Комплексы катионных полимеров с анионными коллоидами: формирование, строение и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Малинин, Андрей Сергеевич АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
2012 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.06 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Комплексы катионных полимеров с анионными коллоидами: формирование, строение и свойства»
 
Автореферат диссертации на тему "Комплексы катионных полимеров с анионными коллоидами: формирование, строение и свойства"

На правах рукописи

Малшшн Андрей Сергеевич

КОМПЛЕКСЫ КАТИОННЫХ ПОЛИМЕРОВ С АНИОННЫМИ КОЛЛОИДАМИ: ФОРМИРОВАНИЕ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 5 НОЯ 2012

МОСКВА-2012

005054804

Работа выполнена в Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова на химическом факультете (в лаборатории синтеза и изучения свойств полимеров кафедры высокомолекулярных соединений). Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ярославов Александр Анатольевич

Официальные оппоненты: Прокопов Николай Иванович

доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова, заведующий кафедрой химии и технологии высокомолекулярных соединений

Мисин Вячеслав Михайлович

доктор химических наук, профессор, Учреждение Российской академии наук «Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля», заведующий лабораторией комплексной оценки антиоксидантов

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетпое

учреждение науки Институт элементо-оргаиических соединений им. АЛ. Несмеянова Российской академии наук (1П1ЭОС)

Защита состоится «14» ноября 2012 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г.Москва, Ленинские горы, д.1, стр.3, МГУ имени М.В.Ломоносова, Химический факультет, Лабораторный корпус «А», кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета

к.х.н. ¿¿.^.¿.^/st^ Долгова Алла Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адсорбция полиэлектролитов (полимеров с ионогенными группами) на противоположно заряженных твердых субстратах (стекле, полимере, металле) представляет собой простой и эффективный способ модификации поверхности. Этот прием позволяет придать поверхности нужную функциональность, упростить процедуру очистки конечного продукта, ковалентно связать на модифицированной поверхности биологически активные вещества, красители и проч. Последовательная адсорбция катионных и анионных полимеров позволяет получать полимерные слои контролируемой толщины, сохраняющие стабильность в широком интервале концентрации соли и рН раствора

Между тем, существует целый ряд задач, для решения которых необходимы полимерные покрытия (моно и мультислойные), обратимо десорбирующиеся с поверхности при изменении внешних условий, например, концентрации соли и/или температуры. Высокая стабильность межфазных электростатических комплексов полиэлектролит-поверхность достигается благодаря множественным солевым связям, в образовании которых участвуют ионогенные группы обоих компонентов. Можно ожидать, что уменьшение количества заряженных групп в макромолекуле будет сопровождаться понижением устойчивости межфазного комплекса в водно-солевых средах. Такие «лабильные» (возобновляемые) покрытия представляют интерес для конструирования носителей лекарственных веществ, катализаторов, сорбентов для извлечения токсичных соединений, антикоррозионных и биоцидных пленок и проч.

Цель работы состояла в синтезе сополимеров с различной долей катионных звеньев в макромолекуле, в формировании комплексов сополимеров с анионными коллоидами, в исследовании стабильности комплексов в водно-солевых средах и миграции адсорбированных макромолекул между коллоидными частицами, и в изучении функциональных свойств белков, адсорбированных на межфазных полимерных слоях.

Для этого в работе необходимо было:

1) синтезировать

- сополимеры с (а) катионными и (б) гидрофильными или

гидрофобными группами;

2) исследовать

- адсорбцию катионных сополимеров на поверхности анионных боросиликатных микросфер (БСМ),

- стабильность комплексов поликатион-БСМ в водно-солевых средах;

>

\

- кинетику перераспределения адсорбированных молекул поликатиона между микросферами;

- формирование мультислойных чередующихся покрытий поликатион/ полианион на поверхности БСМ и каталитическая активность фермента

- а-химотрипсина (ХТ), иммобилизованного на полимерных мультислоях;

Научная новизна. Модификацией поли-4-винилпиридина бромистым этилом и бромуксусной кислотой впервые синтезированы две серии катионных сополимеров: 1) с катионными и гидрофобными звеньями и 2) с катионными и гидрофильными электронейтральными (цвиттер-ионными) звеньями. Впервые показано, что устойчивость комплексов катионных сополимеров с анионными гидрофильными коллоидными частицами (БСМ) в водно-солевых средах резко возрастает с увеличением мольной доли катионных звеньев в макромолекуле (а). Продемонстрирована способность адсорбированных молекул поликатионов перемещаться между БСМ, сделана оценка эффективного коэффициента латеральной диффузии макромолекул Drac = 1,4-10"12 см3/с (при 20 °С). Путем чередующейся адсорбции поликатиона и полианиона получены полимерные мультислои на поверхности БСМ; гидролитический фермент (ос-химотрипсин), иммобилизованный на полимерном мультислое, сохраняет около 50% своей каталитической активности.

Прастическая значимость. Разработан и экспериментально проверен способ контролируемой десорбции поликатиона с анионной поверхности путем изменения концентрации соли в окружающем растворе. Описанная в работе электростатическая адсорбция ферментов на поверхности полиэлектролитного мультислоя может быть использована для получения высокоэффективных биокатализаторов и нанолекарств. Предложен способ нековалентной конъюгации белков с частицами вирусов растений через поликатионный спейсер, который может быть использован для получения биологически безопасных нановакцин.

Апробация работы. Основные результата диссертационной работы докладывались и обсуждались на 7-м Международном симпозиуме по полиэлектролитам "Polyelectrolytes 2008" (Португалия, Коимбра, 2008), Юбилейной научной конференции, посвященной 80-летию Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (Россия, Москва, 2009), 5-ой Всероссийской каргинской конференции "Полимеры-2010" (Россия, Москва, 2010), 7-ом Международном симпозиуме ИЮПАК по молекулярной подвижности и порядку в полимерных системах (Россия, Санкт-Петербург, 2011), а также

на XIV, XV и ХУ1-ой Международных конференциях «Ломоносов 2007, 2008 и 2009» (Россия, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 2 патента, 9 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 2 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 181 ссылки.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В литературном обзоре проанализированы описанные в литературе теории адсорбции полиэлектролитов и обсуждены экспериментальные данные о кинетике адсорбции полиэлектролитов на лиофильных коллоидных частицах, строению и свойствам адсорбционных слоев. В дополнение к этому рассмотрены теоретические и экспериментальные работы, посвященные латеральной (вдоль поверхности) динамике макромолекул.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования. Структурные формулы и составы использованных в работе катионных сополимеров представлены на рис. 1 и в таблице 1.

Катионные сополимеры с гидрофобными звеньями в основной цепи («гидрофобные катионные сополимеры», КС[юб) получали за счет неполной кватернизации 10%-ного метанольного раствора поли-4-винилпиридина (ПВП) со степенью полимеризации 600 бромистым этилом. Катионные сополимеры с цвиттер-ИОИНЫМИ ГИДРОФИЛЬНЫМИ ЗВеНЬЯМИ («Гидрофильные КаТИОННЫе СОПОЛИМерЫ», КСфил)

получали путем последующей кватернизации гидрофобных поликатионов бромуксусной кислотой.

Рис, 1. Структурные формулы катионных сополимеров, а, (1 и у - доли катионных, гидрофобных (неаокилированных) и гидрофшьных электронейтральных (цвиттер— ионных) звеньев соответственно.

Сополимер а В Y

КСфоб-24 0,24 0,76 0

КСфоб-33 0,33 0,67 0

КСфоб-40 0,40 0,60 0

КСфоб-51 0,51 0,49 0

КСфоб-61 0,61 0,39 0

КСфоб-67 0,67 0,33 0

КСфоб-98* 0,98 0,02 0

КСф„-0/97 0 0,03 0,97

КСфш-3/94 0,03 0,03 0,94

КСфил-5/92 0,05 0,03 0,92

КСфи.,-8/90 0,08 0,02 0,90

КСфш-10/86 0,10 0,04 0,86

КСфил-13/85 0,13 0,02 0,85

КСфнл-15/82 0,15 0,03 0,82

КСфи.,-20/76 0,20 0,04 0,76

КСфк1-29/67 0,29 0,04 0,67

КСфи.1-40/56 0,40 0,04 0,56

КСфи.,-47/50 0,47 0,03 0,50

КС,,,,„-63/34 0,63 0,03 0,34

КСфи.,-67/29 0,67 0,04 0,29

КСфкл-98/0* 0,98 0,02 0

*) КСфоб-98 з КСфил-98/0 = КС,

Состав сополимеров определяли методом ИК спектроскопии. Концентрация катионных сополимеров приведена в молях кватернизованных групп на литр раствора Во флуоресцентных экспериментах использовали гидрофильный катионный сополимер КСфил-88/10 с а= 0,88, р= 0,02 и у= 0,10, дополнительно ковалентно модифицированный этилендиамином и флуоресцеин-изо-тиоционатом (ФИТЦ) в расчете «одна флуоресцентная метка на макромолекулу» (Ф-КС).

Каталитическую активность ХТ определяли спектрофотометрически, измеряя скорость гидролиза специфического субстрата, л-нитроанилид пироглугамил-

фенилапанина (01р-Р1к-рЫА), по накоплению в растворе пара-нитроанилина при ^=410 нм.

Катионные сополимеры адсорбировали на поверхности БСМ со средним диаметром 4,9±0,5 мкм (рис. 2). Для получения максимального количества поверхностных анионных групп БСМ обрабатывали смесью концентрированной серной кислоты и пероксида водорода. Среднее количество силанольных групп на поверхности каждой анионной микросферы составило 2,6* 108 или 3 силанольные группы на 1 нм2 поверхности БСМ.

Рис. 2. Микрофотография борсшикатных стеклянных микросфер (БСМ). Просвечивающая электронная микроскопия.

В работе использовали методы флуоресцентной, УФ и ИК спектроскопии, сканирующей, просвечивающей, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, кондуктометрии и потенциометрии. Если не оговорено особо, результаты экспериментов приведены после нормирования на 1 г микросфер. Эксперименты проводились в 1<ГМ боратном буфере с рН 9,2.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Адсорбция катионных сополимеров на поверхности анионных микросфер.

Количество связанного с микросферами сополимера оценивали следующим образом. Водную суспензию БСМ добавляли к раствору сополимера, через 5 мин стеклянные микросферы с адсорбированным сополимером отделяли центрифугированием и находили его концентрацию в надосадочной жидкости [КС]сво& сравнивая оптическую плотность супернатанта с соответствующей градуировочной зависимостью.

На рис. За и 36 приведены экспериментальные данные по связыванию на БСМ четырех катионных сополимеров с гидрофобными звеньями (из 7 исследованных) и четырёх гидрофильных сополимеров (из 14 исследованных) в координатах «концентрация свободного полимера ([КС]СВОб]) - общая концентрация полимера в суспензии ([КС])». Видно, что каждый сополимер полностью связывался с БСМ вплоть до некоторой предельной концентрации [КС]макС- При больших концентрациях несвязанный с микросферами (свободный) полимер появлялся в растворе.

