Конструирование и синтез низкомолекулярных искусственных рибонуклеаз, объединяющих в своей структуре гидрофобные и поликатионные фрагменты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

БУРАКОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА

КОНСТРУИРОВАНИЕ И СИНТЕЗ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ИСКУССТВЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ, ОБЪЕДИНЯЮЩИХ В СВОЕЙ СТРУКТУРЕ ГИДРОФОБНЫЕ И ПОЛИКАТИОННЫЕ ФРАГМЕНТЫ

02 00 10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2008

003171844

Работа выполнена в Инсттуте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель

дхн Сильников Владимир Николаевич

Официальные оппоненты.

дхн, профессор Куликова Валентина Филипповна к х н, доцент Халимская Людмила Михайловна

Ведущая организация Новосибирский институт органической химии им НН Ворожцова СО РАН

Защита состоится «,2.0» иьсиЯ. 2008 г. в -/V_часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045 01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт акад Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www niboch nsc ru

Автореферат разослан « 46 » u*.QJL 2008 г

ученый секретарь диссертационного совета к х н, доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярной основой организации жизни можно рассматривать нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК, являющиеся ответственными за хранение и перенос генетической информации Разработка методов направленного воздействия на нуклеиновые кислоты является одной из приоритетных задач биоорганической химии Создание реагентов, избирательно взаимодействующих с определенными нуклеиновыми кислотами, открывает возможность целенаправленной коррекции протекающих в организме биохимических процессов и селективного повреждения чужеродных нуклеиновых кислот, позволяя подавлять размножение инфекционных агентов (бактерий, вирусов, микоплазмы и т д) Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК В последние годы создано большое число низкомолекулярных соединений, вызывающих расщепление РНК в физиологических условиях Это металлокомплексы, органические соединения, содержащие аминогруппы и/или остатки имидазола, а также пептиды и пептидоподобные молекулы Тем не менее, до настоящего времени не удалось получить конструкций, обладающих активностью, близкой к активности природных ферментов Кроме того, при конструировании таких соединений не всегда учитываются требования, связанные с их практическим применением невысокая токсичность, простота синтеза, невысокая стоимость и доступность исходных реагентов, химическая стабильность

Одной из наиболее перспективных стратегий создания искусственных рибонуклеаз является конструирование низкомолекулярных синтетических катализаторов, функционально моделирующих каталитические центры природных ферментов или имитирующих процессы, протекающие при расщеплении фосфодиэфирных связей в РНК под действием ферментов или рибозимов

Целью настоящей работы являлось конструирование и синтез эффективных низкомолекулярных искусственных рибонуклеаз, объединяющих в своей структуре гидрофобные и поликатионные фрагменты, разработка малостадийных методов синтеза, позволяющих получать искусственные рибонуклеазы в препаративных количествах В ходе исследования решались следующие задачи 1) конструирование искусственных рибонуклеаз на основе бис-четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана, связанных линкерами различной структуры, отличающихся от ранее известных РНКазомиметиков отсутствием функциональных групп, характерных для каталитических центров природных ферментов; 2) разработка методов синтеза и получение комбинаторных библиотек для выявления закономерностей в строении соединений, определяющих их рибонуклеазную активность, 3) разработка препаративных методов синтеза наиболее эффективных искусственных рибонуклеаз.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые сконструированы V искусственные рибонуклеазы, не содержащие каталитически активные. /

группы. Разработан удобный и универсальный метод синтеза искусственных рибонуклеаз нового класса, позволяющий варьировать структурные элементы молекулы. Данный метод позволяет изменять число диазабициклооктановых фрагментов, длину и гибкость соединяющего их линкера, структуру заместителей у четвертичного атома азота Метод отработан для получения граммовых количеств соединений С использованием разработанных синтетических подходов получены 20 комбинаторных библиотек и 30 индивидуальных соединений, способных расщеплять РНК-субстраты.

Сравнительный анализ гидролитической активности синтезированных соединений показал, что эффективность расщепления зависит от структуры искусственных рибонуклеаз (числа 1,4-диазабицикло[2 2 2]октановых фрагментов, строения углеводородного радикала и линкера). Специфичность расщепления РНК под действием искусственных рибонуклеаз нового типа зависит как от пространственного строения РНК, так и от структуры искусственной рибонуклеазы

Синтезированные в работе соединения могут быть использованы для создания высокоэффективных противовирусных и противоопухолевых препаратов.

В литературе аналогов разработанным искусственным рибонуклеазам не описано

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ Результаты были представлены на международных конференциях "Targeting RNA Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference", Новосибирск, 2003 г, XX Украинская конференция по органической химии, Одесса, 2004 г, International Conference on Chemical Biology, Новосибирск, 2005 г, Международный симпозиум «Advanced Science in Organic Chemistry», Судак, 2006 г

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка литературы Работа изложена на 113 страницах, содержит 46 рисунков, 10 схем и 14 таблиц Библиография включает 176 литературных источника

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Конструирование и синтез искусственных рибонуклеаз на основе поликатионных соединений

Одним из подходов к созданию соединений, способных расщеплять РНК, является конструирование молекул, структурно подобных активным центрам природных рибонуклеаз Ранее, используя данную стратегию, в лаборатории органического синтеза ИХБФМ были синтезированы эффективные низкомолекулярные РНКазомиметики серии ABLkCm (рис 1), содержащие в структуре, как и природные ферменты, ряд функциональных доменов РНК-связывающий и каталитический домены, а также

гидрофобный углеводородный остаток РНК-связывающий фрагмент этих соединений состоял из одного или нескольких остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (1) Каталитический фрагмент представлял собой остаток имидазола - ключевого элемента активного центра рибонуклеазы А. Было показано, что, как и в случае природных рибонуклеаз, расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз протекает по кислотно-основному механизму каталитического гидролиза рибонуклеиновых кислот.

ГЛ

-U юп ■ClXXlb

Рис 1 Общая структура соединений искусственных рибонуклеаз АЕНкСт серии, где А - липофильный фрагмент, В - РНК-связывающий фрагмент, I. - линкер, С - каталитическая группа

Было установлено, что исключение любого элемента конструкции (гидрофобного, поликатионного или каталитического) приводит к резкому уменьшению активности РНКазомиметиков в целом Однако, если в случае исключения катионного фрагмента гидролитическая активность практически не детектируется, то при исключении гидрофобного или каталитически активного фрагментов молекулы активность сохранялась, хотя и падала в 1040 раз Поскольку даже незначительное изменение в строении каталитического центра приводит к заметному изменению активности РНКазомиметиков, можно предположить, что сохранение гидролитической активности при отсутствии в структуре каталитически активной составляющей обусловлено деполимеризацией РНК по другому механизму

В то же время известно, что ряд рибозимов гидролизует РНК, вызывая структурные изменения в мишени На настоящий момент в литературе отсутствуют сведения о низкомолекулярных соединениях, способных вносить направленные искажения в структуру нуклеиновых кислот, анализ литературных данных открывает новые пути создания эффективных катализаторов расщепления РНК

R(—о

I

Рис 2 Геометрические параметры РНК и искусственных рибонуклеаз А) и - расстояние мевду атомами фосфора соседних межнукпеотидных фосфатных групп, Э -расстояние меящу ближними -—- 2 в а четвертичными атомами азота двух останов РАВСО, соединённых линкером, Б) геометрические параметры фосфат-Б анионов и бис-четвертичного ОАВСО такого типа могут служить молекулы, содержащие положительно заряженные группы, соединённые подходящим линкером, длина которого Б приблизительно равна расстоянию между соседними межнуклеотидными фосфатами (рис 2А) В нашей работе в качестве таких групп были использованы бис-четвертичные соли 1,4-

Основой катализаторов

диазабицикло[2.2.2]октана (DABCO). Высокое сродство таких солей к фосфат-анионам обусловлено совпадением их геометрических параметров (рис 2Б)

Таким образом, для проверки нашей гипотезы были синтезированы искусственные рибонуклеазы, содержащие в структуре остатки DABCO, соединённые линкерами длиной от 4 Â до 8 Â, и гидрофобные фрагменты

2. Синтез и рибонуклеазная активность искусственных рибонуклеаз

Синтез искусственных рибонуклеаз

Линкерные группы были синтезированы, исходя из коммерчески доступных 1,2-, 1,3- и 1,4-бис(хлорметил)бензолов (2а-в, схема 1), ароматические кольца которых позволяют относительно жёстко закрепить в пространстве заряженные остатки DABCO Расстояние S между ближними четвертичными атомами азота соединений 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в (схема 1) по данным компьютерного моделирования (Hyper Chem 6 0) составляет для ор/ио-изомеров 4 34 Â, для мета - 5.61 Â и пара - 5 98 Â, соответственно Полученные значения достаточно близки к расстоянию между соседними фосфатными группами РНК, что позволяло надеяться на достижение необходимого эффекта

К соединениям 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в можно прийти двумя путями А) через получение бисчетвертичных солей За-в из 1,4-диазабициклооктана (1) и одного из изомеров бис(хлорметил)бензола (2а-в) с последующим их алкилированием алкилгалогенидами; Б) через взаимодействие моночетвертичных солей 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана 8-11 с бис(хлорметил)бензолами (2а-в), как представлено на схеме 1

Схема 1 Синтез искусственных рибонуклеаз 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в При реализации пути А (схема 1) в апротонных растворителях ОАВСО (1) гладко, с высокими выходами, взаимодействовал с бис(хлорметил)бензолами (2а-в), образуя бис-производные За-в Дальнейшее алкилирование этих соединений алкилгалогенидами связано с рядом экспериментальных трудностей в связи с тем, что соединения За-в практически не растворимы в апротонных растворителях. Попытки провести реакцию алкилирования в спиртах приводили преимущественно к образованию промежуточных соединений 12а-в - продуктов моноалкилирования, что связано с низкой растворимостью соединений 12а-в

в соответствующих растворителях Реакция в двухфазной системе вода - н-бутанол давала приемлемые выходы целевых продуктов лишь в случае низших алкилгалогенидов так, продукты 4а-в были получены алкилированием метилиодидом соединений 12а-в с выходами 80-90% Однако этот путь синтеза не позволил получить соединения с алкильными заместителями с числом атомов углерода более трех

В то же время, из литературных данных известно, что моночетвертичные соли 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана 8-11, содержащие различные алкильные заместители, могут быть получены с высокими выходами алкилированием ОАВСО алкилгалогенидами в малополярных растворителях Выход моночетвертичных солей зависит от реакционной способности алкилгалогенидов, чем и определялись температура и время взаимодействия Последующее алкилирование соединений 8-11 бис(хлорметил)бензолами (2а-в) в ацетонитриле (или диметилформамиде) привело к образованию целевых продуктов 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в с хорошими выходами, независимо от строения алкильных радикалов (путь Б, схема 1)

Таким образом, для синтеза соединений 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в мы выбрали путь Б как более универсальный Для доказательства строения и чистоты полученных соединений в работе использованы 'Н- и 3С-ЯМР-спектроскопия Приведены данные элементного анализа

2. Рибоиуклеазная активность искусственных рибонуклеаз

Гидролитическая активность синтезированных искусственных рибонуклеаз была исследована в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН Эксперименты проводились Н.А Ковалёвым под руководством д б н М А Зенковой В качестве субстрата использовали [5' -Р]-меченый 21 -звенный рибоолигонуклеотид (далее СМ21) (рис 3)

ч,

1» С, V

<-> л и и с.

