Конъюгация гликозаминогликанов с аминами и карбоновыми кислотами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИИ И КАТАЛИЗА

На правах рукописи

□03055223

Лукина Елена Сергеевна

КОНЪЮГАЦИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ С АМИНАМИ И КАРБОНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Уфа - 2007

003055223

Работа выполнена в Институте нефтехимии и катализа Российской Академии Наук

Научный руководитель доктор химических наук,

профессор Одинокое Виктор Николаевич

Официальные оппоиен гы доктор химических наук,

профессор Баптина Лидия Ашрафовна

доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович

Ведущая организация Институт органической химии

им Н Д Зелинского РАН

Защита диссертации состоится 16 января 2007 года в 14 00 на заседании диссер!анионного совета Д 002 062 01 в Институте нефтехимии и катализа РАН по адрес> 450075, Уфа, проспект Октября, 141 Факс (3472)2312750, e-mail ink(ii)ainb ш

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института неф|е\имии и катализа РАН

Рефера! разослан 9 декабря 2006 года

Ученым секретарь диссеркщионного совета домор химических наук, профессор

Булгаков Р Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы* Гиалуроновая кислота, гепарин и хондроитинсульфаты - кислые гликозаминогликаны из класса гетерополисахаридов входят в состав внеклеточного матрикса и выполняют важные функции в живом организме На основе гликозаминогликанов создан ряд лекарственных препаратов для хирургии, лечения ожоговой болезни, трофических язв и артритов различной этиологии

В последние годы внимание исследователей привлекают химически модифицированные гликозаминогликаны в качестве неиммуногенных биосовместимых материалов с новыми, полезными для медицины свойствами Особый интерес представляют конъюгаты гликозаминогликанов с биологически активными соединениями, которые рассматривают как лекарственные препараты нового поколения с пролонгированным терапевтическим эффектом направленного действия

В этой связи исследование конъюгации гликозаминогликанов с фармакологически значимыми амино- и карбоксисоединениями, изучение структуры и свойств полученных конъюгатов представляется актуальной задачей

Работа выполнялась в Институте нефтехимии и катализа РАН при финансовой поддержке Отделения химии и наук о материалах РАН по программе «Биомолекулярная и медицинская химия» (проекты «Полусинтетические биополимеры медицинского назначения на основе модифицированных гликозаминогликанов», 2005 г и «Модифицированные гликозаминогликаны как потенциальные лекарственные средства для химиотерапии ВИЧ-инфекции и опухолевых заболеваний», 2006 г)

Цель работы состояла в разработке эффективных методов конъюгации кислых гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов и гепарина) по карбоксильным группам с фармакозначимыми аминами и карбоновыми кислотами и синтезе практически важных конъюгатов

Научная новизна и практическая значимость Разработаны эффективные методы и найдены условия химической модификации гликозаминогликанов аминами и карбоновыми кислотами с высокой конверсией карбоксильных групп полисахаридов Синтезированы новые конъюгаты гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов и гепарина взаимодействием с фармакологически

Автор выражает глубокую благодарность директору ИНК РАН, член-корр РАН Усеину Меметовичу Джемилеву за неоценимую помощь в постановке данной работы и содействие в процессе ее выполнения

значимыми аминосодержащими соединениями в водной среде в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида Получены новые конъюгаты гликозаминогликанов с карбоксилсодержащими фармакофорами через диаминовые спейсеры и УУ-гидроксисукцинимидные эфиры Предложены аналитические и спектральные методы определения содержания звеньев с амидными, изоуреидокарбонильными, изоуреидофениламидными и олигомерными ариламидными группами в модифицированных гликозаминогликанах На основании данных спектроскопии ЯМР 'Н выявлено экранирующее влияние магнитно-анизотропных ароматических колец ариламидных групп на метильные протоны ацетамидных групп в соседних Л'-ацетилглюкозамино- и ТУ-ацетилгалактозаминопиранозильных звеньях гиалуроновой кислоты и, соответственно, хондроитинсульфатов, что использовано при определении конверсии ССЬН-групп в ариламидные Изучена биодеградируемость конъюгатов гиалуроновой кислоты под действием фермента гиалуронидазы Выявлены анальгезирующее действие конъюгатов гликозаминогликанов с 4-аминоантипирином, противовоспалительная активность конъюгатов гликозаминогликанов с таурином и противоопухолевые свойства конъюгата гепарина с таурином

Апробация работы Основные результаты исследований представлены на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), Молодежной научной школе-конференции «Актуальные проблемы органической химии» (Новосибирск, 2003), Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, 2003), конференции "Проблемы создания новых лекарственных средств" (Уфа, 2003), Международной научно-технической конференции "Перспективы развития и практического применения алициклических соединений" (Самара, 2004), V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005) Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бельштейна до современности» (Яльчик, 2006), IV Всероссийской научной конфренции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006)

Публикации По материалам диссертации опубликовано две статьи и тезисы восьми докладов на конференциях, получены один патент и решения на выдачу двух патентов РФ

Объем и структура диссертации Диссертация включает введение, литературный обзор на тему «Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация», обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и

2

список литературы Работа изложена на 110 страницах и содержит 11 таблиц и 7 рисунков Список литературы состоит из 179 ссылок

Автор глубоко благодарен кандидату химических наук, старшему научному сотруднику Понеделькиной Ирине Юрьевне за неоценимый вклад, внесенный на всех этапах выполнения данной работы

Кислые гликозаминогликаны (GAG) содержатся в соединительных тканях человека и животных и могут быть извлечены из них щелочной экстракцией Гиалуроновая кислота (НА) и хондроитинсульфаты (CS) (смесь хондроитин-6-сульфата, CS-6, и дерматансульфата, DS), выделенные из пупочных канатиков новорожденных, и DS, полученный из экстракта свиной кожи, были очищены с помощью колоночной анионообменной хроматографии с использованием высокопроточной волокнистой ДЕАЕ-целлюлозы Аналогичной обработке подвергался выделенный из фармакопейного препарата гепарин (HEP) Полученные таким образом полисахариды охарактеризованы содержанием белка (по Лоури) и серы (по элементному анализу) В НА и IIEP белок отсутствовал, в CS и DS его содержание было 0 38% и 0 40% соответственно В НА сера отсутствовала, содержание серы в CS - 6 02%, DS - 6 36%, HEP - от 14 до 15% Содержание звеньев GlcA в НА - 47 9% масс (по Дише)

1 Конъюгация гликозамнногликанов с фармакозначнмыми аминами. 1 1 Коныогаты гиалуроновоп кислоты

Исследовано взаимодействие НА (звено А, см схему 1) с ароматическими аминокислотами 5-аминосалициловой (1а), 4-аминосалициловой (1Ь), антраниловой (1с) и и-аминобензойной кислотами (1(1) в водной среде в присутствии 1-этил-3-[3-

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

HA (п=И)0 150)

GIcA(l-~3)GIcNAc(l— 4)

п

R = SO,II или Ac, S03II/Ас = 70-80/20-30 IdoA-2S(l —4)GlcNAc-6S(l— 4)

(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC) При обычно применяемой методике с предварительным активированием карбоксигрупп IIA карбодиимидом EDC с последующим введением в реакцию аминокислоты не удается достичь более 5% конверсии С02Н-групп НА в ариламидные, что согласуется с литературными данными (Cera С, 1988) Нами установлено, что при добавлении 0 75-эквимольного количества EDC к смеси НА и соответствующей аминокислоты la-d превращение С02Н-групп НА в ариламидные достигает 30% при суммарной конверсии С02Н-групп НА 46% Более высокая суммарная конверсия С02Н-групп НА по сравнению с их трансформацией в ариламидные обусловлена образованием изоуреидокарбонильных групп В спектрах 'Н-ЯМР и 13С-ЯМР конъюгатов 2а-<1 зафиксированы сигналы ароматических протонов в области 8 6 9-8 5 м д (НАг) и, соответственно, атомов углерода ариламидных звеньев В в области 5 110-163 мд (САг), а сигналы с 8ц~3 0 м д и 8С~45 м д свидетельствуют о присутствии групп Me2N изоуреидного остатка (звенья С)

Схема 1.

