Конструирование и синтез искусственных рибонуклеаз на основе коротких пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

□0305505Т

На правах рукописи

КОРОЛЕВА ЛЮДМИЛА СЕРГЕЕВНА

КОНСТРУИРОВАНИЕ И СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ НА ОСНОВЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ

02.00.! О - биооргаиическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2007 г.

003055057

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.х.н. Сильников Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Новосибирский институт органической химии СО РАН

Защита состоится « » СТЭбИ'^Ь&МЦ 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « » Лл<Л2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

д.х.н. Фёдорова О.С.

д.х.н., профессор Куликова Валентина Филипповна к.х.н. Козлов Максим Викторович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулы РНК обеспечивают функционирование любого живого организма, выполняя множество разнообразных функций от переноса генетической информации до катализа биохимических реакций. Реагенты, избирательно взаимодействующие с определенными видами РНК, могут служить в качестве регуляторов экспрессии генов, а также противовирусными агентами, инактивирующими РНК-содержащие вирусы.

Известен широкий спектр реакционноспособных соединений, вызывающих расщепление РНК в физиологических условиях. Для этой цели используются ионы металлов и металлокомплексы, аминосоединения и органические соединения, содержащие остатки имидазола, а также пептиды и пептидоподобные молекулы. Несмотря на обилие сообщений о синтезе химических рибонуклеаз до настоящего времени не удалось получить конструкций, обладающих активностью близкой к активности природных ферментов. Зачастую эффективными оказались реагенты, обладающие высокой токсичностью, что делает применение таких соединений в биологических системах малоперспективным.

Одной из наиболее перспективных стратегий создания искусственных рибонуклеаз является конструирование низкомолекулярных синтетических катализаторов, функционально моделирующих каталитические центры или имитирующих процессы, протекающие в активных центрах природных ферментов, которые расщепляют фосфодиэфирные связи в РНК.

Целью настоящей работы являлось создание низкомолекулярных искусственных рибонуклеаз на основе коротких пептидов, функционально имитирующих каталитический центр рибонуклеазы Т1. В ходе исследования решались следующие задачи: 1) конструирование и синтез органических соединений, содержащих аминокислоты, функциональные группы боковых радикалов которых входят в состав каталитического центра рибонуклеазы Т1; 2) конструирование и синтез соединений, объединяющих в своей структуре каталитический и РНК-связывающий фрагменты; 3) установление взаимосвязи "структура — рибонуклеазная активность" в ряду различных искусственных рибонуклеаз.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые сконструированы и синтезированы структурные аналоги каталитического центра рибонуклеазы Т1. Получены и охарактеризованы 42 новые искусственные рибонуклеазы, содержащие каталитический домен на основе коротких пептидов, субстрат-связывающий (катионный или интеркалирующий) домен и липофильный домен.

Впервые было показано, что искусственные рибонуклеазы, не содержащие остатков имидазола, способны эффективно расщеплять РНК. Введение в структуру искусственной рибонуклеазы на основе коротких пептидов катионного фрагмента приводит к увеличению эффективности расщепления РНК.

Все искусственные рибонуклеазы, связывающиеся с РНК статистически, на испытанных субстратах проявили схожую специфичность. Расщеплению преимущественно подвергаются фосфодиэфирные связи в СА и иА

последовательностях, локализованных в одноцепочечных участках РНК. Показано, что специфичность расщепления РНК в присутствии низкомолекулярных химических рибонуклеаз определяется прежде всего геометрическими параметрами фосфодиэфирных связей и третичной структурой РНК, а не структурой искусственных рибонуклеаз.

Впервые проведено исследование связи структура - рибонуклеазная активность в ряду различных искусственных рибонуклеаз. Показано, что основной вклад в эффективность расщепления РНК искусственными рибонуклеазами вносят электростатические и гидрофобные взаимодействия

Результаты работы могут быть использованы при создании зондов для изучения пространственной структуры РНК и белково-нуклеиновых комплексов, высокоэффективных противовирусных и противоопухолевых препаратов, а также высоко эффективных каталитически активных групп антисмысловых олигонуклеотидов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты были представлены на международных конференциях "Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference", Новосибирск, 2003г.; XX Украинская конференция по органической химии, Одесса, 2004г.; International workshop "Biosphere origin and evolution", Новосибирск, 2005r; International Conference on Chemical Biology, Новосибирск, 2005r; 18th Polish Peptide Symposium, Польша, 2005; Международный симпозиум «Advanced Science in Organic Chemistry», Судак, 2006.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка литературы. Работа изложена на 148 страницах, содержит 93 рисунка и 17 таблиц. Библиография включает 206 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Конструирование искусственных рибонуклеаз на основе коротких пептидов

Основой нашей стратегии конструирования искусственных рибонуклеаз является создание структурных аналогов каталитических центров природных рибонуклеаз на основе коротких пептидов.

Из литературных данных известно, что имидазольные остатки гистидина/гистамина играют ключевую роль в кислотно-основном механизме расщепления РНК, постулируемого для подавляющего большинства природных ферментов, способных расщеплять Р-0 связи. Положительно заряженные группы боковых радикалов других аминокислот, взаимодействуя с атомами кислорода фосфатной группы, повышают электрофильность атома фосфора и стабилизируют пентакоординированный отрицательно заряженный интермедиат. В таблице 1 представлены статистические данные о роли некоторых аминокислот в функционировании каталитических центров различных ферментов. На основе этих данных можно предположить, что

каталитический центр искусственных РНКаз, функционирующих по кислотно-основному механизму, может быть построен без участия гистидина.

Таблица 1. Участие аминокислотных остатков в проявлении каталитической активности различных ферментов.

Функция аминокислотного остатка Аминокислота*

His Glu Arg Lys Туг Ser Thr

Кислота/основание .72 84 21 38 62 62 39

Стабилизация интермедиата/ активация субстрата 24 16 73 53 35 20 55

Другие функции 4 - - 9 3 28 6

* Доля (в %) всех аминокислот данного типа, встречающихся в каталитических центрах ферментов.

В качестве природного прототипа был выбран каталитический центр хорошо изученной G-специфичной РНКазы Т1. В каталитическом центре этого фермента, в отличие от рибонукпеазы А, роль основания выполняет карбоксилат-анион глутаминовой кислоты. Помимо остатка Glu 58 в катализе принимают участие остатки Туг 38, Arg 77, His 92, Phe 100, при этом остаток гистидина не играет ключевой роли в катализе.

1. Конструирование и синтез тетрапептидов, на основе аминокислот, формирующих каталитический центр РНКазы Т1

В данной работе синтезирована серия коротких пептидов, содержащих следующие аминокислоты в различных комбинациях: Arg, Glu, Ser, Thr, Lys и Phe (серия F*). Аминокислотный состав каталитических центров РНКазомиметиков был выбран таким образом, чтобы при нейтральных значениях рН каждая из аминокислот могла с высокой долей вероятности выполнять одну определенную функцию. Поскольку гидроксильная группа тирозина может играть роль кислотно-основного катализатора, тирозин был заменен серином и схожим с ним по строению, но существенно отличающийся по функциям в каталитических центрах, треонином (табл. 1). В качестве С-концевой аминокислоты синтезируемых тетрапептидов был выбран фенилаланин, входящий в состав каталитического центра РНКазы Т1.

Серия F Arg-Thr-Glu-Phe-OCgHn, RTEF, 1 Lys-Ser-Glu-Phe-OCgHn, KSEF, 3 Lys-Thr-Glu-Phe-OC8H|7, KTEF, 5

Thr-Lys-Glu-Phe-OC8H17, TKEF, 2 Glu-Thr-Lys-Phe-OQHn, ETKF, 4 Glu-Ser-Lys-Phe-OQHp, ESKF, 6

Для выявления роли отдельных аминокислотных остатков были синтезированы две серии РНКазомиметиков, содержащих в структуре два

Серии синтезированных соединений названы по аминокислоте, присутствующей в структуре всех пептидов данной серии: И - фенилаланин, К- лизин, Я-аргинин.

5

аминокислотных остатка, несущих разнозаряженные каталитически активные группы (карбоксильная, амино- или гуанидиниевая), расстояние между которыми изменяли путем введения в качестве линкера каталитически инертных аминокислот (X). Каждая серия содержала по 5 пептидоподобных соединений:

Серия R Glu-X-Arg-Gly-OCI0H2i (соединения 7-11)

Сепия К Glu - X - Lys - Gly - OCi0H2i (соединения 12-16)

где X - Gly (7, 12), p-Ala (8, 13), 4-аминобутановая кислота (GABA, 9, 14), 6-аминогексановая кислота (AHA, 10, 15), я-аминобензойная кислота (ABA, 11,16).

Синтез тетрапептидов проводили в растворе с использованием Вос-стратегии. С-концевую аминокислоту (Phe или Gly) алкилировали 1-бромоктаном или 1-бромдеканом. Введение такой гидрофобной защиты значительно облегчает процедуру выделения и очистки продукта реакции на каждой стадии. Общая схема синтеза представлена на рис. 1.

Вое— Вос-Вос-

Н-

Вос-

--ОН Вое-

■onhs

NO2 «f'y —он --ОН

Вое— -ОН Вос-—ОН вое—

i—ОН вос-:-ONHS Н-

.no2

-ONHS Н-

.n02

ОСюН?, -ОС,оНг, -ОС.оНг.

-ОС,„нг, -ОС,0Н2,

-ос,„нг,

-ОСюНг,

-ОС10нг1 -ос10н„

Вос-Вос-

-ОН Вос-

-ОН Вое--ONHS Н-

<;|у

,Z{2CI)

ОН вос-,Z(2C1|

—ONHS Н-

,Z(2CI)

—ОН —OC10H2t —ОС,0Нг, -ОС10Нг1

-ос,0нг, -ос,0нг, -осшн„ -ос,0нг1

-ОС10Нг1 -ос10нг,

Рис. 1. Схема синтеза тетрапептидов на примере серий R и К. A: Glu-X-Arg-GIy-OCioH2i; В: Glu-X-Lys-Gly-ОС10Н21, где X - Gly, p-Ala, 4-аминобутановая кислота (GABA), 6-аминогексановая кислота (AHA), п-аминобензойная к/слота (ABA).

Защитные группы для боковых радикалов аминокислот выбирали таким образом, чтобы деблокирование конечного продукта можно было осуществить в одну стадию. Удаление Л-нитро- и О-бензильной защитных групп с функциональных групп боковых цепей аминокислот в тетрапептидах проводили путем каталитического гидрогенолиза. Чистоту промежуточных продуктов и полноту протекания реакций контролировали с помощью ТСХ. Строение целевых соединений было подтверждено методами спектроскопии ЯМР 'Н и МАЫ31-ТОР масс-спектрометрии.

Гидролитическая активность РНКазомиметиков серий F, К, R

Гидролитическая активность синтезированных искусственных рибонуклеаз была исследовала в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН. [3 качестве субстрата был использован [5'-12Р]-меченый 96-звенный фрагмент РНК ВИЧ-I, полученный реакцией транскрипции in vitro,

В настоящей работе представлены данные по суммарной деполимеризации РНК, определенной по формуле: (l-PHKHlrT/PHKcyM,J)xlOO%, где PHKHrtT - количество интактной РНК после инкубации, РНК:умм - исходное количество РНК. Погрешность экспериментов по расщеплению РНК-субстратов составила ие более 10 %,

Количественные данные по эффективности расщепления РНК пептидами свидетельствуют, что все синтезированные молекулы способны расщеплять РНК. На рис. 2 приведены данные но расщеплению РНК к присутствии соединений 1-6. Степень деполимеризации колеблется от 35% для пептида 5 до 64% для пептида 1 (при времени инкубации 18 ч).

i

Рис. 2. Эффективность расщепления (5'-:згР)-меченого 96-звенного фрагмента РНК ВИЧ I. Условия реакции: 50 мМ ТП8-НС! (рН 7.0), 0.2 М КО, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1 ж-мл"' суммарной тРНК из дрожжей в качестве носителя, Т=37 °С, концентрация тетра пептидов 103 м.

