Комплексы полиамфолитов с липидными мембранами: формирование, строение и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Ситникова Татьяна Александровна

КОМПЛЕКСЫ ПОЛИАМФОЛИТОВ с липидными МЕМБРАНАМИ: ФОРМИРОВАНИЕ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА.

02.00.06- высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 ^ МАЙ 2011

МОСКВА-2011

4846883

Работа выполнена в лаборатории синтеза и изучения свойств полимеров кафедры высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ярославов Александр Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Штильман Михаил Исаакович доктор химических наук, профессор Литманович Андрей Аркадьевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится 08 июня 2011 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д.1, стр.3, МГУ имени М.В.Ломоносова, Химический факультет, Лабораторный корпус «А», кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова.

Автореферат разослан мая 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета /

к.х.н. WînX^/^t—- Долгова А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последнее время синтетические полиэлектролиты находят все большее применение в различных областях биологии и медицины. На их основе разработаны новые иммуностимуляторы и средства доставки генетического материала в клетки. Показано, что полиэлектролиты обладают антикоагулянтной и антивирусной активностью, а также антимикробными и противоопухолевыми свойствами. Постоянное расширение спектра биомедицинских применений полиэлектролитов делает необходимым исследовать их поведение в биологическом окружении и, в первую очередь, механизмы их взаимодействия с клетками. При рассмотрении физико-химических аспектов такого взаимодействия наряду с клетками часто используют модельные системы, среди которых широкое распространение получили сферические бислойные везикулы (липосомы), сформированные из липидов и синтетических липидоподобных соединений.

Основное внимание в этих работах было уделено катионным и неионным полимерам. Первые были выбраны из-за их высокого сродства к отрицательно заряженным клеточным и модельным липидным мембранам. Интерес к неионным блоксополимерам полиэтиленоксида и полипропиленоксида (плюроникам) был связан с их способностью ускорять мембранный транспорт низкомолекулярных биологически активных веществ. Оказалось однако, что наряду с очевидными положительными эффектами поликатионы характеризуются довольно высоким уровнем цитотоксичности. Нетоксичные шиороники демонстрируют низкую аффинность к биологическим мембранам. Это заставляет обратиться к поиску новых полимеров с минимальной цитотоксичностью, способных эффективно адсорбироваться на клеточной мембране.

Цель работы состояла в синтезе полиамфолитов - полимеров, содержащих в своем составе катионные и анионные группы, в исследовании их комплексообразования с анионными липосомами и цитотоксичности полученных полимеров.

В работе:

синтезированы полиамфолиты с катионными и анионными группами в каждом звене, с бетаиновыми и катионными группами и с бетаиновыми группами и боковыми цетильными радикалами;

исследованы:

- формирование комплексов полиамфолитов с анионными липосомами;

- структурные перестройки в липосомальных мембранах под действием полиамфолитов;

- целостность липидных мембран в контакте с полиамфолитами;

- стабильность комплексов полиамфолит-липосома в водно-солевых средах;

- цитотоксичность полученных полимеров по отношению к нормальным клеткам карциномы молочной железы человека.

Научная новизна. С помощью модификации поли-4-винилпиридина ю-бромкарбоновыми кислотами и бромистыми алкилами синтезированы три группы полиамфолитов: 1) с катионными и анионными группами в каждом звене (полибетаины, ПБ), 2) с бетаиновыми и катионными группами (ПБК) и 3) с бетаиновыми группами и боковыми цетильными радикалами (ПБЦ). Впервые показано, что варьирование длины развязки в бетаиновой группировке позволяет реализовать различные варианты поведения полибетаина в суспензии анионных липосом: от отсутствия взаимодействия («мирного сосуществования») до значительных структурных перестроек в липосомальной мембране, вызванных адсорбцией полимера («агрессивного комплексообразования»). Установлено, что введение в молекулу полибетаина катионных или гидрофобных звеньев приводит к повышению стабильности комплексов полимер-липосома в водно-солевых растворах. Впервые показано, что цитотоксичность синтезированных полиамфолитов на 1-2 порядка ниже цитотоксичности поликатиона схожего строения, поли-№этил-4-винилпиридиний бромида (ПЭВП), той же степени полимеризации.

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании модельной системы полиамфолит-липосома, имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических полиэлектролитов с клетками. Описанная в работе взаимосвязь между строением бетаиновой группировки (длиной метиленовой развязки в ней) и реакцией липидной мембраны на присутствие полиамфолита может быть использована для реализации различных вариантов поведения полиэлектролитов в биологическом окружении. Низкая токсичность делает полиамфолиты перспективным объектом для иммобилизации биологически активных веществ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 3-ей Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры - 2004» (Россия, Москва, 2004), 3-ем Международном симпозиуме «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур» (Россия, Казань, 2004), 5-ом Международном симпозиуме «Молекулярная подвижность и упорядоченность в полимерных системах) (Россия, Санкт- Петербург, 2005), 4-ой Всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку» (Россия, Москва, 2007), Европейском полимерном конгрессе (Словения, Портороз, 2007), 2-ом Международном форуме по ианотехнологиям (Россия, Москва, 2009), Юбилейной научной конференции, посвященной 80-летию химического факультета МГУ (Россия, Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 48 рисунков, 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 144 ссылок.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В обзоре литературы проанализированы приведенные в литературе данные по строению и свойствам липосом и ленгмюровских монослоев, адсорбции катионных полимеров на поверхности липосом и монослоев и структуре липидных мембран в комплексе с поликатионами.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования. Использованные в работе полиамфолиты представлены в Таблице 1. Состав полимеров определяли методом ИК спектроскопии. Степень полимеризации всех полимеров была равна 600. Концентрация полимеров приведена в молях кватернизованных (пиридиниевых) групп на литр раствора.

Для получения липосом использовали этанольные или хлороформные растворы анионных липидов: дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ2") и диолеоилфосфатидилглицерола (ДОФГ1"); цвиттер-ионных (электронейтральных) липидов: яичного лецитина (фосфатидилхолина, ФХ) и дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ); и флуоресцентно меченых липидов: 1,2-диолеоил-глицеро-З-фосфоэтаноламин-М-(карбоксифлуоресцеина) (ДОФЭА-КФ) и дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина, меченного нитробензоксодиазолом (ДПФЭ-НБД) (Рис. 1).

Ультразвуковой обработкой суспензии липидов в воде получали малые моноламеллярные липосомы ФХ/КЛ2' и ДПФХ/ДОФГ1" с мольной долей отрицательно заряженных "головок" v(-) = 2[КЛ2"]/(2[КЛ2"]+[ФХ]) или v(-) = [ДОФГ1 "]/([ДОФГ'] + [ДПФХ]) = 0,2. Размер (гидродинамический диаметр) липосом колебался от эксперимента к эксперименту, но не выходил за пределы интервала 50-80 нм. Электрофоретическую подвижность (ЭФП) липосом определяли методом лазерного микроэлектрофореза. В работе использовали также методы флуоресцентной и ИК спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), кондуктометрии. Воду для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим последовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр

для удаления крупных частиц. Эксперименты проводились в 0,01 М фосфатном или боратном буферных растворах с рН 7,0 или 9,2 соответственно.

Таблица 1. Составы использованных в работе полиамфолитов.

Группа полимеров Полимер а Р У 8

N - ПБ, (п=1) 0,98 0,02

1 к 1 т О Л ЧГ ЬГ ПБ„ (СНг)п соо а = к/(к+т), 8 = т/(к+т) ПБ2 (П=2) 0,98 0,02

ПБз (п=3) 0,70 0,30

ПБ4 (п=4) 0,68 0,32

ПБ5 (п=5) 0,73 0,27

ПБК-5 0,33 0,63 0,04

1 к 1 -т 6 6_6 N N Вг N (СН2)г СН2 СОО- СН3 ПБК а= к/(к+1+т), Р = 1/(к+1+т), 5 = т/(к+1+т) ПБК-4 0,39 0,57 0,04

ПБК-3 0,50 0,45 0,05

ПБК-2 0,58 0,28 0,04

ПБК-1 0,80 0,16 0,04

•V V N I 1 I т ПБЦ-1 0,93 0,03 0,04

п п п N N Вг N (СН2)2 (СН2)15 ПБц СОО" сн3 а = к/(к+1+т), у = 1/(к+1+т), 8 = га/(к+1+т) ПБЦ-2 0,90 0,05 0,05

ПБЦ-3 0,90 0,08 0,02

ПБЦ-4 0,84 0,13 0,03

ОЫа* I

О=Р—0-СН2-СН2 О

М+(СН3)3

сн,

н,с-

-сн "I I

0 о

1 I о=с с=о

I I я

ФХ(Я = С,6-С2„) ДПФХ (Я = С/5)

ОЫа+ ОН I I

0=р—о-сн2-сн—СН2ОН

0

1

сн2

н,с—сн

I I

0 о

1 I о=с с=о

I I

я и

ДОФГ1- (Я = Сп)

»N8* ^(СНз)з

I Н2 I 0=р—о—с -сн, I

0

1

сн2 I

н2с—сн I I о о

о=с с=о

О'Ма"

он

I

ОМа*

0=р—о-сн2-снсн2-о—Р==0

0

1

сн, I

н2с—сн I I

0 о

1 I о=с с=о

I I и я

0

1

сн, I

НС—сн2 I I

0 о

1 I

0=С С=0 I I я я

КЛ (Я = С,6-С20)

ДПФЭ-ИБД (Я = Сп)

оын^ I

О=Р—о-сн2-сн2-мн-1;

0

1

сн2 I

н2с—сн I I

0 о

1 I о=с с=о

I I я я

ДОФЭА-КФ (Я = С, 7)

Рисунок 1. Структурные формулы использованных в работе липидов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Комплексы ПБ„ с анионными липосомами.

