Конформационные и спиновые переходы в органических, элементоорганических и координационных парамагнитных зондах по данным спектроскопии ЯМР и ЭПР тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ



УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ИМ. А.Н. НЕСМЕЯНОВА РАН

На правах рукописи

ООУ^ г^^1 * НОВИКОВ ВАЛЕНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ

КОНФОРМАЦИОННЫЕ И СПИНОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ В ОРГАНИЧЕСКИХ, ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ И КООРДИНАЦИОННЫХ ПАРАМАГНИТНЫХ ЗОНДАХ ПО ДАННЫМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР И ЭПР

02.00.04 - физическая химия 02.00.08 - химия элементоорганических соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

1 8 НК)Ц ЭДЭД

003473571

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова и Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Научные руководители:

профессор, доктор химических наук Волошин Ян Зигфридович

профессор, доктор физико-математических наук Тимофеев Владимир Петрович

Соловьева Анна Борисовна Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Федорова Ольга Анатольевна Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Ведущая организация Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова, химический факультет

Защита диссертации состоится 26 июня 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.250.01 по присуждению ученой степени кандидата химических наук в Учреждении Российской академии наук Институте элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН по адресу. 119991, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Вавилова, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЭОС РАН. Автореферат разослан 25 мая 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

Официальные оппоненты:

профессор, доктор химических наук

профессор, доктор химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Конформационная подвижность биологических макромолекул, в частности белков, является определяющим фактором протекания практически всех биохимических процессов. Сложнейшие белковые «молекулярные машины» в процессе своего функционирования подвергаются значительным конформационным изменениям, важным для проявления их функций. Однако, за небольшим исключением, существующие в настоящее время методы исследований позволяют лишь приблизительно определить структуру как активного центра фермента, так и всего белка.

Использование прямого метода рентгеноструктурного анализа также не во всех случаях позволяет сделать вывод о механизме действия белка, поскольку статическая пространственная структура в кристалле, которую можно установить при помощи дифракционных методов, может в значительной степени отличаться от динамически изменяющейся структуры изучаемой макромолекулы в растворе. Кроме того, вышеуказанные методы предоставляют информацию о структуре белка, соответствующую наиболее устойчивому состоянию системы, и не дают возможности изучить динамику белковой структуры и ее информационную подвижность. Между тем, именно эти факторы в значительной степени ответственны за проявления биологической активности белков и других классов биологических макромолекул. Как результат, в настоящее время, несмотря на значительный прогресс в структурной биологии, все еще наблюдается дефицит методов, которые могут быть использованы для изучения динамической структуры макромолекул. Спектроскопия ЭПР является эффективным методом исследования структуры и динамики макромолекул в растворе. Комбинированное использование спектроскопии ЯМР и метода спиновых меток, при котором источником дополнительной информации о структуре и динамике системы является взаимодействие парамагнитного центра с магнитными моментами ядер, позволяет исследовать объекты, недоступные для стандартных методов ЯМР и ЭПР.

Таким образом, тщательный анализ особенностей структуры и динамики парамагнитных меток и зондов на основе нитроксильных радикалов и парамагнитных ионов переходных металлов, составляющий предмет диссертационной работы, предоставляет широкие возможности для их использования при изучении различных биологических и супрамолекулярных систем.

Связь работы с научными программами, планами, темами. Работа выполнена в соответствии с тематиками Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (ГК № 02.513.12.0005, ГК № 02.513.11.3251), программ фундаментальных

исследований Отделения химии и наук о материалах № 9 «Медицинская и биомолекулярная химия», «Химия и физикохимия супрамолекулярных систем и атомных кластеров» и «Создание научных основ экологически безопасных и ресурсосберегающих химико-технологических процессов», программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Развитие методологии органического синтеза и создание соединений с ценными прикладными свойствами» и «Молекулярная и клеточная биология» и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 06-03-32626, 06-03-90903, 07-03-00765, 07-03-12144, 07-03-12183, 08-03-00341, 08-03-00399, 08-03-90107, 09-03-00540 и 09-03-00688).

Целью работы являлся поиск новых путей исследования динамической структуры биологических макромолекул и супрамолекулярных структур при помощи парамагнитных меток и зондов, позволяющих получать информацию как о макроскопических характеристиках молекул в растворе, так и о слабоамплитудных локальных конформационных изменениях. Основными задачами исследования являются:

- анализ существующих методов теоретического моделирования спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в растворе и определение областей их применимости;

- исследование ряда спин-меченых белков и интерпретация полученных спектров ЭПР при помощи методов, обеспечивающих повышение достоверности результатов за счет регистрации большого числа спектров ЭПР при разных значениях температуры и вязкости, а также за счет регистрации спектров ЭПР в разных частотных диапазонах при параллельном расчете траекторий молекулярной динамики для исследуемых белков;

- установление возможности использования макробициклических трис-диоксиматов (клатрохелатов) кобальта(П) в качестве репортерских групп и сдвигающих реагентов в спектроскопии ЯМР;

- определение с использованием методов ЭПР и магнетохимии молекулярной и электронной структуры ряда клеточных комплексов кобальта(П), перспективных с точки зрения создания новых эффективных парамагнитных зондов.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. Установлено, что при совместном использовании методов молекулярной динамики и метода спиновых меток симуляция спектров ЭПР из траекторий молекулярной динамики, проводимая на основании формализма частичного усреднения магнитных тензоров, приводит к значительному улучшению согласования рассчитанных спектров с экспериментальными по сравнению с формализмом ориентационного потенциала.

Продемонстрирована чувствительность метода спиновых меток, основанного на изучении зависимости формы спектра ЭПР от температуры и вязкости, как к температурно-индуцируемым конформационным переходам, так и к образованию комплексов белок-белок.

Установлено, что в ряде макробициклических трис-диоксиматов кобальта(Н) наблюдаются значительные псевдоконтактные сдвиги в спектрах ЯМР, обуславливающие потенциал этого класса соединений в качестве сдвигающих реагентов и парамагнитных зондов.

Методами магнетохимии и спектроскопии ЯМР обнаружены спиновые переходы в макробициклических гексахлор-содержащих трис-диоксиматах кобальта(П) и подробно изучена их электронная структура.

Апробация результатов работы.

Основные результаты работы были представлены на международных конференциях "Modern Development of Magnetic Resonance" (Казань, Россия, 2004, 2007), "International conference on new techniques and applications of modem physical chemical methods for environmental studies" (Ростов-на-Дону, Россия, 2008), "51st Annual Meeting of Biophysical Society" (Salt Lake City, USA, 2005), "Conference of the International Symposium on Electron Spin Science and the 46th Annual Meeting of the Society of Electron Spin Science" (Shizuoka, Japan, 2007), "EUROMAR-2008" (Санкт-Петербург, Россия, 2008), "9th European Biological Inorganic Chemistry Conference", (Krakow, Poland, 2008), «Высокоспиновые молекулы и молекулярные магнетики» (Екатеринбург, Россия, 2008), "Joint Conference of 13th In Vivo EPR Spectroscopy and Imaging 10th International EPR Spin Trapping/Spin Labeling" (Fukuoka, Japan, 2008).

Публикации.

Основной материал диссертации изложен в 5 статьях в ведущих отечественных и международных научных изданиях, а также тезисах 9 докладов на международных конференциях и симпозиумах.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов (7 глав), экспериментальной части, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 134 страницах, содержит 9 таблиц и 73 рисунка. Список литературы включает 105 наименований.

Образцы белков для исследования методом спин-метки были предоставлены Т.Г. Баландиным, С.М. Деевым, Р.В. Агафоновым и Д.И. Левицким. Образцы клатрохелатов железа(П) и кобальта(П), изученные методами магнитного резонанса, были получены О.А. Варзацким (ИОНХ НАНУ, Киев) и А.С. Беловым, А.Ю. Лебедевым, И.Г. Макаренко

(ИНЭОС РАН, Москва). Автор считает своим долгом выразить вышеупомянутым коллегам глубокую признательность. Автор также выражает благодарность A.C. Перегудову (ИНЭОС РАН, Москва) за предоставление приборного времени на спектрометре ЯМР, A.B. Фионову (МГУ) за помощь в регистрации спектров ЭПР при пониженных температурах и К.А. Лысенко (ИНЭОС РАН, Москва) за проведение рентгенодифракционных исследований и квантовохимических расчетов. Автор особенно благодарен Ю.Е. Несмелову и Я.В. Ткачеву за неоценимую помощь в работе и плодотворные дискуссии.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цели и задачи исследования, показана научная новизна и значимость работы.

В литературном обзоре (глава 1) рассмотрены основы использования методов электронного парамагнитного резонанса для исследования динамической структуры биологических макромолекул. Рассмотрены теоретические основы метода спиновых меток, основные подходы к интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул, в том числе с использованием существующих на настоящий момент методов симуляции спектров ЭПР. Особое внимание уделено анализу существующих в настоящее время моделей для описания динамических процессов, в которых участвует спиновая метка, в первую очередь, таких как модель быстрого движения аминокислотных остатков и модель медленно релаксирующей локальной структуры. Дополнительно рассмотрены способы интерпретации спектров ЭПР при одновременном использовании методов молекулярной динамики и конформационного анализа.

Глава 2. Совместное использование методов спиновых меток и молекулярной динамики.

2.1. Общая характеристика существующих методов расчета спектров ЭПР спин-меченых макромолекул

Основным способом интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул является теоретическое моделирование формы линии спектра. Широкое разнообразие известных методов моделирования затрудняет анализ достоинств и недостатков каждого из существующих подходов и осложняет выбор метода, подходящего для интерпретации данных конкретного эксперимента. В основе подавляющего большинства существующих на настоящий день методов симуляции спектров ЭПР спин-меченых макромолекул лежит решение стохастического уравнения Лиувилля. Дальнейшая классификация указанных методов может быть проведена на основе формализма, используемого для описания анизотропного движения спиновой метки по отношении к глобуле белка. Первый из них базируется на формализме ориентационного потенциала, а второй использует тот или иной

Рис. 1. Проекции функций распределения Эйлеровых углов для трех траекторий МД. вариант формализма частичного усреднения тензоров. В рамках обоих формализмов предполагается, что переориентация спиновой метки относительно макромолекулы и движение всего белка должны учитываться независимо.