Пептиды 7-16 расщепляют РНК-субстрат с большей эффективностью, чем РНКазомиметики 1-6 (рис. 3). Вследствие этого можно предположить, что эффективность расщепления РНК в присутствии данных соединений определяется оптимальным расположением ключевых аминокислот {Glu и Arg/Lys), в то время как гидроксил содержащие аминокислоты, вероятно, не играют заметной роли в реакции гидролиза, а служат лишь связующими звеньями между каталитически активными группами. Кроме того, как видно из приведенных данных, замена остатка Plie на Gly не сказывается на эффективности расщепления.

Природа положительно заряженной аминокислоты оказывает заметное влияние на эффективность расщепления. Соединения 12-16 (К-серия) (эффективность деполимеризации 60-98%) гораздо активнее соответствующих аналогов К-серим (степень деполимеризации 24-62%). При этом влияние длины линкера между каталитически активными аминокислотами на эффективность расщепления наиболее ярко проявляется в случае соединений R-еерии. С увеличением расстояния (числа метиленовых звеньев) между Glu и положительно заряженной аминокислотой суммарный процент расщепления РНК увеличивается. В К-серии отчетливо прослеживается аналогичная зависимость при времени инкубации 6 ч. За время инкубации 18 ч процент деполимеризации РНК практически одинаков для всех соединений серии, что, по-видимому, связано с выходом реакции на плато вблизи 100% (рис, 3).

Рис. 3. Эффективность расщепления [З'-^Р]-мечен ого Эбтзвенкого фрагмента РНК ВИЧ I гетра пептида ми Я-серии (7-11), К-серии (12-16). Условия реакции: 50 мМ Тга-НС! (рН 7.0). 0.2 М КС1, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1 мпмл-1 суммарной тРНК из дрожжей в качестве носителя. Т=37°С, концентрация тетралептидов Ю-4 М.

2. Синтез симметричных пептидов, содержащих внутри структуры протяженный линкер

С целью установления влияния гидрофобного фрагмента в структуре РНКазомиметиков на их эффективность нами были синтезированы две серии симметричных конструкций, содержащих различные функционально значимые аминокислоты, соединенные гидрофильным линкером Ц и гидрофобным линкером одинаковой длины. Структуры синтезированных соединений представлены на рис. 4.

Li

, МП;

h2N — о

L.ys-L,-Lys 17 Lys-Ц-Lys 18

G¡u-L,-Glu 19 Glu-Lî-Gtu 21) Arg-L^Arg 21

Scr-Li-Ser 22 Ser-Li-Ser 23

Uro-Lys{Cbz,CI)-L,-Lys(Cbz.C])-Uro 24 Uro-Lys(Cbz.CI)-L:- Lys(Cbz,CI)-Uno 25 Hisr-Lys-Li-Lyí-Hisl 26

Glu-AIIA-L>s-L,-Ly5-AHA-Glu 27 Glu-AHA-Lys-Lj-Lys-AHA-Glu 28 Glu-AHA-Ser-L,-Ser-AHA-Glu 29 Lys-AHA-Ser-L,-Ser-AHA-Lys JO

Gill"--Lj-G luí** 31

Рис. 4. Симметричные пептиды серий Lt ( А-на основе 4,9-диокса-1,12-диашндодекэна) и L; ( В - на основе 1,12-диаминдодекана).

Линкеры L, и L? соединяли каталитически активные группы некоторых синтезированных ранее пептидов серий F, К, R (Lys, Arg, Ser, Glu).

Синтез соединений серий L¡ и L2 проводили в растворе методом активированных эфиров (N-птдро к с ис у к цн н и м и д н ы е эфиры) с использованием Вос-стратегии. Реакция конденсации проводилась одновременно по обеим аминогруппам. В случае линкера L] синтез

симметричных ди-, тегра- и гексапентидов проводили в этил ацетате или хлористом метилене. При переходе к гидрофобному линкеру мы

столкнулись с проблемой растворимости продуктов в перечисленных выше растворителях. Реакции конденсации в случае симметричных тетра- и гексапептидпв проводили в ДМФА.

Выходы продуктов реакции в случае линкера ь2 оказались меньше в сравнении с аналогами серий что, по-видимому, также связано с низкой растворимостью защищенных Р НКазо мим ет и ков. Чистоту продуктов и полноту протекания реакций контролировали с помощью ТСХ. Строение целевых соединений было подтверждено методами спектроскопии Я М Р Н и М АIЛЗI - м ас с -с п е ктро м етр и и,

Рибонуклеюная активность пептидоподобных соединений серии и 1,2

Гидролитическая активность синтезированных искусственных рибонуклеаз серий и Ь2 также была исследована в экспериментах с [5'-33Р]-меченым 96-звенным фрагментом РНК ВИЧ I и 21-звенным синтетическим ол и гор ибо нуклееггидо м.

Изучение активности синтезированных пептидов показало, что симметричные пептиды активнее в гидролизе РНК по сравнению с аналогичными тетрапептидами, содержащими на С-конце алифатический фрагмент. На рис. 5 приведены данные для соединений, содержащих каталитически активный пептид Е{АНА)К.

100 90 _ SO

£ 70

I во £ £0

S 30 а 20 10

0-1-

dl

Рис. 5. Эффективность расщепления (5'-EPJ-меченого 96-зве иного фрагмента РНК ВИЧ I. Условия реакции: 50 мМ шидазопьвдй буфер (pH 7.0), 0.2 М KCL 0.5 мМ ЭДТА, 0.1 мг-мп'1 суммарной тРНК из дрожжей в качестве носителя, Т=37 °с, концентрация искусственных рибонуклеаз 27, 28 -Ю-3 М, 15-10' М.

Соединения, содержащие

гидрофобный линкер Ьз, проявили более высокую активность в сравнении с аналогичными пептидами серии с гидрофильным линкером Ц. Эта закономерность прослеживается на примере обоих использованных субстратов (рис. 6). При этом наблюдается возрастание активности в ряду 17 < 22 < 27 (линкер Ь[) и 18 < 23 < 28 (линкер Ь2), для соединений содержащих каталитически активные пептиды одинакового строения. Исключением является РНКазомиметик 22, содержащий два остатка серина, который в расщеплении фрагмента РНК ВИЧ I показал низкую активность, тогда как его аналог 23 с гидрофобным линкером расщеплял РНК с высокой эффективностью (80% за 18 ч).

\ ГШ

| М.00 ■¡Вча«* л^д 17(1.11 НП.Ц ' Яо-и

Рис, 6. Эффективность расщеплений [5'-^Р]-меченого 96-звенного фрагмента РНК БИЧ I и 21-эвенного олигонукпеотида год действием соединений серии и и 1г. Условия реакции: 50 мМ имидаэольный буфер (рН 7.0), 0.2 М КС1, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1 мг-мп-1 суммарной тРНК из дрожжей в качестве носителя, Т-37 "С, концентрация искусственных рибонуклеаз Ю"3 моль-л"1.

3. Введение I! структуру искусственных рибонуклеаз дополнительного связывающего фрагмента

По аналогии с природными ферментами при создании искусственных рибонуклеаз в молекуле объединяют каталитический и су бстрат-с вязы ваю щ и и "домены".

Д.чя увеличения эффективности предложенных в данной работе искусственных рибонуклеаз на основе пептидов было решено ввести в структуру РНКаЗомиметика связывающий «домен». В качестве РНК-связывающих фрагментов нами были использованы:

• бис-чегвертичные соли 1,4-дназабициклооктана, имеющие высокое сродство к фосфат-аниону;

• интеркалятор - антрацен, способный встраиваться в двуцепочечные участки РНК.

Синтез производных пептидов К- и К-сергщ, содержащих остаток 1,4-диазабици кл о[2,2.2]октана

В рамках данной работы была предпринята попытка увеличить активность РНКазомиметиков серий К и К путем объединения в одной структуре каталитически активных пептидов и дополнительного кашоппого фрагмента (рис. 7).

Реакцию проводили в ДМФА в присутствии трдатиламина при комнатной температуре в течении 24-43 ч. Продукт выделяли из реакционной смеси высаживанием в серный эфир. Выход продуктов при синтезе конъюгатов пептидов с производным диазабициклооктана составил в среднем 60%.

Удаление И-нитро- и О-бею иль ной защитных групп с боковых радикалов аминокислот проводили путем каталитического гидрогенолиза. В случае конъюгатов диазабицркло[2.2.2]октана с пептидами 13 и 16, выходы при гидрогенолизе оказались низкими, что, по-видимому, связано с высокой необратимой сорбцией образующихся соединений на активированном угле.

Чистоту продуктов и полноту протекания реакций контролировали с помощью ТСХ. Строение целевых соединений было подтверждено методами спектроскопии ЯМР !Н и МАЬШ- и ЕЭ 1-масс-спектрометриеЙ.

10

_ ЮО.ОО

эо.оо

н ТО.СО

X »м-

л Л Л I [I

iin.ii «ал ш.« гчн»

\

*

DH-ccpim

32-3S

DK-ссрия

37-4

П s 1,2,3, 5

Рис. 7. Схема синтеза конъюгатов пептидов с производным диазабициклооктана. Пептиды 7-11: Glu - X - Arg - Gly - ОС10Н21 , пептиды 12-16: Glu - X - Lys - Gly - OCioH2i, где X - Gly (7, 12), ß-Ala (8, 13), 4-аминобутановая кислота (GABA, 9,14), 6-аминогексановая кислота (AHA, 10,15), л-аминобензойная кислота (ABA, 11,16).

Рибоиуклеазная активность производных пептидов Я- и К-серий, содержащих остаток ВАВСО

Введение (4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]окт-1-ил)метил

карбонильного остатка привело к значительному увеличению эффективности гидролиза (рис. 8). В большинстве случаев за 19 ч происходит практически количественное расщепление РНК-субстрата. Кроме того, для некоторых соединений уже за 6 ч инкубации процент расщепления РНК составляет более 80% (соединения 36, 37 и 39). При этом влияние расстояния между каталитически активными группами в тетрапептиде (звено X) на скорость расщепления в значительной степени нивелировалось в сравнении с пептидами серий К и Я. Исключением является линкер на основе п-аминобензойной кислоты. По сравнению с другими соединениями каталитическая активность РНКазомиметика 40 оказалась на порядок ниже. Каталитически активный тетрапептид 16, на основе которого синтезирован конъюгат 40, проявлял наименьшую активность среди соединений серий К и II. Вероятно, жесткий аминобензойный линкер препятствует оптимальному расположению каталитически активных групп относительно рибозофосфатного остова РНК.

Таким образом, было показано, что объединение в структуре РНКазомиметика каталитически активного пептида и РНК-связывающего фрагмента существенно повышает эффективность деполимеризации РНК.

□ 6 ч

100 j во

_ -

сО

Рис. 8. Эффективность расщепления [5'-згР)-мечено го 96-звенного фрагмента РНК БИЧ I производными пептидов И- (17-21) и К-серий (22-25). содержащих ОД8СО. Условия реакции: 50 мМ Тлз-НС1 (рН 7.0), 0.2 М КС1, 0.1 мМ ЭДТА, 0.1 мг-мл"1 суммарной тРНК из дрожжей в качестве носителя, Т=37 °С, концентрация тетралелтидов 10"1 М.

