Взаимодействие производных порфина и порфиразина с потенциальными транспортными агентами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

005004145

На правах рукописи

ПОПОВА Татьяна Евгеньевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПОРФИНА И ПОРФИРАЗИНА С ПОТЕНЦИАЛЬНЫМИ ТРАНСПОРТНЫМИ АГЕНТАМИ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 1 ДЕК 2011

Иваново-2011

005004145

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии растворов им. Г. А. Крестова РАН

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Лебедева Наталья Шамильевна

Андреев Владимир Петрович Альпер Геннадий Аркадьевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославский государственный технический университет»

Защита состоится « 15 » декабря 2011 г. в 13°° часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.106.01 при Учреждении Российской академии наук Институте химии растворов им. Г. А. Крестова РАН по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Академическая, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химии растворов им. Г. А. Крестова РАН по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Академическая, д. 1.

Автореферат разослан <<^> Ц/ОЛ*5р>А-2011 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Антина Е. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной химии является синтез и исследование свойств ароматических макрогетероциклических соединений (МГС) - потенциальных лекарственных препаратов для фотодинамической терапии. Подавляющее большинство фотосенсибилизаторов (первого поколения -порфирины, второго поколения - фталоцианины и хлорины) и разрабатываемые в настоящее время препараты третьего поколения - являются гидрофобными молекулами, имеющими низкую растворимость в водных средах. Липофильные МГС являются менее токсичными и более эффективными по сравнению с водорастворимыми (Jori G. J. J. Photochem. Photobiol. В: Biol. 1996). По этой причине целесообразно проводить синтез МГС, содержащих наряду с гидрофобными гидрофильные функциональные заместители, и использовать транспортные системы для доставки МГС непосредственно в патологический очаг. При использовании МГС, заключенных в транспортную систему, минимизируется их разрушение и инактивация, предотвращается возникновение побочных эффектов. Отсутствие систематических исследований о взаимодействии МГС с синтетическими и биополимерами не позволяет создать научные основы прогнозирования свойств получаемых комплексов. Особую актуальность представляют исследования, направленные на выявление структурно-геометрических параметров молекул МГС, обеспечивающих эффективное взаимодействие с эндогенными носителями без изменения их нативной конформации.

Целью работы является выявление основных закономерностей взаимодействия макрогетероциклических соединений фталоцианинового, порфиринового, порфиразинового ряда с потенциальными транспортными агентами: поли-N-винилпирролидоном, полиметахрилатом гуанидина и сывороточным альбумином. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

• методами ЭСП, ИК спектроскопии, вискозиметрии изучить процессы комплексообразования 5,10,15,20-тетрафенилпорфирина (ТФП), его гидроксо-замещенного производного 5,10,15,20-тетракис(4'-гидрокси-3',5'-ди-третбугилфенил)-21Н,23Н-порфирина (ТБГФП) с поли-М-винилпирролидоном (ПВП). Установить влияние гидроксогрупп в молекуле порфирина на состав и устойчивость комплексов с ПВП;

• для впервые синтезированных тетраантрахинонпорфиразинов (ТАП) определить состояние макрогетероциклических молекул в водных средах, тип димеризации, термодинамическую устойчивость образующихся димеров и фотофизические свойства (время жизни, квантовый выход триплетного состояния, фотоустойчивость) тетраантрахинонпорфиразинов в водных растворах в зависимости от природы заместителя, металла комплексообразователя, среды;

• методами ЭСП, ИК спктроскопии, вискозиметрии, ДСК изучить процессы комплексообразования металлопроизводных водорастворимых фталоцианинов и тетраантрахинонпорфиразинов с полимеггакрилатом гуанидина (ПМАГ) и бычьим сывороточным альбумином (БСА) в темновой фазе. Установить влияние природы заместителя, макрокольца МГС состав, устойчивость образующихся полимерных комплексов и конформационное состояние БСА;

• оценить влияние фотоактивации МГС на транспортные системы, варьируя интенсивность и продолжительность фотооблучения;

выдать практические рекомендации по применению того или иного транспортного агента для заданного фотосенсибилизатора.

Научная новизна. Впервые исследованы процессы комплексообразования ТБГФП с ПВП. Установлено, что введение ОН-групп в молекулу тетрафенилпорфирина способствует специфическому взаимодействию с ПВП,

з

приводящему к образованию устойчивых комплексов. Образования радикальных форм гидроксозамещенного порфирина под действием света не происходит, что обусловлено иммобилизацией порфириновых молекул на полимере, осуществляющейся за счет Н-связывания периферийных заместителей макрогетероцикла с С=0-группами полимера. Впервые исследовано состояние ТАП в водных растворах, установлен тип формирующихся димеров и ассоциатов. Проанализировано влияние электронных и стерических эффектов периферийных заместителей ТАП на термодинамическую устойчивость димеров. Впервые установлено, что расширение ароматической системы макрогетероцикла при переходе от фталоцианинов к ТАП приводит к уменьшению квантового выхода триплетного состояния, но к увеличению времени в возбужденном триплетном состоянии молекулы и большей устойчивости макроцикла к фотолизу. Впервые проведено комплексное исследование взаимодействия металлокомплексов ТАП с ПМАГ и БСА, установлен состав и устойчивость комплексов, выявлены конформационные изменения полимера, обусловленные комплексообразованием с МГС. Доказано расположение молекул ТАП в белковой глобуле.

Практическая значимость. Полученные данные о свойствах ТАП позволяют считать данные МГС перспективными и рекомендовать их для дальнейших исследований. Найденные закономерности взаимосвязи строения МГС и его локализации в белковой глобуле позволят целенаправленно модифицировать макрогетероциклическую молекулу для эффективного транспорта МГС эндогенным альбумином. Полученные сведения об увеличении терморезистентности альбумина в составе комплекса с ТАП до 120 °С могут представлять интерес для эбулио- и криобилогии и химической промышленности.

Личный вклад автора состоит в постановке задач исследования, получении и обработке большинства экспериментальных данных, анализе результатов исследования, написании в соавторстве научных публикаций, формулировке основных выводов и положений диссертации.

Апробация работы. Основные положения, результаты и выводы, содержащиеся в диссертации, докладывались на V Международной научной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации» (Иваново, 2008); Ш, IV, V Региональной конференции молодых ученых «Теорешческая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Иваново, 2008, 2009, 2010); VI Всероссийском семинаре по структурной макрокинепше (Черноголовка, 2008); XVII International Conference on Chemical Thermodynamics in Russia RCCT 2009 (Казань, 2009); V Международной научно-практической конференции «Новые полимерные композиционные материалы» (Нальчик, 2009); Межвузовской научно-практической конференции «Актуальные вопросы общей и специальной химии» (Иваново 2009); Конференции аспирантов, курсантов. (Иваново, 2010); П Молодежной школе «Физико-химические методы в химии координационных соединений» (Суздаль, 2011), XXV Международной Чугаевской конференции го координационной химии (Суздаль^ 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 11 тезисов докладов на конференциях различного уровня.

Структура работы: работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, основных итогов работы, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 206 страницах, содержит 65 рисунков и 23 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР включает полученные к настоящему времени сведения о структурных особенностях и фотофизических свойствах МГС,

4

физико-химических основах метода фотодинамической терапии

онкологических заболеваний, о комплексообразовании МГС с полимерами, физико-химических методах анализа полимерных комплексов МГС. На основании анализа литературных данных обоснованы цель и задачи исследования.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Приводятся методики очистки исследуемых веществ (рис. 1), и контроля их степени чистоты. Описаны методики подготовки образцов для вискозиметрического, спектрального, калориметрического и ДСК исследований.

rN N—

N' V N

a)

6)

CHj

H2 I

- -с—с-

COO"H2N*

II

C(NH2(2

д)

CHi

—CH-CH2-

v-

н0*снг

Oo

И)

e) ж) з)

Рис. 1. а) ТФП: R,=R2=H; ТБГФП: Ri=C4H9, R2=OH 6) ZnOuS: M=Zn; HOAW>uS: M=A10H; в) HOAlTATIPhS: M=A10H, R=PhS03Na; НОА1ТАПС: M=A10H, R=COONa; HOA1TAT1S: M=A10H, R=S03Na; CoTAIlPhS: M=Co, R=PhS03Na; СоТАПС: M=Co, R=COONa; CoTAnS: M=Co, R=S03Na; д) ПМАГ; e) МАГ; ж) ПВП; з) N-винилпирролидон; и) циклопентанон.