Рис 3 Вторичная структура 21-звенного л-" олигорибонукпеотида 0М21 Стрелками

^ обозначены связи, расщепляемые

¿-ч, соединениями серии 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в

и и

5 1

Вторичная структура этого олигонуклеотида представляет собой шпильку, последовательность петли которой иССАСАО повторяет последовательность фрагмента 59-65 тРНКРЬе, особенно чувствительного к расщеплению природными и химическими рибонуклеазами Степень гидролиза определяли по отношению радиоактивности деполимеризованной РНК к общему количеству нанесённой на гель радиоактивности Погрешность экспериментов по расщеплению РНК-субстратов составляет не более 10%

При исследовании расщепления РНК в близких к физиологическим условиях был обнаружен ряд общих закономерностей Из представленных в табл 1 данных о степени расщепления ОЫ21 соединениями 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в за 6 ч видно, что степень расщепления зависит от строения искусственных рибонуклеаз Соединения 4а-в (К=СН3) и 5а-в (И=С4Н9) практически не проявляли рибонуклеазной активности (степень расщепления

О 5-2%) При увеличении длины липофильного остатка до шести атомов С (соединения ба-в) степень расщепления (Ж21 возрастала до 3-4% Значительное увеличение степени расщепления (24-32%) за 6 ч наблюдалось для соединений 7а-в (К=С12Н25), которые за 24 часа практически количественно расщепляют ¿N21 Этот факт хорошо согласуется с полученными ранее данными о влиянии длинного алкильного фрагмента на эффективность расщепления РНК коньюгатами на основе имидазола и 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана или каталитически активными пептидами

Таблица 1 РНК-расщепляющая активность соединений 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в

Условия реакции ОИ21 (5 мкМ) инкубировали в стандартных условиях в присутствии соединений 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в (10 мкМ) в течение 6 ч при 37 'С

Помимо алкильного заместителя, на активность искусственных рибонуклеаз влияет расположение фрагментов ОАВСО относительно бензольного кольца С наибольшей эффективностью деполимеризуют РНК-субстрат соединения, в которых остатки ОАВСО находятся в пара-положении, тогда как соответствующие орто-изомеры проявляют наименьшую активность. Различия в РНК-расщепляющей активности между изомерами соединений 4-7 наиболее отчётливо наблюдались в случае искусственных РНКаз 7а-в, содержащих протяженные алкильные заместители

Следует отметить, что соединения 4а-в, 5а-в, ба-в наиболее активно расщепляют РНК при концентрации 1 мМ, что в 100 раз выше оптимальной концентрации соединений 7а-в Тем не менее, рибонуклеазная активность соединений 4а-в, 5а-в, ба-в в оптимальных концентрациях ниже, чем у соединений 7а-в

На основании полученных данных можно заключить, что эффективность расщепления РНК зависит как от длины алкильного заместителя, так и от пространственного взаиморасположения кватернизованных остатков ОАВСО.

3. Выявление оптимальной длины алкильного радикала и структуры линкера

Для выявления корреляции между структурой и гидролитическими свойствами, для создания «идеальной рибонуклеазы», содержащей линкер и липофильный фрагмент оптимальной структуры, были синтезированы комбинаторные библиотеки и ряды искусственных рибонклеаз Конструирование и синтез комбинаторных библиотек

Для выявления оптимальной структуры заместителя нами были синтезированы комбинаторные библиотеки, содержащие соединения, подобные соединениям 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в, с различными заместителями Синтез комбинаторных библиотек проводили также, как синтез соединений 4а-в, 5а-в, ба-в, 7а-в по пути Б схемы 1, а именно, апеллированием моночетвертичных солей ОАВСО смесью бис(хлорметил)бегоолов (2а-в) или одним из изомеров в ацетонитриле Все использовавшиеся

Эффективность расщепления (%)

а б в

4 0,5 0,5 0,5

5 1 1,5 2,5

6 3 3 4

7 24 26 32

моночетвертичные соли ЭАВСО (Бк) (рис 4) легко синтезируются с высокими выходами Заместители у ОАВСО были выбраны так, чтобы они отличались по гидрофобным/гидрофильным свойствам Это короткие и длинные алифатические радикалы, ароматические и аллильный заместители, алкильные заместители, содержащие гетероатомы

Рис 4 Группы моночетвертичных солей Ок 05, содержащие н-алкильные заместители с числом атомов С 2-7, йь, содержащие н-алкильные заместители с числом атомов С 8-12 атомов, 0*, ароматические заместители и алкильные заместители, содержащие кратные связи или атомы кислорода или галогенов

Реагенты при синтезе комбинаторных библиотек брались в эквимолярных количествах, для количественного образования тетра-четвертичных солей синтез библиотек проводили при нагревании в течение 72 ч (рис 5)

Библиотека Моносоли бис(хлорметил)бензолы

ошр-БЬА 08, ОЦ ОА 2а-в

р-БЬА 08,01, ОА 2в

т-БЬА 08, 01., ОА 26

о-ви ОЭ, ОА 2а

Р-Э Ов 2в

Р-1 01. 2в

Р-А ОА 2в

р-Б!. ог.оц 2в

р-ЭА ОЭ.ОА 2в

р-ЬА 01., ОА 2в

Рис 5 Синтез комбинаторных библиотек Получившиеся комбинаторные библиотеки использовали без очистки В выбранных условиях реакция алкилирования протекает количественно, поэтому в библиотеках образуются все возможные соединения примерно в равных долях Таким образом, были синтезированы библиотека отр-БЬА, содержащая соединения на основе трёх изомеров бис(хлорметил)бензола и

* Где И - заместитель в моночетвертичной соли ОАВСО

солей ЭАВСО с заместителями трёх групп, библиотеки р-вЬА, т-БЬА, о-вЬА, содержащие соединения на основе одного из изомеров бис(хлорметил)бензола и всех солей БАВСО Также были синтезированы подбиблиотеки на основе иара-бис(хлорометил)бензола р-Б, р-Ъ, р-А Кроме того, были синтезированы библиотеки на основе пара-бис(хлорметил)бензола и моночетвертичных солей БАВСО с заместителями двух групп р-БЪ, р-БА, />-Ь,А

В ходе изучения гидролитической активности комбинаторных библиотек необходимо было синтезировать усеченные библиотеки При синтезе таких библиотек из реакции исключали одну из моночетвертичных солей ОАВСО Так были синтезированы библиотеки р-Ь-9, р-Ь-10, р-Ь-12, содержащие длинные алкильные заместители за исключением окта-, нона-, дека- или додекаметиленового заместителя, соответственно

Кроме того, возникла необходимость в синтезе индивидуального соединения 15, содержащего один короткий - этильный и один длинный -додецильный заместители Синтез тетра-четвертичной соли 15 с разными алкильными заместителями был проведён в две стадии (схема 2) Следует отметить, что на ход реакции влияет порядок введения моносоли

гл.

/~л

с

Схема 2 Синтез соединения 15

Синтез предельной библиотеки р-EL мы проводили на основе соединения 14 и смеси моночетвертичных солей группы DL, содержащих длинные заместители Усеченные библиотеки p-EL-8, р-EL-9, р-EL-10, р-EL-12, из которых был исключен один длинный заместитель, также были синтезированы на основе соединения 14

Рибонуклеазная активность комбинаторных библиотек

Рибонуклеазная активность библиотек SLA зависит от расположения DABCO относительно бензольного кольца, как и в случае индивидуальных соединений 4а-в, 5а-в, ба-в и 7а-в p-SLA библиотека проявила активность выше, чем m-SLA, o-SLA и omp-SLA библиотеки (табл 2)

Таблица 2 РНК-расщепляющая активность комбинаторных библиотек SLA

Условия реакции ON21 (5 мкМ) инкубировали в стандартных условиях в присутствии одной из библиотек (1 мМ) в течение 18 ч при 37 'С

| Эффективность расщепления (%)

I 0 т р отр

SLA 1 31 33 39 30

Поэтому объектом нашего дальнейшего изучения явились библиотеки, содержащие соединения на основе иара-бис(хлорметил)бензола

Эксперименты с подбиблиотеками (р-Б, р-Ь, р-А, р-БЬ, р-БА и р-ЬА), содержащими заместители только одной или двух групп (рис 4), демонстрируют, что гидрофобные свойства заместителей сильно влияют на рибонукпеазную активность соединений (табл 3) Среди р-Б, р-Ь и р-А подбиблиотек только р-Ь подбиблиотека проявила высокую рибонукпеазную активность. Активность р-Б и р-А подбиблиотек была в 6-10 раз ниже Эксперименты с подбиблиотеками, образованными из соединений с двумя группами заместителей (р-БЬ, р-БА и р-ЬА подбиблиотеки), также демонстрировали важность наличия длинного алкильного заместителя в структуре рибонуклеазы для гидролитической активности соединений. Наибольшую рибонуклеазную активность среди библиотек, содержащих заместители только одной или двух групп, показалар-БЬ Таблица 3 РНК-раоцепляющая активность лара-подбиблиотек.

Условия реакции ОМ21 (5 мкМ) инкубировали в стандартны* условиях в присутствии одной из комбинаторных библиотек (1 «М) в течение 24 ч при 37 С

Для того, чтобы выявить заместители, наличие которых необходимо для высокой рибонуклеазной активности р-Ь библиотеки, необходимо было изучить гидролитическую активность усеченных библиотек р-Ь-8, р-Ь-9, р-Ь-10, р-Ь-12 Для выявления кооперативного действия короткого и длинного заместителя в одной молекуле необходимо было изучить гидролитическую активность р-ЕЬ (активность которой сравнима с активностью р-вЬ библиотеки) и усеченных библиотек />-ЕЬ-8, р-ЕЬ-9, р-ЕЬ-10, р-ЕЬ-12. Самую высокую гидролитическую активность проявили библиотеки, содержащие все соединения за исключением соединений с октальным заместителем, это р-Ь-8 и р-ЕЬ-8, соответственно (табл 4) Самую низкую гидролитическую активность проявили библиотеки, содержащие все соединения за исключением соединений с додецильным заместителем, это р-Ь-12 ир-ЕЬ-12, соответственно (табл 4)

Таблица 4 РНК-расцепляющая активность р-ЭЬ. и р-Ь библиотек и их усеченных библиотек.

