессах комплексообразования на примере связывания пирофеофорбида а с ЧСА и ЛНП.

Научная новизна работы. Впервые изучено взаимодействие Zn-, Ni-, Pd-металлокомплексов пурпурина-18 с ЧСА и метилфеофорбида а и его диборированных аналогов - 13(2),17(3)-[ди(о-карборан-1-ил)метокси-карбонил]феофорбид а и 13(2),17(3)-[ди(1-карба-клозо-додекаборан-1-ил)метокеикарбонил]феофорбид а — с ЧСА и ЛНП. Нами установлено, что ЛНП - предпочтительный белок-переносчик диборированных производных. Исследовано ранее не изученное взаимодействие пирофеофорбида а с ЧСА и ЛНП и показано влияние среды на процессы комплексообразования. Предложен предпочтительный механизм доставки пирофеофорбида в опухоль.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют предложить механизм доставки исследуемых соединений в опухоль и оптимизировать разработку терапевтических ФС/РС на основе данных соединений.

Методы исследования. Для выполнения работы были использованы физико-химические методы анализа: спектрофотометрия,

спектрофлуориметрия, метод однофотонного счета, лазерный фотолиз. Обработку результатов проводили с применением программы Pro-Data Viewer version 4.2.5 и Origin 6.1. Компьютерное моделирование проводилось" с использованием программ Build Model, Lead Finder, Molsoft ICM 3.6, Avogadro 1.0.3, Gamess US.

На защиту выносятся следующие положения:

- Ионы Zn2+ и Ni2+ в пурпурине-18 способны координироваться с кислородом тирозина в сайте связывания ЧСА за счет образования дополнительных аксиальных связей, тогда как координационная насыщенность Pd2+ препятствует такому взаимодействию.

- Введение в тетрапиррольную молекулу двух объемных заместителей-карборанов приводит к стерическим препятствиям при их комплексообразовании с ЧСА, однако не влияет на взаимодействие с ЛНП.

- Реакция комплексообразования СООН-содержащего тетрапиррола с ЧСА в отличие от его комплексообразования с ЛНП является чувствительной к рН среды.

- Механизм доставки диборированного/СООН-содержащего тетрапиррола в опухолевую ткань может быть опосредован липопротеиновым транспортом.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на X Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (Иваново, 2009), XXI Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2009), IX, X и XI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы (Москва, 2009-2011).

Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 5 статьях и 5 тезисах докладов на международных научных конференциях и симпозиуме.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка используемых сокращений и списка цитируемой литературы, включающего 160 источников. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами, 31 рисунком и 2 схемами, объем — 100 страниц печатного текста.

Личный вклад автора. Диссертантом выполнен весь объем физико-химических исследований, полностью проанализирован весь массив полученных данных по физико-химическому анализу и компьютерному моделированию, сформулированы общие положения, выносимые на защиту, и выводы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность темы работы, выбор объектов исследования; сформулирована основная цель и задачи; обозначены научная новизна и практическая значимость, положения, выносимые на защиту.

Глава I. Литературный обзор. Первая глава посвящена обзору имеющихся литературных данных о фотодинамической и борнейтронозахватной терапии, основных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии, роли белков при распределении и накоплении фотосенсибилизаторов в тканях, процессах взаимодействия фотосенсибилизаторов с белками ЧСА и ЛНП.

Глава II. Материалы и методы исследования. Вторая глава содержит описание экспериментальных методик и методы обсчета. Константы связывания Кс определяли из кривых связывания по уравнению:

О = х tEejI0K1 t Где [Белок] - концентрация ЧСА или ЛНП, а в - доля 1 + iCc х [Белок]

связанных с белком испытуемых соединений, равная (А — А0) / (А„ - А0). А0, А„ и А — поглощение соединения при нулевом, полном и промежуточном связывании с белком, соответственно, измеренное в Q-полосе.

Спектры поглощения были получены на спектрофотометре Shimadzu UV-1700 PC, флуоресценции — на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301 PC; времена жизни флуоресценции - на флуорометре Fluo Time 200 (PicoQuant). Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния исследовались с помощью установки лазерного фотолиза LKS80 (applied Phtophysics, UK); данные обрабатывались в программе Pro-Data Viewer version 4.2.5.