Вискозиметрические исследования проводились с помощью капиллярного вискозиметра типа ВПЖ-2. ДСК исследования проводились на калориметре DuPont 2100 Thermal Analyst, DSC 911 и DSC 204 F 1 Netzsch. ИК исследования были выполнены на спектрофотометре VERTEX 80v и на Avatar 360FTViRESP. Электронные спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Unico 2800. Спектры Т-Т поглощения МГС и кинетику дезактивации триплетного состояния измеряли на установке импульсного лазерного фотолиза2. Растворы МГС облучали импульсами неодимового лазера («Solar», длительность импульса 10 не, энергия до 70 мДж при 354 нм). Спектры флуоресценции регистрировали на спекгрофлуориметре СМ2203 «SOLAR». Использованы источники света: дуговая ртутно-кварцевая лампа ДКР-120, гелий-неоновый лазер AJ10K-2M (Х=633 нм, 15-20 мВт), облучатель «Иволга-ОМС-01» с монохроматором ЛМ-4. Подробно описаны методики проведения эксперимента, калибровки оборудования, математической обработки данных и расчета погрешности.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Взаимодействие порфиринов с иоли-Гч'-нвиншширролидоном. Для оценки характера взаимодействия порфиринов с ПВП использован метод электронной абсорбционной и ИК спектроскопии. ИК спектры исходных реагентов и образовавшегося полимерного комплекса позволяют сделать вывод об образовании водородной связи между С=0 группой полимера и прогоном ОН-групп ТБГФП. Состав комплекса был

1 Исследования проводились в ИФХ ПАН (г. Варшава) под руководством проф. В.Зеленкевича. Исследования проводились в Цешре Фотохимии РАН (г.Москва) под руководством чл.-корр. РАН А.К. Чибисова.

оценен исходя из гидродинамических свойств растворов ПВП и его комплекса с ТБГФП (табл. 1), он составил 1:6 и 1:5 по методу Фикенчера и использованием значения характеристической вязкости, соответственно. На 60 элементарных звеньев ПВП приходится одна молекула ТБГФП. Полученные данные позволяют сделать ряд выводов: во-первых, совпадение (в пределах 5%) средневязкостных молекулярных масс ПВП (74000 и 77066 г/моль), определенных разными методами, позволяет говорить о работоспособности указанных методов применительно к комплексам ПВП с порфиринами. Во-вторых, молекулярная масса ПВП, определенная из данных по вязкости, не равна истинному значению молекулярной массы полимера (40000 г/моль), что в основном связано с тем, что макромолекула при движении захватывает молекулы растворителя (этанол ¡ хлороформ 30:1 v/v), сольватирующие полимер. В-третьих, тот факт, что характеристическая вязкость растворов ПВП пропорциональна молекулярной массе в степени 0.68, позволяет говорить о том, что полимер в растворе имеет форму закрученного клубка (Сидельковская В. П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров. 1970).

Таблица 1. Гидродинамические характеристики растворов ПВП и его комплекса с ТБГФП в смешанном растворителе хлороформ : этанол = 1:30 v/v

с(ПВП) г/ЮОмл Лотн Пул ЛпрИВ Пуд/С к К Mv, определенная по методу Фикенчера, г/моль [nl Mv, определенная графически из [л] г/моль

0

0.0136 1.006 0.005 0.392 39.216 0.0414 41 78571 40 77066

0.0212 1.009 0.008 0.390 39.023 0.0413 41 77953

0.0400 1.015 0.015 0.376 37.555 0.0403 40 73883

0.0507 1.019 0.018 0.364 36.387 0.0396 40 70762

0.0716 1.026 0.025 0.355 35.520 0.0390 39 68318

0.0859 1.029 0.029 0.345 34.526 0.0383 38 65675

0.1065 1.035 0.035 0.330 32.995 0.0373 37 64692

0.1422 1.043 0.043 0.305 30.463 0.0355 36 62277

74000

с(компл) г/100мл

0 42 82290

0.0156 1.007 0.007 0.418 41.802 0.0429 43 85359

0.0282 1.012 0.012 0.417 41.732 0.0428 43 84953

0.0485 1.020 0.020 0.414 41.417 0.0426 43 83773

0.0587 1.024 0.024 0.413 41.288 0.0425 42 83262

0.0796 1.033 0.033 0.411 41.145 0.0423 42 82543

0.0959 1.039 0.039 0.404 40.374 0.0418 42 80300

0.1865 1.075 0.075 0.403 40.273 0.0414 41 78663

0.1922 1.075 0.075 0.389 38.851 0.0406 41 75068

80820

Состав и константа устойчивости комплекса ПВП с ТБГФП были оценены по уравнению Скэтчарда, и составили 1:6 и 4.18><104 М, соответственно. Результаты согласуются с данными, полученными из характеристической вязкости, и подтверждают тезис о схожести конформации полимера и его комплекса с ТБГФП. При изучении гидродинамических свойств растворов полимера, полимерного комплекса установлено, что при УФ облучении растворов ПВП их вязкость увеличивается, т.е. протекает дальнейшая полимеризация ПВП. В присутствии порфиринов этот

б

процесс полностью (ТФП) или частично компенсируется (ТБГФП) деструкцией полимера. Меньшая фотокаталитическая активность ТБГФП по сравнению с ТФП свидетельствует о том, что образования радикальных форм ТБГФП не происходит, а деструкция молекул ПВП осуществляется за счет генерации порфиринами '02. 3.2. Тетраантрахинонпорфиразины, фотофизические свойства, состояние в растворах. Переход от Фц к ТАП за счет аннелирования молекулы Фц фрагментами замещенного 1,4-нафтохинона, сопровождается батохромным сдвигом (^-полосы. В водных средах, ЭСП ТАП характеризуются максимумами поглощения в области 690 нм (НОА1ТАП) и 677 нм (СоТАП). Природа периферийных заместителей ТАП незначительно влияет на положение полос поглощения, что может быть следствием ослабления влияния заместителей по мере их удаления от порфиразинового хромофора Однако заместители ТАП влияют на характер спектра Анализ концентрационной зависимости оптической плотности растворов исследуемых ТАП, показал, что закон ЛББ не выполняется, что свидетельствует о наличии ассоциативных процессов. Ассоциация ТАП (Рис.2) приводит к уменьшению интенсивности, уширению и смещению в коротковолновую область О-полосы. Для определения типа ассоциатов ТАП было проведено спектральное исследование при варьировании свойств среды (увеличении концентрации электролита, изменении температуры, дегазировании растворов, насыщении кислородом, титровании электронодонорными лигандами). Установлено, что НОА1ТАП димеризуются по л-л-типу, для СоТАП характерно формирование ассоциатов за счет донорно-акцепторного взаимодействия одного из периферийных заместителей одной молекулы ТАП с мегаллокомплексообразователем другой молекулы ТАП.

1.0

0.8 < 0.6 0.4

Таблица 2. Термодинамические характеристики

500 550 600 650 700 750 800 850 нм MI

Рис. 2. ЭСП HOAlTAnS (а) и СоТАПС (б) в растворе при добавлении NaCl (0.05-0.35 М).