Синтез антрацап-пептидпых конъюгапюв

Исходя из ЛЦЗ-ам ино пропил) -9-аминометилантрацена были синтезированы две химические рибонуклеазы, содержащие в качестве каталитически активного фрагмента трипегттиды К-(САВ А)-Е и Е-(САВ А)-К, аналоги каталитически активных пептидов серий К и К (рис. 9).

Рис. 9. Химическая структура антрацен-лептидных конъюгатов.

Синтез трипептидов проводили в растворе методом активированных N-гидроксисукцннимидных эфиров с использованием йое-стратегии. Синтез соединения 42 протекал гладко. Благодаря гидрофобности антраценового фрагмента, а также хлор-бензил оке и карбонильной защиты лизина выделение продукта реакций конденсации №(3-аминепропил)-9-аминометилантрацена и Л'-гидроксисукцинимидного эфира jV'-Boc-M-íClCbz-Lys, а также последующих ди- и трипептида не вызывало проблем.

При попытке синтеза аналога, содержащего вместо лизина аргинин, из-за проблем, связанных с растворимостью промежуточных соединений и техническими сложностями при очистке, получить это соединение в индивидуальном виде не удалось. В тоже время синтез РНКазомиметика 43. где первым с С-конца был остаток бензилового эфира глутаминовой кислоты, не вызвал особых затруднений.

Деблокирование функциональных групп Lys и Glu в пептиде 42 осуществляли путем каталитического гидрогенолиза, при этом происходило только удаление бензильной г руппы, тогда как 2С1СЬг-защита оставалась на месте. Деблокирование карбоксильной группы Glu в пептиде 43 проводили омылением 1н NaÛH. Структуры полученных соединений подтверждены методами Í1MP 1Н и масс-спектрометрией.

4, Сравнение рибонуклказной активности соединений различных серий

Для сравнения гидролитической активности соединений различных серий в одном эксперименте были исследованы следующие искусственные рибонуклеазы: тетрапептиды 9, 14, 15; пептидоподобные соединения 27 и 28; коньюгаты трииептидов с антраценом 42 и 43; конъюгаты тетрапегтидов с производным диазабицнклооктапа 34 к 39.

На рис. 10 представлены данные по расщеплению 96-звенного фрагмента РНК ВИЧ I под действием искусственных рибонуклеаз различных серий. Сравнение эффективности расщепления РНК субстрата проводили при оптимальных для каждого соединения концентрациях,

днг-аыздвА-Ац^зп 17ч

Я МВС&ЭД ,^а (й) вдм о». (43( * - .<1

*,-" (де Л ■,/, о. I

Л'. я..... |

0 10 20 30 10 60 60 70 й^пл^м-ч ™

Рис. 10. Степень расщепления [Б'-з^меченого 96-звенного фрагмента РНК ВИЧ I соединениями серий К, й, 0К, Ой, Ь, Щ а также РНКазомиметиками 42 и 43. Время инкубации - 3 и 7 ч. Условия реации: 50 мМ имидазольный буфер (рН 7.0), 0.2 М КС!, 0.5 мМ ЭДТА, 0,1 мг-мп-1 суммарной тРНК из дрожжей а качестве носителя, Т=Э7°С, концентрация искусственных рибонуклеаз: 27, 28,42,43 - 11>3М, 9,14,15,34,39 - Ю-4 М,

В случае введения в структуру РНКазомиметика производного 1,4-диазабициклооктана увеличение активности наблюдается как для пептида Е(ОАВА)КО (9), так и для Е(ОАВА)КО (14). Замена гидрофобного алкильного остатка в пептиде Е(САВА)11С (9) на антраценовый фрагмент {соединение 43) приводит к более низкой активности.

Наибольшей активностью среди изученных конструкций обладают симметричные гексапептиды (27 и 28), а также соединение 39, содержащие каталитически активный пептид, катионный фрагмент и два гидрофобных алкильных остатка.

Синтетические конструкции всех серий, представленные в данной работе, проявляют сходную специфичность по отношению к фосфодиэфирным связям а различных последовательностях, РНК деполимеризуется по ограниченному числу сайтов. С наиболее высокой эффективностью происходит расщепление связей в СрА и ирА сайтах в одно цепочечных участках РНК.

5. Влияние структурных параметров РНК-мишени на специфичность гидролиза Р-О связей в присутствии ннзкомолекулярных РНКазомиметиков

В настоящей работе нами был проведен сравнительный анализ расщепления tPHKAsp под действием панкреатической РНКазы А и искусственных рибонуклеаз L(2L2) и D(D3) типа (рис. 11), с целью дать объяснение наблюдаемой СрА и UpA специфичности гидролиза РНК-мишени. В качестве РНК-мишени был использован 5'-32Р-меченый in vitro транскрипт tPHKasp из дрожжей. Основной причиной, обусловившей выбор данной тРНК, являлось наличие в ее структуре небольшого числа сайтов, гидролизующихся в присутствии искусственных рибонуклеаз, а также наличие в литературе данных о ее третичной структуре. На рис. 11 представлена вторичная структура tPHKAsp. Расщеплению преимущественно подвергаются фосфодиэфирные связи в СрА и UpA последовательностях: U8-A9, U13-A14, С20-А21, С43-А44 и С56-А57. На эти же сайты приходилось около 80% суммарного гидролиз tPHKasp в присутствии РНКазы А.

Исходя из этого предположения, что гидролиз протекает по всем сайтам независимо, нами была выбрана кинетическая схема для расчета констант скоростей гидролиза фосфодиэфнрных связей по пяти сайтам, на которые приходится основной процент деполимеризации и были получены константы скорости реакции гидролиза по каждому из пяти сайтов.

Используя литературные данные по строению различных кристаллических форм tPHKAsp, при помощи компьютерной программы SPDB Viewer, нами была рассчитана величина F (рис. 11) для сайтов, подвергающихся преимущественному гидролизу в присутствии рибонуклеаз. Параметр F уменьшается в следующем ряду: С20А < U8A < С55А < U18A < С43А. Динамика изменения констант скоростей гидролиза по различным сайтам совпадает с изменением значения теоретического параметра F в присутствии как D3, так и 2L2.

Исключением является сайт U8A. Наблюдаемая константа скорости в этом случае оказалась ниже, чем можно было ожидать исходя из значения параметра F. Возможно, повышенная стабильность сайта U8A по сравнению с ожидаемым объясняется расположением этого участка внутри третичной структуры тРНК, что затрудняет доступ искусственных рибонуклеаз к расщепляемой фосфодиэфирной связи.

Сайты С55А, U18A, С43А и С20А локализованы в третичной структуре тРНК на поверхности. Наиболее доступной является межнуклеотидная связь между нуклеотидами С20-А21, что наряду с высоким значением параметра F, по-видимому, и объясняет высокую эффективность гидролиза по этому сайту.

Таким образом, полученные данные наглядно демонстрируют, что специфичность гидролиза фосфодиэфирных связей в РНК в присутствии органических катализаторов, связывающихся с РНК статистическим образом, определяется внутренними свойствами субстрата. Гидролизу, в первую очередь, подвергаются стерически доступные связи, имеющие высокое значение параметра F.

очередь, подвергаются стерически доступные связи, имеющие высокое значение параметра Б.

/ ¥

р.И

ии,

uaAuuuga

G

G A

uco

gaau д g gg <t

i а с

с g

11g u" c

U C u g g и с

(jgcccc UCfGt^U

О OMe

2l2

h' °—I „ в

в

W

гвг-

(а-45) 33

180-45 d3o.

Рис. 11. Вторичная структура in vitro транскрипта дрожжевой тРНЮЧ Стрелками обозначены фосфодиэфирные связи, подвергающиеся гидролизу под действием химических нукпеаз 2L2 и D3. Стрелками указаны сайты расщепления, на которые суммарно приходится более 90% разрывов.

6. Изучение влияния длины гидрофобного радикала па эффективность искусственной рибонуклеазы

В настоящей работе проведены исследования, направленные на оптимизацию длины алкильного остатка в структуре РНКазомиметика. С этой целью был синтезирован ряд соединений А„ВЬС с общей структурой, представленной на рис. 12 и различающихся длиной алкильного остатка А„ (п - число атомов углерода), а также исследовано влияние этого структурного параметра на скорость гидролиза Р-0 связи в различных соединениях.

Соединения, содержащие н-алкильные радикалы с числом атомов углерода от 3 до 12, а также циклогексильный остаток, были синтезированы на смоле Меррифильда по схеме, представленной на рис. 12. Для исключения влияния структуры РНК каталитическую активность соединений серии А ВIX, полученных на твердой фазе, исследовали в экспериментах с модельными субстратами: и-нитрофенилфосфатом, бис-«-нитрофенилфосфатом и тимидин-3 '-«-нитрофенилфосфатом.

На рис. 13 представлены константы скорости реакции гидролиза различных модельных субстратов в зависимости от числа метиленовых звеньев в алкильном фрагменте катализатора.

Как видно из приведенных данных, в случае и-нитрофенилфосфата наблюдается слабое влияние длины алкильного остатка на скорость гидролиза фосфомоноэфирной связи. Наибольшая скорость гидролиза этого субстрата наблюдается для соединений АгуВЬС и ЛюВЬС.

При переходе к бис-л-нитрофенилфосфату в целом отмечается возрастание скорости гидролиза. При этом влияние строения алкильного остатка становится более выраженным. Для бис-п-нитрофеннлфосфата

максимальные константы скорости наблюдались при гидролизе соединениями А6ВЬС, А6В1Х , А9ВЬС и А^ВГС. Константы скоростей находятся в интервале от 3,56 х 10"4 мин"' ± 2,24 х 1СГ5 мин'1 до 6,16 х 10"4 мин"1 ± 3,16 х 10"5 мин". В случае тим иди н-3-л-нитрофен ил фосфата • наблюдается увеличение эффективности расщепления модельного субстрата □ сравнении с бис-л-нитрофеннлфосфатом. Характер зависимости скорости гидролиза от структуры катализатора меняется. Максимальной активностью в этом случае обладало соединение А?ВЬС. Константы изменяются в диапазоне от 4,60 х10"4

мин

± 1,70 х 10'4 Мин"1 до 7,92 х 10"Л мин"' ± 2,25 х 10~4мин"'

Рис. 12. Общая структура соединений АВ1_С-серии. А - алкипьный фрагмент, В - катионный фрагмент, I-линкерная группа, С - каталитический фрагмент. Твердофазный синтез искусственных рибонуклеаз АВ1С-серии. 47а: п-2,47Ь: п=Э, 47с: гь5,47(1: г=6,47е: п=8,47(: п=9,17д: п=11,47Ь: Я - циклогексил-.

сз с* се ся ст ою сиг

Рис. 13. Зависимость скорости гидролиза модельных субстратов от длины апкильного остатка а РНКазомиме тиках.

Из приведенных результатов видно, что в целом в присутствии катализаторов серии АИВЬС фосфодиэфирные связи (б и с - га- н ит р о ф е н и лф ос фат и тимидин-З'-л-нитрофенип фосфат) гидролиз у юте я с большей

А6' - цнклогексильный радикал.

эффективностью по сравнению с фосфомоноэфирными (п-нитрофенилфосфат). При этом даже в случае простых субстратов наблюдается зависимость эффективности расщепления от строения алкильного остатка. Поскольку в работе были использованы условия, исключающие мицеллообразование, можно предположить, что роль алкильных остатков заключается в способствовании созданию благоприятной пространственной структуры комплекса катализатор-мишень за счет гидрофобных взаимодействий.

Гидрофобные взаимодействия играют важную роль при формировании третичной структуры РНК, вследствии этого оптимизация строения таких катализаторов должна проводиться с использованием природных субстратов.