р-1 р-1-1 /Я. 9 p-l.ll> рЯ. р-ЕЫ Р-Е1.9 р-ЕЬ 10 Р-ЕИ2

Эффективность расщепления (%) 35 38 34 30 22 52 51 47 46 34

Условия реакции 0М21 (5 мкМ) инкубировали в стандартных условиях в присутствии одной из комбинаторных библиотек (01 мМ) в течение 8 ч при 37 'С

Анализ активности комбинаторных библиотек свидетельствует о возрастании активности с увеличением длины алкильного заместителя В то же время, наибольшую активность показали соединения, содержащие как длинные, так и короткие алкильные заместители Можно предположить, что наибольшую рибонуклеазную активность будут проявлять соединение 7в из библиотеки р-Ь и соединение 15 из библиотеки р-ЕЬ

Действительно, оба соединения проявляют высокую рибонуклеазную активность и более активны, чем соответствующие им библиотеки Для

р* р-А Р-и р-Э А р-БЬ р-и

Эффективность расцепления (%) 6 10 52 8 75 30

соединений 7в и 15 наблюдаются колоколообразная концентрационная зависимость с максимумами при 10"5 М и 3x10 М, соответственно При сравнении гидролитической активности этих соединений в оптимальных для них концентрациях соединение 15 (42% за 4 ч) обладает более высокой гидролитической активностью, чем соединение 7в (34% за 4 ч) В то время как рибонуклеазная активность соединения 7в ниже активности соединения 15 несущественно, оптимальная для расщепления концентрация соединения 7в в 30 раз ниже концентрации соединения 15 Низкая активная концентрация соединения 7в делает его привлекательным для возможного использования в качестве противовирусного агента.

Таким образом, было выявлено, что для эффективного расщепления РНК в структуре искусственной рибонуклеазы необходимо наличие хотя бы одного гидрофобного фрагмента Два гидрофобных фрагмента в структуре искусственной рибонуклеазы существенно снижают оптимальную для расщепления РНК-субстрата концентрацию, однако эффективность таких рибонуклеаз в оптимальных концентрациях оказывается несколько ниже эффективности соединений, содержащих протяженный и короткий алкильный заместители

Синтез и гидролитическая активность фторсодержащих искусственных рибонуклеаз

В связи с полученными данными по гидролитической активности для комбинаторных библиотек представлялось целесообразным ввести в структуру искусственной рибонуклеазы более гидрофобные фрагменты Замена в углеводородном радикале водорода на фтор приводит к повышению гидрофобности такого радикала, не вызывая при этом проблем с растворимостью соединений, содержащих такие группы Из литературы известно, что одна СР2 группа по гидрофобности эквивалентна 2-3 метиленовым звеньям

Синтез искусственных рибонуклеаз 17-19 (рис 6) был осуществлён по схеме 1Б из бромидов 1-перфторалкил-4-аза-1-азониабицикло[2 2 2]октанов и лг7/?д-бис(хлорметил)бензола в смеси ацетон-ацетонитрил Для доказательства строения и чистоты полученных соединений использованы 'Н-, 13С- и 19Р-ЯМР-спектроскопия

Рис 6 Структура фторсодержащих искусственных рибонуклеаз 17-19 Рибонуклеазную активность производных 17-19 и соединений 5в, 6в, 7в сравнивали в оптимальных для них концентрациях (табл. 5) Эффективность расщепления РНК для соединений 17 и 6в и соединений 19 и 7в сравнима, что коррелирует с числом атомов С в гидрофобном заместителе (7 С и 6 С, 11 С и 12 С, соответственно) Рибонуклеазная активность соединения 5в была

существенно ниже, чем активность производных 17-19, у которых примерно одинаковое число СН2 звеньев (4 СН2 у 5в, 3 СН2 у 17-19), но у соединений 17-19 существенно длиннее углеродная цепь в гидрофобном фрагменте Можно предположить, что для эффективного расщепления РНК оптимальная длина алкильного заместителя - 11-12 метиленовых звеньев, содержащих или нет атом фтора

Таблица 5 РНК-расщепляющая активность соединений 17-19,5в, 6в, 7в

Условия реакции 0№1 (5 мкМ) инкубировали в стандартных условиях в присутствии соединения 17, 5в, 6в (1 мМ), соединения 18 (01 мМ) или соединений 7в, 19 (10 мкМ) в течение 24 ч при 37 'С

17 18 19 5в 68 7в

Эффективность расщепления (%) 78 88 95 40 76 94

Соединения 17-19 могут быть интересны при изучении их биологической активности Физиологическая активность таких производных может существенно отличаться от активности соединений, не содержащих фтор

Синтез и рибонуклеазная активность искусственных рибопуклеаз, содержащих линкеры различной структуры

Для выявления оптимального расстояния между двумя остатками DABCO была синтезирована серия искусственных рибонуклеаз, отличающихся структурой линкера. Для этого мы выбрали соединения с ароматическими, алифатическими линкерами и линкерами с двойной и тройной связью

Синтез производных, содержащих линкеры с двойной, тройной связью или нафтильным фрагментом, мы проводили по схеме 1Б Были получены соединения с этильными, гексильным или додецильным заместителями с высокими выходами (схема 3,20а, б, 21а, 22,23)

17

0

гл

.. -и м

Г

о»

21а. Н-С„Н»

Схема 3 Синтез соединений 20а, б, 21а, 22,23 Несмотря на удачный пример получения серии соединений, в ходе синтеза соединений с алифатическими и бифенильным линкерами мы столкнулись с некоторыми экспериментальными трудностями

При взаимодействии моночетвертичной соли И с алифатическими дигалогенидами 28-31 в ацетонитриле вместо образований тетра-четвертичных солей наблюдалось отщепление галогенводорода от соединений 28-31, из реакционной смеси в осадок выпадает гидробромид моносоли 11 Замена растворителя на диметилформамид и повышение

температуры реакции до 80 °С позволила нам получить соединения 32-35 (п=1,2,3,4) с хорошими выходами (схема 4)

Схема 4 Синтез соединений 32-35 При синтезе тетра-четвертичной соли из дигалогенида 36 с 1-гексил-4-аза-1-азониабицикло[2 2 2]октаном (10) нам не удалось получить требуемое соединение, несмотря на варьирование температурно-временных параметров и замену растворителей В то время как тетра-четвертичная соль 37, содержащая додецильные заместители, была получена с высоким выходом (схема 5)

С.гНи-М^М7 -^ *-

II

Схема 5 Синтез соединения 37 Для доказательства строения и чистоты полученных соединений использованы 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскопия Данные элементного анализа приведены не для всех соединений, так как во многих случаях получение данных осложнялось высокой гигроскопичностью производных

При сравнении гидролитической активности соединений с различными линкерами видно, что на активность влияет расстояние между кольцами диазабициклооктана, и, кроме того, влияние оказывает жёсткость линкеров (табл. 6) Соединения 23 и 37 практически не расщепляют РНК-субстрат, в то время как соединения с такими же алкильными заместителями и сравнимыми расстояниями между атомами азота расщепляют РНК Таблица 6 РНК-расщепляющая активность соединений, содержащих различные линкеры

6а 66 6в 20а 21а 22 23 5а 32 33 34 35 37

Эффективность расщепления (%) 61 76 94 91 71 79 2 76 8 22 85 64 6

Условия реакции 0№1 (5 рМ) инкубировали в стандартных условиях в присутствии соединений 5в, 23 (1мМ) и соединений 6а-6в, 20-23,32-35,37 (10 мкМ) в течение 24 ч при 37 'С

Таким образом, на гидролитическую активность существенное влияние оказывает не только алкильный заместитель, а также расстояние между двумя бис-кватернизованными остатками диазабициклооктана

4. Влияние суммарного положительного заряда искусственных

рибонуклеаз на эффективность гидролиза РНК-субстрата

Ранее было отмечено увеличение гидролитической активности с

увеличением суммарного положительного заряда молекулы (АВЬкСт) В

своей работе авторы сравнивали гидролитическую активность двух-, трёх- и

четырёхзарядных химических рибонуклеаз Наиболее активные молекулы

несли четыре положительных заряда, как и соединения, предложенные в

данной работе Нам представлялось вероятным увеличение скорости

гидролиза РНК соединениями, несущими ещё больший положительный заряд Для проверки нашей гипотезы были синтезированы шестизарядная комбинаторная библиотека В3(о, т, р)6, содержащая три фрагмента диазабициклооктана, и восьмизарядное соединение 38, содержащее четыре фрагмента ОАВСО (рис 7)

Оз(о, ш, р^-' ^ ^

Рис 7 Комбинаторная библиотека 0з(о,т,р)6 и искусственная рибонуклеаза 38 Расщепление РНК под действием т, р) 6 проходило на 20% за 18 ч и на 10% за 24 ч под действием соединения 38 Невысокая гидролитическая активность таких соединений может быть связана с неоптимальными расстояниями между кольцами ОАВСО, с неоптимальной структурой молекулы в целом

5. Синтез соединений, содержащих функциональные группы

Природные рибонуклеазы, катализирующие расщепление фосфодиэфирных связей в РНК, содержат в своём составе функциональные группы в РНК-связывающем и РНК-гидролизующем доменах (имидазольную, амино- или карбоксильную) Путём введения в структуру искусственных рибонуклеаз функциональных групп можно повысить как эффективность расщепления РНК (при введении каталитических групп), так и специфичность узнавания РНК (при введении узнающих групп) Функциональная группа может быть введена как в заместитель в ЬАВСО, так и в линкерную часть молекулы Удобными объектами для введения функциональных групп может быть ароматическое кольцо и кратные связи линкера

Синтез соединений, содержащих функциональные группы, на основе ароматического линкера

При синтезе соединений 40 и 41, содержащих нитро- и аминогруппы, соответственно, нами была реализована следующая схема синтеза (схема 6)

Х-.»«*»)«,

42 (СН2Ь

_С1 Г

V

С1 X

2а 3»

40

Схема 6

Однако осуществить функционализацию ароматической аминогруппы -ацилирование соединения 41 хлорангидридом 42 - не удалось, что, вероятно, связано со стерическим экранированием аминогруппы со стороны ОАВСО.

Нами также был осуществлён синтез соединения 46, содержащего сложноэфирную группу (схема 7) Попытки дальнейшей функционализации карбоксильной группы в различных условиях оказались безуспешны

Схема 7

Гидролитическая активность соединений 40 и 46 была меньше, чем активность 7в (60% и 71%, 94% за 24 ч, соответственно) Поскольку дальнейшие модификации этих соединений оказались безуспешными, нами были предприняты попытки введения функциональных групп в структуру искусственных рибонуклеаз, содержащих кратную связь. Взаимодействие соединения с двойной связью с аминами

Активированная двойная связь является удобным объектом для введения различных функциональных групп с использованием реакций щшюприсоединения, нуклеофильного присоединения и т.д Алифатические амины сравнительно гладко присоединяются по активированной двойной связи в мягких условиях даже в отсутствие катализатора и без нагревания В связи с этим представлялось интересным исследовать возможность введения функциональных заместителей в искусственные рибонуклеазы через реакцию присоединения аминов по двойной связи в соединениях 20а и 21а

При взаимодействии метиламина с соединением 20а или 21а в дейтерированном метаноле при комнатной температуре в 'Н-ЯМР спектре реакционной смеси мы наблюдали ряд изменений На основании этих данных в совокупности с данными С13-, 'H-COSY-ЯМР и хроматомасс-спектрометрии была предложена следующая схема реакции (схема 8) В присутствии метиламина соединения 20а, 21а, независимо от изомера, превращаются в соединения 47 и 11 Аналогичные превращения происходят с соединениями 20а, 21а под действием 1,3-диаминопропана, З-амино-1-пропанола или КОН в дейтерированном метаноле

С1гНя

MeNH2

C„H„—N

"¿\_У/

\-/ 21. л II

Схема 8 Взаимодействие соединений 20а, 21а с метиламином в СЭзОО за 20 ч

Известно, что четвертичные соли некоторых циклических аминов реагируют с нуклеофилами по трём направлениям дезалкилирование, раскрытие цикла по реакции Гофмана и раскрытие цикла реакцией

нуклеофильного замещения Соединения 47 и 11, образующиеся в ходе реакции, не соответствуют продуктам реакций дезалкилирования или раскрытию цикла реакцией нуклеофильного замещения В то же время, классический вариант реакции Гофмана предполагает наличие умеренно сильного основания, положительно заряженного атома азота и атома водорода в р-положении к атому азота, превращения четвертичных солей циклических аминов проходят в довольно жестких условиях при 130°С в метаноле (в запаянной ампуле) В нашем случае, вероятнее всего, как и в случае реакции Гофмана, происходит атака по атому водорода с последующей миграцией двойной связи с образованием бутадиеновой системы

С целью изучить влияние условий реакции взаимодействия аминов с соединениями, содержащими двойную связь, на её протекание, выдержали соединение 206 с эквивалентным количеством различных аминов в течение 20 ч, недели при комнатной температуре, затем при нагревании до 75 °С в течение 8 ч в 020 и в 0М5О-Э6

В присутствии метиламина, 1,3-диаминопропана, н-бутиламина, 1,8-диазабицикло[5 4 0]ундец-7-ена реакция начинается даже без нагревания, в зависимости от растворителя требуется различное время инкубации Под действием триэтиламина реакция проходит количественно за 20 ч в воде, в то время как в БМБО требуется нагревание. В присутствии этилендиамина, бензил амина или гистамина в БМБО наблюдается образование следовых количеств соединений 47 и 11 даже после длительной инкубации, в воде реакция идёт значительно быстрее, например, для этилендиамина за 20 ч превращение наблюдается уже для 68 % соединения 206 В то же время, в присутствии анилина и имидазола при комнатной температуре реакция не начиналась даже после двухнедельной инкубации не зависимо от растворителя; превращение на 50% происходило после 8 ч при 75 °С По-видимому, главное значение в этой реакции имеет основность амина и наличие гидроксид-ионов, что видно при сравнении скорости реакции и рКь этих аминов

Таким образом, путь введения заместителей в линкерную группу, соединяющую остатки БАВСО, следует признать неперспективным Второй подход - введение функциональных групп в алкильный заместитель искусственных рибонуклеаз- будет, скорее всего, более удачным, так как он позволяет избежать стерических эффектов Второй подход не входит в задачи данной работы, так как в этом случае синтез усложняется и проводится более чем в четыре стадии

6. Сиквенс-специфичность расщепления РНК под действием соединений 7в и 15. Антивирусная активность искусственных рибонуклеаз.

Для практического использования полученных искусственных рибонуклеаз важно изучить помимо эффективности расщепления РНК-субстрата сиквенс-специфичность

Исследование сиквенс-специфичности расщепления РНК соединениями 7в и 15 (одними из самых активных искусственных рибонуклеаз) было проведено на РНК-мишенях различной структуры. 21-звенном олигорибонуклеотиде (Ж21, дрожжевой тРНКР11С, 96-звенном фрагменте РНК

HIVl и 190-звенном фрагменте мРНК MDR1 Степень расщепления по каждой определённой фосфодиэфирной связи зависит как от первичной структуры, так и от вторичной структуры РНК Под действием этих соединений гидролизу наиболее эффективно подвергаются фосфодиэфирные связи в 5'-СрА и 5'-UpA последовательностях, расположенных в одноцепочечных фрагментах РНК, которые также чувствительны к расщеплению и другими природными и химическими рибонуклеазами Во всех четырёх исследованных РНК расщепляются с большей эффективностью связи, локализованные в областях резких изгибов РНК (переход стебель -петля, петли или перекрёстки)

На основании анализа данных по расщеплению четырёх РНК, можно сделать вывод, что на специфичность расщепления влияет как пространственное строение субстрата, так и структура искусственной рибонуклеазы Например, в 96-звенном фрагменте HIV1 РНК связь C55-G56, расположенная в однонуклеотидной боковой петле, является одной из наиболее расщепляемых связей В то же время, в других субстратах C-G фосфодиэфирные связи либо не расщепляются вовсе, либо их доля очень незначительна (в трёх других субстратах нет расположенных в однонуклеотидной боковой петле CpG связей), что говорит о структурно-зависимом расщеплении РНК Во всех экспериментах по расщеплению ON21 наблюдалось преимущественное расщепление в СрА мотивах, С10-А11 и С12-А13, расположенных в петле (рис 3) Причём, соединение 7в с большей скоростью расщепляет С12-А13, а соединение 15 - С10-А11, что позволяет говорить о влиянии строения искусственной рибонуклеазы на специфичность расщепления РНК-субстрата Таким образом, соединения проявляют специфичность к последовательности РНК, что является перспективным в свете использования их как противовирусных агентов

Исследования противогриппозной активности искусственных рибонуклеаз проводилось в Одесском противочумном институте им Мечникова в лаборатории иммунобиологических и химиотерапевтических соединений под руководством к м н В П Лозитского Некоторые соединения (5в, 34) были проверены в тестах на противовирусную активность Предварительные эксперименты проводили m vitro на модели репродукции вируса А/Гонконг/1\168 (H3N2) в переживающей культуре ткани хорион-аллантоисных оболочек (chorioallantoic membranes, ССМ) 12-14 дневных куриных эмбрионов ССМ были инфицированы 1000 T1D50 (tissue infection dose) вируса гриппа Соединения 34 и 5в, растворённые в «специальной среде» в 10'3 M концентрации, ингибировали репликацию вируса гриппа с эффективностью 5,4 и 0,17 log)0 ТГО50, соответственно Активность соединения 34 превосходит активность известных противовирусных препаратов ремантадина и дейтифорина, использовавшихся в качестве контроля Эти данные позволяют говорить о практическом применении таких соединений

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 02-04-48664, 0404-48566, 07-04-00990, программ фундаментальных исследований РАН "Происхождение и эволюция биосферы", "Фундаментальные науки -медицине"

выводы

1 Сконструирован новый класс искусственных рибонуклеаз на основе бис-четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана, соединенных линкерами различной длины и жесткости, не содержащих в своей структуре каталитически активные группы, характерные для природных ферментов

2 Разработана универсальная стратегия синтеза предложенных искусственных рибонуклеаз в мультиграммовых количествах из моночетвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2 2]октана С использованием разработанных синтетических подходов получены 20 комбинаторных библиотек и 30 индивидуальных соединений, способных расщеплять РНК-субстраты.

3 Проведён анализ "структура - РНК гидролизующая активность" полученных соединений Показано, что эффективность расщепления зависит от числа 1,4-диазабицикло[2 2 2]октановых фрагментов, строения углеводородного радикала и линкера. Наибольшей активностью обладают тетрагалогениды 1,4-бис-[(4-додецилазониа-1-азониабицикло[2 2 2]октил)метил]бензола и 1-[(4-этилазониа-1-азониабицикло[2 2 2]октил)метил]-4-[(4-додецилазониа-1-азониабицшсло[2 2 2]октил)метил]бензола, 1,5-бис-{4-додецилазониа-1 -азониабицикло[2 2 2]октил)пентана, (£)-1,4-бис-{4-додецилазониа-1 -азониабицикло[2 2 2]октил)бут-2-ена, содержащие в своей структуре два бис-кватернизованных остатка 1,4-диазабицикло[2 2 2] октана, связанных линкерами на основе пара-ксилола, н-пентана, транс-бут-2-ена, соответственно, и один или два додецильных фрагмента

4 Показано, что специфичность расщепления РНК под действием новых искусственных рибонуклеаз зависит как от пространственного строения РНК, так и от структуры искусственной рибонуклеазы Расщеплению преимущественно подвергаются фосфодиэфирные связи, локализованные в областях резких изгибов РНК, в большинстве случаев в СрА и 11рА, а также СрО последовательностях На примере структурированного двадцатиодногозвенного олигорибонуклеотида показано изменение основного сайта гидролиза в зависимости от структуры искусственной РНКазы

5 Предварительные эксперименты по ингибированию репликации вируса гриппа в присутствии тетрагалогенида 1,5-бис-(4-додецилазониа-1-азониабицикло[2 2 2]октил)пентана показали, что его противогриппозная активность превосходит активность известных противовирусных препаратов - ремантадина и дейтифорина

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. ЕA Burakova. VN Silnikov Molecular design of artificial ribonucleases using electrostatic interaction II Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2004. V 23 N 6-7 P 915-920

2 E.A Буракова, BH Сильников Взаимодействие 14,54-дидодецил-1(1),5(1)-ди-1,4-диазабицикло[2 2 2]октанагексафан-3-ена с алифатическими аминами // Труды 2-ого международного форума «Актуальные проблемы современной науки» Естественные науки Самара СГТУ 2006 Ч 29 С. 611

3 ЕА Буракова, Д А Коневец, Н.А Ковалев, М А Зенкова, В Н Сильников Конструирование и синтез поликатионных соединений на основе 1,4-диазабициклооктана, расщепляющих РНК // Труды международной конференции "Физико-химическая биология" Новосибирск. APTA. 2006 С. 90-91

4 N Kovalev, Е Burakova. V Silnikov, М Zenkova, V. Vlassov Artificial ribonucleases from combinatorial libraries to efficient catalysts of RNA cleavage // Bioorg Chem 2006 V 34. P 274-286.

5 ЕА Буракова, H А Ковалев, И Л Кузнецова, М А Зенкова, В В Власов, В Н Сильников Поликатионные катализаторы расщепления фосфодиэфирных связей в РНК на основе 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана // Биоорган химия 2007 Т, 33 № 5. С 563-570

6 ЕА Буракова, AB Рогоза, ВН Сильников Синтез фтор-содержащих искусственных рибонуклеаз // Труды 3-ого международного форума «Актуальные проблемы современной науки» Естественные науки Самара СГТУ 2007 Ч 11. С IIIS

7 Л С Королева, ЕА Буракова. А С Федчук, В П. Лозитский, В Н Сильников Искусственные рибонуклеазы как альтернатива известным противовирусным препаратам // Труды 3-ого международного форума «Актуальные проблемы современной науки» Естественные науки Самара СГТУ 2007 Ч 11 С 6570

Изд Лиц ИД № 04060 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 15 05 2008 Формат 60x84/16 Бумага №1 Гарнитура "Times New Roman" Печать офсетная. Печ. л 1,0 Уч-изд л 1,0 Тираж 120 Заказ №73 Институт неорганической химии им А В Николаева СО РАН Просп. Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С РИБОНУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Структурные характеристики РНК и типы межмолекулярных взаимодействий

1.1.1. Структура РНК

1.1.2. Типы взаимодействий лигандов с РНК

1.1.2.1 Водородные связи.

1.1.2.2. Электростатические взаимодействия. ^

1.1.2.3.7Г-Стекингвзаимодействия.

1.1.2.4. Гидрофобные взаимодействия.

1.2. Лиганды, взаимодействующие с РНК

1.2.1. Лиганды, образующие водородные связи с РНК

1.2.2. Поликатионные молекулы

1.2.2.1 Полиамины

1.2.2.2. Пептиды и пептидоподобные молекулы *

1.2.2.3. Малобороздочные лиганды ДНК

1.2.2.4. Аминогликозиды

1.2.3. Интеркаляторы

1.2.4. Лиганды, узнающие диольный фрагмет

ГЛАВА 2. КОНСТРУИРОВАНИЕ И СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ

НА ОСНОВЕ ПОЛИКАТИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ (РЕЗУЛЬТАТЫ И

ОБСУЖДЕНИЕ)

2.1. Конструирование искусственных рибонуклеаз •

2.2. Синтез и рибонуклеазная активность искусственных рибонуклеаз

2.2.1. Синтез искусственных рибонуклеаз

2.2.2. Рибонуклеазная активность искусственных рибонуклеаз

2.3. Выявление оптимальной длины алкильного радикала и структуры линкера

2.3.1. Конструирование и синтез комбинаторных библиотек

2.3.2. Рибонуклеазная активность комбинаторных библиотек

2.3.3. Синтез и гидролитическая активность фторсодержащих искусственных рибонуклеаз

2.3.4. Синтез искусственных рибонуклеаз, содержащих линкеры различной структуры

2.3.5. Рибонуклеазная активность искусственных рибонуклеаз, содержащих линкеры различной структуры

2.4 Влияние суммарного положительного заряда искусственных рибонуклеаз на эффективность гидролиза РНК-субстрата

2.5. Введение функциональных групп в структуру искусственных рибонуклеаз

2.5.1. Введение функциональных групп в соединения, содержащие ароматический линкер

2.5.2. Взаимодействие соединений 86а,б и 87а, содержащих двойную связь, с аминами

2.6. Сиквенс-специфичность расщепления РНК под действием соединений 73в и

2.7. Антивирусная активность искусственных рибонуклеаз

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 74 ВЫВОДЫ 89 БЛАГОДАРНОСТИ ^ ° 91 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92 ПРИЛОЖЕНИЕ

Список сокращений

В настоящей работе использованы следующие обозначения:

НК - нуклеиновая кислота

ПНК - пептидно-нуклеиновая кислота рРНК- рибосомная РНК тРНК - транспортная РНК

DABCO- 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан

DOS - дезоксистрептамин

HIV - вирус иммунодефицита человека

RRE - Rev-чувствительный регуляторный элемент (Rev responsive element)

TAR - трансактивируемый регуляторный элемент (Trans-Activation Responsive element)

SPR - метод поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance)

DBU - 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен

Bu - бутил

Hex - гексил

Молекулярной основой организации жизни можно считать нуклеиновые кислоты -ДНК и РНК, являющиеся ответственными за хранение и перенос генетической информации. Соединения, способные избирательно взаимодействовать с определенными нуклеиновыми кислотами, представляют интерес для решения ряда задач молекулярной биологии. Небольшие молекулы, расщепляющие фосфодиэфирные связи в РНК в физиологических условиях, могут быть использованы для исследования структуры РНК и РНК-белковых комплексов в растворе [1]. Искусственные рибонуклеазы также могут стать высокоэффективными противовирусными препаратами [2]. Таким образом, синтез новых искусственных рибонуклеаз является актуальной задачей, тем более что количество эффективных малотоксичных противовирусных препаратов ограниченно.

За последнее время было создано большое число низкомолекулярных соединений, вызывающих расщеиление РНК в физиологических условиях [3]. Одной из удачных стратегий при разработке таких реагентов является конструирование химических молекул, функционально моделирующих каталитические центры или имитирующих ' процессы, протекающие в активных центрах природных ферментов, которые с высокой эффективностью расщепляют фосфодиэфирные связи в РНК [4]. Другой перспективной стратегией может оказаться синтез катализаторов, моделирующих процессы, происходящие при расщеплении нуклеиновых кислот рибозимами - природными катализаторами небелковой природы, которые способны ускорять гидролиз РНК за счёт изменения её геометрии. В качестве основы катализаторов такого типа могут выступать поликатионные молекулы, способные с высокой эффективностью воздействовать на нуклеиновые кислоты за счет взаимодействия с отрицательно заряженным' сахаро-фосфатным остовом РНК. Выбор структуры поликагионных молекул можно ' сделать исходя из анализа литературы по соединениям, обладающим повышенным сродством к РНК, и накопленному в лаборатории органического синтеза ИХБФМ материалу по изучению взаимосвязи "структура-расщепляющая активность" различных рядов искусственных рибонуклеаз. Также при конструировании таких соединений нужно учитывать ряд требований, связанных с их практическим применением: невысокая токсичность, простота синтеза, невысокая стоимость и доступность исходных реагешов, химическая стабильность. ' 1

Целью настоящей работы являлось конструирование и синтез эффективных низкомолекулярных искусственных рибонуклеаз, объединяющих в своей структуре гидрофобные и поликатионные фрагменты; разработка малостадийных методов синтеза, позволяющих получать искусственные рибонуклеазы в препаративных количествах. В ходе исследования решались следующие задачи: конструирование искусственных рибонуклеаз на основе бис-четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, связанных линкерами различной структуры, отличающихся от ранее известных РНКазомиметиков отсутствием функциональных групп, характерных для каталитических центров природных ферментов; разработка методов синтеза и получение комбинаторных библиотек для выявления закономерностей в строении соединений, определяющих их рибонуклеазную активность; разработка препаративных методов синтеза наиболее эффективных искусственных рибонуклеаз.

Выводы

1. Сконструирован новый класс искусственных рибонуклеаз на основе бис-четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, соединенных линкерами различной длины и жесткости, не содержащих в своей структуре каталитически активные группы, характерные для природных ферментов.

2. Разработана универсальная стратегия синтеза предложенных искусственных рибонуклеаз в мультиграммовых количествах из моночетвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана. С использованием разработанных синтетических подходов получены 20 комбинаторных библиотек и 30 индивидуальных соединений, способных расщеплять РНК-субстраты.

3. Проведён анализ "структура - РНК гидролизующая активность" полученных соединений. Показано, что эффективность расщепления зависит от числа 1,4-диазабицикло[2.2.2]октановых фрагментов, строения углеводородного радикала и линкера. Наибольшей активностью обладают тетрагалогениды 1,4-бис-[(4-додецилазониа- 1-азониабицикло[2.2.2]октил)метил]бензола и 1 -[(4-эти'лазониа-1 -азониабицикло[2.2.2]октил)метил]-4-[(4-додецилазониа-1азониабицикло[2.2.2]октил)метил]бензола, 1,5-бис-(4-додецилазониа-1азониабицикло[2.2.2]октил)пентана, {Е)-1,4-бис-(4-додецилазониа-1 азониабицикло[2.2.2]октил)бут-2-ена, содержащие в своей структуре два бис-кватернизованных остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, связанных линкерами на основе «ара-ксилола, н-пентана, транс-бут-2-епа, соответственно, и один или два додецильных фрагмента. ' "

4. Показано, что специфичность расщепления РНК под действием1 "новых искусственных рибонуклеаз зависит как от пространственного строения РНК, так и от структуры искусственной рибонуклеазы. Расщеплению преимущественно подвергаются фосфодиэфирные связи, локализованные в областях резких изгибов РНК, в большинстве случаев в СрА й ирА, а также СрО последовательностях. На примере структурированного двадцатиодногозвенного олигорибонуклеотида показано изменение основного сайта гидролиза в зависимости от структуры искусственной РНКазы.

5. Предварительные эксперименты по ингибированию репликации вируса гриппа в присутствии тетрагалогенида 1,5-бис-(4-додецилазониа-1-азониабицикло[2.2.2]октил)пентана показали, что его противогриппозная активность превосходит активность известных противовирусных препаратов -ремантадина и дейтифорина.

БЛАГОДАРНОСТИ 1» j

Автор благодарит своих коллег и соавторов, сотрудников лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН - д.б.н. М.А. Зенкову, к.б.н. И.Л. Кузнецову, H.A. Ковалёва - за изучение гидролитической активности искусственных рибонуклеаз.

Сотрудников лаборатории иммунобиологических и химиотерапевтических соединений украинского научно-исследовательского противочумного института им. И. И. Мечникова (г. Одесса) под руководством к.м.н. В.П. Лозицкого за исследование противогриппозной активности искусственных рибонуклеаз. i i

Сотрудников лаборатории физических методов исследования НИОХ СО РАН к.х^н. В.И. Маматюка, В.В. Кандаурову и А.Б. Скорову за регистрацию ЯМР-спектро'в, В.Г. Васильева за регистрацию масс-спектров, сотрудников лаборатории микроанализа НИОХ СО РАН за элементный анализ.

Сотрудников лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН.

Особая благодарность научному руководителю Сильникову Владимиру Николаевичу за помощь и терпение на всех этапах работы.

1. Kolchanov, N.A., Titov, I.I., Vlassova, I.E., Vlassov, V.V. Chemical and computer probing of RNA structure // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1996. V. 53. P. 131-196.

2. DNA and RNA cleavers and chemotherapy of Cancer and viral diseases // NATO ASI Ser., Ser. C. 1996. V. 479. 379 p.

3. Zenkova, M.A. Artificial ribonucleases. In Nucleic Acids and Molecular Biology. Heidelberg Varlag. 2004. V. 13.

4. Сильников, B.H., Власов, B.B. Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кислот // Успехи химии. 2001. Т. 70. С. 562-580.

5. Ren, J., Chaires, J.B. Sequence and structural selectivity of nucleic acid binding ligands // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 16067-16075.

6. Hermann, T. Strategies for the design of drugs targeting RNA and RNA-protein compexes // Angcw. Chem., Int. Ed. 2000. V. 39. P. 1890-1905.

7. Зенгер, В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. Пер. с англ. Под ред. Б.К. Вайнштейна. М.: Мир, 1987. 584 с.

8. Muller, A., Talbot, F., Leutwyler, S. Hydrogen bond vibrations of 2-aminopyridine*2-pyridone, a Watson-Crick analogue of adenine*uracil // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 14486-14494.

9. Chow, C., Bogdan, E.M. A structural basis for RNA-ligand interactions // Chem. Rev. 1997. V. 97. P. 1489-1513.

10. Hermann, Т., Westhof, E. RNA as a drug target: chemical, modeling, and evolutionary tools // Curr. Opinion Biotech. 1998. V. 97. P. 66-73.

11. Afshar, M., Prescott, C.D., Varant G. Structure-based and combinatorial search, for new RNA-binding drugs // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V. 10. P. 59-63. '; ■

12. Wilson, W.D., Li, K. Targeting RNA with small molecules // Curr. Med. Chem. 2000. V. 7. P. 73-98.•j *

13. Charles, I., Xi, H., Arya, D.P. Sequence-specific targeting of RNA with an oligonucleotide-neomycin conjugate// Bioconjugate Chem. 2007. V. 18. P. 160-169.

14. Venkatesan, N., Kim, B.H. Peptide conjugates of oligonucleotides: synthesis andapplications // Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 3712-3761. ;i 1 3

15. Schmidtchen, F.P., Berger, M. Artificial organic host molecules for anions // Chem: Rev. 1997. V. 97. P. 16099-16460.

16. Шабарова, З.А., Богданов, А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М.: Химия, 1978. 582 с.

17. Carlson, С.В., Stephens, О.М., Beal, P.A. Recognition of double-stranded RNA by proteins and small molecules//Biopolymers. 2003. V. 70. P. 86-102.

18. Neidle, S., Nunn, C.M. Crystal structures of nucleic acids and their drug complexes // Natural Product Rep. 1998. V. 15. P. 1-15.

19. Piantanida, I., Tomisic, V., Zinic, M. 4,9-Diazapyrenium cations. Synthesis, physico-chemical properties and binding of nucleotides in water // J7 Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 2000. P. 375-383.

20. Mertz, E., Mattei, S., Zimmerman, S.C. Synthetic receptors for CG base pairs // Org. Letters.i '2000. V. 2. P. 2931-2934.

21. Lecubin, F., Benhida, R., Fourrey, J.-L., Sun, J.-S. NMR recognition studies of CG base pairsi'by new easily accessible heterobicyclic systems // Tetrahedron Lett. 1999. V. 40. P. 8085-8088.

22. Vourloumis, D., Takahashi, M., Simonsen, K.B., Ayida, B.K., Barluenga, S., Winters, G.C., Hermann, T. Solid-phase synthesis of benzimidasole libraries biased for RNA targets // Tetrahedron Lett. 2003. V. 44. P. 2807-2811.

23. Amemiya, S., Buhlmann, P., Umezawa, Y. Fluoresccnce-mediated sensing of guanosine derivatives based on multitopic hydrogen bonding // Chem. Commun. 1997. P. 1027-1028.

24. Lin, K.-Y., Jones, R.J., Matteucci, M. Tricyclic 2'-deoxycytidine analogs: syntheses and incorporation into oligodeoxynucleotides which have enhanced binding to complementary RNA Hi. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 3873-3874.

25. Flanagan, W.M., Wolf, J.J., Olson, P., Grant, D., Lin, K.-Y., Wagner R.W., Matteucci M.D. A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 3513-3518.

26. Lin, K.-Y., Matteucci, M.D. A cytosine analogue capable of clamp-like binding in helical nucleic acids//J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 8531-8532.

27. Frydman, L., Rosomando, P.C., Frydman, V., Fernandez, C.O., Frydman, В., Samejima, K. Interactions between natural polyamines and tRNA: an 15N NMR analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 9186-9190.

28. Frydman, B., Westler, W.M., Samejima, K. Spermine binds in solution to the TwC Loop of tRNAphe: evidence from a 750 MHz 'H-NMR analysis // J. Org. Chem. 1996. V. 61. P. 25882589.t i

29. Amarantos, I., Kalpaxis, D.L. Photoaffinity polyamines: interactions with AcPhe-tRNA free in solution or bound at the P-site of escherichia coli ribosomes // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3733-3742.

30. Heerschap, A., Walters, J.A., Hilbers, C.W. Influence of the polyamines spermine and spermidine on yeast tRNAPhe as revealed from its imino proton NMR spectrum // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 983-998.

31. Bibillo, A., Figlerowicz, M., Kierzek R. The non-enzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides VI. The role of biogenic polyamines // Nucleic Acids Res. 1999. ,V. 27. P. 3931-3937.

32. Komiyama, M., Yoshinari, K. Kinetic analysis of diamine-catalyzed RNA hydrolysis // J. Org. Chem. 1997. V. 62. P. 2155-2160.

33. Hammann, C., Hormes, R., Sczakiel, G., Tabler, M. A spermidine-induced conformational change of long-armed hammerhead ribozymes: ionic requirements for fast cleavage kinetics // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4715-4722.

34. Aguilar, J., Di'az, P., Escarti, F., Garcia-Espana, E., Gil, L., Soriano, C., Verdejo, B. Cation and anion recognition characteristics of open-chain polyamines containing ethyleriic and propylenic chains // Inorg. Chim. Acta. 2002. V. 339. P. 307- 316.

35. Chand, D.K., Schneider, H.-J., Aguilar, J.A., Escarti, F., Garcia-Espana, E., Luis, S.V. Copper complexes of polyazan.cyclophanes and their interaction with DNA and RNA // Inorg. Chim. Acta. 2000. P. 71-78.

36. McConnaughie, A.W., Spychala, J., Zhao, M., Boykin, D., Wilson, W.D. Design and synthesis of RNA-specific groove-binding cations: implications for antiviral drug design // J. Med. Chem. 1994. V. 37. P. 1063-1069. "

37. Lomadze, N., Schneider, H.-J. Reversal of polyamine selectivity for DNA and RNA by steric hindrance // Tetrahedron Lett. 2002. V. 43. P. 4403-4405. "i' i

38. An, H., Haly, B.D., Cook, P.D. New piperazinyl polyazacyclophane scaffolds. Libraries and biological activities // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. V. 8. P. 2345-2350.

39. Hwang, S., Tamilarasu, N., Ryan, K., Huq, I., Richter, S., Still, W.C., Rana, T.M. Inhibition of gene expression in human cells through small molecule-RNA interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 12997-13002.

40. Tamilarasu, N., Huq, I., Rana, T.M. Design, synthesis, and biological activity of a cyclic peptide: an inhibitor of HIV-1 Tat-TAR interactions in human cells // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. V. 10. P. 971-974.

41. Hamy, F., Felder, E.R., Heizmann, G., Lazdins, J., Aboul-ela, F., Varani, G., Karn, J., Klimkait, T. An inhibitor of the Tat/TAR RNA interaction that effectively suppresses HIV-1 replication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 3548-3553. *

42. Wang, X., Huq, I., Rana, T.M. HIV-1 TAR RNA by an unnatural biopolymer // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 6444-6445.

43. Tamilarasu, N., Huq, I., Rana, T.M. High affinity and specific binding of HIV-1 TAR RNA by a tat-derived oligourca // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 1597-1598.

44. Kesavan, V., Tamilarasu, N., Cao, H., Rana, T.M. A new class of RNA-binding oligomers:'peptoid amide and ester analogues // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. P. 1171-1175.

45. Tamilarasu, N., Huq, I., Rana, T.M. Targeting RNA with peptidomimetic oligomers in human cells // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. P. 505-507.

46. Lawton, G.R., Appella, D.H. Nonionic side chains modulate the affinity and specificity of binding between functionalized polyamines and structured RNA // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 12762-12763.

47. Dietrich, B., Fyles, T.M., Lehn, J.M., Pease, L.G., Fyles, D.L. Anion receptor molecules.i

48. Synthesis and some anion binding properties of macrocyclic guanidinium salts // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1978. V. 21. P. 934-936.

49. Galan, A., Pueyo, E., Salmeron, A., De Mendoza, J. Selective complexation of adenosine monophosphate nucleotides by rigid bicyclic guanidinium abiotic receptors // Tetrahedron Lett. 1991. V. 32. P. 1827-1830.

50. Jubian, V., Dixon, R.P., Hamilton, A.D. Molecular recognition and catalysis. Acceleration of phosphodiester cleavage by a simple hydrogen-bonding receptor // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 1120-1121.

51. He, G.-X., Browne, K.A., Groppe, J.C., Blasko, A., Mei, H.-Y., Bruice, T.C.i .i

52. Microgontropens and their interactions with DNA. 1.Synthesis of the tripyrrole peptides Dien-Microgontropen-a,-b,-c and characterization of their interactions with dsDNA // J. Am. <Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 7061-7071.

53. Bando, T., Narita, A., Sugiyama, H. Highly efficient sequence-specific DNA interstrand cross-linking by pyrrole/imidazole CPI conjugates // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 34713485.

54. Wang, L., Bailly, C., Kumar, A., Ding, D., Bajic, M., Boykin, D.W., Wilson ,W.D. Specificj i imolecular recognition of mixed nucleic acid sequences: an aromatic dication that binds in thev '

55. DNA minor groove as a dimmer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 12-16.r

56. Dervan, P.B. Molecular recognition of DNA by small molecules // Bioorg. Med. Chem. 2001. V. 9. P. 2215-2235.

57. Wilson, W.D., Ratmeyer, L., Zhao, M., Strekowski, L., Boykin, D. The search for structure-specific nucleic acid-interactive drugs: effects of compound structure on RNA versus DNA interaction strength // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 4098-4104.

58. Tanious, F.A., Veal, J.M., Buczak, H., Ratmeyer, L.S., Wilson, W.D. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) binds differently to DNA and RNA: minor-groove binding at AT sites and intercalation at AU sites // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 3103-3112.

59. Rubin, J., Sundaralingam, M. An unexpected major groove binding of netropsin and distamycin A to tRNA(phe) // J. Biomol. Struct. Dyn. 1984. V. 2. P. 165-174.L

60. Zakrzrewska, K., Pullman, B. Theoretical exploration of netropsin binding to tRNA(Phe).// J. Biomol. Struct. Dyn. 1985. V. 2. P. 737-743.

61. Bailly, C., Colson, P., Houssier, C., Hamy, F. The binding mode of drugs to the TAR RNA of HIV-1 studied by electric linear dichroism // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 1460-1464.

62. Sadat-Ebrahimi, S. E., Wilton, A. N., Douglas, K. T. Unique binding site for bis-benzimidazoles on transfer RNA // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1997. P. 385-386.

63. Dassonneville, L., Hamy, F., Colson, P., Houssier, C., Bailly, C. Binding of Hoechst 33258 to the TAR RNA of HIV-1. Recognition of a pyrimidine bulge-dependent structure // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4487-4492.

64. Helm, M., Kopka, M.L., Sharma, S.K., Lown, J.W., Giege, R. Rnase activity of DNA minor groove binder with a minimalist catalytic motif from Rnase A // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2001. V. 281. P. 1283-1290.

65. Botto, R.E., Coxon, B. Nitrogen-15 nuclear magnetic resonance spectroscopy of neomycin B and related aminoglycosides // J. Am. Chem. Soc. 1983. V. 105. P. 1021-1028.

66. Yoshizawa, S., Fourmy, D., Eason, R. G., Puglisi, D. Sequence-specific recognition of the major groove of RNA by deoxystreptamine // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 6263-6270.

67. Recht, M. I., Fourmy, D., Blanchard, S. C., Dahlquist, K. D., Puglisi, J. D. RNA sequence determinants for aminoglycoside binding to an A-site rRNA model oligonucleotide // J. Mol. Biol. 1996. V. 262. P. 421-436.

68. Nature. 1991. V. 353. P. 368-370.

69. Hermann, T., Westhof, E. Aminoglycoside binding to the hammerhead ribozyme: a general model for the interaction of cationic antibiotics with RNA // J. Mol. Biol. 1998. V. 276. P. 903912.

70. Stage, T.K., Hertel, K.J., Uhlenbeck, O.C. Inhibition of the hammerhead ribozyme by neomycin//RNA. 1995. V. 1. P. 95-101.

71. Clouet-d'Orval, B., Stage, T.K., Uhlenbeck, O.C. Neomycin inhibition of the hammerheadinribozyme involves ionic interactions // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 11186-11190.

72. Hermann, T., Westhof, E. Saccharide-RNA recognition // Biopolymers. 1998. V. 48. P. 155166.

73. Zapp, M.L., Stern, S., Green, M.R. Small molecules that selectively block RNA binding of HIV-1 Rev protein inhibit Rev function and viral production // Cell. 1993 V. 74. P. 969-978.

74. Mei, H.-Y., Galan, A.A., Halim, N.S., Mack, D.P., Moreland, D.W., Sanders, K.B.,' fruong, H., Czarnik, A.W. Inhibition of an HIV-1 Tat-derived peptide RNA by aminoglycoside antibiotics // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995. V. 5. P. 2755-2760.

75. Wang, S., Huber, P. W., Cui, M., Czarnik, A. W., Mei, H.-Y. Binding of neomycin to the TAR element of HIV-1 RNA induces dissociation of Tat protein by an allosteric mechanism // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 5549-5557.

76. Tassew, N., Thompson, M. Binding affinity and inhibitory potency of neomycin and streptomycin on the Tat peptide interaction with HIV-1 TAR RNA detected by on-line acoustic wave sensor// Org. Med. Biomol. Chem. 2003. V. 1. P. 3268-3270.

77. Faber, C., Sticht, H., Schweimer, K., Rosch, P. Structural rearrangements of HIV-1 Tat-responsive RNA upon binding of neomycin B // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 20660-20666.

78. Kirk, S.R., Tor, Y. Hydrolysis of an RNA dinucleiside monophosphate by neomicine B // Chem. Commun. 1998. V. l.P. 147-148.

79. Riguet, E., Tripathi, S., Chaubey, B., Desire, J., Pandey, V.N., Dccout, J.-L. A peptide nucleic acid neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication // J. Med. Chem. 2004. V. 47. P. 4806-4809.

80. Earnshaw, D.J., Gait, M.J. Hairpin ribozyme cleavage catalyzed by aminoglycosideantibiotics and the polyamine spermine ih the absence of metal ions // Nucleic Acids Res. V. 26.1. P. 5551-5561.

81. Griffey, R.H., Hofstadler, S.A., Sannes-Lowery, K.A., Ecker, D.J., Crooke, S.T. Determinants of aminoglycoside-binding specificity for rRNA by using mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96. P. 10129-10133.

82. Tor, Y., Hermann, T., Westhof, E. Deciphering RNA recognition: aminoglycoside binding to the hammerhead ribozyme // Chem. Biol. 1998. V. 5. P. R277-R283.>

83. Mikkelsen, N.E., Brannvall, M., Virtanen, A., Kirsebom, L.A. Inhibition of RNase P RNA cleavage by aminoglycosides // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96. P. 6155-6160. •

84. Blount, K.F., Tor, Y. Using pyrene-labeled HIV-1 TAR to measure RNA-small molecule binding // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 5490-5500.

85. Wang, H., Tor, Y. Electrostatic interactions in RNA aminoglycosides binding // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 8734-8735.

86. Chen, Q., Shafer, R.H., Kuntz, I.D. Structure-based discovery of ligands targeted tó the RNA double helix // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 11402-11407.

87. Kuntz, I.D., Meng, E.C., Shoichet, B.K. Receptor-based molecular design // Acc. Chem. Res. 1994. V. 27. P. 117-123.

88. Wallis, M.G., von Ahsen, U., Schroeder, R., Famulok, M. A novel RNA motif for neomycin recognition // Chem. Biol. 1995. V. 2. P. 543-552.

89. Famulok, M., Huttenhofer, A. In vitro selection analysis of neomycin binding RNAs with a mutagenized pool of variants of the 16S rRNA decoding region // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 4265-4270.

90. Wang, Y., Rando, R.R. Specific binding of aminoglycoside antibiotics to RNA // Chem. Biol. 1995. V. 2. P. 281-290.

91. Hermann, T. Rational ligand design for RNA: the role of static structure and conformational flexibility in target recognition // Biochimie. 2002. V. 84. P. 869-875.

92. Michael, K., Wang, H., Tor, Y. Enhanced RNA binding of dimerized aminoglycosides // Bioorgan. Med. Chem. 1999. V. 7. P. 1361-1371.i. .

93. Litovchick, A., Evdokimov, A.G., Lapidot, A. Aminoglycoside-arginine conjugates that bind TAR RNA: synthesis, characterization, and antiviral activity // Biochemistry. 2000. y. 39. P. 2838-2852.

94. Baker, T.J., Luedtke, N.W., Tor, Y., Goodman, M. Synthesis and anti-HIV activity of guanidinoglycosides // J. Org. Chem. 2000. V. 65. P. 9054-9058.

95. Luedtke, N.W., Baker, T.J., Goodman, M., Tor, Y. Guanidinoglycosides: a novel family of RNA ligands // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 12035-12036.

96. Edwards, T.E., Sigurdsson, S.T. Electron paramagnetic resonance dynamics signatures of1. H " * ^

97. TAR RNA-small molecule complexes provide insight into RNA structure and recognition // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 14843-14847.

98. Wong, C.-H., Hendrix, M., Manning, D.D., Rosenbohm, C., Greenberg, W.A. A- library approach to the discovery of small molecules that recognize RNA: use of a 1,3-hydroxyamine motif as core // J. Am Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 8319-8327.

99. Hendrix, M., Priestley, E.S., Joyce, G.F., Wong, C.-H. Direct observation of aminoglycoside-RNA interactions by surface plasmon resonance // J Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P.3641-3648.

100. Wong, C.-H., Hendrix, M., Priestley, E S. Greenberg, W.A. Specificity of aminoglycosideantibiotics for the A-site of the decoding region of ribosomal RNA // Chem. Biol. 1998.V.5. P.1. V ' ■ 397.406.'i

101. Hendrix, M., Alper, P.B., Priestley, E.S., Wong, C.-H. Hydroxyamines as a new motif for the molecular recognition of phosphodiesters: implications for aminoglycoside-RNA interactions //Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997. V. 36. 95-98.

102. Wong, C.-H., Bryan, M.C., Nyffeler, P.T., Liu, H., Chapman, E. Synthesis of carbohydrate-based antibiotics // Pure Appl. Chem. 2003. V. 75. P. 179-186.

103. Ding, Y., Hofstadler, S.A., Swayze, E.E., Griffey, R.H. An efficient synthesis of mimetics of neamine for RNA recognition // Org. Lett. 2001. V. 3. P. 1621-1623. . '

104. Vourloumis, D., Winters, G.C., Simonsen, K.B., Takahashi, M., Ayida, B.K., Shandrick, S., Zhao, Q., Han, Q., Hermann, T. Aminoglycoside-hybrid ligands targeting the ribosomal decoding site // ChemBioChem. 2005. V. 6. P. 58-65.

105. Tok, J. B.-H., Rando, R.R. Simple aminols as aminoglycoside surrogates // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 8279-8280.

106. Simonsen, K.B., Ayida, B.K., Vourloumis, D., Winters, G.C., Takahashi, M., Shandrick, S., Zhao, Q., Hermann, T. Piperidine glycosides targeting the ribosomal decoding' !site // ChemBioChem. 2003. V. 4. P. 886-890. '

107. Alper, P., Hendrix, M., Sears, P., Wong, C.H. Probing the specificity of aminoglycoside-ribosomal RNA interactions with designed synthetic analogs // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 1965-1978.

108. Nunns, C.L., Spence, L.A., Slater, M.J., Berrisford, D.J. Synthesis of neamine libraries for RNA recognition using solution phase chemistry// Tetrahedron Lett. 1999. V. 40. P. 9341-9345.v

109. Hanessian, S., Tremblay, M., Kornienko, A., Moitessier, N. Design, modeling and synthesis of functionalized paromamine analogs // Tetrahedron. 2001. V. 57. P. 3255-3265.

110. Haddad, J., Kotra, L.P., Llano-Sotelo, B., Kim, C., Azucena, E.F., Liu, M., Vakulenko, S.B., Chow, C.S., Mobashery, S. Design of novel .antibiotics that bind to the ribosomal acyltransferase site // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 3229-3237.

111. Zhao, M., Janda, L., Nguyen, J., Strekowski, L., Wilson, W.D. The interaction of substituted 2-phenylquinoline intercalators with poly(A)poly(U): classical and:-threading intercalation modes with RNA//Biopolymers. 1994. V. 34. P. 61-73.