Зависимость [КСфоб],1аге от мольной доли катионных групп в сополимере а, включающая результаты для всех 7 исследованных КС,^ (рис. 4а, кривая 1), свидетельствует о том, что возрастание а сопровождалось уменьшением количества адсорбированного сополимера. Путем пересчета общей концентрации звеньев адсорбированного поликатиона [КСфоб]ма1!С на концентрацию его катионных групп ([КС+фоб]макс = [КСфоб]макс х а) ПОЛуЧИЛИ ЗаВИСИМОСТЬ «[КС+фоб]„акс - а» (рис. 4а, кривая 2), вид которой указывает на то, что количество катионных групп в предельно насыщенных адсорбционных слоях КСфоб не изменялось с увеличением их содержания в поликатионе.

Зависимость [КСф„л]макс от а с учетом всех 14 гидрофильных сополимеров представлена кривой 1 на рис. 46. Она имеет колоколообразный вид с максимумом при а = 0,15 и горизонтальным участком в области а > 0,4. Пересчетом общей концентрации звеньев адсорбированного гидрофильного поликатиона [КС,|,„]макс на концентрацию его катионных групп (|КС*4„])ШС= [КСфк1]Ц1акс х а) получили зависимость «[КС+фш]шкс - а» (рис. 46, кривая 2) с ростом [КСфш]„акс в области низких значений а и выходом на плато при а = 0,4.

На основании приведённых зависимостей можно заключить, что сополимеры количественно связывались с поверхностью БСМ. В случае гидрофобных сополимеров количество предельно адсорбированного поликатиона прогрессивно уменьшалось с ростом а, что отражало уменьшение количества «балластных» некватернизованных групп в адсорбированных сополимерах. В соответствии с этой моделью количество катионных

групп В предельно насыщенных адсорбционных СЛОЯХ КСфоб ([КС+фо«]»икс) не менялось (рис. 4а, кривая 2).

а б

[Кад^Ю4, моль/л 80

[КСф„]сво5*104, моль/л 20

10

120 180 [КСфоо] *104, моль/л

80 [КСф„,-

120 <104, моль/л

Рис. 3. а) Зависимость концентрации несвязанного с микросферами КСфоб от его общей концентрации в суспензии. КСфоб-24 (1), КСфоб-33 (2), КСфоб-51 (V и КСфоб-98 (4). б) Зависимость концентрации несвязанного с микросферами КСфт от его общей концентрации в суспензии. КСфш-0/98 (1), КСфт-8/90 (2), КСфт-15/82 (3) и КСФ„и-40/56 (4).

[КСфоо] *Ю4, моль/л [КС+4„б] *Ю\ моль/л [КСФ„] х104, моль/л [КС*,

90-1 -90 150-1

75 а 75 120

60 60 90

45 ■45 60

30 2 ■ . \ч ■30 30 0

■ 1

I X 10 , моль/л г150

100

50

0.2

0.4

0,8 1.0 а, мол. доли

0,5

1,0

а, мол. доли

Рис. 4. а) Зависимость концентрации КСфоб, обеспечивающей максимальное заполнение поверхности БСМ, от а (1). Кривая 2 получена путем пересчета общей концентрации звеньев КСфоб в концентрацию его катионных групп.

б) Зависимость концентрации КСф111, обеспечивающей максимальное заполнение поверхности БСМ, от а (I). Кривая 2 получена путем пересчета общей концентрации звеньев КСфиЛ в концентрацию его катионных групп.

Несколько сложнее развивалось связывание гидрофильных сополимеров с теми же коллоидными частицами. Согласно теоретическим представлениям об адсорбции полиамфолитов, эффективность адсорбции определяется балансом между притяжением полимерных цепей к поверхности, индуцированным их поляризацией в электрическом поле частицы, и отталкиванием звеньев макромолекулы. Замена части цвитгер-ионных групп на катиониые приводила к изменению баланса сил в пользу притяжения и возрастанию количества адсорбированных макромолекул (или, в других терминах, [КСфш]мак); так продолжалось до тех пор, пока а не становилось равным 0,15 (рис. 46,

9

кривая 1). Последующее увеличение а сопровождалось увеличением количества солевых связей, формируемых адсорбированными макромолекулами, и одновременным уменьшением количества связанных с поверхностью «балластных» цвиттер-ионных групп, что находило отражение в понижении [КСф„,],та1:с.

Стабильность комплексов катнонных сополимеров с БСМ в водно-солевом растворе (2,5 М растворе ЫаС!) оценивали спектрофотометрически по содержанию поликатионов в супернатантах после отделения комплексов с помощью центрифугирования. Результаты представлены на рис. 5 в виде зависимости доли поликатиона, связанного с БСМ, от содержания катионных групп в сополимере. Видно, что КСфов полностью десорбировался с поверхности микросфер при а = 0,24; при большем содержании катионных групп весь адсорбированный поликатион оставался на поверхности микросфер в 2,5 М растворе соли (кривая 1). Что касается гидрофильного поликатиона, его комплекс с БСМ приобретал стабильность в солевом растворе уже при небольшом содержании катнонных групп (при а = 0,08 - 0,1); диссоциация комплекса полностью подавлялась для сополимеров с а > 0,15 (кривая 2).

[КС]с„ЛКС]: 1,0

0,5

0,0

.1 I

Рис. 5. Зависимость доли КСфов (1 - л) и КСфш (2 - а), связанных с поверхностью частиц БСМ в 2.5 Мрастворе ИаС1, от а.

0,5

1,0

а, мол. доли

Таким образом, увеличение суммарного заряда катионного полимера сопровождалось повышением стабильности его комплекса с БСМ. Отличие в поведении гидрофобных и гидрофильных поликатионов проявлялось в том, при каком содержании катионных групп связывание сополимеров на поверхности БСМ становилось необратимым (нечувствительным к присутствию соли в окружающем растворе). Гидрофильные сополимеры демонстрировали необратимое связывание при меньшем содержании катионных групп, чем гидрофобные: а = 0,3 для гидрофильных сополимеров против а = 0,15 для гидрофобных. Это могло быть связано с дополнительным участием цвиттер-ионных групп гидрофильных сополимеров в стабилизации их комплексов с БСМ.

2. Миграция катнонного сополимера между микросферами.

Как показано в предыдущей главе, стабильность комплексов катионных сополимеров с БСМ в солевых средах резко возрастала с повышением доли катионных групп в сополимере. По достижении некоторого порогового содержания катионных групп макромолекулы удерживались на поверхности БСМ даже в растворах с высокой концентрацией низкомолекулярной соли. Однако адсорбированный полимер сохранял способность перемещаться по поверхности микросфер и переходить с одной микросферы на другую. Для демонстрации латеральной подвижности адсорбированных макромолекул был использован метод конфокальной микроскопии.

Водная суспензия БСМ (67 мг/мл) была добавлена к раствору флуоресцентно меченого катионного сополимера (Ф-КС) с таким расчетом, чтобы обеспечить максимальное заполнение поверхности микросфер адсорбированным сополимером. Возможный избыток сополимера удалялся центрифугированием, что гарантировало отсутствие свободного (несвязанного с микросферами) сополимера в водном растворе. Затем к суспензии комплекса БСМ/сополимер добавляли суспенизию исходных («пустых») БСМ. В полученной таким образом смеси количество микросфер с адсорбированным катионным сополимером (Nkc) было равно количеству пустых микросфер (N): Nkc = N, или Nkc/N = 1.

Сразу после приготовления смесь была разбавлена в 20 раз, и аликвоту смеси наносили на стеклянную пластину, помещенную на объектив конфокального микроскопа. Фотография смеси, сделанная во флуоресцентном режиме, представлена на рис. 6а. Хорошо видно, что только что приготовленная смесь содержала два типа микросфер: «зеленых» и «черных» с адсорбированным Ф-КС и без него соответственно. Через 24 часа смесь была снова проанализирована с помощью конфокальной микроскопии. Оказалось, что все находящиеся в фокусе микроскопа частицы были окрашены в зеленый цвет (рис. 66), то есть несли на себе флуоресцентно меченый поликатион. Этот результат однозначно свидетельствовал о том, что адсорбированный катионный сополимер перераспределялся между всеми микросферами в суспензии.

Мы проделали описанный выше эксперимент, добавляя разные количества «пустых» микросфер к максимально насыщенному комплексу БСМ/Ф-КС и анализируя интенсивность флуоресценции индивидуальных частиц с помощью программного обеспечения, предлагаемого фирмой-разработчиком (Carl Zeiss, США). На рис. 7 представлена зависимость средней интенсивности флуоресценции частиц в поле микроскопа (в относительных координатах, 1Ло), установившейся через 24 часа после приготовления смеси «БСМ/Ф-КС + БСМ, от соотношения <p=Nkc/(Nkc+N). Пунктирными

линиями отмечены средние интенсивности флуоресценции частиц в обменивающейся полимером системе, рассчитанные при условии равномерного распределения Ф-КС между всеми микросферами в системе: МоогеорГ^кс/СМкс+Т^). Видно, что экспериментально найденная величина 1До прогрессивно уменьшалась с понижением ф и каждый раз соответствовала равномерному распределению Ф-КС между микросферами.

а б

■и ШШВШ о 1 « ¡¡¡■■■и ■■и ■в .... .,-,.,; — ' ■ ' ■ о шіштж щ с ■1 11 Я! %

с- с*

Шш||рЫ§1| ш

Рис. 6. Микрофотография смеси «БСМ/Ф-КС + БСМ» через 5 минут (а) и 24 часа (б) после смешения. Конфокальная микроскопия (флуоресцентный режим).

Сополимер может перераспределяться между микросферами либо путем десорбции и последующей адсорбции на новой частице, либо «переползая» с одной частицы на другую при непосредственном контакте частиц. Стеклянные микросферы - частицы с высокой плотностью (2,5 г/см3) практически количественно осаждались на дно сосуда пробирки в течение 5 минут после добавления суспензии; получившийся осадок не перемешивался в ходе «миграционного» эксперимента. Поэтому перераспределение сополимера происходило, скорее всего, в ходе его латеральной миграции между соседними микросферами в осадке. Несмотря на высокую вероятность такого способа

Ш:М

перераспределения адсорбированного полимера, мы провели модельный эксперимент, результаты которого могли бы помочь в выборе механизма миграции сополимеров.

Были приготовлены две стеклянные пластинки (10 мм х 40 мм) с силанольными группами на поверхности (их обработка смесью серной кислоты и перекиси водорода проводилась в тех же условиях, что и модификация БСМ). Поверхность одной из пластинок была покрыта 10 мкп 10"2 М раствора Ф-КС. Через 10 мин избыток раствора был удален с поверхности пластинки, а сама она была промыта 3 раза в большом объеме дистиллированной воды. Полученная таким образом пластинка флуоресцировала при ^-Флуор= 515 нм (Х,озб = 493 нм), интенсивность флуоресценции составляла 1,19 а.е, что свидетельствовало о связывании Ф-КС с поверхностью модифицированной пластинки. Затем две пластинки - с адсорбированным Ф-КС и без него - были помещены в наполненный боратным буферным раствором стеклянный сосуд на расстоянии ~1 мм друг от друга. Через 2 недели была измерена интенсивность флуоресценции обеих пластинок, которая оказалась равной 1,19 а.е. для пластинки с адсорбированным Ф-КС, а интенсивность флуоресценции второй пластинки была близка к нулю. Иными словами, нам не удалось за 2 недели зарегистрировать перемещение Ф-КС между платинками, разделенными буферным раствором. Этот результат находился в согласии со сделанным ранее выводом о том, что миграция сополимера развивается в основном по механизму его латеральной диффузии между соседними микросферами.