Для моделирования координации металлопурпурина-18 с ЧСА использовался метод молекулярного докинга, реализованный в программе Lead Finder. Полноатомная модель трехмерной структуры белка была подготовлена при помощи программы Build Model.

Для определения вариантов связывания соединений с ЧСА и оценки возможности их встраивания в «глобиновый» карман белка проводилась процедура «гибкого» докинга в пакете Molsoft ICM Pro 3.6. Грубые пространственные модели молекул построены с использованием программ Molsoft ICM 3.6 и Avogadro 1.0.3, оптимизация их структуры проведена в программе Gamess US. Моделью ЧСА служила пространственная структура 1N5U из банка данных PDB.

При расчете свободной энергии связывания учитывались только вклады электростатической и гидрофобной составляющих, а также энтропийный вклад боковых цепей аминокислот белка. Электростатическую составляющую рассчитывали методом REBEL. Оценка гидрофобной составляющей каждого атома ЧСА проводилась на основе предположения о ее линейной пропорциональности поверхности атома, доступной растворителю. Потеря конфигурационной энтропии боковых цепей аминокислот белка при связывании с испытуемыми соединениями проводилась на основе табулированных данных о ее максимально возможных величинах для каждого аминокислотного остатка.

Глава III. Результаты исследования. Рисунок 1. Структура (1), М =

форме. Об этом свидетельствовало изменение

спектров поглощения соединений при переходе от водной фазы к диметилсульфоксиду. Так, в спектрах поглощения буферных растворов (1) и

В третьей главе представлены результаты взаимодействия ФС с белками ЧСА и ЛНП. Взаимодействие Хп-, N1- и Рс1-пурпуринов-18 (соединения (1), (2) и (3), соответственно, рисунок 1) с ЧСА нами было исследовано методом абсорбционной спектроскопии. В водном буферном растворе, рН 7.0, соединения (1) и (2) склонны к агрегации, тогда как (3) присутствует преимущественно в мономерной

Zn; (2), М = Ni и (3), М = Pd.

U ип

(2) наблюдали максимум в районе 740 нм (пик агрегатов), тогда как (3) поглощало только при 660 нм в области (^-полосы (мономерный пик). Различное поведение исследуемых соединений в водном растворе может быть вызвано влиянием металла в центральном положении. Для иона Рс12+ характерно плоско-квадратное строение его комплекса, которое и реализуется в тетрапирроле. Расщепление же с1-подуровня М2+ и в поле лигандов не столь велико, что приводит к образованию октаэдра и квадратной пирамиды, соответственно. Таким образом, в пурпурине эти два иона должны координировать дополнительные лиганды, что обусловливает сродство их молекул друг к другу, проявляющееся в агрегации.

Добавление ЧСА к буферным растворам (1)-(3) приводило к разрушению агрегированных структур (1) и (2) и к трансформации спектров поглощения всех испытуемых соединений (рисунок 2). По данным изменения спектров поглощения построены кривые связывания (рисунок 2) и рассчитаны константы связывания (таблица 1). Оказалось, что наличие Рс1 в молекуле пурпурина-18 приводит к видимому ослаблению (на один порядок) взаимодействия ФС-ЧСА по сравнению с Ъп- и №-производными. В полости центра связывания гема, расположенного в субдомене 1В альбумина, находится тирозин, способный координировать катион металла (рисунок 3). Однако координационная насыщенность Рс12+ в составе комплекса с пурпурином-18 препятствует взаимодействию этого металла с кислородом тирозина, тогда как ионы и №2+ способны координироваться тирозином за счет образования дополнительных аксиальных связей. Последнее может обусловливать более высокое сродство соединений (1) и (2) к ЧСА относительно соединения (3).

Таким образом, при введении металла в молекулу пурпурина-18 достигается различное сродство металлокомплексов пурпурина к ЧСА.

Для исследования спектрально-кинетических характеристик триплетного состояния металл-пурпуринов нами было взято соединение (2). При фотовозбуждении лазерным импульсом тетрапиррола в этаноле

происходит заселение триплетного состояния соединения. Спектр Т-Т поглощения представляет собой структурную полосу с поглощением в области 430-480 нм; в полосе Соре и (^-полосе наблюдается фотовыцветание.