у—n=c=n

'> EDC/a NaBHj/й NaBII./í>

НА + RNH, ^-- 2a-d--- За-d; HA+ EDC 4-i- 5

la-d A+B+C A+B+D A+C A+D

COOII /OIIo c4ONIIR

IIA (звено А) Модифицированная IIA (MIIA) (звено В)

о

:or> <-01lo он 0,1

OH ----- 46ÍI NIIAc

MHA (звено С) MHA (звено D)

R= a-^^-OII, b-Q-coOII, с Q-COOH, d COOH,

COOII Olí

"/,,ли HC"N °x

H3c 3 N

Реагенты и условия а Н20, 20-22 °С, 2 ч, рН 4 7-4 8, Ъ Н20, 20-22 "С, 1 5-2 ч, рН 7-8

Отмечено, что реакция образования ариламидов 2я-й при действии Е1)С на смесь НА и соответствующей аминокислоты 1а-с1 практически завершается в течение первых 15 мин (рис 1) Используемая нами последовательность добавления реагентов позволяет в этот промежуток времени частично избежать нецелевого расходования

4

ЕПС и увеличить выход ариламидов Действительно, при ином порядке добавления реагентов, например, при предварительном активировании карбоксигрупп НА карбодиимидом наряду с образованием стабильных О-ацилизомочевин 4 (схема 1) происходит частичный гидролиз ЕПС, о чем свидетельствует повышенный расход ЕПС по сравнению со скоростью его расходования на синтез адцукта 4 (рис 2, кривые 1, 2) Кислотно-катализируемый гидролиз ЕПС наблюдался также при действии на него аминокислотами 1а-с1 (рис 2, кривые 3-6), концентрация которых при этом не изменялась, и, следовательно, возможного синтеза гомополиамидов из аминокислот 1а-(1 не происходило Установлено также, что при действии ЕПС на эквимольную смесь конъюгата 2а-с1 и соответствующей аминокислоты 1а-(1 концентрация последней не уменьшалась, и, следовательно, конъюгация аминокислот по карбоксигруппам ариламидных звеньев В не имела места

Рис 1 Динамика образования ариламидных групп в продуктах 2а (/), 2Ь (2), 2с (3) и 2d (4) при взаимодействии IIA с соответствующими аминокислотами la-d в присутствии EDC (при соотношении реагентов IIA 1 EDC=1 1 0 75)

Рис 2 Кривые расходования карбодиимида EDC в присутствии кислот IIA (/), 1а (3), 1Ь (4), 1с (5) и ld (6) (при соотношении кислота EDC=1 0 75) и образования О-ацилизомочевин 4 (2) в реакции HA+EDC при соотношении IIA EDC=1 0 75

Таким образом, аминокислоты la-d в условиях реакции модификации НА расходуются только на образование конъюгатов 2a-d, и содержание звеньев В них правомерно рассчитывать по разности между начальной и конечной концентрациями аминокислот la-d в реакционной смеси, которые определяли методами нитритометрии и ион-парной ВЭЖХ Содержание звеньев С рассчитывали по количеству 0 1 н раствора HCl, расходуемого на титрование реакционной смеси для

Таблица 1. Спектральные характеристики и содержание (%) звеньев А, В и С в конъюгах 2а-р

конъюгат уф. спектр (Н20, ^тач, ИМ) 'Н ЯМР-спектр (5, м д)" НА амин ЕЭС =1 10 75 НА амин ЕйС =1115 НА амин ЕБС =13 3

МеСОЫ Наг Аь В С А4 В С Аь В С

2а 313 1 65-1 72 с и 2 16 с 70 уш с, 7 7 уш си81уш с 64 26 10 50 40 10 49 51 10

2Ь 267 и 304 1 56-1 60 с и 2 04 с 6 9 уш с, 7 5 уш с 85 12 3 76 21 3 60 36 4

2с 304 1 68 си 2 10 с 7 3 уш с, 7 6 уш с, 8 1 уш с, 8 5 уш с 54 30 16 30 43 27 54 46 0

2(1 389 1 50-1 70 с и 2 10 с 7 8 уш с и 8 0 уш с 77 9 14 57 18 25 59 31 10

2е 274 1 58-1 70 уш с, 2 08 с 7 0 уш с, 7 5 уш с 65 35 3 55 45 0 50 50 0

21 281 308 178 с, 183 с, 2 10 с 7 1 уш с, 7 3 уш с, 7 6 уш с 42 52 6 51 49 0 50 50 0

28 262 1 60 с, 2 08 с 7 6 уш с, 7 9 уш с 39 33 28 44 37 19 63 30 7

2ЬС 263 1 62 с, 2 10 с 7 8 уш с, 7 9 уш с 59 15 26 70 25 5 30 49 21

21е 273 1 62 с, 2 09 с 7 8 уш с, 8 1 уш с 82 10 8 80 15 5 44 16 40

21е 274 1 58-1 62 с, 2 06 с 79уш с, 8 0 уш с 72 10 18 42 25 33 11 53 36

2кс 262 1 93 с, 2 08 с, 2 40 с 7 5 уш с, 7 7 уш с 49 48 3 40 57 3 3 83 4

21 266 2 02 с и 2 05 с 80уш с, 8 9 уш с 65 27 8 50 36 14 55 43 2

2т 242 1 52-1 60 с, 2 00 с, 2 07 с 7 4 уш с, 7 5 уш с, 7 6 уш с 56 41 3 27 73 0 18 79 3

2пс - 2 Юс - 71 20 9 71 23 4 73 27 0

2о" - 2 Юс - 90 10 0 - - - - - -

2р' 261 2 Юс - - 13 - - 26 - - - -

а Сигналы приведены для конъюгатов 2ач), 2Г-1, 2п-р, полученных при соотношении реагентов 1 1 0 75, для конъюгатов 2е и 2ш - при соотношении реагентов 1115,6 Содержание звеньев А определено как разность между 100% и суммарным содержанием звеньев В и С, с В 'н ЯМР-спектре конъюгата 2Ь наблюдается характеристичный сигнал с 8 2 0 м д (с, СНзСО), для конъюгата 21-сигналы с 5 1 5 (т, 7=14 1 и 7 0 Нг, сн3сн2о) и 4 5 м д (м, сн3сн2о), для конъюгата 2J-cигнaл с 5 1 4 м д (т, 7=14 1 и 7 0 Нг, КСНгСНз), для конъюгата 2к-сигналы с 5 1 9 и 2 4 (с, С=ССН3) и 3 4 м д (с, СН3М), для конъюгата 2п - сигналы с 5 3 36 (т, 7=13 0 и 6 5 Нг, СН25 03) и 3 53 (т, 7=12 54 и 6 27 Нг, СНгМН), с/ Для конъюгатов 2о, полученных при использовании избытка ЕОС, не удалось определить содержание звеньев из-за их плохой растворимости, е Содержание звеньев В в конъюгатах 2р определено методом ВЭЖХ (по разности концентрации амина 1р до и после реакции)

поддержания рН 4 7-4 8* Содержание отдельно звеньев В, С и А, определенные этими методами (таблица 1), подтверждено данными спектроскопии 'Н-ЯМР -относительными интенсивностями сигналов протонов метальных групп с 5—3 0 м д (Me2N в звеньях С), 8-2 1 м д (MeCON в звеньях А и С) и 5-1 7 м д (MeCON в GlcNAc звеньях, находящихся под экранирующим влиянием пространственно близко расположенных магнитно-анизотропных ароматических колец ариламидных групп) Вклад интенсивности сигнала с 5-1 7 м д в суммарную интегральную интенсивность сигналов метальных протонов практически не зависит от разбавления растворов коныогатов, на основании чего можно сделать вывод, что анизотропное влияние распространяется в пределах молекулярной цепи модифицированной НА

Принято считать (Nakajima N, 1995 г), что при взаимодействии EDC с карбоновыми кислотами образуются О-ацилизомочевины - активные интермедиа™ ацилирования аминов С другой стороны, для GAG известны примеры стабильных О-ацилизомочевин, которые при действии боргидрида натрия в Н20 нацело восстанавливаются в гидроксиметильные производные {Inoe Y, 1982) Боргидридное восстановление аддукта 4, приведшее к соединению 5 с гидроксиметильными группами вместо изоуреидокарбонильных остатков (звенья D вместо С), подтвердило структуру 4 как О-ацилизомочевины Аналогично, боргидридным восстановлением конъюгатов 2a-d получены, соответственно, соединения За-d (схема 1) О полной замене звеньев С на звенья D при боргидридном восстановлении конъюгатов 2a-d и 4 свидетельствует исчезновение сигнала в области 5-3 0 м д, характерного для Me2N-групп в звеньях С Замена уреидных остатков на гидроксиметильные группы не изменяет УФ-спектров, которые идентичны для конъюгатов 2a-d и соответствующих им продуктов восстановления За-d В 'Н-ЯМР-спектрах соединений За-d относительные интенсивности сигналов ароматических протонов ариламидных групп (5 6 9-8 5 мд) и метальных протонов А'-ацетильиых групп (5-2 1 и -17 мд) сохраняются в том же соотношении, что и до боргидридного восстановления Следовательно, в соединениях За-d число звеньев А и В то же, что и в конъюгатах 2а-d, а число звеньев D соответствует числу звеньев С в конъюгатах 2a-d (таблица 1) Содержание звеньев D в полисахаридах За-d и 5, найденное антроновым методом, используемым для определения остатков нейтральных Сахаров (Jermyn MA , 1975 г), совпадает с результатами спектрального метода анализа с помощью 'Н-ЯМР