В описанных выше экспериментах «свободная поверхность», на которую переходил флуоресцентно меченый катионный сополимер, создавалась за счет добавления «пустых» микросфер к микросферам с адсорбированным сополимером. Если же комплекс БСМ/Ф-КС смешивали с микросферами, поверхность которых была максимально заполнена немеченым КС, то даже через неделю в системе присутствовали два типа частиц - «зеленые» с адсорбированным Ф-КС и «черные» с адсорбированным немеченым КС (данные флуоресцентной микроскопии). Иными словами, а такой системе - со 100%-ным заполнением поверхности частиц сополимером - он не перераспределялся между частицами.

Это наблюдение было использовано при постановке «кинетических» экспериментов для оценки скорости миграции сополимера. Кинетическая кривая, описывающая перераспределение сополимера между микросферами, была получена следующим образом. Были приготовлены восемь одинаковых образцов с соотношением (БСМ/Ф-КС)/БСМ (вес./вес.) = 1. Последовательно с интервалом в два часа к образцам добавляли избыток стоп-реагента - немеченого КС, что приводило к заполнению всех свободных для адсорбции мест на поверхности микросфер и блокированию миграции

меченого сополимера. Полученные смеси были проанализированы с помощью конфокальной микроскопии и результаты анализа оцифрованы, как описано выше.

Во всех образцах присутствовали два сорта частиц с примерно равным содержанием частиц обоих типов: (1) с 1>1/1о>0,5 и (2) с 0,5>1/1о>0. Первые логично было приписать микросферам, с поверхности которых сополимер уходил, вторые -микросферам, на поверхности которых он появлялся. Первые для простоты изложения мы назовем «теряющими» сополимер БСМ (т-БСМ), вторые - «приобретающими» сополимер БСМ (и-БСМ). На рис. 8 представлены временные зависимости 1/1о для обоих типов микросфер.

. 1

Рис. 8. Кинетика изменения 2 интенсивности флуоресценции т-БСМ (л1)ип-БСМ(А2).

о *...........................-.........

О 5 10 15 20 вРемя. 4

Полученная кинетическая зависимость для количества (концентрации) сополимера, перешедшего с т-БСМ на л-БСМ (или в обратном направлении), позволяет рассчитать коэффициент латеральной диффузии катионного сополимера (Оке) в предположении, что этот процесс подчиняется второму закону Фика: сЮЖ = Оке^{сРС/сЬ?). Аналитическое решение данного уравнения дало значение Оке равное 1,4><10"12 см2/с при 20 °С. Мы повторили описанные выше эксперименты при 20 °С, но в ЗМ растворе №С1, и в «стандартном» 10"2М боратном буфере с рН 9.2, но при температуре 60 °С. В обоих случаях мы видели ожидаемый отклик системы - возрастание коэффициента диффузии (до 3,2х10"12 см /с в солевом растворе и до 4,2х 10"12 см2/с при повышении температуры).

Вычисленное нами значение латеральной диффузии адсорбированного на стеклянных микросферах катионного сополимера оказалось на 2-3 порядка ниже коэффициентов латеральной диффузии, приводимых в литературе для (био)полимеров, в частности, белков и ДНК. Меньшая скорость миграции катионных сополимеров в суспензии (плотном слое) БСМ может быть следствием (¡) несовершенной морфологии отдельных микросфер (наличием «гор» и «оврагов» на их поверхности) и образованных ими агломератов (сополимеру приходится перемещаться по «бугристой» поверхности, что

И0

1

0,8

0,6 0,4 0.2

эквивалентно увеличению пройденного им пути), (и) возможного застревания макромолекул в узких щелях между соседними микросферами, (ш) больших расстояний между соседними микросферами, существенно превышающих длину сегмента макромолекулы (то есть отсутствия подходящих мостиков для перехода на соседнюю частицу), (¡у) блокирования больших участков поверхности микросфер (доступных мест связывания) в агломератах, и ряда других причин. Поэтому в нашем случае правильнее говорить об эффективном коэффициенте латеральной диффузии катионного сополимера, имея в виду те специфические ограничения, которые характерны для перемещения адсорбированного полимера в плотном слое 5 мкм частиц (см. выше).

3. Латеральная подвижность катионного сополимера в тройной системе анионная микросфера-сополимер-линейный/сшитый полианион.

Общепринято, что латеральная (вдоль плоскости) миграция гибкоцепных полиэлектролитов развивается по механизму рептации. Решающую роль в такой диффузии играют «петли» и «хвосты» адсорбированных макромолекул. Движение макромолекул осуществляется за счёт разрыва старых и образования новых ионных контактов полимер-поверхность. При таком скомпенсированном разрушении/формировании связей движущихся макромолекул с поверхностью энергетические затраты диффузии сведены к минимуму и движение макромолекул характеризуется низким барьером активации.

Мы видим, что необходимыми условиями для реализации двумерной диффузии полиэлектролитов являются (1) свободное (незанятое полимером) пространство и (2) наличие некомпенсированного заряда в адсорбированных макромолекулах. Первое условие было обсуждено выше. Важность выполнения второго была продемонстрирована в ходе следующего эксперимента. Мы воспроизвели условия «кинетического» опыта с одним изменением: после завершения адсорбции Ф-КС на поверхности БСМ к суспензии комплекса был добавлен раствор полиакриловой кислоты (ПАК). (Перед этим - в отдельном эксперименте с использованием флуоресцентно меченой ПАК - было показано, что ПАК не адсорбируется на поверхности анионных БСМ, но эффективно связывается с БСМ, поверхность которых предварительно покрыта слоем адсорбированного катионного сополимера, например, КС^д) Понятно, что ПАК могла связываться с БСМ/Ф-КС только за счет образования солевых связей с катионными «петлями» и «хвостами» адсорбированного Ф-КС. Но это должно было приводить к исчезновению необходимого условия диффузии Ф-КС! И, действительно, мы наблюдали полное блокирование миграции комплекса Ф-КС/ПАК на «пустые» микросферы.

Таким образом, катионный сополимер способен перемешаться на свободное место на поверхности соседней анионной микросферы, но неспособен покидать поверхность и переходить в раствор даже в присутствии больших избытков линейного полианиона. В первом случае перемещение сополимера между микросферами не приводит к потере конформационного набора адсорбированных макромолекул (конформационной энтропии системы), но сопровождается повышением конфигурационной энтропии системы за счет увеличения числа возможных вариантов размещения макромолекул по поверхности микросфер. Во втором случае переход сополимера в раствор за счет формирования интерполиэлектролитного комплекса (ИПЭК) с полианионом (если бы такое имело место) должен был бы привести к значительному обеднению конформационного набора молекул ПАК и, как следствие, к заметному уменьшению энтропии системы. Минимальные энтропийные потери достигаются в том случае, если только часть молекул полианиона электростатически связывается с адсорбированным катионным сополимером, формируя тройной комплекс «полианион-поликатаон-анионная поверхность». Другая часть анионных макромолекул остается в растворе, сохраняя высокий уровень энтропии в системе. Именно по этому пути развивается взаимодействие в тройной системе с участием линейного полианиона: ПАК+КС+БСМ.

Что произойдет, если мы будем увеличивать длину молекулы полианиона и в пределе возьмем «супермолекулу», достаточно жесткую, один конец которой закрепим на поверхности сорбента, а другой оставим в растворе? Очевидно, такой жесткий анионный стержень будет выполнять ту же функцию, что и поверхность соседней микросферы в экспериментах по миграции поликатиона между анионными БСМ: поликатион будет перемещаться вдоль стержня, удаляясь от поверхности сорбента. Некоторую иллюстрацию к описанному «мысленному» эксперименту можно получить, используя в качестве «супермолекулы» частицы слабосшитого гидрогеля из поли-2-акрилоамид-2-метил-1-пропансульфокислоты (ПАМПС), сшитого КМ-метиленбисакриламидом, в котором 1 поперечная сшивка приходится на 100 звеньев ПАМПС1.

Мы добавили частицы гидрогеля к суспензии БСМ с адсорбированным Ф-КС; параллельно был проведен эксперимент, в котором гидрогель был помещен на поверхность стеклянной пластинки с адсорбированным Ф-КС. Изображения двух систем сразу после смешивания приведены на рис. 9а и 96, причем на каждом из них приведены две пары изображений: слева флуоресценция, справа видимый свет. Спустя 5 минут в обоих случаях наблюдалось окрашивание частиц гидрогеля в зеленый цвет (рис. 10а и 106), что свидетельствовало о переходе части молекул Ф-КС с поверхности микросфер и

') Предоставлен к.х.н. В.Б.Рогачевой (химический факультет МГУ имени М.И. Ломоносова)

16

стекла внутрь частиц гидрогеля. Процесс перераспределения Ф-КС между частицами происходил за более короткое время по сравнению с перераспределением полимера между частицами БСМ. По-видимому, причина этого заключалась в существенно большей плотности заряда геля ПАМПС по сравнению с плотностью заряда БСМ.

Рис. 9. Микрофотографии смеси «БСМ/Ф-КС+гидрогель» (а) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) и стеклянной пластинки с нанесенным Ф-КС в контакте с гидрогелем (б) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) сразу после смешения.

Рис 10. Микрофотографии смеси «БСМ/Ф-КС+гидрогель» (а) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) и стеклянной пластинки с нанесенным Ф-КС в контакте с гидрогелем (б) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) через 5 минут.

4. Полиэлею-ролитные мультислои с иммобилизованным а-химотрипеином.

Полиэлектролитные мультислои на поверхности микросфер получали последовательной адсорбцией катионного и анионного полимеров. Адсорбция максимально возможного количества поликатиона создавала на поверхности микросфер избыточный положительный заряд, который мог быть использован для последующей адсорбции полианиона. После завершения каждой стадии адсорбции микросферы с адсорбированными полиэлекролитами отделяли от водного раствора многократным центрифугированием, включающим промывание осадка дистиллированной водой. Это обеспечивало удаление избыточных полиэлектролитов и формирование полимерного мультислоя на поверхности микрочастиц.

Для формирования полимерных мультислоев использовали два типа микросфер: описанные выше анионные БСМ и катионные БСМ, полученные из анионных путем аминирования их поверхности 3-аминопропилтриэтоксисиланом в абсолютном толуоле:

= Si - ОН + H2N - (СН2)3 - Si(OEt)3 PhMe"- > s Si - О - Si(OEt)2 - (CH2 )3 - NH2 + ЕЮН

Среднее количество аминопропильных групп на поверхности каждой микросферы составило 2,2х108 или 3 амино-группы на 1 нм2 поверхности БСМ.