Термодинамические характеристики диссоциации димеров НОА1ТАП в водных средах определены методом калориметрии разведения (табл.2). Большая устойчивость димеров (НОА1ТАПС)2 по сравнению с (НОА1ТАГО)2, связана не

только с большим сродством к протону карбоксильной группы по сравнению с сульфогруппой, но и с тем, что сульфо-заместители, имеющие приблизительно в 1.4 раза больший ван-дер-ваальсовый радиус, чем карбоксильные заместители, препятствуют я-л-

взаимодействию между

ТАП КдиСС, л/моль ДН, кДж/моль AS, Дж/(мольК)

HOAlTAnPhS в мономерном состоянии

HOAlTAnS 9.78x10° 0.11 -76

НОА1ТАПС 8.67x10"' 11.89 -76

♦Погрешность составляет 8% для К, 5% для АН и 13% для AS.

двумя ароматическими

Рис. 3. ЭСП НОА1ТАПС в растворе при добавлении Ру (0*0.09 М).

системами молекул ТАП в димерной структуре.

Существование НОА1ТАПРЬ8 при данных условиях преимущественно в мономерной форме также подчеркивает значимость сгерического фактора при копланарном взаимодействии молекул. л-л-Димеры координационно ненасыщенных МТС диссоциируют при взаимодействии с пиридином (Рис. 3). Титрование НОА1ТАП пиридином изобестическое и свидетельствует о смещении ассоциативного равновесия в сторону мономеризации. Комплексообразование ТАП с пиридином приводит к уменьшению устойчивости димеров (табл. 3).

Таблица 3. Термодинамические характеристики процессов ((ТАП)2«-»2ТАП;

ТАП К, л/моль ДН,, кДж/ моль ДБ,, Дж/ (моль-К) к2 л/моль Д#2, кДж/ моль Дж/ (моль-К)

НОА1ТАП8 3.56-10"4 58.49 130 130 -29.54 -59

НОА1ТАПС 2.25Т0*5 69.91 145 105 -30.19 -63

Термодинамические характеристики комплексообразования НОА1ТАП с пиридином индифферентны к природе периферийного замещения в молекуле МГС, что обусловлено пространственной удаленностью заместителя от реакционного центра. Полученные термодинамические характеристики процессов (НОА1ТАП)2 2НОА1ТАП и НОА1ТАП+ Ру -о- НОАГГАПРу позволили на каждом этапе титрования рассчитать равновесные концентрации димерных струюур в растворе и вычислить количество пиридина, которое необходимо добавить в раствор для смещения равновесия в сторону мономеризации ТАП. Полученная зависимость случае НОАГГАПЭ близка к экспоненциальной. Добавление свыше 150-кратного мольного избытка пиридина в раствор не существенно отразится на процентном содержании димеров ТАП, что важно т.к. ТАП не растворяется в пиридине и слишком большой избыток его в растворе нежелателен. Вид зависимости процентного содержания (НОА1ТАПС)2 от мольного соотношения Ру/ГАП свидетельствует, что пиридин не является эффективным комплексообразующим реагентом для НОА1ТАПС. В случае НОАГГАГО в качестве транспортного агента может быть рекомендована система, содержащая пиридиновый атом азота. Для карбоксипроизводных ТАП введение в состав транспортной системы ароматического амина нецелесообразно.

Кроме состояния МГС в растворах важной характеристикой МГС является их устойчивость к фотолизу. При облучении УФ светом в течение 30 минут интенсивность поглощения в ЭСП ТАП не изменялась, в то время как по данным (Огоетепа К., 1 РЪыосЬет. РИоюЫо!. А: СИет. 2001) фотолиз водорастворимых Фц в аналогичных условиях протекал от 15 до 80% в зависимости от количества сульфо-групп Фц. На рис. 4 в качестве примера приведен разностный спектр Т-Т поглощения НОА1ТАП8, измеренный к различным моментам времени после лазерного импульса, а также кинетические кривые дезактивации молекул МГС в триплетном состоянии (рис.5).

8

1) -0 02-

300

400

700

800

Сравнение кинетических

кривых затухания триплет-триплегного поглощения

демонстрирует, что ТАП обладают меньшим квантовым выходом возбужденного триплегного

состояния по сравнению с НОА1Фц8 но время жизни возбужденного триплегного состояния в случае ТАП значительно больше, чем

аналогичная характеристика Фц. В отличие от НОА1ТАП, СоТАП не проявляет изменений в поглощении под действием лазерного импульса, что согласуется с теоретическими представлениями об электронном строении металла комплексообразователя. Электронная конфигурация Со2+ (3с!7), в отличие от А13+ (гр6), имеющего устойчивое энергетическое состояние, не устойчива, что не исключает другие пути диссипации поглощенной световой энергии. Учитывая данные сведения, а так же высокую склонность к ассоциации и тип ассоциатов нецелесообразно рассматривать СоТАП в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для ФДТ.

0.8

500 600 Х.НМ

Рис 4. Разностный спектр поглощения НОА1ТАШ в воде, измеренный через 10 (1), 100 (2), 500 (3) и 2000 мкс (4) после возбуждения лазеоным импульсом 354 нм.

0.02

0.01

0.00

а)

0.6

■0.4

0.2

0.0

б)

0.0

0.5 Саз у, I Л

1.0

0.00

0.02 аба! у, I с

0.04

Рис 5. Кинетика затухания триплет-триплетного поглощения в обескислороженном водном растворе, X = 354 нм: а) НОАГГАГО, б) НОА1Фц8.

3.3. Взаимодействие полиметакрилата гуанидина с тетрасульфофталоцианином цинка и тетрантрахинонпорфиразинами в водной среде. Для водных растворов ПМАГ характерен эффект полиэлектролитного набухания. Установлено, что стабилизация конформации полимера во времени (160 часов) достигается в интервале концентраций хлорида натрия 0.05-0.08 М. В связи с тем, что увеличение концентрации ИаС1 вызывает ассоциацию МТС (Рис.2), поэтому все дальнейшие исследования были выполнены в воде на фоне №С1 с концентрацией 0.05 М, т.е. на минимальной границе указного выше диапазона Использование фонового электролита для изучения растворов МТС необходимо и направлено на подавление солевого эффекта, так как при высоких суммарных концентрациях ионов изменение коэффициентов активности с концентрацией происходит менее резко. Таким образом, добавление большого, избытка соли способствует постоянству коэффициентов активности.

Неожиданным оказалось уменьшение вязкости (от 0.5 до 2.6%) растворов ПМАГ при добавлении МГС ^пФцБ, НОАГГАПРЬБ, НОА1ТАПС, НОАГГАШ). В данном случае конформационные изменения, обусловленные комплексообразованием МГС с