Аналогично конъюгатам 2a-d были получены конъюгаты 2е-р с использованием соответствующих аминов le-p п- (Je) и о-аминофенолов (If), п-аминобензолсульфамида (стрептоцида) (lg), л-аминобензолсульфацетамида-натрий

Образование О-ацилизомочевин или Д-анилмочевип в реакции кислот с карбодиимидачи сопровождается присоединением протона (кислоты) и, как следствие, возрастанием рН среды

(сульфацил-натрия) (1Ь), этилового (1|) и р-диэтиламиноэтилового (1]) эфиров п-аминобеизойной кислоты (анестезина и новокаина соответственно), 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолона-5 (4-аминоантипирина) (1к), гидразида изоникотиновой кислоты (изониазида) (11), анилина (1т), таурина (1п), ремантадина (1о) и 7-аминоцефалоспориновой кислоты (1р)

RNIIj (1е-р), где R=-<QbOH -^^"SOjNII^.-^^-SOjNNaCOCH,.

ОН

/Г~\ I-1 CH3(k4 CONH-

-<^JbCOOC2H, (,), -<^JbCOOCH2CHJN(C2II5)2 0),оAn.N,ch ' ^ (,), (m),

^ [| I N

-OCC%)

COOII

Характеристики конъюгатов 2a-p приведены в таблице 1

Для конъюгата IIA с анилином 2ш (73%-ая конверсия карбоксигрупп в фениламидные) были выполнены 1D и 2D спектры ЯМР *Н и 13С (COSY, TOCSY, HSQC, D20, 500 МГц)*, позволившие сделать отнесение сигналов протонов фрагмента GlcA модифицированного звена и фрагмента GlcNAc соседнего с ним звена Эти фрагменты объединены в звено М По такому же принципу соответствующие фрагменты немодифицированных звеньев объединены в звено NM

(Звено NM R=OH)

Как видно (таблица 2), в спектре ЯМР 'Н фрагмента 01сЛ звена М имеет место заметное смещение сигналов Н(1)-Н(5) в слабое поле (Д5 ~0 2-0 3 м д ) по отношению к соответствующим сигналам фрагмента 01сЛ звена NM, а сигналы Н(1)-Н(5) фрагмента ОсЫАс звеньев М и N>1 практически совпадают

Автор благодарит д х н , профессора А С Шашкова (ИОХ им Н Д Зелинского РАН) за снятие двумерных спектров и обсуждение спектральных данных

Таблица 2 Химические сдвиги протонов фрагментов ИсЫЛс и С1сА модифицированного звена М и немодифицированного звена N№1 конъюгата 2ш

Протоны Звено NN1 Звено М

асЫАс ИсА ОсИАс ОсА

Н1 4 55 4 46 4 60 4 62

Н2 3 82 3 34 3 80 3 41

НЗ 3 73 3 58 3 70 3 73

Н4 3 51 3 74 351 3 98

Н5 3 47 3 72 3 47 4 04

Н6 3 91 - 3 91 -

Нб' 3 71 - 3 71 -

МеССЖ 2 00 - 1 52-1 60, 2 07 -

о-НАг - - - 7 51

м-НАг - - - 7 47

п- НАг - - - 731

В двумерном спектре ЯМР (режим ЯОЕвУ) для звена М наблюдаются те же МОП-эффекты между Н(1)- и Н(3)-, Н(1)- и Н(5)- аксиальными протонами во фрагменте 01сЛ и между метальными протонами МеСОМ-группы и Н(2)-аксиальным протоном во фрагменте Ок^'Ас, что и в соответствующих фрагментах звена NN1 (или аналогичного звена исходной НА) Это свидетельствует о сохранении свойственной природной НА 4С1-конфорчации фрагментов 01сА и ОсКАс в конъюгате 2т

Для метальных протонов ацетамидных групп звена М в спектре ЯМР 'Н конъюгата 2т наблюдается смещение сигналов как в слабое (Д8 0 07 м д ), так и в сильное поле (Д8 0 4-0 5 м д) (рис За) Силыюпольный сдвиг (сигналы в области 5 1 52-1 60 м д ), очевидно, обусловлен анизотропным влиянием ароматического кольца фениламидной группы соседнего фрагмента С1сА, сближенного в пространстве с ацетамидной группой, о чем свидетельствует >ТОЕ, наблюдаемый в спектрах ЯОЕЗУ между орто-протонами фенильного заместителя (5 751 мд) и метальной группой МеССЖ (5 2 00 м д)

Все наблюдаемые в области 8 1 52-2 07 м д сигналы относятся к протонам МеССЖ-группы, подтверждением чего является двумерный спектр С-Н ЯМР (режим

Н5С)С), согласно которому эти сигналы коррелируют с сигналом атома углерода метильной группы в той же МеССЖ-группе (8 ~23 м д) (рис 36)

а

б

-^ррт

24

20

1 5 Ерт

21 20 19 1? 17 16 15 14 13 РР™

Рис За - Область метальных протонов в 'Н-ЯМР спектре конъюгата 2ш (с=20 мг/мл П20), б - Спектр ШОС конъюгата 2т

Интегральная интенсивность сигналов, наблюдаемых в области 8 1 52-1 60 м д и отвечающих метальным протонам ацетамидных групп, коррелирует с содержанием звеньев В в конъюгатах с конверсией С02Н-групп НА в амидные < 30% В конъюгатах с более высоким содержанием звеньев В относительная интенсивность этих сигналов снижается, что, вероятно, обусловлено иной ориентацией анизотропного ароматического кольца относительно группы МеСОЫ, которая не попадает в зону его экранирования

Для понимания природы наблюдаемого дополнительного слабопольного сигнала с 5 2 07 м д , был проведен мониторинг интенсивности сигналов спектра ЯМР *Н конъюгата 2ш в области 5 1 52-2 07 м д в зависимости от концентрации растворов Оказалось, что относительная интенсивность сравнительно узкого дополнительного сигнала с 6 2 07 м д (рис За) снижается почти в ~6 раз с уменьшением концентрации раствора от 20 до 5 мг/мл, в то время как относительная интенсивность других сигналов (5 2 00 и в области 5 1 52-1 60 мд) практически не изменяется Из этого можно заключить, что сигнал с 5 2 07 м д является результатом межмолекулярных взаимодействий в концентрированных растворах и свидетельствует об образовании иной, чем в природной НА, субмолекулярной (третичной) структуры конъюгата 2т в водном растворе*

Автор благодарит д х н, профессора Л М Халилова и кхн, снс ТВ Тюмкину за активное участие в интерпретации спектральных характеристик конъюгатов

1 2 Коныогаты хондронтпнсульфатов

Взаимодействием Св и Бв с аминами 1а-ш в присутствии ЕОС (при соотношении вАв/амин/ЕОС, равном 1 1 0 75 или 1115) получены соответствующие конъюгаты ба-ш и 7а-гп (схема 2) Их характеристики приведены в таблице 3 В случае избытка ЕПС в конъюгате 6(1 отмечено образование олигомерных ариламидных групп, о чем свидетельствовали повышенная интенсивность сигналов ароматических протонов в 'Н-ЯМР-спектре и батохромный сдвиг максимумов поглощения в их УФ-спектрах (Хтах=289 нм для конъюгата с 58% звеньев В, \тзх 300 нм для конъюгата с 100% звеньев В, таблица 3)