В этом разделе - для удобства описания состава комплексов микросфер с нанесенными моно- и мультислоями - мы будем пользоваться следующими обозначениями:

БСМ(-)

БСМ(+)

БСМ(-)//КСпреД, БСМ(-)//КСпред//ПАК, БСМ(-)//КСпред//ПАК//КСпри и т.д.

БСМ(+)//ПССК*, БСМ(+)//ПССК//КСпред, БСМС+у/ПССК/ЛССпрсд/ЯТАК и т.д. *) Полистиролсульфокислота

анионные БСМ

катионные БСМ

моно- и мультислойные ИПЭК предельного состава на поверхности анионных микросфер

моно- и мультислойные ИПЭК предельного состава на поверхности катионных микросфер

Количество связанного с микросферами полиэлектролита определяли, отделяя микросферы с адсорбированным полимером (или полимерами) и измеряя оптическую плотность раствора при /.=257 и 230 нм (для КС1фед и ПССК, соответственно) или интенсивность флуоресценции Хфл>ор= 515 нм (Х,озб = 493 нм) (для флуоресцентно меченой ПАК). Полученные результаты позволили рассчитать предельное количество катионных и анионных групп, которые приносит на поверхность микросферы адсорбированный полимер: 5,5х108 для КС^Д и 3,7х108 для ПССК. Увеличение числа полимерных слоев практически не сказывалось на количестве вновь адсорбируемых полимеров. Иными словами, соотношение поликатион/полианион в межфазном комплексе не менялось в ростом толщины мультислойного покрытия. Составы полученных комплексов микросфера-полиэлектролит приведены в таблице 2 (колонка 2).

№ п/п Состав Заряд Количество адсорбированных глобул ХТ* Аістнвность адсорбированного ХТ(%)**

1 2 3 4 5

1 БСМ(-) отрицат. 9,3x10" 5

2 БСМ(+)//ПССК отрицат. 9,8*10* 18

3 БСМ(+)//ПССК//КСпред//ПАК отрицат. 9,5x104 42

4 БСМ(+)//ПССК//(КСго„//ПАК); отрицат. 9,6x104 44

5 БСМ(+) положит. 4,6 х 104 = 1

6 БСМН/ЖС™, положит. 5,2хЮ4 30

7 БСМН/ЖС^у/ПАК/ЛСС™«, положит. 5,4x10" 16

8 БСМ(-)//КСпте.ДПАК//КС1гоез)2 положит. 5,5x10" 15

*) В расчете на одну микросферу;

**) По отношению к активности ХТ в буфере с рН 5,5 (1-4) и 9,2 (5-8).

Микросферы с моно- и мультиполимерными покрытиями были использованы для электростатической иммобилизации протеолитического фермента (ХТ) с р1=8,6-8,8. Мы ожидали, что активность фермента будет сохраняться в большей степени при его иммобилизации на «мягкой» поверхности - полимерном (мульти)слое. Для повышения эффективности связывания фермента его адсорбцию проводили в условиях, когда заряды поверхности и глобулы были противоположны по знаку: использовали водный раствор с рН 9,2 для связывания ХТ с анионными БСМ и раствор с рН 5,5 для его связывания с катионными БСМ. Знак заряда поверхности указан в таблице 2 (колонка 3).

Количество связанного с микросферами ХТ определяли, отделяя микросферы с адсорбированным ферментом и измеряя интенсивность флуоресценции супернатанта при ?-Ф-туор= 345 нм (Хвозб = 280 нм). Каталитическую активность адсорбированного фермента оценивали по скорости гидролиза субстрата, GIp-Phe-pNA. Результаты адсорбционных и каталитических экспериментов для всех исследованных систем сведены в таблицу 2 (колонки 4 и 5).

Каталитическая активность фермента, иммобилизованного на поверхности исходных анионных и катионных микросфер (образцы 1 и 5 в таблице 2), была на порядки ниже его активности в растворе (последнюю принимали за 100%), но прогрессивно увеличивалась по мере возрастания числа полиэлектролитных слоев на поверхности микросфер. Иммобилизация ХТ на один слой полианиона повышала его активность до 18% (образец 2), иммобилизация на три слоя (полианион/поликатион/полианион) сохраняла 42% ферментативной активности (образец

3). Дальнейшее увеличение количества полимерных слоев (толщины полиэлектролитной прослойки) не оказывало заметного влияния на активность ХТ (44% активности, образец

4). Таким образом, трехслойное полиэлектролитное покрытие с анионным полимером на внешнем слое обеспечивало эффективную иммобилизацию фермента и высокий уровень его каталитической активности.

5. Тройные комплексы белок-катионный сополимер-вирус табачной мозаики.

Описанный выше подход - электростатическая адсорбция полиэлектролитов и белков на поверхности анионных микросфер - был использован для модификации коллоидных частиц биологического происхождения. В этом разделе мы описываем получение и свойства тройного комплекса, полученного последовательной адсорбцией катионного сополимера (КСпред) и затем белка на поверхности частиц вируса табачной мозаики (ВТМ). Растительные вирусы безопасны для человека и в то же время высоко иммуногенны, что позволяет использовать их в качестве носителей для иммобилизации различных по химической природе биологически активных веществ - полипептидных антигенов, лекарственных препаратов, ферментов - и разрабатывать новые биотехнологии для медицины и ветеринарии.

В качестве сорбентов для иммобилизации полимера и белка использовали нативный палочкообразный ВТМ (рис. 11а) и сферический термически модифицированный ВТМ2 (тер-ВТМ, рис. 116); последний был получен кратковременным нагреванием раствора ВТМ до 94-98°С.

а б

■ИННН

_1 рт

Рис. 11. Микрофотографии нашивного ВТМ (а) и тер-ВТМ (б). Просвечивающая электронная микроскопия, контрастирование 2% уранш ацетатом (а), сканирующая электронная микроскопия (б).

В растворах с рН, близким к нейтральному, частицы вируса заряжены отрицательно; поэтому катионный сополимер эффективно адсорбировался на поверхности

2) Предоставлен д.б.н. О.В.Карповой (биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова).

20

частиц. Данные микроэлектрофореза смеси ВТМ+поликатион показали, что адсорбция поликатиона приводила к перезарядке поверхности вирусных частиц (рис. 12а). Это позволяло адсорбировать на межфазном монослое поликатиона отрицательно заряженные синтетические полипептиды или нативные белки. Максимальное количество связанного с ВТМ поликатиона было определено методом спектрофотометрии после отделения комплекса ВТМ/поликатион и измерения оптической плотности супернатанта (рис. 126).

Рис. 12. а)Завиашость электрофоретической подвижности (ЭФП) частиц ВТМ от концентрации КС„ред и б) зависимость концентрации не связанного с микросферами КС„ред от его общей концентрации в суспензии. Концентрация ВТМ 1 мг/мл-1СГ2М ТРИС-НС1 буфер, рН 7.5.

За формированием тройного комплекса ВТМ/КС|/белок следили с помощью

метода флуоресценции; использовали БСА, ковалентно меченый ФИТЦ, который добавляли к комплексу ВТМ/ КС^д с максимальным содержанием поликатиона. Оказалось, что белок не регистрировался в супернатанте вплоть до [БСА]макс = 2х10"6М, которая соответствовала предельному заполнению поверхности бинарного комплекса белковыми глобулами. Для тер-ВТМ предельное заполнение поверхности достигалось при [БСА]макс = 1,5*10'5М.

Принцип последовательной адсорбции, лежащий в основе получения тройной системы вирион-поликатион-белок, был затем использован для электростатической иммобилизации на поверхности вириона рекомбинантного гидрофильного фрагмента гемаглютинина вируса гриппа (Р1и1-3). Иммуногенная активность полученного тройного комплекса ВТМ/КС,/Р1и1-3, оказалась значительно выше активности изолированного (не связанного с вирионом) фрагмента вируса гриппа Р1и 1-33.

') Эксперименты по определению иммуногенной активности выполнены Т.Н.Ерохиной (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН).

выводы

1. Впервые модификацией поли-4-винилпиридина бромистым этилом и бромуксусной кислотой синтезированы две серии катионных сополимеров: 1) с катионными и гидрофобными звеньями и 2) с катионными и гидрофильными электронейтральными (цвиггер-ионными) звеньями, и исследована их адсорбция на поверхности анионных боросиликатных микросфер (БСМ).

2. Показано, что устойчивость комплексов катионных сополимеров с БСМ в водно-солевых средах критическим образом зависит от содержания (мольной доли) катионных звеньев в макромолекуле (а). Сополимеры с гидрофобными звеньями необратимо связываются с микросферами при а > 0,24, с гидрофильными - при а > 0,15.

3. Впервые продемонстрирована способность адсорбированных молекул поликатионов перемещаться между БСМ, сделана оценка эффективного коэффициента латеральной диффузии макромолекул Бпк = 1,4' 10"12 см2/с (при 20 °С). Показано, что коэффициент диффузии возрастает при увеличении температуры и/или концентрации соли в окружающем растворе.

4. Путем чередующейся адсорбции поликатиона и полианиона получены полимерные мультислои на поверхности БСМ. Гидролитический фермент (а-химотрипсин), иммобилизованный на полимерном мультислое, сохраняет около 50% своей каталитической активности.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. A.C. Малинип, И.В. Калашникова, A.A. Рахнянская, A.A. Ярославов. Адсорбция катионных полимеров на поверхности анионных стеклянных микросфер. // Высокомолек. соед. Сер.А. 2012. Т. 54. № 1. С. 208-214.

2. H.A. Никитин, A.C. Малинин, A.A. Рахнянская, Е.А. Трифонова, О.В. Карпова, A.A. Ярославов, И.Г. Атабеков. Использование поликатионого спейсера для нековапентной иммобилизации альбумина на термически модифицированных вирусных частицах. // Высокомолек. соед. Сер.А. 2011. Т. 53. № 11. С. 1885-1891.

3. A.A. Ярославов, И.Б. Каплан, Т.Н. Ерохина, С.Ю. Морозов, А.Г. Соловьев, А.Д. Лещинер, A.A. Рахнянская, A.C. Малинин, Л.А. Степанова, О.И. Киселев, И.Г. Атабеков. Новый способ получения биологически активных нанокомплексов путем нековалентной конъюгации белков с вирусными частицами. // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. № 4. С. 441-447.

4. A.C. Малинин, A.A. Рахнянская, A.B. Бачева, A.A. Ярославов. Активность фермента, иммобилизованного на полиэлектролитных мультислоях. // Высокомолек. соед. Сер.А. 2011. Т. 53. № 1. С. 54-59.

5. И.Г. Атабеков, И.Б. Каплан, С.Ю. Морозов, А.Г. Соловьёв, Т.Н. Ерохина, О.В. Карпова, A.A. Ярославов, A.A. Рахнянская, A.C. Малинин. Биологически активный комплекс, обладающий протективной активностью против вируса гриппа. Патент РФ № 2427385. 29.12.2009.