Добавление кислорода к образцу соединения (2) в этаноле оказывало воздействие на кинетику гибели триплетного состояния (2). В таблице 2 приведены константы скорости псевдопервого порядка гибели триплетного состояния к для системы в отсутствие кислорода, насыщенной кислородом воздуха и чистым кислородом. По данным таблицы построен график (рисунок 4). Константа скорости бимолекулярной реакции тушения кислородом кч составила 1хЮ9 М~'с~', что соответствует этой величине для бимолекулярной реакции диффузионно контролируемых реакций.

"400 600 700 800 Длина волны, нм

Рисунок 2. Спектры поглощения а: (1), б:

(2), в: (3)(1х10"5М) в присутствии ЧСА (0 р к 3 Структура металлокомплекса - 6x10- М). Стрелками показано изменение _18 с шьбумин0м1 предсказанная

спектров поглощения при увеличении методом молекулярного докинга. концентрации белка. Вставки: кривые связывания (1)-(3) с ЧСА.

Соединение Кс, М1

(1) (4.5±0.2)х10ь

(2) (2.0±0.2)х10ь

(3) (3.7±0.2)хЮ4

Таблица 2. к для систем с различной [02

Ю21, мМ с"1

0 3.5Х105

2 4.4x10"

10 1.3x10'

О 5 10

[0,1. мМ

Рисунок 4. Зависимость к (2) от концентрации кислорода.

Исследование комплексообразования метилфеофорбида а (4) и его диборированных аналогов — 13(2), 17(3 )-[ди(о-карборан-1-ил)метоксикарбонил] феофорбид а (5) и 13(2),17(3)-[ди(1-карба-кт70зо-додекаборан-1-ил)метокси-карбонил]феофорбид а (6) (рисунок 5) — с ЧСА проводилось спектрометрическими методами и компьютерным моделированием при помощи «гибкого» докинга. Взаимодействие (4)-(6) с ЛНП было исследовано спектрометрическими методами.

Добавление ЧСА к водному буферному раствору, рН 7.0, соединения (4) приводило к трансформации спектров поглощения (4) (рисунок 6, а). Наблюдалось увеличение оптической плотности полосы Соре и уменьшение поглощения (^-полосы при 689 нм (пик агрегатов (4)) с образованием нового максимума в области 677 нм (пик мономерной формы (4) в комплексе с белком); на 680 нм наблюдалась изобестическая точка. Присутствие преимущественно агрегированной формы (4) в водном буфере подтверждалось спектрами поглощения (4) в неполярных растворителях. Константа связывания Кс для комплекса (4) с ЧСА составила 5*104 М-1. Для

Рисунок 5. Структура 1: (4), 2: (5) и 3: (6).

соединений (5), (6) добавление ЧСА не приводило к видимым изменениям их спектров поглощения.

Однако все три исследуемых соединения проявляли практически одинаковое сродство к ЛНП с Кс ~ 1х108 М-1. Взаимодействие с ЛНП приводило к изменениям спектров поглощения (4), сходным с изменениями при его связывании с ЧСА (рисунок 6, б). При добавлении ЛНП, в спектрах поглощения (4) наблюдали падение интенсивности полосы поглощения в области 689 нм с возрастанием нового максимума на 673 нм. Для соединений (5), (6) добавление ЛНП приводило к возрастанию интенсивности основных полос поглощения (рисунок 6, в, г).

Природа комплексообразования с липопротеинами отличается от связывания с альбумином. Если в последнем случае тетрапиррольный фрагмент связывается со специфическим сайтом, обладающим сродством к гемоподобным структурам, то при взаимодействии с ЛНП таких определенных мест связывания до сих пор не выявлено, и

Длина волны, нм

Рисунок 6. Спектры поглощения (4) (1 х 10"5 М) в присутствии ЧСА (0 - 5 х 10-5 М, а) и (4), (5), (6) (1х1СГ5 М) в присутствии ЛНП (0 - 8х1СГ8 М, б, в, г, соответственно). Стрелками показано изменение спектров поглощения при увеличении концентрации белка. Вставки: изменение поглощения при добавлении белков, измеренное в (З-полосе.

комплексообразование осуществляется за счет липофильных свойств ФС/РС. Другими словами, имеет место разделение ФС/РС между водной и протеиновой фазами.