Известно, что кватернизованные производные поли-4-винилпиридина являются эффективными тушителями флуоресценции. Поскольку в синтезированных нами

полибетаинах (ПБ„, Таблица 1) также присутствуют катионные пиридиниевые группы, естественно было использовать метод тушения флуоресценции для контроля комплексообразования в системе полибетаин - анионная липосома.

Как следует из данных Рис. 2, добавление растворов различных полибетаинов к суспензии ФХ/КЛ2' липосом, в мембрану которых был встроен флуоресцентно меченый липид (ДОФЭА-КФ), по-разному сказывалось на интенсивности флуоресценции метки. ПБ1 слабо влиял на флуоресценцию метки (Рис. 2, кривая /), ПБг и ПБ5 вызывали заметное тушение флуоресценции (Рис. 2, кривые 2 и 4), в то время как ПБз с промежуточной длиной развязки оказался менее эффективным тушителем (Рис. 2, кривая

3).

Рисунок 2. Зависимость

относительной интенсивности

флуоресценции меченых фх/кл2-липосом от концентрации ПБ. ПБ1 (I), ПБ2 (2), ПБз (3), ПБ5 (4). Суммарная концентрация липидов 1 мг/мл; 10~2М, боратный буфер; рН 9,2.

Тушение флуоресценции, в разной степени наблюдавшееся для ПБ2, ПБ3 и ПБ5, очевидно, являлось результатом адсорбции этих полимеров на поверхности анионных липосом. В случае ПБ] с минимальной длиной развязки в бетаиновой группе низкая эффективность тушения отражала его слабое связывание с липосомами.

Эти выводы находятся в согласии с результатами экспериментов по измерению размеров частиц в супензиях в присутствии полибетаинов. Так, размер липосом практически не менялся при добавлении инертного ПБ1 (Рис. 3, кривая /); напротив, взаимодействовавший с липосомами ПБз инициировал агрегацию липосом, что отражалось на увеличении среднего размера частиц в системе (Рис. 3, кривая 2).

Инертность ПБ[ по отношению к липосомам ФХ/КЛ2' может быть следствием строения его бетаиновых группировок, в которых положительные и отрицательные заряды разделены всего одной метиленовой группой. Такое сближение зарядов понижает способность катионных пиридиниевых групп в ПБ1 образовывать солевые связи с

фосфатными группами КЛ2\ Рост числа метиленовых групп приводит к увеличению эффективного длпольного момента бетаиновой группировки и, как следствие, к связыванию полибетаинов с липосомами.

Рисунок 3. Зависимость размера частиц в системе ПБ - ФХ/КП2-пипосомы. от концентрации ПБ. ПБ1 (1) и ПБз (2). Суммарная концентрация липидов 1 мг/мл: 10'2М боратный буфер; рН 9,2.

4 6 [ПБп]*104, М

За устойчивостью комплексов ПБ-липосома в водно-солевых средах следили с помощью метода флуоресценции. Выше отмечалось, что связывание полибетаинов в комплекс с флуоресцентно мечеными ДОФЭА-КФ липосомами сопровождалось тушением флуоресценции метки (Рис. 2). Последующее добавление раствора ЫаС1 к суспензиям комплексов полибетаин-липосома приводило к различным результатам. Для комплексов с участием ПБ2 и ПБ5 наблюдалось полное восстановление интенсивности флуоресценции метки, т.е. диссоциация этих комплексов на исходные компоненты, при [ЫаС1] = 0,05 М (Рис. 4, кривые 1 и 3). Это указывает на электростатическую природу взаимодействия этих полибетаинов с ФХ/КЛ2" липосомами.

Рисунок 4. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции комплекса ПБ-меченые ФХ/КЛ2' липосомы от концентрации МаС1. [ПБ] = 2,5 х/О"' М. ПБ2 (1), ПБ3 (2) и ПБ> (3). Суммарная концентрация липидов 1 мг/мл; боратный буфер, 1(У2М; рН 9.2.

1,0-

а> 0,8 о

| 0,6

х ф

3 0,4

<а

в

0,0

-I 3 А-А-4

Физиологическая . , \

0,00 0,05 0,10 0,15 [№СЦ, М

0,20

Что касается комплекса с участием ПБз, его флуоресценция практически не менялась (т.е. комплекс не диссоциировал) при увеличении концентрации соли (Рис. 4, кривая 2). Важно отметить, что комплекс сохранялся при [NaCl] = 0,2 М, когда происходит разрушение всех солевых контактов пиридиниевых звеньев полимера с фосфатными группами КЛ2- [A.A.Yaroslavov et al„ Colloids Surf. В, 16 (1999) 29-43].

Что может быть причиной столь неожиданно высокой стабильности комплекса ПБз-липосома в водно-солевых средах? Как следует из Таблицы /, ПБз и ПБ5 содержат заметные количества немодифицированных пиридиновых колец. Их встраивание в гидрофобную часть липидного бислоя может приводить к дополнительной стабилизации комплексов этих полимеров с липосомами. Мы видели, однако, что соль полностью убирает ПБз с липосомальной мембраны. Это означает, что немодифицированные пиридиновые звенья и другого полибетаина, ПБз, не участвуют в дополнительной стабилизации его комплекса с ФХ/КЛ2" липосомами.

Известно, что шестичленные циклические структуры обладают повышенной термодинамической стабильностью. Бетаиновые группы в ПБз могут в принципе формировать подобные структуры за счет внутримолекулярных солевых связей, как это показано на Схеме 1.

Схема 1. Образование внутримолекулярных циклов в ПБз.

Образующиеся шестичленные циклы с взаимно нейтрализованными зарядами карбоксилатной и пиридиниевой групп могли бы проникать в гидрофобную часть липидного бислоя и тем самым стабилизировать комплекс ПБз-липосома, делая его нечувствительным к концентрации соли в окружающем растворе. В связи с этим стоит отметить, что формирование внутримолекулярных циклов должно понижать доступность пиридиниевых групп и уменьшать их способность тушить флуоресценцию встроенной в липосомальную мембрану метки (по сравнению с ПБ2 и ПБ5). Последнее действительно наблюдалось в эксперименте (ср. Рис. 2, кривую 3 с кривыми 2 и 4).

Встраивание таких достаточно объемных заместителей, какими являются внутримолекулярные шестичленные циклы в ПБз, может сопровождаться формированием дефектов в липидном бислое и повышением его проницаемости по отношению к низкомолекулярным ионам. Целостность липосомальной мембраны в контакте с поликатионами контролировали методом кондукгометрии. Для этого были приготовлены ФХ/КЛ2' липосомы, внутренний водный объем которых был заполнен 1М раствором NaCl. Нарушение целостности мембраны должно было сопровождаться увеличением электропроводности липосомальной суспензии. Полученный результат сравнивали с электропроводностью, полученной в ходе контрольного эксперимента - разрушения липосом в присутствии избытка детергента (Тритона Х-100), которую принимали за 100%.

При добавлении ПБз к суспензии липосом наблюдалось увеличение электропроводности смеси на 13 % за 45 минут (Рис. 5, кривая 1), что свидетельствует о появлении дефектов в липосомальной мембране, через которые происходило вытекание соли в окружающий раствор. Напротив, добавление другого, обратимого адсорбирующегося полибетаина, ПБг, не вызывало увеличения электропроводности системы (Рис. 5, кривая 2), и указывало на сохранение целостности мембраны при образовании комплекса ПБг-липосома.

Рисунок 5. Зависимость относительной

электропроводности П/С1маа: суспензии комплекса ПБз-КЛ2~/ФХ липосомы (1), ПБ2- КЛ2'/ФХ — липосомы (2) и суспензии липосом

после добавления детергента (3) от времени. Общая концентрация липидов 1 мг/мл, [ПБ]]=!№' М, 150 [ПБ3]=Ш3 М, Iff2 М фосфатный буфер, рН 7,0.

50 100

ЕрЁМЯ MkW

Ранее было показано, что адсорбция катионного полимера с высокой линейной плотностью заряда (например, полилизина) на поверхности смешанных липосом, состоящих из анионного и нейтрального липидов, сопровождается микрофазовым разделением в липосомальной мембране [A.A.Yaroslavov et al., Асс. Chem. Res.; 39 (2006) 702-710]. Для проверки способности полибетаинов вызывать структурные перестройки в липосомальной мембране мы использовали метод дифференциальной сканирующей калориметрии. С его помощью можно анализировать фазовые переходы в липидном

бислое, что в свою очередь позволяет следить за микрофазовым разделением в липосомальной мембране под действием полибетаинов. Липидный бислой характеризуется температурой фазового перехода Гф. Ниже температуры Гф липидный бислой находится в состоянии геля с резко ограниченной подвижностью липидных молекул ("твердые" липосомы). При температуре выше Гф мембрана переходит в жидкокристаллическое состояние, и подвижность липидов в ней значительно возрастает ("жидкие" липосомы).

Липосомы, приготовленные из природных липидов, ФХ и КЛ2\ характеризуются широкими фазовыми переходами в области температур, находящихся за пределами возможностей традиционных микрокалориметров (Гф < 5°С). Кроме того, оба образца представляют собой смеси липидов с различными температурами фазового перехода, что приводит к уширению калориметрической кривой и осложняет интерпретацию полученных результатов. Поэтому для калориметрических экспериментов липосомы готовили из смеси синтетических липидов: нейтрального ДПФХ и анионного ДОФГ1' с Гф = 41,5 и -20°С соответственно.