6. И.Г. Атабеков, И.Б. Каплан, С.Ю. Морозов, А.Г. Соловьёв, О.В. Карпова, A.A. Ярославов, A.A. Рахнянская, A.C. Малинин. Способ получения биологически активного комплекса Патент РФ № 2427386. 29.12.2009.

7. A.S. Malinin, A.A. Rakhnyanskaya, A.A. Yaroslavov. Diffusion of polyelectrolytes adsorbed on glass microspheres // Book of Abstracts of 7th International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", 2011, Saint-Petersburg, Russia, p. 0-16.

8. H.A. Никитин, Е.А. Трифонова, A.C. Малинин, A.A. Рахнянская, О.В. Карпова, A.A. Ярославов, И.Г. Атабеков. Создание функционально активных комплексов на основе нового типа сферических наночастиц. // Сб. тезисов докладов Третьей Международной конференции "От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий к наноиндустрии", 2011, Ижевск, с. 109-110.

9. T.N. Erokhina, A.A. Yaroslavov, I.B. Kaplan, S.Yu. Morozov, A.G. Solovyev, J.G. Atabekov, A.A. Rakhnyanskaya, A.S. Malinin. A method to produce biologically active

nanocomplexes by non-covalent conjugation of proteins with viral particles // Book of Abstracts of 2nd Russian - Hellenic Symposium "Biomaterials and bionanomaterials: Recent Advances and Safety - Toxicology issues", 2011, Heraklion, Greece, c. 44.

10.A.C. Малинин, A.A. Рахнянская, A.A. Ярославов. Активность фермента, иммобилизованного на полиэлектролитных мультислоях // Сб. тезисов докладов Пятой Всероссийской Каргинской конференции "Полимеры - 2010", 2010, Москва, с. 145.

11.А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, А.А. Ярославов. Наноструктурированные полимерные слои на твёрдой поверхности. // Сб. тезисов докладов Второго международного конкурса научных работ молодых учёных в области нанотехнологий в рамках Международного форума по нанотехнологиям, 2009, Москва, секция "Углеродные волокна. Армидные волокна. Композиционные полимеры", с. 360-361.

12. А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, А.А. Ярославов. Влияние степени полимеризации адсорбированных полиэлектролитов на их подвижность. // Сб. тезисов докладов Юбилейной научной конференции, посвящённая 80-летию Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, 2009, Москва, с. 89.

13. И В. Калашникова, А.С. Малинин. Устойчивость последовательно адсорбированных полиэлектролитов // Сб. тезисов докладов XVI Конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009", 2009, Москва, секция "Химия ", подсекция "Высокомолекулярные соединения", с. 52.

14. A.S. Malinin, А.А. Rakhnyanskaya, А.А. Yaroslavov. Multilayer adsorption of polyelectrolytes on the surface of the glass microspheres. // Book of Abstracts of 7A International Symposium on Polyelectrolytes, 2008, Coimbra, Portugal, c. 99.

15.A.C. Малинин, A.A. Рахнянская, A.A. Ярославов. Мультислойная адсорбция полиэлектролитов и устойчивость полимерных слоёв. // Сб. тезисов XV Конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2008", 2008, Москва, секция "Химия Подсекция "Высокомолекулярные соединения", с. 159.

Подписано в печать:

04.10.2012

Заказ № 7676 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 И5230, Москва, Варшавское ш„ 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Малинин, Андрей Сергеевич

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

1. Адсорбция полиэлектролитов.

1.2. Кинетика адсорбции полиэлектролитов

1.3. Электростатические взаимодействия при адсорбции

1.4. Влияние молекулярной массы полиэлектролита на адсорбцию

1.5. Структура адсорбционного слоя

2. Взаимодействие полиэлетролитов с коллоидными частицами.

2.1. Взаимодействие поликатионов с частицами силикагеля

2.2. Адсорбция полиэлектролитов, содержащих гидрофобные блоки

2.3. Адсорбция полиамфолитов

3. Динамика адсорбированных макромолекул.

3.1. Теоретические представления о двумерной диффузии адсорбированных макромолекул и математическое моделирование процесса

3.2. Двумерная динамика реальных адсорбированных макромолекул 34 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Используемые материалы.

1.1. Полимеры

1.1. Белки

1.2. Низкомолекулярные реагенты

1.3. Вода

1.4. Борсиликатные стеклянные микросферы (БСМ)

2. Методы исследования.

2.1. Динамическое светорассеяние

2.2. Электрофоретическая подвижность

2.3. Флуориметрия

2.4. УФ-спектроскопия

2.5. Потенциометрия 53 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬ ТА TOB.

1. Адсорбция катионных сополимеров на поверхности анионных микросфер.

2. Миграция катионного сополимера между микросферами.

3. Латеральная подвижность катионного сополимера в тройной системе анионная микросфера-сополимер-линейный/сшитый полианион.

4. Полиэлектролитные слои с иммобилизованным а-химотрипсином.

5. Тройные комплексы белок-катионный сополимер-вирус табачной мозаики.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРА ТУРЫ.

 
Введение диссертация по химии, на тему "Комплексы катионных полимеров с анионными коллоидами: формирование, строение и свойства"

Адсорбция полиэлектролитов (полимеров с ионогенными группами) на противоположно заряженных твердых субстратах (стекле, полимере, металле) представляет собой простой и эффективный способ модификации поверхности [1-10], который востребован во многих технологических областях. Большой размер молекулы и, соответственно, наличие большого числа взаимодействующих с поверхностью участков позволяют полиэлектролитам формировать более устойчивые слои, чем адсорбированным низкомолекулярным веществам, причем широкое разнообразие полиэлектролитов по химической природе и молекулярной массе дает возможность направленного выбора вещества для придания поверхности заданных свойств. За счет регуляции гидрофильного/гидрофобного баланса поверхности [2, 11, 12] и изменения ее заряда [1, 4, 6, 10, 13, 14], адсорбированные слои полиэлектролитов обладают способностью обеспечивать солюбилизацию малорастворимых компонентов или же, напротив, флокуляцию частиц за счет нейтрализации их поверхностного заряда, иммобилизацию различных молекул за счет электростатических взаимодействий (в случае, например, белков) [1, 15, 16], или же антистатические и бактерицидные свойства поверхностей [17-20] и их защиту поверхностей от химического воздействия (например, от коррозии) [18, 21-25]. Соответственно, полиэлектролиты применяются в качестве флокулянтов для водо- и стокоочистки [26-33], для созданий покрытий биосенсоров [34-40], для стабилизации суспензий (в строительных материалах), а также они могут выступать как пластификаторы для бетонных смесей, значительно улучшая их реологические и физико-химические характеристики [41-56]. Кроме того, отдельным направлением является последовательная адсорбция катионных и анионных полимеров, которая позволяет получать полимерные слои контролируемой толщины, сохраняющие стабильность в широком интервале концентрации соли и рН раствора [10, 57-59].

Между тем, особый интерес представляют полимерные покрытия (моно и мультислойные), которые могут обратимо десорбироваться с поверхности при изменении внешних условий, например, концентрации соли и/или температуры

60-62]. Такие «лабильные» (возобновляемые) покрытия представляют интерес, например, в медицине, для конструирования носителей лекарственных веществ, катализаторов, сорбентов для извлечения токсичных соединений, антикоррозионных и биоцидных пленок, легкоощищаемых поверхностей и проч. [63-65].

Высокая стабильность межфазных электростатических комплексов полиэлектролит-поверхность достигается благодаря множественным солевым связям, в образовании которых участвуют ионогенные группы обоих компонентов [66-70]. Можно ожидать, что уменьшение количества заряженных групп в макромолекуле будет сопровождаться понижением устойчивости межфазного комплекса в водно-солевых средах и, как следствие, увеличения его способности к десорбции с поверхности при изменении внешних условий (температура, рН, ионная сила). Кроме того, свойства и структура полимерного слоя должны оказывать значительное влияние на состояние иммобилизованных таким образом молекул (например, каталитическую активность ферментов).

Таким образом, целью данной работы стал синтез сополимеров с различной долей катионных звеньев в макромолекуле, формирование комплексов сополимеров с анионными коллоидами, исследовании стабильности комплексов в водно-солевых средах, миграции адсорбированных макромолекул между коллоидными частицами и изучении функциональных свойств белков, адсорбированных на межфазных полимерных слоях.

 
Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

ВЫВОДЫ

1. Впервые модификацией поли-4-винилпиридина бромистым этилом и бромуксусной кислотой синтезированы две серии катионных сополимеров: 1) с катионными и гидрофобными звеньями и 2) с катионными и гидрофильными электронейтральными (цвиттер-ионными) звеньями, и исследована их адсорбция на поверхности анионных боросиликатных микросфер (БСМ).

2. Показано, что устойчивость комплексов катионных сополимеров с БСМ в водно-солевых средах критическим образом зависит от содержания (мольной доли) катионных звеньев в макромолекуле (а). Сополимеры с гидрофобными звеньями необратимо связываются с микросферами при а > 0.24, с гидрофильными при а > 0.15.

3. Впервые продемонстрирована способность адсорбированных молекул поликатионов перемещаться между БСМ, сделана оценка эффективного

12 2 коэффициента латеральной диффузии макромолекул Бпк = 1,4-10" см /с (при 20 °С). Показано, что коэффициент диффузии возрастает при увеличении температуры и/или концентрации соли в окружающем растворе.

4. Впервые путем чередующейся адсорбции поликатиона и полианиона получены полимерные мультислои на поверхности БСМ. Гидролитический фермент (а-химотрипсин), иммобилизованный на полимерном мультислое, сохраняет около 50% своей каталитической активности.

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Малинин, Андрей Сергеевич, Москва

1. Caruso F., Niikura К., Furlong D.N., Okahata Y. Assembly of Alternating Polyelectrolyte and Protein Multilayer Films for Immunosensing //Langmuir. 1997. V. 13. № 13. P. 3427-3433.

2. Elbert D.L., Herbert C.B., Hubbell J.A. Thin Polymer Layers Formed by Polyelectrolyte Multilayer Techniques on Biological Surfaces // Langmuir. 1999. V. 15. № 19. P. 5355-5362.

3. Donath E., Sukhorukov G.B., Caruso F., Davis S.A., Mohwald H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes // Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 1998. V. 37. № 16. P. 2201-2205.

4. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M., Mohwald H. Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles // Colloids Surf A. 1998. V. 137. № 1-3. P. 253-266.

5. Caruso F., Caruso R.A., Mohwald H. Nanoengineering of inorganic and hybrid hollow spheres by colloidal templating // Science. 1998. V. 282. № 5391. P. 11111114.

6. Dubas S.T., Iansamai Ch., Potiyaraj P. Optical alcohol sensor based on dye-Chitosan polyelectrolyte multilayers // Sens. Actuators. B. 2006. V. 113. № 1. P. 370-375.

7. Lee S.H., Kumar J., Tripathy S.K. Thin film optical sensors employing polyelectrolyte assembly // Langmuir. 2000.V. 16. № 26. P. 10482-10489.

8. Rubner M. F. pH-Controlled fabrication of polyelectrolyte multilayers: assembly and applications. Multilayer thin films. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 2002. P. 133-339.