7. Взаимосвязь "структура - каталитическая активность" в рядах различных искусственных рибонуклеаз

К настоящему моменту предложено большое количество искусственных рибонуклеаз различного строения. Разнообразие РНК-субстратов и условий тестирования каталитической активности делает невозможным прямое сопоставление между собой активности искусственных рибонуклеаз. В рамках данной работы нами предпринята попытка провести корреляции структура -свойства на примере РНКазомиметиков различной природы, синтезированных в лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН.

Для работы были отобраны следующие серии искусственных рибонуклеаз:

• Структурно-функциональные аналоги каталитического центра рибонуклеазы А: ди- и трипептиды, содержащие в своем составе гистидин или гистамин, а также положительно заряженные аминокислоты (Lys и Arg).

• Структурно-функциональные аналоги каталитического центра рибонуклеазы Т1, предложенные в настоящей работе.

• РНКазомиметики, состоящие из четырех функциональных доменов: каталитического и РНК-связывающего центров, соединенных между собой линкерной группой, а также протяженного алифатического фрагмента.

• Связанные различными линкерами два остатка кватернизованного 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана с алкильными заместителями различной длины.

В настоящей работе предприняты первые попытки определения молекулярных структурных характеристик, ответственных за гидролитическую активность изученных РНКазомиметиков. В качестве основного инструмента для исследования связи структура-активность был использован QSAR подход на основе симплексного представления молекулярной структуры. Математические расчеты были проведены к.х.н. Муратовым E.H. при консультациях к.х.н. Артеменко А.Г. в лаборатории теоретической химии Физико-химического института им. A.B. Богатского HAH Украины (г. Одесса) под руководством д.х.н. Кузьмина В.Е.

В результате анализа данных QSAR моделирования (на выборке из 64 соединений) определены молекулярные фрагменты структуры, способствующие и препятствующие появлению требуемой активности.

Вклад молекулярных фрагментов в активность искусственных рибонуклеаз зависит от структуры субстрата, используемого в тестировании. В

случае 21-звенного олигонуклеотида и тРНКА!!р определенные участки молекулы вносят заметный вклад в проявление рибонуклеазной активности. В случае 96-звенного фрагмента РНК ВИЧ I для проявления активности важно не столько наличие или отсутствие определенных структурных фрагментов, сколько структура молекулы в целом.

Анализ вкладов различных симплексов показал, что в случае 21-звенного олигонуклеотида основное влияние оказывают электростатические (49%) и гидрофильно/гидрофобные (38%) взаимодействия, тогда как влияние природы атома, составляет всего 13 %. Для тРНКА;!р основное влияние (40%) вносят электростатические взаимодействия. При этом природа атома и гидрофильно/гидрофобные взаимодействия также играют заметную роль (табл. 2).

Таблица 2. Относительное влияние некоторых физико-химических факторов на изменение каталитической активности искусственных рибонуклеаз в гидролизе различных РНК-субстратов._

Субстрат Вклад в активность различных физико-химических факторов (%)

Природа атома Гидрофильно/ гидрофобные вз/д Электростатические вз/д Дисперсионные вз/д

21-звенный олпгонуклеотид 13 38 49 -

т РНК*" 33 25 40 2

В случае фрагмента РНК ВИЧ I большее влияние на расщепление оказывают интегральные дескрипторы, описывающие молекулу целиком (84%), в отличие от симплексных, отражающих количество четырехатомных фрагментов (симплексов) фиксированной структуры, симметрии и хиральности (16%).

Полученные данные свидетельствуют о необходимости комплексного подхода к конструированию РНКазомиметиков. Различные структурные элементы и функциональные группы будут превалировать при создании катализаторов, эффективно расщепляющих фосфодиэфирные связи в составе коротких фрагментов рибонуклеиновых кислот или в составе протяженных, структурированных РНК. Для создания катализаторов, ориентированных на гидролиз, например, полноразмерных вирусных РНК или для создания сайт-специфичных искусственных РНКаз необходимо ориентироваться на дизайн молекул с определенной структурой, максимально учитывающей возможные взаимодействия между катализатором и РНК-мишенью.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 02-04-48664, 04-0448566, программ фундаментальных исследований РАН "Происхождение и эволюция биосферы", "Фундаментальные науки - медицине", "Молекулярная и клеточная биология".

выводы

1. На основе природных аминокислот Arg, Lys, Glu, Ser, Thr, Phe впервые получены искусственные рибонуклеазы, имитирующие каталитический центр рибонуклеазы Т1. Синтезированные соединения представлены четырьмя сериями:

• тетрапептиды, содержащие на С-конце гидрофобный алифатический фрагмент (серия А);

• симметричные пептидоподобные соединения, содержащие гидрофобный (на основе 1,12-диаминододекана) и гидрофильный (на основе 4,9-диокса-1,12-диаминододекана) фрагмент в середине молекулы (серия В);

• конъюгаты четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, несущего апкильные заместители различной длины с тетрапептидами серии А (серия С);

• конъюгаты трипептидов Lys-X-Glu и Glu-X-Arg (X - 4-аминобутановая кислота) с интеркалятором — антраценом (серия D).

2. Показано, что:

• искусственные рибонуклеазы серии А и В, моделирующие каталитический центр РНКазы Т1, но не содержащие в своем составе остатков имидазола, способны эффективно расщеплять РНК;

• при небольших временах гидролиза среди пептидоподобных конструкций серии В с одинаковым строением пептидного фрагмента более высокой активностью обладают РНКазомиметики с гидрофобным линкером на основе 1,12-диаминододекана;

• на примере гидролиза Р-0 связей в и-нитрофенил фосфате, бис-п-нитрофенилфосфате и тимидин-3'-/7-нитрофенилфосфате искусственными рибонуклеазами на основе производного 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана показано, что на эффективность гидролиза влияет как длина гидрофобного радикала, так и структура субстрата;

• введение в структуру искусственной рибонуклеазы катионного фрагмента на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (серия D) приводит к увеличению эффективности расщепления РНК в 2-3 раза при небольших временах гидролиза.

3. Все искусственные рибонуклеазы серий A-D при расщеплении РНК-мишеней (9б-звенный фрагмент РНК ВИЧ-1 и 21-звенный олигонуклеотид) проявили схожую специфичность. Расщеплению преимущественно подвергаются фосфодиэфирные связи в СА и UA последовательностях, локализованных в одноцепочечных участках РНК. Сопоставление констант скоростей гидролиза различных сайтов tPHKAsp в присутствии низкомолекулярных РНКазомиметиков с геометрическими параметрами данных фосфодиэфирных связей показало, что специфичность расщепления РНК в присутствии низкомолекулярных химических рибонуклеаз определяется прежде всего геометрическими параметрами фосфодиэфирных связей и структурой РНК, а не структурой искусственных рибонуклеаз.

4. Впервые был осуществлен QSAR анализ более 60-ти структур искусственных рибонуклеаз (включая соединения серий A-D). Установлены наиболее общие структурные элементы, ответственные за

гидролитическую активность соединений различного строения. Показано, что в случае 21-звенного олигонуклеотида и tPHKAsp в основной вклад в эффективность расщепления РНК вносят группы, обеспечивающие электростатические и гидрофобные взаимодействия между искусственными рибонуклеазами и РНК, в случае 96-звенного фрагмента РНК ВИЧ-1 эффективность расщепления определяется взаиморасположением функциональных групп в РНКазомиметике.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. L.S. Koroleva, V.N. Silnikov. Toward the development of metal-free synthetic nucleases cleavage of a model substrates by bis-quaternary salts of l,4-diazabicyclo[2.2.2]octane derivatives. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2004.V. 23. N. 6-7. P. 993-996.

2. JI.C. Королева, A.A. Донина, H.B. Тамкович, H.A. Ковалев, M.A. Зенкова, В.Н. Сильников. Искусственные рибонуклеазы. Сообщение 6. Рибонуклеазная активность тетрапептидов на основе аминокислот, формирующих каталитический центр РНКазы Т1. И Изв АН, Сер.хим. 2005. С. 2596-2605.

3. JI.C. Королева. В.Н. Сильников. Искусственные рибонуклеазы на основе коротких пептидов. // Труды 1-ого международного форума «Актуальные проблемы современной. науки». Естественные науки. Самара: СГТУ. 2005, Ч. 29, С. 41-43.

4. JI.C. Королева, Е.А. Буракова, С.В. Васильева, Д.А. Коневец, В.Н. Сильников Искусственные рибонуклеазы: конструирование, синтез и перспективы применения. // Труды конференции «Органическая химия от Бутлерова и Бельштейна до современности». Санкт-Петербург: Издательство НИИ химии СПбГУ. 2006. С. 106-109.

5. JI.C. Королева. Н.С. Свищева, А.А. Донина, Н.В. Тамкович, Н.А. Ковалев, В.Н. Сильников. Низкомолекулярные катализаторы расщепления РНК, моделирующие активные центры природных ферментов. // Труды международной конференции "Физико-химическая биология". Новосибирск: АРТА. 2006, С. 119-120.

6. V. Kuzmin, Е. Muratov, A. Artemenko, L. Koroleva. V. Silnikov, V. Lozitsky, A. Fedchuk. Influence of artificial ribonucleases structure on their anti-HIV activity. II Antiviral Res., 2006, V. 70, P. A43.

Изд. Лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001. Подписано к печати и в свет 11.01.2007. Формат 60x84/16. Бумага №1. Гарнитура "Times New Roman". Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 120. Заказ №1 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН. Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. СОЗДАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ КАТАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕНТРОВ ПРИРОДНЫХ НУКЛЕАЗ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Конструирование искусствгнных нуклеаз

111 Механизм гидролитического расщепления РНК

112 Механизм гидролитического расщепления ДНК

113 Основные структурные элементы активных центров нуклеаз

114 Создание аналогов каталитических центров метамонезависимых ферментов 11 П 4 1 Моделирование каталитических центров нуклеаз (искусственные нуклеазы на основе аминокислот и пептидов).

1.1.4.2. Создание моделей нуклеаз (объединение в одной молекуле связывающего и каталитического центров)

1 14 2 1. Химические нуклеазы с интеркалятором в качестве связывающего домена

114 2 2 Химические нуклеазы, содержащие поликатионные РНК-связывающие фрагменты

115 Моделирование каталитических центров металлозависимых ферментов

115 1 Механизмы активации фосфатной группы ионами металлов 29 1.1 5 2 Химические нуклеазы на основе моноядерные металлокомплексов . 31 115 3 Химические нуклеазы на основе биядерных комплексов . 37 115 4 Химические нуклеазы на основе трехядерных металлокомплексов

1 2 МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КАТАЛИТИЧЬСКОЙ АКТИВНОСТИ СОЕДИНЕНИЙ, ГИДРОЛИЗУЮЩИХ Рсвязи в различных субстратах

121 Качественные методы детекции расщепления Р-0 связей

12 2 Спектрофотометрический анализ в изучении активности химических нуклеаз 45 12 3 Изучение нукпеазной активности с испочъзованием флуоресцентно-меченых субстратов

12 4 Хроматографические методы анализа в изучении нуклеазной активности

125 Исследования нуклеазной активности с помощью метода31Р ЯМР

12 6 Испочъзование радиоактивно-меченых субстратов в изучении нуклеазной активности

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2 1 Влияние длины гидрофобного радикала на эфф1 ктивностьискусственной рибонуклеазы

2 2 Конструирование структурно-функциональных аналогов каталитических центров природных рибонуклеаз.

2 21 Конструирование и синтез тетрапептидов, на основе аминокислот, формирующих каталитический центр РНКазы Т

2 2 2 Гидролитическая активность РНКазомиметиков серий F, К, R 73 2 2 3 Синтез симметричных пептидов, содержащих внутри структуры протяженный линкер

2 2 4 Рибонуклеазная активность пептидоподобных соединений серий Li и L

2 3 вве-дение в структуру искусственных рибонуклеаз дополнительного связывающе фрагмента.

2 31 Синтез производных пептидов R- и К-серий, содержащих остаток 1,4диазабицикло[2 2 2]октана . 82 2 3 2 Рибонуклеазная активность производных пептидов R- и К-серий, содержащих остаток DABCO

2 3 3 Синтез антрацен-пептидных конъюгатов

2 3 4 Рибонуклеазная активность антрацен пептидных конъюгатов

2 4. Сравнение рибонуклеазной активности соединений различных серий

2 5. влияние структурных параметров РНК-мишени на специфичность i идр0лиза Рсвязей в присутствии низкомолекулярных РНКазомиметиков.

2 6 Взаимосвязь "структура - каталитическая акшвность" в рядах различных искуссшьнных рибонуклеаз.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3 1 pfakthbbi и материалы

3 2 методы.

3 3 ор1аничьскийсинтгз.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Молекулы РНК обеспечивают функционирование любого живого организма, выполняя множество разнообразных функций от переноса генетической информации до катализа биохимических реакций. Реагенты, избирательно взаимодействующие с определенными видами РНК, могут служить в качестве регуляторов экспрессии генов, а также противовирусными агентами, инактивирующими РНК-содержащие вирусы

Известен широкий спектр реакционноспособных соединений, вызывающих расщепление РНК в физиологических условиях [1]. Для этой цели используются ионы металлов и металлокомплексы [2, 3], аминосоединения [4, 5] и органические соединения, содержащие остатки имидазола [6, 7], а также конструкции на основе пептидов [8, 9] Несмотря на обилие сообщений о синтезе химических рибонуклеаз до настоящего времени не удалось получить конструкций, обладающих активностью близкой к активности природных ферментов. Зачастую эффективными оказались реагенты, обладающие высокой токсичностью, что делает применение таких соединений в биологических системах малоперспективным.

Одной из наиболее перспективных стратегий создания искусственных рибонуклеаз является конструирование низкомолекулярных синтетических катализаторов, функционально моделирующих каталитические центры или имитирующих процессы, протекающие в активных центрах природных ферментов, которые расщепляют фосфодиэфирные связи в РНК

Структурный анализ активных центров природных ферментов [10] приводит к обнадеживающему выводу. Ферменты бесконечно вариабельны по структурам аффинных центров, но в значительной степени консервативны по структурам каталитических центров Опираясь на знания по строению каталитических центров ферментов и механизмам их функционирования, при использовании современного арсеншта органической химии можно создавать высокоэффективные синтетические катализаторы расщепления РНК.

Целью настоящей работы являлось создание низкомолекулярных синтетических конструкций на основе коротких пептидов, функционально имитирующих каталитический центр рибонуклеазы Т1.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• конструирование и синтез органических соединений, содержащих аминокислоты, функциональные группы боковых радикалов которых входят в состав каталитического центра рибонуклеазы Т1;

• конструирование и синтез конструкций, объединяющих в своей структуре каталитический и РНК-связывающий фрагменты;

• установление взаимосвязи "структура - рибонуклеазная активность" в ряду различных искусственных рибонуклеаз.

Выводы

1 На основе природных аминокислот Arg, Lys, Glu, Ser, Thr, Phe впервые получены искусственные рибонуклеазы, имитирующие каталитический центр рибонуклеазы Т1 Синтезированные соединения представлены 4-я сериями

• тетрапептиды, содержащие на С-конце гидрофобный алифатический фрагмент (серия А);

• симметричные пептидоподобные соединения, содержащие гидрофобный (на основе 1,12-диаминододекана) и гидрофильный (на основе 4,9-диокса-1,12-диаминододекана) фрагмент в середине молекулы (серия В),

• конъюгаты четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана, несущего алкильные заместители различной длины с тетрапептидами серии А (серия С),

• конъюгаты трипептидов Lys-X-Glu и Glu-X-Arg (X - 4-аминобутановая кислота) с интеркалятором - антраценом (серия D)

2 Показано, что

• искусственные рибонуклеазы серии А и В, моделирующие каталитический центр РНКазы Т1, но не содержащие в своем составе остатков имидазола, способны эффективно расщеплять РНК,

• при небольших временах гидролиза среди пептидоподобных конструкций серии В с одинаковым строением пептидного фрагмента более высокой активностью обладают РНКазомиметики с гидрофобным линкером на основе 1,12-диаминододекана,

• на примере гидролиза Р-0 связей в я-нитрофенилфосфате, бис-п-нитрофенилфосфате и тимидин-З'-и-нитрофенилфосфате искусственными рибонуклеазами на основе производного 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана показано, что на эффективность гидролиза влияет как длина гидрофобного радикала, так и структура субстрата;

• введение в структуру искусственной рибонуклеазы катионного фрагмента на основе 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана (серия D) приводит к увеличению эффективности расщепления РНК в 2-3 раза при небольших временах гидролиза

3 Все искусственные рибонуклеазы серий A-D при расщеплении РНК-мишеней (96-звенный фрагмент РНК ВИЧ-1 и 21-звенный олигонуклеотид) проявили схожую специфичность Расщеплению преимущественно подвергаются фосфодиэфирные связи в СА и UA последовательностях, локализованных в одноцепочечных участках РНК Сопоставление констант скоростей гидролиза различных сайтов tPHKAsp в присутствии низкомолекулярных РНКазомиметиков с геометрическими параметрами данных фосфодиэфирных связей показало, что специфичность расщепления РНК в присутствии низкомолекулярных химических рибонуклеаз определяется прежде всего геометрическими параметрами фосфодиэфирных связей и структурой РНК, а не структурой искусственных рибонуклеаз 4 Впервые был осуществлен QSAR анализ более 60 структур искусственных рибонуклеаз (включая соединения серий A-D) Установлены наиболее общие структурные элементы, ответственные за гидролитическую активность соединений различного строения Показано, что в спучае 21-звенного олигонуклеотида и tPHKAsp в основной вклад в эффективность расщепления РНК вносят группы, обеспечивающие электростатические и гидрофобные взаимодействия между искусственными рибонуклеазами и РНК, в случае 96-звенного фрагмента РНК ВИЧ-1 эффективность расщепления определяется взаиморасположением функциональных групп в РНКазомиметике

Благодарности

Автор благодарит

Своих коллег и соавторов, сотрудников лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН - д х н М А Зенкову, Н В Тамковича, Н А Ковалева - за изучение гидролитической активности синтезированных искусственных рибонуклеаз

Сотрудников лаборатории теоретической химии Физико-химического института им А В Богатского НАН Украины (г. Одесса) Е Н Муратова, А Г Артеменко, В Е Кузьмина за математические расчеты

Кандаурову В В и Скорову А Б (НИОХ СО РАН) за регистрацию ЯМР-спектров, Коваля В В. (ИХБФМ СО РАН) и Васильева В Г (НИОХ СО РАН) за регистрацию масс-спектров

Сотрудников лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН Автор выражает особую благодарность научному руководителю - Сильникову Владимиру Николаевичу - за помощь и поддержку на всех этапах работы

1. М A Zenkova Artificial nbonucleases In Nucleic Acids and Molecular Biology Heidelberg Springer Verlag 2004 V 13

2. В N Trawick, A.T Daniher, J К Bashkin Inorganic mimics of nbonucleases and nbozymes from random cleavage to sequence-specific chemistry to catalytic antisense drugs HChem Rev 1998 V 98 P. 939-960

3. F. Mancin, P Scnmin, P Tecilla, U. Tonellato Artificial metallonucleases // Chem Commun 2005 P 2540-2548

4. К Shinozuka, Y Nakashima, К Shimizu, H Sawai Synthesis and characterization ot poliamine-based biomimetic catalysts as artificial nbonuclease // Nucleotides, Nucleotides&Nucleic Acids 2001 V. 20 P 117-130

5. К Yoshinan, К Yamazaki, M Komiyama Oligoamines as simple and efficient catalysts for RNA hydrolysis IIJ Am Chem Soc 1991. V 113 P 5899-5901

6. MA Podyminogin, V V Vlassov, R. Giege. Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking nbonuclease A active center Design and cleavage of tRNA transcripts // Nucleic Acids Res 1993 V 21 P 5950-5956

7. S Fouace, С Gaudin, S Picard, S Corvaisier, J. Renault, В Carbom, В Felden// Poliamine derivatives as selective RNase A mimics // Nucleic Acids Res 2004 V 32. P 151-157

8. В Barbier, A. Brack Basic polypeptides accelerate the hydrolysis of ribonucleic acids IIJ Am Chem Soc 1988 V 110 P 6880-6882

9. В Barbier, A Brack Conformation-controlled hydrolysis of polyribonucleotides by sequential basic polypeptides IIJ Am Chem Soc 1992 V 114 P 3511-3515

10. С Д Варфоломеев, A E. Пожитков Активные центры гидролаз основные типы структур и механизм катализа // Вести Моек Уииверитета Сер 2 Химия 2000. Т 41 С 147-156

11. В Jandeleit, D J Schaefer, Т S Powers, H.W Turner, W H Weinberg Combinatorial materials science and catalysis // Angew Chem Int Ed 1999 V 38 P 2494-2532

12. MA Gallop, RW Barrett, W J Dower, S.P A Fodor, E.M Gordon Applications of combinatorial technologies to drug discovery 1. Background and peptide combinatorial libraries IIJ Med Chem 1994. V 37. P 1233-1251

13. FM Menger, A.V Ehseev, VA Migulin Phosphatase catalysis developed via combinatorial organic chemistry. 11J Org Chem 1995 V 60 P. 6666-6667

14. A Berkessel, DA Herault Discovery of peptide-zirconium complexes that mediate phosphate hydrolysis by batch screening of a combinatorial undecapeptide library // Angew Chem Int Ed Engl 1999 V 38 P 102-105

15. A Berkessel, R Riedl Combinatorial de novo synthesis of catalysts how much of a hit-structure is needed for activity? // J Comb Chem 2000 V 2 P 215-219

16. BH Сильников, В В Власов Конструирование реагентов для направленного расщепления нуклеиновых кислот II Успехи химии 2001. Т 70 С 562-580

17. R Т Raines. Ribonuclease А II Chem Rev 1998 V 98. Р 1045-1065

18. EL Hegg, JN Burstyn Toward the development of metal-based synthetic nucleases and peptidases a rationale and progress report in applying the principles of coordination chemistry II Coord Chem Rev 1998. V 173 P 133-165

19. M Komiyama, J Sumaoka Progress towards synthetic enzymes for phosphodiester hydrolysis HCurr Opin Chem Biol, 1998, V 2, P 751-757

20. N Strater, W N Lipscomb, T Klabumde, В Krebs Two-metal catalysis in enzymatic acyl-and phosphoryl-transfer reactions //Angew Chem Int Ed Engl 1996 V 35 P 2024-2055

21. DE Wilcox. Binuclear metallohydrolases II Chem Rev 1996 V 96 P 2435-2458

22. J A Cowan Metal activation of enzymes in nucleic acid biochemistry // Chem Rev 1998 V 98 P 1067-1088

23. R A. Kovall, В W Matthews. Type II restriction endonucleases. structural, functional and evolutionary relationships // Curr Opin Chem Biol 1999 V 3 P 578-583

24. С Д Варфоломеев, И А Гариев, И В Упоров Каталитические центры гидролаз структура и каталитический цикл // Успехи химии 2005 Т. 74. С 67-83

25. G J Bartlett, С Т Porter, N Borkakoti, J. М. Thornton Analysis of catalytic residues in enzyme active sites.// J Mol Biol 2002 V 324 P. 105-121

26. С Lim, P Tole. Endocyclic and exocychc cleavage of phosphorane monoanion a detailed mechanism of the RNase A transphorylation step IIJ Am Chem Soc 1992. V114 P 7245-7252

27. R J Hondal, Z Zhao, A.V Kravchuk, H Liao, S R. Riddle, X. Yue, К S Bruzik, M.-D Tsai Mechanism of phosphatidyhnositol-specific phospholipase С a unified view of the mechanism of catalysis II Biochemistry 1998 V. 37 P 4568-4580

28. J A Gerlt, P G Gassman. Understanding the rates of certain enzyme-catalyzed reactions, proton abstraction from carbon acid, acyl transfer reactions, and displacement reactions of phosphodiesters. // Biochemistry 1993. V. 32. P 11943-11952

29. R Breslow, M Labelle Sequential general base-acid catalysis in the hydrolysis of RNA by imidazole IIJ Am Chem Soc 1986 V. 108. P. 2655-2659

30. R Breslow, J В Doherty, G Guillot, С Lipsey P-Cyclodextnnyl-bisimidazole, a model for nbonuclease IIJ Am Chem Soc 1978 V 100 P 3227-3229

31. E Anslyn, R Breslow Geometric evidence on the nbonuclease model mechanism IIJ Am Chem Soc 1989 V 111 P 5972-5973

32. R Breslow Biomimetic chemistry II Pure&Appl Chem 1994. V 66 P 1573-1582

33. I G Kamphuis, J Drenth, E N Baker Thiol proteases comparative studies based on the high-resolution structures of papain and actinidin, and on amino acid sequence information for cathepsins В and H, and stem bromelain // J Mol Biol 1985 V 182 P 317-329

34. J D Schrag, Y Li, S Wu, M Cygler Ser-His-Glu triad forms the catalytic site of the lipase from Geotrichum candidum II Nature. 1991 V 351 P 761-765

35. J L. Sussman, M Harel, F Frolow, С Oefner, A. Goldman, L. Toker, I Silman. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo califomica a prototypic acetylcholine binding protein II Science 1991 V 253. P 872-879

36. H W Anthonsen, A Baptista, F Drabols, P Martel, S В Petersen, M Sebastiao, L Vaz Lipases and esterases a review of their sequences, structure and evolution // Biotechnol Annu Rev 1995 V 1 P 315-371

37. ТА Steitz, R.G Shulman Crystallographic and NMR Studies of the Serine Proteases II Annu Rev Biophys Bioeng 1982 V. 11 P. 419-444.

38. P Carter, J. A. Wells Dissecting the catalytic triad of a serine protease // Nature. 1988 V 332 P 564-568

39. DR. Corey, WS Willett, G.S. Coombs, С S. Craik. Trypsin specificity increased through substrate-assisted catalysis II Biochemistry. 1995 V 34. P 11521-11527

40. S Sprang, T Standing, R J. Flettenck, R M Stroud, J Finer-Moore, N H Xuong, R Hamlin, W J. Rutter, С S Craik The three-dimensional structure of Asnl02 mutant of trypsin: role of Asp 102 in serine protease catalysis II Science 1987 V 237 P 905-909

41. Y Li, Y. Zhao, S Hatfield, R Wan, Q Zhu, X Li, M McMills, Y Ma, J Li, K. L. Brown, С He, F Liu, X. Chen Dipeptide seryl-histidine and related oligopeptides cleave DNA, protein, and a carboxyl ester // Bioorg Med Chem Lett 2000 V 8 P 26752680

42. M Sun, Y. Ma, S Ji, H Liu, Y Zhao Molecular modeling on DNA cleavage activity of seryl-histidine and related dipeptide. // Bioorg Med Chem Lett 2004 V 14 P 37113714

43. H. Fu, Z L Li, Y F. Zhao, G Z Tu Oligomenzation of/V,0-bis(tnmethyIsilyl)-a-amino acids into peptides mediated by o-phenylene phosphorochlondate // J Am Chem Soc 1999 V 121 P 291-295

44. M Sun, С Zhu, В Tan, Y Jin, Y Zhao Molecular modeling of diastereoisomeric aggregates of L/D Ser/histamine amide with 5'-TpTpdC-3'.// J Mol Model 2003 V 9 P 84-87

45. М А Зенкова, Н JI Чумакова, А В Власов, Н И. Комарова, А Г. Веньяминова, В В Власов, В Н. Сильников Синтетические конструкции функционально имитирующие рибонуклеазу А. // Моя биология 2000 Т 34 С 456-460

46. ХН Li, R Wan, Q Zhang, Y F Zhao The cleavage effect of histidyl-Lysine on RNA // Chin Chem Lett 1998 V 9. P 333-334.

47. R Breslow. How do imidazole groups catalyze the cleavage of RNA in enzyme models and in enzymes? Evidence from'negative catalysis' // Acc Chem Rev 1991 V 24. P. 317-324.

48. I Zegers, D. Maes, M H Dao-Thi, F Poortmans, R. Palmer, L Wyns The structures of RNase A complexed with З'-CMP and d(CpA) active site conformation and conserved water molecules. // Protein Sci 1994 V 3 P 2322-2339.

49. В J Calnan, В Tidor, S Biansalana, D Hudson, A D Frankel Arginine-mediated RNA recognition the argimne fork II Science 1991 V 251. P 1167-1171

50. T Nakai, W. Yoshikawa, H. Nakamura, H Yoshida The three-dimensional structure of guanine-specific ribonuclease F1 in solution determined by NMR spectroscopy and distance geometry // Eur J Biochem 1992 V. 208. P. 41-51

51. J Sevcik, E J Dodson, G G Dodson. Determination and restrained least squares refinement of the crystal structure of the ribonuclease Sa and its complex with 3'-guanyhc acid at 1 8 A resolution // Acta Crystallogr B. 1991 V 47 P 240-253

52. В Baumeister, S Matile Toward /?-octiphenyl /^-barrel RNases // Macromolecules 2002. V. 35 P 1549-1555.

53. H Witzel. The function of the pynmidine base in the nbonuclease reaction // Prog Nucleic Acids Res 1963 V 2. P 221-258

54. С Florentz, J-P Bnand, P Romby, L. Hirth, J-P. Ebel, R Giege The tRNA-like structure of turnip yellow mosaic virus RNA structural organization of the last 159 nucleotides from the 3' OH terminus l/EMBOJ 1982 V 1 P 269-276

55. R. Kierzek Nonenzymatic hydrolysis of ohgonbonucleotides. // Nucleic Acids Res 1992 V 20 P 5079-5084.

56. A Lorente, J F Espinosa, M. Femandez-Saiz, J-M. Lehn, W D. Wilson, Y Y Zhong Synthesis of lmidazole-Acndine conjugates as nbonuclease A mimics // Tetrahedron Lett 1996 V 37 P 4417-4420

57. C-H Tung, Z. Wei, M J Leibowitz, S Stein Design of peptide-acndine mimics of nbonuclease activity // Proc Natl Acad Sci (JSA 1992. V. 89 P 7114-7118

58. M Endo, К Hirata, T Ihara, S Sueda, M Takagi, M. Komiyama RNA hydrolysis by the cooperation of carboxylate ion and ammonium ion II J Am Chem Soc 1996 V 118 P. 5478-5479

59. Q Yang, J Xu, Y Sun, Z Li, Y Li, X Qian. Hydrolysis of plasmid DNA and RNA by amino alkyl naphthalimide as metal-free artificial nuclease. // Biooig Med Chem Lett 2006 V. 16 P. 803-806

60. К. Yoshinan, К Yamazaki, М. Komiyama Oligoamines as simple and efficient catalysts for RNA hydrolysis. IIJ Am Chem Soc 1991 V 113 P 5899-5901

61. Y Xu, X Qian, W Yao, P Mao, J Cui Novel naphthalimide hydroperoxide photonucleases The role of thiocychc-fused area and the difference in spectra, photochemistry and photobiological activity // Bioorg Med Chem 2003 VHP 5427-5433

62. С Bailly, M Brana, M J Waring Sequence-selective intercalation of antitumour bis-naphthalimides into DNA Evidence for an approach via the major groove // Eur J Biochem 1996 V 240 P 195-208

63. I Tabushi, Y Kobuke, J Imuta Molecular recognition of nucleotides by means of ionic interaction in hydrophobic media // Nucl Acids Svmp Ser Oxford University Press 1979 V. 6 P 175-178

64. N. Borkakoti. Enzyme specificity, base recognition and hydrolysis of RNA by nbonuclease A IIFEBS Lett 1983 V 162 P 367-373

65. MA Зенкова, H Л Чумакова, А В. Власов, H И Комарова, А Г Веньяминова, В В Власов, В Н Сильников Синтетические конструкции, функционально имитирующие рибонуклеазу А // Moi биология 2000.1.34 С 456-460

66. ДА Коневец, Н Л Миронова, И Э Бекк, М А Зенкова, Г.В Шишкин, В В. Власов, В Н Сильников. Химические рибонуклеазы 4 Анализ фрагментной структуры химических рибонуклеаз на основе 1,4-диазабицикло2 2 2J // Биоорган химия 2002 Т 28 С 367-378

67. E H. Serpersu, D Shortle, A S Mildvan Kinetic and magnetic resonance studies of effects of genetic substitution of a Ca2+-liganding amino acid in staphylococcal nuclease II Biochemistry 1986 V 25 P 68-77.

68. EH Serpersu, J McCracken, J Peisach, A S Mildvan. Electron spin echo modulation and nuclear relaxation studies of staphylococcal nuclease and its metal-cordinationg mutants II Biochemistry 1988 V 27 P 8034-8044

69. F A. Cotton, E E Hazen, Jr, M J Legg. Staphylococcal nuclease proposed mechanism of action based on structure of enzyme-thymidine 3',5'-bisphosphate-calcium ion complex at 1 5-angstrom resolution II Proc Natl Acad Sci USA 1979 V 76 P 25512555

70. M -S Muche, M W. Gobel Bis(guanidinium) alcohols as models of staphylococcal nuclease, substrate binding through ion pair complexes and fast phosphoryl transfer reactions II Angew Chem Int Ed Engl 1996 V 35. P 2126-2129

71. K. Kurz, M.W Gobel. Hydrolytical cleavage of TAR-RNA, the trans-activation responsive region of HIV-l, by a bis(guamdimum) catalyst attached to arginine // llelv Chim Acta 1996 V 79 P 1967-1979

72. U Scheffer, A Stnck, V Ludwig, S Peter, E. Kalden, MG Gobel Metal-free catalysts for the hydrolysis of RNA derived from guanidines, 2-aminopyndines, and 2-aminobenzimidazoles IIJ Am Chem Soc 2005 V 127 P. 2211-2217

73. S Pitsch, U. Scheffer, M Hey, A Stnck, M W Gobel. On facts and artifacts the difficulty to evaluate an artificial nuclease // Helv Chim Acta 2003 V 86 P 37403752.