Как видно из Рис. 6, калориметрическая кривая смешанных ДПФХ/ДОПГ1" липосом (Рис. 6, кривая /) характеризуется фазовым переходом с пиком при 33,2 °С и плечом при 30 °С. Полибетаины добавляли к липосомам, находящимся в жидкокристаллическом состоянии (при 55 °С) в соотношении [ПБ]/[ДОФГ'-] = 2,5, чтобы обеспечить участие всех молекул ДОФГ1' в образовании комплекса с полимером. Добавление раствора ПБг к суспензии липосом не сказывалось на положении и форме калориметрической кривой (ср. Рис. 6, кривые I и 2). Переход от ПБг к ПБз сопровождался смещением калориметрической кривой в область более высоких температур, при этом пик фазового перехода становился более узким, хотя и оставался "двухкомпонентным" с максимумом при 34,8 и плечом при 36,4°С (Рис. 6, кривая 3). Наконец, при добавлении ПБ4 регистрировался только один узкий пик (Рис. 6, кривая 4), который не менял своего положения при замене ПБ4 на ПБз {Рис. 6, кривая 5). В присутствии ПБ5 калориметрическая кривая полностью совпадала с кривой фазового перехода для липосом, сформированных только из нейтрального липида ДПФХ (ср. Рис. 6, кривые 5 и 7).

Смещение калориметрической кривой в сторону более высоких температур означает появление в липосомальной мембране областей с повышенным содержанием ДПФХ по сравнению с усредненным его содержанием в мембране исходных ДПФХ/ДОФГ1" липосом. Эти области могут возникнуть только в результате формирования кластеров, состоящих преимущественно из анионного ДОФГ1" благодаря

их взаимодействию с адсорбированными молекулами полибетаина. Таким образом, связывание ПБг не вызывало латеральной сегрегации в мембране ДПФХ/ДОФГ1" липосом. Такое взаимодействие развивалось как адсорбция полибетаина на поверхности с фиксированным положением зарядов.

Рисунок 6. Калориметрические кривые дпфх/дофг1- липосом (1) и их смесей с пб2 (2), пб3 (3), пб4 (4), ПБз (5), пэвп (б) и дпфх липосом (7). Суммарная концентрация липидов 3 мг/мл; [пб] = 1.5Х-КТ1 М; 1(Т2 М фосфатный буфер, рН 7,0; скорость нагревания образцов 0.25 град/мин.

Что касается ПБ4 и ПБ5, их адсорбция приводила к формированию фазы, состоявшей практически целиком из молекул нейтрального ДПФХ. Иными словами, эти полибетаины образовывали электростатический комплекс со всеми молекулами анионного ДОФГ1". Ранее в литературе отмечали, что адсорбция поликатиона схожего строения, поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромида (ПЭВП) на поверхности смешанных отрицательно заряженных липосом индуцирует переход анионных липидов с внутренней стороны липосомальной мембраны на внешнюю (флип-флоп) [A.A.Yaroslavov et al., Асс. Chem. Res.; 39 (2006) 702-710]. Кривая теплоемкости липосом в присутствии ПБ5 совпадала с кривой в присутствии ПЭВП (Рис. 6, кривые 5 и б). Это позволяет утверждать, что и полибетаин ПБ> инициирует аналогичный процесс, в результате чего на внешней стороне мембраны концентрируются все молекулы ДОФГ1", изначально распределенные по обеим сторонам бислоя.

Кривая 3 (Рис. 6) для системы с участием ПБз занимает промежуточное положение между теми, которые описывают поведение комплексов липосом с ПБг и ПБ4/ПБ5. Иными словами, адсорбция ПБз вызывала латеральную сегрегацию, однако в этом процессе участвовали не все анионные липиды мембраны. По-видимому, адсорбция ПБз индуцировала формирование кластеров лишь из молекул ДОФГ1" внешнего слоя липосомальной мембраны.

Таким образом, длина развязки -(СНг)п- в бетаиновой группировке оказывает решающее влияние на способность полибетаина взаимодействовать с анионными липосомами и вызывать структурные перестройки в липосомальной мембране. При п = 1 полибетаин вообще не связывается с анионными липосомами, полибетаин с п = 2 адсорбируется на мембране, не вызывая существенных структурных перестроек в бислое. В случае п = 3 адсорбция полибетаина индуцирует латеральную сегрегацию липидов во внешнем слое мембраны. При п = 4 и 5 адсорбция полимера сопровождается латеральной сегрегацией и флип-флопом липидных молекул, в результате чего в микрофазовом разделении принимают участие все анионные липиды мембраны. Процессы, развивающиеся в смешанной системе полибетаин + анионная липосома, схематически представлена на Рис. 7.

Рисунок 7. Реакция липосомальной мембраны на присутствие полибетаина.

Говоря о возможном биомедицинском использовании полибетаинов, например, в качестве носителей лекарственных веществ, следует иметь в виду, что биологическая среда представляет собой водно-солевой раствор с концентрацией соли 0,15 М. Наши эксперименты показали, что в этих условиях большинство исследованных полибетаинов не взаимодействует с анионными липосомами. Единственным исключением является ПБ3, который необратимо связывается с анионной мембраной в концентрированных растворах солей. По-видимому, это происходит благодаря особой геометрии бетаиновых групп ПБ3

Адсорбция и индуцирование латеральной сегрегации и флип-флопа

ПБ4.

ПБ3

Адсорбция и индуцирование латеральной сегрегации

способных формировать шестичленные циклы, которые встраиваются в липидный бислой и стабилизируют комплекс ПБз-липосома. Однако мы видим, что адсорбция ПБз сопровождается появлением дефектов в липидном бислое и вытеканием содержимого из липосом в окружающий раствор.

Для повышения стабильности комплексов в водно-солевых растворах можно предложить, по крайней мере, два способа. Первый заключается в использовании сополимеров с бетаиновыми и катионными группами. Присутствие последних будет способствовать упрочнению электростатического связывания сополимеров с отрицательно заряженной липосомальной мембраной. Второй способ - введение в молекулу полибетаинов боковых алкильных заместителей. В этом случае стабильность комплексов будет достигаться за счет встраивания алкильных «шпилек» в гидрофобную часть липидного бислоя.

2. Комплексы ПБК и ПБЦ с анионными липосомами.

Для апробации первого из описанных выше подходов была приготовлена серия сополимеров путем модификации поли-4-винилпиридина ш-бромпропионовой кислотой и бромистым этилом (ПБК, Таблица 1). Доля катионных групп в сополимерах возрастает от 0,16 (ПБК-1) до 0,63 (ПБК-5), соответственно доля бетаиновых групп в этом ряду уменьшается от 0,8 до 0,33.

Рисунок 8. Зависимость относительной флуоресценции меченных КЛ2'/ФХ липосом от концентрации ПБ2 (1), ПБК-1 (2), ПБК-2 (3), ПБК-4 (4), ПБК-5 (5) и ПЭВП (6). Общая концентрация липидов 1 мг/мл, Ш2 М боратный буфер, рН 9,2.

5 10 15

[Полиэлекгролит]*104, М

Добавление всех ПБК-сополимеров к суспензии флуоресцентно меченых ДПФЭ-НБД ФХ/КЛ2" липосом сопровождалось тушением флуоресценции, что однозначно

15

указывает на их связывание с анионными липосомами (Рис. 8). Увеличение доли катионного компонента в сополимере повышало эффективность тушения метки, и для ПБК-5 с долей катионных групп а = 0,63 она становилась сопоставимой с таковой для поликатиона ГТЭВП.

Последующее добавление раствора №С1 к суспензиям комплексов приводило к возгоранию флуоресценции (Рис. 9), то есть к диссоциации комплексов, так же, как это наблюдалось для комплексов анионных липосом с полибетаинами. Все комплексы практически полностью диссоциировали на исходные компоненты при физиологическом значении концентрации соли (0,15 М).

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,3 [NaCI], М

Рисунок 9. Зависимость

относительной флуоресценции

комплекса Полиэлектролит меченные КЛ2'/ФХ липосомы от концентрации NaCL

[Полиэлектролит] = 2,5 *10'4 М. ПБ2

Физиологическая (')• ПБК'1 <2>- ПБК'2 (3). ПБК~5 (4> " ПЭВП (5). Общая концентрация

липидов I мг/мл, Ю'2 М боратный

буфер, рН 9,2.

Второй подход к стабилизации комплексов в водно-солевой среде -гидрофобизация полибетаина, был реализован с использованием сополимеров, полученных модификацией поли-4-винилпиридина и-бромпропионовой кислотой и бромистым цетилом (ПБЦ, Таблица /). Обработка бромистым цетилом позволила ввести в макромолекулу боковые алкильные радикалы и одновременно придала полимерной цепи избыточный положительный заряд, как и в случае ПБК. Поэтому полиамфолиты серии ПБЦ можно рассматривать как гидрофобизованный варианты полимеров, содержащих бетаиновые и катионные группы. Доля цетильных групп в сополимерах варьировалась от 0,03 до 0,13 с соответствующим понижением доли бетаиновых групп от 0,93 до 0,84.

Как и ожидалось, добавление синтезированных ПБЦ сополимеров к суспензии флуоресцентно меченых ФХ/КЛ2" липосом приводило к образованию комплекса ПБЦ-липосома и уменьшению интенсивности флуоресценции метки (Рис. 10). Добавление раствора ЫаС1 к суспензиям полученных комплексов практически не влияло на

интенсивность флуоресценции: она сохранялась на уровне, достигнутом при формировании комплексов ПБЦ-липосома (Рис. На). Таким образом, увеличение концентрации соли не приводило к диссоциации комплексов липосом с гидрофобизованными полиамфолитами. Очевидно, дополнительная стабилизация таких комплексов в водно-солевых средах достигалась за счет встраивания цетильных радикалов в гидрофобную часть липидного бнслоя. Для сравнения на том же рисунке приведены данные для комплекса ФХ/КЛ2" липосом с полибетаином ПБг и катионным ГТЭВП, которые, как было показано выше, полностью диссоциируют при повышении концентрации соли в окружающем растворе.

2 4 6 8 10 [Полиэлектролит]*104, M

Рисунок 10.

относительной меченных KJl2~/<t

Зависимость флуоресценции липосом от

концентрации ПБ2 (I), ПБЦ-1 (2), ПБЦ-5 (3) и ПЭВП (4). Общая концентрация липидов 1 мг/мл, 10~2 M фосфатный буфер, рН 7,0

Таким образом, уже сформированный комплекс анионных липосом и гидрофобизованного полиамфолита не разрушается при увеличении концентрации соли. А может ли комплекс формироваться при добавлении раствора полиамфолита к водно-солевой суспензии липосом? Такая ситуация имитирует поведение полиамфолита в клеточной суспензии, содержащей значительные количества неорганических солей.