полимером, оказывают на гидродинамические характеристики

растворов ПМАГ большее влияние, чем увеличение молекулярной массы. Уменьшение вязкости растворов ПМАГ при комплексообразовании с МТС свидетельствует о локализации МГС на поверхности полимерного клубка. Поэтому корректно определить состав полимерного комплекса из данных по вязкости не возможно. Метод Скэтчарда не приемлем, так как растворы ПМАГ являются не истинными и при высоких концентрациях полимера проявляется эффект Тиндаля. Для уточнения центров взаимодействия, ответственных за комплексообразование ПМАГ с МГС (Zn<l>uS, HOAlTATIPhS, НОА1ТАПС, HOAITAJTS), был проведен ПК спектральный анализ ПМАГ, МГС и комплекса МГС - ПМАГ. Для корректного отнесения сигналов были проведены ab initio расчеты ИК спектра МАГ - мономера ПМАГ, теоретические расчеты были выполнены методом DFT/LSDA, базис 3-2 lg с использованием программы GAUSSIAN 03. Проведенные расчеты " показали хорошее соответствие экспериментальных и рассчитанных спектров МАГ. В работе (Хаширова С. Ю. Дис. д. хим. наук 2009.) показано, что основное отличие в ИК спектрах МАГ и ПМАГ заключается в поглощении в области 938 и 1008 см"1, характеризующей неплоские деформационные Н2С=С-колебания, остальные полосы, активные в ИК спектрах МАГ, присутствуют и в ИК спектрах ПМАГ, данные сведения позволили провести аналогию в отнесении полос МАГ и ПМАГ. Сравнительный анализ ИК спектров кристаллических образцов индивидуальных ПМАГ, МГС и комплекса МГС - ПМАГ показал, что в комплексе МГС - ПМАГ сохраняется большинство полос, присущих полимеру и соответствующему МГС. Наряду с этим зафиксированы следующие спектральные изменения: 1) интенсивность полоса в области 2210 см"1 в спектре ПМАГ, характеризующей асимметричные валентные колебания NH2 гуанидинового фрагмента, в спектре комплекса ПМАГ-МГС (Zn<t>nS, HOAlTATIPhS, НОА1ТАПС, НОА1ТАШ) значительно уменьшается; 2) очень интенсивная и узкая полоса в области 1400 см"1 в спектре МГС (Zn<t>nS, HOAlTATIPhS, НО АПАШ), характеристичная для колебаний 0=S в S03, исчезает в спектре комплекса ПМАГ-МГС. В случае комплексообразования ПМАГ с НОА1ТАПС регистрируется смещение на 40 см"1 в высокочастотную область полосы, локализованной в случае индивидуального НОА1ТАПС в области 1664 см"1 и характеризующей валентные колебания атомов С и О СОО-группы. Перечисленные спектральные изменения позволяют заключить, что иммобилизация изученных МГС на ПМАГ осуществляется за счет взаимодействия сульфогрупп (Zn<J>HS, HOAlTAnPhS, HOAITAnS) или карбоксильных групп НОА1ТАПС с гуанидиновым фрагментом полимера.

Облучение растворов полимерных комплексов ПМАГ-МГС приводит к деструкции полимера, что подтверждалось ИК спектральным анализом по увеличению интенсивности полос в области 1008 и 940 см"1. Следовательно, ПМАГ не целесообразно рассматривать в качестве транспортной системы для МГС, т.к. невозможно достигнуть требуемой селективности фотоокисления, кроме того продукты фотоокисления транспортной системы могут оказывать биоцидное действие.

3.4. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с тетрасульфофталоцианином алюминия и тетраантрахинонпорфиразинами в водных средах. Использование в качестве транспортной системы эндогенных белков имеет ряд несомненных преимуществ, среди которых в первую очередь биосовместимость, нетоксичность. БСА, являясь полиэлектролитом также чувствителен к катион-анионному окружению и демонстрирует эффект полиэлектролитного набухания. С учетом результатов изменения кинематической вязкости растворов, содержащих 0.08 масс.% альбумина от концентрации фонового электролита по истечении 160 часов установлено, что концентрация хлорида натрия 0.05М является оптимальной для изучения БСА - МГС систем. .

10

Комплексообразование МГС с БСА вызывает изменения в электронных спектрах поглощения МГС аналогичные зарегистрированным ранее при титровании пиридином (рис.3). При титровании водных растворов ТАП альбумином димеры распадаются т.к. на спектрах уменьшается интенсивность поглощения в области 650нм и увеличивается в области 690нм. Кроме того, (¿-полоса мономера ТАП претерпевает батохромное смещение на 3-5 нм в зависимости от исследуемого ТАП. Смещение равновесия Д-М в сторону мономеризации может быть связано с комплексообразованием белковых макромолекул с мономерным ТАП. Следовательно, равновесие: (НОА1ТАП)2 -о- 2 НОА1ТАП (1) будет смещаться вправо в соответствии с принципом Ле-Шателье, так как продукт будет связываться в молекулярный комплекс в соответствии с уравнением: пНОА1ТАП+ БСАо БСА-(НОА1ТАП)„ (2). С другой стороны, состояние равновесия (1) существенно зависит от содержания №С1 в растворе. Уменьшение концентрации №С1 приводит к смещению агрегационного

равновесия в сторону мономеризации (рис.2). Возможно, что белок взаимодействуя с фоновым электролитом, способствует мономеризации ТАП по указанному механизму. Дня уточнения характера межмолекулярного

взаимодействия альбумина с ТАП было проведен анализ спектров флуоресценции БСА в водных с растворах (0.05 №С1) при добавлении ТАП. Спектр флуоресценции раствора БСА при возбуждении светом 295 нм представлен на рис. 6 линия 1. Максимум флуоресценции приходится на 340нм, что является типичным для белка в нативной конформации и обусловлено

1 - БСА

2 - БСА-НОАНАПЭ

3 - БСА-НОАГГАПС

4 - BCA-HOAITAnPhS

5 - BCA-HOAlePuS

450

Х,нм

Рис. 6. Флуоресцентные спектры БСА и комплексов БСА с МГС (U lO^M).

возбуждением триптофановых остатков аминокислот (О. Barreca. Biophys. Chem. 2010). Титрование растворов БСА МГС приводит к уменьшению относительной флуоресценции. Титрование растворов альбумина HOA№nS при достижении концентрации 1.2* 10"4 M приводит к полному тушению флуоресценции белка. По данным (В. Valeur, Molecular Fluorescence. Principles and Applications 2002; A. Sulkowska Journal of Molecular Structure, 2007) тушение флуоресценции БСА может быть обусловлено либо конформационными изменениями белка, либо связано с переносом энергии с флуорофоров альбумина на ТАП. При этом комплексообразователь-тушитель должен быть расположен не далее 10 нм от флуорофора. Триптофановые остатки занимают 135 и 214 положение в полипептидной цепи и локализованы в субдоменах IB и II А (Рис.7), следовательно, МГС должны располагаться в указанных субдоменах или в непосредственной близости от них. Результаты титрования по Скэтчарду (табл.4), полученные для системы, содержащий НОА1Фц хорошо согласуются с данными (David Phillips. Pure &Appl. Chem., 1995), согласно которым константа диссоциации полимерного комплекса HOA№nS- БСА составляет 1

Рис.7 БСА (Yunnan Dissertation. The Ohio University, 2004).

Fang. State

Таблица 4. Физико-химические параметры комплексов БСА-МГС

МГС Кдисс, Л/МОЛЬ п К1

НОА1Фц8 1.02x10"' 2 0.979

НОА1ТАШО 1.05x10"' 1 0.978

НОА1ТАПРЬ5 5.57x10° 4 0.993

НОА1ТАПС 9.23x10"8 2 0.857

♦Погрешность Кд,,* составляет 2%

Наибольшую устойчивость

демонстрирует комплекс БСА с НОА1ТАПС, что, безусловно связано с большим сродством к протону карбоксильной группы по сравнению с сульфозаместителями ТАП. ТАП имеют несколько реакционных центров способных отвечать за связывание МГС с белками. Для определения реакционных центров была использована ИК спектроскопия. Образование комплекса БСА -НОА1ТАПС приводит к уменьшению интенсивности полосы в области 835 см'1 (валентные колебания С-Н ароматических углеводородов) и смещению её положения на 10 см"1 в высокочастотную область. Колебательная мода в области 700 см"1, обусловленная колебаниями С-Н ароматических фрагментов, уменьшается в ИК спектрах комплексов ТАП с БСА. Поглощение в области 1492 см"1 связанное с симметричными валентными колебаниями С=0 в СОСЖа-группе при комплексообразовании НОА1ТАПС с БСА исчезает. В ИК спектре индивидуального НОА1ТАПС данная полоса средней интенсивности. Положение сильных полос, связанных с колебаниями этой же группы атомов, например, валентных асимметричных колебаний С=0, локализованных в области 1580-1680 см"1, при комплексообразовании ТАП с белком анализировать проблематично, что связано с интенсивным поглощением белка в данном спектральном диапазоне. Валентным колебаниям С-0 в ИК спектрах ТАП, соответствуют полосы поглощения в области 1005-980 см"1, которые в ИК спектрах полимерного комплекса отсутствуют. Слабая полоса в области 1856 см"1, отвечающая колебаниям С=0 в антрахиноновых фрагментах ТАП в комплексе исчезает.