В ЧСА сайт связывания для гемоподобных структур представляет собой узкую и достаточно глубокую впадину на поверхности субдомена Ш, которая сформирована в основном гидрофобными остатками аминокислот. Большинство позиций (4), найденных по результатам докинга, находятся внутри сайта связывания (рисунок 7А). Именно такие позиции (4) обладают наиболее низкой свободной энергией связывания Ес и являются наиболее вероятными. В отличие от (4), соединения (5) и (6) располагаются у входа в сайт (рисунок 7Б; (6) не показано). Две массивные боковые группы, представленные карбораном в нейтральной/заряженной форме, не способны одновременно разместиться на его входе. Таким образом, из всех исследованных соединений наиболее эффективно с ЧСА связывается (4). Относительные величины Ес и ее составляющих наиболее вероятной конформации (4)—(6) с ЧСА представлены в таблице 3. Основной стабилизирующий вклад в суммарную энергию связывания вносится гидрофобной составляющей. Электростатическая же составляющая несколько дестабилизирует связывание. Боковые цепи аминокислотных остатков ЧСА, принимающих участие в связывании, частично теряют свою подвижность, а значит, уменьшается и их энтропия. Причем гидрофобные остатки в сайте уже выстроены определенным образом, и их энтропия лишь незначительно уменьшается при связывании лиганда, тогда как большинство остатков, окружающих вход в сайт, являются полярными или заряженными. Они напрямую контактируют с растворителем, поэтому их подвижность выше. Следовательно, связывание лиганда с такими остатками в большей степени уменьшает их энтропию. Таким образом, хотя гидрофобная составляющая и вносит основной вклад в суммарную Ес, потеря энтропии боковых цепей аминокислотных остатков при связывании (4)-(6) делает значимую корректировку ее величины.

Рисунок 7. Конформации А, (4) и Б, (5) с наименьшей свободной энергией связывания. Таблица 3. Ес наиболее вероятной конформации (4)-(6) с ЧСА

Соединение Ес, ккал/моль

Гидрофобная Электростатическая Потеря энтропии Суммарная

(4) -15.6 1.2 2.6 -11.8

(5) -17.5 2.2 5.4 -9.9

(6) -14.5 1.1 4.7 -8.7

Следует отметить, что борирование не всегда отрицательно сказывается на взаимодействии ФС-ЧСА. Показано, что введение одного карборана в молекулу метилфеофорбида а - 13(2)-[( 1 -карба-клозо-додекаборан-1-ил)метоксикарбонил]феофорбид а метиловый эфир, соединение (7) — не только не препятствует такому взаимодействию, а, напротив, способно усиливать его.

Показано усиление связывания производного хлорина еб (хлорин еб 13(1)-М-(2-аминоэтиламид-15(2),17(3)-диметиловый эфир, (8)) с ЧСА в 4 раза при введении одного карборана в его макроцикл (хлорин еб 13(1 )->чт-(2-(Ы-( 1 -о-карборанил)метил)аминоэтил)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир, (9)). Константы комплексообразования составили 2><105 КГ1 и 8><105 М-1 для (8) и (9), соответственно. Константы считали по изменению спектров флуоресценции испытуемых соединений (концентрация образца - 1СГ5 М)

при добавлении ЧСА (0 - 5><10~5 М); интенсивность флуоресценции возрастала с увеличением концентрации ЧСА.

Итак, установлено, что введение в молекулу (4) двух объемных заместителей карборанов приводит к стерическим препятствиям при взаимодействии с сайтом связывания ЧСА, но не влияет существенным образом на сродство к ЛНП. Таким образом, распределение и доставка дикарборан-содержащих ФС/РС (5), (6) может осуществляться липопротеин-опосредованным транспортом.

Взаимодействие пирофеофорбида а Рисунок 8. Пирофеофорбид а.