Для ответа на этот вопрос 1 мг/мл суспензию меченых ФХ/КЛ2" липосом смешивали с раствором ЫаС1 разной концентрации и затем добавляли 7,5x1с"4 М раствор полиамфолита, ПБЦ-1 или ПБЦ-4. Результаты представлены на Рис. 116 в виде зависимости относительной интенсивности флуоресценции, установившейся в системе, от концентрации №С1. Видно, что при всех исследованных концентрациях соли ([ЫаС1] < 0,3 М) уровень флуоресценции равен примерно 50% от исходного (липосом в отсутствии полимера). Иными словами, оба полиамфолита с боковыми гидрофобными радикалами образовывали с анионными липосомами комплексы в водно-солевом растворе. Важно, что

для эффективного связывания полимера на поверхности липосом достаточно было ввести в макромолекулу 3 мол. % цетильных боковых групп.

1.0 п

0,8-

с 0.2 е

ос о е -

I

1.0

0.8-

. 0.6-

0.4

© 0.2

0.0

0,1

[NaCI], М

0,2

0.0 -I 0.00

0.05

0.10 0.15 0.20 [NaCI], М б

0.25 0.30

Рисунок 11. Зависимость относительной флуоресценции комплекса полиэлектролит -меченные КЛ2/ФХ липосомы от концентрации ЫаС1. (а) Раствор соли добавляли к раствору комплекса; [Полиэлектролит] ~ 2*КГ4 М. ПБЦ-1 (1), ПБЦ-4 (2), ПЭВП (3) и ПБ2 (4). (б) Раствор полимера добавляли к водно-солевой суспензии липосом; [Полиэлектролит] = 7,5 * 10'4 М. ПБЦ-1 (I), ПБЦ-4 (2). Общая концентрация липидов I мг/мл, 0,01 Мборатный буфер, рН 9.2.

0,8-

о) а §§

0,4

8 х

И

О

Полное разрушение липосом

-4 й

20 30 40 50 Время, мин.

1,0

£ 1°.<Ч

а а

0.4

0,2

60 70 80

0,0

Полное разрушение липосом

20 40

60 80 100 Время, мин.

120 140

Рисунок 12. Зависимость относительной электропроводности суспензии комплекса ПБК-3-КЛ2УФХ липосомы (1, а), ПБЦ-1- КЛ2УФХ липосомы (2, б), ПБЦ-4- КП2'/ФХ липосомы (3, б) и суспензии липосом после добавления детергента (4 а, б) от времени. Общая концентрация липидов 1 мг/мл, [ПБК-3]=НГ3 М [ПБЦ-11=10 * М, [ПБЦ-4]=1(Г1 М, Iff2 М фосфатный буфер, рН 7,0.

В заключение возникает вопрос: сохраняется ли целостность липосом после их связывания с модифицированными полибетаинами, ПБК и ПБЦ? Для ответа на него был использован описанный выше подход: смешивали растворы полимеров (ПБК-3 из первой группы и ПБЦ-4 из второй группы) и ФХ/КЛ2" липосом, заполненных I М раствором NaCl, и следили за электропроводностью полученной суспензии с помощью кондуктометрии (Рис. 12). Оказалось, что в обоих случаях электропроводность суспензии комплекса не менялась по крайней мере в течение 1,5 часов, то есть целостность липосом в комплексе с полиамфолитами сохранялась.

3. Цитотоксичность полиамфолитов.

Для определения цитотоксичности полиамфолитов был использован метод прижизненного окрашивания клеток метилтетразолевым синим. Проникший внутрь клеток краситель под действием окислительно-восстановительных ферментов окислялся до формазана, который выпадал в виде темно-синих кристаллов. В погибших клетках такого превращения красителя не происходило. Чем активнее происходили процессы жизнедеятельности в клетке, тем большее количество красителя в ней накапливалось. Долю выживших (т.е. продуцирующих формазан) клеток оценивали, измеряя оптическую плотность при длине волны 550 нм, соответствовавшей максимуму поглощения формазана.

На Рис. 13а представлены зависимости доли выживших клеток линии MCF-7 от концентрации добавленных полибетаинов (ПБ„). Как следует из представленных на рисунке данных, для катионного полимера, ПЭВП (поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромида), концентрация, вызывавшая 50% гибель клеток (ДД50), составляет примерно 10"4 М. Для полибетаинов с небольшой длиной развязки в бетаиновой группе (ПБ1 и ПБг) ЛД50 выше на два порядка, а для ПБз и ПБ5 на один порядок по сравнению с поликатионом, то есть оба полимера обладают меньшей токсичностью, чем ПЭВП. Высокую токсичность катионных полимеров обычно связывают с их способностью эффективно взаимодействовать с анионными компонентами клеточной мембраны (ферментами, рецепторами, каналообразователями и проч.), что сказывается на функционировании клетки и в конечном итоге может привести к ее гибели. Можно предположить, что анионная группа, расположенная поблизости от катионной, уменьшает эффективность связывания полимера с анионными компонентами мембраны и снижает токсичность полимера.

.s

'S

g

с

3

&

5

<1 s о

Казалось бы, замена части бетаиновых групп на катионные (переход от ПБ„ к ПБК) должна приводить к увеличению токсичности полимеров. Однако, как следует из данных Рис. 136, полиамфолиты серии ПБК демонстрировали токсичность на 2 порядка меньшую по сравнению с токсичностью катионного ПЭВП. Причина низкой токсичности ПБК, особенно у полимеров с высоким содержанием катионных групп, остается пока неясной. Тем не менее, полученный результат показывает, что введение катионных групп в молекулу полибетаина не оказывает влияния на токсичность полимера и при этом повышает устойчивость комплекса полимер-анионный липид в водно-солевых растворах (Рис. 9). Вместе с тем, даже при высоком содержании катионных групп в ПБК наблюдается диссоциация комплекса в растворе с физиологической концентрации соли, [ЫаС1] = 0,15 М.

Модификация полибетаина боковыми гидрофобными (цетильными) радикалами позволяет сохранить характерный для полибетаинов низкий уровень цитотоксичности (Рис. 13в) и решить проблему стабилизации комплекса полимер-липидный бислой в присутствии высоких концентраций соли. Введение в молекулу поолибетаина всего 3 мол.% боковых цетильных групп полностью блокирует диссоциацию комплекса в 0,15 М растворе ЫаС1 (Рис. Л).

выводы

1. Впервые путем модификации поли-4-винилпиридина ш-бромкарбоновыми кислотами и бромистыми алкилами синтезированы три группы полиамфолитов: 1) с катионными и анионными группами в каждом звене (полибетаины, ПБ„), 2) с бетаиновыми и катионными группами и 3) с бетаиновыми группами и боковыми цетильными радикалами, и исследовано их комплексообразование с липосомами, сформированными из цвитгер-ионного (электронейтрального) фосфатидилхолина и анионного дифосфатидилглицерола (кардиолипина).

2. Установлено, что варьирование длины метиленовой развязки в бетаиновой группировке позволяет реализовать различные варианты поведения полибетаина в суспензии анионных липосом: от отсутствия взаимодействия до значительных структурных перестроек в липосомальной мембране (латеральной сегрегации и трансмембранной миграции липидов), вызванных адсорбцией полимера. Целостность липосом в комплексе с полиамфолитами сохраняется. Единственным исключением является ПБз, полученный модификацией поли-4-винилпиридина со-бромпропионовой кислотой, который при связывании с липосомами формирует дефекты в липидном бислое и повышает проницаемость липосомальной мембраны.

3. Показано, что стабильность комплексов полиамфолит-липосома в водно-солевых средах определяется строением полимерной молекулы. Комплексы, образованные ПБ„ и липосомами, полностью диссоциируют на составляющие компоненты в растворе с физиологической концентрацией соли; введение в молекулу полибетаина боковых цетильных радикалов стабилизирует его комплекс с липосомами в присутствии соли.

4. Цитотоксичность синтезированных полиамфолитов на 1-2 порядка ниже цитотоксичности хорошо изученного катионного полимера, поли-М-этил-4-винилпиридиний бромида (ПЭВП), той же степени полимеризации.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. A.A.Yaroslavov, T.A.Sitnikova, A.A.Rakhnyanskaya, Yu.D.Ermakov, T.V.Burova, V.Ya.Grinberg, F.M.Menger. Contrasting behavior of zwitterionic and cationic polymer bound to anionic liposomes. //Langmuir. 2007. V. 23. P. 7539-7544.

2. A.A.Yaroslavov, T.A.Sitnikova, A.A.Rakhnyanskaya, E.G.Yaroslavova, D.A.Davydov, T.V.Burova, V.Ya.Grinberg, Lei Shi, F.M.Menger, Biomembrane sensitivity to structural changes in bound polymers. II J. Am. Chem. Soc. 2009.131 (5). P. 1666-1667.

3. T.A. Ситникова, A.A. Рахнянская, Е.Г.Ярославова, А.Н.Сергеев-Черенков, Г.Б.Хомутов, В.Я.Гринберг, Т.В.Бурова, А.А.Ярославов, Строение и свойства комплексов полиамфолитов с анионными липосомами. // Высокомолек. соед. 2009. Т. 51. №6. С. 954961.

4. Т.А. Ситникова, А.А. Рахнянская. Особенности взаимодействия двузарядных поливинилпиридинов с липосомами. // Тезисы докладов Третьей Всероссийская Каргинская Конференция «Полимеры - 2004». Москва. 2007. Т.1. С. 406.

5. Т. A. Sitnikova, A. A. Yaroslavov, A. A. Rakhnyanskaya. Complexation of negative liposomes with polybetaines. // International Symposium "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures". 2004. Kazan. Russia. Book of Abstract. P. 96.