ИК спектральные проявления комплексообразования сульфозамещенных ТАП с БСА также достаточно информативны. Полоса в ИК спектрах сульфопроизводных ТАП в области 1135 (средняя) обусловленная асимметричными валентными колебаниями в группе БО/ при комплексообразовании с белком практически исчезает. Очень интенсивная полоса в области 1366 см"1 (НОА1ТАГ18), 1374 см"1 (НОА1ТАПРЬ8), характеристичная для симметричных деформационных колебаний 8=0 в БОз - заместителе, в спектрах полимерных комплексов также отсутствует. Наряду с этим полностью исчезает при комплексообразовании ТАП с белком чрезвычайно интенсивная полоса в ИК спектрах ТАП при 700 см"1 . Для комплексов БСА с НОА1ТАГО - уменьшается интенсивность поглощения в области 832см'1, а в случае комплексов НОАГГАПРЬБ с БСА указанная полоса исчезает. При связывании ТАП с альбумином значительно уменьшается интенсивность колебательных мод при 1852см"1 (у С=0, антрахиноновых фрагментов НОА1ТАШ) 1899 см"1 (уС=0, антрахиноновых фрагментов НОА1ТАПРЬ8). Схожие ИК спектральные изменения регистрируются при комплексообразовании НОА1Фц8 с БСА, а именно исчезают полосы поглощения в области 690 и 899 см"1 наряду со значительным уменьшением интенсивности полосы при 1400см"1. Таким образом комплексообразование ТАП с БСА является многоцентровым, с участием периферийных карбоксильных заместителей ТАП, атомов кислорода антрахиноновых фрагментов и ароматической 7с-системы макрогетероцикла. Иммобилизация НОА1Фц8 на БСА преимущественно осуществляется за счет периферийных сульфо-заместителей.

Один из ключевых вопросов при оценке применимости эндогенной транспортной системы - конформационное состояние при комплексообразовании,

которое традиционно оценивают в случае БСА по анализу положения полос в I-III амидных областях. При анализе конформационных изменений белка, вызванных комплексообразованием с МГС, были проанализированы I и III амидные области (Рис.8), II амидная область исключена из рассмотрения т.к. исследуемые МГС имеют много интенсивных колебательных полос в данном диапазоне. Исходный спектр БСА, полученный в данной работе, типичен для белка в нативной конформации (D. Barreca. Biophys. Chem. 2010), в I амидной области регистрируется один интенсивный широкий пик с максимумом в области 1653 см"1, в III амидной области регистрируются три пика в области 1242, 1262, 1304 см'.

волновое число (см1) волновое число (см1)

Рис 8. ИК спектры I и III амидных областей альбумина (слева - I, справа - 1П). Сверху вниз: БСА, БСА - HOAlTAnS, ECA-HOAlTAIIPhS, БСА - НОА1ТАПС, БСА с HOAktiß.

Комплексообразование БСА с ТАП приводит к конформационным изменениям во вторичной белковой структуре, что отражается в уширении полосы поглощения в I амидной области, появлению пика в области 1620 см"1, что по сведениям (М. Jackson, H.H. Manisch. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. ¡995; E.A. Cooper et. AI. Pharm. Biotechnol. 1995) вызвано формированием ß-складчатости. Кроме того, наряду с интенсивным поглощением в области 1652 см"1 регистрируется интенсивное поглощение при 1632 см"1, которое обусловлено появлением коротких сегментов цепи, содержащих а-спирали (£>. Barreca. Biophys. Chem. 2010). В III амидной области регистрируется смещение максимума поглощения в высокочастотную область, связанное с а-структурированием белка, увеличение интенсивности поглощения, связанное с ß-структурой и практически полное исчезновение полос, связанных с разупорядоченными участками белковой молекулы. Выявленные спектральные изменения позволяют говорить о промотировании комплексообразованием ТАП с белком локальных конформационных переходов из разупорядоченной в ß-структуру (У. Liu, et.al Spectrochim. Acta, Part A. 2003). Иные спектральные изменения вызывает комплексообразование HOAlí>nS с БСА (в I амидной области наряду с интенсивным поглощением в области 1630 см"1, новый пик при 1620 см"1 не появляется), указанные данные совместно с изложенными выше литературными сведениями позволяет говорить о том, что взаимодействие IíOA№nS с БСА вызывает конформационное

Таблица 5. Термическая денатурация БСА, его комплексов с МГС

изменение: а-спирали —>■ коротко сегментные а-складки.

Другой важной характеристикой, позволяющей получить сведения об особенностях взаимодействия ТАП с белком, является устойчивость БСА к температурному воздействию. На кривой ДСК БСА в температурном интервале до 100 °С регистрируется эндо-эффект с Тшах = 56°С, связанный с термической денатурацией альбумина, что подтверждалось ИК спектральным анализом исходных и прогретых до температуры 56°С образцов. В прогретых образцах зафиксировано значительное уменьшение интенсивности поглощения в области 476 и 525 см"1 (валентные колебания S-S), что позволяют говорить об изменении третичной и вторичной структуры альбумина. Полученные сведения совпадают с литературными данными (Shun-Li Wang el.al, Biophys. Chem. 2005), свидетельствующими, что разрушение дисульфидных мостиков, стабилизирующих структуру альбумина, лежит в основе пускового механизма денатурации альбуминов. Следует отметить, что Ттах эффекта тепловой денатурации белка существенно зависит от различных факторов, в том числе от наличия электролитов и комплексообразования с МГС (табл.5). Так, на кривой ДСК образца, полученного выпариванием из раствора БСА с фоновым

электролитом (0.05M), эндо-эффект, связанный с термической денатурацией альбумина, регистрируется с Tmají = 69°С. Комплексообразование БСА с ТАП существенно увеличивает резистентность белка к денатурации, в то время как фталоцианин не оказывает заметного влияния (табл.5). Учитывая результаты исследования методом флуоресцентной спектроскопии, очевидно, что HOAIÍ>uS находится в непосредственной близости к триптофановым аминокислотным остаткам белковой цепи и локализованы внутри субдоменов IB и II А. Молекулы ТАП расположены дальше от тригггофановых остатков и их расположение позволяет дополнительно стабилизировать белковую молекулу, наиболее вероятна локализация ТАП между субдоменами IB - IIIB и IA- IIIA, чему способствует больший размер молекулы TAIT по сравнению с фталоцианином и наличие нескольких центров связывания макрогетероцикла с белковой глобулой.

Оценка гидродинамических свойств растворов БСА с МГС в условиях фотоактивации МГС в спектральном диапазоне от ближнего УФ до 850 нм показала, что БСА в условиях эксперимента фотолизу не подвергается. Таким образом, учитывая устойчивость и состав комплексов ТАП с БСА, сохранение нативной конформации белка в составе комплекса, а так же фотостабильность белка при фотоактивации МГС, можно заключить, что альбумин может быть использован как транспортный белок для ТАП и система ТАП-БСА может быть рекомендована для дальнейших исследований

Вещество т °c ■пах)

БСА 56

ECA+NaCl 69

BCA+NaCI+HOAl®uS 68

ECA+NaCl+HOAlTAnC 120

BCA+NaCl+HOAlTAnPhS 128

БСА+NaCl+HO AIT AUS 129

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Впервые проведено систематическое экспериментальное исследование взаимодействия новых фотосенсибилизаторов порфиринового, порфиразинового ряда с синтетическими и биополимерами. Установлено, что:

1. Поли-Ы-вини л пиррол идон может быть использован в качестве транспортной системы для 5,10,15,20-тетракис(4'-гидрокси-3',5'-ди-третбутилфенил)-21 Н,23Н-

14

порфирина, т.к. образуется устойчивый полимерный комплекс за счет образования водородных связей между С=0 группой полимера и протоном гидроксильных групп порфирина, на 60 элементарных звеньев ПВП приходится одна молекула порфирина, при этом конформация полимера существенных изменений не претерпевает, а при световом облучении транспортная система не подвергается деструкции.