2.2. Стабильные интермедиаты актин-миозинового цикла по данным метода спин-метки

В теории, при задании одинаковых начальных моделей движения спин-метки использование разных подходов симуляции должно приводить к идентичным спектрам ЭПР. Для сравнения практической применимости некоторых из них было проведено моделирование спектров ЭПР спин-меченых стабильных аналогов интермедиатов актин-миозиного АТФазного цикла на основе траекторий молекулярной динамики с последующим сравнением результатов расчетов со спектрами, полученными экспериментально. Были рассчитаны три траектории молекулярной динамики (МД) длительностью по 5 не для трех основных стабильных интермедиатов актомиозинового цикла АРО, АОР и АЭР-У], имитирующих следующие состояния: состояние с незанятым нуклеотидом активным центром (АРО), состояние 81 непосредственно после генерации усилия со связанным в активном центре аденозиндифосфатом (АОР) и состояние, предшествующее генерации усилия со связанными в активном центре аденозиндифосфатом и неорганическим фосфатом (АБР+Р;). Полученные траектории были проанализированы и на их основе рассчитаны спектры ЭПР, которые сравнивали с экспериментально полученными спектрами.

2.3. Анализ траекторий молекулярной динамики

Для расчета спектра ЭПР спин-меченой макромолекулы из траектории МД необходимо получить информацию о переориентациях спин-метки по отношению к белку. Для каждого шага траектории МД получали набор из трех Эйлеровых углов, характеризующих ориентацию нитроксильной системы координат в системе отсчета, связанной с белком. На Рис. 1 показаны проекции функций распределения в пространстве Эйлеровых углов. Очевидно, что для траектории АРО каждая из проекций может быть описана при помощи функции нормального распределения. Для двух других форм миозина функция распределения имеет более сложную форму. В случае АВР-\^ на проекциях особенно

хорошо заметно, что функция распределения включает в себя две составляющие, каждая из которых с высокой достоверностью соответствует нормальному распределению. Анализ зависимости Эйлеровых углов от времени указывает на то, что для системы характерно долгое пребывание вблизи каждого из локальных минимумов с редкими переходами между ними. При этом переход от одного локального минимума к другому реализуется за пренебрежимо малое время, поэтому можно сделать предположение о том, что спектр представляет собой суперпозицию двух независимых составляющих, относящихся к разным локальным минимумам. Поэтому траектории молекулярной динамики были разделены на составляющие, которые обрабатывали независимо, а затем полученные спектры суммировали с соответствующими вкладами.

2.4. Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма частичного усреднения тензоров

При расчет спектров использовали формализм частичного усреднения магнитных тензоров, в рамках которого принимали, что весь процесс быстрой переориентации спин-метки относительно белка может быть описан путем частичного усреднения значений магнитных тензоров спин-метки. Влияние медленной броуновской диффузии всего белка учитывали путем решения стохастического уравнения Лиувилля.

Усреднение магнитных тензоров проводили на основании выражения:

В = Т~1АТ. (1)

где А - исходный §-тензор, либо тензор сверхтонкого взаимодействия, В - усредненный тензор, а Т - матрица направляющих косинусов, зависящая от значений Эйлеровых углов. Запишем выражение для компоненты Вху усредненного тензора:

К = 4» +Лху {}р,лгр(п)й'п+л„ Яргл,р(П№ (2)

п п п

гдср(П) = р(<р,0,Ц!) — функция плотности распределения Эйлеровых углов, определяемая из

траекторий МД, <К1 = ьхл9с1(р<16с1\1/- элемент пространства Эйлеровых углов с учетом

якобиана перехода Бшб, а являются элементами матрицы направляющих косинусов.

Обозначим первое слагаемое в правой части уравнения (2) как Вху и рассмотрим его нахождение более подробно:

V = Я!= ¡¡¡1„(ср,в,щ)1^(<р,0,¥)р{<рл¥)™в<1<р</вс111, (3)

п п

или, при переходе от тройного интеграла к повторному и численном вычислении значения интеграла:

_, 4 з N)

NiNj"k --1 j-1 1

При повторении указанной процедуры для всех компонент В находим, после диагонализации, главные значения усредненного тензора. Для ADP и ADP-Vi ввиду разделения траекторий были рассчитаны два набора частично усредненных тензоров с соответствующими весами.

Полученные значения усредненных тензоров были использованы для расчета спектров ЭПР, которые приведены на Рис. 2. Отмстим хорошее согласование симулированных спектров с экспериментальными данными как в Х-, так и в W- диапазонах.

2.5. Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма ориентационного потенциала

Для сравнения расчет спектров ЭПР из траекторий МД проводили в рамках формализма ориентационного потенциала, являющегося частью метода медленно релакеирующей локальной структуры SRLS (Z.C. Liang, J. Chem. Phys., 1999, 103, 6384). При этом принимали, что вся информация о движении спиновой метки относительно белка задается при помощи потенциала -U(n)/kT = (где У£(в,<р) - сферические гармоники),

L.K

который определяет форму функции плотности вероятности распределения ориентации спин-метки:

РвМ = -

ехр I 1..К

<1<р схр 1 ,к ,<р)

(5)

Для приближения функций плотности вероятности Рт(в,<р), полученных из траекторий МД, сферическими функциями необходимо было найти минимум следующей функции:

*2=1 (^(М-^ЛМ)2

(6)

Функция Рв(б,(р) хорошо передает все особенности функции Рш(в,ср), полученной из траекторий МД для формы миозина АОР-У: (Рис. 3). Однако значения коэффициентов сферических гармоник плохо согласуются с данными спектроскопии ЭПР (Рис. 4). Полученные данные свидетельствуют о том, что метод симуляции спектров ЭПР, основанный па использовании модели ЭЯЬЭ, при совместном использовании с методом молекулярной динамики не позволяет получить удовлетворительные результаты. В первую очередь, это связано с тем, что функция Рв[в,(р) определена в пространстве сферических координат, а не в пространстве Эйлеровых углов, и определение направления осей директора и ориентации молекулярной системы отсчета по отношению к диффузионной системе координат не может быть проведено однозначным образом, в частности из-за неясного физического смысла понятия диффузионной системы координат по отношению к спиновой метке, ковалентно присоединенной к белковой глобуле. Таким образом, внутренние ограничения, присущие модели БЫ^, значительно затрудняют се использование для интерпретации спектров спин-меченых белков.

Глава 3. Метод температурно-вязкостной зависимости в спектроскопии ЭПР.

эксперимент расчет

Рис. 3. Сравнение функции Рш(в,(р), полученной из траектории МД для АОРЛ',, и функции Рв (в,([>), рассчитанной на основе выражения (5) при использовании следующих коэффициентов: с о = 7.27, с22 = 3.80, с4о = 0.76.

Рис. 4. Сравнение экспериментально полученного спектра ЭПР спин-меченого АОР-У, и спектра, рассчитанного на основе модели ЯК1

Альтернативой использованию многочастотных спектров ЭПР и молекулярной динамики для повышения достоверности данных, получаемых в рамках метода спин-метки, является подход, названный «методом температурно-вязкостной зависимости» (В.П. Тимофеев, Молекулярная биология, 1986, 20, 697) и не требующий наличия дорогостоящих приборов или проведения сложных расчетов, в рамках которого изучают изменение формы спектра ЭПР при варьировании температуры и вязкости раствора спин-меченого белка. В настоящей работе этот подход использовали для изучения динамических характеристик уже описанных в предыдущей главе спин-меченых аналогов стабильных интермедиатов актин-миозинового цикла, а также для исследования образования белковых комплексов барстара и барназьг.

3.1. Основы метода температурно-вязкостной зависимости

Метод температурно-вязкостной зависимости основан на регистрации и анализе изменений, происходящих в спектрах ЭПР спин-меченых макромолекул, при варьировании таких макроскопических характеристик образца, как вязкость (путем прибавления к образцу сахарозы) и температура. В основе метода лежит предположение, согласно которому изменение вязкости образца влияет, в первую очередь, на время корреляции белковой глобулы как целого в растворе, не затрагивая локальную подвижность аминокислотных остатков, в том числе и спин-меченого остатка цистеина. С другой стороны, повышение температуры ведет как к увеличению подвижности всей белковой глобулы, так и к изменению динамических характеристик спин-меченого аминокислотного остатка, выражающемуся, как правило, в увеличении конформационного пространства, доступного для переориентаций спин-метки. В качестве анализируемого параметра используют расщепление, наблюдаемое между так называемыми крайними широкими пиками (КШП) (т.е. расстояние в гауссах между самым сильнопольным и самым слабопольным экстремумами в спектре).

В основе анализа полученного массива экспериментальных данных (порядка 20-25 спектров при 4-5 значениях вязкости и температуры) лежит построение графика зависимости расстояния между КШП (2А') от значения (Т/т|)р, где Т представляет собой температуру, ц -вязкость, ар- определяемый теоретически параметр. При этом для каждого значения температуры наблюдается линейная зависимость, анализ которой позволяет определить время корреляции спин-меченого белка и значение параметра упорядоченности спиновой метки, описывающее конформационную подвижность спиновой метки по отношению к ее окружению.

3.2. Стабильные интермедиаты актин-миозинового цикла

Описанный подход был применен для изучения описанных в предыдущей главе стабильных интермедиатов актин-миозинового цикла.

В случае АРО-формы миозина расстояния между крайними широкими пиками в спектрах ЭПР относительно слабо зависели как от температуры, так и от вязкости (Рис. 5А). Слабые изменения, происходящие в спектрах ЭПР при увеличении вязкости, могут быть связаны с агрегацией глобул миозина в растворе и с сопутствующим увеличением времени вращательной корреляции полученных агрегатов.

Спектры ЭПР, зарегистрированные для формы миозина АОР-Уь значительно больше зависят от температуры и вязкости (Рис. 5В). При температурах выше 20° С наклон графиков не зависит от температуры, однако ее понижение приводит к резкому увеличению этого наклона, что свидетельствует о значительном уменьшении эффективного времени корреляции белковой глобулы при низких температурах. Поскольку время корреляции всего белка зависит от размера белка и от его конформационной подвижности, логично предположить, что при понижении температуры до 10° С для миозина в форме АХ)Р-У| происходит температурно-индуцируемый конформационный переход. Полученных данных, однако, недостаточно для того, чтобы описать механизм указанного температурно-зависимого конформационного перехода и, тем более, связать указанный переход с какими-либо физиологическими функциями миозина. Тем не менее, нашей целью являлась демонстрация возможности использования метода спиновых меток для регистрации конформационных переходов в спин-меченых белках, затрагивающих не только ближайшее окружение спин-метки, но и весь белок в целом.

Рис. 5. Зависимость расстояния между КШП от температуры и вязкости в спектрах спин-меченого субфрагмекга-1 миозина в формах (А) АРО и (В) АИРЛ^.

3.3. Образование белкового комплекса барстар-барназа

Нами было исследовано образование комплекса между рибонуклеазой барназой (Вп) и ее ингибитором барстаром (Вэ) в модификации С40А, в которой сороковой остаток цистсина был заменен на остаток аланина, что приводит к существованию только одного цистеинового фрагмента С82 в аминокислотной последовательности белка, находящегося вблизи интерфейса связывания с барназой. Этот белок был отдельно помечен двумя спиновыми метками с различной конформационной подвижностью ковалентного линкера, связывающего нитроксил-содержащее кольцо с остатком цистеина (Рис. 6).

Зависимости расстояния между КШП в спектрах ЭПР спин-мсченого барстара и его комплекса с барназой от температуры и вязкости показаны на Рис. 7. Наклон полученной линейной зависимости по отношению к оси

т.

SL1

SL2

Рис. 6. Спин-метки с относительно гибким (БЫ) и жестким (5Ь2) линкерами

абсцисс позволил определить эффективные времена вращательной корреляции барстара и комплекса барстар-барназа, составляющие при 20° С 4 и 9 не соответственно. Эти же времена, определенные с использованием метки 81Л, равны 3 и 8.5 не соответственно. Расхождения в полученных значениях обусловлены, в первую очередь, неточностью определения положения крайних широких пиков в случае Вя-ЙИ.

Образование белкового комплекса приводит к увеличению параметра упорядоченности спин-метки как для БЫ, так и для БЬ2. Важно отметить, что при этом значения параметра упорядоченности для спиновой метки 81Л с более длинным и конформационно-лабильным линкером во всех случаях выше, чем для метки БЬ2 с жестким и коротким линкером, т.е. метка БЫ более ограничена в А своих переориентациях, чем метка 81,2. Этот результат

£

может быть объяснен только ^ тем, что метка БЫ попадает в другую область пространства, ограниченного близлежащими

(т/ч)'" (ЮсПэ)"'

14"', (ЮсПзГ

аминокислотными остатками Зависимости расстояния между КШП (2А') в спектрах ЭПР спин-

меченого барстара (1, о) и его комплекса с барназой (2, •) при 1°С при по сравнению с меткой БЬ2. использовании меток ЭИ (А) и (В).

Таким образом, было показано, что метод темпсратурно-вязкостной зависимости может быть использован как для исследования процессов, происходящих со спиновой меткой на микроскопическом уровне, таких как ее взаимодействие с ближайшими аминокислотами, так

и для описания свойств белковой глобулы в целом, в частности, для описания конформационных переходов или образования комплексов белок-белок.

Глава 4. Использование методов ЯМР для исследования клеточных комплексов переходных металлов.

4.1. Современные методики магнитного резонанса в исследовании макробициклических трис-диоксиматов железа(И) и кобальта(П)

Альтернативой использованию метода ЭПР для изучения спин-меченых систем является метод ЯМР. Действительно, наличие в составе спиновых меток неспаренного электрона приводит к заметных изменениям в спектрах ЯМР спин-меченых макромолекул из-за взаимодействия магнитного момента электрона с магнитными моментами ядер. В этом случае парамагнитные зонды должны отвечать ряду требований: связывание их с белком должно приводить к заметным изменениям в спектрах ЯМР (поэтому вместо малопригодных для этих целей нитроксильных спиновых меток используют парамагнитные ионы переходных металлов или лантанидов); они должны быть устойчивыми в различных средах и при различных значениях рН; размер молекул-зондов не должен быть слишком велик, поскольку слишком большие зонды неизбежно будут оказывать влияние на структуру изучаемой системы и затруднять анализ полученных данных. При этом абсолютно необходимо, чтобы парамагнитный ион металла был максимально изолирован от влияния растворителя и других молекул в растворе, чтобы избежать возможного дополнительного комплсксообразования и изменения характеристик парамагнитного зонда.

Таким требованиям отвечают клеточные комплексы переходных металлов, в частности макробициклические трис-диоксиматы кобальта(П).

4.2. Конформационная динамика бис-клатрохелатов железа(П)

На Рис. 8 представлены исследованные бис-клатрохелаты железа(П), молекулярные графы которых (буквами А, В, С и Б в узлах обозначены азометиновые атомы углерода и

каждой половине димера будут находиться по

Рис. 8. Сопряженные бис-клатрохелаты железа(П)

1-4, изученные с использованием метода ЯМР. Два узла типов В и С (Рис. 9а). Во втором

2 Х=С1

3 Х = Вг

4 Х = |

связанные с ними заместители) приведены на Рис. 9. Очевидно, что в зависимости от пространственных характеристик заместителя R, находящегося в узле А, могут наблюдаться две ситуации. В первом случае, когда происходит быстрое вращение вокруг одинарной связи D-D, связывающей два сопряженных клатрохслатных фрагмента, в

CI

Br

JL

JWL

Рис. 9. Схематическое представление структуры бис-клатрохелатов 1-4.

131.5 131.0 130.5 130.0 129.5 129.0 125.5 120.0 121

Рис. 10. Ароматические области спектров "С клатрохелатов 1-4.

случае, когда заместитель R достаточно объемен, это вращение заторможено. При этом система дополнительно характеризуется двугранным углом между двумя смежными реберными фрагментами различных клатрохелатных остовов, что приводит к понижению симметрии системы при значениях этого угла, отличных от 0 и 180° (Рис. 96). Такая система менее симметрична и узлы В и В', также как С и С' являются невырожденными, что должно сопровождаться удвоением числа сигналов в спектре.

На Рис. 10 представлены области спектра ЯМР 13С, соответствующие сигналам ароматических атомов углерода. Хорошо видно, что комплексы 1, 3 и 4 демонстрируют удвоенное количество сигналов в спектре (по четыре сигнала для орто-, мета-, пара- и unco-

\ i

9 R, =Ме, R2 = Ph

10 R, = Ph, R2 = Me

19 R, = Ph, R2 = CI

20 R, = Ph, R2 = S-h-C8H17

12 Ri = н-С4Н9, R = циклооктил 7 R, i = H-CleH33, R = Me

13 R, = н-С4Н9, R = Me 16 R, = h-C16H33, R = цикпогексил

14 Ri = н-С4Н9, R = S-Ph 17 Ri = н-С16Н33, R = циклооктил

15 Ri = н-С4Н9, R = Ph 18 Ri = н-С16Н33, R = Ph

22 Ri = Ph. R = S-h-C8H17 23 R, = Ph, R = S-h-C4H9

Рис. 11. Клеточные комплексы кобальта (II), изученные с использованием спектроскопии ЯМР.

атомов углерода), в то время как в спектре их хлор-содержащего аналога обнаружены только по два сигнала от каждого типа углеродов. Полученные данные позволяют предположить, что вследствие меньшего размера атома хлора в соединении 2 происходит быстрое вращение вокруг связи D-D и, как результат, усреднение, приводящее к вырождению атомов типа В и В', С и С'.

4.3. Парамагнитные сдвиги в клатрохелатах кобальта(И)

Спектры ЯМР, полученные для комплекса кобальта(И) 6 (Рис. 11) с гексадецильными

апикальными заместителями, свидетельствуют о влиянии парамагнитного иона на химические сдвиги ядер этого заместителя. Спектр, приведенный на Рис. 12, демонстрирует очень большие значения парамагнитных сдвигов, приводящие к тому, что протоны каждой метиленовой группы характеризуются своей собствен-5 ; 2 ¡о „ ,0 , ной величиной химического

Рис. 12. 'Н ЯМР спектр гексадецилборатного клеточного комплекса сдвига И ИХ сигналы не кобальта(Н) 6.

перекрываются.

На Рис. 13 приведена зависимость величины парамагнитного сдвига, определенного как разность между химическими сдвигами соответствующего ядра в парамагнитном

соединении 6 и его диамагнитном

А8

ч.

13 И 15

Номер метиленовой группы

железо-содержащем аналоге 5, от номера метиленовой группы, отсчитываемого от апикального атома бора. Практически полное совпадение величин

парамагнитных сдвигов для протонов и ядер 13С является дополнительным свидетельством псевдоконтактного характера наблюдаемых парамагнитных сдвигов, так как величины

Рис. 13. Величина парамагнитного сдвига в спектрах 'Н и "С комплекса 6 в зависимости от удаленности ядра от парамагнитного иона.

псевдоконтактного сдвига не зависят от гиромагнитного отношения ядра.

Спектр ЯМР 'Н гексаметил-

содержащего аналога комплекса 6

приведен на Рис. 14. Очевидно, что,

за исключением сигнала протонов

реберных метильных заместителей,

который сильно сдвинут в сильное

поле, другие сигналы в этом спектре

характеризуются сравнительно ' • а ■« -« -¡о -«

слабыми парамагнитными сдвигами. Рис- I4- 'н ЯМР спектр гексадецилборатного

диметилглиоксиматного клеточного комплекса кобальта(И) 7.

Важно отметить, что в данном Сигналы, соответствующие протонам метиленовых групп,

пронумерованы.

случае наблюдается небольшой

отрицательный парамагнитный сдвиг, т.е. сдвиг в сильное поле, в то время как в случае комплекса 6 с шестью реберными атомами хлора наблюдается значительный положительный парамагнитный сдвиг. При этом даже в случае комплекса 7 влияние парамагнитного иона на величину химического сдвига атомов метиленовых групп наблюдается более, чем через шесть ст-связей, что свидетельствует о его диполь-дипольной псевдоконтактной природе.

Поскольку величина парамагнитного сдвига определяется геометрическими характеристиками изучаемой системы, а также анизотропией тензора магнитной восприимчивости парамагнитного иона, существуют только две причины, объясняющие этот результат. Во-первых, принципиально различное положение осей тензора магнитной восприимчивости в этих комплексах могло привести к разным величинам парамагнитного сдвига. Во-вторых, резкое изменение анизотропии тензора магнитной восприимчивости также могло вызвать значительное изменение величин псевдоконтактных сдвигов так, что значительную роль стали играть и более слабые в данном случае контактные взаимодействия. Подобное изменение анизотропии тензора магнитной восприимчивости может иметь место, например, в том случае, если комплексы 6 и 7 различаются спиновыми состояниями инкапсулированного иона металла. Действительно, электронная конфигурация инкапсулированного иона двухвалентного кобальта сI7 подразумевает возможность существования двух низколежащих электронных состояний с отличающимся спином: низкоспиновое основное состояние характеризуется максимальным количеством спаренных электронов на орбиталях 1г8, в то время как в высокоспиновом состоянии электроны размещаются па а'-орбигалях в соответствии с правилом Гунда. В зависимости от типа лигандов, в поле которых находится парамагнитный ион металла, и от симметрии их

кристаллического поля возможно существование комплексов, являющихся низкоспиновыми или высокоспиновыми во всем интервале температур, а также соединений со спиновыми переходами, которые могут существовать в обоих спиновых состояниях в зависимости от внешних условий (температуры, давления, агрегатного состояния и т.д.). Мы предположили, что в растворе комплекс 7 является низкоспиновым, а клатрохелат 6 - высокоспиновым. Для подтверждения этого предположения был проведен анализ спектров ЯМР 'Н, 13С и 15Р ряда макробициклических комплексов кобальта(Н).

Дополнительным свидетельством принципиального отличия магнитных свойств комплексов с реберными атомами хлора от производных алифатических или ароматических а-диоксимов являются данные спектроскопии ЯМР на ядрах |9Р. В этом случае были зарегистрированы спектры ЯМР "И ряда комплексов кобальта(П) с одинаковыми борфторидными апикальными группами и различными реберными заместителями. Диамагнитный сдвиг |9Р апикальной группы ОзВР, характерный для макробициклических комплексов железа(Н), находится в узком диапазоне от -91 до -90 м.д. При этом химический сдвиг в комплексе Со(СЬОт)з(ВР)2 (8), для которого спектры ЯМР удается зарегистрировать только на ядре 'V из-за близости парамагнитного иона кобальта к азометиновым атомам углерода и атомам бора апикальных сшивающих фрагментов, что приводит к полному уширению их сигналов в ЯМР спектрах, равен - 60.7 м.д. Это свидетельствует о значительном положительном парамагнитном сдвиге. С другой стороны, парамагнитный сдвиг в спектрах комплексов с алифатическими и ароматическими реберными заместителями СоОтяВсКВКЬ (9, §>'г = - 111.6 м.д.) и СоВ(12Пт(ВР)2 (10, = - 110.1 м.д.) отрицателен и его величина меньше, чем в случае комплекса 8. Это указывает на заселенности различных спиновых состояний в изученных клатрохелатах: высокоспинового в случае гексахлор-содержащего комплекса и низкоспинового в случае комплексов с арильными и алкильными заместителями в хелатирукмцих а-диоксиматных фрагментах.

Анализ спектров ЯМР ряда комплексов кобальта(Н) показал, что магнитные свойства клеточных комплексов кобальта в значительной степени зависят от природы реберных заместителей. В спектрах комплексов с шестью реберными атомами хлора наблюдаются значительные псевдоконтактные сдвиги, что позволяет использовать эти соединения в качестве предшественников парамагнитных зондов и сдвигающих реагентов. В случае клеточных комплексов кобальта (II) с алифатическими и ароматическими реберными заместителями парамагнитные сдвиги имеют преимущественно контактную природу. Это различие может быть связано с заселенностью различных спиновых состояний в этих типах клеточных комплексов. Тем не менее, использование данных только спектроскопии ЯМР

недостаточно для определения спинового состояния иона кобальта(П) в указанных комплексах, поэтому клеточные комплексы были дополнительно охарактеризованы с использованием методов, которые являются общепринятыми для изучения спиновых состояний и спиновых переходов - магнетохимии и спектроскопии ЭПР.

Глава 5. Магнетохимическое изучение макробициклических трис-диоксиматов кобальта(П).

5.1. Магнетохимические характеристики комплекса Со(С12Ст)^ВСН^2 (24)

Температурная зависимость эффективного магнитного момента ц,фф мелкокристаллического образца 24 (Рис. 15) характерна для постепенного и неполного спинового перехода. В температурном диапазоне от 10 до 100 К значения эффективного магнитного момента близки к чисто спиновым для системы с $ = 1/2 (в частности, р,фф= 1.96В.М. при 100 К).

Дальнейшее повышение температуры

Рис. 15. Температурная зависимость эффективного приводит к постепенному увеличению магнитного момента дня комплекса 24.

магнитного момента. Тем не менее, даже при температуре 400 К спиновый переход не

завершен. На основании чисто спиновых значений были оценены заселенности дублетного и

квартетного состояний. Принимая во внимание постепенный характер спинового перехода,

для определения термодинамических параметров спинового перехода АН и Тс

экспериментальные данные были аппроксимированы при помощи простой больцмановской

1

функции Чш - 1 1(4/7/4Х1/Г-1/Гг)1

Для комплекса 24 удалось получить монокристаллы, позволившие провести многотемпературное рснтгснодифракционнос исследование и проследить за изменением геометрии комплекса при повышении температуры.

На Рис. 16 приведена температурная зависимость длин связей Со-Ы в координационном полиэдре комплекса 24 (по данным рентгенодифракционного исследования), а также по данным квантовохимического ВЗР\У91/6-31 Ю**-расчета низкоспинового и высокоспиного состояний соединения 24. Качественная схема расщепления ¿/-орбиталей, наблюдаемая при последовательном понижении симметрии комплекса от октаэдричсской до приведена на Рис. 17. Поворот вокруг одной из осей третьего порядка приводит к искаженной тригональной призме (ТП, точечная группа йз).

Длина связи Со-1М, А 2.15-,

Расчет Н.С.

Расчет 4 В.С. . .

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Т, К

Рис. 16. Температурная зависимость длин связей в

координационном полиэдре комплекса 24 по данным РСА и квантовохимического моделирования (в последнем случае значения температуры условны).

Ч--

-н- -

-Н---

-—н-

Рис. 17. Расщепление ¿-орбиталей при понижении симметрии от октаэдрической до

При электронной конфигурации иона металла с/ в случае низкоспинового комплекса и ТП-геометрии однократно занятая ВЗМО дважды вырождена, что приводит к проявлению эффекта Яна-Теллера и искажению геометрии молекулы. Природа клеточного лиганда такова, что за счет напряжений, возникающих в его жесткой макробициклической полиазомстиновой структуре, наиболее предпочтительным будет такое искажение, при котором не происходит значительного изменения расстояний между донорными атомами азота одного и того же хелатного цикла. Искажение этого типа происходит при смещении инкапсулированного иона кобальта из геометрического центра клеточного лиганда по направлению к двум из трех хелатирующих реберных фрагментов. Это позволяет снять

вырождение е8-орбиталсй и понизить энергию системы.

Данные многотемпературного рентгенодифракционного исследования также позволили оценить относительные заселенности высокоспинового и низкоспинового состояний клатрохелата 24. Как по данным РСА, так и в соответствии с результатами квантовохимических расчетов

400

т, К инкапсулированный ион кобальта в

Рис. 18. Температурная зависимость заселенности ВЫСОкоспиновом СОСТОЯНИИ находится высокоспинового состояния в комплексе 24 от температуры поданным магнетохимии (■) и РСА (А).

вблизи геометрического центра клеточного лиганда, в то время как в низкоспиновом состоянии этот ион значительно смсщсн в направлении двух из трех реберных фрагментов. Величина этого смещения была использована для оценки засоленностей дублетного и квартетного состояний.

На Рис. 18 приведены температурные зависимости засоленностей спиновых состояний комплекса 24, полученные на основании данных магнетохимии для мелкокристаллического образца и рентгеновской дифракции для монокристалла. Сплошные линии представляют собой оптимизированные кривые, полученные с использованием термодинамических параметров АН =616 см"', Тс = 286 К и АН = 839 см"1, Тс = 328 К для данных магнетохимии и РСА соответственно.

5.2. Влияние апикальных заместителей на магнитные свойства гексахлор-содержащих клеточных комплексов кобальта(П)

На Рис. 19 приведены температурные зависимости эффективных магнитных моментов для трех гексахлор-содержащих клеточных комплексов с различными апикальными сшивающими фрагментами. При низких температурах комплексы как с алифатическими н-бутильными (11) и н-гсксадецильными (6), ц в.м.

так и с фенильными (21) апикальными заместителями имеют магнитный момент, близкий к чисто спиновому значению, характерному для систем с 5 = 14. Повышение температуры приводит к увеличению цэфф. Фснилборатный макробициклический

комплекс 21 характеризуется более низкой температурой спинового перехода, чем

/

Г

зоо

алкил-содержащие аналоги, и, несмотря на Т, к

ТО, что при температуре 300 К спиновые Рис- 19' Температурные зависимости эффективного ' г г Jr магнитного момента для комплексов Со^ЬСп^Вя-С^Н?)*

переходы не завершены во всех трех случаях, а!)(-). С»(С,гот)3(ВС4н5)2 (21) (.) и Со(С12Ст)з(вл-

М6"33>2 (»Неочевидно, что заселенность высокоспинового

состояния выше для комплекса с фенильными апикальными заместителями.

Менее элсктроноакцспторныс реберные заместители приводят к заселенности только низкоспинового состояния соответствующих клатрохелатов кобальта(П). Так, в случае клеточных комплексов 9, 10, 14 и 23 величины |х,фф слабо зависят от температуры и соответствуют чисто спиновым значениям для низкоспиновых комплексов.

25

26

27

28

ЬВ> «-Ви

«Оук «Ч^Л

■^Ок,.,, „„А

ноХг „0Х

(Ли , <■««

но 1

но

(-Вц 1-6 и-

А

но *

но

29

30

31

Рис. 20. Фенол-содержащие клатрохелаты, использованные для получения свободно-радикальных продуктов окисления.

Глава б. Использование спектроскопии ЭПР для изучения особенностей электронной структуры клеточных комплексов кобальта и железа.

6.1. Фенол-содержащие макробициклические трис-диоксиматы

Для оценки способности клеточного лиганда к делокализации и стабилизации неспаренного электрона нами изучена серия фенол-содержащих клеточных комплексов железа(И) и кобальта(П) (Рис. 20), окисление которых оксидом свинца(1У) приводило к образованию достаточно устойчивых свободно-радикальных продуктов. Интерпретацию их спектров ЭПР проводили путем симуляции формы линии спектра в приближении быстрого движения радикалов в растворе. При расчете модифицировали величины констант

Рис. 21. Реберный фрагмент феноксильных заместителей в случае соединений 28-30. феноксил-содержащего

клатрохелатного остова и атомы, Следует отметить увеличение изотропной константы аы обуславливающие расщепление в спектрах ЭПР.

сверхтонкого взаимодействия с протонами реберного феноксильного заместителя, а также с ближайшим донорным атомом азота клатрохелатного остова (Рис. 21).

Ь.

Спектры монофеноксил-содержащих комплексов 25 и 26 содержали девять слаборасщепленных линий, обусловленных взаимодействием неспареного электрона с двумя эквивалентными протонами феноксильного заместителя и ближайшим донорным атомом азота клеточного остова (Рис. 22). Аналогичная картина сохранялась и при увеличении числа

Рис. 22. Экспериментальные и рассчитанные спектры ЭПР феноксил-содержащих комплексов 25-31. сверхтонкого взаимодействия с ближайшим атомом азота в ряду комплексов 25, 26 < 28 < 29, 30, свидетельствующее об увеличении степени делокализации неспаренного электрона на макробициклическом лиганде с увеличением числа реберных фенольных заместителей. Для соединения 27, в котором фенольный заместитель непосредственно присоединен к клеточному остову, степень делокализации неспаренного электрона выше, чем в случае фенолсульфидных комплексов, что приводит к шестикратному увеличению ан- В спектре кобальт-содержащего клатрохелата 25 было обнаружено также взаимодействие неспаренного электрона с ядром 59Со инкапсулированного иона кобальта(П).

6.2. Электронная структура инкапсулированного иона кобалъта(11) в клатрохелатах кобальта по данным спектроскопии ЭПР

ЭПР спектры стекол, полученных при замораживании толуольного раствора комплекса 24, характерны для низкоспинового состояния иона кобальта(Н). Приведенный на Рис. 23 спектр характеризуется слегка ромбическим §-тензором и содержит восемь хорошо расщепленных линий в слабопольной части спектра, обусловленных сверхтонким взаимодействием с ядром 59Со инкапсулированного иона кобальта(Н). На участке спектра, соответствующем ду-компоненте ^-тензора, дополнительно наблюдается сверхтонкая структура, обусловленная взаимодействием неспаренного электрона с донорными атомами азота. Анализ второй производной спектра ЭПР показал, что неспаренный электрон взаимодействует только с двумя из шести донорных атомов азота клеточного остова. Это, по видимому, объясняется Ян-Теллеровским понижением симметрии комплекса от Дг до Сл, приводящим к значительному смещению инкапсулированного иона кобальта из центра

клатрохелатного остова и предпочтительной локализации

орбитали, на которой находится неепаренный электрон, на одном из трех реберных фрагментов этого остова.

Во всех спектрах общими являются ромбичность ^-тензора и тензора сверхтонкой структуры, значительная близость значений g-

Рис. 23. Экспериментальный и рассчитанный спектры ЭПР фактора к р.факгору свободного комплекса 24 при температуре 20 К. Параметры, т г т

использованные для моделирования: а, = 1.989, г,,. =2.076, электрона и наличие дополнительной 2.263, А«(Со) = 4.64 мТ, А„(Со) = 0.66 мТ, А^Со) = 13.20 мТ,

А]«,(Ы) = 0.054 мТ. сверхтонкой структуры от

взаимодействия с донорными атомами азота клатрохелатного остова, а также отсутствие сигналов ЭПР высокоспинового иона кобальта(П) в изученном диапазоне температур. Для комплексов с борметильной, борбутильной и боргексадецильной апикальными группами этот факт согласуется с данными магнетохимических измерений, поскольку высокоспиновое состояние заселено только при относительно высоких температурах, при которых сигналы высокоспинового иона кобальта(П) зарегистрировать невозможно. Для комплекса с борфенильной апикальной сшивающей группой по данным магнетохимии высокоспиновое состояние в значительной степени заселено уже при 30 К. Отсутствие сигналов, соответствующих высокоспиновому состоянию инкапсулированных ионов кобальта(П), для этого комплекса может быть вызвано значительным уширением этих сигналов из-за релаксационных эффектов, существенных даже при низких температурах, а также относительно слабой заселенностью высокоспинового состояния при низкой температуре.

Отметим, что сверхтонкая структура, соответствующая взаимодействию неспаренного электрона с донорными атомами азота, хорошо разрешена только в спектре гексахлор-содержащих клатрохелатов. По-видимому, в алкильных и арильных комплексах степень делокализации неспаренного электрона на атомах реберных фрагментов достаточно велика, что приводит к понижению спиновой плотности на донорных атомах азота клатрохелатного остова и уменьшению соответствующих констант сверхтонкого взаимодействия. Практически полностью идентичными являются спектры комплексов с гомологичными апкилсульфидными заместителями: ядра, удаленные от парамагнитного иона более, чем на 34 сг-связи, не вносят значительного вклада в характер делокализации неспаренного электрона, что хорошо согласуется с данными спектроскопии ЯМР.

Глава 7. Ингибиторы протеазы ВИЧ на основе клеточных комплексов железа(П).

В Главе 7 рассмотрена возможность практического использования макробициклических трис-диоксиматных комплексов железа(П) в качестве терапевтических агентов для терапии ВИЧ. В качестве фармакологической мишени выступала протеаза ВИЧ, геометрия активного центра которой близка к форме молекул клатрохелатов.

На первой стадии была создана виртуальная библиотека структурных данных потенциальных ингибиторов протеазы ВИЧ, различающихся как апикальными, так и реберными заместителями. Затем при помощи метода молекулярного докинга определяли константу связывания ингибитора с белком и конформацию ингибитора в активном центре. Максимальная энергия связывания, полученная для соединения с циклогексильными реберными и ацетамидными апикальными заместителями составила - 13 ккал моль"1, что соответствует пикомолярной константе ингибирования. Кроме того, была проведена оценка ингибирующей способности указанного соединения по отношению к основным мутантным модификациям протеазы ВИЧ. Использование мутантного белка очень слабо изменяло энергию связывания (на 0.6 ккал моль"') и приводило лишь к небольшим изменениям в конечной константе ингибирования. Это свидетельствует о том, что макробициклические трис-диоксиматные комплексы железа (II) могут быть использованы для ингибирования не только нативной протеазы ВИЧ, но также и для ингибирования ее мутантных модификаций.

Глава 8. Экспериментальная часть.

В Главе 7 описано приготовление образцов для спектроскопических ЯМР и ЭПР

исследований, приведены параметры регистрации спектров, а также описаны методы, использованные для симуляции спектров ЭПР, протоколы расчета траекторий молекулярной динамики и молекулярного докинга.

ВЫВОДЫ

- Впервые проведен исчерпывающий анализ и сравнение основных существующих методов теоретического моделирования (симуляции) спектров ЭПР и описаны области применения и ограничения, свойственные для каждого из методов. Показано, что наиболее часто используемый в настоящее время метод симуляции спектров ЭПР на основе формализма ориентационного потенциала фактически неприменим для исследования спин-меченых белков в водных растворах.

- На примере мышечного белка миозина продемонстрирована чувствительность модифицированного метода спиновых меток, использующего зависимость формы спектра ЭПР от температуры и вязкости, к изменениям доменной подвижности стабильного аналога интермедиата актин-миозинового мышечного цикла АОР-У| при изменении температуры.

На примере комплекса барстар-барназа показана высокая информативность метода спиновых меток для изучения взаимодействия белок-белок.

- Методом ЯМР охарактеризован ряд макробициклических трис-диоксиматов кобальта(И), интерпретированы величины парамагнитных сдвигов и показана возможность использования этих соединений в качестве парамагнитных зондов.

- С использованием метода магнетохимии и спектроскопии ЯМР обнаружены спиновые переходы в гексахлор-содержащих клеточных комплекса кобальта(П).

- С использованием гетероядерной спектроскопии ЯМР обнаружено влияние размера реберных заместителей в новых сопряженных бис-клатрохелатах железа(П) на величину барьера вращения вокруг мостиковой С-С связи.

- С использованием спектроскопии ЭПР, многотемпературных рентгенодифракционных исследований и квантовохимических расчетов показано, что искажение геометрии координационного полиэдра в низкоспиновых клатрохелатных комплексах кобальта(Н) обусловлено проявлениями эффекта Яна-Теллера.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Timofeev V.P., Tkachev Y.V., Novikov V.V., Alyoshkin V.A., Lapuk V.A. Is the Fab-fragment from monoclonal rheumatoid IgM flexible? A spin label dynamics study // J. Biomol. Struct. Dyn.- 2005. - V.23, №2. - P. 175-181.

2. Тимофеев В.П., Ткачев Я.В., Новиков B.B., Варламова Е.Ю., Лапук В.А.. Сравнительное изучение глобулярной структуры Fab-фрагментов моноклональных ревматоидного и неревматоидного иммуноглобулинов М. // Биофизика. - 2005. - Т.50, №5. - С. 787 - 792.

3. Тимофеев В.П., Баландин Т.Г., Ткачев Я.В., Новиков В.В., Лапук В.А., Деев С.М.. Использование динамического метода спин-метки для изучения комплекса барстар-барназа. // Биохимия. - 2007. - Т.72, №9. - С. 1220 - 1230.

4. Timofeev V.P., Novikov V.V., Tkachev Ya.V., Balandin T.G., Deyev S.M. Spin label method reveals barnase-barstar interaction: a temperature and viscosity dependence approach. // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2008. - V.25, №5. - P. 525 - 534.

5. Voloshin Ya. Z., Varzatskii O. A., Belov A. S., Starikova Z. A., Suponitsky K. Y., Novikov V. V., Bubnov Yu. N. Interaction of dichloride iron(II) clathrochelate with dimercaptomaleodinitrile: synthesis of the precursor of monoribbed-functionalized phthalocyanmoclathrochelates and the unexpected formation of a new thiophene-containing heterocyclic system in the ribbed chelate fragment of the clathrochelate framework. // Inorg. Chem. - 2008. - V.47, №6. - P. 2155 - 2161.

6. Voloshin Ya. Z., Varzatskii O. A., Novikov V. V., Bubnov Yu. N. Biochemical and medicinal application of cage transition metal complexes: the design of new HIV protease inhibitors. // Proceedings of 9th EUROBIC. - 2008. - P. 71 - 76.

7. Novikov V.V., Timofeev V.P. The new program with WYSIWYG interface for EPR spectra simulation U Abstracts of International conference "Modern Development of Magnetic Resonance. - Kazan, Russia. - 2004. - P. 270.

8. Novikov V.V., Burr A.R., Thomas D.D., Nesmelov Y.E. Multifrequency EPR and site-directed spin labeling reveal structural dynamics within myosin SI. // Abstract book of 51st Annual Meeting of Biophysical Society. - Salt Lake City, Utah, USA. - 2006. - P. 482.

9. Novikov V. V., Tkachev Ya. V., Timofeev V. P. Describing spin label motion: ordering potential or partial averaging? // Abstract book of International Conference "Modern Development of Magnetic Resonance". - Kazan, Russia. - 2007. - P. 79.

10. Novikov V. V., Voloshin Ya.Z., Timofeev V. P. Describing spin label motion: Is the fast motion fast enough? // Abstract book of Conference of the International Symposium on Electron Spin Science and the 46th Annual Meeting of the Society of Electron Spin Science. - Shizuoka, Japan-2007.-P. 163.

11. Novikov V.V. Spin label study of the proteins: different approaches for accounting side-chain motion. // Abstract book of EUROMAR-2008. - St. Petersburg, Russia. - 2008. - P. 62.

12. Новиков B.B., Волошин Я.З. Дизайн, синтез и структура новых типов наноразмерных систем на основе комплексов с инкапсулированным ионом металла. // Сборников тезисов IX Международного семинара по магнитному резонансу. - Ростов-на-Дону, Россия. -2008.-С. 55.

13. Novikov V. V., Voloshin Ya.Z., Timofeev V. P. Spin label method: looking for universal approach to EPR spectra simulation of complex systems. // Joint Conference of 13th In Vivo EPR Spectroscopy and Imaging 10th International EPR Spin Trapping/Spin Labeling (EPR-2008). - Fukuoka, Japan. - 2008. - P. 31.

14. Волошин Я.З., Новиков B.B., Лебедев А.Ю., Пауков И.Е., Ковалевская Ю.А. Электронная и пространственная структура макробициклических комплексов кобальта(П) и спиновые переходы в них по данным РСА, магнетохимии, ЭПР и калориметрии И IV международная конференция «Высокоспиновые молекулы и молекулярные магнетики». -Екатеринбуг, Россия. - 2008. - Р. 15.

Заказ №108/05/09 Подписано в печать 21.05.2009 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 YAvw.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Структура и динамика биологических макромолекул по данным спектроскопии магнитного резонанса.

1.1. Основы метода спиновых меток.

1.2. Симуляция спектров ЭПР на основе атомистического моделирования.

ГЛАВА 2. Совместное использование методов спиновых меток и молекулярной динамикиЗЗ

2.1. Общая характеристика существующих методов расчета спектров ЭПР спин-меченых макромолекул.

2.2. Стабильные интермедиаты актин-миозинового цикла по данным метода спин-метки.

2.3. Анализ траекторий молекулярной динамики.

2.4. Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма частичного усреднения тензоров.

2.5. Расчет спектров ЭПР из траекторий МД на основе формализма ориентационного потенциала.

ГЛАВА 3. Метод температурно-вязкостной зависимости в спектроскопии ЭПР.

3.1. Основы метода температурно-вязкостной зависимости.

3.2. Стабильные интермедиаты актин-миозинового цикла.

3.3. Образование белкового комплекса барстар-барназа.

ГЛАВА 4. Использование методов ЯМР для исследования клеточных комплексов переходных металлов.

4.1. Современные методики ядерного магнитного резонанса в исследовании макробициклических трис-диоксиматов железа(И) и кобальта(П).

4.2. Конформационная динамика бис-клатрохелатов железа(Н).

4.3. Парамагнитные сдвиги в клатрохелатах кобальта(П).

ГЛАВА 5. Магнетохимическое изучение макробициклических трис-диоксиматов кобальта(И).

5.1. Магнетохимические характеристики комплекса Со(С120ш)з(ВСНз)2.

5.2. Влияние апикальных заместителей на магнитные свойства комплексов с шестью реберными атомами хлора.

ГЛАВА 6. Использование спектроскопии ЭПР для изучения особенностей электронной структуры клеточных комплексов кобальта и железа.

6.1. Фенол-содержащие макробициклические трис-диоксиматы.

6.2. Электронная структура инкапсулированного иона кобальта(И) в клатрохелатах кобальта по данным спектроскопии ЭПР.

ГЛАВА 7. Ингибиторы протеазы ВИЧ на основе клеточных комплексов железа(П).

7.1. Антиретровирусная терапия ВИЧ.

7.2. Ингибиторы протеазы ВИЧ на основе клеточных комплексов железе(И).

ГЛАВА 8. Экспериментальная часть.

8.1 Приготовление образцов спин-меченых белков.

8.2. Регистрация спектров ЭПР.

8.3. Симуляция спектров ЭПР.

8.4. Регистрация спектров ЯМР.

8.5. Расчет траекторий молекулярной динамики.

8.6. Молекулярный докинг клеточных комплексов железа(П) в активный центр протеазы

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. Конформационная подвижность биологических макромолекул, в частности белков, является определяющим фактором протекания практически всех биохимических процессов. Сложнейшие белковые «молекулярные машины» в процессе своего функционирования подвергаются значительным конформационным изменениям, важным для проявления их функций. Однако, за небольшим исключением, существующие в настоящее время методы исследований позволяют лишь приблизительно определить структуру как активного центра фермента, так и всего белка.

Использование прямого метода рентгеноструктурного анализа также не во всех случаях позволяет сделать вывод о механизме действия белка, поскольку статическая пространственная структура в кристалле, которую можно установить при помощи дифракционных методов, может в значительной степени отличаться от динамически изменяющейся структуры изучаемой макромолекулы в растворе. Кроме того, вышеуказанные методы предоставляют информацию о структуре белка, соответствующую наиболее устойчивому состоянию системы, и не дают возможности изучить динамику белковой структуры и ее конформационную подвижность. Между тем, именно эти факторы в значительной степени ответственны за проявления биологической активности белков и других классов биологических макромолекул. Как результат, в настоящее время, несмотря на значительный прогресс в структурной биологии, все еще наблюдается дефицит методов, которые могут быть использованы для изучения динамической структуры макромолекул. Спектроскопия ЭПР является эффективным методом исследования структуры и динамики макромолекул в растворе. Комбинированное использование спектроскопии ЯМР и метода спиновых меток, при котором источником дополнительной информации о структуре и динамике системы является взаимодействие парамагнитного центра с магнитными моментами ядер, позволяет исследовать объекты, недоступные для стандартных методов ЯМР и ЭПР.

Таким образом, тщательный анализ особенностей структуры и динамики парамагнитных меток и зондов на основе нитроксильных радикалов и парамагнитных ионов переходных металлов, составляющий предмет диссертационной работы, предоставляет широкие возможности для их использования при изучении различных биологических и супрамолекулярных систем.

Связь работы с научными программами, планами, темами. Работа выполнена в соответствии с тематиками Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК № 02.513.12.0005, ГК № 02.513.11.3251), программ фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах № 9 «Медицинская и биомолекулярная химия», «Химия и физикохимия супрамолекулярных систем и атомных кластеров» и «Создание научных основ экологически безопасных и ресурсосберегающих химико-технологических процессов», программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Развитие методологии органического синтеза и создание соединений с ценными прикладными свойствами» и «Молекулярная и клеточная биология» и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 06-03-32626, 06-03-90903, 07-0300765, 07-03-12144, 07-03-12183, 08-03-00341, 08-03-00399, 08-03-90107, 09-03-00540 и 09-03-00688).

Целью работы являлся поиск новых путей исследования динамической структуры биологических макромолекул и супрамолекулярных структур при помощи парамагнитных меток и зондов, позволяющих получать информацию как о макроскопических характеристиках молекул в растворе, так и о слабоамплитудных локальных конформационных изменениях. Основными задачами исследования являются:

- анализ существующих методов теоретического моделирования спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в растворе и определение областей их применимости; исследование ряда спин-меченых белков и интерпретация полученных спектров ЭПР при помощи методов, обеспечивающих повышение достоверности результатов за счет регистрации большого числа спектров ЭПР при разных значениях температуры и вязкости, а также за счет регистрации спектров ЭПР в разных частотных диапазонах при параллельном расчете траекторий молекулярной динамики для исследуемых белков;

- установление возможности использования макробициклических трис-диоксиматов (клатрохелатов) кобальта(И) в качестве репортерских групп и сдвигающих реагентов в спектроскопии ЯМР; определение с использованием методов ЭПР и магнетохимии молекулярной и электронной структуры ряда клеточных комплексов кобальта(П), перспективных с точки зрения создания новых эффективных парамагнитных зондов.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов.

Установлено, что при совместном использовании методов молекулярной динамики и метода спиновых меток симуляция спектров ЭПР из траекторий молекулярной динамики, проводимая на основании формализма частичного усреднения магнитных тензоров, приводит к значительному улучшению согласования рассчитанных спектров с экспериментальными по сравнению с формализмом ориентационного потенциала.

Продемонстрирована чувствительность метода спиновых меток, основанного на изучении зависимости формы спектра ЭПР от температуры и вязкости, как к температурно-индуцируемым конформационным переходам, так и к образованию комплексов белок-белок.

Установлено, что в ряде макробициклических трис-диоксиматов кобальта(И) наблюдаются значительные псевдоконтактные сдвиги в спектрах ЯМР, обуславливающие потенциал этого класса соединений в качестве сдвигающих реагентов и парамагнитных зондов.

Методами магнетохимии и спектроскопии ЯМР обнаружены спиновые переходы в макробициклических гексахлор-содержащих трис-диоксиматах кобальта(И) и подробно изучена их электронная структура.

Апробация результатов работы.

Основные результаты работы были представлены на международных конференциях "Modern Development of Magnetic Resonance" (Казань, Россия, 2004, 2007), "International conference on new techniques and applications of modern physical chemical methods for environmental studies" (Ростов-на-Дону, Россия, 2008), "5Ist Annual Meeting of Biophysical Society" (Salt Lake City, USA, 2005), "Conference of the International Symposium on Electron Spin Science and the 46th Annual Meeting of the Society of Electron Spin Science" (Shizuoka, Japan, 2007), "EUROMAR-2008" (Санкт

Петербург, Россия, 2008), "9th European Biological Inorganic Chemistry Conference", (Krakow, Poland, 2008), «Высокоспиновые молекулы и молекулярные магнетики» (Екатеринбург, Россия, 2008), "Joint Conference of 13th In Vivo EPR Spectroscopy and Imaging 10th International EPR Spin Trapping/Spin Labeling" (Fukuoka, Japan, 2008).

Публикации.

Основной материал диссертации изложен в 5 статьях в ведущих отечественных и международных научных изданиях, а также тезисах 9 докладов на международных конференциях и симпозиумах.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов (7 глав), экспериментальной части, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 134 страницах, содержит 9 таблиц и 73 рисунка. Список литературы включает 105 наименований.

выводы

1. Впервые проведен исчерпывающий анализ и сравнение основных существующих методов теоретического моделирования (симуляции) спектров ЭПР и описаны области применения и ограничения, свойственные для каждого из методов. Показано, что наиболее часто используемый в настоящее время метод симуляции спектров ЭПР на основе формализма ориентационного потенциала фактически неприменим для исследования спин-меченых белков в водных растворах.

2. На примере мышечного белка миозина продемонстрирована чувствительность модифицированного метода спиновых меток, использующего зависимость формы спектра ЭПР от температуры и вязкости, к изменениям доменной подвижности стабильного аналога интермедиата актин-миозинового мышечного цикла АЛР-У, при изменении температуры.

3. На примере комплекса барстар-барназа показана высокая информативность метода спиновых меток для изучения взаимодействия белок-белок.

4. Методом ЯМР охарактеризован ряд макробициклических трис-диоксиматов кобальта(П), интерпретированы величины парамагнитных сдвигов и показана возможность использования этих соединений в качестве парамагнитных зондов.

5. С использованием метода магнетохимии и спектроскопии ЯМР обнаружены спиновые переходы в гексахлор-содержащих клеточных комплекса кобальта(П).

6. С использованием гетероядерной спектроскопии ЯМР обнаружено влияние размера реберных заместителей в новых сопряженных бис-клатрохелатах железа(П) на величину барьера вращения вокруг мостиковой С-С связи.

7. С использованием спектроскопии ЭПР, многотемпературных рентгенодифракционных исследований и квантовохимических расчетов показано, что искажение геометрии координационного полиэдра в низкоспиновых клатрохелатных комплексах кобальта(П) обусловлено проявлениями эффекта Яна-Теллера.

1. Berliner L. J. Spin Labeling I. Theory and Application. // Academic Press Inc. New York. 1976.

2. Fajer P. G. Electron Spin Resonance Spectroscopy Labeling in Peptide and Protein Analysis // in Encyclopedia of Analytical Chemistry, R.A. Meyers (Ed.), John Wiley & Sons Ltd, Chichester. 2000. - C. 5725-5761.

3. Gaffney B. J. The Chemistry of Spin Labels // In Spin Labeling I. Theory and Application. Berliner, L.J. editors. Academic Press Inc. New York. 1976. - C. 183-338.

4. Altenbach C., Flitsch S. L., Khorana H. G., Hubbell W. L. Structural studies on transmembrane proteins. 2. Spin labeling of bacteriorhodopsin mutants at unique cysteines // Biochemistry. 1989. - T. 28. № 19. - C. 7806-7812.

5. McHaourab H. S., Lietzow M. A., Hideg K., Hubbell W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics // Biochemistry. 1996. - T. 35. № 24. - C. 7692-7704.

6. Керрингтон А., Маклечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии // М.: Мир. 1970.

7. Berliner L. J., Reuben. J. Biological Magnetic Resonance 8, Spin Labeling. // Plenum Press, New York. 1989.

8. Timofeev V. P., Tkachev Y. V., Novikov V. V., Alyoshkin V. A., Lapuk V. A. Is the Fab-fragment from monoclonal rheumatoid IgM flexible? A spin label dynamics study // J Biomol Struct Dyn. 2005. - T. 23. № 2. - C. 175-181.

9. Тимофеев В. П., Ткачев Я. В., Новиков В. В., Варламова Е. Ю., Лапук В. А. Сравнительное изучение глобулярной структуры Fab-фрагментов моноклональных ревматоидного и неревматоидного иммуноглобулинов М // Биофизика. 2005. - Т. 50. № 5. - С. 787-792.

10. Liang Z. С., Freed J. Н., Keyes R. S., Bobst A. M. An electron spin resonance study of DNA dynamics using the slowly relaxing local structure model // Journal of Physical Chemistry B. 2000. - T. 104. № 22. - C. 5372-5381.

11. Schneider D. J., Freed H. J. Calculating slow motional magnetic resonance spectra: a users guide. // In Biological Magnetic Resonance 8. Spin Labeling. L. J. Berliner and J. Reuben, editors. Plenum Press. New York. 1989. - C. 1-76.

12. Meirovitch E., Nayeem A., Freed H. J. Analysis of protein-lipid interactions based on model simulations of electron spin resonance spectra // Journal of Physical Chemistry -1984. T. 88. № 16. - C. 3454 - 3465.

13. Polimeno A., Freed J. H. Slow Motional Esr in Complex Fluids the Slowly Relaxing Local-Structure Model of Solvent Cage Effects // Journal of Physical Chemistry. - 1995. -T. 99. № 27. - C. 10995-11006.

14. Liang Z. C., Freed J. H. An assessment of the applicability of multifrequency ESR to study the complex dynamics of biomolecules // Journal of Physical Chemistry B. 1999. -T. 103. № 30. - C. 6384-6396.

15. Timofeev V. P., Samarianov B. A. About a new universal approach to the EPR spectra simulation of the spin-labeled molecules // Appl. Magn. Reson. 1993. - T. 4. - C. 523-539.

16. Ryckaert J.-P., Ciccotti G., Berendsen H. J. C. Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of n-alkanes // Journal of Computational Physics. 1977. - T. 23. № 3. - C. 327-341.

17. Timofeev V. P., Samarianov B. A. Dynamics of macromolecule spin-labelled side-chain groups by EPR spectra simulation // J. Chem. Soc. PERKIN TRANS. 1995. - T. 2. -C. 2175-2181.

18. Itzkowitz M. S. Monte Carlo Simulation of the Effects of Molecular Motion on the EPR Spectrum of Nitroxide Free Radicals // The Journal of Chemical Physics. 1967. - T. 46. № 8. - C. 3048-3056.

19. Robinson B. H., Slutsky L. J., Auteri F. P. Direct Simulation of Continuous Wave Electron-Paramagnetic Resonance-Spectra from Brownian Dynamics Trajectories // Journal of Chemical Physics. 1992. - T. 96. № 4. - C. 2609-2616.

20. Steinhoff H. J., Hubbell W. L. Calculation of electron paramagnetic resonance spectra from Brownian dynamics trajectories: application to nitroxide side chains in proteins // Biophys J. 1996. - T. 71. № 4. - C. 2201-2212.

21. Steinhoff H. J., Muller M., Beier C., Pfeiffer M. Molecular dynamics simulation and EPR spectroscopy of nitroxide side chains in bacteriorhodopsin // Journal of Molecular Liquids. 2000. - T. 84. № 1. - C. 17-27.

22. Beier С., Steinhoff H. J. A structure-based simulation approach for electron paramagnetic resonance spectra using molecular and stochastic dynamics simulations // Biophys J. 2006. - T. 91. № 7. - C. 2647-2664.

23. Stoica D. Using molecular dynamics to simulate electronic spin resonance spectra of T4 lysozyme // Journal of Physical Chemistry B. 2004. - T. 108. № 5. - C. 1771-1782.

24. Schwartz J. L., Stillman E. A., Freed H. J. Analysis of electron spin echoes by spectral representation of the stochastic Liouville equation // Journal of Chemical Physics. 1982. -T. 77. № 11. - C. 5410-5425.

25. Stoica I. Force field impact and spin-probe modeling in molecular dynamics simulations of spin-labeled T4 lysozyme // J Mol Model (Online). 2005. - Т. 11. № 3. - C. 210-225.

26. Stoica I. Solvent interactions and protein dynamics in spin-labeled T4 lysozyme // J Biomol Struct Dyn. 2004. - T. 21. № 6. - C. 745-760.

27. Usova N., Persson L., Westlund P. O. Theory of slow-motion EPR lineshapes for studies of membrane curvature // Physical Chemistry Chemical Physics. 2000. - T. 2. № 12. - C. 2785-2793.

28. Oganesyan V. S. A novel approach to the simulation of nitroxide spin label EPR spectra from a single truncated dynamical trajectory // J Magn Reson. 2007. - T. 188. № 2. - C. 196-205.

29. LaConte L. E., Voelz V., Nelson W., Enz M., Thomas D. D. Molecular dynamics simulation of site-directed spin labeling: experimental validation in muscle fibers // Biophys J. 2002. - T. 83. № 4. - C. 1854-1866.

30. Nikol'skii D. O., Timofeev V. P. Role of rapid movement of spin labels in interpreting EPR spectra for spin-labelled macromolecules. // Biofizika. 2003. - T. 48. № 4. - C. 606-617.

31. Timofeev V. P., Nikolsky D. O. The role of the fast motion of the spin label in the interpretation of EPR spectra for spin-labeled macromolecules // J Biomol Struct Dyn. -2003. T. 21. № 3. - C. 367-378.

32. Budil D. E., Sale K. L., Khairy K. A., Fajer P. G. Calculating slow-motional electron paramagnetic resonance spectra from molecular dynamics using a diffusion operator approach // J Phys Chem A. 2006. - T. 110. № 10. - C. 3703-3713.

33. Tombolato F., Ferrarini A., Freed J. H. Modeling the effects of structure and dynamics of the nitroxide side chain on the ESR spectra of spin-labeled proteins // J Phys Chem B. 2006. - T. 110. № 51. - C. 26260-26271.

34. Tombolato F., Ferrarini A., Freed J. H. Dynamics of the nitroxide side chain in spinlabeled proteins // J Phys Chem B. 2006. - T. 110. № 51. - C. 26248-26259.

35. Sezer D., Freed J. H., Roux B. Using Markov models to simulate electron spin resonance spectra from molecular dynamics trajectories // J Phys Chem B. 2008. - T. 112. №35.-C. 11014-11027.

36. Sezer D., Freed J. H., Roux B. Simulating electron spin resonance spectra of nitroxide spin labels from molecular dynamics and stochastic trajectories // J Chem Phys. 2008. - T. 128. № 16.-C. 165106.

37. Sezer D., Freed J. H., Roux B. Parametrization, molecular dynamics simulation, and calculation of electron spin resonance spectra of a nitroxide spin label on a polyalanine alpha-helix // J Phys Chem B. 2008. - T. 112. № 18. - C. 5755-5767.

38. Sezer D., Freed J. H., Roux B. Multifrequency electron spin resonance spectra of a spin-labeled protein calculated from molecular dynamics simulations // J Am Chem Soc. -2009. T. 131. № 7. - C. 2597-2605.

39. Foth B. J., Goedecke M. C., Soldati D. New insights into myosin evolution and classification // Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. T. 103. № 10. - C. 3681-3686.

40. Geeves M. A., Fedorov R., Manstein D. J. Molecular mechanism of actomyosin-based motility // Cell Mol Life Sci. 2005. - T. 62. № 13. - C. 1462-1477.

41. Taylor E. W. Transient phase of adenosine triphosphate hydrolysis by myosin, heavy meromyosin, and subfragment 1 // Biochemistry. 1977. - T. 16. № 4. - C. 732-739.

42. Phan B., Reisler E. Inhibition of myosin ATPase by beryllium fluoride // Biochemistry. 1992. - T. 31. № 20. - C. 4787-4793.

43. Goodno C. C. Inhibition of myosin ATPase by vanadate ion // Proc Natl Acad Sci U S A. 1979. - T. 76. № 6. - C. 2620-2624.

44. Werber M. M., Peyser Y. M., Muhlrad A. Characterization of stable beryllium fluoride, aluminum fluoride, and vanadate containing myosin subfragment 1-nucleotide complexes // Biochemistry. 1992. - T. 31. № 31. - C. 7190-7197.

45. Gopal D., Burke M. Formation of stable inhibitory complexes of myosin subfragment 1 using fluoroscandium anions // J Biol Chem. 1995. - T. 270. № 33. - C. 19282-19286.

46. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J. B., Smith R., Sutoh K., Holden H. M., Rayment I. X-ray structures of the myosin motor domain of Dictyostelium discoideum complexed with MgADP.BeFx and MgADP.A1F4 // Biochemistry. 1995. - T. 34. № 28. - C. 8960-8972.

47. Ponomarev M. A., Timofeev V. P., Levitsky D. I. The difference between ADP-beryllium fluoride and ADP-aluminium fluoride complexes of the spin-labeled myosin subfragment 1 // FEBS Lett. 1995. - T. 371. № 3. - C. 261-263.

48. Rayment I., Holden H. M., Whittaker M., Yohn C. B., Lorenz M., Holmes K. C., Milligan R. A. Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction // Science. 1993. - T. 261. № 5117. - C. 58-65.

49. Kabsch W., Mannherz H. G., Suck D., Pai E. F., Holmes K. C. Atomic structure of the actin:DNase I complex // Nature. 1990. - T. 347. № 6288. - C. 37-44.

50. Schroder R. R., Manstein D. J., Jahn W., Holden H., Rayment I., Holmes K. C., Spudich J. A. Three-dimensional atomic model of F-actin decorated with Dictyostelium myosin SI // Nature. 1993. - T. 364. № 6433. - C. 171-174.

51. Rayment I., Holden H. M. The three-dimensional structure of a molecular motor // Trends Biochem Sci. 1994. - T. 19. № 3. - C. 129-134.

52. Uyeda T. Q., Ruppel K. M., Spudich J. A. Enzymatic activities correlate with chimaeric substitutions at the actin-binding face of myosin // Nature. 1994. - T. 368. № 6471. -C. 567-569.

53. Anson M., Geeves M. A., Kurzawa S. E., Manstein D. J. Myosin motors with artificial lever arms // Embo J. 1996. - T. 15. № 22. - C. 6069-6074.

54. Thomas D. D., Seidel J. C., Hyde J. S., Gergely J. Motion of subfragment-1 in myosin and its supramolecular complexes: saturation transfer electron paramagnetic resonance // Proc Natl Acad Sci USA.- 1975. T. 72. № 5. c. 1729-1733.

55. Thomas D. D., Ishiwata S., Seidel J. C., Gergely J. Submillisecond rotational dynamics of spin-labeled myosin heads in myofibrils // Biophys J. 1980. - T. 32. № 3. - C. 873-889.

56. Barnett V. A., Thomas D. D. Saturation transfer electron paramagnetic resonance of spin-labeled muscle fibers. Dependence of myosin head rotational motion on sarcomere length // J Mol Biol. 1984. - T. 179. № 1. - C. 83-102.

57. Barnett V. A., Thomas D. D. Resolution of conformational states of spin-labeled myosin during steady-state ATP hydrolysis // Biochemistry. 1987. - T. 26. № 1. - C. 314323.

58. Fajer P. G., Fajer E. A., Schoenberg M., Thomas D. D. Orientational disorder and motion of weakly attached cross-bridges // Biophys J. 1991. - T. 60. № 3. - C. 642-649.

59. Raucher D., Fajer P. G. Orientation and dynamics of myosin heads in aluminum fluoride induced pre-power stroke states: an EPR study // Biochemistry. 1994. - T. 33. № 39. -C. 11993-11999.

60. Adhikari В., Hideg K., Fajer P. G. Independent mobility of catalytic and regulatory domains of myosin heads // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. T. 94. № 18. - C. 96439647.

61. Baker J. E., Brust-Mascher I., Ramachandran S., LaConte L. E., Thomas D. D. A large and distinct rotation of the myosin light chain domain occurs upon muscle contraction // Proc Natl Acad Sci U S A.'- 1998. T. 95. № 6. - C. 2944-2949.

62. Ostap E. M., Thomas D. D. Rotational dynamics of spin-labeled F-actin during activation of myosin SI ATPase using caged ATP // Biophys J. 1991. - T. 59. № 6. - C. 1235-1241.

63. Naber N., Lorenz M., Cooke R. The orientation of spin-probes attached to Cys374 on actin in oriented gels // J Mol Biol. 1994. - T. 236. № 3. - C. 703-709.

64. Arfken G. Mathematical Methods for Physicists // 3rd ed. Orlando, FL: Academic Press. 1985. - C. 198-200.

65. Новиков В. В., Тимофеев В. П. Новая программа с оконным интерфейсом для симуляции спектров ЭПР нитроксильных радикалов // III Съезд Биофизиков России, Воронеж, тезисы докладов. 2004. - Т. 1. - С. 78.

66. Novikov V. V., Timofeev V. P. New Programs with the WYSIWIG Interface for Simulation of EPR Spectra Nitroxide Spin-Label // международная конференция "Modern Development of Magnetic Resonance", Казань, тезисы докладов. 2004. - С. 270.

67. Тимофеев В. П. Сегментальная подвижность поли(и) и метод спин-метки // Молекулярная биология. 1986. - Т. 20. № 3. - С. 697-711.

68. Biosca J. A., Travers F., Barman Т. E. A jump in an Arrhenius plot can be the consequence of a phase transition. The binding of ATP to myosin subfragment 1 // FEBS Lett. 1983. - T. 153. № 1. - C. 217-220.

69. Deyev S. M., Waibel R., Lebedenko E. N., Schubiger A. P., Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module // Nat Biotechnol. 2003. - T. 21. № 12. - C. 1486-1492.

70. Dmitriev O. Y., Freedman K. H., Hermolin J., Filiingame R. H. Interaction of transmembrane helices in ATP synthase subunit a in solution as revealed by spin label difference NMR//Biochim Biophys Acta. 2008. - T. 1777. № 2. - C. 227-237.

71. Jager H., Koch A., Maus V., Spiess H. W., Jeschke G. Relaxation-based distance measurements between a nitroxide and a lanthanide spin label // J Magn Reson. 2008. - T. 194. № 2. -C. 254-263.

72. Lindfors H. E., de Koning P. E., Drijfhout J. W., Venezia B., Ubbink M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR // J Biomol NMR. 2008. - T. 41. № 3. - C. 157-167.

73. Clore G. M. Visualizing lowly-populated regions of the free energy landscape of macromolecular complexes by paramagnetic relaxation enhancement // Mol Biosyst. 2008. -T. 4. № 11. -C. 1058-1069.

74. Bertini I., Luchinat C., Parigi G., Pierattelli R. Perspectives in paramagnetic NMR of metalloproteins // Dalton Trans. 2008. № 29. - C. 3782-3790.

75. Voloshin Y. Z., Varzatskii O. A., Bubnov Y. N. Cage complexes of transition metals in biochemistry and medicine // Russian Chemical Bulletin. 2007. - T. 56. № 4. - C. 577605.

76. Pantani O., Naskar S., Guillot R., Millet P., Anxolabehere-Mallart E., Aukauloo A. Cobalt clathrochelate complexes as hydrogen-producing catalysts // Angew Chem Int Ed Engl. 2008. - T. 47. № 51. - C. 9948-9950.

77. Goodwin H. A. Spin crossover in cobalt(II) systems // Spin Crossover in Transition Metal Compounds Ii. Berlin: Springer-Verlag Berlin, 2004: T. 234.

78. Krivokapic I., Zerara M., Daku M. L., Vargas A., Enachescu C., Ambrus C., Tregenna-Piggott P., Amstutz N., Krausz E., Hauser A. Spin-crossover in cobalt(II) imine complexes // Coordination Chemistry Reviews. 2007. - T. 251. № 3-4. - C. 364-378.

79. Jean Y. Molecular Orbitals of Transition Metal Complexes. New York: Oxford University Press, 2005: C. 60-61.

80. Voloshin Y. Z., Varzatskii O. A., Vorontsov, II, Antipin M. Y. Tuning a metal's oxidation state: the potential of clathrochelate systems // Angew Chem Int Ed Engl. 2005. - T. 44. № 22. - C. 3400-3402.

81. Schinazi R. F., Sijbesma R., Srdanov G., Hill C. L., Wudl F. Synthesis and virucidal activity of a water-soluble, configurationally stable, derivatized C60 fullerene // Antimicrob Agents Chemother. 1993. - T. 37. № 8. - C. 1707-1710.

82. Friedman S. H., Ganapathi P. S., Rubin Y., Kenyon G. L. Optimizing the binding of fullerene inhibitors of the HIV-1 protease through predicted increases in hydrophobic desolvation // J Med Chem. 1998. - T. 41. № 13. - C. 2424-2429.

83. Bosi S., Da Ros T., Spalluto G., Balzarini J., Prato M. Synthesis and anti-HIV properties of new water-soluble bis-functionalized60.fullerene derivatives // Bioorg Med Chem Lett. 2003. - T. 13. № 24. - C. 4437-4440.

84. Marchesan S., Da Ros T., Spalluto G., Balzarini J., Prato M. Anti-HIV properties of cationic fullerene derivatives // Bioorg Med Chem Lett. 2005. - T. 15. № 15. - C. 36153618.

85. Zhu Z., Schuster D. I., Tuckerman M. E. Molecular dynamics study of the connection between flap closing and binding of fullerene-based inhibitors of the HIV-1 protease // Biochemistry. 2003. - T. 42. № 5. - C. 1326-1333.

86. Eads T. M., Thomas D. D., Austin R. H. Microsecond rotational motions of eosin-labeled myosin measured by time-resolved anisotropy of absorption and phosphorescence // J Mol Biol. 1984. - T. 179. № 1. - C. 55-81.

87. Margossian S. S., Lowey S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle // Methods Enzymol. 1982. - T. 85 Pt B. - C. 55-71.

88. Lanzetta P. A., Alvarez L. J., Reinach P. S., Candia O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate // Anal Biochem. 1979. - T. 100. № 1. - C. 9597.

89. Tarasov V. F., Shakurov G. S. // Appl. Magn. Res. -1991. T. 2. - C. 571. '

90. Stoll S., Schweiger A. EasySpin, a comprehensive software package for spectral simulation and analysis in EPR // J Magn Reson. 2006. - T. 178. № 1. - C. 42-55.

91. Phillips J. C., Braun R., Wang W., Gumbart J., Tajkhorshid E., Villa E., Chipot C., Skeel R. D., Kale L., Schulten K. Scalable molecular dynamics with NAMD // J Comput Chem. 2005. - T. 26. № 16. - C. 1781-1802.

92. Sale K., Sar C., Sharp K. A., Hideg K., Fajer P. G. Structural determination of spin label immobilization and orientation: a Monte Carlo minimization approach // J Magn Reson. 2002. - T. 156. № 1. - C. 104-112.

93. Jorgensen W. L., Chandrasekhar J., Madura J. D., Impey R. W., Klein M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water // Journal of Chemical Physics. 1983. - T. 79. № 2. - C. 926-935

94. Bauer C. B., Holden H. M., Thoden J. B., Smith R., Rayment I. X-ray structures of the apo and MgATP-bound states of Dictyostelium discoideum myosin motor domain // J Biol Chem. 2000. - T. 275. № 49. - C. 38494-38499.

95. Gulick A. M., Bauer C. B., Thoden J. B., Rayment I. X-ray structures of the MgADP, MgATPgammaS, and MgAMPPNP complexes of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain // Biochemistry. 1997. - T. 36. № 39. - C. 11619-11628.

96. Smith C. A., Rayment I. X-ray structure of the magnesium(II).ADP.vanadate complex of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain to 1.9 A resolution // Biochemistry. 1996. - T. 35. № 17. - C. 5404-5417.

97. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: visual molecular dynamics // J Mol Graph. 1996. - T. 14. № 1. - C. 33-38, 27-38.