6. T. A. Sitnikova Negative liposomes in contact with polybetaines. //5th International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems". 2005. Saint-Petersburg. Russia. Book of Abstract. P. 214.

7. T.A. Ситникова, A.A. Рахнянская, A.A. Ярославов, A.H. Сергеев-Черенков, Отрицательные липосомы в контакте с полиамфолитами// Тезисы докладов Четвертой Всероссийской Каргинской Конференции «Наука о полимерах 21-му веку». Москва. Россия. 2007. Т.2. с. 423.

8. T.A. Sitnikova, A.A.Rakhnyanskaya, F.M.Menger, A.A.Yaroslavov Polybetaines on the surface of negative liposomes// 4th European polymer congress 2007. Slovenia. Portoroz. Book of Abstract, p. 217.

9. T.A. Sitnikova, A.A. Rakhnyanskaya, A.A. Yaroslavov Polymer nanoparticles in complexes with negative liposomes // The Second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers. The second nanotechnology international forum. Moscow. Russia. 2009. P. 719.

10. Т.А.Ситникова, А.А.Рахнянская, A.A. Ярославов, Е.Г.Ярославова. Свойства комплексов гидрофобизованных полибетаинов с анионными липосомами. //Тезисы докладов Юбилейной научной конференции, посвященной 80-летию химического факультета МГУ. Москва. Россия. 2009. С. 110.

Подписано в печать 29,04.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1109 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Биомедицинское применение полиэлектролитов.

2.1.1. Полианионы.

2.1.2. Поликатионы.

2.1.3. Полиамфолиты.

2.2. Эволюция представления о структуре биологических мембран.

2.3. Системы, моделирующие биологические мембраны.

2.3.1. Липосомы.

2.3.1.1. Строение липосом и получение.

2.3.1.2. Структура и свойства липосомальной мембраны.

2.3.1.3. Фазовые переходы в мембране липосом.

2.3.1.4. Динамические процессы в липосомальной мембране.

2.3.1.5. Взаимодействие полиионов с липидными мембранами.

2.3.1.5.1. Взаимодействие полиэлектролитов с липидными везикулами.

2.3.1.5.2. Влияние конкурентных реакций и ионной силы раствора на стабильность комплексов полимер-липосома.

2.3.2. Ленгмюровские монослои.

2.3.2.1. Молекулярные слои Ленгмюра как модельные системы.

2.3.2.2. Использование атомно-силовой микроскопии для 49 исследования липидных монослоев.

2.3.3. Плоские бислойные мембраны.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы.

3.1.1. Фосфолипиды.

3.1.2. Липосомы.

3.1.3. Полиэлектролиты.

3.1.4. Низкомолекулярные вещества.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Динамическое светорассеяние.

3.2.2. Измерение эдектрофоретической подвижности 62 частиц.

3.2.3. Флуоресцентная спектроскопия.

3.2.4. УФ-спектроскопия.

3.2.5. Потенциометрия.

3.2.6. Препаративное центрифугирование.

3.2.7. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия (ДСК).

3.2.8. Монослойная техника.

3.2.9. Атомно-силовая микроскопия.

3.2.10. Определение цитотоксичности полиэлектролитов.

3.3. Описание эксперимента.

3.3.1. Взаимодействие отрицательно заряженных липосом с 66 полиамфолитами при рН=7 или 9.2.

3.3.2. Влияние ионной силы раствора и присутствия полианиона на 67 стабильность комплекса полимер-липосома.

3.3.3. Фазовые переходы в мембранах.

3.3.4. Целостность мембраны при взаимодействии с полиэлектролитами.

3.3.5. Образование монослоя Ленгмюра и взаимодействие полимеров с 68 монослоем.

3.3.6. Приготовление образцов для АСМ.

4. Обсуждение результатов.

4.1. Взаимодействие полибетаинов с длиной развязки п=1-5 метиленовых групп, с модельными мембранами.

4.1.1. Взаимодействие полибетаинов с отрицательно заряженными 70 липосомами.

4.1.2. Стабильность комплексов полибетаинов с липосомами.

4.1.3. Взаимодействие полибетаинов с липидными монослоями 85 Ленгмюра.

4.2. Взаимодействие сополимеров поливинилпиридина, алкилированных со

Br-пропионовой кислотой и этилбромидом, с отрицательно заряженными липосомами.

4.3. Взаимодействие сополимеров поливинилпиридина, алкилированных ю- 95 Вг-пропионовой кислотой и ю-Вг-кислотами с длинными развязками, с отрицательно заряженными липосомами.

4.4. Взаимодействие сополимеров поливинилпиридина, алкилированных ю- 104 Вг-пропионовой кислотой и цетилбромидом, с отрицательно заряженными липосомами.

Выводы.

Полиэлектролитами (ПЭ) называют синтетические или природные полимерные вещества, способные к электролитической диссоциации при растворении или набухании в полярных растворителях. В зависимости от природы ионогенных групп ПЭ делятся на сильные и слабые полимерные кислоты и основания, а также соли. Существуют, кроме того, амфотерные полимерные электролиты (полиамфолиты), в цепях которых имеются как кислотные, так и основные группы. Полиэлектролиты своеобразно сочетают свойства неионогенных полимеров и низкомолекулярных электролитов. Вместе с тем ПЭ в растворах характеризуются особенностями, отличающими их от растворов незаряженных полимеров и низкомолекулярных электролитов. Все специфические свойства ПЭ проявляются только в условиях, в которых их макромолекулы приобретают локально нескомпенсированные заряды. И определяются эти свойства взаимодействием заряженных групп полиионов между собой и с окружающими их противоионами.

Вот уже более полувека ведутся работы по применению полиэлектролитов в медицине и биотехнологии. В последние два десятилетия эта область активно развивается и имеет хорошие перспективы. Спектр возможных применений чрезвычайно разнообразен. Одним из них является разработка искусственных вакцин [1], что возможно благодаря способности ряда полиэлектролитов увеличивать иммунный ответ. После того, как было обнаружено, что образование комплексов с поликатионами облегчает проникновение ДНК в клетку, это стало применяться для разработки препаратов для трансфекции [2, 3]. Анионные полимеры применяются в противоопухолевой терапии благодаря своей способности уменьшать токсичность лекарственного вещества и одновременно облегчать его проникновение в клетку [4].

Столь активное и постоянно расширяющееся биомедицинское применение ПЭ требует проведения исследований по изучению их поведения в биологическом окружении, т.е. по взаимодействию с клетками. Для этой цели могут быть использованы нативные клетки. Однако необходимо иметь в виду, что при интерпретации полученных результатов могут возникать трудности, связанные со сложностью организации клеточной мембраны. Кроме того, состав многокомпонентной клеточной мембраны неодинаков для различных типов клеток. Наконец, необходимо иметь в виду, что в ходе жизненного цикла клетки поверхностные свойства ее мембраны могут существенно изменяться. Т. о полученные результаты могут оказаться неуниверсальными. Для того чтобы полученные результаты можно было применять для описания поведения ПЭ в контакте с различными типами клеток, необходимо применять модельный подход. Известно, что основной частью биологических мембран является липидный бислой. Потому в качестве модельных объектов широко применяются липосомы -замкнутые сферические липидные бислои. Также распространено использование плоских липидных моно- и бислоев, нанесенных на подложку или образованных на поверхности водной фазы.

Что касается исследуемых полимерных объектов, их спектр чрезвычайно широк и включает в себя в основном различные вещества поликатионной и полианионной природы. Что же касается синтетических амфифильных веществ, то исследования их активности по отношению к клеткам весьма ограниченны. Тем не менее, поскольку известным недостатком катионных полимеров является их высокая цитотоксичность, а полианионов - низкая активность, полиамфолиты могли бы стать перспективным решением, в качестве «золотой середины».

Полимеры, которые предполагается использовать в биомедицинских целях, должны помимо активности по отношению к клеточной мембране, обладать умеренной токсичностью. Взаимодействие с мембраной не должно приводить к разрушению клетки. Недопустимым является и стимулирование необратимых изменений в мембране, в частности перемещение ее компонентов и изменение гибкости, приводящее к неспособности клетки нормально функционировать. В этой связи необходимо проводить исследование не только процесса образования комплекса полимера с нативной или модельной мембраной, но и изучать происходящие в результате этого эффекты, в частности динамические процессы, возникающие в мембране.

В настоящей работе на основе широко известного поликатиона поли-4-винилпиридина путем введения в молекулу карбоксильных групп был создан ряд б новых полимеров амфифильной природы. Возможно было ожидать, что полимеры такого типа не будут столь токсичны по отношению к клеткам, как их поликатионный предшественник. Однако по нашему предположению наличие катионных групп могло позволить сохранить активность полимера к мембране, близкую к хорошо известной активности поли-К-этил-4-винилпиридина.

Таким образом, в данной работе на модельных системах различных типов (липосомах и липидных монослоях) будет рассмотрена активность новой группы полимеров по отношению к анионным липидным мембранам, эффекты, вызываемые действием полимера на мембрану, а также цитотоксичность полимеров.

2. Литературный обзор

выводы

1. Впервые путем модификации поли-4-винилпиридина со-бромкарбоновыми кислотами и бромистыми алкилами синтезированы три группы полиамфолитов: 1) с катионными и анионными группами в каждом звене (полибетаины, ПБ„), 2) с бетаиновыми и катионными группами и 3) с бетаиновыми группами и боковыми цетильиыми радикалами, и исследовано их комплексообразование с липосомами, сформированными из цвиттер-ионного (электронейтрального) фосфатидилхолина и анионного дифосфатидилглицерола (кардиолипина).