2. Склонность к димеризации НОА1ТАП увеличивается в ряду: HOAlTAITPhS < HOAlTAnS < НОА1ТАПС. Большая термодинамическая устойчивость димеров (НОАПГАПСЬ по сравнению с (HOAlTAnS)2. обусловлена не только большим сродством к протону карбоксильной группы по сравнению с сульфо-заместителем, но и стерическими препятствиями, оказываемыми более объемными заместителями.

3. НОА1ТАП по сравнению с HOA№uS значительно устойчивее к фотолизу, обладают меньшим квантовым выходом возбужденного тринлетного состояния, но большим временим жизни возбужденного триплетного состояния.

4. Иммобилизация изученных МГС на ПМАГ осуществляется за счет взаимодействия сульфогрупп (ZnOuS, HOAlTAÜPhS, HOA1TATIS) или карбоксильных групп НОА1ТАПС с гуанидиновым фрагментом полимера ПМАГ. Уменьшение кинематической вязкости растворов комплексов ПМАГ с МГС по сравнению с растворами ПМАГ свидетельствует о том, что иммобилизация МГС осуществляется на поверхности полимера, что приводит к растягиванию полимерного клубка и стабилизации его конформации.

5. УФ облучение и облучение светом дальневолновой части спектра приводит к деструкции ПМАГ, в присутствии МГС деструкция полимера протекает в 2-4 раза эффективнее, в зависимости от МГС, поэтому ПМАГ не целесообразно использовать в качестве транспортного агента.

6. Комплексообразование МГС с БСА является многоцентровым, с участием периферийных заместителей и л-системы МГС, атомов кислорода антрахиноновых фрагментов (в случае ТАП) и приводит к локальным информационным изменениям во вторичной белковой структуре. При этом ТАП локализованы между противолежащими субдоменами LA - 1IIA и IIIB - IB, обеспечивая их «сшивку» и повышенную терморезистрентность белка.

7. БСА является оптимальной транспортной системой для ТАП, т.к. обеспечивает их эффективное связывание (Ку=105-М07), сохраняя при этом нативную структуру и демонстрируя фотостабильность, оставляя вакантными основные сайты связывания и может быть рекомендован для дальнейших исследований.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. N. Lebedeva, Т. Popova, М. Kozbial, М. Wszelaka-Rylik, Yu. Gubarev, P. Gieiycz. Influence of complex formation with tetraantraquinoporphyrazines and tetrasulphophthalocyanine on thermal stability of bovine serum albumin. // Journal of Porphyrines and Phthalocyanines. V. 15.2011. p. 223-229

2. Popova Т., Lebedeva N., Semeykin A. Interaction between poly-N-vinylpirrolidone, 5,10,15,20-tetraphenylporphyrine and 5,10,15,20-tetra(4'-hydroxy-3',5'-di-tret-butiphenyl)-21H, 23H-porphyrine. // Journal of Solution Chemistry. V. 39.2010. p. 1113-1121.

3. Павлычева H.A., Попова Т.Е., Лебедева Н.Ш., Хаширова С.Ю., Вьюгин А. И. Межмолекулярное взаимодействие полимегакрилата гуанидина с натриевой солью цинк(11)теггра-4-сульфофталоцианина в водной среде. // ЖСХ. 2009. т. 50. № 5. стр. 975-980.

4. Попова Т.Е., Павлычева Н.А., Лебедева Н.Ш., Хаширова С.Ю. Получение композита на основе полиметакрилата гуанидина и натриевой соли цинкового комплекса тетразамещенного фталоцианина. // В тезисах докладов V Международной научной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация для нанотехнологий, техники и медицины». Иваново 23-26 сентября 2008 г., с. 186.

5. Попова Т. Е. Исследование взаимодействия полиметакрилата гуанидина с натриевой солью цинк(Н)тетра-4-сульфофталоцианина в водной среде. // В тезисах докладов III Региональной конференции молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем». Иваново 18-21 ноября 2008 г., с.54.

6. Попова Т.Е., Лебедева Н.Ш., Семейкин А. С. Устойчивость тетрафенилпорфиринов к термоокислению. // В тезисах докладов VI Всероссийской школы-семинара по структурной макрокинетике для молодых ученых. Черноголовка 26-28 ноября 2008 г сс. 96-98.

7. Popova Т., Lebedeva N., Semeykin A. Thermodynamic stability poly-N-vinylpyirolidone and 5,10,15,20-tetra(4'-hydroxy-3 ',5'-di-tret-butilphenyl)-21H, 23H-porphyrine complex. // Abstracts of XVII International Conference on Chemical Thermodynamics in Russia RCCT. Казань 29 июня - 3 июля 2009 г., с. 487.

8. Попова Т.Е., Лебедева Н.Ш., Семейкин А. С. Получение композита на основе поли-N-винилпирролидона и 5,10,15,20-тегтракис(4'-гидрокси-3',5'-ди-тре1бутил-фенил)-21Н,23Н-порфирина // В материалах V Международной научно-практической конференции «Новые полимерные композиционные материалы». Нальчик 10-14 сентября 2009 г., сс. 157-159.

9. Попова Т. Е. Полимерные комплексы поли-№винилпирролидона с порфиринами. // В тезисах докладов IV Региональной конференции молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем». Иваново 17-20 ноября 2009 г., с. 42.

Ю.Попова Т. Е. Разработка полимерных препаратов для фотодинамической таргетной терапии. // В материалах Межвузовской научно-практической конференции «Актуальные вопросы общей и специальной химии». Иваново 21-23 декабря 2009 г с. 49.

П.Попова Т. Е. Состояние тетрашгграхинонпорфиразинов в водных растворах. // В материалах Межвузовской конференции аспирантов, курсантов и слушателей. Иваново 7-10 июня 2010 г., с. 50.

12. Попова Т. Е., Губарев Ю. А. Исследование димеризации тетра-антрахинонпорфиразинов в водных растворах. // В тезисах докладов V Региональной конференции молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем». Иваново 16-19 ноября 2010 г., сс. 38-39.

13. Попова Т. Е., Захарова Г. В., Губарев Ю. А., Лебедева Н. Ш. Влияние расширения ароматической системы при переходе от фталоцианинов к тетраашрахинонпорфиразинам на физико-химические свойства макрогетероциклических соединений. // В тезисах докладов И Молодежной конференции-школы «Физико-химические методы в химии координационных соединений». Суздаль 6-11 июня 2011 г., с. 266.

И.Лебедева Н. Ш., Попова Т. Е. Особенности взаимодействия алюминиевых комплексов макрогетероциклических соединений с альбумином // В тезисах докладов XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии. Суздаль 6-11 июня 2011. Тез. конф. с. 437.

Автор выражает благодарность своим научным руководителям д.х.н. Лебедевой Н.Ш.

и кх.н. Губареву Ю.А., а также чл.-корр. РАН Чибисову А.К. за помощь при

обсуждении результатов.

Подписано в печать 04.11.2011. Формат 60x84 1/16. Бумага писчая. Усл.печ.л. 0,93. Уч.-изд.л. 1,03. Тираж 80 экз. Заказ 2694

ФГБОУ ВПО Ивановский государственный химико-технологический университет

Отпечатано на полиграфическом оборудовании кафедры экономики и финансов ФГБОУ ВПО «ИГХТУ» 153000, г. Иваново, пр. Ф. Энгельса, 7

Учреждение Российской Академии Наук Институт Химии Растворов им. Г.А. Крестова РАН

На правах рукописи

04201252424

Попова Татьяна Бвгеньевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПОРФИНА И ПОРФИРАЗИНА С ПОТЕНЦИАЛЬНЫМИ ТРАНСПОРТНЫМИ АГЕНТАМИ

02.00.04 - физическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н., доц. Лебедева Н.Ш.