В спектрах 'Н-ЯМР конъюгатов и 6т для метальных протонов МеСОМ-групп наряду с сигналами 5 ~ 2 0 м д наблюдались сигналы в более сильном поле (5 1 42-1 74 мд), обусловленные экранирующим влиянием пространственно близко расположенных к сульфатированным Л^-ацетилгалактозаминопиранозильным звеньям магнитно-анизотропных ароматических колец ариламидных групп (ср со сказанным выше для конъюгатов НА) Отнесение дополнительных сильнопольных сигналов к сигналам метальных протонов МеСОИ-групп можно считать правомерным, поскольку в 'Н-ЯМР спектре конъюгата 6т со 100% содержанием фенилачидных звеньев сигналы в области 5 ~ 20 мд практически отсутствуют, а наблюдаются только сигналы с химсдвигами 8 1 42 и 1 55 м д Из двух последних сигналов в спектре ЯМР 'Н конъюгата 7т индивидуального П8 присутствует только сигнал с 8 1 42 м д Следовательно, сигнал с 8 1 55 м д, наблюдаемый в конъюгате 6т Св (смеси Св-6 и ОБ), можно отнести к конъюгату СБ-б, а сигнал с 8 1 42 м д — конъюгату Бв

Взаимодействие СБ с ЕПС в отсутствие амина дало аддукт 8 с изоуреидокарбоксильными группами (36 % звеньев С) Боргидридное восстановление аддукта 8 и конъюгатов привело к соединениям 9 и, соответственно,

с гидроксиметильными группами вместо изоуреидокарбонильных остатков (звенья Б вместо С) Содержание звеньев Б в полисахаридах 9 и найденное антроновым методом, используемым для определения остатков нейтральных Сахаров, соответствует числу звеньев С в конъюгатах 8 и 6с,И,], что подтвердило сложноэфирную природу изоуреидокарбонильных остатков

™ edc/я , „„ , edc/я Схема 2. CS + RNHj-- 6a-m, DS + RNH2-- 7a-m

la-m A+B+C 1а-ш A+B+C

re . гтч^ a . o NaBH/ji „ , . , , NaBH,/¿ , , ,

CS + EDC->-8 -9; 6c,d,t,g,h,j-10 c,d,f,g,h,j,

a+c a+d a+B+c a+B+D

O'

но:

OR2 OR3 СООН о ^

ОН

NHAc

OR2 OR3 CONHR ^ /О

HO

OH

NHAc

CS (смесь CS-6 и DS) (звено А) Модифицированный CS (MCS) (звено В)

OR2 OR3

T""/ П П1 nil

OR2 OR3 л COR1 ~ /О

О HO

OH

MCS (звено С)

NHAc

О

НО

CH,OH0

ОН

MCS (звено D)

NHAc

R - те же, что и в схеме 1, для 6f R= "о

Н3Сч Г

R'= 3 > н,с

-N=c; ^СП, NH

II,С.

ii / или " ')]

СООН

\=/ '0-2

NH\ ^СН, JON О^

R2= Н (в CS-6), S03H (в DS), R3= S03H (в CS-6), Н (в DS)

Реагенты и условия а Н20, 20-22 °С, 2 ч, рН 4 7-4 8, Ъ Н20, 20-22 °С, рН 7-8

1.3 Коныогаты гепарина

Обнаружена высокая реакционная способность HEP по отношению к аминам реакция с аминами 1а-1,п в присутствии EDC завершается через 1-3 мин и, в зависимости от соотношения реагентов, приводит к конъюгатам 11а-1,п, содержащим звенья с амидными и изоуреидокарбонильными группами (схема 3) Характеристики полученных конъюгатов даны в таблице 4 Содержание звеньев В определено из соотношения приведенных к одному протону суммарных интенсивностей сигналов ароматических (5 7 1-8 9 мд) и аномерных протонов углеводного остова (8 5 1-5 5 м д), содержание звеньев С - из соотношения интенсивностей сигналов в области 8 ~3 м д (Me2N) и 5 1-5 5 м д

Таблица 3 Спектральные характеристики и содержание (%) звеньев А,В и С в конъюгатах ба-гп и 7а-ш

конъюгат уф. спектр (Н20, НМ) 'Н ЯМР-спектр" (5, м д) Св амин ЕОС =1 1 0 75 ее амин ЕБС =1115 конъюгат "II ЯМР-спектр" (5, м д.) ББ амин ЕОС =1115

МеСОК А6 В С Аь В С МеС(Ж А6 В С

6а 313 1 42 с, 1 53 с, 1 65 с, 2 09 уш с 25 65 10 0 83 17 7а 1 42 с, 2 11 с 67 30 3

6Ь 266 и 304 1 42 с, 1 54 с, 2 08 уш с 73 19 8 43 40 17 7Ь 1 42 с, 2 11 с 62 28 10

6с 300 143 с, 167 с, 2 05 уш с 64 33 3 22 75 3 7с 1 49 с, 2 16 с 29 71 0

611е 289, 300 1 55 с, 2 09 уш с 33 58 9 0 100 14 711 1 46 с, 2 11 с 62 33 5

бе 247 1 49 с, 1 70 с, 1 82 с, 2 08 уш с 38 62 0 27 73 0 7е 1 44 с, 1 74 с, 2 Юс 25 65 10

6Г 282 1 52 с, 1 74 с, 1 81 с, 2 09 уш с 25 72 3 24 76 0 К 1 52 с, 1 86 с, 2 Юс 25 52 23

6g 259 1 52 с, 1 72 с, 2 05 уш с 25 48 37 3 52 45 ч 1 72 с, 2 07 с 30 26 44

61,'' 264 1 45 с, 2 09 уш с 49 22 29 34 24 42 71/ 2 04 с, 2 17 с 30 20 50

6.' 271 2 09 уш с 42 58 0 43 57 0 Ъ* 1 43 с, 1 71 с, 2 07 с 15 40 45

6|' 273 1 50 с, 2 07 уш с 64 33 3 59 38 3 1 70 с, 2 Юс 35 33 32

6к'; 261 2 06 уш с 28 72 0 0 100 0 7 к'' 1 89 с, 2 11 с 48 52 0

61 263 2 06 уш с 27 63 10 19 70 11 71 2 11с 55 42 3

6ш 242 I 42 с, 1 55 с, 2 09 уш с - - - 0 100 0 7т 1 42 с, 2 13 с 0 75 0

а Сигналы приведены для конъюгатов 6а-ш и 7а-т, полученных при соотношении реагентов 1 1 0 75, Ь Содержание ¡веньев V определено как разность между 100% и суммарным со юр,капнем звеньев В и С , с Баточромный сдвиг в УФ-спемрах конъюгатов 6с1 (?ч1п\=289 нм для конъюгата, порченного при использовании 0 75 мот экв ЬЭС > „1ач 300 нм - 1 5 мол экв ЕОС) обусловпен образованием олнгомерныч фениленамидов с! В 'н ЯМР-спектре конъюгага 611 и 7И набиодаегся чараюершличный сигнал с 5 1 9 м д (с, СНзСО) 61 и 7| -сигналы с 5 1 5 (т, >14 1 и 7 0 Нг сн3сн2о) и 4 5 м д (м, СЬЬСЩЭ), 6J н 7j-cигнaл с 5 1 3 (т, У=14 1 и 7 0 Нг ЫСН2СНз) и 4 0 (м ЫСН2СНз), 6к и 7к-сигналы с б 1 9 и 2 3 (с С=ССНз) и 3 4 м д (с, ЫСН,)

HEP+RNH2-^lla-l,n, lla,b,e,f «!£ 12a,b,e,f CxeMa 3-lj-),n A+B+C+E A+B+C+E A+B+D+E

-O . <osoJb ^ ^o ^ <0S°Ä

0 \COOIl_ \ "

о

'но "o

OSO3II NUR1

инфицированный HEP (МНЕР) (звено ]

OSO3II NUR1 OSO3II NUR1

II EP (звено А) Модифицированный HEP (МНЕР) (звено В)

-о Л05^ <osoJb

OSO3II NHR1 OSO3H NUR1

MIIEP (звено D,R2=CH,OII) 1 МНЕР (звено Е)

2 о-с=о

"Ьс-J N11 , ,C=N

МНЕ!'(звено С, R2= ,N и/или _ _ _

н,с н,с о=с-о

Реагенты и условия а Н20, 20-22 "С, 2 ч, рН 4 7-4 8,Ь Н20, 20-22 °С, рН 7-8

При мсныюм соотношении НЕР/амин/EDC, равном 1 1 0 75, достигается 3675% конверсия карбоксильных групп HEP в ачидные Исключение составляет реакция HEP с таурином In, когда содержание звеньев В в конъюгате lin было всего 7%, тогда как содержание звеньев С было необычно высоким (68%) Увеличение EDC вдвое (до 1 5 кратного) позволило существенно повысить содержание звеньев В в полученных конъюгатах (за исключением 11а, в котором число амидных звеньев практически не изменилось) Отметим, что полученные в этих условиях конъюгаты Ilk и 111 целиком состоят из звеньев В, а в конъюгатах llg-j существенно возрастает содержание звеньев С, тогда как в конъюгате lin оно снижается до 30%, при этом BOjpaciaoi содержание звеньев В (25%) (таблица 4) Снижение содержания звеньев В в коныогла\ Не и llf, вероятно обусловлено протеканием реакции EDC с фенольной гидроксильной группой амидных остатков в этих конъюгатах с образованием звеньев Е с О-изоуреидофениламидными группами, число которых существенно возрастает Такие звенья обнаруживаются также в конъюгатах с аминосалициловыми кислотами - 11а и lib, однако содержание их заметно меньше,