2. Установлено, что варьирование длины метиленовой развязки в бетаиновой группировке позволяет реализовать различные варианты поведения полибетаина в суспензии анионных липосом: от отсутствия взаимодействия до значительных структурных перестроек в липосомальной мембране (латеральной сегрегации и трансмембранной миграции липидов), вызванных адсорбцией полимера. Целостность липосом в комплексе с полиамфолитами сохраняется. Единственным исключением является ПБ3, полученный модификацией поли-4-винилпиридина со-бромбутановой кислотой, который при связывании с липосомами формирует дефекты в липидном бислое и повышает проницаемость липосомальной мембраны.

3. Показано, что стабильность комплексов полиамфолит-липосома в водно-солевых средах определяется строением полимерной молекулы. Комплексы, образованные ПБП и липосомами, полностью диссоциируют на составляющие компоненты в растворе с физиологической концентрацией соли; введение в молекулу полибетаина боковых цетильных радикалов стабилизирует его комплекс с липосомами в присутствии соли.

4. Цитотоксичность синтезированных полиамфолитов на 1-2 порядка ниже цитотоксичности катионного полимера, поли-1ч[-этил-4-винилпиридиний бромида, той же степени полимеризации.

1. Kabanov V.A., Petrov R.V., and Khaitov R.M. Artificial Antigenes and Vaccines Based on Non-natural Polyelectrolytes// Sov. Sci. Rev. D, Physicochemical Biology. 1984. V. 5.P. 277-322.

2. Yaroslavov A.A., Sukhishvili S.A., Obolsky O.L., Yaroslavova E.G., Kabanov A.V., Kabanov V.A. DNA Affinity to Biological Membranes is Enhanced Due to Complexation with Hydrophobized Polycation// FEBS Lett. 1996. № 384. P. 177-180.

3. Kabanov A.V., Kabanov V.A ./DNA complexes with polycations for the delivery of genetic material into cells.// Bioconjug. Chem. 1995. V. 6. P. 7-20.

4. Chung J. C., Gross D. J., Thomas, J. L., Tirrell D. A., Opsahl-Ong L. R. pH-Sensitive, Cation-Selective Channels Formed by a Simple Synthetic Polyelectrolyte in Artificial Bilayer Membranes// Macromolecules. 1996. V. 29. № 13. P. 4636-4641.

5. A.A. Иванов, A.H. Гвоздетский, В.А.Кабанов, Влияние поли-4-винилпиридина и полиокси-4-винилпиридина и их сополимеров на гемолитическую активность комплемента// Докл. Акад. Наук СССР. 1976. Т. 229. С. 1946.

6. В.А. Кабанов, И.М. Паписов. Комплексообразование между комплементарными синтетическими полимерами и олигомерами в разбавленных растворах// Высокомол. Соед. А. 1979. Т. 21. С. 243.

7. В.А. Кабанов, Р.В. Петров, P.M. Хаитов. Новый принцип создания искусственных иммуногенов// Ж. Всес. Хим. Об-ea им. Д.И.Менделеева. 1982. Т. 27. С. 417-424.

8. Zunino F., Pratesi G., Pezzoni G. / Increased therapeutic efficacy and reduced toxicity of doxorubicin linked to pyran copolymer via the side chain of the drug. // Cancer Treat. Rep. 1987. V. 71. P. 367-373.

9. Oda Т., Sato F., Maeda H. Facilitated internalization of neocarzinostatin and its lipophilic polymer conjugate, SMANCS, into cytosol in acidic pH. // J. Natl. Cancer Inst. 1987. V. 79. P. 1205-1211.

10. Janes, K.A., Fresneau, M.P., Marazuela, A., Fabra, A., Alonso, M.J. .Chitosan nanoparticles as delivery systems for doxorubicin// J. Control. Release. 2001. V. 73. P. 255-267.

11. Bogush, Т., Smirnova, G., Shubina, I., Syrkin, A., Robert. Direct evaluation of intracellular accumulation of free and polymer-bound anthracyclines// Cancer Chemother. Pharmacol. 1995. V. 35. P. 501-505.

12. Ефимова A.A. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва. 1996.

13. Coakley W.T., Heweison L.A., and Tilley D. Interfacial instability and the agglutination of erythrocytes by polylysine// Eur. Biophys. J. 1985. V. 13, P. 123-130.

14. T. Ikeda, H. Hirayama, K. Suzuki, H. Yamaguchi, Sh. Tazuke, Polymeric pyridinium salts with well-defined main chain structure// Makromol. Chem. 1986. V. 187. P. 333-340.

15. В.А.Кабанов, A.B. Кабанов, Интерполиэлектролитные комплексы нуклеиновых кислот как средство доставки генетического материала в клетку// Высокомол. Соед. 1994. Т. 36. № 2. С. 198-211.

16. Li Song, Huang Leaf. Lipidic supramolecular assemblies for gene transfer// J. Liposome Res. 1996. V. 6. № 3. P. 589-608.

17. Mack Karl D., Walzem Rosemary L., Lehmann-Bruinsma Karin, Powell Jerry S., Zeldis Jerome B. Polylisene enhances cationic liposome-mediated transfection of the hepatoblastoma cell line Hep G2// Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. V 23. № 3. P. 217220.

18. Плате H.A., Васильев A.E. Физиологически активные полимеры. М. :Мир. 1986. С. 159.

19. Margolin A.L., Izumrudov V.A., Shviadas V.K., Zezin A.V., Kabanov V.A., Berezin I.V. Reversibly soluble penicillin amidase immobilized in polyelectrolyte complexes// Biochem. Biophys. Acta. 1981. V. 660. P. 359.

20. B.A. Кабанов. Физикохимические основы и перспективы примерения растворимых интерполиэлектролитных комплексов// Высокомол. Соед. 1994. Т. 36. №2. С. 183-197.

21. Xiubo Zhao, Zhuoqi Zhang, Fang Pan, Yihua Ma, Steve P. Armes, Andrew L. Lewis, Jian R. Lu. Solution pH-Regulated Interfacial Adsorption of Diblock Posphorylcholine Copolimers// Langmuir. 2005. № 21. P. 9597 -9603.

22. Fischer D, Li Y, Ahlemeyer B, Krieglstein J, Kissel T. In vitro cytotoxicity testing of polycations: influence of polymer structure on cell viability and hemolysis// Biomaterials. 2003.24(7). P. 1121-31.

23. N.P.Shusharina, E.B.Zhulina, A.V.Dobrynin, M. Rubinstein. Scaling Theory of Diblock Polyampholyte Solutions// Macromolecules. 2005. V. 38. P. 8870 -8881.

24. C.S. Patrickios, W.R.Hertler, N.L.Abbott, T.A.Hatton, Diblock. ABC Triblock, and Random Methacrylic Poly electrolytes: Synthesis by Group Transfer Polymerization and Solution BehaviorII Macromolecules. 1994. V. 27. № 4. P. 930-937.

25. Mahlti B, Werner C, Muller M, Jerjme R, Stamm M. Protein adsorption on preadsorbed polyampholytic monolayers// J Biomater Sei Polym Ed. 2001. № 12. P. 9951010.

26. Sunil Nath, Costas S. Patrickios, T.Alan Hatton. Turbodimetric Titration Study of the Interaction of Proteines with Acrilic Polyampholytes// Biotechnol. Prog. 1995. №11. P. 99-103.

27. C.S. Patrickios, S.D. Gadam, S.M. Cramer, W.R. Hertier, T.A. Hatton. Block Methacrilic Polyampholytes as Protein Displacer in Ion-Exchange chromatography. Biotechnol//Prog. 1995. № 11. P. 33-38.

28. Б. Альберте, Д. Брей, Дж. Льюис, К. Роберте, Дж. Д. Уотсон. Молекулярная биология клетки. М.: Мир. 1998.

29. Р. Геннис. Биомембраны: молекулярная структура и функции. М.: Мир. С. 52, 84-85.

30. Болдырев A.A., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В. А. Биомембранология. Петрозаводск, 2006.

31. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука. 198. С. 8-40.

32. Bangham A.D. In liposomes Letters (Bangham A.ed), L.,N.Y., Acad. Press. 1983, 12-15.

33. Барсуков Л.И., Липосомы. Соросовский обогревательный журнал. 1998, № 10, 2-9.

34. Mueller P., Chien T.F., Rudy B. Formation and Properties of Cell-saze lipid bilayer vesicles И Biophys. J. 1983. 44. P. 375-381

35. Huang C.-H. Studies on phosphatidylcholine vesicles. Formation and physical characteristics// Biochemistry. 969. 8. P. 344-351.

36. Goormaghtigh E., Scarborough G.A. Density-based reparation of liposomes by glycerol gradient centrifugationП Analitical biochemistry. 1987. 159. P. 122-131.

37. Lentz B.R., Barenholz Y., Thompson Т.Е. Fluorescence depolarization studies of phase transitions and fluidity in phospholipids bilayers. Two component phosphatidylcholine liposomes// Biochemistry. 1976. 15. P. 4529-4537.

38. Ueno M., Tanford C., Reynolds J.A., Phospholipid vesicle formatuion using nonionic detergents with low monomer solubility. Kinetic factors determine vesicle size and permeability// Biochemistry. 1984. 23.P. 3070-3076.

39. Papahadjorpoulos D., Vail W.J., Jacobson K., Poste G. Cochleate lipid cylinders: formation by fusion of unilamellar lipid vesicles// Biochim Biophys. Acta. 1975. 394. P. 483-491.

40. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. M.: Просвещение. 1987. С. 577.

41. Huang С, Mason J.T. geometric Packing constraints in egg phosphatidylcholine vesicles// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. 75.P. 308-310.

42. N. Oku, S.Shibamoto, F. Ito, H. Gongo, Nango M. Low pH induced membrane fusion of lipid vesicles containing proton-sensitive polymer// Biochemistry. 1987. № 26, P. 8145-8150.

43. Dill K.A., Flory P.J. Molecular organization in micelles and vesicles// Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1981. V. 78. P. 676-680.

44. Lichtenberg D., Freire E., Schmidt C.F. Effect of surface curvature on stability, thermodynamic, behavior end osmotic activity of dipalmitoylphospotidilholine single lamellar vesicles// Biochemistry. 1981. V. 20. P. 3462-3467.