(ПФФ, соединение (10), рисунок 8) с ЧСА и

ЛНП в водном буферном растворе при рН 7.4 н2с

и 5.0 нами исследовано методом ^

н3с—/ сн3

абсорбционной и флуоресцентной

спектроскопии. В водном буферном растворе ПФФ присутствует преимущественно в виде агрегатов (максимум поглощения 710 нм). Это подтвердждали спектры поглощения ПФФ в этаноле и в смесях этанола с водным буфером; хон добавление этанола к водным растворам агрегированных соединений вызывает их дезагрегацию, проявляющуюся в исчезновении полосы агрегатов и появлении максимума поглощения мономерной формы. При рН 5.0 полоса агрегатов ПФФ была вдвое интенсивнее, чем при рН 7.4, а поглощение мономеров (674 нм) практически не наблюдалось. Устойчивость агрегатов тетрапиррольных соединений определяется гидрофобными взаимодействиями между макроциклами и электростатическим отталкиванием одноименно заряженных заместителей соседних молекул. Таким образом, уменьшение рН и смещение кислотно-основного равновесия в сторону недиссоциированных СООН-групп ПФФ приводит к возрастанию стабильности его агрегатов.

н3с н

Добавление ЧСА и ЛНП к раствору ПФФ сопровождалось дезагрегацией и образованием мономеров ПФФ в комплексе с белком. В спектрах поглощения наблюдалось падение абсорбционного максимума ПФФ в области 710 нм и возрастание поглощения при 674 нм (рисунок 9). Напротив, малые количества ЛНП (< 5х10"9 М) приводили к возрастанию полосы агрегатов ПФФ. ЛНП способны связывать ФС как в мономерной, так и в агрегированной формах. В случае малых концентраций ЛНП большее число молекул ПФФ связывается с одной макромолекулой, что может вызывать агрегацию ПФФ. При комплексообразовании ПФФ с ЧСА такой эффект не наблюдался, т.к. альбумин связывает тетрапиррольный ФС в мольном соотношении 1:1. При насыщении связывания ПФФ с ЛНП пики агрегатов при обоих значениях рН исчезали, тогда как при взаимодействии ПФФ с ЧСА практически полная дезагрегация ПФФ наблюдалась только при рН 7.4. Кислая среда — рН 5.0 - препятствовала образованию мономеров ПФФ в комплексе с белком в исследуемом диапазоне концентраций.

0.6

0.0

Ч)

400

600

700

400

600

700

0.6

400 600 700

Длина

волны, нм

600

700

Рисунок 9. Спектры поглощения ПФФ (1x10 5 М) в отсутствие и в присутствии ЧСА (1x10^ - 5хЮ"5 М, а, б) и ЛНП (2.5хЮ~9 - 1хЮ"7 М, в, г) при рН 7.4 (а, в) и 5.0 (б, г). Стрелками показано изменение спектров ПФФ при увеличении концентрации белка

[ЧСА]х105, М [ЛНП]х108, М

Рисунок 10. Кривые связывания ПФФ с ЧСА (а) и с ЛНП (б), рН среды 7.4 (/) и 5.0 (2).

Связывание с ЧСА ослабевает, а с ЛНП возрастает с увеличением гидрофобное™ ФС. Снижение рН от 7.4 до 5.0, несмотря на смещение равновесия в сторону недиссоциированных молекул ПФФ, не должно изменять его гидрофобность. Такое предположение, высказанное для пурпурина-18, должно быть справедливо и для ПФФ, т.к. структуры обоих соединений схожи: у ПФФ имеется циклопентенон вместо ангидридного цикла в пурпурине-18. Действительно, уменьшение рН не отразилось на взаимодействии ПФФ с ЛНП, обусловленном экстракцией ПФФ из водной фазы в фазу ЛНП, однако, привело к ослаблению связывания ПФФ с ЧСА в 1.5 раза (рисунок 10, таблица 4). Последнее может быть вызвано как конформационными изменениями ЧСА в исследуемом диапазоне рН, так и смещением равновесия ПФФ в сторону недиссоциированных карбоксильных групп и уменьшением стабилизации комплекса.

Таким образом, реакция комплексообразования ПФФ с ЧСА более чувствительна к рН, чем взаимодействие ПФФ с ЛНП.

Таблица 4. Константы связывания (ЛУ ПФФ с белками

Белок рН Кс, М"1

7.4 1.7х105

ЧСА 5.0 1.1х105

7.4 2.7x10'

ЛНП 5.0 2.5хЮ7

Склонность к образованию агрегированных структур в водном растворе обусловливала низкий квантовый выход флуоресценции ПФФ. Добавление ЧСА приводило к увеличению интенсивности флуоресценции благодаря образованию стабильного комплекса мономерной формы ПФФ с белком, а также усилению жесткости макроцикла в белковом окружении. На основании изменений интенсивности флуоресценции (676 нм) построены кривые связывания. Константы связывания составили 1.4*105 и 8.4х104 М~' при рН 7.4 и 5.0, соответственно. Наибольшее значение параметров связывания ПФФ с ЧСА достигалось при рН 7.4 по сравнению с рН 5.0.