Иваново 2011

t

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ " 4

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7

1.1. Химическое строение тетрапиррольных макрогетероциклических соединений 7

1.2. Фотохимические и фотофизические свойства тетрапиррольных макрогетероциклических соединений 10

1.2.1. Электронные спектры поглощения 10

1.2.2. Спектры флуоресценции 14г 1.2.3 Квантовый выход и время жизни возбужденного состояния молекул 16

1.2.4. Фотолиз 22

1.2.5. Квантовый выход синглетного кислорода 24

1.3. Физикохимические основы метода фотодинамической терапии онкологических заболеваний 29

1.4. Комплексообразование макрогетероциклических соединений с синтетическими и биополимерами 36

1.5. Транспортные системы для макрогетероциклических соединений 38

1.5.1. Синтетические водорастворимые полимеры 38

1.5.2. Белки 42

1.6. Физико-химические методы анализа полимерных комплексов макрогетероциклических соединений 50

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 88

2.1. Объекты исследования 88

2.2. Подготовка образцов для исследования 90

2.3. Методы исследования 91

2.3.1. Вискозиметрический метод 91

2.3.2. Денсиметрия 95

2.3.3. Калориметрический метод 95

2.3.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия 104

2.3.5. Турбидимстрнческий анализ 105

2.3.6. Вычисление параметров комплексообразования полимеров

с макрогетероциклическими соединениями но методу Скэтчарда 106

2.3.6. ИК, электронная и флуоресцентная спектроскопия 107

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ . 109

3.1. Взаимодействие норфиринов с поли-ГЧ-виншширролидоном 110

3.2. Тетраантрахинонпорфиразины, фотофизические свойства, состояние в растворах 121

3.3. Взаимодействие полиметакрилата гуанидина с

тетрасульфофталоцианином цинка и тетрантрахинонпорфиразинамн в

водной среде 136

3.4. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с

тетрасульфофталоцианином алюминия и тетраантрахинонпорфиразинами в водных средах 146

ОСНОВНЫЕ ИТОГИ РАБОТЫ 159

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 161

ПРИЛОЖЕНИЕ 186

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной химии является синтез и исследование свойств ароматических макрогетероциклических соединений (МГС) — потенциальных лекарственных препаратов для фотодинамической терапии. Подавляющее большинство фотосенсибилизаторов (первого поколения - порфирины, второго поколения - фталоцианины и хлорины) и разрабатываемые в настоящее время препараты третьего поколения — являются гидрофобными молекулами, имеющими низкую растворимость в водных средах. Липофильные МГС являются менее токсичными и более эффективными по сравнению с водорастворимыми. По этой причине целесообразно проводить синтез МГС, содержащих наряду с гидрофобными гидрофильные функциональные заместители, и использовать транспортные системы для доставки МГС непосредственно в патологический очаг. При использовании МГС, заключенных в транспортную систему, минимизируется их разрушение и инактивация, предотвращается возникновение побочных эффектов. Отсутствие систематических исследований о взаимодействии МГС с синтетическими и биополимерами не позволяет создать научные основы прогнозирования свойств получаемых комплексов. Особую актуальность представляют исследования, направленные на выявление структурно-геометрических параметров молекул МГС, обеспечивающих эффективное взаимодействие с эндогенными носителями без изменения их нативной конформации.

Целью работы является выявление основных закономерностей взаимодействия макрогетероциклических соединений фталоцианинового, порфиринового, порфиразинового ряда с потенциальными транспортными агентами: поли-Ы-винилпирролидоном, полиметакрилатом гуанидина и сывороточным альбумином. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• методами ЭСП, ИК спектроскопии, вискозиметрии изучить процессы комплексообразования 5,10,15,20-тетрафенилпорфирина (ТФП), его гидроксозамещенного производного 5,1 ОД 5,20-тетракис(4'-гидрокси-3',5'-ди-третбутилфенил)-21Н,23Н-порфирина (ТБГФП) с поли-Ы-винилпирролидоном (ПВП). Установить влияние гидроксогрупп в молекуле порфирина на состав и устойчивость комплексов с поли-Ы-винилпирролидоном;

• для впервые синтезированных тетраантрахинонпорфиразинов (ТАЛ) ' определить состояние макрогетероциклических молекул в водных

средах, тип димеризации, термодинамическую устойчивость образующихся димеров и фотофизические свойства (время жизни, квантовый выход триплетного состояния, фотоустойчивость) тетраантрахинонпорфиразинов в водных растворах в зависимости от природы заместителя, металла комплексообразователя, среды;

• методами ЭСП, ИК спктроскопии, вискозиметрии, ДСК изучить процессы комплексообразования металлопроизводных водорастворимых фталоцианинов и тетраантрахинонпорфиразинов с полиметакрилатом гуанидина (ПМАГ) и бычьим сывороточным альбумином (БСА) в темновой' фазе. Установить влияние природы заместителя, макрокольца МГС на состав, устойчивость образующихся полимерных комплексов и конформационное, состояние БСА;

• оценить влияние фотоактивации МГС на транспортные системы, варьируя интенсивность и продолжительность фотооблучения;

• выдать практические рекомендации по применению того или иного транспортного агента для заданного фотосенсибилизатора.

Научная новизна. Впервые исследованы процессы комплексообразования ТБГФП с ПВП. Установлено, что введение ОН-групп в молекулу тетрафенилпорфирина способствует специфическому взаимодействию с ПВП, приводящему к образованию термодинамически устойчивых комплексов. Образования радикальных форм гидроксозамещенного

порфирина под действием света не происходит, что обусловлено иммобилизацией порфириновых молекул на полимере, осуществляющейся за счет Н-связывания периферийных заместителей макрогетероцикла с С=0— группами полимера. Впервые исследовано состояние ТАП в водных растворах, установлен тип формирующихся димеров и ассоциатов. Проанализировано влияние электронных и стерических эффектов, периферийных заместителей ТАП на термодинамическую устойчивость димеров. Впервые установлено, что расширение ароматической системы макрогетероцикла при переходе от фталоцианинов к ТАП приводит к уменьшению квантового выхода триплетного состояния, но к увеличению времени в возбужденном триплетном состоянии молекулы и большей устойчивости макроцикла к фотолизу. Впервые проведено комплексное исследование взаимодействия металлокомплексов ТАП с ПМАГ и БСА, установлен состав и устойчивость комплексов, выявлены конформационные изменения полимера, обусловленные комплексообразованием с МТС. Доказано расположение молекул ТАП в белковой глобуле.

Практическая значимость. Полученные данные о свойствах ТАП позволяют считать данные МГС перспективными» и рекомендовать их для дальнейших исследований. Найденные закономерности взаимосвязи строения МГС и его локализации в белковой глобуле позволят целенаправленно модифицировать макрогетероциклическую молекулу для эффективного транспорта МГС эндогенным альбумином. Полученные сведения об увеличении терморезистентности альбумина в составе комплекса с ТАП до 120 °С могут представлять, интерес для эбулио- и криобилогии и химической промышленности.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Химическое строение тетрапиррольных макрогетероциклических соединений

Макрогетероциклические

соединения

порфиринового,

фталоцианинового и порфиразинового класса обладают уникальными физико-химическими свойствами, среди которых, кинетическая и термодинамическая устойчивость, комплексообразующая способность по отношению к нейтральным и заряженным лигандам, полупроводниковые и оптические свойства. Все перечисленные свойства обусловлены особенностями строения и структуры перечисленных соединений. Так, порфирины относятся к ароматическим гетероциклическим соединениям, имеющим сопряженную систему двойных связей, включающую 4 атома азота. Родоначальник класса порфиринов — порфин (I) - образован замыканием четырех пиррольных колец метановыми мостиками, которые по Фишеру [1] нумеруются а,(3,у,5, а 1-8 положения в формуле (I) называют (3-положениями пиррольных колец.