112. Ratmeyer, L., Zapp, M.L., Green, M.R., Vinayak, R., Kumar, A., Boykin, D.W., Wilson, W.D. Inhibition of HIV-1 Rev-RRE interaction by diphenylfuran derivatives // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 13689-13696.

113. Li, K., Davis, T.M., Kumar, A., Singh, R., Boykin, D.W., Wilson, W.D. Heterocyclic inhibitor of the Rev-RRE complex binds to RRE as a dimmer // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 1150-1158. '

114. Xiao, G., Kumar, A., Li, K., Rigl, T., Bajic, M., Davis, T.M., Boykin, D.W., Wilsoh, W.D. Inhibition of the HIV-1 Rev-RRE complexformarion by unfused aromatic cations // Biorg. Med. Chem. 2001. V. 9. P. 1097-1113.

115. Gelus, N., Bailly, C., Hamy, F., Klimkait, T., Wilson, W. D., Boykin, D. W. Inhibition of!

116. HIV-1 Tat-TAR interaction by diphenylfuran derivatives: effects of the terminal basic side chains // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V. 7. P. 1089-1096. ' !

117. Palm, B.S., Piantanida, I., Zinic, M., Schneider, H.-J. The interaction of new 4,9-diazapyrenium compounds with double stranded nucleic acids // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 2000. P. 385-392.

118. Hamy, F., Brondani, V., Florscheimer, A., Stark, W., Blommers, J.J., Klimkait, T. A new class of HIV-1 Tat antogonist acting through Tat-TAR inhibition // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 5086-5095. , i

119. Gelus, N., Hamy, F., Bailly, C. Molecular basis of HIV-1 TAR RNA specific recognitionby an acridine Tat-antagonist // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V. 7. P. 1075-1079. . •i .

120. Kirk, S.R., Luedtke, N.W., Tor, Y. Neomycin-acridine conjugate: a potent inhibitor of Rev-RRE binding // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 980-981.

121. Ratmeyer, L., Vinayak, R., Zon, G., Wilson, W.D. An ethidium analog that binds with high specificity to a base-bulged duplex from the TAR RNA region of the HIV-1 genome // J. Med. Chem. 1992. V. 35. P. 966-968. ;

122. Gayle, A.Y., Baranger, A.M. Inhibition of the U1A-RNA complex by an aminaacridine derivative // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. V. 12. P. 2839-2842. , f

123. Luedtke, N.W., Liu, Q., Tor, Y. RNA-ligand interactions: affinity and specificity of aminoglycoside dimers and acridine conjugates to the HIV-1 Rev Response Element // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 11391-11403.

124. Krishnamurthy, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Peptide quinoline conjugates: a new class of RNA-binding molecules // Org. Lett. 2004. V. 6. P. 63-66.

125. Carlson, C.B., Beal, P.A. Solid-phase synthesis of acridine-based threading intercalator peptides // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. V. 10. P. 1979-1982.

126. Gooch, B.D., Beal, P.A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides'.// J. Am.j i

127. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 10603-10610.

128. Piantanida, I., Palm, B.S., Cudic, P., Zinic, M., Schneider, H.-J. Phenanthridinium cyclobisintercalands. Fluorescence sensing of AMP and selective binding to single-stranded nucleic acids // Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 6779-6783.

129. Morin, G.T., Paugam, M.-F., Hughes, M.P., Smith, B.D. Boronic acids mediate glycoside transport through a liquid organic membrane via reversible formation of trigonal boronate esters Hi. Org. Chem. 1994. V. 59. P. 2724-2728.

130. James, T.D., Samankumara, K.R.A.S., Shinkai, S. Saccharide sensing with molecular receptors based on boronic acid // Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. P. 1910-1922.

131. Riggs, J.A., Hossler, K.A., Smith, B.D., Karpa, M.J., Griffin, G., Duggan, P.J. Nucleotide carrier mixture with transport selectivity for ribonucleoside-5'-phosphates // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 6303-6306.- /

132. Tung, C., Wei, Z.? Leibowitz, M.J., Stein, S. Design of peptide-acridine mimics of1» Vribonuclease activity// Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1992. V. 89. P. 7114-7118.

133. Lorente, A., Espinosa, J.F., Fernandez-Saiz, M., Lehn, J.-M., Wilson, W.D., Zhong, Y.Y. Synthesis of imidazole-acridine conjugates as ribonuclease A mimics // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 4417-4420.

134. Vlassov V.V., Zuber G., Felden В., Behr J.-P., Giege R. Cleavage of RNA with imidazole constructs: a new approach for probing RNA structure // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3161-3167. .1.'ll"

135. Hovinen, J., Guzaev, A., Azhayeva, E., Azhayev, A., Lonnberg, H. Imidazole tethered oligodeoxyribonucleotides: synthesis and RNA cleaving activity // J. Org. Chem. 1995. V. 60, 2205-2209.

136. Ждан, H.C., Кузнецова, И.JI., Власов, А.В., Сильников, В.Н., Зенкова, М.А., Власов,f

137. В.В. Синтетические рибонуклеазы. 1. Синтез и свойства искусственных рибонуклеаз,tсодержащих РНК-связывающий фрагмент на основе остатков лизина // Биоорг. Химия. 1999. Т. 25. С. 723-732.

138. Королева, Jl.C., Донина, А.А., Тамкович, Н.В., Ковалев, Н.А., Зенкова, М.А.,

139. Сильников, В.Н. Искусственные рибонуклеазы. Сообщение 6. Рибонуклеазная активность1тетрапептидов на основе аминокислот, формирующих каталитический центр РНКазы Т1 // Изв. АН. Сер. Хим. 2005. Т. 54. С. 2596-2605.

140. Коневец, Д.А., Бекк, И.Э., Сильников, B.H., Зенкова, М.А., Шишкин, Г.В.i I

141. Коневец, Д. А.,. Бекк, И.Э, Шишкин, Г.В., Власов, В.В., Сильников, В.Н. Конструирование и синтез искусственных рибонуклеаз на основе 1, 4-диазабицикло2.2.2.октана и имидазола // Изв. АН. Сер. Хим. 2002. Т. 7. С. 1014-1024.

142. Зенкова, М.А., Чумакова, Н.Л., Власов, А.В., Комарова, Н.И., Веньяминова, А.Г.,• >

143. Власов, В.В., Сильников, В.Н. Синтетические конструкции, функциональноимитирующие рибонуклеазу А // Мол. Биология. 2000. Т. 34. С. 456-460 •i '

144. Коневец, Д.А., Миронова, Н.Л., Бекк, И.Э., Зенкова, М.А., Шишкин, Г.В., Власов,F

145. В.В., Сильников, В.Н. Химические рибонуклеазы. 4. Анализ доменной структуры-'НО ,химических рибонуклеаз на основе конъюгатов 1, 4-диазабицикло2.2.2.октана // Биоорг.

146. Химия. 2002. Т. 28. С. 367-378. • !

147. Soukup, G.A., Breaker, R.R. Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of RNA // RNA. 1999. V. 5. P. 1308-1325. '>',

148. McKay, D.B., Wedekind, J.E. Small Ribozymes // The RNA world / Eds Gesteland R.F., Cech T.R., Atkins J.F. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1999. P. 265-286.

149. Tabushu, I., Imuta, J.-I., Seko, N., Kobuke, Y. Highly discriminative binding of nucleoside phosphates by a lipophilic diammonium salt embedded in bicyclic skeleton // J. Am. Chem. Soc. 1978. V. 100. P. 6287-6288.

150. Narlikar, G.J., Hcrschlag, D. Mechanistic aspects of enzymatic catalysis: lessons from comparison of RNA and protein enzymes // Annu. Rev. Biochem. V. 66. 1997. P. 19-59.

151. Shan, S.-O., Herschlag, D. The change in hydrogen bond strength accompanying charge rearrangement: implications for enzymatic catalysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. 1996.p. 14474-14479.

152. Katritzky, A.R., Rao, M.S.C., Stevens, J. Compounds with potential 2 -order nonlinear optical-activity// J. Heterocycl. Chem. 1991. V. 28. P. 1115-1119.

153. Garratt, P. J., Ibbett, A.J., Ladbury, J.E., O'Bien, R., Hursthouse, M.B., Abul Malik, K.M.< >

154. Molecular design using electrostatic interections. 1. Synthesis and properties of flexible tripodand tri- and hexa-cations witn restricted conformations. Molecular selection of ferricyanide from ferrocyanide // Tetrahedron. 1998. V. 54. P. 949-968.

155. Cohen, J.I., Castro, S., Han, J.-a., Behaj, V., Engel, R. Polycations. IX. Polyammonium derivatives of cyclodelxtrins: syntheses and binding to organic oxyanions // Heteroatom Chem. 2000. V. 11. P. 546-555.

156. Giege, R., Felden, В., Silnikov, V.N., Zenkova, M.A., Vlassov, V.V. Cleavage of RNA with synthetic ribonuclease mimics // Methods Enzymol. 2000. V. 318. P. 147-165. . 1

157. Rogoza, A.V. Superlipophilicity (Xenophilicity) and Microlipophilicity of Perfluorinated

158. Saturated Groups. Part 1. Qualitative Selection Criteria for Biologically Active Substances

159. Containing Perfluorinated Fragments // International conference on natural products andiphysiologically active substances (ICNPAS-98). November 30 December 6, 1998.i t

160. Novosibirsk, Russia. P. 149.

161. Jakersman, К. J., Tisdale, M., Russell, S. Efficacy of 2'-fluororiboside against influenza A and В virus inferrets // Antimicrobial agents and chemotherapy. 1994. V. 38. P. 1864-1867.

162. Tisdale, M., Ellis, M., Klumpp, K. Inhibitionof 2'-fluororiboside against influenza A and В virus inferrets // Antimicrobial agents and chemotherapy. 1994. V. 38. P. 1864-1867 ;

163. Коваль, И. В. N-Галогенреагенты. N-Галогенсукцинимиды в органическом синтезе и в химии природных соединений // Журн. Орг. Химии. 2002. Т. 38. С. 327-359.

164. Cerichelli, G., Illuminati, G., Lillocci, C. Structural and mechanistic effects on the rates of ring-opening reactions in the 5-16-membered-ring region // J. Org. Chem. 1980. V. 45. P. 39523957.

165. Zenkova, M., Beloglazova, N., Sil'nikov, V., Vlassov, V.V., Giege, R. RNA cleavage by l,4-diazabicyclo2.2.2.octane-imidazole conjugates // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 468490.

166. Kierzek, R. Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5073-5077.

167. Гордон, А., Форд, P. Спутник химика: пер. с англ. М.: Мир, 1976. 541 с. '