45. Cevc G. How membrane chain melting properties are regulated by the polar surface of the lipid bilayer// Biochemistry. 1987. 26. P. 6305-6310.

46. Е.И. Чадов, И.Н. Смирнов, А.В. Мазаев, В.П. Торчилин. Макромолекулярные лекарственные препараты в кардиологии// Ж. Всес. Хим. Об-ea им. Д.И.Менделеева. 1985, Т. 30, С. 365-372.

47. Albon N., Sturtevant J.M. Nature of the gel to lipid crystal transition of synthetic phosphatidylcholines// Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1978. 75. P. 2258-2260.

48. Lichtenberg D., Menasche M., Donaldson S., Biltonen R.L. Thermodynamic characterization od the pretranstion of unilamellar dipalmitoylphospotidilholine vesicles// Lipids. 1984. 19. P. 395-400.

49. Ярославов A.A., Ефимова A.A., Лобышев В.И., Ермаков Ю.А., Кабанов В.А. Обратимость изменения структуры липидных мембран, индуцированных адсорбцией поликатиона// Биологические мембраны. 1996. № 13. Р. 628-633.

50. Kennedy М.Т., Pozharski E.V., Rakhmanova V.A., MacDonald R.C. Factors Governing the Assembly of Cationic Phospholipid-DNA Complexes// Biophys. J. 2000. V. 78, P. 1620-1633.

51. Wu S.H.-W., McConnell H.M. Phase separations in phospholipids membranes// Biochemistry. 1975.14. P. 847-854.

52. Tokutomi S., lew R., Ohnishi S.I. Ca2+-induced phase separation in phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylcholine mixed membranes// Biochim Biophys. Acta. 1981. 643. P. 276-282.

53. Ипатова O.M. Фосфоглив. Механизм действия и применения в клинике. Под ред. академика РАМН Арчакова А.И. М.: Изд. ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН, 2005.

54. Galla H.J., Hartman W., Theilen U., Sackmann E. On two-dimensional passive random walls in lipid bilayers and fluid pathways in biomembranes// J. Membrane boil. 1979. 48. P. 215-236.

55. Vaz W.L.C., Goodsail-Zalduondo F., Jacobson K. Lateral diffusion of lipids and proteins in bilayer membranes// FEBS Lett. 1984. 174. P. 199-207.

56. Vaz, W.L.C., R.M. Clegg and D. Kallmann. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theoryI/ Biochemistry. 1985.V. 24. P. 781-786.

57. O'Leary, T.J. Lateral diffusion of lipids in complex biological membranes// Proc. Nat. Acad.Sci. USA. 1987. V. 84, P. 429-433.

58. Galla, H.-J., W. Hartmann, U. Theilen and E. Sackmann. On two-dimensional passive randomwalk in lipid bilayers and fluid pathways in biomembranes// J. Membr. Biol. 1979. V. 48. P. 215-236.

59. Sankaram, M.B. and T.E. Thompson. Modulation of phospholipid acyl chain order by cholesterol. A solid-state 2H nuclear magnetic resonance study// Biochemistry. 1990.V. 29. P. 10676-10684.

60. Sankaram, M.B. and T.E. Thompson. Cholesterol-induced fluid phase immiscibility in membranes// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 8686-8690.

61. Bishop W.R., Bell R.M. Assembly of the endoplasmic reticulum phospholipids bilayer: the phosphatidylcholine transporter// Cell. 1985. V. 42. P. 51-60.

62. Barsukov L.I., Kulikov V.I., Bergelson L.D. Cytochrome P-450 facilitate phosphatidylcholine flip-flop in proteohiposomes// FEBS Lett. 1982. V. 144. P. 337-340.

63. Mclntyre J.C. Sleight R.G. Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry//Biochemistry. 1991. Y. 30. P. 11819-11827.

64. Bai J. Pagano R.E. Measurement of spontaneous transfer and transbilayer movement of BODIPY-labeled lipids in lipid vesicles// Biochemistry. 1997. V. 36. P. 8840-8848.

65. Kornberg R.D., McConnell H.M. Inside-outside transition of phospholipids in vesicle membranes//Biochemistry. 1971. V. 10. P. Ill 1-1120.

66. Homan R. Pownall H.R. Transbilayer diffusion of phospholipids: dependence on headgroup structure and acyl chain length // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 938. P.155-166.

67. Tilley L., Cribier S., Roelofsen B., Op den Kamp J.A.F., Van Deenen L.L.M. ATP-dependent translocation of aminophospholipids across the human erythrocyte membrane// FEBS Lett. 1986. V. 194. P. 21-27.

68. Zachowski A., Favre E., Cribier S., Herve P., Devaux P.F. Outside-inside translocation aminophospholipids in the human erythrocyte membrane is mediated by a specific enzyme// Biochemistry. 1986. V. 25. P. 2585-2590.

69. Devaux P. Protein involvement in transmembrane lipid assimetryIIAnnu. Rev. Biophys. Boimol. Struct. 1992. V. 21. P. 417-439.

70. Buton X., Morrot G., Fellmann P., Seigneuret M. Ultrafast glycerophospholipid-selective transbilayer motion mediated by a protein in the endoplasmic reticulum membrane// J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 6651-6657.

71. Pomorski T., Muller P., Zimmermann B., Burger K., Devaux P.F., Herrmann A. Transbilayer movement of fluorescent and spin-labeled phospholipids in plasma membrane of human fibroblasts: a quantitative approach// J. Cell Sci. 1996. V. 109. P. 687-698.

72. Oram J.F., Wolfbauer G., Vaughan A.M., Tang C., Albers J.J. Phospholipid transfer protein interact with and stabilized ATP-binding cassette transporter A1 and enhances cholesterol efflux from cells// J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 52379-52385.

73. Schwichtenhovel C., Deuticke B., Haest C.W. Alcohols produce reversible and irreversible acceleration of phospholipid flip-flop in the human erythrocyte membrane// Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1111. P. 35-44.

74. Jain M.K., Jahagirdar D.V., Linde M.V., Roelofsen B., Eibl H. Solute-induced acceleration of transbilayer movement and its implications on models of blood-brain barrier/I Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 818. P. 356-364.

75. Apell H.-J., Lauger P. Quantitative analysis of pump-mediated fluxes in reconstituted lipid vesicles// Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 861. P. 302-310.

76. A.A. Meier-Koll, C.C. Fleck and H.H. von Grtinberg. The counterion-release interaction// J. Phys.: Condens. Matter. 2004. № 16. P. 6041-6052.

77. Franks N.P. Structural analysis of hydrated egg lecithin in cholesterol belayers I. X-ray diffraction// J. Mol. Biol. 1976. V. 100. P. 345-358.

78. A.A. Yaroslavov, E.G. Yaroslavova, A.A. Rakhnyanskaya, F.M. Menger, V.A. Kabanov. Modulation of interaction of polycatoions with negative unilamellar lipid vesicles// Coll. And Surf B. Bio interfaces. 1999. № 16. P. 29-43

79. A.A. Yaroslavov, V.Ye. Kulkov, A.A.Efimova, M.O. Ignatiev. Synthetic polycations on the surface of negatively charged liposomes// Thin Solid Films. 1995. V. 265. P. 66-70.

80. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A. What happens to negatively charged lipid vesicles upon interacting with polycation species?// J. Control. Release. 2002. V. 78. P. 267-271.

81. Murray D, Arbuzova A, Hangyas-Mihalyne G, Gambhir A, Ben-Tal N, Honig B, McLaughlin S. Electrostatic properties of membranes containing acidic lipids and adsorbed basic peptides: theory and experiment// Biophys J. 1999 . V. 77(6). P. 3176-88.

82. S. Sennato, F. Bordi, C. Cametti, M. Diociaiuti, P. Malaspina.Charge patch attraction and reentrant condensation in DNA—liposome complexes// Langmuir. 2004. V. 20 (13). P. 5214-5222.

83. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Kabanov V.A. Reversibility of structural rearrangements in the negative vesicular membrane upon electrostatic adsorption/desorption of the polycation.// Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1560. P. 1424.

84. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Ermakov Y.A., Kabanov V.A. Reversibility of structural rearrangements in lipid membranes induced by adsorption-desorption of a polycation// Membr. Cell Biol. 1997. V. 10. P. 683-688.

85. G.G. Hammes, S.E. Schullery. Structure of macromolecular aggregates. Construction of model membranes from phospholipids and polypeptides// Biochemistry. 1970. №9. P. 2555-2563.

86. Gad AE, Silver BL, Eytan GD. Poly cation-induced fusion of negatively-charged vesicles// Biochim Biophys Acta.1982. 690(1). P. 124-132.

87. Walter A, Steer CJ, Blumenthal R. Polylysine induces pH-dependent fusion of acidic phospholipid vesicles: a model for polycation-induced fusion// Biochim Biophys Acta. 1986. 861(2). P. 319-330.

88. Bordi F, Cametti C, Diociaiuti M, Gaudino D, Gili T, Sennato S. Complexation of anionic polyelectrolytes with cationic liposomes: evidence of reentrant condensation and lipoplex formation//Langmuir. 2004. 20(13). P. 5214-22.

89. A.A. Yaroslavov, V.Ye. Kulkov, F.S. Polinsky, B.A. Baibakov, V.A. Kabanov. A polycation causes migration of negatively charged phopholipids from the inner to outer leaflet of the liposomal membrane// FEES Lett. 1994. V. 340. P. 121-123.

90. Gad AE. Cationic polypeptide-induced fusion of acidic liposomes// Biochim Biophys Acta. 1983. 728(3). P. 377-82.

91. Akesson, T., Woodward, C., Jonsson, B.J. Electric double layer forces in the presence of polyelectrolytes II J. Chem Phys. 1989. V. 91. P. 2461-2469.

92. Linse P. Adsorption of weakly charged polyelectrolytes at oppositely charged surfaces. // Macromolecules. 1996. V. 29. P. 326-336.