По номенклатуре ИЮПАК [2] принята другая нумерация атомов в порфине, но в связи с её сложностью она практически не применяется. Поэтому в данной работе будут использоваться тривиальные названия, предложенные Фишером. Замещение атомов водорода в пиррольных фрагментах и мезо-положениях макрокольца на различные по природе группы представляет практически неограниченные возможности для создания соединений

собственно порфиринового класса. К ним относятся важнейшие природные и синтетические порфирины. Среди последних наиболее широко изучаются свойства симметрично-замещенных производных порфина: тетрафенилпорфирина (II) и тетраазапорфина (III), называемого также порфиразином.

Основной особенностью молекулярной структуры порфиринов и металлопорфиринов является наличие непрерывного сопряжения, чем и обусловлена конформационная жесткость молекул порфиринов. Замкнутая сопряженная система двойных связей придает молекулам порфиринов ароматические свойства. Ароматичность порфиринов подтверждена различными экспериментальными методами [3,4].

II III

Особый класс тетрапиррольных макрогетероциклических соединений составляют металлофталоцианины, характерной особенностью которых является расширение ароматической системы макрогетероцикла за счет конденсации пиррольных колец с бензольными фрагментами. Расширение ароматической системы при переходе от порфиринов к фталоцианинам приводит к изменению контура сопряжения, увеличению конформационной жесткости макрогетероцикла, термической и химической устойчивости, появлению новых практически полезных свойств.

Современные возможности органической химии- позволяют «комбинировать» молекулы, получая при этом новые соединения с заданными свойствами. Например, авторами [5] описан синтез и свойства карбонилпорфиринов — конденсированных систем, включающих порфириновый цикл и карбораны (полиэдрические соединения). Указанные соединения считаются перспективными для борнейтронозахватной терапии рака. Серия работ [6, 7] посвящена синтезу димерных порфиринов с полиэтиленоксидными и калике[4]ареновыми связывающими фрагментами. Синтезированные соединения способны селективно взаимодействовать с ионами щелочноземельных металлов, при этом порфириновые фрагменты позволяют сравнительно легко регистрировать образование металлокомплексов. При этом задача целенаправленного синтеза такова, что роль порфириновых или фталоцианиновых молекулы сводится к роли сигнальной системы, а не активного реакционного центра [7]. Иное направление может быть достигнуто за счет «жесткой привязки», например, за счет конденсации нафтахиноновых колец с бензольными фрагментами порфиразинов или/и фталоцианинов. Логично ожидать, что синтезированные соединения будут иметь более протяженную сопряженную ти-систему по сравнению с антрахинонами и металлопорфиринами, и, следовательно, будут иметь больший квантовый выход синглетного кислорода и большую устойчивость, что обеспечит их пролонгированное- действие как фотосенсибилизаторов. Кроме того, наличие в молекуле двух типов макроциклических систем (антрахинона и порфирина) обеспечит расширение диапазона фотоактивации фотосенсибилизатора от УФ до ближней ИК области. На кафедре «Технологии Тонкого Органического Синтеза» ИГХТУ под руководством проф. Г.П.Шапошникова разработаны методики синтеза и идентификации данных соединений. По номенклатуре ИЮПАК принята нумерация атомов в молекуле, согласно схеме IV. В дальнейшем, в диссертационной работе для удобства будут использованы тривиальные названия - тетраантрахинонпорфиразины.

IV

7, 23:17, 24 - диимино - 5, 21:12, 22 - динитрилотетра [с, Ь, ш, г] (9, 10 — дегидро-9, 10 диоксоантрацено) [1, 6, 11, 16] тетраазациклоэйкозин

Тетраантрахинонпорфиразины, содержащие сульфо- и карбоксильные группы получены недавно [8] и их свойства не изучены до настоящего времени, поэтому подавляющее большинство сведений в литературном обзоре будет относиться к их аналогам: макрогетероциклическим тетрапиррольным соединениям.

1.2. Фотохимические и фотофизические свойства тетрапиррольных макрогетероциклических соединений

1.2.1. Электронные спектры поглощения

Порфирины, фталоцианины и порфиразины являются хромофорными соединениями, характеризующиеся сравнительно интенсивным поглощением в видимой части спектра. Спектры поглощения порфиринов в видимой части спектра имеют четыре, узкие полосы. На границе между ультрафиолетовой и

видимой областью порфирины имеют очень интенсивную полосу — полосу Соре. Полосы в видимой части спектра по Штерну [9] нумеруют римскими цифрами, начиная с длинноволновой. У порфиринов с различными заместителями полосы поглощения имеют разную относительную интенсивность. Подробное исследование спектров поглощения порфиринов привело Штерна к выводу, что у порфиринов из 24 возможных типов распределения интенсивностей в четырехполосном спектре наблюдаются только 3 спектральных типа: «этиотип» (IV, III, II, I), «родотип» (III, IV, II, I) и «филлотип» (IV, II, III, I). Спектры этиопорфирина, родопорфирина и филлопорфирина, как характерных представителей этих типов, изображены на рис. 1.1.

Рис. 1.1. Спектры поглощения в диоксане: 1-этиопорфирина; 2-родопорфирина, 3 -филлопорфирина [1].

Штерну удалось связать «тип спектра» со свойствами боковых заместителей в молекуле, подробно данный вопрос освящен в обзорной статье [10]. Так как данный вопрос лежит за рамками тематики данной работы, более подробно он рассмотриваться не будет. Как уже отмечалось выше, в электронных спектрах порфиринов в видимой области присутствуют четыре полосы поглощения, соответствующие энергетическим переходам 1А]е—> 'В3и (I полоса поглощения), 'А^—» {В2и (III полоса поглощения),

которые относятся к числу чисто электронных переходов, а также 1А1ё—» В2и

(II полоса поглощения) и 'А^—> В зи (IV полоса поглощения), относящиеся к электронно-колебательным переходам. Полосы поглощения 1-ГУ относят к квазизапрещенным ти-л;+-переходам.[11]

Интересное действие оказывает на спектр порфиринов введение атома азота вместо метановых групп СН (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Влияние азазамещения на спектры поглощения порфиринов в диоксанеЛ-этиопорфирин; 2-моноазаэтиопорфирин; 3 -диазаэтиопорфирин;

4-тетразаэтиопорфирин [12].

Электроотрицательные атомы азота сильно возмущают л-электронное облако. Результатом одного аза-замещения является заметное возрастание интенсивности полос I и III, ослабление полос II и IV и незначительное коротковолновое смещение полосы I. Увеличение числа атомов азота приводит к дальнейшему росту полос I и III, размытию и ослаблению полос

II в IV и небольшому общему красному смещению видимого спектра (полоса

III смещается сильнее). В спектрах металлопроизводных азапорфиринов

имеются две полосы в видимой области, как и у обычных металлопорфиринов. Различие заключается в том, что у первых полоса I имеет большую интенсивность аналогично полосам I и III свободных азапорфиринов. Полоса Соре у азапорфиринов и их металлопроизводных сильно расширена и смещена в коротковолновую сторону, причем этот эффект тем более выражен, чем больше введено атомов азота. Включение бензольных колец в систему сопряжения' приводит к усилению видимых полос поглощения и смещению их в длинноволновую сторону. Электронные спектры фталоцианинов имеют несколько полос в электронных спектрах поглощения, обусловленных л-л и- п-тс переходами. Для обозначения этих полос были приняты следующие обозначения: С-, L- и N- полосы, расположенные в УФ области при 220, 240 и 270 нм, соответственно; В — полоса (или полоса Соре) локализована в ближней УФ области около 320'нм; Q - наиболее интенсивная, полоса, расположенная в видимой части спектра при 650 - 700 нм. Неоднократно проводились Paris er-P'arr-Pople и ab initio вычисления [13, 14, 15], показавшие, что В- и Q-полосы поглощения вызваны электронным возбуждением двух орбиталей: высшей заполненной и нижней вакантной молекулы фталоцианина. Результирующая электронная конфигурация имеет электронное состояние, в котором диполи либо гасят друг друга, либо взаимно усиливают [16, 17]. Этот факт является причиной появления колебательных спутников В- и Q-полос - Вх, Ву, Qx и Qy> соответственно. Наибольший интерес представляет анализ интенсив