74. К Michaelis, M Kalesse Selective cleavage of the HIV-I TAR-RNA with a peptide-cyclen conjugate II Angew Chem Int Ed 1999 V 38 P 2243-2245

75. J D Pughsi, R Tan, В J Calnan, A D Frankel, J R. Williamson Conformation of the TAR RNA-argimne complex by NMR spectroscopy II Science 1992 V 257 P 76-80

76. E Kikuta, M. Murata, N Katsube, T Koike, E Kimura Novel recognition of thymine base in double-stranded DNA by zinc(II)-macrocyclic tetraamine complexes appended with aromatic groups. IIJ Am. Chem Soc 1999 V 121 P 5426-5436

77. S Aoki, M. Shiro, T Koike, E. Kimura Three-dimensional supermolecules assembled from a tns(Zn2+-cyclen) complex and di- and tnanionic cyanunc acid in aqueous solutioncyclen = 1,4,7,10-tetraazacyciododecane) II J Am Chem Soc. 2000 V 122 P 576584

78. К Michaelis, M. Kalesse Selective cleavage of unpaired undines with tyrosine-cyclen conjugate // Chembiochem 2001 V 1 P. 79-83

79. A Maxwell, M Gellert Mechanistic aspects of DNA topoisomerases // Adv Protein Chem 1986 V 38 P 69-107

80. P Molenveld, S Kapsabelis, J E Engbersen, D N. Reinhoudt Highly efficient phosphate diester transestenfication by a calyx4.arene-based dinuclear zinc(ll) catalyst IIJ Am Chem Soc 1997 V 119 P 2948-2949

81. N H Williams, В Takasaki, M Wall, J Chin Structure and nuclease activity of simple dinuclear metal complexes quantitative dissection of the role of metal ions // Acc Chem Res 1999 V 32 P 485-493

82. T H. Fife, T Przystas Effects of divalent metal ions on the hydrolysis of esters of 2-(hydroxyethyl)-picolmic acid Metal ion catalysis of the carboxyl, hydroxide ion, and water reactions IIJ Am Chem Soc 1982 V 104 P 2251-2257

83. R Jou, J A Cowan Ribonuclease H activation by inert transition-metal complexes -mechanistic probes for metallocofactors insights on the metallobiochemistry of divalent magnesium-ion IIJ Am Chem Soc 1991 V 113 P 6685-6686

84. G C. Yeh, A M Beatty, J К Bashkin. Synthesis and charactenzation of cobalt-cage complexes with pendant phenol groups // Inorg Chem 1996 V 35 P 3828-3835

85. С В Anfinsen. Pnnciples that govern the folding of protein chains // Science 1973 V 181 P 223-230

86. D J Weber, А К Meeker, A.S Mildvan Interactions of the acid and base catalysts on staphylococcal nuclease as studied in a double mutant // Biochemistrv 1991 V 30 P 6103-6114

87. H. Witzel, W Berg, О Creutzenberg, A Karreh. Zinc Enzymes Birkhauser Boston. 1986 P 295-306

88. EE Kim, H.W Wyckoff Reaction mechanism of alkaline phosphotase based on crystal structures. Two-metal ion catalysis HJ Mol Biol 1991 V 218. P 449-464

89. N. Strater, T Klabunde, P Tucker, H Witzel, B. Krebs. Crystal structure of a purple acid phosphotase containing a dinuclear Fe(III)-Zn(II) active site. // Science. 1995 V 268. P 1489-1492.

90. E. Kovan, R. Kramer. Rapid phosphodiester hydrolysis by an ammonium-functionalized copper(II) complex. A model for the cooperativity of metal ions and NHacidic groups in phosphoryl transfer enzymes II J Am Chem Soc 1996 V 118 P 12704-12709

91. R Ren, P Yang, W Zheng, Z. Hua. A simple copper(II)-L-histidine system for efficient hydrolytic cleavage of DNA // Inorg Chem 2000 V 39 P 5454-5463

92. T Gunnlaugsson, R J H Davies, M Nieuwenhuyzen, С S Stevenson, R. Viguier, S. Mulready Rapid hydrolytic cleavage of the mRNA model compound HPNP by glycine based macrocyclic lanthanide nbonuclease mimics // Chem Commun 2002 P 21362137

93. T Gunnlaugsson, JE O'Bnen, S. Mulready Glycine-alanine conjugated macrocyclic lanthanide ion complexes as artificial nbonucleases 11 Tetrahedi on Lett 2002 V 43 P 8493-8497

94. LH Schnaith, RS Hanson, LJr Que Double-stranded cleavage of pBR322 by a duron complex via a "hydrolytic" mechanism // PNAS 1994. V 91 P 569-573

95. KG Ragunathan, H J. Schneider Binuclear lanthanide complexes as catalysts for the hydrolysis of bis(p-nitrophenyl)phosphate and double-stranded DNA // Angew Chem Int Ed Engl 1996 V 35 P 1219-1221

96. M Komiyama, N Takeda, H Shigekawa Hydrolysis of DNA and RNA by lanthanide ions mechanistic studies leading to new applications II Chem Commun 1999. P 14431451.

97. SJ Franklin. Lanthanide mediated DNA hydrolysis II Curr Opin Chem Biol 2001 V 5 P 201-208

98. L Ma, TT Tibbits, E.R. Kantrovitz. Eschenchia coll alkaline phosphatase X-ray structural studies of a mutant enzyme (His-412 -> Asn) at one of the catalytically important zinc binding sites II Proteinsci 1995 V 4. P 1498-1506

99. E Hough, L К Hansen, В Birknes, K. Jynge, S Hansen, A. Hardvik, С Little, E Dodson, Z. Derewenda High-resolution (1,5 A) crystal structure of phospholipase С from Bacillus cereus II Nature. 1989 V. 338 P 357-360.

100. L S. Beese, T A Steitz. Structural basis for the 3'-5' exonuclease activity of Eschenchia coli DNA polymerase I. a two metal ion mechanism. // EMBOJ 1991 V. 10 P 25-33

101. PR. Reddy, S К Mohan, К S. Rao. DNA hydrolytic cleavage bystable Zn(ll) dipeptide complexes // Indian J Chem 2004 V 43A. P 2329-2332.

102. E Boseggia, M. Gatos, L Lucatello, F. Mancin, S. Moro, M. Palumbo, С Sissi, P Tecilla, U. Tonellato, G Zagotto Toward efficient Zn(II)-based artificial nucleases II J. Am Chem Soc 2004 V 126 P 4543-4549

103. L Bonfa, M Gatos, F Mancin, P Tecilla, U Tonellato The ligand effect on the hydrolytic reactivity of Zn(II) complexes toward phosphate diesters // Inorg Chem 2003 V 42 P 3943-3949

104. JW. Lown, AR Morgan, SF Yen, Y H Wang, W D Wilson Characteristics of the binding of the anticancer agents mitoxantrone and ametantrone and related structures to deoxyribonucleic acids II Biochemistry 1985. V. 24 P 4028-4035

105. В Gatto, G Zagotto, С Sissi, С Cera, E Unarte, G. Palu, G. Capramco, M Palumbo Peptidyl anthraquinones as potential antineoplastic drugs- synthesis, DNA binding, redox cycling, and biological activity. IIJ Med Chem 1996 V 39 P 3114-3122

106. MP Fitzsimons, J К Barton Design of synthetic nuclease. DNA hydrolysis by a zinc-binding peptide tetheres to a rhodium intercalator IIJ Am Chem Soc 1997 V 119 P 3379-3380

107. AM Pyle, EC Long, J К Barton Shape-selective targeting of DNA by (phenanthrenequinone dnmine)rhodium(III) photocleaving agents // J Am Chem Soc 1989 V 111 P 4520-4522.

108. AH Krotz, L Y Kuo, TP Shields, J К Barton DNA recognition by rhodium(III) polyamine intercalators considerations of hydrogen bonding and van der Waals interactions IIJ Am Chem Soc 1993. V 115 P 3877-3882.

109. PR Reddy, KS Rao, SK Mohan Copper(II) complexes containing N,N-donor ligands and dipeptides act as hydrolytic DNA-cleavage agents // Chemistry&Biodiversity 2004 V 1 P. 839-853

110. PR Reddy, P Manjula, S К Mohan Novel peptide-based copper(II) complexes for total hydrolytic cleavage of DNA // Chemistry&Biodiversitv 2005 V 2 P 1338-1350

111. PR Reddy, KS Rao Ternary nickel (II) complexes as hydrolytic DNA-cleavage agents II Chemistry&Biodiversity 2006 V 3. P 231-243

112. FH Westheimer Why nature choose phosphate II Science. 1987 V 235 P 11731178

113. С В Black, J A Cowan Magnesium activation of nbonuclease-H-evidence for one catalytic metal-ion II Inorg Chem 1994 V 33 P 5805-5808

114. N H. Williams, J Chin. Metal-ion catalyzed phosphate diester transestenfication quantifying double Lewis-acid activation. // J Chem Soc Chem Commun 1996. V 2 P 131-132

115. NH Williams, W. Cheung, J Chin Reactivity of phosphate diester doubly coordinated to a dinuclear cobalt(III) complex, dependence of the reactivity on the basicity of the leaving group IIJ Am Chem. Soc 1998. V 120. P. 8079-8087

116. D Wahnon, A.-M. Lebuis, J Chin. Hydrolysis of a phosphate diester doubly coordinated to a dinuclear cobalt(III)-complex: a novel mechanism // Angew Chem Int Ed Engl 1995 V 34 P 2412-2414.

117. M. Wall, RC Hynes, J Chin Double Lewis acid activation in phosphate diester cleavage II Angew Chem Int Ed Engl 1993 V 32. P 1633-1635

118. M J Young, J Chin Dinuclear copper(II) complex that hydrolyzes RNA // J Am Chem Soc 1995 V 117 P 10577-10578

119. P Rossi, F Felluga, P Scnmin A new ligand alpha-amino acid (S)-2-amino-3-l-(l,4,7-tnazacyclononane).propanoic acid // Tetrahedron Lett 1998 V 39 P 71597162

120. P Rossi, F. Felluga, P Tecilla, F Formaggio, M Cnsma, С Toniolo, P Scnmin A bimetallic helical heptapeptide as a transphosphorylation catalyst in water // J Am Chem Soc 1999 V 121 P 6948-6949

121. С Sissi, P Rossi, F. Felluga, F Formaggio, M. Palumbo, P Tecilla, С Toniolo, P Scnmin Dinuclear Zn2+ complexes of synthetic heptapeptides as artificial nucleases IIJ Am Chem. Soc 2001. V. 123 P 3169-3170.

122. P Molenveld, J F J Engbersen, D N Reinhoudt. Specific RNA dinucleotide cleavage by a synthetic calyx4.arene-based tnnuclear metallo(II)-phosphodiesterase // Angew Chem Int Ed Engl 1999 V 38 P 3189-3192

123. С Madhavaiah, S Verma Kinetic evaluation of a metalated diglycine conjugate as a functional mimetic of phosphate ester hydrolase // Bioconjugate Chem 2001 V 12 P 855-860

124. Q-X Xiang, X-Q Yu, X-Y Su, Q-S Yan, T. Wang, J-S You, R-G Xie Phosphodiester hydrolysis by metal ion macrocyclic dioxotetraamine complexes beanng alcohol pendant in comicellar solution IIJ Mo I Catal A Chem 2002. V 187 P 195200

125. К Yamaguchi, F Akagi, S Fujinami, M Suzuki, M. Shionoya, S Suzuki Hydrolysis of phosphodiester with hydroxy- or carboxylate-bndged dinuclear Ni(II) and Cu(II) complexes // Chem Commun 2001 P 375-376

126. H Kurosaki, T Tawada, S Kawasoe, Y Ohashi, M. Goto A model for Znll-contaimng-P-lactamase- synthesis, X-ray crystal structure of a Zinc(II) complex beanngthiol croup and hydrolysis of phosphate diester // Bioorg Med Chem Lett 2000 V 10 P 1333-1337

127. BR Bodsgard, JN Burstyn Silica-bound copper(II) tnazacyclononane a robust material for the heterogeneous hydrolysis of a phosphodiester. // Chem Commun 2001 P 647-648

128. P Gomez-Tagle, А К Yatsimirsky Kinetics of phosphodiester hydrolysis by lanthanide ions in weakly basic solutions IIJ Chem Soc , Dalton Trans 1998 P 29572959.

129. LM Rossi, A Neves, R Horner, H Terenzi, В Szpoganicz, J Sugai Hydrolytic activity of a dinuclear copper(II,II) complex in phosphate diester and DNA cleavage // Inorg Chim Acta 2002 V 337 P 366-370

130. T Berg, A Simeonov, KD Janda A combined parallel synthesis and screening of mdcrocyclic lanthanide complexes for the cleavage of phospho di- and trimesters and double-stranded DNA.// J Comb Chem 1999 V l.P 96-100

131. RA Moss, J Zhang, К Bracken. Extraordinary acceleration of phosphodiester hydrolyses by thorium cations II Chem Commun 1997 P 1639-1640

132. RA Moss, W Jiang Lanthanide-mediated cleavage of micellar phosphodiesters // Langmuu 2000 V 16 P 49-51

133. V. Jubian, RP Dixon, AD Hamilton Molecular recognition and catalysis Acceleration of phosphodiester cleavage by simple hydrogen-bonding receptor // J Am Chem Soc 1992 V 114 P 1120-1121

134. U Baykal, M S Akkaya, E U Akkaya A novel lanthanide complex with remarkable phosphodiester transestenfication activity and DNA-conjugatable functionality // J Inclus Phenomena Macrocyclic Chem 1999 V 35 P 311-315

135. U. Baykal, M.S. Akkaya, E U Akkaya Remarkable phosphodiester hydrolysis activity of a novel Celv complex in neutral aqueous solutions // J Mol Catal A Chem 1999 V 145 P 309-312

136. RA Moss, S Bose, KG. Ragunathan, N. Jayasunya, TJ Emge. An exceptionally reactive phosphortiester. // Tetrahedron Lett. 1998. V. 39 P 347-350

137. RA. Moss, KG Ragunathan An unusually reactive phosphodiester // Tetrahedron Lett 2000. V 41. P. 3275-3278.

138. J E. Thompson, R T Raines Value of general acid-base catalysis to nbonuclease A // J Am Chem Soc 1994 V 116 P 5467-5468

139. A J Kirby, R E Marriott. Mechanism of RNA cleavage by imidazole Catalysis vs medium effects IIJ Am Chem Soc 1995 V 117 P 833-834

140. A Berkessel, R Riedl. Fluorescence reporter for phosphodiesterase activity II Angew Chem Int Ed Engl 1997 V 36 P 1481-1483

141. Y Kawanishi, К Kikuchi, H Takakusa, S Mizukami, Y Urano, T Higuchi, T Nagano Design and synthesis of intramolecular resonance-energy transfer probes for use in ratiometnc measurements in aqueous solution // Angew Chem Int Ed Engl 2000 V 39 P 3438-3440

142. H Takakusa, К Kikuchi, Y Urano, S Sakamoto, К Yamaguchi, T Nagano Design and synthesis of an enzyme-cleavable sensor molecule for phosphodiesterase activity based on fluorescence resonance energy transfer // J Am Chem Soc 2002 V 124 P 1653-1657

143. О Zelenko, U Neumann, W Brill, U Pieles, H E Moser, J Hofseenge A novel fluorogenic substrate for nbonucleases Synthesis and enzymatic characterization // Nucleic Acids Res 1994 V 22. P 2731-2739

144. BR Kelemen, ТА Klink, MA. Behlke, SR Eubanks, PA Leland, Raines R Hypersensitive substrate for nbonucleases II Nucleic Acids Res 1999 V 27 P 36963701

145. DA James, G A. Woolley A fluorescence-based assay for nbonuclease A activity // Anal Biochem 1998 V 264 P 26-33

146. S Tyagi, F R. Kramer Molecular beacons probes that fluoresce upon hybridization // Nature Biotechnol 1996 V 14 P 303-308

147. AS Piatek, S Tyagi, A.C. Pol, A Telenti, LP Miller, FR Kramer, D Alland Molecular beacon sequence analysis for detecting drug resistance in Mycobactenum tuberculosis II Nature Biotechnol 1998 V 16. P. 359-363

148. G. Leone, H van Schijndel, В van Gemen, FR Kramer, CD Schoen Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogeneous, real-time detection of RNA 11 Nucleic Acids Res 1998. V 26 P. 2150-2155

149. R. Ehncht, T Kirner, T Ellinger, P Foerster, JS McCaskill Momtonng the amplification of CATCH, a 3SR based cooperatively coupled isothermal amplification system, by fluonmetric methods II Nucleic Acids Res 1997 V 25 P 4697-4699

150. В A J Giesendorf, JAM Vet, S Tyagi, EJMG Mensink, F J M Tnjbels, H J Blom Molecular beacons a new approach for semiautomated mutation analysis // Clin Chem 1998. V 44 P 482-486

151. DL Sokol, X Zhang, P Lu, A M Gewirtz Real time detection of DNA RNA hybridization in living cells И Proc Natl Acad Sci USA 1998 V 95 P 11538-11543.

152. J J Li, X Fang, S M Schuster, W Tan Molecular beacons, a novel approach to detect protein-DNA interactions // Angew Chem Int Ed Engl 2000 V 39 P 1049-1052

153. J J Li, R Geyer, W Tan Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA 11 Nucleic Acids Res 2000 V 28 e52

154. A Tsubouchi, TC Bruice Remarkable (~10u) rate enhancement in phosphonate ester hydrolysis catalyzed by two metal ions II J Am Chem Soc 1994 V 116 P 1161411615

155. H L. Osterman, Jr F G Walz Subsites and catalytic mechanism of nbonuclease T1 kinetic studies using GpA, GpC, GpG, and GpU as substrates // Biochemistry 1978 V 17 P 4124-4130

156. R. Shapiro, J W Fett, D J Strydom, В L Vallee Isolation and characterization of a human colon carcinoma-secreted enzyme with pancreatic nbonuclease-like activity // Biochemistry 1986 V 25 P 7255-7264

157. R Breslow, D-L Huang Effects of metal ions, including Mg2+and lanthanides, on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. // Proc Natl Acad Sci USA. 1991 V 88. P 4080-4083

158. J Lacadena, A. Martinez del Polo, V Lacadena, A Martinez-Ruiz, J M Mancheno, M. Onaderra, J G. Gavilanes The cytotoxin a-sarcin behaves as a cyclizing nbonuclease // FEBS Lett 1998 V 424 P 46-48

159. SR Kirk, Y Tor Hydrolysis of an RNA dinucleoside monophosphate by neomycin В II Chem Commun 1998 P 147-148.

160. MJ Han, К S Yoo, Y H. Kim, J Y Chang. The catalytic activity of nbose-containing polymers for the hydrolysis of phosphodiester and the cleavage of nucleic acid // Tetrahedron Lett 2002. V 43 P. 5597-5600

161. R Ott, R Kramer Rapid phosphodiester hydrolysis by zirconium (IV) // Angew Chem Int Ed Engl 1998 V 37 P 1957-1960

162. TP Prakash, SS Kunte, KN Ganesh. Self cleavage of C8-histamino-r(UpA) promoted by ZnCl? mechanistic studies on a designed nbonuclease mimic. // Tetrahedron 1994. V 50 P 11699-11708

163. M Komiyama, К Yoshinan Kinetic analysis of diamine-catalyzed RNA hydrolysis // J Org Chem 1997 V 62. P 2155-2160

164. M-S Muche, P Kamalapnja, M W. Gobel Reaction cascade in the supramolecular phosphorylation of a bis(guamdinium) diol // Tetrahedron Lett 1997 V 38 P 29232926

165. A Bibillo, M. Figlerowicz, R. Kierzek The non-enzymatic hydrolysis of oligonbonucleotides VI The role of biogenic polyamines // Nucleic Acids Res 19991. V 27 P 3931-3937

166. F Chillerru, RB Mernfield Use of N,m-Dinitrophenylhistidine in the Solid-Phase Synthesis of the Tncosapeptides 124-146 of Human Hemoglobin (3 Chain // Biochemistry 1969 V 8 P 4344-4346

167. J I Cohen, V Shteto, R. Engel Polycations 8: the synthesis of polycatiomc nngs // Synthesis 2000 P 1263-1268

168. A R Katntzky, M S С Rao, J. Stevens Compounds with potential 2nd-order nonlinear optical-activity IIJ Heterocycl Chem 1991 V 28 P 1115-1119

169. НМ Кальтгоф, E Б Сендэл. Количественный анализ. // Москва Химия 1948

170. A. Heydenreich, G. Koellner, Н Choe, F Cordes, С. Kisker, H Schindelin, R Adamiak, U Hahn, and W Saenger The complex between nbonuclease T1 and 3'GMP suggests geometry of enzymic reaction path. An X-ray study // Eur J Biochem 19931. V 218 P.1005-1012.

171. S Lovenx, A Winqvist, R Stromberg, and J Steyaert Mechanism of RNase T1 concerted tnester-like phosphoryl transfer via a catalytic three-centered hydrogen bond // Chemistry &Biology 2000. V 7 P 651-658

172. А А Гершкович, В К Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы // Киев Наукова думка 1987

173. R Giege, В Felden, V N. Silnikov, М A Zenkova, V V Vlassov Cleavage of RNA with synthetic nbonuclease mimics II Methods Enzymol 2000 V. 318 P 147-165

174. A Riepe, H Beier, HJ Gross Enhancement of RNA self-cleavage by micellar catalysis IIFEBS Lett 1999 V 457 P 193-199

175. G A Soukur, R R Breaker Relationship between intemucleotide linkage geometry and the stability of RNA II RNA 1999 V5 P 1308-1325

176. E Westhof, P Dumas, D Moras Restrained refinement of two crystalline forms of yeast aspartic acid and phenylalaninie transfer RNA crystals // Acta Crystallogr A 1988 V l.P 112-123

177. M.A Zenkova, NG Beloglazova, VN Sil'nikov, V V. Vlassov, R Giege RNA cleavage l,4-diazabicyclo2 2 2.octane-imidazole conjugates II Methods Enzvmol 2001 V 341 P 469-490

178. EA Burakova, V N. Silnikov Molecular design of artificial nbonucleases using electrostatic interaction. // Nucleosides, Nucleotides&Nucleic Acids. 2004. V 23 P 915920

179. NG Beloglazova, VN Silnikov, MA Zenkova, VV Vlassov Cleavage of yeast tRNAPhe with complementary oligonucleotide conjugated to a small nbonuclease mimic II FEBS Lett 2000. V 481 P 277-280

180. N Beloglazova, A Vlassov, D Konevetz, M. Zenkova, V Silnikov, R Giege, V Vlassov Mechanism and specificity of RNA cleavage by chemical nbonucleases // Nucleosides&Nucleotides 1999 V 18 P. 1463-1465

181. S Rannar, F Lindgren, P Geladi, S.Wold. A PLS kernel algorithm for data sets with many variables and fewer objects Part 1 Theory and algorithm // J Chemometi ics 1994 V 8. P 111-125

182. ДА Филимонов, ДВ Акимов, В В Поройков Метод самосогласованной регрессии для количественного анализа связи структуры и свойств химических соединений //Хим-фарм журн 2004 С 21-24.

183. V Е Kuz'min, Е L Beresteckaya Atomic charges computation program by orbital electronegativities leveling method II Zh Struct Khim 1983 V 24 P 187-188

184. WL Jolly, W В Perry Estimation of Atomic Charges by an Electronegativity Equalization Procedure Calibration with Core Binding Energies // J Am Chem Soc 1973 V 95 P. 5442-5450

185. R. Wang, Y Fu, L Lai A New Atom-Additive Method for Calculating Partition Coefficients H J Chem Inf Comput Sci 1997. V 37 P 615-621.

186. А Гордон, P Форд Спутник химика //Москва «Мир» 1976

187. Р Досон, Д Эллиот, У Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика // Москва «Мир» 1991

188. В F Gisxn The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid И Anal Chim Acta 1972 V 58 P 248-249.

189. F В Breitbeil III, N Kaur, J -G Delcros, В Martin, К A Abboud, О Phanstiel IV Modeling the preferred shapes of polyamine transporter ligands and dihydromotuporamine-C mimics' shovel versus hoe // J Med Chem 2006 V 49 P 2407-2416