9. Wong J.E., Ana M., Diez-Pascual, Richtering W. Layer-by-Layer assembly of polyelectrolyte multilayers on thermoresponsive Poly(NiPAM-co-MAA) microgel: effect of ionic strength and molecular weight //Macromol. 2009. V. 42. № 4. P. 1229-1238.

10. Multilayer Thin Films / Ed. by G. Decher, J.B. Schlenoff. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA, 2002.ll.Hwang J.J., Jaeger K., Hancock J., Stupp S.I. Organoapatite growth on an orthopedic alloy surface // J. Biomed. 1999. V. 47. P. 504-515.

11. Sangribsub S., Tangboriboonrat P., Pith T., Decher G. Hydrophobization of multilayered film containing layer-by-layer assembled nanoparticle by Nafion adsorption // Polym. Bull. 2005. V. 53. № 5.6. P. 425-434.

12. Radeva Ts., Stoimenova M. Electrooptic Study of Colloid Dispersions Stabilized by Poly electrolyte Adsorption // J. Coll. And Int. Sci. 1993. Vol. 160. № 2. P. 475478.

13. Wagberg L., Ondaral S., Enarsson L.E. Hyperbranched polymers as a fixing agent for dissolved and colloidal substances on fiber and Si02 surfaces // Ind. Eng. Chem. Res. 2007. V. 46. № 7. P. 2212-2219.

14. Keller S.W., Kim H.N., Mallouk T. E. Layer-by-Layer assembly of intercalation compounds and heterostructures on surfaces: toward molecular "Beaker" epitaxy // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. № 19. P. 8817-8818.

15. Lvov Yu., Mohwald H. Protein architecture: Interfacial molecular assembly and immobilization biothechnology. New York: Marcel Dekker. 2000.

16. Hattori H. Antireflection surface with particle coating deposited by electrostatic attraction // Adv. Mater. 2001. V. 13. № 1. P. 51-54.

17. Muller M., Rieser T., Lunkwitz K., Meierhaack J. Polyelectrolyte complex layers -a promising concept for antifouling coatings verified by in-Situ ATR FTIR spectroscopy // Macromol. Rapid Commun. 1999, V. 20. P. 607-611.

18. Li Q., Mahendra S., Lyon D., Brunet L., Liga M., Li D., Alvarez P. Antimicrobial Nanomaterials for Water Disinfection and Microbial Control: Potential Applications and Implications // Water Research. 2008. V.42. № 18. P. 4591-602.

19. Lichter J.A., Van Vilet K.J., Rubner M.F. Design of Antibacterial Surfaces and Interfaces: Polyelectrolyte Multilayers as a Multifunctional Platform // Macromol. 2009. V. 42. № 22. P. 8573-8586.

20. Andreeva D., Skorb E.V., Shchukin D.G. Layer-by-Layer polyelectrolyte/inhibitor nanostructures for metal corrosion protection // Appl. Mater. Interfaces. 2010. V. 2, №7. P. 1954-1962.

21. Farhat T.R., Schienoff J.B. Corrosion control using polyelectrolyte multilayers // Electrochem. Solid-State Lett. 2002. V. 5. № 4. P. B13-B15.

22. Grigoriev D.O., Köhler K., Skorb E., Shchukin D.G., Möhwald H. Polyelectrolyte complexes as "smart" depot for self-healing anticorrosion coatings // Soft Matter. 2009. V. 5. P. 1426-1432.

23. Shchukin D.G., Zheludkevich M., Yasakau K., Lamaka S., Möhwald H. Ferreira M.G.S. LbL Nanocontainers for Self-Healing Corrosion Protection // Adv. Mater. 2006. V. 18. P. 1672-1678.

24. Lamaka S.V., Shchukin D.G., Andreeva D.V., Zheludkevich M.L., Möhwald H., Ferreira M.G.S . Sol-Gel/Polyelectrolyte active corrosion protection system. //Advanced Functional Materials. 2008. V. 18. P. 3137-3147.

25. Rasteiro M.G., Garcia F.A.P., Ferreira P.J., Antunes E., Hunkeler D., Wandre C. Flocculation by cationic polyelectrolytes: relating efficiency with polyelectrolyte characteristics. // J.Appl. Polymer Sei. 2010. V. 116. P. 3603-3612.

26. Mortimer D. A. Synthetic polyelectrolytes—A review // Polymer International. 1991. V. 25. № l.P. 29-41.

27. Bolto B., Gregory J. Organic polyelectrolytes in water treatment // Water Res. 2007. V.41.P. 2301-2324.

28. Mahvi A.H., Razavi M. Application of polyelectrolytes in turbidity removal from surface water // American J. Applied Sei. 2005. V. 2. P.397-399.

29. Radoiu M.T., Martin D.I., Calinescu I., Iovu H. Preparation of polyelectrolytes for wastewater treatment // J. Hazard Mater. 2004. V.106. P. 19-24.

30. Barkâcs K., Bohuss I., Bukovszky A., Varga I., Zâray G. Comparison of polyelectrolytes applied in drinking water treatment // Microchemical J. 2000.V. 67. P. 271-277.

31. Kapoor J.K., Jabin S., Bhatia H.S., Kapoo N. Application of synthetic polyelectrolytes in turbidity removal from water. // J. Ind. Res. Tech. 2011. V. l.P. 114-118.

32. Shaughnessy R.J., Byeseda J.J., Sylvester N. D. Cationic polyelectrolyte flocculation of oil-water emulsions. Effects of mixing intensity and oil concentration. // Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 1983. V. 22. P. 473-478.

33. Chaniotakis N.A. Enzyme stabilization strategies based on electrolytes and polyelectrolytes for biosensor application. // Ana. Bioanal Chem. 2004. V. 378 . P. 89-95.

34. S. Yabuki. Polyelectrolyte complex membranes for immobilizing biomolecules, and their applications to bio-analysis. // Analytical Sciences. 2011. V. 27. № 7. P. 695-702.

35. Dimakis V.T., Gavalas V.G., ChaniotakisN.A. Polyelectrolyte-stabilized biosensors based on macroporous carbon electrode. // Analytica Chimica Acta. 2002. V. 467. P. 217-223.

36. Fiorentino D., Gallone A., Fiocco D., Palazzo G., Mallardi A. Mushroom tyrosinase in polyelectrolyte multilayers as an optical biosensor for o-diphenol. // Biosens. Bioelectron. 2010. V. 25. P. 2033-2037.

37. Gibson T.D., Pierce B.L.J., Hulbert J.N., Gillespie S. Improvements in the stability characteristics of biosensors using protein-polyelectrolyte complexes. //Sens. Act B: Chemical. 2001. V. 33. P. 13-18.

38. Narvaez A., Suarez G., Popescu I.C., Katakis I., Dominguez E. Reagentless biosensors based on self-deposited redox polyelectrolyte-oxidoreductases architectures. // Biosens. Bioelectron. 2000. V. 15.P. 43-52.

39. Wang D., Gong X., Heeger P.S., Rininsland F., Bazan G.C., Heege A.J. Biosensors from conjugated polyelectrolyte complexes. // PNAS. 2002 . V. 99 P. 49-53.

40. Concrete Admixtures Handbook. Properties, Science and Technology / Ed. by V.S. Ramachandran. Park Ridge: Noyes publications, 1988.

41. Handbook of plasticizers/ Ed. by G. Wypych. Toronto: ChemTee publishing, 2004.

42. Технология бетона / Ю. M. Баженов. Москва: Издательствово АСВ 3-е издание, 2002.

43. Модифицированные бетоны. Теория и практика / Батраков В.Г. Москва: Технопроект, 1998.

44. Sakai Е., Yamada К., Ohta A.J. Molecular Structure and Dispersion-Adsorption Mechanisms of Comb-tType Superplasticizers Used in Japan // J. Adv. Concrete Tech. 2003. V. 1. P. 16-25.

45. Aruntas H.Y., Cemalgil S., Simsek O., Durmus G., Erdal M. Effects of super plasticizer and curing conditions on properties of concrete with and without fiber //Matt. Sci. 2008. Vol. 62. № 19. p. 3441—3443.

46. Bojadjieva C., Glavchev I. Polymeric plasticizers for gypsum-free cement // Cement and Concrete Research. 2004. V. 34. № 4. P. 611-613.

47. Carazeanu I., Chirila E., Georgescu M. Investigation of the hydration process in 3Ca0-A1203-CaS04D D2H20-plasticizer-H20 systems by X-ray diffraction // Talanta. 2002. V. 57. № 4. P. 617-623.

48. Emoto Т., Bier T.A. Rheological behavior as influenced by plasticizers and hydration kinetics //Cement and Cocrete Research. 2007. V. 37. № 5. P. 647-654.

49. Chang D.Y., Chan S.Y.N., Zhao R.P. The combined admixture of calcium lignosulphonate and sulphonated naphthalene formaldehyde condensates // Construction and building materials. 1995. V. 9. № 4. P. 205-209.

50. E1H S., Eusebio L., Gronchi P., Ganazzoli F., Goisis M. Modeling the adsorption behavior of linear end-functionalized poly(ethylene glycol) on an ionic substrate by a coarse-grained Monte Carlo approach //Langmuir. 2010. V. 26. № 20. P. 1581415823.

51. Хаук Х.Г. Высокоэффективные пластификаторы на базе эфиров поликарбоксилатов. Потенциал применения в современных бетонных технологиях // ALITINFORM: Цемент. Бетон. Сухие смеси. 2007. № 1. С.78-84.

52. Шитиков Е.С., Кириллов A.M., Феднер JI.A., Ефимов С.Н., Самохвалов А.Б. Лигносульфонатные пластификаторы нового типа для бетонных смесей и бетонов различного направления // Строительные материалы. 2002. № 6. С. 36-37.

53. Kong J.K., Bike S.G., Li V.C. Electrosteric stabilization of concentrated cement suspensions imparted by a strong anionic polyelectrolyte and a non-ionic polymer //Cement and Concrete Research. 2006. V.36. № 5. P. 842-850.

54. Bertrand P., Jonas A., Laschewsky A., Legras R. Ultrathin polymer coatings by complexation of polyelectrolytes at interfaces: suitable materials, structure and properties //Macromol. Rapid Comm. 2000. V. 21. № 7. P. 319-348.

55. Baur J.W., Rubner M.F., Reynolds J.R., Kim S. Förster energy transfer studies of polyelectrolyte heterostructures containing conjugated polymers: □ A means to estimate layer interpenetration //Langmuir. 1999. V. 15. № 19. P. 6460-6469.

56. Sun B., Mutch S.A., Lorenz R.M., Chiu D.T. Layered polyelectrolyte-silica coating for nanocapsules // Langmuir. 2005. V. 21. № 23. P. 10763-10769.

57. Rojas O.J., Ernstsson M., Neuman R.D., Claesson P.M. Effect of polyelectrolyte charge density on the adsorption and desorption behavior on mica // Langmuir. 2002. V. 18. № 5. P. 1604-1612.

58. Hansupalak N., Santore M.M. Polyelectrolyte desorption and exchange dynamics near the sharp adsorption transition^ Weakly Charged Chains // Macromolecules. 2004. V. 37. № 4. P. 1621-1629.