Добавление < 5*10^ М ЛНП к ПФФ не вызывало существенных изменений в спектрах флуоресценции последнего. Дальнейшее повышение концентрации ЛНП приводило к значительному возрастанию интенсивности флуоресценции ПФФ. Это может объясняться тем, что интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству неагрегированных молекул ФС, и служить дополнительным подтверждением способности ЛНП связывать как мономерную, так и агрегированную формы ПФФ.

По кинетическим кривым флуоресценции, полученным методом однофотонного счета, были измерены времена жизни флуоресценции ПФФ (1x10^ М) в этиловом спирте и фосфатном буфере, рН 7.0, в отсутствие и в присутствии ЧСА (5х 10~5 М). Затухание флуоресценции может быть описано моно-экспоненциальной кривой, что свидетельствует о наличии одного типа комплекса. Время жизни флуоресценции ПФФ в ЧСА оказалось близким по значению со временем жизни в этиловом спирте (таблица 5). Время жизни флуоресценции обусловлено природой микроокружения. Так, в мицеллярном окружении время жизни определяется доступностью соединения для контакта с водной фазой. Таким образом, было обнаружено, что в комплексе с ЧСА контакт ПФФ с водной фазой ограничен.

Таблица 5. Время жизни флуоресценции т ПФФ, 653 нм

Система Г, НС

Этиловый спирт 6.4

Буфер 5.1

ЧСА 6.5

Наши исследования показали, что на связывание с ЧСА существенным образом влияют такие факторы, как наличие заместителей (как в координационной сфере молекулы тетрапиррола, так и на периферии) и рН среды. Однако при связывании данных соединений с ЛНП такие эффекты не наблюдались. Т.е. ни заместители (карбораны), ни рН не оказывали существенного влияния на комплексообразование ФС с данным белком. Наши исследования позволили предложить механизм распределения пирофеофорбида а и диборированных производных метилфеофорбида а. Изложение работы заканчивается заключением и выводами.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что природа металла обусловливает различное поведение металлокомплексов пурпурина-18 в водном буферном растворе (смещение равновесия мономер—»агрегат) и различное сродство к ЧСА. Присутствие Ъ\ и N1 приводит к агрегации в водном буфере и усилению взаимодействия ФС-ЧСА по сравнению с Рс1-комплексом благодаря способности Тг\ и № образовывать дополнительные аксиальные связи; координационная насыщенность Р<1 препятствует такому взаимодействию.

2. Показано, что распределение и доставка дикарборан-содержащих сенсибилизаторов может осуществляться липопротеиновым транспортом. Ведение в молекулу МФФ двух карборанов (нейтральных или отрицательно заряженных) приводит к стерическим препятствиям при взаимодействии с сайтом связывания ЧСА, но практически не влияет на сродство к ЛНП.

3. Показано, что стабильность агрегатов ПФФ в водном буферном растворе возрастает с понижением рН (от 7.4 до 5.0). Это объясняется

смещением кислотно-основного равновесия в сторону недиссоциированных СООН-групп в кислой среде.

4. Обнаружена способность ЛНП связывать ПФФ как в мономерной, так и в агрегированной форме. Комплексообразование ПФФ с ЧСА или ЛНП в целом сопровождается его дезагрегацией и образованием мономеров в комплексе с белком; малые количества ЛНП, напротив, стимулируют дополнительную агрегацию ПФФ в комплексе с макромолекулой.