14

что обусловлено, вероятно, снижением реакционной способности фенолмюго гидроксила, вызванного карбоксильной группой

В спектрах 'Н-ЯМР конъюгатов lla,b,c,f в области 5 ~3 м д наблюдаются два синглета, отвечающие различным Me2N-rpynnaM, которые могут находиться как в звеньях С, так и в звеньях Е Суммарное содержание звеньев С и Е в этих конъюгатах определяют из 'Н- ЯМР спектров, а содержание звеньев С - боргидридным восстановлением конъюгатов lla,b,e,f (схема 3) с последующей антроповой реакцией для анализа нейтральных Сахаров в конъюгатах 12а,Ь,с,f В результате установлено что конъюгаты 12а, 12Ь и 12е не содержат звеньев D Соответственно в конъюгатах 11а, lib и lie отсутствуют звенья С и оба сигнала Me2N-rpynn отвечают двум региоизомерным О-изоуреидофениламидным группам в звеньях Е С другой стороны в конъюгате 12f найдено 27% звеньев D, соответствующих такому же содержанию звеньев С в конъюгате llf Следовательно, один из двух наблюдаемых сигналов метальных протонов Me2N-rpynn в спектре 'Н-ЯМР конъюгата llf относится к О-изоуреидокарбонильным группам

При мольном соотношении НЕР/амина/EDC равном 1 3 3 увеличить содержание звеньев В удалось только в конъюгатах lib, lid и llj, при этом возрастало содержание звеньев Е в конъюгатах lla,b,c,f (таблица 4) Аномально высокое найденное значение для ариламидных групп (звенья В) в конъюгате lid (140%) объясняется, вероятно, образованием олигомерных ариламидных групп, что отмечалось для конъюгатов CS с и-аминобензойной кислотой Об этом свидетельствует повышенная интенсивность сигналов ароматических протонов в 'Н-ЯМР-спектре, увеличение числа сигналов атомов углерода арилышх групп в спектре |3С-ЯМР конъюгата lid (5 123 7, 124 0, 131 2, 132 5, 142 5, 143 8 мд) повышение растворимости в EtOH и батохромный сдвиг максимумов поглощения в УФ-спектр&х с увеличением содержания звеньев В в конъюгатах lid Следует отметить что из реакции HEP с амином id наряду с конъюгатом lid выделены олигомеры п-аминобензойной кислоты (^тах= 284 им)

Поскольку при взаимодействии НА с я-аминобензойной и аминосалицитовыми кислотами олигомерные ариламидные остатки или О-изоуреидоариламидные группы в соответствующих конъюгатах не были обнаружены, можно предположить, что причиной их образования в модифицированных производных 11ЕР и CS является присутствие в этих полисахаридах сульфатных групп

Таблица 4. Спектральные характеристики и содержание (%) звеньев А,В,С и Е в конъюгах 11 а-1,п

конъюгат уф-спектры (h20 >.nm им) 'h ЯМР-спектр" (5, м д) НЕРямин EDC =1 1 0 75 ПЕР яминEDC = 1115 НЕР аминEDC =13 3

Me2N наг В с е а* В с е л* В с е

11а 317 2 94 с, 3 02 с 7 1 >ш с, 7 7 >ш с, 8 0 >ш с 52 48 0 0 36 44 0 20 4 45 0 41

11b 268 и 306 2 95 с, 3 00 с 7 2 с, 7 3 уш с, 7 9 уш с 62 36 0 2 29 60 0 11 25 61 0 14

11с 259 и 303 - 7 3 уш с, 7 6 уш с, 8 1 уш с, 8 5 уш с 48 52 0 - 25 75 0 - 14 86 0 -

lid' 291,298, 317 - 7 8 уш с, 8 0 уш с 47 53 0 - 17 83 0 - 0 140" 0 -

lie 260 3 02 с, 3 06 с 7 1 уш с, 7 4 уш с 25 72 0 3 4 44 0 52 4 24 0 72

llf 281 и 308 2 99 с, 3 04 с 7 1 уш с, 7 3 уш с, 7 6 уш с 7 7 уш с 25 63 0 12 0 46 27 27 0 0 30 70

"g 258 2 94 с 7 9 уш с, 8 0 уш с 61 36 3 - 0 83 17 - 0 82 18 -

llh'' 263 2 95 с 7 8 уш с, 8 0 уш с 47 48 5 - 0 75 25 - 0 75 25 -

lli" 271 2 97 с 7 8 уш с, 8 1 уш с 25 70 5 - 0 90 10 - 0 90 10 -

п/ 273 2 94 с 7 8 уш с, 8 1 уш с 21 66 3 - 10 81 9 - 0 90 10 -

пк' 262 - 7 5 уш с, 7 7 уш с 25 75 0 - 0 100 0 - 0 100 0 -

111 266 - 8 2 уш с, 8 9 уш с 55 45 0 - 0 100 0 - 0 100 0 -

lln" - 3 01с - 25 7 68 - 45 25 30 - 20 44 36 -

а,Ь Приведены в таблице 3, с Аномально высокое (>100%) содержание звеньев В и батохромный сдвиг в УФ-спектрах конъюгатов lid (Лта\=291 нм для конъюгата, полученного при использовании 0 75 мол экв EDC, ?.тач 298 нм - 1 5 мол экв EDC, Хтач317 нм - 3 мол экв EDC) обусловлен образованием олигомерных фениленамидов, d В 'н-ямр спектре llh - сигнал с 5 2 0 м д (с, снзсо), lli-сигналы с 5 1 5 (т, У= 14 1 и 7 0 Hz, СН3СН20) и 4 5 м д (м, сн3сн2о), llj-сигнал с 8 1 4 м д (т, ./=14 1 и 7 0 Hz, nch2ch3), llk-сигналы с 8 2 4 (с, с=ссн3) и 3 4 (с, NCH3), lln - сигналы с 8 3 36 (т, 7=13 0 и 6 5 Hz, CH2S03) и 3 53 (т, J=12 54 и 6 27 Hz, ch2nh2)

2 Конъюгация гликозаминоглнканов с фармакозиачимымн клрбоиовымп кислотами

Коиъюгацию GAG по карбоксильным группам (GAG-COOH) с карбоксилсодержащими фармакофорами (RCOOH) осуществляют как правило путем сочетания дополнительно функционализированных диаминами GAG (GAG-CONHXNH2) с Л^гидроксисукцинимидными эфирами карбоновых кислот (NHS-эфирами)

GAG - СООН ^XNH2/EDCgag .^.nhxnh

RCOOH +

О

N-OH О

DCC

О -Rfc

Л-гидроксисукшшимид (N11S)

V1

О

NHS-эфнр

О о

II II

GAG - C-NHXNH-CR

К01ГМ0ГЯТМ

С использованием данного подхода ранее были синтезированы коныогаты НА с ибупрофеном (содержание 14% в расчете на дисачаридное звено НА) гидрокортизоном (25%) (Роиуат Т, 1994 г) и I1EP с тетрагидрокортизоном (0 4%) (Derdyshire Е, 1996 г )

С целью получения конъюгатов HEP, обладающих антимикробными и противовоспалительными свойствами, нами были вовлечены в реакцию сочетания антибиотик широкого спектра действия - [3-(5-метил)-1,3,4-т1К1диазолил)-2-тиометил)-7-(1-тетразолил-ацетамидо)-3-цефем-4]-карбоновая кислота (цсфазолин) (14а), противовоспалительные средства - и-аминобензойная кислота (14Ь) и D L-2-(4-изобутилфенит)пропионовая кислота (ибупрофен) (14с) В качестве диаминовых спейсеров использовали гидразин (13а), гексаметилендиамин (13 Ь) и 0,Ь-лизин (13с)

Взаимодействием IIEP с диаминами 13а-с в присутствии EDC получены т-амино-амиды 15а-с, очищенные трехкратным переосаждением из воды метанолом Их образование подтверждено 'Н-ЯМР спектрами (присутствием сигналов, характерных для остатков соответствующих диаминов 13а-с) и нингидриинои реакцией на свободные аминогруппы Поскольку реакция ПЕР с а-\-ацетилпроизводным лизина в тех же условиях не протекала, можно заключить, что амид 15с образовался по а-аминогруппе D L-лизина 13с Конверсия карбоксильных групп HEP в реакциях с гидразином 13а и лизином 13с составила 80-100%, с гексаметилендиамином 13Ь - 20% Карбоксильные группы фармакофоров 14а-с

были активированы превращением их в соответствующие Т^Ш-эфиры 16а-с (схема 4)

кпдмн,. 131-е и НЕР - СООИ---НЕР - С-ШХМ!,

Схема 4.