93. M. Brynda, P. Chodanowski, and S. Stoll. Polyelectrolyte-particle complex formation. Polyelectrolyte linear charge density and ionic concentration effects// Polymer and Colloid Science. 2002. V. 280. P. 789-797.

94. Кученкова O.E., Ярославов A.A., Кабанов B.A. Размер отрицательно заряженных липосом решающим образом влияет на их взаимодействие с полилизином// Доклады Акад. Наук. 1999. Т. 369. С. 778-780.

95. Kleinschmidt J.H., Marsh D. Spin-label electron spin resonance studies on the interactions of lysine peptides with phospholipid membrane// Biophys. J. 1993. V.73. P. 2546-2555.

96. Tighe A. Spurlin, Andrew A. Gewirth. Poly-L-Lysine-Induced Morphology Changes in Mixed Anionic/Zwitterionic and Neat Zwitterionic-Supported Phospholipid Bilayers// Biophysical Journal. 2006. V. 91, P. 2919-2927.

97. Macdonald P.M., Crowell K.J., Franzin C.M., Mitrakos P, Semchyschyn D.J. Poly electrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective// Biochem Cell Biol. 1998. 76(2-3). P.452-64.

98. Xie AF, Granick S. Phospholipid membranes as substrates for polymer adsorption// Nat Mater. 2002. 1(2). P. 129-33.

99. G. Laroche, D. Carrier, M. Pezolet. Study of the effect of poly(L-lysine) on phosphatidic acid and phosphatidylcholine/phosphatidic acid bilayers// Biochemistry. 1988. № 27. P. 6220-6228.

100. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J.-F., Pezolet M. A fluorescence investigation of the effects of polylysine on dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers// Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 820. P. 131-139.

101. Feng Z.V., Granick S, Gewirth A.A. Modification of a supported lipid bilayer by polyelectrolyte adsorption// Langmuir. 2004. V. 20. P. 8796-804.

102. Epand RM, Lim W. Mechanism of liposome destabilization by polycationic amino acids// Biosci. Rep. 1995. V. 15. P. 151-160.

103. Kozlova N.O., Bruskovskaya I.B., Okuneva I.B., Melik-Nubarov N.S., Yaroslavov A.A., Kabanov V.A., Menger F.M. Interaction of a cationic polymer with negatively charged proteoliposomes// Biochim Biophys Acta. 2001. 1514(1). P. 139-51.

104. A.A. Ярославов, У.А. Киселева, О.Ю. Удалых, В.А. Кабанов. Композиционный предел устойчивости жидких отрицательно заряженных липосом при контакте с поликатионом// Докл. Акад. Наук. 1996. Т. 349. С. 67-69.

105. Ozon F, di Meglio J.M., Joanny J.F. Adsorption of polyampholytes on charged surfaces// Ear Phys JE Soft Matter. 2002. V. 8(3). P. 321-30.

106. Dobrynin A.V. Polyampholyte adsorption on a charged sphere// Phys. Rev. 2001. V. 63. Is. 5.

107. Netz R.R., Joanny J.F. Complexation Behavior of Polyampholytes and Charged ObjectsII Macromolecules. 1998. V. 31(15). P. 5123-41.

108. B. Philipp, H. Dautzenberg, K.-J. Linow, L. Kotz, W. Dawydoff. Polyelectrilyte complexes recent developments and open problems// Prog. Polym. Sei. 1989. V. 14. P. 91-172.

109. V.A. Kabanov, A.B. Zezin. Water-Soluble nonstoichiometric polyelectrolyte complexes: a new class of syntetic polyelectrolytes// Sov. Sei. Rev. B. 1982. V. 2. P. 207282.

110. V.A. Kabanov, A.B. Zezin, M. I. Mustafaev. Soluble Interpolymeric Complexes as a New Class of Synthetuc Polyelectrolytes// Pergamon. 1980. P. 173-192.

111. Pawagi A.B., Campbell I.M. Vesicle surface charge and polylysine modification of ultraviolet absorption by the olefinic bonds in charged lipid// Can J Biochem. 1981. V. 59. P. 404-411.

112. Щукин Е.Д., Перцов A.B., Амелина E.A. Коллоидная химия. М.: Высшая школа. 2004. 96-102 с.

113. Блинов JI.M. Физические свойства и применение ленгмюровских моно- и мультимолекулярных структур. Успехи Химии. 1983. Т. 52. № 8. С. 1263-1300.

114. Gaines G.L. On the history of Langmuir-Blodgett films. Thin Solid Films. 1983. V. 99. P. 9-13.

115. Ghannam M.M., Mady M.M., Khalil W.A. Interaction of type-I collagen with phospholipid monolayer// Biophis. Chem. 1999. V. 80. P. 31-40.

116. Demel R.A., London Y. The specific interaction of myelin basic protein with lipids at the air-water interface// Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 311. P. 507-519.

117. Shafer P.T. The interaction of polyamino acids with lipid monolayers// Biochim. Biophys. Acta. 1974. V. 373. P. 425-435.

118. Gawrish K., Barry J.A., Holte L.L., Sinnwell T., Bergelson L.D., Ferretti J.A. Role of interactions at the lipid-water interface for domain formation// Mol. Membr. Biol. 1995. V. 12. P. 83-88.

119. J. Engelking, M. Wittemann, M. Rehahn, H. Menzel. UV/Vis spectroscopic monitoring of polyelectrolyte adsorption onto monolayers of azobenzene amphiphiles// Langmuir. 2000. № 16. 3407-3413.

120. Bordi F., De Luca F., Cametti C., Nagliely A., Misasi R., Sorice M. Interactions of mono- and di-sialogangliosides with phospholipids in mixed monolaers at the air-water surface// Colloids Surfaces. 1999. V. 13. P. 135-142.

121. Bordi F., De Luca F., Cametti C., Gibi T., Gaudino D., Sennato S. Charged lipid monolayers at the air-solution surfase: coupling to polyelectrolytes// Colloids Surfaces. 2003. V. 29. P. 149-157.

122. Pezron E., Claesson M., Berg J.M. and Vollhardt D. Stability of arachidic acid monolayers on aqueous salt solution// J. of Coll. and Int. Sci. 1990. V. 138. P.245-254.

123. V.J. Morris//Pergamon, Prog. Biophys. molec. Biol. 1994. V. 61, P. 131-185.

124. D.K. Schwartz, R. Viswanathan, J.A. Zasadzinski. Surface order and stability of Langmuir-Blodgett films// J. Phys. Chem. 1992. V. 96. P. 10444-10447.

125. Kolb H. A., Enders O., Schauer R. Morphology of native and reconstructed biological membranes and their components analysed with atomic force microscopy// Applied Physics. 1999. V. 68. P. 247-254.

126. Hui S. U., Viswanathan R., Zasadzinski R. A.,Israelachvili J., N. The structure and stability of phospholipid bilayers by atomic force microscopy // Biofhysical Journal. 1995. V. 68. P. 171-178.

127. R. Viswanathan, D.K. Schwartz, J. Garnaes, J.A.N. Zasadzinski. Atomic Force Microscopy imaging of substrate and pH effects on Langmuir-Blodgett monolayers// Langmuir. 1992. № 8. P. 1603-1607.

128. Montal M. Formation of biomolecular membranes from lipid monolayers// Mehod in enzym. 1974. V. 32. P. 545-556.

129. Montal M. Reconstitution of channel proteins from excitable cells in plannar lipid bilayer membranes// J. membrane boil. 1987. V. 98. P. 105-111.

130. Vaz W.L.C., Derzco I., Jacobson K.A. Photobleaching measurements of the lateral diffusion of lipids and proteins in artificial phospholipid bilayer membranes// Cell surface reviews. 1982. V. 8. P. 84-128.

131. Fuoss, R.M.; Strauss, U.P. Poly-4-vinylpyridonium chloride and poly-4-vinyl-N-butylpyridonium bromide//./ Polym. Sci. 1948. № 3. P. 246.

132. Кирш Ю.Э., Плужнов C.K., Шомина T.C.,Кабанов В.А., Каргин В.А. Синтетические полимерные аналоги ферментов, обладающие эстеразной активностью// Высокомол. Соед. 1970. № 1. С. 186.

133. Krylova, О.О.; Melik-Nubarov, N.S.; Badun, G.A.; Ksenofontov, A.L.; Menger, F.M.; Yaroslavov A.A. Pluronic L61 accelerates flip-flop and transbilayer doxorubicin permeation// Chemistry. A European Journal. 2003. V. 9. P. 3930-3936.

134. V.A.Izumrudov, N.I.Domashenko, M.V. Zhiryakova, A.A.Rakhnyanskaya. Effect of Alkyl Spacer in the Betaine Moiety pf Polycarboxybetaines on Their Complexing With Poly(methacryIic acid) and DNA// Macromol. Rapid Commun. 2005. № 26. P. 1060-1063.

135. Yaroslavov A.A., Yaroslavova E.G., Rakhnyanskaya A.A., Menger F.M., Kabanov V.A. Modulation of interaction of polycations with negative unilamellar lipid vesicles// Colloids Surf. 1999. V. 16B. P. 29.

136. Ohno H., Shimidzu N., Tsuchida E., Sasakawa S., Honda K. Fluorescence polarization study on the increase of membrane fluidity of human erythrocyte ghostsinduced by synthetic water-soluble polymers// Biochim. Biophys. Acta. 1981. V.649. P. 221.

137. IkedaT., Lee B., Yamaguchi Y., Tazuke S. Time-resolved fluorescence anisotropy studies on the interaction of biologically active polycations with phospholipid membranes 11 Biophys. Biochim. Acta. 1990. V. 1021. P. 56.

138. Kabanov, V.A.; Yaroslavov, A.A.; Sukhishvili, S.A. Interaction of Polyions with Cell-Mimetic Species: Physico-Chemical and Biomedical AspectsII J.ControlledRelease. 1996. №39. P. 173-189.