5. Установлено, что реакция комплексообразования ПФФ с ЧСА более чувствительна к pH, чем взаимодействие ПФФ с ЛНП. Уменьшение pH (от 7.4 до 5.0) не влияет на взаимодействие ПФФ с ЛНП, т.к. при этом не изменяется гидрофобность ПФФ. В исследуемом диапазоне pH константа связывания ПФФ с ЧСА уменьшается в 1.5 раза, что обусловлено конформационными изменениями ЧСА и смещением равновесия в сторону образования недиссоциированных карбоксильных групп ПФФ.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Ol'shevskaya, V. A. Novel boronated chlorin e6-based photosensitizers: Synthesis, binding to albumin and antitumour efficacy / V. A. Ol'shevskaya, R. G. Nikitina, A. N. Savchenko, M. V. Malshakova, A. M. Vinogradov, G. V. Golovina, D. V. Belykh, A. V. Kutchin, M. A. Kaplan, V. N. Kalinin, V. A. Kuzmin, A. A. Shtil // Bioorg. Med. Chem. - 2009. - No. 17. - P. 1297-1306.

2. Ольшевская, В. А. Новые борированные производные пурпурина-18: синтез и взаимодействие с сывороточным альбумином / В. А. Ольшевская, А. Н. Савченко, Г. В. Головина, В. В. Лазарев, Е. Г. Кононова, П. В. Петровский, В. Н. Калинин, А. А. Штиль, В. А. Кузьмин // Доклады академии наук. -2010. - Т. 435. - № 5. - С. 633-639.

3. Головина, Г. В. Роль кислотности среды в комплексообразовании пирофеофорбида а с альбумином и липопротеинами / Г. В. Головина, В. А. Ольшевская, В. Н. Калинин, А. А. Штиль, В. А. Кузьмин // Биоорганическая химия. - 2011. - Т. 37. -№ 5. - С. 718-720.

4. Головина, Г. В. Константы комплексообразования Zn-, Ni- и Pd-производных пурпурина-18 с сывороточным альбумином / Г. В. Головина, Ф. Н. Новиков, В. А. Ольшевская, В. Н. Калинин, А. А. Штиль, В. А. Кузьмин // Журнал физической химии.-2012.-Т. 86.-№ 11.-С. 1887-1889.

5. Golovina, G. V. Differential binding preference of methylpheophorbide a and its diboronated derivatives to albumin and low density lipoproteins / G. V. Golovina, G. N. Rychkov, V. A. Ol'shevskaya, A. V. Zaitsev, V. N. Kalinin, V. A. Kuzmin, A. A. Shtil // Anti-Cancer Agents in Médicinal Chemistry. - 2013. - V. 13. —No. 4.-P. 639-646.

6. Головина, Г. В. Изучение взаимодействия пирофеофорбида и его борированного производного с альбумином для оптимизации фотосенсибилизаторов / Г. В. Головина, В. А. Ольшевская, А. М. Виноградов, М. И. Коноваленко, В. Н. Лузгина, В. А. Кузьмин, А. А. Штиль // Сборник тезисов X Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов. Иваново. — 2009. — С. 102.

7. Головина, Г. В. Спектральные исследования комплексообразования пирофеофорбида и его карборансодержащего производного с человеческим сывороточным альбумином и липопротеинами низкой плотности / Г. В. Головина, В. А. Кузьмин, В. А. Ольшевская // Сборник тезисов XXI Симпозиума «Современная химическая физика». Туапсе. - 2009.

8. Головина, Г. В. Взаимодействие новых фотосенсибилизаторов на основе борированных производных метилфеофорбида а с компонентами плазмы крови: человеческим сывороточным альбумином и липопротеинами низкой плотности / Г. В. Головина, А. Н. Савченко, В. А. Ольшевская, В. Н. Калинин, В. А. Кузьмин, А. А. Штиль // Сборник тезисов IX Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы. Москва. — 2009.-С. 64-67.

9. Головина, Г. В. Влияние металла в пурпурине-18 на процессы комплексообразования с человеческим сывороточным альбумином / Г. В.

Головина, В. А. Кузьмин, В. А. Ольшевская, А. Н. Савченко, В. Н. Калинин, А. А. Штиль // Сборник тезисов X Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы. Москва. - 2010. - С. 49-50. 10. Головина Г. В. Комплексообразование пирофефорбида а с альбумином и липопротеинами в условиях различных рН / Г. В. Головина, В. А. Ольшевская, В. Н. Калинин, А. А. Штиль, В. А. Кузьмин // Сборник тезисов XI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы. Москва. - 2011. - С. 77-78.

Подписано в печать:

01.09.2014

Заказ № 10174 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru