Конформационные изменения полиэлектролитов и интерполиэлектролитные взаимодействия в водных растворах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

Каргов Сергей Игоревич

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ И ИНТЕРПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ

02 00 04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

003166910

I ______ )

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук

Долинный Анатолий Иванович,

доктор химических наук Литманович Андрей Аркадьевич,

доктор химических наук, профессор Щербаков Владимир Васильевич.

Ведущая организация Институт Биохимии им А Н Баха

Российской Академии наук

Защита состоится

24 апреля 2008 года в 16 час 15 мин на заседании диссертационного совета Д 501 001 50 при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 3, Химический факультет МГУ, ауд 337

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Химического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан 24 марта 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Актуальность изучения физико-химических свойств полиэлектролитов и полиэлектролитных комплексов объясняется потребностями как фундаментальной, так и прикладной науки Природные, модифицированные природные и синтетические полиэлекфолиты и полиэлектролитные комплексы на их основе широко применяются в различных областях химической технологии, биотехнологии, медицины, охраны окружающей среды, а изучение свойств полиэлектролитов и интерполиэлектролитных комплексов является фундаментальной задачей физической химии полимеров Функции полиэлектролитов в природе и их главные области применения основываются на их взаимодействиях с низкомолекулярными противоионами, с заряженными поверхностями или с противоположно заряженными иолиэлектролитами Однако особенности этих взаимодействий и связанное с ними взаимовлияние структуры и реакционной способности полиэлектролитов еще далеки от полного понимания, в значительной степени из-за сложности изучаемых объектов Особый интерес в рамках этой проблемы представляет изучение биологически значимых полиэлектролитов, в частности, нуклеиновых кислот, а также ингерполиэлектролитных реакций с их участием Комплексы нуклеиновых кислот с белками составляют основу хроматина, рибосом и других компонентов клетки, а также вирусов Образование комплексов нуклеиновых кислот с гистонами составляет существенный этап в процессах передачи генетической информации Выяснение механизма таких взаимодействий необходимо как для понимания их нормальных биологических функций, так и их нарушений в процессах канцерогенеза и мутагенеза Основная трудность при изучении этих систем заключается в том, что биологические полиэлектролиты имеют сложную и изменчивую структуру В связи с этим большой интерес представляют исследования более простых модельных систем, позволяющие выявить физико-химические закономерности влияния различных факторов на структуру и реакционную способность полиэлектролитов и процессы ингерполиэлектролитных взаимодействий Изучение взаимодействия нуклеиновых кислот с различными высокомолекулярными противоионами весьма актуально также в связи с разработкой эффективных методов доставки генетического материала в клетку Необходимым условием для таких исследований является, в частности, всестороннее знание о поведении полиэлектролитов в растворах В то же время имеющаяся информация о свойствах и поведении полиэлектролитов даже в простых модельных системах неполна, фрагментарна или противоречива

Основная часть диссертационной работы проводилась в рамках темы «Физико-химические свойства природных и синтетических полиэлектролитов», номер госрегистрации 01 980 008940 В разное время работа была поддержана грантами INTAS No 93-1083 "Fabrication of nanostructures for imaging and addressing nanometer scale objects" и РФФИ № 97-03-32302a «Исследование селективности ДНК и синтетических полинуклеотидов к низко- и высокомолекулярным катионам»

[ Г\

Цели работы

1 Изучение конформационных изменении ДНК и линейных синтетических полиэлектролитов в водных растворах и их связи с молекулярными характеристиками полиионов

2 Изучение интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК и линейных синтетических полиионов в водных растворах, а также факторов, влияющих на скорость и равновесие таких реакций

Научная новизна

• Показано, что использование кондуктометрических данных совместно с теорией полиэлектролитов Маннинга открывает новые возможности для анализа конформационного поведения полиионов в растворах Разработанный в диссертации кондуктометрический подход является простым и информативным методом, позволяющим изучать конформационные изменения полиионов в растворах в зависимости от их молекулярных характеристик и внешних условий

• Методом тушения флуоресценции впервые изучены интерполиэлектролитные реакции замещения с участием ДНК и водорастворимых нестехиометричных полшлектролитных комплексов, образованных линейными синтетическими полиионами Выявлены особенности таких реакций, обусловленные структурой и ионной селективностью ДНК Установлены факторы, способные эффективно влиять на скорость и равновесие реакций конкурентного взаимодействия ДНК с полиионами

• Предложен новый подход к изучению взаимодействия ДНК с поликатионами с использованием бромида этидия в качестве флуоресцентной метки Метод позволяет изучать взаимодействие ДНК и других полинуклеотидов с широким кругом поликатионов, а также интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК, не прибегая к синтезу флуоресцентно меченных полианионов и не отраничиваясь использованием поликатионов-тушителей, что позволяет существенно расширить круг доступных для исследования объектов

Практическая значимость работы

• Результаты изучения растворов полиэлектролитов могут быть использованы для разработки и дальнейшего усовершенствования существующих теорий полиэлектролитов и интерполиэлектролитных взаимодействий

• Результаты изучения скорости и равновесия интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК могут быть использованы для направленного синтеза ДНК-содержащих полиэлектролитных комплексов с заданными свойствами и прогнозируемым поведением, что необходимо для разработки лекарственных препаратов в генной терапии и эффективных методов их доставки в клетку

• Предложенный метод изучения комплексообразования ДНК с поликатионами различной природы с использованием бромида этидия может быть использован для исследования широкого круга интерполиэлектролитных реакций с участием нуклеиновых кислот, для разработки схем разделения мно! окомпонентных

биологических смесей, а также для создания простых и высокочувствительных методов диагностики

Личный вклад автора

Постановка проблем, экспериментальные исследования, анализ и интерпретация полученных результатов проведены автором лично и с участием соавторов совместных научных публикаций

Работы по изучению ионообменных свойств иммобилизованной ДНК выполнены совместно с И Л Кузнецовым, Р X Хамизовым, А Г Козловым, С М Филипповым, В А Ивановым, В И Горшковым

Работы по кондуктометрическому изучению конформационных изменений ДНК, РНК и синтетических полинуклеотидов в водных растворах выполнены совместно с О В Давыдовой и А Г Козловым

Работы по кондуктометрическому изучению конформационных изменений синтетических полиэлектролитов в водных растворах выполнены совместно с О В Давыдовой, В А Изумрудовым и А Н Зеликиным

Работы по изучению интерполиэлегаролитных реакций с участием ДНК и природных и синтетических полиэлектролитов выполнены совместно с В А Изумрудовым и М В Жиряковой В обсуждении результатов принимали участие чл -корр РАН А Б Зезин и акад РАН В А Кабанов

Автору принадлежит формулировка основных положений и выводов диссертации

Публикации и апробация работы

По результатам диссертации опубликовано 22 статьи, список которых приведен в конце автореферата Результаты работы были представлены на VII международной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991 г), на международной конференции "Nano-structures and self-assemblies m polymer systems" (Санкт-Петербург - Москва, 1995 г), на Российско-Израильском полимерном семинаре (Москва, 1995 г), на всероссийской конференции «Конденсационные полимеры синтез, структура, свойства» (Москва, 1999 г), на втором всероссийском каргинском симпозиуме «Химия и физика полимеров в начале XXI века» (Черноголовка, 2000 г ), международном симпозиуме "Polyelectrolytes 2002" (Лунд, Швеция, 2002 г), юбилейной научной конференции «Герасимовские чтения» (Москва. 2003 г), третьей всероссийской каргинской конференции «Полимеры-2004» (Москва, 2004 г), XII симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Пущино, 2004 г)

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы Работа изложена на 220 страницах, включает 77 рисунков и 4 таблицы Список цитируемой литературы включает 365 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Состояние и свойства полиэлектролитов в растворах

В литературном обзоре приведены общие сведения о полиэлектролитах в растворах Введены основные понятия и терминология, используемые для описания полиэлектролитов Обсуждены особенности свойств и поведения полиэлектролитов в растворах, их отличия как от низкомолекулярных электролитов, так и от незаряженных полимеров Рассмотрены современные теоретические подходы к описанию состояния и свойств полиэлектролитов в растворах

Полиэлектролиты особым образом сочетают в себе свойства полимеров и простых электролитов Цепи полиэлектролитов отличаются от цепей незаряженных полимеров наличием ковалентно связанных с ними заряженных групп, которые электростатически нейтрализуются соответствующим количеством малых ионов (противоионов) Отличие от низкомолекулярных электролитов заключается в том, что в полиэлектролитах заряды одного вида фиксированы на полимерной цепи В результате этого возникают особые аспекты поведения полиэлектролитов в растворах, так называемые полиэлектролитные эффекты С одной стороны, это отклонения от поведения незаряженных полимеров, возникающие из-за наличия зарядов на цепи полииона С другой стороны, это отклонения от поведения простых низкомолекулярных электролитов, возникающие из-за асимметричного расположения разноименных зарядов Эта асимметрия является следствием того, что один из видов заряда, фиксированный на полимерной цепи, не может быть разбавлен В результате этого высокая плотность заряда сохраняется на полимерной цепи даже в разбавленных растворах

Современные теории растворов полиэлектролитов, как правило, основаны на понятии конденсации противоионов, подробно разработанном в теории Маннинга [1, 2] Основная идея состоит в том, что если плотность заряда на цепи полиэлектролита превышает некоторое критическое значение, определенная доля противоионов «конденсируется» на цепи полииона, т е удерживается вблизи полииона, чтобы понизить его заряд Хотя существует всеобщее согласие по поводу этой качественной картины, которое подтверждается большим количеством экспериментальных данных, детали физического механизма конденсации противоионов по-прежпему остаются спорной темой Теория Маннинга является на сегодняшний день фактически базовой теорией растворов полиэлектролитов Несомненным ее достоинством является относительная простота и отсутствие подгоночных параметров Часто теорию Маннинга предпочитают другим подходам при описании свойств растворов линейных полиэлектролитов В классической теории Маннинга полиион представляется в виде бесконечно длинной прямой нити, на которой на равных расстояниях Ь друг от друга расположены заряды Полиион характеризуется параметром плотности заряда £,, который равен отношению бьеррумовской длины /в и расстояния Ъ между зарядами на цепи [1]

1в _ е2

Ъ 4 ке0еШ

Согласно теории Маннинга, в разбавленном растворе полиэлектролита, содержащего однозарядные группы и противоионы, с не может быть больше единицы При > 1 определенная доля противоионов электростатически удерживается в непосредственной близости от полииона («конденсируется»), чтобы понизить эффективную плотность заряда до верхнего предела с, = 1 Остальные противоионы не являются полностью свободными, а образуют традиционную дебай-хюккелевскую атмосферу противоионов вокруг полииона

Достоинства и ограничения теории Маннинга широко обсуждаются до настоящего времени Ее применимость для описания гибкоцепных и короткоцепных полиэлектролитов по-прежнему является спорной Тем не менее, она довольно успешно применяется для описания многочисленных экспериментальных данных В последние годы были предложены некоторые альтернативные теории, которые математически более сложны [3, 4]

Локальная конформация цепи полиэлектролита является результатом тонкого баланса между взаимодействиями цепи с растворителем и электростатическим отталкиванием, поэтому модель «заряженной нити», принятая в теории Маннинга, не отражает истинной конформации цепи полииона В конце 70-х годов была предложена скейлинговая модель для описания конформации полиэлектролитов [5] Согласно этой модели, в малом масштабе (порядка нескольких мономерных звеньев) опалкивания зарядов недостаточно для того, чтобы изменить конформацию цепи В результате цепь полиэлектролита локально сворачивается в шарики -электростатические блобы, состоящие из нескольких мономерных звеньев (рис 1) Размер этих блобов определяется балансом между электростатическими взаимодействиями, жесткостью цепи полимера, гидрофобными взаимодействиями и взаимодействием звеньев с растворителем

В результате электроста1Ического отталкивания между блобами в разбавленном растворе в полярном растворителе гибкоцепнои полиэлектролит без добавленной соли принимает вытянутую конформацию, т с направленную последовательность электростатических блобов Вытянутая конформация сохраняется до так называемой корреляционной длины Ь, в то время как в более крупном масштабе цепь полиэлектролита представляет собой случайнонаправленную последовательность

I

а

Рис 1 Схема цепи полголектролита в разбавленном растворе [5]

(' random walk") корреляционных блобов Корреляционная длина не зависит от длины цепи и уменьшается с увеличением концентрации

Как теория, так и компьютерное моделирование говорят о том, что локальная конформация цепей полиэлектролитов может быть более сложной, чем простая картина электростатических блобов В некоторых случаях области локального сворачивания цепи могут перемежаться вытянутыми областями («бусины на нитке»)

Для целей настоящей работы эти детали не существенны, и для описания структуры полиэлектролитов в растворе мы используем простую картину электростатических блобов Это по существу эквивалентно представлению бусин и нитей (или любых других локальных конформаций) в виде цилиндра с диаметром, равным диаметру блоба

Дополняя классическую теорию Маннинга скейлинговыми представлениями, можно получить модифицированную модель Маннинга, в которой «структурными единицами» являются не отдельные мономерные звенья, а электростатические блобы [6] Соответственно, расстояние между зарядами b представляет собой не длину мономерного звена, а некоторую среднюю эффективную величину [6]

2 Конформационные изменения ДНК и линейных синтетических полиэлектролитов в водных растворах

Для изучения конформационного поведения полиэлектролитов в настоящей работе разработан и применен новый подход, суть которого заключается в следующем Из экспериментальных данных по электропроводности растворов полиэлектролитов на основе теории полиэлектролитов Маннинга рассчитывается среднее расстояние b между зарядами на полиионе Полученные значения b используются для оценки информационных изменении полиионов в растворе

Согласно теории Маннинга, удельные электропроводности к бессолевого раствора полиэлектролита и раствора полиэлектролита, содержащего низкомолекулярную соль, выражаются соответственно следующими формулами [1,2]

О S66FA {О 5 1п(с^3)+я1

ю iu "<; с <,+

[ 104

к = Kj +10~3 1

K = K0+0 866 10-VV№ + -:- ' ;7 Д ,) (2)

1 104+0 134F4A°+) 0 51п(рД-3)+5|

б^-б^м.!

М)5 1п(2сД-2+с^"3)

4-В\

10 Ч^Л^Г1 +(^Г')|о 51п(2 сД-2 +с/,гг3)+£|

(3)

Здесь Кц и к4 - удельные электропроводности воды и раствора соли в отсутствие полииона, ср и с4 - концентрации полииона и соли в растворе, Я0, и - предельные подвижности катиона и аниона соли, Р- число Фарадея, А = 4г0екТ/Зг\е,

,Злг0 5Л

В = 1п

e3N'

А

4тс

1 с 1 I 10

+ 15 In

s0s кТ

элементарный заряд, к- константа Больцмана,

7УЛ- число Авогадро, Т— абсолютная темпера1ура, е- диэлектрическая проницаемость, г] - вязкость растворителя,- параметр плотности заряда полииона

Значения к, к0, к1; ср, с4 и Г для каждой экспериментальной точки подставляли в уравнения (2) или (3), уравнения решали численно методом итераций относительно и соответствующие значения Ь рассчитывали по уравнению (1)

В расчетах учитывали зависимости от температуры вязкости и диэлектрической проницаемости воды, а также предельных подвижностей низкомолекулярных коионов и противоионов

2.1 Термическая денатурация ДНК в водных растворах

На рис 2 приведены полученные в работе зависимости удельной электропроводности растворов ДНК от температуры для трех различных концентраций высокополимерной ДНК Видно, что на приведенных зависимостях обнаруживаются два излома, а сами кривые состоят из трех линейных участков, соответствующих электропроводности нативной, денатурированной, а также изменяющейся между ними в процессе денатурации структуры ДНК Сопоставление этих результатов с данными прямых калориметрических исследований показывает, что эти кривые представляют собой кондуктометрические кривые плавления ДНК

и °с

Рис. 2 Зависимости удельной электропроводности водных растворов высокополимерной ДНК от температуры для различных концентраций ДНК

На рис 3 представлены зависимости среднего расстояния Ь между зарядами на цепи полииона от температуры, рассчитанные из данных рис 2 по уравнениям (1) -(3) Из рисунка видно, что приведенные зависимости Ь ог температуры имеют 5-образную форму, характерную для кривых плавления ДНК, по положению точек

перегиба которых можно определять температуру плавления биополимера, а по величине Ъ судить о структурных изменениях молекул ДНК в растворе при изменении температуры

Из рис 3 видно, что величина Ъ для молекулы ДНК в исходном состоянии несколько превышает «классическое» значение этого параметра для правильной двойной спирали В-формы ДНК, равное 1 7 А [7] Такое отличие можно объяснить тем, что полностью нативная двухспиральная структура ДНК может существовать по-видимому, только в растворах, содержащих большие, по сравнению с количеством биополимера, избытки поддерживающего электролита Хотя, согласно литературным данным, в бессолевых растворах ДНК и растворах, содержащих соизмеримые с концентрациями биополимера количества низкомолекулярной соли, двухспиральная структура молекул ДНК сохраняется, структурные параметры этой спирали должны отличаться от «идеальных»

Рис 3 Зависимости среднего расстояния между зарядами Ь на полиионе ДНК в водных солевых растворах от температуры, рассчитанные из данных рис 2

Из рис 3 также видно, что предельное достигаемое при денатурации значение расстояния Ь между заряженными фосфатными группами составляет около 4 5 А, то есть существенно ниже, чем значение Ь ~7 А, соответствующее полностью вытянутой конформации одиночной цепи ДНК [7] Этот результат свидетельствует о том, что конформация денатурированной ДНК в растворе далека от полностью вытянутой, и полианионы ДНК в таких растворах в значительной степени свернуты Такой вывод совпадает с оценками, проведенными в литературе на основании данных но термической денатурации ДНК, согласно которым величина Ь для денатурированной ДНК должна составлять около 4-5 А [В, 9] Полученное в настоящей работе значение Ь » 4 5 А хорошо согласуется с ) 1 ими данными

2.2 Концентрационная денатурация ДНК в бессолевых растворах

Известно, что в достаточно концентрированных бессолевых растворах ДНК находится в состоянии, близком к нативному Это подтверждается низкими значениями коэффициента молярной экстинкции растворов, а также высокими значениями температуры и энтальпии плавления ДНК в таких растворах Причина сохранения нативной структуры ДНК заключается в том, что низкомолекулярные противоионы, образующиеся при диссоциации ДНК, играют роль электролита, поддерживающего ее нагивную структуру В пользу такого объяснения говорит линейная зависимость температуры плавления ДНК в бессолевых растворах от логарифма ее концентрации, аналогичная зависимости температуры плавления ДНК от логарифма концентрации добавленной соли Соответственно, при уменьшении концентрации ДНК еЬ температура плавления закономерно понижается, и при достаточно низкой концентрации денатурация ДНК происходит уже при комнатной температуре Поэтому при последовательном разбавлении бессолевого раствора ДНК при постоянной температуре происходит ее денатурация, которую можно считать концентрационной денатурацией

На рис 4 представлена полученная в работе зависимость логарифма удельной электропроводности бессолевого раствора ДНК от логарифма ее концентрации в растворе Видно, что на этой зависимости обнаруживается два излома, а сама кривая состоит из трех участков Начальный и конечный участки соответствуют электропроводности нативной и денатурированной ДНК, а промежуточный участок -электропроводности ДНК в процессе денатурации Таким образом, эта кривая представляет собой кондуктомегрическую кривую концентрационной денатурации ДНК

Рис. 4. Зависимость удельной электропроводности водного бессолевого раствора ДНК от концентрации ДНК

На рис 5 представлена зависимос1ь среднего расстояния Ъ между зарядами на полиионе от логарифма концентрации ДНК (сР), рассчитанная из данных рис 4 по уравнениям (1)- (3) Из рисунка видно, что эта зависимость имеет характерную для кривых денатурации ДНК ¿«-образную форму По величине получаемого параметра Ъ можно судить о конформации молекул биополимера в растворе при различных кон цен грациях

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

-|дср

Рис 5. Зависимости коэффициента экстинкции б26о от концентрации ДНК (1) [10] и среднего расстояния Ъ между зарядами на цепи полииона ш концентрации ДНК (2)

Для сравнения на рис 5 приведена зависимость молярной экстинкции ДНК от концентрации ДНК, взятая из литературы [10] Видно, что денатурация ДНК происходит практически в одном и том же диапазоне изменения концентрации Некоторые различия могут быть вызваны различием условий эксперимента

Из рисунка видно, что, как и в случае термической денатурации, величина параметра Ъ»2 5 А для молекулы ДНК в исходном состоянии превышает «классическое» значение этого параметра для правильной двойной спирали молекулы В-формы ДНК, равное 1 7 А Как отмечено выше, такое отличие можно объяснить тем, что параметры двойной спирали ДНК в бессолевых растворах должны отличаться от «идеальных» в результате некоторого нарушения структуры ДНК Из рисунка также видно, что предельное значение расстояния Ь для денатурированной ДНК составляет около 4 5 А, то есть значительно ниже, чем значение Ъ»7 А, соответствующее полное! ью вытянутой конформации Эюг факт свидетельствует о том, что конформация денатурированной ДНК существенно отличается от полностью вытянутой даже в разбавленном бессолевом растворе

2.3 Факторы, влияющие на конформацию полиионов в растворе 2 31. Влияние длины и жесткости цепи

На рис 6 представлены температурные зависимости среднего расстояния между зарядами Ь, рассчитанные из электропроводности растворов, для трех образцов ДНК с разными длинами цепей Из рисунка видно, что все кривые являются 5-образными, как и кривая для высокополимерной нативной ДПК Это означает, что все исходные образцы изученных ДНК перед плавлением имели нативную двухспиральную структуру независимо 01 длины цепи Значения температуры плавления, определенные из этих кривых, весьма близки дру! другу и хорошо согласуются со значением, полученным для высокополимерной ДНК при тех же условиях

Рис. 6 Зависимости среднего расстояния Ь между зарядами от температуры для ДНК с разными длинами цепи 300, 500 и »10000 пар оснований

В то же время, несмотря на практически одинаковый темперагурный интервал плавления, образцы ДНК с разной длиной цепи различаются значениями параметра Ь Из рис 6 видно, что при уменьшении длины цепей ДНК кривая ее плавления смещается в сторону более высоких значений Ъ Такое увеличение среднего расстояния между зарядами в макромолекуле ДНК при сохранении ее нативной двухспиральной структуры можно объяснить тем, что уменьшение длины цени ДНК приводит к разворачиванию цепи полииона, те к переходу от свернутой конформации полииона к вытянутой

Следует отметить, что численные шачения среднего расстояния между зарядами, полученные для коротких образцов ДНК, являются чрезмерно высокими Так, значения параметра Ъ для самых коротких исследованных образцов ДНК (300 пар оснований) в нативном состоянии значительно выше, чем «классическое»

значение Ъ = 1 7 А для двойной спирали ДНК, а в расплавленном состоянии даже выше, чем Ь = 1 А, соответствующее полностью вытянутой конформации Такое расхождение может быть вызвано неадекватностью теории Маннинга для количественного описания поведения коротких полиионов, поскольку в теории полиионы считаются бесконечно длинными Тем не менее, тенденция последовательного увеличения параметра Ь при укорачивании полииона ДНК прослеживается весьма явно Поэтому можно предположить, что, несмогря на количественные отклонения, пояученные данные отражают процесс перехода от свернутой конформации для длинных полиионов к вытянутой для коротких полиионов Этот вывод подтверждается результатами изучения гибкоцепных синтетических полиионов, описанными ниже

На рис 7 представлены температурные зависимости среднего расстояния между зарядами Ь для образцов полиакрилата (ПА) натрия с разными степенями полимеризации (ДР) В отличие от нативной ДНК, ПА не обладает специфической вторичной структурой, поэтому электропроводность его растворов и среднее расстояние между зарядами Ь монотонно увеличиваются с ростом температуры без особых точек во всем изученном температурном интервале В то же время, из рисунка видно, что, как и в случае ДНК, уменьшение длины цепи полианиона ПА также приводит к увеличению значений Ь, свидетельствующему о разворачивании цепей полиионов Аналогичные данные были получены и для других исследованных в работе полианионов и поликатионов

7,0 6,56,0 5,55,0-

<

4,0-| 3,5 3,0 2,5 2,0

ОР = 30

0Р = 2ОО

= 3200

10 20 30 40 50 60 70 80

Рис. 7 Зависимости среднего расстояния Ъ между зарядами от температуры для полиакрилата натрия с различными степенями полимеризации (ОР)

На рис 8 представлены зависимости значений А, полученных при 25 °С для изученных линейных виниловых полианионов полистиролсульфоната (ПСС) и

полиакрилата (ПА) и поликатионов поли-М-этил-4-винил-пиридиния (ПЭВП) от 1%ОР Видно, что увеличение значения Ъ при уменьшении длины цени наблюдается для всех изученных нами полиионов Поскольку все виниловые полигоны имеют практически одинаковую плотность заряда, конформационныи переход для них должен происходить в одном и том же интервале ОР Это предположение согласуется с экспериментальными данными Видно, что наиболее резкое увеличение параметра Ь с уменьшением длины цепей полиионов, отражающее переход от свернутой к вытянутой конформации, для всех полиионов наблюдается приблизительно в одном и том же диапазоне степеней полимеризации - порядка 102-103 Этот результат находится в разумном соответствии с литературными данными о конформации ПСС, полученными с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) [11]

Рис. 8. Зависимости среднего расстояния Ь между зарядами от \%ОР для различных полиионов при 25 °С

Отметим, что численные значения Ь, полученные для самых коротких образцов ПА, ПСС и ПЭВП, являются чрезмерно высокими и превышают значение Ъ = 2 5 А, соответствующее полностью вытянутой конформации Эти несоответствия, как и в случае ДНК, могут быть объяснены неадекватностью теории Маннинга для количественного описания поведения коротких полиионов

С другой стороны, с уменьшением длины цепи полииона параметр Ъ не может увеличивагься бесконечно При достижении определенной длины цепи, когда дальнейшее уменьшение степени полимеризации уже не приводит к существенному распрямлению полииона (что соответствует достижению персистентной длины), параметр Ъ должен достигать своего максимального постоянного значения Такая ситуация действительно наблюдается для изученных нами синтетических виниловых полиионов В частности, после достижения значения £>Р«100 дальнейшее укорачивание цепи ПЭВП не приводит к увеличению параметра Ъ Полученные

данные свидетельствуют о том, чю персистентная длина ПЭВП соответствует приблизительно 100 мономерным звеньям Как видно из рисунка, тенденция к достижению предельного значения Ь в области самых низких йР проявляется довольно отчетливо и для ПСС Однако, нам не удалось более точно определить значение персистентной длины ПСС из наших экспериментальных данных из-за недостаточного количества исследованных образцов с малой длиной цепи (были исследованы только два образца со значениями ОР ниже ожидаемой величины персистентной длины, а именно ОР = 8 и ОР = 31) Согласно данным МУРН, персистентная длина ПСС соответствует приблизительно ОР и 45 [11] Видно, что полученные в работе данные не противоречат этим значением В случае ПА определенных выводов о величине персистентной длины сделать нельзя из-за недостаточного количества экспериментальных точек (был исследован только один образец с соответствующим значением ОР - 28) Значения персистентных длин, определенные для изученных в работе полиионов, представлены в таблице 1

Таблица 1 Значения персистентных длин изученных полиионов

Полиион Метод определения персистентной длины

Предложенный метод МУРН [11]

ДНК < 300 пар оснований «150 пар оснований

ПСС [-сн2—сн-]„ V Э03 N8* ОР~ 40 ОР« 45

ПЭВП [—сн2-сн-]„ 6 с2н5 ЭР* 100 -

3,3-ионен _СНз СНз Вг 1+ Вг 1 + —[¡1—(СН2Ь-(]1-(СН2)з- СНз СН3 о ОР~ 50 -

2,4-ионен СНз СНз Вг 1+ Вг 1+ —М-(СН2)Г-М-(СН2)4- ^ СНз СНз ~ п ПР< 13 -

Влияние жесхкости цепи на ¡«информационный переход полиионов иллюстрируется заметной разницей в поведении гибких виниловых полианионов и жесткого полианиона нативной двухспиральной ДНК На рис 8 представлена также зависимость Ь от lg DP для нативной ДНК Эта кривая получена из значений Ъ, определенных при 25 °С, то есть в условиях, когда ДНК не денатурирована и находится в нативной жесткой двухспиральной конформации Из рисунка видно, что ход кривой для ДНК аналогичен ходу кривых для синтетических полиионов, однако наиболее существенное увеличение параметра b для жестких двухспиральных молекул нативной ДНК происходит при более высоких значениях степеней полимеризации, порядка 10'-104 Именно в этой области изменений DP были зарегистрированы наиболее резко выраженные изменения конформации ДНК с помощью метода МУРН Тот факт, что для образцов ДНК мы не наблюдали достижения постоянного максимального значения параметра b с уменьшением длины цепи, можно объяснить отсутствием экспериментальных данных для образцов ДНК с достаточно низкой длиной цепи Согласно данным метода МУРН, персистентная длина нативной двухспиральной ДНК составляет около 150 пар оснований, что приблизительно вдвое меньше длины самых коротких исследованных в работе образцов ДНК (около 300 пар оснований)

2.3 2 Влияние температуры

Особый интерес представляет вопрос, являются ли короткие цепи полиэлектролитов (с длиной равной или меньшей персистентной длины) полностью вытянутыми в водном бессолевом растворе Однако о степени развернутости цепей нельзя судить непосредственно по полученным численным значениям Ь, поскольку, как отмечено выше, они являются чрезмерно высокими Тем не менее, ответ на этот вопрос можно получить из рассмотрения температурных зависимостей электропроводности растворов изученных полиионов

На рис 9 представлены зависимости значений b для полианиона ПСС и поликатиона ПЭВП от логарифма степени полимеризации, полученные при 25 °С и при 70 °С Несмотря на весьма высокие численные значения b для коротких цепей ПЭВП и ПСС, полученные при комнатной температуре, повышение темпера гуры приводит к еще большему увеличению этого параметра Это означает, что даже короткие цепи ПЭВП и ПСС с длиной, не превышающей персистентной длины этих поликатионов, не являются полностью вытянутыми в разбавленных бессолевых растворах при комнатной температуре и при нагревании разворачиваются, принимая более вытянутую конформацию

Из рис 9 также следует, что степень разворачивания исследованных полиионов при повышении температуры зависит от длины цепи Так, из рисунка видно, что эта величина максимальна для самых коротких цепей, а с ростом степени полимеризации она уменьшается

5,2 п 4,8 4,44,0-

<

* 3,63,2 2,8

2,4-|—,—,—.—,—.—,—,—,—,—,—г—г—,—, 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

1дОР

Рис. 9. Зависимости среднего расстояния Ъ между зарядами от ЫОР для ПЭВ11 и ПСС при 25 °С и 70 °С

Такое увеличение устойчивости к разворачиванию с увеличением степени полимеризации можно объяснить тем, что с ростом длины цепи увеличивается вклад внутримолекулярных взаимодействий, которые стабилизируют более свернутую конформацию цепей Этот вывод подтверждается результатами, изложенными в следующем разделе

2.3.3. Влияние гидрофобных взаимодействий

Для изучения влияния внутримолекулярных гидрофобных взаимодействий на конформацию цепей полиионов мы сравнили поведение исчерпывающе алкилированных поликатионов поли-№алкил-4-винил-пиридиния (ПАВП), имеющих одну и ту же степень полимеризации ОР ~ 100, но разные Ы-алкильные заместители -э гил, пропил, бутил, гидроксиэтил и гидроксипроцил

На рис 10 представлена зависимость среднего расстояния Ь между зарядами для исследованных поликатионов при 25 °С от относительной гидрофобности заместителя, рассчитанной из коэффициентов распределения соответствующих полимеров между органической и водной фазами [12] Из рисунка видно, что с ростом гидрофобности заместителя значение Ь практически линейно уменьшается, что отражает постепенный переход от более вытянутой к более свернутой конформации полииона Это означает, что чем более гидрофобным является заместитель в поликатионе поли-Ы-алкил-4-винил-пиридиния, тем в большей степени он способствует сворачиванию цепи

6,5 п

<

■а

3,0-

3,5

4,0-

4,5-

5,5-

5,0-

6,0-

-Ви

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

п

Рис 10 Зависимость среднего расстояния Ь между зарядами для ПАВП (ВР = 100) от гидрофобности Л'-заместителя

Полученные данные показывают, что вклад уже 100 мономерных звеньев в гидрофобную стабилизацию конформации цепи достаточен для обеспечения устойчивости цепей к разворачиванию при нагревании Об этом же свидетельствуют и данные рис 9, из которых следует, что приблизительно при ВР > 100 значения Ь для изученных полиионов практически перестают зависеть от температуры

Для изучения влияния плотности заряда на конформационное поведение полиионов в работе исследовали бромиды частично алкилированных поли-1Ч-этил-4-винилпиридинов В нейтральных и щелочных водных растворах положительно заряжены только алкилированные пиридиниевые группы, поэтому плотность заряда на полигоне определяется его степенью алкилирования Это делает частично алкилированные ПЭВП удобными объектами для исследований

На рис 11 представлены зависимости значений Ь при 25 "С от степени алкилирования (3 для образцов ПЭВП с тремя различными ст епенями полимеризации ОР = 900, ВР = 100 и ВР = 20 Данные, представленные на рис 11, свидетельствуют о существенных конформационных изменениях полиионов, вызванных изменением их плотности заряда Из рисунка видно, что с уменьшением плотности заряда значения Ъ дця высокомолекулярных образцов ПЭВП с ВР= 100 и ЭР = 900 уменьшаются и проходят через минимум при р » 70 %, после чего снова наблюдается рост Ъ Для ПЭВП с ВР = 20 значения Ь незначительно увеличиваются во всем изученном диапазоне [3 вплоть до самых низких степеней алкилирования

2 3 4. Влияние плотности заряда на полиионе

5,5-,

4,0-

<

в* 3,5-

4,5-

2,5-

5,0

3,0

2,0

' 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Рис 11. Зависимости среднего расстояния между зарядами Ь от степени алкилирования Р для образцов ПЭВП с различными ОР

Уменьшение степени алкилирования приводит к уменьшению плотности заряда ПЭВП, то есть к уменьшению числа зарядов на единицу длины цепи Если бы конформация цепи при этом оставалась постоянной, это должно было бы приводить к увеличению расстояния между зарядами В то же время, значения Ъ образцов ПЭВП с ОР = 20 с уменьшением р хотя и увеличиваются, но весьма незначительно Действительно, как видно из рис 11, для этих образцов почти четырехкратное уменьшение степени алкилирования приводит к увеличению значений Ь всего на 10% Это означает, что при уменьшении р цепи ПЭВП сворачиваются, и это сворачивание компенсирует увеличение расстояния между зарядами Такой вывод согласуется с представлениями о том, что уменьшение числа зарядов на цепях полиэлектролита должно приводить к уменьшению их жесткости [13, 14] и, следовательно, способствовать их сворачиванию Как следует из рисунка, цепи поликатионов с ИР = 100 и ОР = 900 с уменьшением степени алкилирования в интервале 70 % < р < 95 % сворачиваются в еще большей степени, о чем свидетельствует уменьшение значений Ъ В то же время, при дальнейшем уменьшении степени алкилирования в интервале р < 70 % для образцов с ИР = 100 и ОР = 900 наблюдается увеличение значений Ь Кроме того, отчетливо прослеживается тенденция к сближению кривых для всех образцов с уменьшением р

Такие конформационные изменения цепей полиионов можно объяснить в рамках скейлинговой теории полиэлектролитов [5] Как отмечено выше, согласно этой теории, в бессолевом растворе полиэлектролита каждая заряженная макромолекула представляет собой последовательность электростатических блобов В масштабах длин меньше корреляционной длины Ь электростатические взаимодействия

преобладают, и цепь представляет собой вытянутую последовательность электростатических блобов В масштабах длин больше Ь электростатические взаимодействия экранируются, и цепь представляет собой беспорядочную последовательность корреляционных блобов, каждый из которых в свою очередь представляет собой вытянутую последовательность электростатических блобов

Поведение самых коротких образцов ПЭВП с ОР = 20 во всем изученном интервале Р говорит о том, что цепи этих поликатионов имеют длину меньше корреляционной длины, и их цепи представляют собой вытянутую последовательность электростатических блобов При уменьшении степени алкилирования вытянутая последовательность электростатических блобов сохраняется, а количество мономерных звеньев в каждом блобе растет, т е цепь ПЭВП сжимается подобно пружине, в результате чего среднее значение Ь изменяется незначительно

С другой стороны, поведение образцов ПЭВП с ОР = 100 и ОР = 900 с изменением (3 говорит о том, что цепи этих поликатионов имеют длину, превышающую корреляционную длину, и поэтому представляют собой уже не вытянутую, а беспорядочную последовательность блобов При уменьшении степени алкилирования в интервале 70 % < (5 <95 % количество зарядов на цепях этих поликатионов уменьшается, что приводит к сворачиванию цепи, в результате чего среднее расстояние между зарядами уменьшается Дальнейшее уменьшение степени алкилирования в интервале ¡3 < 70 %, по-видимому, уже не приводит к сворачиванию цепи поликатионов, и уменьшение количества зарядов на цепи приводит к увеличению среднего расстояния между ними

По мере уменьшения степени алкилирования поликатионов вклад электростатических взаимодействий в конформацию их цепей уменьшается, и определяющее влияние на конформацию цепей начинает оказывать собственная жесткость незаряженной цепи внутри блоба, которая для всех образцов ПЭВП одинакова По-видимому, этим объясняется наблюдаемая тенденция к сближению кривых для всех образцов ПЭВП при самых низких значениях р (рис 11)

Степень полимеризации самой длинной из изученных цепей ПЭВП (ОР = 900) почти на порядок превышает ОР = 100, а значит, при одинаковых р эта цепь должна состоять из большего числа корреляционных блобов и, следовательно, быть более свернутой Об этом свидетельствуют самое низкое расположение кривой для ОР- 900, т е более низкие значения Ь по отношению к другим кривым рис 11 Несмотря на явную тенденцию сближения кривых для ОР= 100 и ОР =■ 900 при уменьшении степени алкилирования, значения Ъ для образца ПЭВП с ОР = 900 все же остаются самыми низкими

2.3 5. Влияние распределения зарядов на полиионе

Для изучения влияния распределения зарядов на конформационное поведение полиионов в работе исследовали бромиды алифатических ионенов Алифатические ионены представляю! собой поликатионы, содержащие заряженные группы в

основной цепи В отличие от частично алкилированпых катионов поли-Ы-этил-4-винилпиридиния со статистическим распределением зарядов, ионены характеризуются строго регулярным чередованием заряженных групп, расстояния между которыми могут быть заданы в процессе их синтеза соответствующим выбором исходных реагентов

На рис 12 представлены зависимости b от степени полимеризации для 2,4- и 3,3-ионенов Из рисунка видно, что, как и для других исследованных в работе полиионов, уменьшение длины ионенов сопровождается увеличением Ь, свидетельствующим о разворачивании цепей полиионов Однако, хотя среднее расстояние между зарядами, рассчитанное для полностью вытянутых цепей, для этих двух ионенов одинаково, наблюдаемые изменения b для них существенно различны Так, наиболее резкий рост b для 3,3-ионена наблюдается в диапазоне DP = 80-50, в то время как дальнейшее уменьшение длины цепей не приводит к заметным изменениям b В рамках развиваемых нами представлений эти результаты свидетельствуют о том, что персистентная длина 3,3-ионена составляет около 50 мономерных звеньев

5,0 4,5 4,0-

<

■а

3,5 3,0

2 £ I_,_^ _]_|_| ■ | • [

0 20 40 60 80 100 120 ОР

Рис. 12. Зависимости среднего расстояния Ь между зарядами от степени полимеризации (£>Р) для 2,4- и 3,3-ионенов

В то же время кривая для 2,4-ионена сдвинута в область значительно более низких значений ОР, и, кроме того, рост Ь наблюдается во всем изученном диапазоне ОР без заметной тенденции к достижению предельного значения в области самых коротких цепей Это означает, что персистентная длина 2,4-ионена не превышав х длины самого короткою исследованного образца, те 13 мономерных звеньев Другими словами, цепи 2,4-ионена в растворе существенно более свернуты по сравнению с цепями 3,3-ионена

Этот вывод согласуется с результатами компьютерного моделирования поведения цепей ионенов На рис 13 представлены данные оптимизации структуры

20-меров бромидов 2,4- и 3,3-ионенов методом ММ2 (атомы водорода и противоионы не показаны) На полученных изображениях отчетливо видна более вытянутая конформация цепей 3,3-ионена и более свернутая конформация цепей 2,4-ионена Хотя использованный метод ММ2 дает довольно грубую оценку конформации цепей, он подтверждает вывод о существенно более высокой гибкости цепей 2,4-ионена

Рис. 13. Результаты ММ2 моделирования (а) 20-мера 3,3-ионена и (б) 20-мера 2,4-ионена (Chem3D Pro) Атомы водорода и противоионы не показаны

Одна из вероятных причин более высокой гибкости 2,4-ионена по сравнению с 3,3-ионеном заключается в наличии близко расположенных зарядов на цепи 2,4-ионена, а именно двух заряженных атомов азота, разделённых только двумя метиленовыми группами Параметр плотности заряда, рассчитанный для этих атомов, равен = 1 93, что существенно превышает среднее значение = 1 44 для 2,4- и 3,3-ионенов Высокая локальная плотность заряда может приводить к дополнительной конденсации противоионов в данной области и, как следствие, к понижению жесткости цепи полииона

Это предположение согласуется с литературными данными по изучению 2,10- и 6,6- ионенов методом вискозиметрии [15] Хотя средние плотности заряда для этих двух ионенов одинаковы, 2,10-ионен (на цепи которого также имеются заряженные атомы азота, разделенные двумя метиленовыми группами) по сравнению с 6,6-ионсном в растворе обладает более свернутой конформацией

На рис 14 представлены зависимости относительного расстояния между зарядами bre¡ = Ы ¿>max (где bmíx - значение, рассчитанное для полностью вытянутой

конформации) от степени полимеризации для различных изученных в работе ионенов Из представленных данных видно, что для самых коротких исследованных в работе образцов 3,3-ионена значение 6ге| близко к единице, что говорит о том, что цепи этих полиионов в растворе практически полностью вытянуты Для 4,4-ионена также наблюдается рост значений Ьгй с уменьшением степени полимеризации Однако отсутствие образцов с ВР < 40 не позволило нам достичь области, где значения Ъ перестают зависеть от ОР и определить значение персистентной длины 4,4-ионена Тем не менее, очевидно, что это значение значительно ниже, чем персистентная длина 3,3-ионена Для 6,6- и 10,10-ионенов значения 6ге1 мало изменяются при изменении ОР, что свидетельствует о существенно свернутой конформации цепей этих ионенов во всем изученном диапазоне степеней полимеризации

DP

Рис. 14 Зависимости относительного расстояния между зарядами brci = ЫЪтзх or DP для 3,3-, 4,4-, 6,6- и 10,10-ионенов

Эти результаты согласуются с литературными данными изучения 3,3-, 4,5-, 6,6-и 6,9- ионенов методом потенциометрии [16] Эффективные плотности заряда с, этих ионенов превышали значения, рассчитанные для полностью вытянутой конформации, причем расхождение увеличивалось с увеличением расстояния между заряженными группами на цепи ионенов Авторы объяснили полученные данные уменьшением расстояния между зарядами в результате сворачивания цепей полиионов, причем степень сворачивания возрастала с увеличением числа метиленовых групп между зарядами на цепи ионенов

Считается, что персистентная длина Р полиэлектролита складывается из стерической (Р») и электростатической (Ра) составляющих [17] Согласно литературным данным, значение Ра для алифатических ионенов составляет около 1 4 нм независимо от числа метиленовых групп между зарядами ионена [17] Для поли-М-этил-4-винилпиридиния, имеющего персистентную длину приблизительно

100 мономерных звеньев, величина Р0 имеет тот же порядок (около 2 0 нм) В то же время, согласно данным нашей работы, значение персистентной длийы 3,3-ионена соответствует приблизительно 50 мономерным звеньям (т е около 25 нм), что позволяет оценить вклад электростатической составляющей в персистентную длину изученных поликатионов

Известно, что величина Ре, коррелирует с дебаевской длиной lD [18], и во многих случаях эта корреляция является линейной [18] В бессолевом растворе полиэлектролита величина ir, описывается формулой [3]

/d = MAWTT3» <4>

(где /в - бьеррумовская длина, сР - концентрация полииона) Значения 10, рассчитанные по формуле 4 для полностью вытянутых симметричных ионенов, приведены в таблице 2 Отношение найденной персистентной длины к соответствующему значению lD (выраженному в числе мономерных звеньев) для 3,3-ионена составляет ~ 3 0 Если считать корреляцию между Ре1 и /0 линейной, то для исследованных поликатионов величина Ре) должна быть кратной с коэффициентом ~ 3 Это соотношение позволяет оценить величины персистентной длины симметричных ионенов и сравнить их с экспериментальными данными Соответствующие значения для симметричных ионенов представлены в таблице 2

Таблица 2. Характеристики симметричных ионенов (сР - 2 5 10~3 М)_

Полиион ^caicj нм % 4>> нм /о, мономер звеньев Л мономер звеньев Р/1D

3,3-ионен 0 495 1 44 10 3 17 -50 -30

4,4-ионен 0 621 1 15 92 12 -30*

6,6-ионен 0 873 0 82 78 7 -20*

10,10-ионен 1376 0 52 62 4 - 10*

(*оценочные значения, рассчитанные из величины Р//0 для 3,3-ионена)

Расчетное значение /г, для 4,4-ионена составляет ~ 12 мономерных звеньев (таблица 2), что соответствует персистентной длине около 30 мономерных звеньев, вследствие чего она не была достигнута в наших экспериментах (рис 14) Расчетные значения /0 для 6,6- и 10,10-ионенов еще ниже (7 и 4 мономерных звена соответственно), что позволяет объяснить наблюдаемую свернутую конформацию этих ионенов во всем исследованном диапазоне ДР (рис 14)

Данные, представленные в таблице 2, также свидетельствуют о том, что Ре1 превышает Ро даже для наименее заряженного 10,10-ионена Этот результат означает, что для всех исследованных образцов ионенов главным фактором, определяющим жесткость цепи, является электростатическое отталкивание заряженных групп на цепях полиионов

3. Конкурентные интерполиэлектролитные реакции в растворах полиэлектролитных комплексов с участием ДНК

Разноименно заряженные полигоны способны взаимодействовать между собой в водных растворах с образованием полиэлектролитных комплексов (ПЭК) [19] Водорастворимые ПЭК могут быть получены из противоположно заряженных полиэлектролитов, если молярное соотношение звеньев блокирующего полиэлектролита (БПЭ) и лиофилизирующего полиэлектролита (ЛПЭ), Ф = [БПЭ] / [ЛПЭ], не превышает некоторого критического значения <рст < 1 [19] Такие нестехиометрические ПЭК (НГ1ЭК) можно рассматривать как своеобразные блок-сополимеры, содержащие гидрофильные одноцепочечные и относительно гидрофобные двухцепочечные участки Критическое значение (рсг определяет предельную степень заполнения ЛПЭ цепями БПЭ, выше которого гидрофильности одноцепочечных участков становится недостаточно для того, чтобы удерживать частицы НПЭК в растворе Значение срог для большинства комплексов изменяется в диапазоне 0 2-07 и определяется в основном химической природой и строением взаимодействующих полиэлектролитов [19]

Одним из важнейших свойств НПЭК является их способность участвовать в конкурентных интерполиэлектролитных реакциях замещения или обмена с другими полиионами Изучение таких интерполиэлектролитных реакций представляет как самостоятельный интерес, так и позволяет моделировать процессы с участием биологически значимых полиэлектролитов

Одним из наиболее удобных и информативных методов изучения процессов образования и превращения растворимых ПЭК является метод тушения флуоресценции Метод основан на использовании поликатионов, звенья которых способны эффективно тушить флуоресценцию меток, ковалентно связанных с цепями полианионов Образование (разрушение) комплекса флуоресцентно меченного полианиона с поликатионом-тушителем сопровождается уменьшением (ростом) интенсивности флуоресценции, что позволяет регистрировать образование или разрушение полимер-полимерных контактов Большинство исследований таких реакций было проведено с использованием флуоресцентно меченных полианионов полиметакрилата (ПМА), содержащих антрильные или пиренильные метки, и поликатионов поли-Ы-этил-4-виниллиридиния (ПЭВП), звенья которого эффективно тушат флуоресценцию меток при образовании комплекса (ПМА*-ПЭВП) Результаты исследования равновесий в интерполиэлектролитных реакциях между гибкоцепными синтетическими полиионами обобщены в обзоре [20]

В частности, было показано, что конкуренция двух линейных синтетических полианионов - флуоресцентно меченного полиметакрилата (ПМА*) и полифосфата (ПФ) - за связывание с поликатионом поли-М-этил-4-винилпиридиния (ПЭВП), то есть положение равновесия в интерполиэлектролитной реакции замещения

МеС1

НПЭК(ПМА*-ПЭВП) + ПФ <==> НПЭК(ПФ-ПЭВП) + ПМА* (5)

(где Ме = Li, Na, К) зависит от природы низкомолекулярного катиона и степени полимеризации ПФ [20] Было отмечено, что подобные эффекты могут играть важную роль в процессах с участием биополиэлектролитов в природе

В настоящей работе был сделан следующий шаг в направлении моделирования таких процессов в качестве одного из конкурирующих полианионов впервые была использована ДНК - полиэлектролит огромной биологической значимости Известно, что перестройки ПЭК, образованных полианионами ДНК и положительно загаженными белками - гистонами, составляют один из важных этапов в передаче генетической информации Комплексы ДНК с различными синтетическими поликатионами используются для доставки ДНК в клетку, а также для защиты доставленной ДНК от расщепления клеточными нуклеазами [21] В настоящей работе была изучена реакция

соль

НПЭК(ПМА*-ПЭВП) + ДНК <==> НПЭК(ДНК-ПЭВП) + ПМА* (6) (где соль = LiCl, NaCl, KCl, СаС12 и MgCl2)

Степень протекания реакции (6), то есть долю звеньев ПМА*, не связанных в комплекс с поликатионом-тушителем, определяли путем измерения интенсивности флуоресценции I раствора В качестве параметра, характеризующего степень протекания реакции (6) слева направо, использовали степень превращения q, которую рассчитывали по уравнению

q=l-lN (?)

Л)-In \-In/Iq

где /0 и /дг - интенсивности флуоресценции растворов ПМА* и НПЭК(ПМА*-ПЭВП) при одинаковых условиях и одинаковых концентрациях полиэлектролитов в реакционной смеси

3.1. Факторы, влияющие на скорость достижения равновесия в интерполиэлектролитных реакциях

На рис 15 приведены кинетические кривые прямой и обратной реакции

МеС1

НПЭК(ПМА*21оо-ПЭВП3о) + ДНК <===> НПЭК(ДНК-ПЭВП30) + 11МА*2„)0, (8)

в которой длинные полианионы ДНК и ПМА 2юо конкурируют друг с другом за связывание с относительно короткими поликатионами ПЭВПзо, 'фи различных концентрациях NaCl (Нижними индексами обозначены степени полимеризации соответствующих полиионов) Из рисунка видно, что скорости прямой и обратной реакций существенно возрастают с увеличением концентрации соли Способность низкомолекучярных электролитов ускорять перенос поликатиона была установлена при изучении интерполиэлектролитных реакций в растворах НПЭК, образованных синтетическими гибкоцепными полиионами [22,23] Вместе с тем, интерполиэлек-тролитные реакции с участием ДНК характеризуются некоторыми особенностями

Время

Рис. 15. Зависимости степени превращения в реакции (8) в растворах НПЭК(ПМА*210(Г ПЭВПзо) и ДНК (•■ А) и в растворах НПЭК(ДНК-ПЭВП-,0) и ПМА*2100 (опД) при разных концентрациях №С1 [ПМА*] = [ДНК] = 4 10~5 М, [ЛЭВП]/[ПМА*] = 04

Интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК протекают значительно более медленно по сравнению с реакциями с участием гибкоцепных полиионов Так, если в 0 05 М №С1 время завершения реакции замещения в системах ПМА*28оо/ПЭВП3оо/ПССшо[22] или ПМА*4юо/ПЭВПзоо/ПФ,2о [24] не превышает нескольких секунд, го, согласно нашим экспериментальным данным, скорость реакции (6) в системе Г1МА*21оо / ПЭВПш' ДНК в 0 05 М/ЫаС1 близка к нулю

Увеличение степени полимеризации поликатиона при прочих равных условиях, как и в реакциях с синтетическими гибкоцепными полианионами, приводит к уменьшению скорости реакции (6) Так, если в 0 25 М №С1 равновесие в реакции (8) устанавливается за время смешения реагентов (рис 15), то при замене ПЭВП30 на ПЭВПпо, т е при увеличении длины цепи поликатиона в 4 раза, при той же концентрации соли равновесие не достигается в течение нескольких суток

Эти различия согласуются с общими представлениями о механизме замещения и обмена полиионов в растворах НПЭК [23], согласно которым перенос поликатионов происходит в промежуточных тройных комплексах, образующихся при контакте и взаимном проникновении клубков НПЭК и свободных полиионов Для осуществления переноса необходимо, чтобы за время существования промежуточного комплекса успела реализоваться благоприятная подстройка конформаций взаимодействующих клубков и соответствующая перегруппировка системы межцепных солевых связей Понятно, что увеличение длины и жесткости полиионов, как в случае ДНК, затрудняет такой перенос

В работе были подобраны условия, при которых равновесие для каждой из изученных систем заведомо достигалось пе более чем за сутки, и полученные значения ц в реакции (6) являются равновесными (д,,)

3.2. Факторы, влияющие на положение равновесия в интерполиэлектролитных реакциях

3.2.1. Влияние природы катионов щелочных металлов

На рис 16 представлены зависимости равновесной степени превращения </с в реакции (8) от концентрации хлоридов щелочных металлов Видно, что при концентрации солей, на три и более порядка превышающей концентрацию звеньев взаимодействующих полиэлектролитов, положение равновесия реакции (8) решающим образом зависит от природы вводимого катиона В частности, в 0 25 М 1дС1 равновесие реакции практически полностью сдвинуто влево, т е свободная ДНК сосуществует в растворе с НПЭК(ПМА*-ПЭВП), в то время как в 0 25 М ЫаС1 равновесие существенно сдвинуто вправо, то есть в сторону образования НПЭК(ДНК-ПЭВП), который сосуществует со свободным ПМА* В растворе КС1 реализуется промежуточная ситуация

[МеС1], М

Рис. 16. Зависимости степени превращения де в реакции (8) для системы Г(Ма'21 оо' ПЭВП30 / ДНК от концентрации соли [МеС1] Нативная ДНК (•■ А), денатурированная ДНК (оаД)

Таким образом, замены катионов одного щелочного металла на катионы другого оказывается достаточно для того, чтобы вызвать кардинальную реорганизацию в системе ПМА* /ПЭВП / ДНК, в частности, перенос поликатионов ПЭВП из комплекса с ПМА* в комплекс с ДНК или перенос поликатионов в обратном направлении Аналогичный эффект был ранее обнаружен в системе ПМА/ПЭВП/ПФ, однако если для реакции с участием ПФ по способности смещать равновесие реакции (6) вправо катионы располагаются в ряд К+ < Ма+ < 1л+ [24], то для реакции с учасшем ДНК этот ряд имеет вид Ь)+ < К+ < (рис 16)

На рис 17 представлены данные изучения устойчивости НПЭК(ПМА*-ПЭВП) методом тушения флуоресценции и НПЭК(ДНК-ПЭВП) методом скоростной седиментации Из этих данных следует, что в отсутствие конкурирующих полианионов эти НПЭК являются устойчивыми при концентрации соли [МеС1] < 0 25 М Это означает, что практически все звенья цепей ПЭВГГ принимают участие в образовании солевых связей со звеньями ПМА* или ДНК, т е при любом положении равновесия реакции (6) в системе отсутствуют свободные цепи ПЭВП

[MeCI], М

Рис 17 Зависимости относительной интенсивности флуоресценции IN / /0 НПЭКСПМА'гюо-ПЭВПзд) и определенной методом седиментации доли Q поликатиона ПЭВП30, выделившегося из НПЭК(ДНК-ПЭВП30), от [MeCI]

Для объяснения влияния природы катионов добавленной соли на равновесие представим общее изменение энергии Гиббса в реакции (8) в виде

AG - А6> + А&Ъ (9)

где AGr - разность энергий Гиббса взаимодействия ДНК и ПМА* с поликатионом ПЭВП, a A- разность энергий Гиббса взаимодействия ДНК и ПМА* с низкомолекулярными катионами Слагаемое AGP не зависит от природы низкомолекулярных катионов, поэтому изменение величины AG должно быть обусловлено изменением AGc, то есть различием энергий Гиббса взаимодействия полианионов 11МА* и ДНК с разными катионами щелочных металлов

Этот вывод согласуется с данными по устойчивости соответствующих НПЭК к действию соли в водно-солевых растворах, представленными на рис 17 Из рисунка видно, что по способности разрушать НПЭК(ДНК-ПЭВП30) катионы располагаются в ряд Li+ > Na+ > К1" Этот ряд совпадает с рядом селективности ДНК к этим катионам, установленным разными методами, и который был установлен нами прямым методом ионного обмена на иммобилизованной ДНК Ряд катионов по способности разрушать НПЭК(ПМА гш-ПЭВПзо) имеет аналогичный вид Li+ > Na4" > К1" и совпадает с рядом

сродства этих катионов к карбоксилсодержащим полигонам Таким образом, чем больше сродство катиона к полианиону, т е чем сильнее связывается катион соли с полианионом, тем в большей степени он способствует разрушению НЛЭК, образованного этим полианионом с поликатионами

3 2 2. Влияние вторичной структуры ДНК

Положение иона Lv+ в ряду селективности к ДНК, противоположное его положению в ряду связывания катионов с анионами ПФ, обусловлено его более высоким сродством к двуспиральной молекуле нативной ДНК по сравнению с катионами Na+ и К+ Очевидно, на фоне незначительных различий в энергии Гиббса взаимодействия полианионов ПМА и ДНК с вводимыми катионами, как это следует из близости кривых разрушения соответствующих НПЭК в водно-солевых растворах (рис 17), этого дополнительного сродства катиона лития к ДНК оказывается достаточно для предотвращения переноса поликатиона ПЭВП с поликатионов ПМА* на ДНК во всем исследованном интервале изменения концентрации LiCl (рис 16)

Этот вывод подтверждается результатами исследования равновесия реакции (8) с участием термически денатурированной ДНК (рис 16) Из рисунка следует, что замена нативной ДНК на денатурированную в реакции (8) практически не отражается на положении равновесия в растворах NaCl и КС1, но приводит к существенному сдвигу равновесия вправо в растворе LiCl Таким образом, полученные данные показывают, что термическая денатурация ДНК приводит к уменьшению ее селективности к ионам Li, и если нативная ДНК практически не взаимодействует с ПЭВП во всем изученном интервале концентраций LiCl, то денатурированная ДНК, не обладающая высоким сродством к иону Li+, оказывается способной к конкурентному связыванию с поликагионом ПЭВП

3 2 3. Влияние катионов кальция и магния

Добавление уже незначительных количеств хлоридов кальция или магния к растворам ПМА или НПЭК(ПМА -ПЭВП) приводит к выпадению осадка из-за межмакромолекулярного сшивания макромолекул ПМА* Поэтому реакцию

МеС12

НПЭК(ПМА*2,оо-ПЭВП,о) + ДНК <=> НГОК(ДНК-ПЭВП,„) + ПМА*2100 (Ю)

(где Ме = Са и Mg) исследовали в присутствии 0 14 М раствора хлорида калия, т е при концентрации ионов калия, близкой к их концентрации в живой клетке Отметим, что присутствие КС) в такой концентрации практически не приводит к сдвигу положения равновесия реакции (8) вправо, как это следует из рис 16

Полученные нами данные показывают, что при концентрации СаС12, превышающей 2 5 10"4 М, равновесие в реакции (10) заведомо достигается в течение

24 часов Это означает, что полученные в этих условиях значения степени превращения ц в реакции (10) являются равновесными

На рис 18 представлены данные изучения устойчивости к действию СаС12 и М^'СЛ2 комплексов НПЭК(ПМА*2шо-ПЭВПз0) методом тушения флуоресценции и НПЭК(ДНК-ПЭВПзо) методом скоростной седиментации Из сравнения рис 17 и 18 видно, что для разрушения обоих комплексов требуется на порядок меньшая концентрация СаС12 по сравнению с концентрацией хлоридов щелочных металлов В то же время, увеличение на порядок концентрации НПЭК(ПМА\п1!гПЭВПз0) практически не влияет на концентрацию СаС12, при которой наблюдается его разрушение (кривая 2) Из рисунка также видно, что разрушение НПЭК(ПМА*2юо-ПЭВПзо) в растворах СаС12 происходит при более низкой концентрации, чем в растворах М£С12, что согласуется с более высоким сродством ионов кальция к карбоксилсодержащим полианионам по сравнению с ионами магния [25]

[МеС12], М

Рис. 18 Зависимости относительной интенсивности флуоресценции 1ц / /0 раствора НПЭК(ПМА*2юо-ПЭВПзо) (1 -3) и определенной методом седиментации доли Q поликатиона, выделившегося из НПЭК(ДНК-ПЭВП30) (4), от концентрации СаС12 (1, 2,4) и М§С12 (3) [ДНК] = 4 10-4 М, [ПМА*] = 4 10-5 М (1, 3) и 2 1О^1 М (2) [КС1] = 014М

На рис 19 приведены зависимости равновесных степеней превращения де в реакции (10) от концентрации хлоридов кальция и магния Как следует из рис 19, равновесие реакции (10) в 0 0025 М МеС12 полностью сдвинуто вправо В отсутствие ДНК в этих условиях НПЭК(ПМА*2юо-ПЭВПзо) вполне стабилен, и его заметное разрушение происходит только при на порядок более высоких концентрациях СаС12 и М»С12 (рис 18, кривые 1-3) Ионы кальция сдвигают равновесие реакции (10) вправо эффективнее, чем ионы магния (рис 19), что согласуется с более сильным связыванием ионов кальция с полианионом ПМА [25]

[MeCI2] 103,М

Рис. 19. Зависимости степени превращения q в реакции (10) от концентрации СаС12 и MgCl2 [ПМА*] = [ДНК] = 4 10'5М [КС1] = 0 14 M

Таким образом, катионы кальция и магния существенно сильнее влияют на равновесие реакции по сравнению с катионами щелочных металлов, для которых заметный сдвиг равновесия реакции (8) вправо наблюдается при концентрациях солей МеС1 порядка 0 25 M (рис 16) Основной причиной такого различия является, очевидно, существенно более сильное связывание двухвалентных катионов с конкурирующими полианионами Кроме того, существенную роль может играть специфическое сродство ионов магния и кальция к карбоксилсодержащим полианиояам Вероятно, именно этим обусловлено наблюдаемое значительное различие в устойчивости НПЭК(ПМЛ*210(гПЭВПзо) и НПЭК(ДНК-ПЭВП30) в растворах СаС12 и MgCl2 (рис 18), в то время как в растворах хлоридов щелочных металлов разница в устойчивости этих НПЭК существенно меньше (рис 17)

3 2.4. Влияние степени полимеризации синтетических полиионов

Как отмечено выше, реакция (6) с участием ДНК и высокомолекулярных поликатиона ПЭВП130 и полианиона ПМА 2100 протекает очень медленно даже при сравнительно высоких концентрациях низкомолекулярных солей, что затрудняет ее исследование Уменьшение степени полимеризации ПМА приводит к существенному увеличению скорости реакции и уменьшает время достижения равновесия Аналогичный эффект ускорения интерполиэлектролитной реакции был ранее обнаружен при изучении конкурентных реакций в растворах гибкоцепных синтетических полиионов [26]

В настоящей работе изучено влияние соотношения степеней полимеризации = -D/Vima' /-С^пэвп на положение равновесия реакции (6) Степень полимеризации образца ДНК во всех опытах была постоянной (использовали один и toi же препарат

ДНК) и существенно превышала степени полимеризации синтетических полиионов Соотношение степеней полимеризации ПМА* и ПЭВП изменяли, используя образцы ПМА*5о, ПМа'нхш, ПМА 21 оо, ПЭВП3о и ПЭВПш в различных комбинациях Как отмечено выше, скорость переноса полиионов в реакции (6) существенно уменьшается при увеличении длины цепей Поэтому степени полимеризации компонентов во всех использованных комбинациях ПМА*/ПЭВП/ДНК подбирали так, чтобы время установления равновесия не выходило за рамки экспериментально приемлемых величин (не превышающих 24 ч)

[ЫаСЦ, М

Рис. 20. Зависимость равновесной степени превращения д,. в реакции (6) от концентрации №С1 в системах ПМА* / ПЭВП / ДНК при разных соотношениях степеней полимеризации ПМА* и ПЭВП

На рис 20 приведены зависимости де от концентрации КаС! в системах ПМА^юо-' /ПЭВП30/ДНК (ч/= 70), ПМА'юоо/ПЭВПзо/ДНК (ц/ = 33), ПМА*5о/ПЭВП3о/ДНК (у = 1 7) и ПМА*5о/ПЭВП130/ ДНК (у = 0 4) Как следует из рис 20, при переходе от 14/ » 1 к ч/ < 1 во всем исследованном интервале концентраций низкомолекулярной соли равновесие в реакции (6) смещается вправо, т е в сторону образования НПЭК(ДНК-ПЭВП) Аналогичная картина наблюдается и в растворах КС1 и 1лС1 Вместе с тем, в области у » 1 переход от \|/ = 70 к \|/ = 33 практически не влияет на положение равновесия во всех солях (рис 20)

Поскольку в исследованном интервале концентрации низкомолекулярной соли все индивидуальные НПЭК устойчивы, можно считать, что общее число межцепных солевых связей в рассматриваемых системах не зависит от степени полимеризации полиионов и от \|/ и остается практически постоянным Поэтому наблюдаемое смещение равновесия в реакции (6) при изменении ц> нельзя отнести за счет составляющей АСгс в уравнении (9) По той же причине его нельзя отнести и за счет энтальпийной составляющей в уравнении

= ДЯР - ТАБ? (11)

Следовательно, причина заключается в энтропийной составляющей Мр Ясно, что при ОРцМА, » £>РПэвп, (т е при Ц1 = ОР^^ / ОРюш » 1), число полимерных частиц в рассматриваемой системе не зависит от положения равновесия (рис 21) Соответственно, зависимости дд от концентрации соли при = 70 и у = 33 практически совпадают (рис 20)

Рис. 21. Схема реакции (6) при £>РПма* » ОРпэвп

При ОРпма* < ДРпэвп (т е при ^ < 1), смещение равновесия в реакции (6) слева направо приводит к увеличению общего числа полимерных частиц в системе, и, следовательно, к увеличению А5Р (рис 22)

ПЭВП

ДНК

Л

ДНК ^ПМА* НПЭК

Рис. 22. Схема реакции (6) при ОРТЫк* < О/пэвп

В случае, когда ОРпма* и £>Лювп соизмеримы (т е при у « 1), общее число полимерных частиц в системе, на первый взгляд как и при у » 1, не должно зависеть от положения равновесия в реакции (6) Однако, если принять во внимание ранее установленный факт ассоциации растворимых интерполиэлектролитных комплексов, образованых противоположно заряженными полиионами с близкими степенями полимеризации [27], становится ясно, что при протекании реакции (6) слева направо общее число полимерных частиц в системе, (и, следовательно, и Мр) в этом случае должно возрастать (рис 23)

Рис. 23. Схема реакции (6) при ПРПмл* ~ ОРГ1эвп

По-видимому, этот эффект является причиной сдвига равновесия реакции вправо при переходе от 14/ = 33 к = 1 7 (рис 20)

Из приведенных данных следует, что существенные перестройки итерполиэлектролитных комплексов, содержащих ДНК, могут происходить в результате интерполиэлектролитных реакций, контролируемых как концентрацией и природой низкомолекулярных противоионов, так и соотношением степеней полимеризации конкурирующих полиионов Эти факторы могут играть существенную роль в интерполиэлектролитных реакциях с участием ДНК, протекающих в природе

3 3 Использование бромида этидия для изучения интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК

Существенным недостатком использованного метода тушения флуоресценции является то, что в качестве поликатиона можно использовать только тушитель флуоресценции Из обычных полимеров таковыми являются только гомо- и сополимеры, содержащие пиридиниевые группы Это существенно ограничивает круг доступных для исследования поликатионов Кроме того, используемые полианионы должны содержать флуоресцентные метки Ковалентное присоединение флуоресцирующих многоядерных ароматических молекул к заряженным цепям успешно осуществляется в основном только для карбоксилсодержащих полимеров [28] Введение флуоресцентных меток в ДНК также представляет собой достаточно сложную задачу [29] Кроме того, такая модификация неизбежно приводит к изменению свойств нуклеиновой кислоты

Для преодоления указанных выше ограничений в работе предложен новый подход, позволяющий изучать взаимодействие ДНК с широким кругом поликатионов Метод основан на использовании в качестве флуоресцентной метки бромида этидия (БЭ) - флуоресцентного красителя, широко применяемого в биохимии для идентификации нативной ДНК В водном растворе БЭ практически не флуоресцирует, однако интенсивность флуоресценции резко возрастает при его

интеркаляции (то есть встраивании его молекул) в двойную спираль ДНК с образованием комплекса (ДНК БЭ) [30] Этот комплекс очень устойчив (константа образования комплекса Кс составляет порядка 106 Мч) в результате специфического взаимодействия пленарных молекул этидия с основаниями ДНК и сохраняется даже в концентрированных растворах низкомолекулярных солей [31] Таким образом, отпадает необходимость в синтезе флуоресцентно меченной ДНК, поскольку флуоресцирующий комплекс образуется при простом добавлении БЭ к раствору ДНК В работе установлено, что взаимодействие поликатионов с ДНК приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции интеркалированного этидия независимо от того, является ли поликатион тушителем флуоресценции или нет Это позволяет исследовать взаимодействие ДНК с широким кругом природных и синтетических поликатионов различной природы

<Р

Рис. 24. Зависимость интенсивности флуоресценции I в системе (ДНК БЭ)-ПК от ф = [ПК] / [ДНК] для разных ПК [ДНК] = 4 10"5 М, [БЭ] / [ДНК] = 02

На рис 24 представлены зависимости интенсивности флуоресценции комплекса (ДНКБЭ) от количества добавляемых поликатионов (ПК) различной природы -синтетических поликатионов ПЭВП, 5,6-ионена (5,6-И), поли-Ы,№-диметилдиаллил-аммония (ПДМДАА), полипептида поли-Ь-лизина (ПЛ) и основного белка гистона Н1 Из рисунка видно, что зависимости состоят из двух приблизительно линейных участков При этом уменьшение I происходит сходным образом при добавлении всех использованных нами ПК - как для эффективного тушителя флуоресценции ПЭВП, так и для пе обладающих этим свойством остальных поликат ионов

На седиментограммах реакционных смесей, соответствующих первой части кривых (с меньшим наклоном), присутствует только один быстро седиментирующий компонент, а именно тройной комплекс (ДПКБЭ-ПК) Дальнейшее увеличение концентрации ПК, соответствующее второму участку кривых, приводит к

вытеснению БЭ поликатионами из комплекса (ДНК БЭ) и накоплению свободного БЭ в растворе На это указывает появление на седиментограммах практически неседиментирующих молекул БЭ и появление в спектрах поглощения полосы, характерной для свободного БЭ

Таким образом, в работе впервые зарегистрировано вытеснение интеркали-рованных молекул БЭ в раствор молекулами поликатионов и определены условия, при которых оно происходит Вытеснение интеркалированного БЭ в раствор является, по-видимому, результатом совместного действия электростатических и гидрофобных взаимодействий

Уменьшение I на начальных участках кривых на рис 24 объясняется, по-видимому, изменением локального окружения интеркалированных молекул БЭ под влиянием ПК, экранирующего отрицательные заряды на двойной спирали ДНК Такое опосредованное влияние ПК аналогично влиянию низкомолекулярных катионов Добавление простой соли к раствору комплекса (ДНК БЭ) сопровождается уменьшением I из-за изменения локального окружения интеркалированных молекул БЭ без изменения числа мест их связывания [30] Однако влияние ПК, образующего с ДНК систему интерполимерных солевых связей, значительно выше, чем простой соли Так, из рис 24 следует, что введение около 3 КГ3 М заряженных звеньев ПК приводит к уменьшению I приблизительно на 30% Для достижения сравнимого уменьшения I с помощью ЫаС1 требуется на четыре порядка большая его концентрация [30]

Из рис 24 видно, что эффективность воздействия ПК на интенсивность флуоресценции интеркалированного БЭ зависит от их химической природы Дополнительный вклад в тушение флуоресценции могут вносить гидрофобные взаимодействия, обусловленные наличием в молекулах ПК гидрофобных участков основной цепи и боковых групп Так, для ПЭВП и ПДМДАА, имеющих сходную структуру мономерных звеньев, наклон начальных участков кривых практически одинаков, а для относительно более гидрофобных 5,6-И и ПЛ он заметно выше

Особую группу среди изученных нами ПК составляют белки Их поведение не укладывается в рамки этих представлений Так, влияние богатого лизином гистона Н1 на интенсивность флуоресценции интеркалированного БЭ оказывается значительно слабее по сравнению с гомополимером ПЛ (рис 24) Такое различие, по-видимому, обусловлено спецификой структуры белков и особенностями их взаимодействия с ДНК Выяснение этого вопроса требует дальнейших исследований

Электростатическое связывание ПК с ДНК, сопровождаемое компенсацией зарядов фосфатных групп, приводит к формированию протяженных гидрофобных участков По-видимому, это приводит к нарушению положения оснований ДНК, обеспечивающего оптимальную интеркаляцию БЭ По мере увеличения степени заполнения ДНК цепями ПК это нарушение становится настолько значительным, что приводит к вытеснению молекул БЭ в раствор В случае ПЭВП и ПДМДАА это происходит вблизи точки эквивалентности зарядов, <р = I 0, а для относительно более гидрофобных 5,6-И и ПЛ несколько раньше, при ф = 0 8 (рис 24) О важной роли гидрофобных взаимодействий в этом процессе говорит и тот факт, что во всех системах начало выделения БЭ в раствор совпадает с появлением опалесценции,

свидетельствующей об агрегации частиц ПЭК Образование нерастворимых агрегатов может служить еще одним фактором, способствующим вытеснению интеркалированного красителя Рост числа свободных молекул БЭ в растворе компенсирует проигрыш в энтропии системы, обусловленный уменьшением общего числа частиц в растворе из-за перевода комплексов в осадок

Важно, что уменьшение интенсивности флуоресценции, вызванное вытеснением интеркалированного БЭ и образованием комплекса ДНК с ПК, полностью обратимо Разрушение комплекса, достигаемое добавлением низкомолекулярного электролита, сопровождается ростом интенсивности флуоресценции /

[МеС1], М

Рис. 25 Зависимость относительной интенсивности флуоресценции /к / /0 комплекса (ДНК БЭ-ПЭВПзо) и определенной методом седиментации доли 2 поликатиона, выделившегося из НПЭК(ДНК-ПЭВП30), от концентрации соли [МеС1]

Это иллюстрируется рис 25, на котором представлены зависимости относительной интенсивности флуоресценции 1к /' 1<> в смеси комплекса (ДНК-ПЭВП) и БЭ от концентрации хлоридов щелочных металлов (/0 - интенсивность флуоресценции раствора комплекса (ДНК БЭ) при тех же условиях) Для сравнения на рисунке приведены также заимствованные из рис 17 кривые разрушения НПЭК(ДНК-ПЭВП), полученные методом седиментации Из рисунка видно, что во всех солях при полной диссоциации НПЭК происходит полное восстановление интенсивности флуоресценции Кроме того, видно, что последовательности катионов по их способности разрушать комплекс ДНК-ПЭВП, определяемые обоими методами, одинаковы К+ < Ыа' < 1л+ Наблюдаемое на рис 25 расхождение кривых при низких концентрациях солей свидетельствует о том, что использование БЭ позволяет регистрировать процесс разрыва связей ДНК-ПК в масштабе участков цепей полиионов В то же время, это невозможно при применении метода седиментации

так как фиксируемое с его помощью отделение молекулы ПК от молекулы ДНК происходит лишь после полного разрушения межцепных связей

Таким образом, измеряя интенсивность флуоресценции бромида этидия, можно следить как за образованием, так и за разрушением комплексов (ДНК-ПК) и изучать различные факторы, влияющие на комплексообразование

Предложенный подход является удобным также и для изучения конкурентных интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК

Покажем это на примере реакции (6), изученной нами с использованием флуоресцентно-меченного ПМА юоо-. но вместо флуоресцентно-меченного ПМА* используем меченную бромидом этидия ДНК

НПЭК(ПМА1(Юо-ПЭВПзо) + (ДНК БЭ) <===> ПМА,осо + НПЭК(ДНК БЭ-ПЭВП30) (12) Полученные результаты представлены на рис 26 в виде зависимости степени превращения дс от концентрации соли Видно, что эта кривая практически совпадает с кривой, полученной при использовании флуоресцентно меченного ПМА'юоо, взятой из рис 16 Некоторое расхождение кривых при низкой концентрации соли может быть обусловлено предпочтительным связыванием ПЭВП с участками ПМА*, несущими пиреновую метку [32] Известно, что причиной подобной избирательности является стремление гидрофобных пиреновых меток находиться в гидрофобном окружении, создаваемом углеводородными цепями взаимодействующих полиионов В более концентрированных растворах соли, где сисгема межцепных солевых связей в существенной степени разрушена, гидрофобность двухцепочечных участков комплекса снижается, и разница в поведении ПМА и ПМА исчезает

ИаС1

0 8-,

сг 0 4-

0 6-

02-

00

НПЭК(ПМА*-ПЭВП) + ДНК

0.05 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 [ЫаС1], М

Рис. 26 Зависимость степени превращения <ус в интерполиэлектролитных реакциях НПЭЩПМЛ, 000-ПЭВП:,0) с (ДНК КЭ) и НПЭКЩМА" шоо-ПЭВПзо) с ДНК от концентрации ЫаС1

Таким образом, используя бромид этидия в качестве флуоресцентной метки, можно изучать как степень связывания различных поликатионов с ДНК, гак и конкурентные интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК Как отмечено выше, интеркаляция БЭ приводит к частичному раскручиванию двойной спирали ДНК и изменению ее геометрии, что неизбежно должно оказывать влияние на ее взаимодействие с поликатионами Поэтому предлагаемый подход неприменим для получения абсолютных количественных параметров комплексообразования ДНК с поликатионами Однако, как следует из приведенных выше примеров, эгот подход вполне пригоден для сравнительной оценки связывания ДНК с поликатионами различной природы

Предложенный подход также применим для изучения комплексообразования ДНК с другими заряженными молекулами, в том числе и неполимерной природы -например, с ПАВ, дендримерами и т п Кроме гого, он может быть использован для исследования комплексообразования и конкурентных реакций не только с ДНК, но и с другими полинуклеотидами, интеркаляция БЭ в молекулы которых сопровождается увеличением его флуоресценции [33]

Выводы

1 Предложен и апробирован новый подход к изучению конформационного поведения полиэлектролитов в водных растворах, позволяющий на основании данных по электропроводности растворов полиэлектролитов определять структурные характеристики полиионов и конформационные изменения полиионов различной природы в зависимости от их молекулярных характеристик и внешних условий Разработанный подход впервые применен для изучения состояния синтетических полинуклеотидов, а также для изучения процессов термической и концентрационной денатурации нативной ДНК в водных растворах Показано, что разработанный кондуктометрический подход адекватно отражает состояние полиионов ДНК и их конформационные изменения в указанных процессах Установлено, что конформация денатурированной ДНК не является полностью вытянутой даже в разбавленных бессолевых растворах

2 Впервые проведено систематическое изучение конформационного поведения полианионов нативной ДНК и линейных синтетических полианионов полиакрилата и полистиролсульфоната и поликатионов поли-Ы-этил-4-винилпиридиния и алифатических ионенов в бессолевых водных растворах в зависимости от степени полимеризации полиионов Показано, что для всех изученных полиионов уменьшение степени полимеризации приводит к увеличению среднего расстояния между зарядами на цепи полиионов, что указывает на конформационный переход полиионов от свернутой к вытянутой конформации Установлено, что для гибкоцепных синтетических полиионов этот переход происходит при более низких значениях степеней полимеризации по сравнению с полианионом нативной двухспиральной ДНК

3 Установлено, что при достижении характерного для каждого полииона значения степени полимеризации, дальнейшее укорачивание цепи не приводит к увеличению среднего расстояния между зарядами, что свидетельствует о достижении персистентной длины полииона На основании этих данных оценены значения персистентных длин изученных полиионов Установлено, что полиионы с длиной цепи, не превышающей их персистентной длины, не принимают полностью вытянутой конформации даже в бессолевых растворах при комнатной температуре, причем увеличение температуры приводит к увеличению среднего расстояния между зарядами

4 Впервые проведено систематическое изучение конформационного поведения ряда линейных синтетических поликатионов в бессолевых водных растворах в зависимости от их молекулярных характеристик На примере поликатионов поли-М-алкил-4-винилпири.диния с различными №алкильными заместителями показано, что увеличение гидрофобносш заместителя приводит к уменьшению среднего расстояния между зарядами на полиионе, что говорит о переходе

полиионов к более свернутой конформации 11а примере поликатионов поли-И-этил-4-виншширидиния с различными степенями алкилирования показано, что уменьшение плотности заряда полиионов приводит к сворачиванию цепей поликатионов Установлено, что степень и характер сворачивания цепей поликатионов зависят от степени полимеризации На примере поликатионов алифатических ионенов изучено влияние распределения зарядов на цепи полиионов на их конформацию в водных бессолевых растворах Показано, что в широком интервале изменения плотности зарядов на цепях ионенов электростатическая составляющая жесткости цепи полиионов доминирует над структурной составляющей Показано, что не только плотность зарядов, но и их распределение по цепи существенно влияет на жесткость и конформацию цепи лолииона

5 Методом тушения флуоресценции впервые изучена реакция конкурентного связывания полианионов ДНК и флуоресцентно меченных полиметакрилатных полианионов с поликатионами поли-М-этил-Д-винилпиридиния Показано, что степени полимеризации взаимодействующих полиионов и концентрация низкомолекулярной соли являются решающими факторами, определяющими скорость этой реакции Установлено, что соотношение степеней полимеризации взаимодействующих полиионов, а также природа и концентрация низкомолекулярной соли являются факторами эффективного воздействия на направление и положение равновесия реакции конкурентного связывания Установлено, что влияние солей на равновесие реакции зависит от селективности ДНК к катионам соли Показано, что термическая денатурация ДНК приводит к изменению ее ионной селективности и конкурентоспособности в интерполиэлекгролитной реакции

6 Исследованы реакции комплексообразования ДНК с природными и синтетическими поликатионами различной природы с использованием бромида этидия в качестве флуоресцентной метки Впервые показано, что электростатически связывающиеся с ДНК поликатионы способны обратимо вытеснять интеркалированные молекулы красителя из двойной сшфали ДНК На основании полученных результатов предложен новый подход, позволяющий изучать взаимодействие ДНК с широким кругом поликатионов, а также интерполи-электролитные реакции с участием ДНК, не прибегая к синтезу флуоресцентно меченных полианионов и не ограничиваясь использованием поликатионов-тушителей Предложенный подход применим для исследования взаимодействия нуклеиновых кислот и их аналогов с заряженными объектами, в том числе и неполимерной природы

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1 Кузнецов И А, Каргов С И, Хамизов Р X, Горшков В И Ионообменные свойства иммобилизованной ДНК влияние концентрации полимера и природы растворителя на обмен ионов щелочных металлов II Мол Биол 1983, т 17, №2, с 403-409

2 Кузнецов И А , Каргов С И, Козлов А Г Взаимодействие иммобилизованной ДНК с ионами щелочных металлов и аммония // Мол Биол 1984, т 18, №6, с 1583-1589

3 Kuznetsov I А, Gorshkov V I, Ivanov V А, Kargov S I, Korolev N I, Fihppov S M, KhamizovR Kh Ion-exchange properties of îmmobilized DNA II Reactive polymers, ton Exchangers, Sorbents 1984, Vol 3,No l,p 37—49

4 Каргов С И, Королев H И, Кузнецов И А, Станиславский О Б Взаимодействие иммобилизованной ДНК с ионами серебра II Мол Биол 1986, т 20, № 6, с 1499— 1505

5 Каргов С И , Филиппов С M, Кузнецов И А Протонирование оснований в изоионных растворах ДНК Физико-химический анализ с использованием Ag(I) в качестве зонда II Журн Физ Химии 1988, т 62, №5, с 1320-1329

6 Кабанов В А, Жирякова M В , Каргов С И, Зезин А Б , Изумрудов В А Влияние низкомолекулярных солей на конкурентное связывание полианионов ДНК и полиметакрилат-анионов с поли-Ы-этил-4-винилпиридинием в водных растворах // Доклады Академии Наук 1993, т 329, № 1, с 66-70

7 Козлов А Г, Давыдова О В , Каргов С И Исследование бессолевых растворов полигуаниловой кислоты методом кондуктометрии // Журн Физ Химии 1993, т 67, №8, с 1692-1696

8 Козлов А Г, Давыдова О В , Каргов С И Кондуктометрическое исследование растворов полигуаниловой кислоты при низкой концентрации поддерживающего электролита Сравнение подходов В инка и Маннинга И Журн Физ Химии 1993, т 67, № 8, с 1697-1700

9 Кабанов В А , Жирякова M В , Каргов С И, Зезин А Б , Изумрудов В А Возможность определяющего влияния степени полимеризации полиионов на направление конкурентной реакции в растворах нестехиометричных интерполиэлектролитных комплексов и ДНК // Доклады Академии Наук 1993, т 332, № 6, с 722-727

10 Изумрудов В А, Зезин А Б , Каргов С И , Жирякова M В , Кабанов В А Конкурентное вытеснение интеркалированных в ДНК катионов этидия поликатионами И Доклады Академии Наук 1995, г 342, № 5, с 626-629

11 Izumrudov V А , Kargov S 1, Zhiryakova M V, Zezm A В , Kabanov V A Compétitive reactions in solutions of DNA and water-soluble interpolyelectrolyte complexes II Biopolymers 1995, Vol 35, No 5, p 523-531

12 Izumrudov V A , Zhiryakova M V , Kargov S I, Zezm A В , Kabanov V A Compétitive reactions m solutions of DNA-contaimng polyelectrolyte complexes // Macromol Symp 1996, Vol 106, p 179-192

13 Давыдова О В, Каргов С И, Козлов А Г Кондуктометрическое исследование перехода «спираль - клубок» в концентрированных растворах нуклеиновых кислот с использованием подхода Маннинга // Журн Физ Химии 1996, т 70, № 2, с 306-310

14 Жирякова М В , Каргов С й, Изумрудов В А Влияние катионов кальция и магния на конкурентную реакцию в растворах ДНК-содержащих полиэлектролитных комплексов // Вестн Моек Ун-та, Сер 2 Химия 1996, т 37, №4, с 410-415

15 Давыдова О В , Каргов С И Кондуктометрическое исследование взаимодействия солей полирибоадениловой и полирибоуридиловой кислот в водных растворах с использованием подхода Маннинга // Вестн Моек Ун-та, Сер 2 Химия 1997, т 38, № 1, с 42—45

16 Каргов С И, КозловА Г, Давыдова О В Взаимодействие ионов серебра с полигуаниловой кислотой в изоионных и не содержащих поддерживающего электролита растворах П Журн Физ Химии 1997, т 71, №8, с 1510-1513

17 Давыдова О В, Каргов С И Влияние диэлектрической проницаемости растворителя и концентрации ДНК на процесс ее термической денатурации в водных растворах // Вестн Моек Ун-та, Сер 2 Химия 1999, т 40, №3, с 152— 154

18 DavydovaO V, ZelikmAN, KargovSI, IzumrudovV A Conformation of polyelectrolyte chains m dilute aqueous solutions investigated by conductometry

1 Influence of the degree of polymerization on the conformation of flexible vmylic polyamons and rigid native DNA // Macromol Chem Phys 2001, Vol 202, No 8, p 1361-1367

19 DavydovaO V, ZelikmAN, KargovSI, IzumrudovV A Conformation of polyelectrolyte chains m dilute aqueous solutions investigated by conductometry

2 Influence of temperature, cham length and N-alkyl substituent on conformation of exhaustively alkylated poly(N-alkyl-4-vinylpyridinmm) cations // Macromol Chem Phys 2001, Vol 202, No 8,p 1368-1373

20 Davydova О V, Zelikin A N, Kargov S I, Izumrudov V A Coniormation of polyelectrolyte chains m dilute aqueous solutions investigated by conductometry

3 Influence of charge density on the conformation of partly alkylated poly(N-ethyl-4-vmylpyridmium) cations and lonenes // Macromol Chem Phys 2002, Vol 203, No 5-6,p 837-844

21 Давыдова О В , Козлов А Г, Каргов С И Концентрационная денатурация ДНК в бессолевых растворах Журн Физ Химии 2002, г 76, №10, с 1852-1855

22 Zelikin А N , Davydova О V, Akritskaya N I, Kargov S I, izumrudov V A Conformation of polyelectrolyte chains m dilute aqueous solutions investigated by conductometry 4 Influence of molecular mass and charge density of the chains on conformation of symmetrical aliphatic юпепе bromides // J Phys Chem В 2004, Vol 108, No l,p 490^195

Цитированная литература

1 Manning G S A limiting law for the conductance of the rod model of a salt-free polyelectrolyte solution IIJ Phys Chem 1975, Vol 79, No 3,p 262-265

2 Manning G S Limiting laws and counterion condensation m polyelectrolyte solutions 7 Electrophoretic mobility and conductance // J Phys Chem 1981, Vol 85, No 11, p 1506-1515

3 Wandrey С , Hunkeler D Study of polyion counterion interaction by electrochemical methods // Handbook of polyelectrolytes and their applications (Ed Tripathy S К, Kumar J , Nalwa H S ), American Scientific Publishers, 2002, Vol 2,p 147-172

4 MuthukumarM Theory of counter-ion condensation on flexible polyelectrolytes Adsorption mechanism IIJ Chem Phys 2004, Vol 120, No 19, p 9343-9350

5 Dobrynm A V, Colby R H, Rubinstein M Scaling theory of polyelectrolyte solutions // Macromolecules 1995, Vol 28, No 6,p 1859-1871

6 Bordi F , Cametti С , Colby R H Dielectric spectroscopy and conductivity of polyelectrolyte solutions // J Phys Condens Matter 2004, Vol 16, R1423-R1463

7 Зенгер В II Принципы структурной организации нуклеиновых кислот M Мир, 1987 584 с

8 Manning G S The application of polyelectrolyte limiting laws to the helix-coil transition of DNA VI The numerical value of the axial phosphate spacing for the coil form //Biopolymers 1976, Vol 15, No 12, p 2385-2390

9 Olson W K, Manning G S A configurational interpretation of the axial phosphate spacing in polynucleotide helices and random coils // Biopolymers 1976, Vol 15, No 12, p 2391-2405

10 АхремА А, Андрианов В Г, Власов A 11, КоролевНИ, Кузнецов И А Термическая денатурация ДНК в концентрированных бессолевых растворах сопоставление микрокалориметрических и спектрофотометрических данных // Мол Биол 1985, т 19, № 3, с 623-628

11 Kassapidou К, Tesse W , Kuil M Е, Lapp А , Egelhaaf S , van der Maarel J R С Structure and charge distribution m DNA and poly(styrenesulfonate) aqueous solutions II Macromolecules 1997, Vol 30, No 9,p 2671-2684

12 Leo A, HanschC, ElkinsD Partition coefficients and their uses II Chem Rev 1971, Vol 71, No 6,p 525-616

13 OdijkT Polyelectrolytes near the rod limit I I J Polym Sci,Polym Phys Ed 1977, Vol 15, No 3, p 477-483

14 Skolnick J , Fixman M Electrostatic persistence length of a wormlike polyelectrolyte // Macromolecules 1977, Vol 10, No 5,p 944-948

15 Zhuomei L , Xuexm Z , Yuanpei С, Yuanzhen Z Hydrophobic interaction oi lonenes m aqueous solution II Macromolecules 1992, Vol 25, No 1,450^153

16NagayaJ, MmakataA, TaniokaA Conductance and counterion activity of юпепе solutions // Langmuir 1999, Vol 15, No 12, p 4129^1134

17 Yamazaki S, Muroga Y, Nodal Persistence lengths of îonenes m methanol // Langmuir 1999, Vol 15, No 12, p 4147-4149

18 Ullner M Comments on the scaling behavior of flexible polyelectrolyles wilhm the Debye-I-Iuckelapproximation //J Phys Chem B2003,Vol 107,No 32,p 8097-8110

19 Кабанов В А Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов И Высокомолек соед 1994, г 36, № 2, с 183-197

20 Изумрудов В А, Зезин А Б , Кабанов В А Равновесие интерполиэлектролитных реакций и явление молекулярного «узнавания» в растворах интерполиэлектролитных комплексов II Успеха химии 1991, т 60, №7, с 1570-1595

21 Кабанов А В, Кабанов В А Интерполиэлектролитные комплексы нуклеиновых кислот как средство доставки генетическою материала в клетку // Высокомолек соед 1994, т 36, № 2, с 198-221

22 Kabanov V А, Zezm А В , Izumrudov V А , Bromch Т К , Bakeev К N Cooperative interpolyelectrolyte reactions // Macromol Chem, Suppl 1985, Vol 13, p 137-155

23 Bakeev К N , Izumrudov V A, Kuchanov S I, Zezin А В , Kabanov V A Kinetics and mechanism of interpolyelectrolyte exchange and addition reactions // Macromolecules 1992, Vol 25, No 17, p 4249-4254

24 Изумрудов В A, Бронич T К , Сабурова О С , Зезин А Б , Кабанов В А Степень полимеризации полииона и природа низкомолекулярного противоиона как факторы, определяющие направление интерполиэлектролитной реакции // ДАН СССР 1988, т 301, №3, с 634-638

25 Гордон Дж Органическая химия растворов электролитов М Мир, 1979, 712с

26 Изумрудов В А, Ныркова Т Ю , Зезин А Б , Кабанов В А Влияние длины цепи лиофилизирующего полииона на направление и кинетику интерполиэлектролитной реакции обмена II Высокомолек соед 1987, т Б29, № 6, с 474^478

27 Зезин А Б , Касаикин В А, Кабанов Н М, Харенко О А, Кабанов В А Влияние соотношения степеней полимеризации компонентов на образование нестехио-метричных комплексов // Высокомолек соед 1984, т А26, № 7, с 1519-1523

28 Краковяк М Г , Ануфриева Е В , Скороходов С С Получение полимеров с люминесцентными метками ИВысокомолек соед 1969, т All,№11, с 2499-2504

29 Сухишвили С А, Обольский О JI, Астафьева И В , Кабанов А В , Ярославов А А Интерполиэлектролитные комплексы, содержащие ДНК взаимодействие с липосомами II Высокомолек соед 1993, т 35, №11, с 1895-1899

30 Le Pecq J -В , Paoleto С A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids Physical-chemical characterization // J Mol Biol 1967, Vol 27, No 1, p 87106

31 Waring M J Complex formation between ethidium bromide and nucleic acids IIJ Mol Biol 1965, Vol 13, No l,p 269-282

32 Бакеев К H , Изумрудов В А, Зезин А Б , Кабанов В А Эффект молекулярной избирательности в интерполиэлектролитных реакциях // Высокомолек соед 1987, т Б29, № 7, с 483-484

33 БабаянЮ С , Манзини Дж, КвадрифолиоФ Взаимодействие бромистого этидия с синтетическими двуспиральными полирибонуклеотидами // Мол Биол 1988, т 22, №4, с 898-910

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stpnnt ru e-mail zakaz@stprmt ru тел 939-33-38 Тираж 150 экз Подписано в печать 20 03 2008 г

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Теоретические подходы к описанию электропроводности растворов полиэлектролитов.

1.1.1. Электропроводность растворов полиэлектролитов.

1.1.2. Модель пористой сферы.

1.1.3. Модель линейного заряда.

1.1.4. Модель Маннинга.

1.2. Влияние различных факторов на подвижность полииона.

1.2.1. Влияние степени полимеризации.

1.2.2. Влияние плотности заряда.

1.2.3. Влияние ионной силы.

1.2.4. Влияние гибкости цепи.

1.3. Модификация модели Маннинга с помощью теории скейлинга для конформации полиэлектролитов.

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы.

2.1.1. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

2.1.2. Синтетические полианионы.

2.1.3. Синтетические поликатионы.

2.1.4. Полипептиды и белки.

2.1.5. Бромид этидия (БЭ).

2.2. Приборы и методики экспериментов.

2.2.1. Кондуктометрические измерения.

2.2.2. Потенциометрические измерения.

2.2.3. Определение концентрации низкомолекулярных солей.

2.2.4. Спектрофотометрические измерения.

2.2.5. Приготовление растворов нестехиометричных полиэлектролитных комплексов (НПЭК).

2.2.6. Спектрофлуориметрические измерения.

2.2.7. Измерения спектров кругового дихроизма (КД).

2.2.8. Седиментационные измерения.

2.2.9. Молекулярное моделирование.

ГЛАВА 3. Конформационные изменения ДНК и линейных синтетических полиэлектролитов в водных растворах.

3.1. Применение теории полиэлектролитов Маннинга для оценки конформационных изменений полиэлектролитов в водных растворах.

3.2. Термическая денатурация ДНК в водных растворах.

3.3. Концентрационная денатурация ДНК в бессолевых растворах.

3.4. Факторы, влияющие на конформацию полиионов в растворе.

3.4.1. Влияние длины и жёсткости цепи.

3.4.2. Влияние температуры.

3.4.3. Влияние гидрофобных взаимодействий.

3.4.4. Влияние плотности заряда на полиионе.

3.4.5. Влияние распределения зарядов на полиионе.

ГЛАВА 4. Конкурентные интерполиэлектролитные реакции в растворах полиэлектролитных комплексов с участием ДНК.

4.1. Водорастворимые полиэлектролитные комплексы и интерполиэлектролитные реакции с их участием.

4.2. Интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК.

4.3. Факторы, влияющие на скорость достижения равновесия в интерполиэлектролитных реакциях с участием ДНК.

4.4. Факторы, влияющие на положение равновесия в интерполиэлектролитных реакциях с участием ДНК.

4.4.1. Влияние катионов щелочных металлов.

4.4.2. Влияние вторичной структуры ДНК.

4.4.3. Влияние катионов кальция и магния.

4.4.4. Влияние степени полимеризации синтетических полиионов.

ГЛАВА 5. Использование бромида этидия для изучения взаимодействия ДНК с поликатионами различной природы и интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК.

5.1. Взаимодействие бромида этидия с ДНК.

5.2. Механизм взаимодействия БЭ с ДНК.

5.3. Влияние интеркаляции БЭ на структуру и свойства ДНК.

5.4. Тушение флуоресценции интеркалированного в ДНК бромида этидия ионами металлов и низкомолекулярными соединениями.

5.5. Взаимодействие комплекса ДНК-БЭ с поликатионами различной химической природы.

5.6. Механизм тушения флуоресценции интеркалированного БЭ поликатионами.

5.8. Поведение комплексов (ДНК-БЭ)-поликатион в водно-солевых растворах.

5.9. Использование бромида этидия для изучения интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК.

ВЫВОДЫ.

Актуальность темы

Актуальность изучения физико-химических свойств полиэлектролитов и полиэлектролитных комплексов объясняется потребностями как фундаментальной, так и прикладной науки. Природные, модифицированные природные и синтетические полиэлектролиты и полиэлектролитные комплексы на их основе широко применяются в различных областях химической технологии, биотехнологии, медицины, охраны окружающей среды, а изучение свойств полиэлектролитов и интерполиэлектролитных комплексов является фундаментальной задачей химии и физики полимеров. Функции полиэлектролитов в природе и их главные области применения основываются на их взаимодействиях либо с низкомолекулярными противоионами, либо с заряженными поверхностями, либо с противоположно заряженными полиэлектролитами. Однако особенности этих взаимодействий и связанное с ними взаимовлияние структуры и реакционной способности полиэлектролитов ещё далеки от полного понимания, в значительной степени из-за сложности учёта влияния многих факторов. Особый интерес в рамках этой проблемы представляет изучение биологически значимых полиэлектролитов, в частности, нуклеиновых кислот, а также интерполиэлектролитных реакций с их участием. Комплексы нуклеиновых кислот с белками составляют основу хроматина, рибосом и других компонентов клетки, а также вирусов. Образование комплексов нуклеиновых кислот с гистонами составляет существенный этап в процессах передачи генетической информации. Выяснение механизма таких взаимодействий необходимо как для понимания их нормальных биологических функций, так и их нарушений в процессах канцерогенеза и мутагенеза. Значение таких исследований особенно возрастает в связи с проблемами экологии. Однако основная трудность при изучении этих систем заключается в том, что биологические полиэлектролиты имеют сложную и изменчивую структуру. В связи с этим большой интерес представляют исследования более простых модельных систем, позволяющие выявить физико-химические закономерности влияния различных факторов на структуру и реакционную способность полиэлектролитов и процессы интерполиэлектролитных взаимодействий. Изучение взаимодействия нуклеиновых кислот с различными высокомолекулярными противоионами весьма актуально также в связи с разработкой эффективных методов доставки генетического материала в клетку. Необходимым условием для таких исследований является, в частности, всестороннее знание о поведении полиэлектролитов в растворах. В то же время имеющаяся информация о свойствах и поведении полиэлектролитов далее в простых модельных системах неполна, фрагментарна или противоречива.

Основная часть диссертационной работы проводилась в рамках темы «Физико-химические свойства природных и синтетических полиэлектролитов», номер госрегистрации 01.980.008940. В разное время работа была поддержана грантами INTAS No. 93-1083 "Fabrication of nanostructures for imaging and addressing nanometer scale objects" и РФФИ № 97-03-32302a «Исследование селективности ДНК и синтетических полинуклеотидов к низко- и высокомолекулярным катионам».

Цели работы

1. Изучение конформационных изменений ДНК и линейных синтетических полиэлектролитов в водных растворах и их связи с молекулярными характеристиками полиионов.

2. Изучение интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК и линейных синтетических полиионов в водных растворах, а также факторов, влияющих на скорость и равновесие таких реакций.

Научная новизна

• Показано, что использование кондуктометрических данных совместно с теорией полиэлектролитов Маннинга открывает новые возможности для анализа конформационного поведения полиионов в растворах. Разработанный в диссертации кондуктометрический подход является простым и информативным методом, позволяющим изучать конформационные изменения полиионов в растворах в зависимости от их молекулярных характеристик и внешних условий.

• Методом тушения флуоресценции впервые изучены интерполиэлектролитные реакции замещения с участием ДНК и водорастворимых нестехиометричных полиэлектролитных комплексов, образованных линейными синтетическими полиионами. Выявлены особенности таких реакций, обусловленные структурой и ионной селективностью ДНК. Установлены факторы, способные эффективно контролировать скорость и равновесие реакций конкурентного взаимодействия ДНК с полиионами.

• Предложен новый подход к изучению взаимодействия ДНК с поликатионами с использованием бромида этидия в качестве флуоресцентной метки. Метод позволяет изучать взаимодействие ДНК и других полинуклеотидов с широким кругом поликатионов, а также интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК, не прибегая к трудоёмкому синтезу флуоресцентно меченных полианионов и не ограничиваясь использованием поликатионов-тушителей, что позволяет существенно расширить круг доступных для исследования объектов.

Практическая значимость работы

• Результаты изучения растворов полиэлектролитов могут быть использованы для разработки и дальнейшего усовершенствования существующих теорий полиэлектролитов и интерполиэлектролитных взаимодействий.

• Результаты изучения скорости и равновесия интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК могут быть использованы для направленного синтеза ДНК-содержащих полиэлектролитных комплексов с заданными свойствами и прогнозируемым поведением, что необходимо для разработки лекарственных препаратов в генной терапии и эффективных методов их доставки в клетку.

• Предложенный метод изучения комплексообразования ДНК с поликатионами различной природы с использованием бромида этидия может быть использован для исследования широкого круга интерполиэлектролитных реакций с участием нуклеиновых кислот, для разработки схем разделения многокомпонентных биологических смесей, а также для создания простых и высокочувствительных методов диагностики.

Личный вклад автора

Постановка проблем, экспериментальные исследования и анализ полученных результатов проведены автором лично и с участием соавторов совместных научных публикаций.

Работы по изучению ионообменных свойств иммобилизованной ДНК выполнены совместно с И. А. Кузнецовым, Р. X. Хамизовым,

A. Г. Козловым, С. М. Филипповым, В. А. Ивановым, проф.

B. И. Горшковым.

Работы по кондуктометрическому изучению конформационных изменений ДНК в водных растворах выполнены совместно с О. В. Давыдовой и А. Г. Козловым.

Работы по кондуктометрическому изучению конформационных изменений синтетических полиэлектролитов в водных растворах выполнены совместно с О. В. Давыдовой, проф. В. А. Изумрудовым и А. Н. Зеликиным.

Работы по изучению интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК и природных и синтетических полиэлектролитов выполнены совместно с проф. В. А. Изумрудовым и М. В. Жиряковой. В обсуждении результатов принимали участие чл.-корр. РАН А. Б. Зезин и акад. РАН В. А. Кабанов.

Публикации и апробация работы

По результатам диссертации опубликовано 22 статьи, список которых приведён в конце автореферата. Результаты работы были представлены на VII международной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991 г.), на международной конференции "Nano-structures and self-assemblies in polymer systems" (Санкт-Петербург - Москва, 1995 г.), на Российско-Израильском полимерном семинаре (Москва, 1995 г.), на всероссийской конференции «Конденсационные полимеры: синтез, структура, свойства» (Москва, 1999 г.), на втором всероссийском каргинском симпозиуме «Химия и физика полимеров в начале XXI века» (Черноголовка, 2000 г.), международном симпозиуме "Polyelectrolytes 2002" (Лунд, Швеция, 2002 г.), юбилейной научной конференции «Герасимовские чтения» (Москва, 2003 г.), третьей всероссийской каргинской конференции «Полимеры-2004» (Москва, 2004 г.), XII симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Пущино, 2004 г.).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 220 страницах, включает 77 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 365 наименований.

Выводы

1. Предложен и апробирован новый подход к изучению конформационного поведения полиэлектролитов в водных растворах, позволяющий на основании данных по электропроводности растворов полиэлектролитов определять структурные характеристики полиионов и конформационные изменения полиионов различной природы в зависимости от их молекулярных характеристик и внешних условий. Разработанный подход впервые применён для изучения состояния синтетических полинуклеотидов, а также для изучения процессов термической и концентрационной денатурации нативной ДНК в водных растворах. Показано, что разработанный кондуктометрический подход адекватно отражает состояние полиионов ДНК и их конформационные изменения в указанных процессах. Установлено, что конформация денатурированной ДНК не является полностью вытянутой даже в разбавленных бессолевых растворах.

2. Впервые проведено систематическое изучение конформационного поведения полианионов нативной ДНК и линейных синтетических полианионов полиакрилата и полистиролсульфоната и поликатионов поли-М-этил-4-винилпиридиния и алифатических ионенов в бессолевых водных растворах в зависимости от степени полимеризации полиионов. Показано, что для всех изученных полиионов уменьшение степени полимеризации приводит к увеличению среднего расстояния между зарядами на цепи полиионов, что указывает на конформационный переход полиионов от свёрнутой к вытянутой конформации. Установлено, что для гибкоцепных синтетических полиионов этот переход происходит при более низких значениях степеней полимеризации по сравнению с полианионом нативной двухспиральной

ДНК.

3. Установлено, что при достижении характерного для каждого полииона значения степени полимеризации, дальнейшее укорачивание цепи не приводит к увеличению среднего расстояния между зарядами, что свидетельствует о достижении персистентной длины полииона. На основании этих данных оценены значения персистентных длин изученных полиионов. Установлено, что полиионы с длиной цепи, не превышающей их персистентной длины, не принимают полностью вытянутой конформации даже в бессолевых растворах при комнатной температуре, причём увеличение температуры приводит к увеличению среднего расстояния между зарядами.

4. Впервые проведено систематическое изучение конформационного поведения ряда линейных синтетических поликатионов в бессолевых водных растворах в зависимости от их молекулярных характеристик. На примере поликатионов поли-Ы-алкил-4-винилпиридиния с различными Ы-алкильными заместителями показано, что увеличение гидрофобности заместителя приводит к уменьшению среднего расстояния между зарядами на полиионе, что говорит о переходе полиионов к более свёрнутой конформации. На примере поликатионов поли-]М-этил-4-винилпиридиния с различными степенями алкилирования показано, что уменьшение плотности заряда полиионов приводит к сворачиванию цепей поликатионов. Установлено, что степень и характер сворачивания цепей поликатионов зависят от степени полимеризации. На примере поликатионов алифатических ионенов изучено влияние распределения зарядов на цепи полиионов на их конформацию в водных бессолевых растворах. Показано, что в широком интервале изменения плотности зарядов на цепях ионенов электростатическая составляющая жёсткости цепи полиионов доминирует над структурной составляющей. Показано, что не только плотность зарядов, но и их распределение по цепи существенно влияет на жёсткость и конформацию цепи полииона.

5. Методом тушения флуоресценции впервые изучена реакция конкурентного связывания полианионов ДНК и флуоресцентно меченных полиметакрилатных полианионов с поликатионами поли-1Ч-этил-4-винилпиридиния. Показано, что степени полимеризации взаимодействующих полиионов и концентрация низкомолекулярной соли являются решающими факторами, определяющими скорость этой реакции. Установлено, что соотношение степеней полимеризации взаимодействующих полиионов, а также природа и концентрация низкомолекулярной соли являются факторами эффективного воздействия на направление и положение равновесия реакции конкурентного связывания. Установлено, что влияние солей на равновесие реакции зависит от селективности ДНК к катионам соли. Показано, что термическая денатурация ДНК приводит к изменению её ионной селективности и конкурентоспособности в интерполиэлектролитной реакции.

6. Исследованы реакции комплексообразования ДНК с природными и синтетическими поликатионами различной природы с использованием бромида этидия в качестве флуоресцентной метки. Впервые показано, что электростатически связывающиеся с ДНК поликатионы способны обратимо вытеснять интеркалированные молекулы красителя из двойной спирали ДНК. На основании полученных результатов предложен новый подход, позволяющий изучать взаимодействие ДНК с широким кругом поликатионов, а также интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК, не прибегая к синтезу флуоресцентно меченных полианионов и не ограничиваясь использованием поликатионов-тушителей. Предложенный подход применим для исследования взаимодействия нуклеиновых кислот и их аналогов с заряженными объектами, в том числе и неполимерной природы.

1. Mandel М. Polyelectrolytes. // Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, 2nd ed. (MarkH. F., BikalesN. M., Overberger C. G., Menges G., eds.), Vol. 11, New York, Wiley, 1988, p. 739-829.

2. Van Leeuwen H. P., Cleven R. F. M. J., Valenta P. Conductometric analysis of polyelectrolytes in solution. // PureAppl. Chem. 1991, Vol.63, No. 9, p. 1251-1268.

3. VinkH. Conductance of polyelectrolyte solutions, anisotropy, and other anomalies. // Physical Chemistry of Polyelectrolytes (Radeva Т., ed.), New York, Dekker 2001, p. 203-222.

4. Wandrey C., Hunkeler D. Study of polyion counterion interaction by electrochemical methods. // Handbook of Polyelectrolytes and their Applications (Tripathy S. K., Kumar J., NalwaH. S., eds.), American Scientific Publishers, 2002, Vol. 2, p. 147-172.

5. Bordi F., Cametti C., Colby R. H. Dielectric spectroscopy and conductivity of polyelectrolyte solutions. // J. Phys.: Condens. Matter, 2004, Vol. 16, No. 49, p. R1423-R1463.

6. Manning G. S. A limiting law for the conductance of the rod model of a saltfree polyelectrolyte solution. // J. Phys. Chem. 1975, Vol. 79, No. 3, p. 262-265.

7. Manning G. S. Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions. 7. Electrophoretic mobility and conductance. // J. Phys. Chem. 1981, Vol. 85, No. 11, p. 1506-1515.

8. GueronM., WeisbuchG. Polyelectrolyte theory. I. Counterion accumulation, site-binding, and their insensitivity to polyelectrolyte shape in solutions containing finite salt concentrations. // Biopolymers 1980, Vol. 19, No. 2, p. 353-382.

9. Anderson С. F., Record M. T. The relationship between the Poisson-Boltzmann model and the condensation hypothesis: an analysis based on the low salt form of the Donnan coefficient. // Biophys. Chem. 1980, Vol. 11, No. 3-4, p. 353-360.

10. Klein В. K., Anderson C. F., Record M. T. Comparison of Poisson-Boltzmann and condensation model expressions for the colligative properties of cylindrical polyions. // Biopolymers 1981, Vol. 20, No. 10, p. 2263-2280.

11. Zimm B.H., Le Bret M. Counter-ion condensation and system dimensionality. //J. Biomol. Struct. Dyn. 1983, Vol. 1, No. 2, p. 461-471.

12. LeBretM., ZimmB.H. Distribution of counterions around a cylindrical polyelectrolyte and Manning's condensation theory. // Biopolymers 1984, Vol. 23, No. 2, p. 287-312.

13. Франк-Каменецкий M. Д., Аншелевич В. В., Лукашин А. В. Полиэлектролитная модель ДНК. // Успехи физич. наук 1987, т. 151, № 4, с. 595-618.

14. StigterD. Evaluation of the counterion condensation theory of polyelectrolytes. // Biophys. J. 1995, Vol. 69, No. 2, p. 380-388.

15. Manning G. S. The critical onset of counterion condnsation: A survey of its experimental and theoretical basis. // Ber. Bunsenges. Phys. Chem. Chem. Phys. 1996, Vol. 100, No. 6, p. 909-922.

16. Mohanty U., NinhamB. W., Oppenheiml. Dressed polyions, counterion condensation, and adsorption excess in polyelectrolyte solutions. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, No. 9, p. 4342-4344.

17. Tracy C. A., WidomH. On exact solutions to the cylindrical Poisson-Boltzmann equation with applications to polyelectrolytes. // PhysicaA 1997, Vol. 244, No. 1-4, p. 402^113.

18. Manning G. S. Counterion condensation theory constructed from different models. //PhysicaA 1996, Vol. 231, No. 1-3, p. 236-253.

19. Levin Y. Theory of counterion association in rod-like poly electrolytes. // Europhys. Lett. 1996, Vol. 34, No. 6, p. 405-^10.

20. Levin Y., Barbosa M. C. Thermodynamic theory of counterion association in rigid polyelectrolytes. II J. Phys. 1997, Vol. 7, No. 1, p. 37-55.

21. Manning G. S., Ray J. Counterion condensation revisited. // J. Biomol. Struct. Dyn. 1998, Vol. 16, No. 2, p. 461-476.

22. Ray J., Manning G. S. Counterion and coion distribution functions in the counterion condensation theory of polyelectrolytes. // Macromolecules 1999, Vol. 32, No. 14, p. 4588-4595.

23. SchiesselH. Counterion condensation on flexible polyelectrolytes: dependence on ionic strength and chain concentration. // Macromolecules 1999, Vol. 32, No. 17, p. 5673-5680.

24. BlaulJ., WittemannM., BallauffM., RehahnM. Osmotic coefficient of a synthetic rodlike polyelectrolyte in salt-free solution as a test of the Poisson-Boltzmann cell model. // J. Phys. Chem. B 2000, Vol.104, No. 30, p. 7077-7081.

25. Popov A., HoaglandD. A. Electrophoretic evidence for a new type of counterion condensation. // J. Polymer Sci. B 2004, Vol.42, No. 19, p. 3616-3627.

26. Muthukumar M. Theory of counter-ion condensation on flexible polyelectrolytes: Adsorption mechanism. // J. Chem. Phys. 2004, Vol. 120, No. 19, p. 9343-9350.

27. Huizenga J. R., Grieger P. F., Wall F. T. Electrolytic properties of aqueous solutions of polyacrylic acid and sodium hydroxide. I. Transference experiments using radioactive sodium. // J.Am. Chem. Soc. 1950, Vol. 72, No. 6, p. 2636-2642.

28. EisenbergH. Conductance of partially neutralized polymethacrylic and polyacrylic acids, using a polarization compensated twin cell. // J. Polym. Sci. 1958, Vol. 30, No. 121, p. 47-66.

29. Kurucsev T., Steel B. J. The use of electrical transport measurements for the determination of counterion association in salt-free polyelectrolyte solutions. // Rev. Pure Appl. Chem. 1967, Vol. 17, p. 149-157.

30. Manning G. S. On the interpretation on conductance measurements in saltfree polyelectrolyte solutions with an application to the helix-coil transition of poly(D-glutamic acid). // Biopolymers 1970, Vol. 9, No. 12, p. 1543-1546.

31. Katchalsky A., Alexandrawicz Z., Kedem O. Polyelectrolyte solutions. // Chemical Physics of Ionic Solutions, (Conway B. E., Barrada R. G., eds.), New York, Wiley, 1966, p. 295.

32. Manning G. S. Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions I. Colligative properties. // J. Chem. Phys. 1969, Vol. 51, No. 3, p. 924-933.

33. Manning G. S. Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions II. Self-diffusion of the small ions. // J. Chem. Phys. 1969, Vol. 51, No. 3, p. 934-938.

34. Overbeek J. T. G. Polyelectrolytes: past, present and future. // Pure Appl. Chem. 1976, Vol. 46, No. 2-4, p. 91-101.

35. Van den Hoop M. A. G. T., Benegas J. C. Improvement in conductometric analysis of metal / polyelectrolyte systems. // Macromolecules 1997, Vol. 30, No. 13, p. 3930-3932.

36. DeJongH. G., LyklemaJ., Van Leeuwen H. P. Conductometric analysis of the competition between monovalent and divalent counterions in their interaction with polyelectrolytes. // Biophys. Chem. 1987, Vol. 27, No. 2, p. 173-182.

37. Henry D. C. Cataphoresis of suspended particles. Part I. The equation of cataphoresis. // Proc. Roy. Soc., Ser. A 1931, Vol. 133, No. 821, p. 106-129.

38. Wiersema P. H., Loeb A. L., Overbeek J. T. G. Calculation of the electrophoretic mobility of a spherical colloid particle. // J. Coll. Int. Sci. 1966, Vol. 22, No. 1, p. 78-99.

39. Booth F. The cataphoresis of spherical, solid non-conducting particles in a symmetrical electrolyte. // Proc. Roy. Soc., Ser. A 1950, Vol. 203, No. 1075, p. 514-533.

40. Hermans J. J. Sedimentation and electrophoresis of porous spheres. // J. Polym. Sci. 1955, Vol. 18, No. 90, p. 527-534.

41. Allison S. A., NambiP. Transport of charged macromolecules in an electric field by a numerical method. 1. Application to a sphere. // Macromolecules 1992, Vol. 25, No. 15, p. 3971-3978.

42. Allison S. A., Nambi P. Electrophoresis of spheres by a discretized integral equation / finite difference approach. // Macromolecules 1994, Vol. 27, No. 6, p. 1413-1422.

43. RasmussonM., Vincent B.3 MarstonN. The electrophoresis of poly(N-isopropylacryl-amide) microgel particles. // Coll. Polym. Sci. 2000, Vol. 278, No. 3, p. 253-258.

44. Imai N., Iwasa K. Theory of electrophoresis of polyelectrolytes. // Isr. J. Chem. 1973, Vol. 11, No. 2-3, p. 223-233.

45. OhshimaH. Electrophopretic mobility of soft particles. I I Electrophoresis 1995, Vol. 16, No. 1, p. 1360-1363.

46. Takahashi T., Noda I., Nagasawa M. Electrophoresis of a rod-like polyelectrolyte in salt solution. // J. Phys. Chem. 1970, Vol. 74, No. 6, p. 1280-1284.

47. Mills R. A. Electrophoretic charge of a cylindrical macroion in aqueous 1:1 electrolyte. // Biopolymers 1970, Vol. 9, No. 12, p. 1511-1530.

48. Van der Drift W. P. J. T., De Keizer A., Overbeek J. T. G. Electrophoretic mobility of a cylinder with high surface charge density. // J. Coll. Int. Sci. 1979, Vol. 71, No. l,p. 67-78.

49. Ohshima H. Electroosmotic velocity in an array of parallel soft cylinders in a salt-free medium. // Coll. Surf.: Biointerf. 2004, Vol. 38, No. 3-4, p. 139-141.

50. Allison S. A., Mazur S. Modeling the free solution electrophoretic mobility of short DNA fragments. // Biopolymers 1998, Vol. 46, No. 6, p. 359-373.

51. Schmitt A., Meullenet J. P., Varoqui R. Relaxation and electrophoretic effects in polyelectrolyte solutions. I. Salt-free solutions. // Biopolymers 1978, Vol. 17, No. 2, p. 413^123.

52. Schmitt A., Meullenet J. P., Varoqui R. Relaxation and electrophoretic effects in polyelectrolyte solutions. II. Polyelectrolyte-plus-salt solutions. // Biopolymers 1978, Vol. 17, No. 5, p. 1249-1255.

53. LongD., ViovyJ.-L., Ajdari A. A Zimm model for polyelectrolytes in an electric field. II J. Phys. Condens. Matter 1996, Vol. 8, No. 47, p. 9471-9475.

54. Long D., Viovy J.-L., Ajdari A. Simultaneous action of electric fields and nonelectric forces on a polyelectrolyte: Motion and deformation. // Phys. Rev. Lett. 1996, Vol. 76, No. 20, p. 3858-3861.

55. Allison S., Wall S., Rasmusson M. A general gel layer model for the transport of colloids and macroions in dilute solution. // J. Coll. Interface Sci. 2003, Vol. 263, p. 84-98.

56. DolnikV., Liu J., Banks Jr. J. F., NovotnyM. V., BocekP. Capillary zone electrophoresis of oligonucleotides. Factors affecting separation. // J. Chromatogr. 1989, Vol. 480, p. 321-330.

57. Carney S. L., Osborne D.J. The separation of chondroitin sulfate disaccharides and hyaluronan oligosaccharides by capillary zone electrophoresis. II Anal. Biochem. 1991, Vol. 195, No. 1, p. 132-140.

58. Braud C., Vert M. Degradation of poly((3-malic acid)-monitoring of oligomers formation by aqueous SEC and HPCE. // Polym. Bull. 1992, Vol. 29, No. 1-2, p. 177-183.

59. Volkel A. R., Noolandi J. Mobilities of labeled and unlabeled single-stranded DNA in free solution electrophoresis. // Macromolecules 1995, Vol. 28, No. 24, p. 8182-8189.

60. Volkel A. R., Noolandi J. On the mobility of stiff polyelectrolytes. // J. Chem. Phys. 1995, Vol. 102, No. 13, p. 5506-5511.

61. Stellwagen N. C., Gelfi C., Righetti P. G. The free solution mobility of DNA. // Biopolymers 1997, Vol. 42, No. 6, p. 687-703.

62. Cohen A. S., Najarian D., Smith J. A., Karger B. L. Rapid separation of DNA restriction fragments using capillary electrophoresis // J. Chromatogr. 1988, Vol. 458, p. 323-333.

63. ClelandR. L. Electrophoretic mobility of wormlike chains. 1. Experiment: Hyaluronate and chondroitin 4-sulfate. // Macromolecules 1991, Vol.24, No. 15, p. 4386-4390.

64. ClelandR. L. Electrophoretic mobility of wormlike chains. 2. Theory. I I Macromolecules 1991, Vol. 24, No. 15, p. 4391^1402.

65. Muthukumar M. Theory of electrophoretic mobility of polyelectrolyte chains. // Macromol. Theory Simul. 1994, Vol. 3, No. 1, p. 61-71.

66. Muthukumar M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. // Electrophoresis 1996, Vol. 17, No. 6, p. 1167-1172.

67. Hoagland D. A., Arvanitidou E., Welch C. Capillary electrophoresis measurements of the free solution mobility for several model polyelectrolyte systems. II Macromolecules 1999, Vol. 32, No. 19, p. 6180-6190.

68. Skolnick J., Grimmelmann E. K. A preliminary examination of end effects in polyelectrolyte theory: The potential of a line segment of charge. // Macromolecules 1980, Vol. 13, No. 2, p. 335-338.

69. Record M. T., Lohman T. M. A semiempirical extension of polyelectrolyte theory to the treatment of oligoelectrolytes: application to oligonucleotidehelix coil transitions. // Quart. Rev. Biophys. 1978, Vol.11, No. 2, p. 103-178.

70. Katoh T., Ohtsuki T. End effects for a rodlike polyelectrolyte molecule in salt solution. // J. Polymer Sci., Polymer Phys. 1982, Vol.20, No. 1, p. 21672175.

71. OdijkT. Impact of nonuniform counterion condensation on the growth of linear charged micelles. // Physica A 1991, Vol. 176, No. 2, p. 201-205.

72. HickeyD. R., Turner D. H. Solvent effects on the stability of A7U7P. II Biochemistry 1985, Vol. 24, No. 8, p. 2086-2094.

73. Williams A. P., Longfellow C. E., FreierS.M., KierzekR., Turner D. H. Laser temperature-jump, spectroscopic, and thermodynamic study of salt effects on duplex formation by dGCATGC. // Biochemistry 1989, Vol. 28, No. 10, p. 4283-4291.

74. Mills P. A., RashidA., James T. L. Monte Carlo calculations of ion distributions surrounding the oligonucleotide d(ATATATATAT) in the B, A, and wrinkled D conformations. // Biopolymers 1992, Vol.32, No. 11, p. 1491-1501.

75. Dewey T. G. A ligand binding model of counterion condensation to finite length polyelectrolytes. II Biopolymers 1990, Vol. 29, No. 14, p. 1793-1799.

76. Woodbury C. P., Ramanathan G. V. End effects of polyelectrolytes by the Mayer cluster integral approach. // Macromolecules 1982, Vol. 15, No. 1, 82— 86.

77. Stein V. M., Bond J. P., CappM. W., Anderson C. F., Record M. T. Importance of coulombic end effects on cation accumulation nearoligoelectrolyte B-DNA: A demonstration using Na NMR. // Biophys. J. 1995, Vol. 68, No. 3, p. 1063-1072.

78. Ramanathan G. V., Woodbury C. P. Statistical mechanics of electrolytes and polyelectrolytes. II. Counterion condensation on a line charge. // J. Chem. Phys. 1982, Vol. 77, No. 8, p. 4133-4140.

79. Manning G. S. Counterion condensation on ionic oligomers. // PhysicaA 1997, Vol. 231, No. 1-4, p. 196-204.

80. Yang A. J. M., Fleming P. D., Gibbs J. H. Molecular theory of surface tension. II J. Chem. Phys. 1976, Vol. 64, No. 9, p. 3732-3747.

81. Jones G. L., MohantyU. A density functional-variational treatment of the hard sphere transition. II Mol. Phys. 1985, Vol. 54, p. 1241-1252.

82. González-Mozuelos P., Olvera De La Cruz M. Ion condensation in salt-free dilute polyelectrolyte solutions. // J. Chem. Phys. 1995, Vol. 103, No. 8, p. 3145-3157.

83. Nodal., NagasawaM., OtaM. Electrophoresis of a polyelectrolyte in solutions of high ionic strength. // J. Am. Chem. Soc. 1964, Vol. 86, No. 23, p. 5075-5079.

84. Anzuino G., Costantino L., Gallo R., Vitagliano V. Electrophoretic separation of conventional and isotactic poly(methacrylic acid). // J. Polym. Sci.: Part B 1966, Vol. 4, No. 7, p. 459-462.

85. Mandel M., Leyte J. C. Interaction of polymethacrylic acid and bivalent counterions. II. II J. Polym. Sci.: Part A 1964, Vol. 2, No. 8, p. 3771-3780.

86. Nagasawa M., Noda I., Takahashi T., Shimamoto N. Transport phenomena of polyelectrolytes in solution under electric field. // J. Phys. Chem. 1972, Vol. 76, No. 16, p. 2286-2294.

87. ProkopováE., CiferriA. Electrophoretic behavior of poly-L-glutamic acid and poly-L-lysine. // Biopolymers 1972, Vol. 11, No. 8, p. 1621—1626.

88. Prokopova E., Vitagliano V. Electrophoretic heterogeneity of poly-methacrylic, polyacrylic and polyethylenesulphonic acid in NaCl solutions. // Eur. Polym. J. 1972, Vol. 8, No. 6, p. 851-859.

89. Meullenet J. P., SchmittA., DriffordM. Electrophoretic light scattering of linear polyelectrolyte aqueous salt solutions. // J. Phys. Chem. 1979, Vol. 83, No. 14, p. 1924-1927.

90. Van der Drift W. P. J. T., Overbeek J. T. G. Electric transport properties of alkali polymethacrylates in alkali bromide solutions. // J. Colloid Interface Sci. 1979, Vol. 71, No. 1, p. 79-92.

91. Cha C. Y., Folger R. L., Ware B. R., Electrophoretic light scattering of water-soluble polyelectrolytes. // J. Polym. Sci.: Polym. Phys. Ed. 1980, Vol. 18, No. 8, p. 1853-1857.

92. Whitlock L. R., Wheeler L. M. Isotachophoresis of synthetic ion-containing polymers separation of copolymer mixtures of poly(2-hydroxyethyl-methacrylate-co-2-acrylamido-2-methylpropanesulfonate). // J. Chrom. 1986, Vol. 368, 125-134.

93. Klein J. W., Ware B. R. Direct observation of the transition to counterion condensation. II J. Chem. Phys. 1984, Vol. 80, No. 3, p. 1334-1339.

94. Xia J., Dubin P. L., Havel H. A. Electrophoretic light scattering study of counterion condensation on polylysine. // Macromolecules 1993, Vol. 26, No. 24, p. 6335-6337.

95. Manning G. S. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic properties of polynucleotides. // Quart Rev. Biophys. 1978, Vol. 11, No. 2, p. 179-246.

96. Stigter D. Electrophoresis of highly charged colloidal cylinders in univalent salt solutions. 1. Mobility in transverse field. // J. Phys. Chem. 1978, Vol. 82, No. 12, p. 1417-1423.

97. Stigter D. Electrophoresis of highly charged colloidal cylinders in univalent salt solutions. 2. Random orientation in external field and application to polyelectrolyte. II J. Phys. Chem. 1978, Vol. 82, No. 12, p. 1424-1429.

98. Stigter D. A comparison of Manning's polyelectrolyte theory with the cylindrical Gouy model. // J. Phys. Chem. 1978, Vol. 82, No. 14, p. 16031606.

99. Stigter D. Theory of conductance of colloidal electrolytes in univalent salt solutions. II J. Phys. Chem. 1979, Vol. 83, No. 12, p. 1663-1670.

100. Schellman J. A., Stigter D. Electrical double layer, zeta potential, and electrophoretic charge of double stranded DNA. // Biopolymers 1977, Vol. 16, No. 7, p. 1415-1434.

101. Hoagland D. A., Smisek D. L., Chen D. Y. Gel and free solution electrophoresis of variably charged polymers. // Electrophoresis 1996, Vol. 17, No. 6, p. 1151-1160.

102. Manning G. S. Is the counterion condensation point on polyelectrolytes a trigger of structural transition? // J. Chem. Phys. 1988, Vol. 89, No. 6, p. 3772-3777.

103. RasmussonM.; AkermanB. Dynamic mobility of DNA. // Langmuir 1998, Vol. 14, No. 13, p. 3512-3516.

104. NagasawaM., Soda A., Kagawal Electrophoresis of polyelectrolyte in salt solutions. II J. Polym. Sci. 1958, Vol. 31, No. 123, p. 439-451.

105. Wilcoxon J. P., Schurr J. M. Electrophoretic light scattering studies of poly(L-lysine) in the ordinary and extraordinary phase. Effects of salt, molecular weight, and polyion concentration. // J. Chem. Phys. 1983, Vol. 78, No. 6, p. 3354-3364.

106. Zero K., Ware B. R. Mobilities of poly-Z-lysine molecules in low-salt solutions. II J. Chem. Phys. 1984, Vol. 80, No. 4, p. 1610-1616.

107. Creeth J. M., Jordan J. O., Gulland J. M. Deoxypentose nucleic acids. Part IV. The electrophoresis of the deoxypentose nucleic acid of calf thymus. // J. Chem. Soc. 1949, p. 1406-1409.

108. Mathieson A. R., McLaren J. V. Deoxypentose nucleic acids. Part IX. The electrophoretic mobility of sodium deoxyribonucleate at various pH values and ionic strengths. // J. Chem. Soc. 1956, p. 303-307.

109. Ross P. D., Scruggs R. L. Electrophoresis of DNA. III. The effect of several univalent electrolytes on the mobility of DNA. // Biopolymers 1964, Vol. 2, No. 3, p. 231-236.

110. OliveraB. M., Baine P., Davidson N. Electrophoresis of the nucleic acids. // Biopolymers 1964, Vol. 2, No. 3, p. 245-257.

111. Costantino L., LiquoriA. M., Vitagliano, V. Influence of thermal denaturation on the electrophoretic mobility of calf thymus DNA. // Biopolymers 1964, Vol. 2, No. 1, p. 1-8.

112. Hartford S. L., Flygare W. H. Electrophoretic light scattering on calf thymus deoxyribonucleic acid and tobacco mosaic virus. // Macromolecules 1975, Vol. 8, No. l,p. 80-83.

113. DriffordM., MenezR., TivantP., NectouxP., DalbiezJ. P. Quasi-elastic light-scattering in an electrical-field — electrophoretic mobility and apparent charge of macromolecules. // Rev. Phys. Appl. 1981, Vol. 16, No. 2, p. 19-33.

114. Cesaro A., Paoletti S., UrbaniR., Benegas J. C. Polyelectrolytic effects in semi-flexible carboxylate polysaccharides. Part 2. // Int. J. Biol. Macromol. 1989, Vol. 11, No. 2, p. 66-72.

115. YuM., Liu Q. An equation of state for polymer molecules: From flexible chains to rigid rods. // Macromolecules 1996, Vol. 29, No. 21, p. 6928-6932.

116. Tufflle F. M., AnderP. Electric transport for aqueous solutions of sodium alginate and sodium polygalacturonate. I I Macromolecules 1975, Vol. 8, No. 6, p. 789-792.

117. Ma C., Bloomfield V. A. Gel electrophoresis measurement of counterion condensation on DNA. // Biopolymers 1995, Vol. 35, No. 2, p. 211-216.

118. Li A. Z., Qi L. J., Shih H. H., Marx K. A. Trivalent counterion condensation on DNA measured by pulse gel electrophoresis. // Biopolymers 1996, Vol. 38, No. 3, p. 367-376.

119. Li A. Z., Huang H., Re X., Qi L. J., Marx K. A. A gel electrophoresis study of the competitive effects of monovalent counterion on the extent of divalent counterions binding to DNA. // Biophys. J. 1998, Vol. 74, No. 2, p. 964-973.

120. Fenley M. O., Olson W. K., Manning G. S. Dependence of counterion binding on DNA shape as determined by counterion condensation theory. // Macromolecules 2000, Vol. 33, No. 5, p. 1899-1903.

121. Manning G. S. Counterion condensation on a helical charge lattice. // Macromolecules 2001, Vol. 34, No. 13, p. 4650^1655.

122. Manning G. S. Electrostatic free energy of the DNA double helix in counterion condensation theory. // Biophys. Chem. 2002, Vol. 101-102, p. 461—473.

123. De Gennes P. G., Pincus P., Velasco R. M., Brochard F. J. Remarks on polyelectrolyte conformation. // J. Phys. 1976, Vol. 37, p. 1461-1473.

124. OdijkT. Possible scaling relations for semidilute polyelectrolyte solutions. // Macromolecules 1979, Vol. 12, No. 4, p. 688-693.

125. Rubinstein M., Colby R. H., DobryninA. V. Dynamics of semidilute polyelectrolyte solutions. II Phys. Rev. Lett. 1994, Vol. 73, No. 20, p. 2776-2779.

126. Dobrynin A. V., Colby R. H., Rubinstein M. Scaling theory of polyelectrolyte solutions. II Macromolecules 1995, Vol. 28, No. 6, p. 1859-1871.

127. Dobrynin A. V., Rubinstein M. Counterion condensation and phase separation in solutions of hydrophobic polyelectrolytes. // Macromolecules 2001, Vol. 34, No. 6, p. 1964-1972.

128. Dobrynin A. V., Rubinstein M. Theory of polyelectrolytes in solutions and at surfaces IIProg. Polym. Sci. 2005, Vol. 30, No. 11, p. 1049-1118.

129. Dobrynin A. V., Rubinstein M. Hydrophobic polyelectrolytes. // Macromolecules 1999, Vol. 32, No. 3, p. 915-922.

130. Dobrynin A. V., Rubinstein M., Obukhov S. P. Cascade of transitions of polyelectrolytes in poor solvents. // Macromolecules 1996, Vol. 29, No. 8, p. 2974-2979.

131. SchiesselH., Pincus P. Counterion-condensation-induced collapse of highly charged polyelectrolytes. // Macromolecules 1998, Vol. 31, No. 22, p. 7953— 7959.

132. Limbach H. J., Holm C. Single-chain properties of polyelectrolytes in poor solvent. HJ. Phys. Chem. B 2003, Vol. 107, No. 32, p. 8041-8055.

133. Liao Q., Dobrynin A. V., Rubinstein M. Molecular dynamics simulations of polyelectrolyte solutions: Nonuniform stretching of chains and scaling behavior. II Macromolecules 2003, Vol. 36, No. 9, p. 3386-3398.

134. Liao Q., Dobrynin A. V., Rubinstein M. Counterion-correlation-induced attraction and necklace formation in polyelectrolyte solutions: Theory and simulations. IIMacromolecules 2006, Vol. 39, No. 5, p. 1920-1938.

135. Colby R. H., Boris D. C., Krause W. E., Tan J. S. Polyelectrolyte conductivity. II J. Polym. Sci.: Polym. Phys. 1997, Vol. 35, No. 17, p. 2951-2960.

136. Bordi F., Cametti C., Motta A., Paradossi G. Electrical conductivity of dilute and semidilute aqueous polyelectrolyte solutions. A scaling theory approach. II J. Phys. Chem. B 1999, Vol. 103, No. 24, p. 5092-5099.

137. Bordi F., Colby R. H., Cametti C., De Lorenzo L., Gili T. Electrical conductivity of polyelectrolyte solutions in the semidilute and concentratedregime: The role of counterion condensation. // J. Phys. Chem. В 2002, Vol. 106, No. 27, p. 6887-6893.

138. BordiF., Cametti C., Gili T. Electrical conductivity of aqueous polyelectrolyte solutions in the presence of counterion condensation: The scaling approach revisited. // Phys. Rev. E 2002, Vol. 66, No. 2, p. 021803/1021803/11.

139. Marmur J., Doty P. Heterogeneity in deoxyribonucleic acids. I. Dependence on composition of the configurational stability of deoxyribonucleic acids. // Nature 1959, Vol. 183, No. 4673, p. 1427-1429.

140. Спирин А. С. Спектрофометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. // Биохимия 1958, т. 23, №3, с. 656-662.

141. Olins D. Е., Olins A. L., Von Hippel P. Н. Model nucleoprotein complexes: studies on the interaction of cationic homopolypeptides with DNA. // J. Mol. Biol. 1967, Vol. 24, No. 2, p. 157-176.

142. Izumrudov V. A., Savitskii A. P., Bakeev K. N., Zezin А. В., Kabanov V. A. A fluorescence quenching study of interpolyelectrolyte reactions. // Macromol. Chem., Rapid Commun. 1984, Vol. 5, No. 11, p. 709-714.

143. Харенко О. А., Харенко А. В., Калюжная P. И., Изумрудов В. А., Касаикин В. А., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Нестехиометричные комплексы новые водорастворимые макромолекулярные соединения. // Вьгсокомол. соед. 1979, т. А21, № 12, с. 2719-2725.

144. Starodubtsev S. G., KirshYu. E., Kabanov V. A. Solvation effects and reactivity of free pyridine residues in macromolecules of poly-4-vinylpyridine derivatives. II Eur. Polym. J. 1977, Vol. 10, No. 8, p. 739-745.

145. Zelikin A. N., AkritskayaN. I., Izumrudov V. A. Modified aliphatic ionenes. Influence of charge density and length of the chains on complex formation with poly(methacrylic acid). // Macromol. Chem. Phys. 2001, Vol. 202, No. 15, p. 3018-3026.

146. LePecq J.-B., Paoletti C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids. Physical-chemical characterization. // J. Mol. Biol. 1967, Vol. 27, No. l,p. 87-106.

147. Харнед Г., Оуэн Б. // Физическая химия растворов электролитов. М.: ИЛ, 1952, 628 с.

148. Справочник по электрохимии (под ред. Сухотина А. М.) Л.: Химия, 1981,488 с.

149. Jones S. A., Goodall D. М., Cutler A. N., Norton I. Т. Application of conductivity studies and polyelectrolyte theory to the conformation and orderdisorder transition of xanthan polysaccharide. // Eur. Biophys. J. 1987, Vol. 15, No. 3, p. 185-191.

150. GrassiH., Rix-Montel M. A., KranckH., VasilescuD. Premelting effects in DNA under saltfree conditions. // Biopolymers 1975, Vol. 14, No. 12, p. 2525-2534.

151. Кузнецов И. А., Аполонник H. В., ШкловерИ. С. Полиэлектролитные свойства ДНК: Энергия активации электропроводности и кондукто-метрические кривые плавления концентрированных бессолевых растворов. // Биополимеры и клетка 1987, т. 3, № 2, с 71—76.

152. Кузнецов И. А., Матвеев В. К., Шкловер И. С. Зависимость электропроводности концентрированных бессолевых растворов ДНК от температуры, концентрации и природы противоиона. // Журн. физ. химии 1987, т. 61, № 10, с. 2841-2845.

153. Кузнецов И. А., Давыдова О. В., Шкловер И. С. Кондуктометрическое исследование перехода «спираль-клубок» в концентрированныхрастворах ДНК при низких концентрациях поддерживающего электролита. // Журн. физ. химии. 1988, т. 62, № 9, с 2506-2509.

154. Vasilescu D., Teboul М., KranckH., Camous В. Showing up the thermal transconformation of Na-DNA in solution by noise spectrography. // Biopolymers 1973, Vol. 12, No. 2, p. 341-352.

155. Korolev N. I., Vlasov А. P., Kuznetsov I. A. Thermal denaturation of Na- and Li-DNA in salt-free solutions. // Biopolymers 1994, Vol. 34, No. 9, p. 12751290.

156. Manning G. S. The application of poly electrolyte limiting laws to the helix-coil transition of DNA. VI. The numerical value of the axial phosphate spacing for the coil form. // Biopolymers 1976, Vol. 15, No. 12, p. 23852390.

157. Olson W. K., Manning G. S. A configurational interpretation of the axial phosphate spacing in polynucleotide helices and random coils. // Biopolymers 1976, Vol. 15, No. 12, p. 2391-2405.

158. Rix-Montel M. A., Grassi H., Vasilescu D. Experimental studies of thermal denaturation of the Na-DNA system with respect to Manning's model. // Biophys. Chem. 1974, Vol. 2, No. 3, p. 278-289.

159. Manning G. S. On the application of polyelectrolyte "limiting laws" to the helix-coil transition of DNA. I. Excess univalent cations. // Biopolymers 1972, Vol. 11, No. 5, p. 937-949.

160. Bloomfield V. A., Crothers D. M., Tinoco I. Physical Chemistry of Nucleic Acids. NY: Harper and Row, 1974, ch. 7.

161. Crothers D. M. Statistical thermodynamics of nucleic acid melting transitions with coupled binding equilibria. // Biopolymers 1971, Vol. 10, No. 11, p. 2147-2160.

162. Barber R. Studies in the alkaline denaturation of DNA and the stability of the helix. Biochim. Biophys. Acta 1971, Vol. 238, No. 1, p. 60-66.

163. Dore E., Frontali C., Gratton E. The role of ions in the acid melting of DNA. II Biopolymers 1972, Vol. 11, No. 10, p. 2033-2041.

164. Shiao D. D. F., Sturtevant J. M. Heats of thermally induced helix coil transitions of DNA in aqueous solution. // Biopolymers 1973, Vol. 12, No. 8, p. 1829-1836.

165. Privalov P. L., Ptitsyn O. B., Birshtein T. M. Determination of stability of the DNA double helix in an aqueous medium. // Biopolymers 1969, Vol. 8, No. 5, p. 559-700.

166. GruenwedelD. W. Salt effects on the denaturation of DNA. III. A calorimetric investigation of the transition enthalpy of calf thymus DNA in Na2S04 solutions of varying ionic strength. // Biochim. Biophys. Acta 1974, Vol. 340, No. l,p. 16-30.

167. Marmur J., Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. // J. Mol. Biol. 1962, Vol. J, No. l,p. 109-118.

168. Schildkraut C., Lifson S. Dependence of the melting temperature of DNA on salt concentration. // Biopolymers 1965, Vol. 3, No. 2, p. 195-208.

169. Wetmur J. G. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991, Vol. 26, No. 3^, p. 227-259.

170. SantaLucia J., AllawiH. T., Seneviratne P. A. Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability. // Biochemistry 1996, Vol. 35, No. 11, p. 3555-3562.

171. Blake R. D., Delcourt S. G. Thermal stability of DNA. // Nucleic Acids Res. 1998, Vol. 26, No. 14, p. 3323-3332.

172. Owczarzy R, YouY., MoreiraB. G., MantheyJ. A., Huang L., Behllce M. A., Walder J. A. Effects of sodium ions on DNA duplex oligomers: improved predictions of melting temperatures. // Biochemistry 2004, Vol. 43, No. 12, p. 3537-3554.

173. Frank-Kamenetskii M. D. Simplification of the empirical relationship between melting temperature of DNA, its GC content and concentration of sodium ions in solution. // Biopolymers 1971, Vol. 10, No. 12, p. 2623-2624.

174. Wada A., Yabuki S., Husimi Y. Fine structure in the thermal denaturation of DNA: high temperature-resolution spectrophotometric studies. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1980, Vol. 9, No. 2, p. 87-114.

175. GruenwedelD. W., Hsu C.-H. Salt effects on the denaturation of DNA. // Biopolymers 1969, Vol. 7, No. 4, p. 557-570.

176. Gruenwedel D. W., Hsu C.-H., LuD. S. The effects of aqueous neutral-salt solutions on melting temperatures of deoxyribonucleic acids. // Biopolymers 1971, Vol. 10, No. l,p. 47-68

177. Record М. Т. Electrostatic effects on polynucleotide transitions. II. Behavior of titrated systems. И Biopolymers 1967, Vol. 5, No. 10, p. 993-1008.

178. Власов А. П., СинякинА. H., Андрианов В. Т. Влияние ионной силы раствора на тепловую денатурацию ДНК. // Весцг АН БССР. 1988, № 3, с. 70-74.

179. Record М. Т. Effects of NaT and Mgzions on the helix-coil transition of DNA. II Biopolymers 1975, Vol. 14, No. 9, p. 2137-2158.

180. Mingot F. Quantitative test of Record's theory for proton-induced lowering of DNA melting temperature. // Biopolymers 1981, Vol. 20, No. 10, p. 21212136.

181. Klump H., Ackermann T. Experimental thermodynamics of the helix-random coil transition. IV. Influence of the base composition of DNA on the transition enthalpy. //Biopolymers 1971, Vol. 10, No.3, p. 513-522.

182. Klump H., Burkart W. Calorimetric measurements of the transition enthalpy of DNA in aqueous urea solutions. // Biochim. Biophys. Acta. 1977, Vol. 475, No. 4, p. 601-604.

183. Nordmeier E. Effects of pressure on the helix-coil transition of calf thymus DNA. // J. Phys. Chem. 1992. Vol. 96, No. 3, p. 1494-1501.

184. AuerH. E., Alexandrowicz Z. Sedimentation, diffusion and osmotic pressure of sodium DNA in salt-free solution. // Biopolymers 1969, Vol. 8, No. 1, p. 1-20.

185. InmanR. В., Jordan D. O. Deoxypentose nucleic acids. XI. The denaturation of deoxyribonucleic acid in aqueous solution: conductivity and mobility measurements. // Biochim. Biophys. Acta 1960, Vol. 42, No. 4, p. 421-426.

186. Inman R. В., Jordan D. O. Deoxypentose nucleic acids. XII. The denaturation of deoxyribonucleic acid in aqueous solution: changes produced by environment. // Biochim. Biophys. Acta 1960, Vol. 42, No. 4, p. 427-434.

187. KassapidouK., Jesse W., Kuil M. E., Lapp A., EgelhaafS., van der Maarel J. R. C. Structure and charge distribution in DNA and poly(styrenesulfonate) aqueous solutions. // Macromolecules 1997, Vol. 30, No. 9, p. 2671-2684.

188. Leo A., Hansch C., Elkins D. Partition coefficients and their uses. // Chem. Rev. 1971, Vol. 71, No. 6, p. 525-616.

189. Odijk T. Polyelectrolytes near the rod limit. // J. Polym. Sci., Polym. Phys. Ed. 1977, Vol. 15, No. 3, p. 477-483.

190. Skolnick J., FixmanM. Electrostatic persistence length of a wormlike polyelectrolyte. II Macromolecules 1977, Vol. 10, No. 5, p. 944-948.

191. Everaers R., Milchev A., Yamakov V. The electrostatic persistence length of polymers beyond the OSF limit. // Eur. Phys. J. E 2002, Vol. 8, No. 1, p. 3-14.

192. Ariel G., Andelman D. Persistence length of a strongly charged rodlike polyelectrolyte in the presence of salt. // Phys. Rev. E 2003, Vol. 67, No. 1, p. 011805/1-011805/11.

193. Dobrynin A. V. Electrostatic persistence length of semiflexible and flexible polyelectrolytes. II Macromolecules 2005, Vol. 38, No. 22, p. 9304-9314.

194. Schiessel H., Pincus P. Counterion-condensation-induced collapse of highly charged polyelectrolytes. // Macromolecules 1998, Vol. 31, No. 22, p. 79537959.

195. Dobrynin A. V. Effect of counterion condensation on rigidity of semiflexible polyelectrolytes. // Macromolecules 2006, Vol. 39, No. 26, p. 9519-9527.

196. Zhuomei L., Xuexin Z., Yuanpei C., Yuanzhen Z. Hydrophobic interaction of ionenes in aqueous solution. // Macromolecules 1992, Vol. 25, No. 1, p. 450^153.

197. Nagaya J., Minakata A., Tanioka A. Conductance and counterion activity of ionene solutions. // Langmuir 1999, Vol. 15, No. 12, p. 4129-4134.

198. Yamazaki S., Muroga Y., Noda I. Persistence lengths of ionenes in methanol. II Langmuir 1999, Vol. 15, No. 12, p. 4147^1149.

199. Uliner M. Comments on the scaling behavior of flexible polyelectrolytes within the Debye-Hückel approximation. // J. Phys. Chem. В 2003, Vol. 107, No. 32, p. 8097-8110.

200. Кабанов В. А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов. // Высокомолек. соед. 1994, т. 36, № 2, с. 183-197.

201. Кабанов В. А. Полиэлектролитные комплексы в растворе и в конденсированной фазе. // Успехи химии 2005, т. 64, № 1, с. 5—23.

202. Thünemann А. F., Müller М., Dautzenberg Н., JoannyJ.-F., Löwen Н. Polyelectrolyte complexes. II Adv. Polym. Sei. 2004, Vol. 166, p. 113-171.

203. Kabanov V. A., ZezinA. В., Izumrudov V. A., BronichT. K., Balceev K. N. Cooperative interpolyelectrolyte reactions. // Macromol. Chem., Suppl. 1985, Vol. 13, p. 137-155.

204. Изумрудов В. А., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Равновесие интерполиэлектролитных реакций и явление молекулярного «узнавания» в растворах интерполиэлектролитных комплексов. // Успехи химии 1991, т. 60, №7, с. 1570-1595.

205. Friedmann Т., RoblinR. Gene therapy for human genetic disease? // Science 1972, Vol. 175, No. 25, p. 949-955.

206. Crystal R. G. The gene as drug. // Nature Med. 1995, Vol. 1, No. 1, p. 15-17.

207. Vermal. M., SomiaN. Gene therapy promises, problems and prospects. // Nature 1997, Vol. 389, No. 6648, p. 239-242.

208. Feigner P. L., BarenholzY., BehrJ. P., Cheng S. H., Cullis P., Huang L., JesseeJ. A., Seymour L., SzokaF., Thierry A. R., Wagner E., Wu G.

209. Nomenclature for synthetic gene delivery systems. // Hum. Gene Ther. 1997, Vol. 8, No. 5, p. 511-512.

210. Bishop J. M. The molecular genetics of cancer. // Science 1987, Vol. 235, No. 4786, p. 305-311.

211. Russell S. J., Brandenburger A., Flemming C. L., Collins M. K. L., Rommelaere J. Transformation-dependent expression of interleulcin genes delivered by a recombinant parvovirus. // J. Virol. 1992, Vol. 66, No. 5, p. 2821-2828.

212. Niidome T., Huang L. Gene therapy progress and prospects: Nonviral vectors. // Gene Ther. 2002, Vol. 9, No. 24, p. 1647-1652.

213. Lu Q. L., Bou-Gharios G., Partridge T. A. Non-viral gene delivery in skeletal muscle: A protein factory. // Gene Ther. 2003, Vol. 10, No. 2, p. 131-142.

214. Schmidt-Wolf G. D., Schmidt-Wolf I. G. H. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: An update. // Trends Mol. Med. 2003, Vol. 9, No. 2, p. 67-72.

215. DemeneixB., HassaniZ., BehrJ.-P. Towards multifunctional synthetic vectors. // Cur. Gene Ther. 2004, Vol. 4, No. 4, p. 445-455.

216. Duncan R. The dawning era of polymer therapeutics. // Nature Rev. Drug Disc. 2003, Vol. 2, No. 5, p. 347-360.

217. Kabanov А. V., Astafyeva I. V., Chikindas М. L., Rosenblat G. F., Kiselev V. I., Severin E. S., Kabanov V. A. DNA interpolyelectrolyte complexes as a tool for efficient cell transformation. // Biopolymers 1991, Vol. 31, No. 12, p. 1437-1443.

218. Oupicky D., KonakC., UlbrichK., WolfertM. A., Seymour L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. II J. Control Release 2000, Vol. 65, No. 1-2, p. 149-171.

219. De Smedt S. C., Demeester J., Hennink W. E. Cationic polymer based gene delivery systems. // Pharm. Res. 2000, Vol. 17, No. 2, p. 113-126.

220. Neu M., Fischer D., Kissel T. Recent advances in rational gene transfer vector design based on poly(ethylene imine) and its derivatives. // J. Gene Med. 2005, Vol. 7, No. 8, p. 992-1009.

221. Ramsay E., Gumbleton M. Polylysine and polyornithine gene transfer complexes: a study of complex stability and cellular uptake as a basis for theirdifferential in-vitro transfection efficiency. // J. Drug Target. 2002, Vol. 10, No. 1, p. 1-9.

222. Zhang S., Xu Y., Wang B., Qiao W., Liu D., Li Z. Cationic compounds used in lipoplexes and polyplexes for gene delivery. // J. Control. Release 2004, Vol. 100, No. 2, p. 165-180.

223. Elouahabi A., Ruysschaert J.-M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. // Mol. Ther. 2005, Vol. 11, No. 3, p. 336-347.

224. Tseng W.-C., Huang L. Liposome-based gene therapy. // Pharm. Sci. Technol. Today 1998, Vol. 1, No. 5, p. 206-213.

225. Pedroso de Lima M. C., Neves S., Filipe A., Duzgiine§ N., Simdes S. Cationic liposomes for gene delivery: From biophysics to biological applications. // Curr. Med. Chem. 2003, Vol. 10, No. 14, p. 1221-1231.

226. Xu Y., Szoka Jr. F. C. Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection. // Biochemistry 1996, Vol. 35, No. 18, p. 5616-5623.

227. Meyer O., Kirpotin D., Hong K., Sternberg B., Park J. W., Woodle M. C., Papahadjopoulos D. Cationic liposomes coated with polyethylene glycol as carriers for oligonucleotides. J. Biol. Chem. 1998, Vol. 273, No. 25, p. 15621-15627.

228. Florence A. T., Sakthivel T., Toth I. Oral uptake and translocation of a polylysine dendrimer with a lipid surface. // J. Control. Release 2000, Vol. 65, No. 1-2, p. 253-259.

229. Ramaswamy C., Sakthivel T., Wilderspin A. F., Florence A. T. Dendriplexes and their characterization. // Int. J. Pharm. 2003, Vol. 254, No. 1, p. 17—21.

230. Zuhorn I. S., Kalicharan R., HoelcstraD. Lipoplex-mediated transfection of mammalian cells occurs through the cholesterol-dependent clathrin-mediated pathway of endocytosis. II J. Biol. Chem. 2002, Vol. 277, No. 20, p. 1802118028.

231. Ahmed O. A. A., AdjimateraN., PourzandC., Blagbrough I. S. N4,N9-dioleoyl spermine is a novel nonviral lipopolyamine vector for plasmid DNA formulation. // Pharm. Res. 2005, Vol. 22, No. 6, p. 972-980.

232. Кабанов А. В., Кабанов В. А. Интерполиэлектролитные комплексы нуклеиновых кислот как средство доставки генетического материала в клетку. // Высокомолек. соед. 1994, т.36, № 2, с. 198-221.

233. Kabanov А. V., Kabanov V. A. DNA complexes with polycations for the delivery of genetic material into cells. // Bioconj. Chem. 1995, Vol. 6, No. 1, p. 7-20.

234. Wiethoff C. M., Middaugh C. R. Barriers to nonviral gene delivery. // J. Pharm. Sci. 2003, Vol. 92, No. 2, p. 203-217.

235. Read M. L., Logan A., Seymour L. W. Barriers to gene delivery using synthetic vectors. II Adv. Gen. 2005, Vol. 53, p. 19-46.

236. Schaffer D. V., Fidelman N. A., DanN., Lauffenburger D. A. Vector unpacking as a potential barrier for receptor-mediated polyplex gene delivery. // Biotechnol. Bioeng. 2000, Vol. 67, No. 5, p. 598-606.

237. Chollet P., Favrot M. C., Hurbin A., Coll J.-L. Side-effects of a systemic injection of linear polyethylenimine-DNA complexes. // J. Gene Med. 2002, Vol. 4, No. l,p. 84-91.

238. Dash P. R., Read M. L., Barrett L. В., Wolfert M. A., Seymour L. W. Factors affecting blood clearance and in vivo distribution of polyelectrolyte complexes for gene delivery. // Gene Ther. 1999, Vol. 6, No. 4, p. 643-650.

239. Tranchant I., Thompson В., Nicolazzi С., MignetN., SchermanD. Physico-chemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids. // J. Gene Med. 2004, Vol. 6, Suppl. 1, p. S24-S35.

240. Pannier A. K., SheaL. D. Controlled release systems for DNA delivery. // Mol. Ther. 2004, Vol. 10, No. l,p. 19-26.

241. Wagner E. Strategies to improve DNA polyplexes for in vivo gene transfer: will "artificial viruses" be the answer? // Pharm. Res. 2004, Vol. 21, No. 1, p. 8-14.

242. Bach D., Miller I. R. Interaction of deoxyribonucleic acid with poly-4-vinyl-pyridine. //Biochim. Biophys. Acta 1966, Vol. 114, No. 2, p. 311-325.

243. Miller I. R., BachD. Interaction of DNA with heavy metal ions and polybases: cooperative phenomena. // Biopolymers 1968, Vol. 6, No. 2, p. 169-179.

244. Изумрудов В. А., Бронич Т. К., ЗезинА. Б., Кабанов В. А. Кинетика и механизм реакции макромолекулярного замещения в растворах полиэлектролитов. И ДАН СССР 1984, т. 278, № 2, с. 404-408.

245. Пергушов Д. В., Изумрудов В. А., ЗезинА. Б., Кабанов В. А. Влияние низкомолекулярных солей на поведение водорастворимых нестехиометричных комплексов. // Высокомолек. соед. 1993, т. A3 5, № 7, с. 844-849.

246. Bakeev К. N., Izumrudov V. A., Kuchanov S. I., Zezin А. В., Kabanov V. А. Kinetics and mechanism of interpolyelectrolyte exchange and addition reactions. // Macromolecules 1992, Vol. 25, No. 17, p. 4249-4254.

247. Изумрудов В. А., Ныркова Т. Ю., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Влияние длины цепи лиофилизирующего полииона на направление и кинетику интерполиэлектролитной реакции обмена. // Высокомолек. соед. 1987, т. Б 29, № 6, с. 474-478.

248. Strauss U. P., Leung Y. P. Volume changes as a criterion for site binding of counterions by polyelectrolytes. // J. Am. Chem. Soc. 1965, Vol. 87, No. 7, p. 1476-1480.

249. Щелкина А. К., Минченкова JI. E., Иванов В. И. Влияние температуры на параметры двойной спирали ДНК в растворе. // Мол. биол. 1977, т. 11, № 2, с. 466-472.

250. Благой Ю. П., Галкин В. Д., Гладченко Г. О., Корнилова С. В., Сорокин В. А., Шкорбатов А. Г. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. Киев: Наукова думка, 1991, 272 с.

251. Korolev N., Nordenskiold L. Influence of alkali cation nature on structural transitions and reactions of biopolyelectrolytes. // Biomacromolecules 2000, Vol. 1, No. 4, p. 648-655.

252. Гордон Дж. Органическая химия растворов электролитов. М.: Мир, 1979, 712 с.

253. Зезин А. Б., Касаикин В. А., Кабанов Н. М., Харенко О. А., Кабанов В. А. Влияние соотношения степеней полимеризации компонентов на образование нестехиометричных комплексов. // Высокомолек. соед. 1984, т. А26, № 7, с. 1519-1523.

254. Краковяк М. Г., Ануфриева Е. В., Скороходов С. С. Получение полимеров с люминесцентными метками. // Высокомолек. соед. 1969, т. All, № 11, с. 2499-2504.

255. Сухишвили С. А., Обольский О. Л., Астафьева И. В., Кабанов А. В., Ярославов А. А. Интерполиэлектролитные комплексы, содержащие ДНК: взаимодействие с липосомами. // Высокомолек. соед. 1993, т. 35, № И, с. 1895-1899.

256. SambrookJ., FritschE. F., ManiatisT. In: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989.

257. Waring M. J. Complex formation between ethidium bromide and nucleic acids. // J. Mol. Biol. 1965, Vol. 13, No. 1, p. 269-282.

258. Кантор Ч., Шиммелл П. Биофизическая химия, М.: Мир, 1984, т. 2, гл. 8.

259. Nathans D., Smith Н. О. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. // Annu. Rev. Biochem. 1975, Vol. 44, p. 273-293.

260. RengarajanK., Cristol S. M., MehtaM., Nickerson J. M. Quantifying DNA concentrations using fluorometry: A comparison of fluorophores. // Molecular Vision 2002, Vol. 8, p. 416-421.

261. Baguley В. C., Le Bret M. Quenching of DNA ethidium fluorescence by amsacrine and other antitumor agents: a possible electron-transfer effect. // Biochemistry 1984, Vol. 23, No. 3, p. 937-943.

262. Сибирцев В. С. Изучение возможностей применения к анализу ДНК бифункциональной системы: бромид этидия + Хехст-33258. // Биохимия 2005, т. 70, № 4, с. 545-555.

263. Angerer М., Moudrianakis Е. N. Interaction of ethidium bromide with whole and selectively deproteinized deoxynucleoproteins from calf thymus. // J. Mol. Biol. 1972, Vol. 63, No. 3, p. 505-521.

264. Stratling W. H., Seidel I. Relaxation of chromatin structure by ethidium bromide binding: determined by viscometry and histone dissociation studies. II Biochemistry 1976, Vol. 15, No. 22, p. 4803^1809.

265. Sugimoto N., Sasaki M. Pressure effect on ethidium binding to DNA. // Chem. Express 1988, Vol. 3, No. 8, p. 487-490.

266. Lerman L. S. Structural considerations in the interaction of DNA and acridines. II J. Mol. Biol. 1961, Vol. 3, No. 1, p. 18-30.

267. Lippard S. J., Bond P. J., Wu К. C., Bauer W. R. Stereochemical requirements for intercalation of platinum complexes into double-stranded DNAs. // Science 1976, Vol. 194, No. 4266, p. 726-728.

268. Jain S. C., Tsai C., Sobell H. M. Structure of an ethidium / dinucleoside monophosphate crystalline complex, ethidium: 5-iodocytidylyl (3-5') guanosine. II J. Mol. Biol. 1977, Vol. 114, No. 3, p. 317-331.

269. Chandrasekaran S., Jones R. L., Wilson W. D. Imino 'H- and 31P-NMR analysis of the interaction of propidium and ethidium with DNA. // Biopolymers 1985, Vol. 24, No. 10, p. 1963-1979.

270. Begusova M., Spotheim-Maurizot M., Michalik V., Charlier M. Effect of ethidium bromide intercalation on DNA radiosensitivity. // Int. J. Radiat. Biol. 2000, Vol. 76, No. 1, p. 1-9.

271. Tsuboi M., Benevides J. M., Thomas G. J., Jr. The complex of ethidium bromide with genomic DNA: Structure analysis by polarized Raman spectroscopy II Biophys. J. 2007, Vol. 92, No. 3, p. 928-934.

272. Fuller W., Waring M. J. A molecular model for the interaction of ethidium bromide with deoxyribonucleic acid. // Ber. Bunsenges. Physic. Chem. 1964, Vol. 68, No. 8/9, p. 805-809.

273. Chou W. Y., Marky L. A., Zaunczkowski D., Breslauer K. J. The thermodynamics of drug DNA interactions: ethidium bromide and propidium iodide. // J. Biomol. Struct. Dyn. 1987, Vol. 5, No. 2, p. 345-359.

274. Nelson J. W., Tinoco I., Jr. Intercalation of ethidium ion into DNA and RNA oligonucleotides. II Biopolymers 1984, Vol. 23, No. 2, p. 213-233.

275. Bresloff J. L., Crothers D. M. Equilibrium studies of ethidium — polynucleotide interactions. II Biochemistry 1981, Vol. 20, No. 12, p. 3547-3553.

276. Bauer W., Vinograd J. Interaction of closed circular DNA with intercalative dyes. II. The free energy of superhelix formation in SV40 DNA. // J. Mol. Biol. 1970, Vol. 47, No. 3, p. 419-435.

277. FromherzP., RiegerB. Photoinduced electron transfer in DNA matrix from intercalated ethidium to condensed methylviologen. // J. Am. Chem. Soc. 1986, Vol. 108, No. 17, p. 5361-5362.

278. Бабаян Ю. С., Манзини Дж., Квадрифолио Ф. Взаимодействие бромистого этидия с синтетическими двуспиральными полирибонуклеотидами. И Мол. биол. 1988, т. 22, № 4, с.898-910.

279. Krugh T. R., Reinhardt С. G. Evidence for sequence preferences in the intercalative binding of ethidium bromide to dinucleoside monophosphates. // J. Mol. Biol. 1975, Vol. 97, No. 2, p. 133-162.

280. Becker M. M., DervanP. B. Molecular recognition of nucleic acid by small molecules. Binding affinity and structural specificity of bis(methidium)-spermine. II J. Am. Chem. Soc. 1979, Vol. 101, No. 13, p. 3664-3666.

281. BaguleyB. C., Falkenhaug E.-M. The interaction of ethidium with synthetic double-stranded polynucleotides at low ionic strength. // Nucleic Acids Res. 1978, Vol. 5, No. l,p. 161-171.

282. FoxK. R., Waring M.J. Footprinting at low temperatures: evidence that ethidium and other simple intercalators can discriminate between different nucleotide sequences. II Nucleic Acids Res. 1987, Vol. 15, No. 2, p. 491-507.

283. Shi X., Chaires J. B. Sequence- and structural-selective nucleic acid binding revealed by the melting of mixtures. // Nucleic Acids Res. 2006, Vol. 34, No. 2, p. 1-7.

284. Nordmeier E. Absorption spectroscopy and dynamic and static light-scattering studies of ethidium bromide binding to calf thymus DNA: implications for outside-binding and intercalation. // J. Phys. Chem. 1992, Vol. 96, No. 14, p. 6045-6055.

285. Waring M. J. Structural requirements for the binding of ethidium to nucleic acids. // Biochim. Biophys. Acta 1966, Vol. 114, No. 2, p. 234-244.

286. Wakelin L. P. G., Waring M.J. Kinetic of drug DNA interaction. Dependence of the binding mechanism on structure of the ligand. // J. Mol. Biol. 1980, Vol. 144, No. 2, p. 183-214.

287. PorumbH. The solution spectroscopy of drugs and drug nucleic acid interactions. II Prog. Biophys. Mol. Biol. 1978, Vol. 34, No. 3, p. 175-195.

288. BasuH. S., Schwietert H. C. A., Feuerstein B. G., MartonL. J. Effects of variation in the structure of spermine on the association with DNA and the induction of DNA conformational changes // Biochem. J. 1990, Vol. 269, No. 2, p. 329-334.

289. Parodi S., Kendall F., Nicolini C. A clarification of the complex spectrum observed with the ultraviolet circular dichroism of ethidium bromide bound to DNA. I I Nucleic Acids Res. 1915, Vol. 2, No. 4, p. 477-486.

290. Luedtke N. W., Liu Q., TorY. On the electronic structure of ethidium. // Chem. Eur. J. 2005, Vol. 11, p. 495-508.

291. Vardevanyan P. O., Antonyan A. P., Parsadanyan M. A., Davtyan H. G., Karapetyan A. T. The binding of ethidium bromide with DNA: interactionwith single- and double-stranded structures. // Exp. Mol. Med. 2003, Vol. 35, No. 6, p. 527-533.

292. Vardevanyan P.O., Antonyan A. P., Parsadanyan M. A., Davtyan H. G., Boyajyan Z. R., Karapetian A. T. Complex formation of ethidium bromide with Polyd(A-T).- Poly[d(A-T)]. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2005, Vol. 22, No. 4, p. 465-470.

293. Шабарова 3. А., Богданов А. А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М.: Химия, 1978, 583 с.

294. Cosa G., Focsaneanu K.-S., McLean J. R. N., McNamee J. P., Scaiano J. C. Photophysical properties of fluorescent DNA-dyes bound to single- and double-stranded DNA in aqueous buffered solution. // Photochem. Photobiol. 2001, Vol. 73, No. 6, p. 585-599.

295. Beach L., Schweitzer C., Scaiano J. C. Direct determination of single-to-double stranded DNA ratio in solution using steady-state fluorescence measurements. // Org. Biomol. Chem. 2003, Vol. 1, No. 3, p. 450-451.

296. Waring M. J. Variation of the supercoils in closed circular DNA by binding of antibiotics and drugs: evidence of molecular model involving intercalation. // J. Mol. Biol. 1970, Vol. 54, No. 2, p. 247-279.

297. Paoletti C., LePecqJ.-B. Resonance energy transfer between ethidium bromide molecules bound to nucleic acids. Does intercalation wind or unwind the DNA helix? // J. Mol. Biol. 1971, Vol. 59, No. 1, p. 43-62.

298. Wang J. C. Degree of unwinding of the DNA helix by ethidium. I. Titration of twisted PM2 DNA molecules in alkaline cesium chloride density gradients. II J. Mol. Biol. 1974, Vol. 89, No. 4, p. 783-801.

299. Waring M. J. Complex formation with DNA and inhibition of Escherichia-Coli RNA polymerase by ethidium bromide. // Biochem. Biophys. Acta 1964, Vol. 87, No. 2, p. 358-361.

300. Luedtke N. W., Hwang J. S., Nava E., Gul D., Kol M., Tor Y. The DNA and RNA specificity of eilatin Ru(II) complexes as compared to eilatin and ethidium bromide. Nucleic Acids Res. 2003, Vol. 31, No. 19, p. 5732-5740.

301. Sigmon J., Larcom L. L. The effect of ethidium bromide on mobility of DNA fragments in agarose gel electrophoresis. // Electrophoresis 1996, Vol. 17, No. 10, p. 1524-1527.

302. Vardevanyan P. O., Antonyan A. P., Manulcyan G. A., Karapetyan A. T. Study of ethidium bromide interaction peculiarities with DNA. // Exp. Mol. Med. 2001, Vol. 33, No. 4, p. 205-208.

303. Elliott W. H. Effects of antimicrobial agents on deoxyribonucleic acid polymerase. // Biochem. J. 1963, Vol. 86, p. 562-567.

304. Berman H. M., Young P. R. The interaction of intercalating drugs with nucleic acids. // Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1981, Vol. 10, p. 87—114.

305. Waring M. J. Effects of antimicrobial agents on ribonucleic acid polymerase. // Mol. Pharmacol. 1965, Vol. 1, No. 1, p. 1-13.

306. McCann J., SpingarnN. E., Kobori J., Ames B. N. Detection of carcinogens as mutagens: bacterial tester strains with R factor plasmids. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975, Vol. 72, No. 3, p. 979-983.

307. Waring M. J. DNA modification and cancer. // Annu. Rev. Biochem. 1981, Vol. 50, p. 159-192.

308. Nishiwaki H., MiuraM., Imai K. Experimental studies on the antitumor effect of ethidium bromide and related substances. // Cancer Res. 1974, Vol. 34, No. 10, p. 2699-2703.

309. MacGregor J. R., Johnson I. J. In vitro metabolic activation of ethidium bromide and other phenanthridinium compounds: mutagenic activity in Salmonella typhimurium. II Mutat. Res. 1977, Vol. 48, No. 1, p. 103-107.

310. McCann J., ChoiE., YamasakiE., Ames B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella microsome test: assay of 300 chemicals. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, Vol. 72, No. 12, p. 5135-5139.339. http://www.laprovet.fr/Trypanosomoses.html

311. JostE., Clark S. Binding and arrangement of non-histone proteins in chromatin-like structures from mammalian cells. // FEBS Lett. 1975, Vol. 60, No. l,p. 197-201.

312. Benyajati C., Worcel A. Isolation, characterization, and structure of the folded interphase genome of drosophila melanogaster. // Cell 1976, Vol. 9, No. 3, p. 393-407.

313. Ленинджер А. Основы биохимии, т. 3, гл. 27. М.: Мир, 1985.

314. Burns V. W. F. Fluorescence Decay Time Characteristics of the complex between ethidium bromide and nucleic acids. // Arch. Biochem. Biophys. 1969, Vol. 133, No. 2, p. 420-424.

315. Wahl P., Paoletti J., Le Pecq J.-B. Decay of fluorescence emission anisotropy of the ethidium bromide DNA complex. Evidence for an internal motion in DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1970, Vol. 65, No. 2, p. 417-421.

316. Olmsted III J., Kearns D. R. Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids. // Biochemistry 1977, Vol. 16, No. 16, p. 3647-3654.

317. Heller D. P., Greenstock C. L. Fluorescence lifetime analysis of DNA intercalated ethidium bromide and quenching by free dye. // Biophys. Chem. 1994, Vol. 50, No. 3, p. 305-312.

318. Bugs M. R., Cornelio M. L. Analysis of the ethidium bromide bound to DNA by photoacoustic and FTIR spectroscopy. // Photochem. Photobiol. 2001, Vol. 74, No. 4, p. 512-520.

319. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986, 496 с.

320. Avitabile М., Sciacca G., Raciti G. Influence of different counterions on the fluorescent probe DNA complex. // Ital. J. Biochem. 1992, Vol. 47, No. 1, p. 1-8.

321. Atherton S. J., Beaumont P. C. Ethidium bromide as a fluorescent probe of the accessibility of water to the interior of DNA.// Photobiochem. Photobiophys. 1984, Vol. 8, No. 2, p. 103-113.

322. Atherton S. J., Beaumont P. C. Quenching of the fluorescence of DNA1intercalated ethidium bromide by some transition-metal ions. // J. Phys. Chem. 1986, Vol. 90, No. 10, p. 2252-2259.

323. Atherton S. J., Beaumont P. C. The effect of mercuric ions on the excited states of DNA — intercalated ethidium bromide. // Photochem. Photobiol. 1993, Vol. 57, No. 3, p. 460-464.

324. Atherton S. J., Beaumont P. C. Laser flash photolysis of DNA-intercalated ethidium bromide in the presence of methylviologen. // J. Phys. Chem. 1987, Vol. 19, No. 15, p. 3993-3997.

325. Brun A. M., Harriman A. Dynamics of electron transfer between intercalated polycyclic molecules: effect of interspersed bases. // J. Am. Chem. Soc. 1992, Vol. 114, No. 10, p. 3656-3660.

326. Кабанов В. А., Зезин А. Б., Рогачева В. Б., Рыжиков С. В. Диспропорцио-нирование нестехиометричных полиэлектролитных комплексов в водно-солевых растворах. // ДАН СССР 1982, т. 267, № 4, с. 862-865.

327. Morgan A. R., Lee J. S., Pulleyblank D. E., Murray N. L., Evans D. H. Ethidium fluorescence assays. Part. I. Physicochemical studies. // Nucleic Acids Res. 1979, Vol. 7, No. 3, p. 547-569.

328. Евдокимов Ю. M., Салянов В. И., Варшавский Я. М. Компактная форма ДНК в растворе. III. Влияние ионного состава раствора на компактизацию двухспиральной ДНК в присутствии полиэтилен-гликоля. И Мол. биол. 1975, т. 9, № 4, с. 563-573.

329. Shapiro J. Т., LengM., FelsenfeldG. Deoxyribonucleic acid polylysine complexes. Structure and nucleotide specificity. // Biochemisrty 1969, Vol. 8, No. 8, p. 3219-3232.

330. Olins D. E., Olins A. L. Model nucleohistones: the interaction of F1 and F2al histones with native T7 DNA. // J. Mol. Biol. 1971, Vol. 57, No. 3, p. 437455.

331. Girardet J.-L., CasasM.-T., Cornudella L., GorlcaC., Lawrence J.-J., Mura С. V. // Conformational effects of histones HI on DNA structure. Comparative study between Hl-1, HI0, H5 and sperm holothuria f0. // Biophys. Chem. 1988, Vol. 31, p. 275-286.

332. Евдокимов Ю. M., Акименко H. M., Глухова H. E., Тихоненко A. C., Варшавский Я. M. Образование компактной формы двухспиральной ДНК в растворе в присутствии полиэтиленгликоля. // Мол. биол. 1973, т. 7,№ 1, с. 151-159.

333. Изумрудов В. А., Харенко О. А., Харенко А. В., Гуляева Ж. Г., Касаикин В. А., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Поведение нестехиометричных полиэлектролитных комплексов в водных растворах солей. // Высокомолек. соед. 1980, т. А22, № 3, с. 692-699.

334. Бакеев К. Н., Изумрудов В. А., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Эффект молекулярной избирательности в интерполиэлектролитных реакциях. // Высокомолек. соед. 1987, т. Б29, № 7, с. 483-484.

335. Изумрудов В. А., Бронич Т. К., Новикова М. Б., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Реакции замещения в трехкомпонентных макромолекулярных системах. // Высокомолек. соед. 1982, т. А24, № 2, с. 339-348.