ИСООИ + N115 14а-с

О

н

1*С-

о

15а-с О

О-^

.Г О 16д-с

° 9 н н

НЕР - с-гшхгчн-ск

17-21

15а+16с

■17, 15Ь + 16а 18, 15с+16а-

19,15с+16Ь

-20, 15с+16с-

21

X отсутствует (13а, 15а, 17), Х= -(СН2)6- (13Ь, 15Ь,18), -(СН2)4СН- (13с, 15с,19,20,21)

СООН

К= 16а, 18,19),"<Г1^Н,(14Ь, 16Ь, 20)/ ("с, 16с, 17,21)

1ЧчО I » 3 * СИ,

А |1 3

N — N Редгешы II условия

а [НЕР]=0015 ммоль/мл НЕР/13а-с/ЕОС=1 25-40 3-5, Н20, рН 4 7-4 8, 20-25»С, 2 ч, Ь С,НИЫ=С=КС(НП(ОСС)Л№18]=0 1-0 2 ммоль/мл, 1ЧН5/14а-с/ОСС=1 1 Ю5,ОМР, 0-20°С 5-60 мни

с [15а-с]-0 02 \iMOji ь/мл, 15л-с/16а-с=1 4-5, (0 1М НаНС03/Н20)/0МР(1 1), рН = 8 5, 20°С 16-20ч

Содержание фармакофоров в полученных конъюгатах 17-21 определяли из соотношения приведенных к одному протону суммарных интенсивностей характеристических сигналов, отвечающих остаткам соответствующих кислот 14а-с (2 8 м д - Ме-С=М-группа в конъюгатах 18, 19, 6 9 и 7 7 м д - НАг в конъюгате 20 и 7 1-7 5 м д - НАг в конъюгатах 17, 21), и аномерных протонов в углеводном остове коныогатов 17-21 (5 5 1-5 5 м д) в спектрах 'Н ЯМР

О сн,

НЕР-С1ЧИ1ЧНС' ^ ^ О

сн.

сн3

17

омр-мн

911, г

V

N

N—N

О =9-N11

СН,

У-Г1 14—14

\1 О

N "Л® I

0=CNH(CH2),

N—N

8а8Л-с„з

0=С NII (С Н2)4СН N¿-11 ЕР СООН

О СООН НЕР-СТНСН(СН2)^Н 21 О

.МНС-^ЕР 18 О

о СООН HEP-CNHCH(CHJ)4NH^Ч /"N112 О

20

СН,

\\ /г

сн3

СН,

Из НА, гидразина 13а и ибупрофена 14с синтезирован по той же схеме конъюгат 22, а из Св, 0,Ь-лизина 13с и ибупрофена 14с - конъюгат 23

о 9"з_ С11 о соон си3

на—► иасмшнс/ч^^л,!,, >с8 —с8йчнакснг)4№19'а^__^члс1ь о 22 23 О

Содержание остатков ибупрофена в конъюгатах 22 и 23 определяли из соотношения приведенных к одному протону суммарных интепсивпостеи сигналов ароматических протонов фармакофора (5 7 1-7 5 м д ) и метильных протонов МеССЫ-групп (5 ~2 1 м д) в спектрах 'Н ЯМР

Характеристики конъюгатов 17-23 приведены в таблице 5

Таблица 5 Данные УФ- и *Н ЯМР-спектров и содержание фармакофорных групп в конъюгах 17-23 (а, % мольн )

конъюгат УФ-спектр (Н20, Хтах, нм) 'Н ЯМР-спектр (020, 5, м д ) а

17 264 7 1-75 (м, НАг) 85

18 272 2 8 (с, ЗН, Ме-С=>1), 5 6 (с, 1Н, СН-в), 9 4 (с, 1Н, Ы-СН=Ы) 5

19 272 2 8 (с, ЗН, Ме-С=М), 5 6 (с, 1Н, СН-Б), 9 4 (с, 1Н,Ы-СН=Ы) 10

20 276 6 9 (м, 2Н, НАг) и 7 7 (м, 2Н, НАг) 32

21 264 7 1-75 (м, НАг) 46

22 263 7 1-75 (м, НАг) 64

23 264 7 1-75 (м, НАг) 80

3. Бнодеграднруемость конъюгатов гиалуроповой кислоты

Важной характеристикой полимеров медицинского назначения является их биодеградируемость Нами исследована биодеградируемость синтезированных конъюгатов ПА под действием гиалуронидазы После 20-часовой инкубации водных растворов конъюгатов (4мг/мл) с гиалуронидазой (активность 3 уе/мл) при 37°С (рН 6 8) к раствору приливали трехкратное (по объему) количество этанол осадок отделяли центрифугированием, продукты биодеградации в супернатанте количественно анализировали реакцией Дише на уроновые кислоты а

1,4

г 1,2

3 1

о I | 0,8

| 0,6

4 0,4

о '

« 0,2

и

< £ "««'й ил « с 01

о

о I

!<»* Iе*

I02

* О

й 1 О 1

|вл |0£

1т

К

а 15 22 2в 35 4 5 50%

Содержание звеньев В

О 5 ) 13 И «94

Содержание звеньев В

Рис.5. а; Б и одетрадиру е м ость конъюгатов НА (с содержанием звеньев В 20-40% по всех коныогатах, кроме 2) и 2«, содержание звеньев 11 В которых составили 10 и 15% соответственно) 2ш (с аиилшюм), 2с (с антранюювой к-тон), 21 (с анестезином), 21 (с июни азидом) 2(1 (с /¡-пминобензойпой к-той), 2Г (с с-амниофенолом), 2с (с п-амшмфеишчм). 21) (с 4-амин о салициловой к-той), 2а (с 5-аминосалициловой к-той), 2 о (с ремантадином), 2j (с новокаином), 2р (с 7-аминоцефалоспориновой к-той), 21] (с еульфацил-н атрием), 2п (с тауриком), 2% (со стрептоцидом), 6 и в: Бкодеградируемость кОнъюгатов 2с 1с л-аминофеколом) (о) и 2к (с 4-аминоантипирином) (в) н зависиЩюти от конверсии кйрбЬксигр)пп НА в амидные.

Установлено, что биодеградируемость конъюгатов 2а-р зависит от природы амидных звеньев (рис, 5а) и их содержания в конъюгате (рис, 5б,в). $иодеградир\ емость конъюгатов 2с. 2\ и 2р была выше (на 10-30%), чем нативной Пд, конъюгатов 2(1, 2( и 21 - па уровне НА, а биодеградируемость конъюгатов 2а, 21) и 2с на 20-35% ниже. Для конъюгатов 21) и 2} с высоким содержанием изоуреидо карбонильных звеньев биодеградируемоеть оказалась существенно ниже (на 7()-К5%) по отношению к этому показателю для ПА,

В результате проведенного в Новосибирском ИОХ им Н Н Ворожцова СО РАН исследования противоопухолевой активности синтезированных коныогатов вАв на мышах самках линии С57В1/6 с перевиваемой аденокарциномой Льюис найдены выраженные противоопухолевые свойства у копъюгата 14п (ИГР с таурином) По данным исследований на моделях воспаления, вызванного каррагенином и гистамином, выявлена противовоспалительная активность конъюгатов НА и НЕР с таурином и НЕР с лизин-ибупрофеноч (конъгагаты 2п 14п и 21 соответственно)

При исследовании в лаб конструирования биологически активных веществ ИНК РАН анальгезирующей активности на модели «уксусных корчей», вызванных внутрибрюшинным введением крысам 1 мл -1% раствора уксусной кислоты (доза 40 мг/кг), установлено, что конъюгат 2к (НА с 57 % остатка 4-аминоантипирина (4-ААП)) снижал частоту болевых проявлений в 1 9 раза, а конъюгат 14К (ПЕР с 72 % 4-ААП ) - в 1 6 раза по сравнению с контрольной группой (нелеченных) животных Конъюгат 6к (С8 с 75% 4-ААП) показал на 15% более высокую активность по сравнению с анальгином, который в той же дозе снижал частоту болевых проявлений в 2 3 раза