59. Kato N., Schuetz P., Fery A., Caruso F. Thin Multilayer Films of Weak Polyelectrolytes on Colloid Particles // Macromolecules. 2002. V. 35. № 26. P.9780-9787.

60. Scranton A.B., Rangarajan B., Klier J. Biomedical applications of polyelectrolytes // Advances in Polymer Science. 1995. V. 122. P. 1-54.

61. Wolgemuth C.W., Mogilner A., Oster G. The hydration dynamics ofpolyelectrolyte gels with applications to cell motility and drug deliver // Eur. Biophys J. 2004. V. 33. P. 146-158.

62. Jiang B., Barnett J.B., Li B. Advances in polyelectrolyte multilayer nanofilms as tunable drug delivery system // Nanotechnology, Science and Applications. 2009. V.2.P. 21-27.

63. Castelnovo M., Joanny J.F. Formation of Polyelectrolyte Multilayers // Langmuir. 2000. V. 16. №19. P. 7524-7532.

64. Shiratori S.S., Rubner M.F. pH-Dependent Thickness Behavior of Sequentially Adsorbed Layers of Weak Polyelectrolytes // Macromolecules. 2000. V. 33. №11. P.4213.

65. Lee L., Cavalieri F., Johnston A.P.R., Caruso F. Influence of Salt Concentration on the Assembly of DNA Multilayer Films //Langmuir. 2010. V. 26. № 5. P. 34153422.

66. Lee L., Johnston A.P.R., Caruso F. Manipulating the Salt and Thermal Stability of DNA Multilayer Films via Oligonucleotide Length // Biomacromolecules. 2008. V. 9. № 11. P. 3070-3078.

67. Van Tassel P.R. Polyelectrolyte adsorption and layer-by-layer assembly: Electrochemical control // Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2012. V.17. № 2. P. 106-113.

68. Scaling Concepts in Polymer Physics /de Gennes P. G. New York: Cornell University Press. 1979.

69. Edwards S.F. The statistical mechanics of polymers with excluded volume // Proc. Phys. Soc. 1965. V. 85. P. 613-624.

70. Edwards S.F. The theory of polymer solutions at intermediate concentration // Proc. Phys. Soc. 1966. V. 88. P. 265-280.

71. Schmid F. Self-consistent-field theories for complex fluids // J. Phys. Condens. Matter. 1998. V.10. № 37. P. 8105-8138.

72. Fredrickson G.H., Ganesan V., Drolet F. Field-Theoretic Computer Simulation Methods for Polymers and Complex Fluids // Macromolecules. 2002. V.35. № 1. P. 16-39.

73. Qiao B., Zhao D. A theory of polymer solutions without the mean-field approximation in Flory-Huggins theory //J. Chem. Phys. 2004. V. 121. № 10. P. 4968-5023.

74. Jimenez J., de Joannis J., Bitsanis I., Rajagopalan R. Interaction between undersaturated polymer layers: □ computer simulations and numerical mean-field calculations //Macromol. 2000. V. 33. № 22. P. 8512-8519.

75. Gerasimchuk I.V., Sommer J.U. Mean-field treatment of polymer chains trapped between surfaces and penetrable interfaces // Phys. Rev. E. 2007. V. 76. № 4. P. 041803.

76. Meneghetti P., Qutubuddin S Application of mean-field model of polymer melt intercalation in organo-silicates for nanocomposites //J. Coll. and Int. Sci. 2005. V. 288. №2. P. 387-389.

77. Ganesan V., Pryamitsyn V. Dynamical mean-field theory for inhomogeneous polymeric systems // J. Chem. Phys. 2003. V. 118. № 10. P. 4354-4358.

78. Surfactants and Polymers in Aqueous Solution / Holmberg K., Jonsson B., Kronberg B., Lindman B. Chicester: John Wiley & Sons Ltd. 2002.

79. Polymers at Interfaces / Fleer G. J., Cohen-Stuart M. A., Scheutjens J. M. H. M., Cosgrove T., Vincent B. London: Elsevier. 1993.

80. Scheutjens J. M. H. M., Fleer G. J. Statistical theory of the adsorption ofinteracting chain molecules. 1. Partition function, segment density distribution, and adsorption isotherms // J. Phys. Chem. 1979. V. 83. № 12. P. 1619-1635.

81. Scheutjens J. M. H. M., Fleer G. J. Statistical theory of the adsorption of interacting chain molecules. 2. Train, loop, and tail size distribution // J. Phys. Chem. 1980. V. 84. № 2. P. 178-190.

82. Scheutjens J. M. H. M., Fleer G. J. Interaction between two adsorbed polymer layers // Macromolecules. 1985. V. 18. № 10. P. 1882-1900.

83. Miklavic S.J., Marcelja S. Interaction of surfaces carrying grafted polyelectrolytes // J. Phys. Chem. 1988. V. 92. № 23. P. 6718-6722.

84. Miklavic S.J. Self-consistent field theory for confined polyelectrolyte chains: comment. // J. Phys. Chem. 1993. V. 97. № 15. P. 3924-3926.

85. Miklavic S.J., Ninham B.W. Competitiion for adsorption sites by hydrated ions // J. Coll. and Int. Sci. 1990. V. 134. № 2. P. 305-311.

86. Kjellander R., Marcelja S. Double-layer interaction in the primitive model and the corresponding Poisson-Boltzmann description // J. Phys. Chem. 1986. V. 90. № 7. P. 1230-1232.

87. Podgornik R. Self-consistent-field theory for confined polyelectrolyte chains //J. Phys. Chem. 1992. V. 96. № 2. P. 884-896.

88. Blokhuis E. M., Skau K.I., Bonet Avalos J. Free energy formalism for polymer adsorption: Self-consistent field theory for weak adsorption // J. Chem. Phys. 2003. V. 119, №6. P. 3483-3495

89. Solutions onto a Flat Surface // Macromolecules. 1996. V. 29. № 6. P. 2179-2196. 96. Semenov A. N. Theory of Long-Range Interactions in Polymer Systems // J. Phys.1.. 1996. V.6. № 12. P. 1759-1780.

90. Cohen Stuart M., Hoogendam C.W., de Keizer A. Kinetics of polyelectrolyte adsorption // J. Phys. Condens. Matter. 1997. V. 9. № 37. P. 7767-7784.

91. Cohen Stuart M.A., Fleer G.J. Adsorbed polymer layers in nonequilibrium situations // Annu. Rev. Mater. Sci. 1996. V. 26. P. 463-500.

92. Dijt J.C., Cohen Stuart M.A., Hofman J.E., Fleer G.J. Kinetics of polymer adsorption in stagnation point flow // Coll. Surf. 1990. V. 51. P. 141-158.

93. Dijt J.C., Cohen Stuart M.A., Fleer G.J. Competitive adsorption kinetics of polymers differing in length only // Macromolecules. 1994. V.27. P. 3219-3228.

94. Rebar V.A., Santore M.M. Molecular weight effects and the sequential dynamic nature of poly(ethyleneoxide) adsorption on silica from polydisperse aqueous solution // Macromolecules. 1996. V. 29. P. 6273-6283.

95. Santore M.M., Fu Z. Direct measurement of molecular-weight driven competition during polymer adsorption // Macromolecules. 1997. V. 30. P. 8516— 8517.

96. Fuchs N. Influence of the charge of aerosols on their stability // Z. Physik. 1934. V.89. P. 736-742.

97. Aoki K., Adachi Y. Kinetics of polyelectrolyte adsorption onto polystyrene latex particle studied using electrophoresis: Effects of molecular weight and ionic strength // J. Coll. and Int. Sci. 2006. V. 300. № 1. P. 69-77.

98. Cosgrove Т., Obey Т. M., Vincent B. The configuration of sodium poly(styrene sulfonate) at polystyrene/solution interfaces //J. Colloid Interface Sci. 1986. V. 111. P. 409-418.

99. Matuszewska В., Norde W., Lyklema J. Competitive adsorption of human plasma albumin and dextran on silver iodide. //J. Colloid Interface Sci. 1981. V. 84. P. 403-408.

100. Polymer surfaces and interfaces / ed. M. Stamm. Springer. 2008.

101. Buron C.C., Filiatre C., Membrey F., Bainier C., Charraut D., Foissy A. Effect ofsubstrate on the adsorption of polyelectrolyte multilayers: Study by optical fixed-anglereflectometry and AFM // Colloids and Surfaces A. 2007. V. 305. P. 105-111.

102. Solis F. J., Olvera de la Cruz M. Surface-induced layer formation in polyelectolytes. //J. Chem. Phys. 1999. V. 110. P. 11517-11522.

103. Netz R. R., Joanny J. F. Adsorption of semi-flexible polyelectrolyte on charged planar surfaces: charge overcompensation, charge reversal and multilayer formation. IIJ. Phys.: Condens. Matter. 2000. V. 12. P. 117.

104. Адсорбция полимеров / Липатов Ю.С., Сергеева Л.М. Киев: «Наукова думка». 1972.

105. Chibowski. S. Dependence of the adsorption behavior of polyvinyl alcohol at the polystyrene latex solution interface on the molecular weight. //J. Colloid Interface Sci. 1990. V. 143. P. 174-180.

106. Schlenoff J.B., Dubas S.T. Mechanism of polyelectrolyte multilayer growth: □ charge overcompensation and distribution// Macromolecules. 2001. V. 34. № 3. P. 592-598.

107. Messina R., Holm C., Kremer K. Polyelectrolyte Multilayering on a Charged Sphere // Langmuir. 2003. V. 19. № 10. P. 4473-4482.

108. Lowack K., Helm C.A. Molecular mechanisms controlling the self-assembly process of polyelectrolyte multilayers // Macromolecules. 1998. V. 31. №2. P. 823833.

109. Jenkel F., Rumbach B. Uber die adsorption von hochmolekulares stoffen aus der losung. HZ. Electrochem. 1951. V. 55. P. 612-619.

110. Koral I., Ulman R., Eirich F. The adsorption of polyvinyl acetate //J. Phys. Chem. 1958. V. 62. P. 541-550.

111. Patat F., Schliebener C. Die adsorption von makromolekulen. I. Uber eine neue messmethode //Macromol. Chem. 1961. V. 44. P. 643-668.

112. Heller L. W., Bhatnager H. L., Nakagaki M. Theoretical investigations on the light scattering of spheres. XIII. The " Wavelength Exponent" of differential turbidity spectra //J. Chem. Phys. 1962. V. 36. P. 1163-1194.

113. Липатов Ю. С., Фабуляк Ф. Г. Энтальпия и энтропия активирования релаксационных процессов в поверхностном слое полимера. //Высокомол. соед. 1970. Т. Б12. С. 871-875.

114. Radeva Ts., Milkova V., Petkanchin I. Structure of polyelectrolyte layers on colloidal particles at different ionic strengths //Coll. and Surf. A. 2002. Vol. 209. P. 227-233.

115. Pettersson A., Marino G., Pursiheimo A., Rosenholm J.B. Electrosteric Stabilization of A1203, Zr02, and 3Y-Zr02 Suspensions: Effect of Dissociation and Type of Polyelectrolyte // J. Coll. and Int. Sci. 2000. V. 228. № 1. P.73-81.

116. Gurovitch E., Sens P. Adsorption of polyelectrolyte onto a colloid of opposite charge // Phys. Rev. Lett. 1999. V. 82. №,2. P. 339-342.

117. Dzubiella J., Moreira A.G., Pincus P.A. Polyelectrolyte-Colloid complexes:□ polarizability and effective interaction // Macromolecules. 2003. Vol. 36. № 5. P. 1741-1752.

118. Dahlgren M.A.G. Effect of counterion valency and ionic strength on polyelectrolyte adsorption // Langmuir. 1994. V. 10. № 5. P. 1580-1583.

119. Shubin V. Adsorption of cationic polymer onto negatively charged surfaces in the presence of anionic surfactant // Langmuir. 1994. V. 10. № 4. P. 1093-1100.

120. Rojas O. J., Claesson P.M., Muller D., Neuman R.D. The effect of salt concentration on adsorption of low-charge-density polyelectrolytes and interactions between polyelectrolyte-coated surfaces// J. Coll. and Int. Sci. 1998. V. 205. № 1. P.77-88.

121. Liufu S.C., Xiao H.N., Li Y.P. Adsorption of cationic polyelectrolyte at the solid/liquid interface and dispersion of nanosized silica in water // J. Coll. and Int. Sci. 2005. V. 285. № 1. P.33-40.

122. Liu J.F., Min G., Ducker W.A. AFM study of adsorption of cationic surfactants and cationic polyelectrolytes at the silica-water Interface // Langmuir. 2001. Vol.17. № 16. P. 4895-4903.

123. Boufi S., Baklouti S., Pagnoux C., Baumard J.F. Interaction of cationic and anionic polyelectrolyte with Si02 and A1203 powders // J. Eur. Ceramic Soc. 2002. V. 22. P. 1493-1500.

124. Schwarz S., Nagel J., Janke A., Jaeger W., Bratskaya S. Adsorption of polyelectrolytes with hydrophobic parts // Progr. Coll. Polym. Sci. 2006. V. 132. P. 102-109.

125. Bolto B.A., Dixon D.R., Gray S.R., Chee H., Harbour P.J., Ngoc L., Ware A.J. The use of soluble organic polymers in waste treatment. // Water Sci. Technol. 1996. V. 34. p. 117-125.

126. Dobrynin A.V., Rubinstein M., Joanny J.F. Adsorption of a polyampholyte chain on a charged Surface // Macromolecules. 1997. Vol. 30. № 14. P. 4332-4341.

127. Curme H.G., Natale C.C. The adsorption of gelatin to a silver bromide sol // J. Phys. Chem. 1964. V. 68. № 10. P. 3009-3016.

128. Kawanishi N., Christenson H., Ninham B. Measurement of the interaction between adsorbed poly electrolytes: gelatin on mica surfaces // J. Phys Chem. 1990. V. 98. № 11. P. 4611-4617.

129. Vaynberg A.K., Wagner N.J., Sharma R., Matric P.J. Structure and extent of adsorbed gelatin on acrylic latex and polystyrene colloidal particles // J. Coll. and Int. Sci. 1998. V. 205. № 1. P. 131-140.

130. Zhulina E.B., Dobrynin A.V., Rubinstein M. Adsorption Isotherms of Polyampholytes at Charged Spherical Particles // J. Phys Chem. B. 2001. V. 105. P. 8917-8930.

131. Dobrynin A.V., Colby R.H., Rubinstein M. Polyampholytes // J. Polym. Sci. B. 2004. V. 42. P. 3513-3538.

132. Dobrynin A.V., Rubinstein M. Theory of polyelectrolytes in solutions and at surfaces // Prog. Polym. Sci. 2005. V. 30. P. 1049-1118.

133. Milchev A., Binder K. Static and dynamic properties of adsorbed chains at surfaces: Monte Carlo simulation of a bead-spring model // Macromolecules. 1996. V. 29. P.343-354.

134. Chakraborty A.K., Adriani P.M. Glassy relaxation at polymer-solid interfaces // Macromolecules. 1992. V. 25. № 9. P. 2470-2473.

135. Lai P.Y. Statics and dynamics of a polymer chain adsorbed on a surface: Monte Carlo simulation using the bond-fluctuation model // Phys. Rev. E. 1994. V. 49. № 6. P. 5420-5430.

136. Введение в физико-химию полимеров / Аскадский А.А., Хохлов А.Р. Москва: Научный мир. 2009.

137. Kremer К., Binder К. Dynamics of polymer chains confined into tubes: Scaling theory and Monte Carlo simulations // J Chem. Phys. 1984. Vol. 81. № 12. P.63816395.

138. Dacheng W., Delu Z., Renyuan Q. Monte Carlo simulation of a confined random-walk chain //Polymer. 1986. V. 27. P. 1087-1090.

139. Das A.K. Hong P.D. Forced translocation of polymer chains through a nanotube: A case of ultrafiltration // Polymer. 2010. V. 51. P. 2244-2254.

140. Jeon J., Chun M.S. Structure of flexible and semiflexible polyelectrolyte chains in confined spaces of slit micro/nanochannels // J. Chem. Phys. 2007. V. 126. P. 154904.

141. Pokrovskii V.N. A justification of the reptation-tube dynamics of a linear macromolecule in the mesoscopic approach // Physica A. 2006. V. 366. P. 88-106.

142. Pokrovskii V.N. Reptation and diffusive modes of motion of linear macromolecules // J. Exp. and Theor. Phys. 2008. V. 106. P. 604-607.

143. Leiderman K., Steinberg S. High-resolution models of motion of macromolecules in cell membranes // Math, and Comp. in Simulation. 2008. V. 77. P. 389-399.

144. Statistical Analysis of Spherical Data / N.I. Fisher, T. Lewis, B.J.J. Embleton. Cambridge: Cambridge University Press. 1987.

145. Muthukumar M. Brownian dynamics of polymer chains in membranes // J. Chem. Phys. 1985. V. 82. P. 5696-5706.

146. Noda I. Recent advancement in the field of two-dimensional correlation spectroscopy // J. Mol. Structure. 2008. V. 883-884. P. 2-26.

147. Eggl P., Pink D., Quinn B., Ringsdorf H., Sackmann E. Diffusion in Quasi Two-Dimensional Macromolecular Solutions // Macromolecules. 1990. V. 23. P. 3472-3480.

148. Seiffert S., Oppermann W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope // J. Microscopy. 2005. V. 220. P. 20-30.

149. Abney J.R., Scalettar B.A., Owicki J.C. Self diffusion of interacting membrane proteins // J. Biophys. 1989. V. 55. P. 817-833.

150. Hashimoto Т., Tsukahara Y., Kawai H. Dynamic small-angle X-ray scattering studies on diffusion of macromolecules in bulk. 2. Principle and preliminary experimental results // Macromolecules. 1981. V. 14. P. 708-715.

151. Polymer dynamics: Long Time Simulations and Topological Constraints / Kremer K. Berlin: Springer-Verlag. 2006.

152. Bae S.C., Xie F., Jeon S., Granick S. Single isolated macromolecules at surfaces // Current Opinion in Solid State and Material Science. 2001. V. 5. P. 327-332.

153. Sukhishvili S. A., Chen Y., Muller J. D., Gratton E., Schweizer K. S., Granick S. Diffusion of polymer "pancake". //Nature. 2000. V. 406. P. 146.

154. Maier В., Radler O. Conformation and self-diffusion of single DNA molecules confined to two dimensions. // Phys. Rev. Lett. 1999. V. 82. P. 1911-1914.

155. Kumaki J., Kawauchi Т., Yashima E. Peculiar 'reptational' movements of single synthetic polymer chains on substrate observed by AFM. // Macromol. Rapid. Commun. 2008. V. 29. P. 406-411.

156. Zhao J., Granick S. How polymer surface diffusion depends on surface coverage // Macromolecules. 2007. V. 40. P. 1243-1247.

157. Brito R.O., Marques E.F. Neat DODAB vesicles: Effect of sonication time on the phase transition thermodynamic parameters and its relation with incomplete chain freezing.// Chem Phys Lipids. 2005. Vol. 137. p. 18

158. Maier В., Radler J.O. DNA on fluid membranes: A model polymer in two dimensions // Macromolecules. 2000. V. 33. P. 7185-7194.

159. Kahl V., Hennig M., Maier В., Radler J.O. Conformational dynamics of DNAelectrophoresis on cationic membranes // Electrophoresis. 2009. V. 30. P. 1276-1281.

160. Fuoss, R.M.; Strauss, U.P. Poly-4-vinylpyridonium chloride and poly-4-vinyl-N-butylpyridonium bromide // J. Polym. Sci. 1948. № 3. P. 246.

161. Нестеренко П.Н., Иванов A.B., Талева H.A., Сеневератне Дж. Б. // Журн. аналит. химии. 1997. Т. 52. №8. С. 814.

162. Lee C.M., Pearce E.M., Kwei Т.К. Viscosity and light scattering studies of poly(4-vinylpyridine N-oxide) in solution // Polymer. V. 37. № 19. P. 4283-4288.

163. Фоменко O.E., Рёсснер Ф. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. № 5. С. 633.

164. Рахнянская А.А., Пебалк И.Д., Орлов В.Н., Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Ярославов А.А. Контролируемая адсорбция-десорбция катионных полимеров на поверхности анионных латексных частиц // Высокомолек. соед. А. 2010. Т. 52. №5. С. 761.

165. Enzymes of Molecular Biology / Ed. by M.M. Burrell. Totowa: Humana Press, 1993. V. 16. P. 277.

166. Lewis D., Whateley T.L. Adsorption of enzymes at the solid-liquid interface: I. Trypsin on polystyrene latex // Biomaterials. 1988. V. 9. №1. P. 71.

167. Zoungrana Т., Findenegg G.H., Norde W. Structure, Stability, and Activity of Adsorbed Enzymes // J. Colloid Interface Sci. 1997. V. 190. № 2. P. 437-448.

168. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, H.JI. Клячко, А.В. Левашов, К. Мартинек, В.В. Можаев, Ю.Л. Хмельницкий. Москва: «Высшая школа». 1987.

169. Mohy Eldin M.S., Portaccio M., Diano N., Rossi S., Bencivenga U., D'Uva A., Canciglia P., Gaeta F.S., Mita D.G. Influence of the microenvironment on the activity of enzymes immobilized on Teflon membranes grafted by g-radiation //

170. J. Mol. Cat. B. 1999. V. 7. P. 251-261.

171. Fersht A.R., Renard M. pH Dependence of chymotrypsin catalysis // Biochemistry. 1974. V. 13. № 7. P. 1416-1426.

172. Теплопроводность твёрдых тел / Карслоу Г., Егер Д. Москва: Наука. 1964.

173. Справочник по точным решениям уравнений тепло- и массопереноса / Полянин А.Д., Вязьмин А.В. и др. Москва: Факториал. 1998.