ВЫВОДЫ

1 Исследована модификация природных гликозаминогликанов -гиалуроновой кислоты, гепарина и хондроитинсульфатов с фармакозначимыми аминосодержащими соединениями, обладающими противовоспалительными, антимикробными и анестезирующими свойствами, в присутствии водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида Разработаны эффективные методы конъюгации, аналитические и спектральные методы идентификации и количественного определения модифицированных (ариламидных и изоуреидокарбонильных) звеньев в конъюгатах гликозаминогликанов с аминами Выявлен ценный для количественного определения ариламидных звеньев экранирующий магнитно-анизотропный эффект ароматического кольца ариламидной группы модифицированного звена на метальные протоны ацетамидной группы соседнего Л-ацетиламинопиранозильного звена гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов

2 Синтезированы новые конъюгаты гликозаминогликанов с высоким содержанием амидных звеньев Установлено, что в зависимости от природы

амина и соотношения реагентов конъюгаты гиалуроновой кислоты включают звенья с амидными (5-83%) и изоуреидокарбонильными группами (0-50%) В структуру производных гепарина входят звенья с амидными (36-100%), изоуреидокарбонильными (0-30%) или (для конъюгатов с аминофенолами) изоуреидофениламидными группами (11-72%) Конъюгаты

хондроитинсульфатов содержат звенья с амидными (19-100%) и изоуреидокарбонильными группами (0-60%) В состав конъюгатов дерматансульфата входят фрагменты с амидными (26-75%) и изоуреидокарбонильными (0-50%) группами Конъюгаты гепарина и хондроитинсульфатов с я-аминобензойной кислотой содержат звенья с олигомерными фениламидными группами

3 Сочетанием дополнительно функционализированных диаминами природных гликозаминогликанов и Л'-гидроксисукцинимидных эфиров фармакозначимых карбоновых кислот синтезированы новые конъюгаты гепарина с я-аминобензойной кислотой (32% модифицированных звеньев), ибупрофеном (46-85%) и антибиотиком цефазолином (5-10%), а также конъюгаты гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов с ибупрофеном (64 и 80% соответственно)

4 Изучена ферментативная биодеградируемость конъюгатов гиалуроновой кислоты и установлена ее зависимость от природы и содержания модифицированных звеньев Показано, что биодеградируемость конъюгатов с содержанием амидных звеньев до 30% такая же, как у природной гиалуроновой кислоты, тогда как с дальнейшим увеличением конверсии карбоксильных групп биодеградируемость снижается, особенно для конъюгатов с изоуреидокарбонильными группами

5 Выявлены анальгезирующее действие конъюгатов гликозаминогликанов с 4-аминоантипирином, противовоспалительная активность конъюгатов гиалуроновой кислоты и гепарина с таурином и конъюгата гепарина с ибупрофеном, а также противоопухолевые свойства конъюгата гепарина с таурином

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

1 И Ю Понедельника, В Н Одиноков, Е С Вахрушева*, М Т Голикова JIМ Халилов, У М Джемилев Модификация гиапуроновой кислоты ароматическими аминокислотами // Биоорг химия 2005 Т31 №1 С 90-95

2 И10 Понеделькина, В Н Одиноков, Е С Лукина, Т В Тюмкина J1 М Халилов, У М Джемилев Химическая модификация гепарина // Биоорг химия 2006 Т 32 №5 С 524-529

3 И10 Понеделькина, В Н Одиноков, Е С Лукина, Р Ш Суфиярова, Т И Парфенова, С А Башкатов, Н Г Сибагатуллин, У М Джемилев Способ получения модифицированных гликозаминогликанов, обладающих анальгезирующими свойствами Патент РФ № 2283320 Б И № 25 (2006)

4 И Ю Понеделькина, В Н Одиноков, Е С Лукина, Н Г Сибагатуллин, ИФ Суфияров, ЕМ Серик, УМ Джемилев Способ получения конъюгатов гепарина Заявка № 2005105549 Решение о выдаче патента РФ от 20 11 2006 г

5 И10 Понеделькина, В Н Одиноков, Е С Лукина, Э А Саитгалина, У М Джемилев, О В Иванова Способ получения модифицированного дерматансульфата Заявка № 2005135929 Положительное решение от 09 02 2006 г

6 ЕС Вахрушева, И Ю Понеделькина, В Н Одиноков Модификация гликозаминогликанов ачиносалициловыми кислотами при участии 1-тгил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида // Тезисы XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, г Казань, 2003 г С 181

7 И10 Понеделькина, Е С Вахрушева*, Д В Бармин, В Н Одиноков Модификация гликозаминогликанов ароматическими аминокислотами при участии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида// Тезисы конференции "Пробчемы создания новых лекарственных средств", г Уфа, 2003 г С 93

8 ЕС Вахрушева*, И Ю Понеделькина, В Н Одиноков Метод карбодиимидной конъюгации в модификации гиапуроновой кислоты и гепарина биологически значимыми аминами // Тезисы международной научной конференции 'Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений", г Алчаты, 2003 г С 117

9 И10 Понеделькина, Е С Вахрушева*, В Н Одиноков, Л М Халилов УМ Джемилев Модификация гликозаминогликанов по карбоксильным группам// Тезисы международной научно-технической конференции "Перспективы развития

* Вахрушева Е С сменила фамилию на Лукину Е С

23

химии и практического применения алициклических соединений", г Самара, 2004 г С

10 ЕС Лукина, ИЮ Понеделькина, РШ Суфиярова, ВН Одиноков Противовоспалительные и анапьгезирующие свойства модифицированных гликозаминогликанов // Тезисы V Всероссийского научного семинара и Молодежной научной школы "Химия и медицина", г Уфа, 2005 г С 48-49

11 ЕС Лукина Синтез конъюгатов гиалуроновой кислоты и гепарина с первичными аминами в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида // Материалы III конкурса научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН РБ г Уфа, 2005 г С 24

12 ЕС Лукина, И Ю Понеделькина, В Н Одиноков Синтез конъюгатов гепарина с 0,1-2-(4-изобутилфенил)пропионовой кислотой (ибупрофеном) // Тезисы Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бельштейна до современности» г Санкт-Петербург, 2006 г С 763

13 ТВ Помкина, И Ю Понеделькина, Е С Лукина, Л М Халилов Стереохимия новых вторичных ароматических амидов гиалуроновой кислоты // Тезисы XIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем», г Яльчик, 2006 г С 251

91

Соискатель-

ЛУКИНА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

КОНЪЮГАЦИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ С АМИНАМИ И КАРБОНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

02 00 03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Лицензия № 0177 от 10 06 96г Подписано в печать 07 12 2006г Бумага офсетная Отпечатано на ризографе Формат 60x84'/i6 Уел-печ л 1,57 Уч -изд л 1,86 Тираж 120 экз Заказ №409

450000, г Уфа, ул Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА»

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. КИСЛЫЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ И ИХ ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ

1.1. Структура, свойства и применение гликозаминогликанов

1.2. Комплексные соединения

1.3. Химическая модификация

1.3.1. Сульфатированные и десульфатированные гликозаминогликаны

1.3.2. Сложные эфиры гликозаминогликанов со спиртами и карбоновыми кислотами

1.3.3. Нитропроизводные гликозаминогликанов

1.4. Амиды гликозаминогликанов

1.4.1. Карбодиимидная конъюгация

1.4.2. Образование амидов через сукцинимидные эфиры

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ >

2.1. Конъюгация гликозаминогликанов с фармакозначимыми аминами '

2.1.1. Конъюгаты гиалуроновой кислоты

2.1.2. Конъюгаты хондроитинсульфатов

2.1.3. Конъюгаты гепарина

2.2.Конъюгация гликозаминогликанов с фармакозначимыми карбоновыми кислотами

2.3. Исследование биологической активности конъюгатов

2.3.1. Биодеградируемость конъюгатов гиалуроновой кислоты

2.3.2. Анальгезирующая активность конъюгатов гликозаминогликанов с 4-аминоантипирином

2.3.3. Противовоспалительная активность конъюгатов гликозаминогликанов с таурином и ибупрофеном

2.3.4. Противосвертывающие свойства конъюгатов гликозаминогликанов

2.3.5. Противоопухолевая активность конъюгатов гликозаминогликанов

2.3.6. Антиметастатическое действие конъюгатов гликозаминогликанов

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Методики аналитических реакций

3.2. Получение гликозаминогликанов

3.2.1. Гиалуроновая кислота (НА) и хондроитинсульфаты (CS)

3.2.2. Дерматансульфат (DS)

3.2.3. Гепарин (HEP) 79 3.3 Конъюгаты гиалуроновой кислоты с аминами

3.4. Аддукт гиалуроновой кислоты с EDC,

3.5. Конъюгаты 3a-3d и 5 - продукты гидридного восстановления

3.6. Конъюгаты хондроитинсульфатов и дерматансульфата с аминами

3.7. Аддукт хондроитинсульфатов с EDC

3.8. Конъюгаты 10a,10b,10d,10g,10h,10j и 9 - продукты гидридного восстановления

3.9. Конъюгаты гепарина с аминами . 83 ЗЛО. Аддукт гепарина с EDC

3.11. Конъюгаты 12a,12b,12e,12f и 14 - продукты гидридного восстановления

3.12. Конъюгаты гепарина с карбоновыми кислотами через диаминовые спейсеры

3.12.1. Конъюгат с гидразином-ибупрофеном

3.12.2. Конъюгат с гексаметилендиамином-цефазолином

3.12.3. Конъюгат с 0,Ь-лизином-цефазолином

3.12.4. Конъюгат с 0,Ь-лизином-«-аминобензойной кислотой

3.12.5. Конъюгат с Б,Ь-лизином-ибупрофеном

3.13. Конъюгат гиалуроновой кислоты с гидразином-ибупрофеном

3.14. Конъюгат хондроитинсульфатов с 0,Ь-лизином-ибупрофеном

ВЫВОДЫ

Гиалуроновая кислота, гепарин и хондроитинсульфаты - кислые гликозаминогликаны из класса гетерополисахаридов входят в состав внеклеточного матрикса и выполняют важные функции в живом организме. Создание биосовместимых полимеров медицинского назначения -перспективная область исследований, одним из приоритетных направлений которой является разработка природных, полусинтетических и композиционных материалов на основе гликозаминогликанов. Данное направление особо значимо для хирургии, где требуется устранение дефектов тканей и органов и ускорение процессов репарации и регенерации. Гликозаминогликаны участвуют практически во всех процессах обмена соединительной ткани и могут оказывать модулирующее влияние на дифференциацию её клеточных элементов. На основе гликозаминогликанов создан ряд лекарственных препаратов для хирургии, лечения ожоговой болезни, трофических язв и артритов различной этиологии. |

В последние годы внимание исследователей привлекают химически модифицированные гликозаминогликаны в качестве неиммуногенных биосовместимых материалов с новыми, полезными для медицины свойствами. Химическая модификация низкомолекулярными фармакофорами может придать гликозаминогликанам дополнительные полезные свойства: антимикробные, противовирусные, противовоспалительные, анальгезирующие, анестезирующие и др., при этом могут значительно измениться физико-химические и биологические свойства полисахаридов. Это позволит существенно расширить области применения Автор выражает глубокую благодарность директору ИНК РАН, член-корр. РАН Усеину Меметовичу Джемилеву за неоценимую помощь в постановке данной работы и содействие в процессе ее выполнения. производных гликозаминогликанов как в качестве самостоятельных лекарственных препаратов, так и в качестве адъювантов.

Особый интерес представляют конъюгаты гликозаминогликанов с биологически активными соединениями. Такого рода модифицированные гликозаминогликаны с пролонгированным терапевтическим эффектом направленного действия относятся к лекарственным препаратам нового поколения.

В этой связи исследование конъюгации гликозаминогликанов с фармакологически значимыми амино- и карбоксисодержащими соединениями, изучение структуры и свойств полученных конъюгатов представляется актуальной задачей.

В результате проведенных исследований были разработаны эффективные методы конъюгации гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов и гепарина по карбоксильным группам с фармакозначимыми аминами и карбоновыми кислотами. Синтезированы новые конъюгаты гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов и гепарина взаимодействием с аминосодержащими соединениями в водной среде в присутствии 1 -этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида. Получены новые конъюгаты гликозаминогликанов с карбоксилсодержащими фармакофорами через диаминовые спейсеры и TV-гидроксисукцинимидные эфиры. Предложены аналитические и спектральные методы определения содержания звеньев с амидными, изоуреидокарбонильными, изоуреидофениламидными и олигомерными ариламидными группами в модифицированных гликозаминогликанах. На основании данных спектроскопии ЯМР выявлено экранирующее влияние магнитно-анизотропных ароматических колец ариламидных групп на метальные протоны ацетамидных групп в соседних N-ацетилглюкозамино- и N-ацетилгалактозаминопиранозильных звеньях гиалуроновой кислоты и, соответственно, хондроитинсульфатов, что использовано при определении конверсии С02Н-групп в ариламидные. Изучена биодеградируемость конъюгатов гиалуроновой кислоты под действием фермента гиалуронидазы. Выявлены анальгезирующее действие конъюгатов гликозаминогликанов с 4-аминоантипирином, противовоспалительная активность конъюгатов гликозаминогликанов с таурином и противоопухолевые свойства конъюгата гепарина с таурином.

Работа выполнялась в Институте нефтехимии и катализа РАН при финансовой поддержке Отделения химии и наук о материалах РАН по программе «Биомолекулярная и медицинская химия» (проекты «Полусинтетические биополимеры медицинского назначения на основе модифицированных гликозаминогликанов», 2005 г. и «Модифицированные гликозаминогликаны как потенциальные лекарственные средства для химиотерапии ВИЧ-инфекции и опухолевых заболеваний», 2006 г.).

Автор выражает благодарность ft» f С» 11» с. Понеделькипой < Ирине Юрьевне за научно-методическое руководство и постоянную помощь при выполнении работы. * v

выводы

1. Исследована модификация природных гликозаминогликанов -гиалуроновой кислоты, гепарина и хондроитинсульфатов с фармакозначимыми аминосодержащими соединениями, обладающими противовоспалительными, антимикробными и анестезирующими свойствами, в присутствии водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида. Разработаны эффективные методы конъюгации, аналитические и спектральные методы идентификации и количественного определения модифицированных (ариламидных и изоуреидокарбонильных) звеньев в конъюгатах гликозаминогликанов с аминами. Выявлен ценный для количественного определения ариламидных звеньев экранирующий магнитно-анизотропный эффект ароматического кольца ариламидной группы модифицированного звена на метальные протоны ацетамидной группы соседнего TV-ацетиламинопиранозильного звена гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов.

2. Синтезированы новые конъюгаты гликозаминогликанов с высоким содержанием амидных звеньев. Установлено, что в зависимости от природы амина и соотношения реагентов конъюгаты гиалуроновой кислоты включают звенья с амидными (5-83%) и изоуреидокарбонильными группами (0-50%). В структуру производных гепарина входят звенья с амидными (36-100%), изоуреидокарбонильными (0-30%) или (для конъюгатов с аминофенолами) изоуреидофениламидными группами (11-72%). Конъюгаты хондроитинсульфатов содержат звенья с амидными (19-100%) и изоуреидокарбонильными группами (0-60%). В состав конъюгатов дерматансульфата входят фрагменты с амидными (26-75%) и изоуреидокарбонильными (0-50%) группами. Конъюгаты гепарина и хондроитинсульфатов с и-аминобензойной кислотой содержат звенья с олигомерными фениламидными группами.

3. Сочетанием дополнительно функционализированных диаминами природных гликозаминогликанов и iV-гидроксисукцинимидных эфиров фармакозначимых карбоновых кислот синтезированы новые конъюгаты гепарина с я-аминобензойной кислотой (32% модифицированных звеньев), ибупрофеном (46-85%) и антибиотиком цефазолином (5-10%), а также конъюгаты гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов с ибупрофеном (64 и 80% соответственно).

4. Изучена ферментативная биодеградируемость конъюгатов гиалуроновой кислоты и установлена ее зависимость от природы и содержания модифицированных звеньев. Показано, что биодеградируемость конъюгатов с содержанием амидных звеньев до 30% такая же, как у природной гиалуроновой кислоты, тогда как с дальнейшим увеличением конверсии карбоксильных групп биодеградируемость снижается, особенно для конъюгатов с изоуреидокарбонильными группами.

5. Выявлены анальгезирующее действие конъюгатов гликозаминогликанов с 4-аминоантипирином, противовоспалительная активность конъюгатов гиалуроновой кислоты и гепарина с таурином и конъюгата гепарина с ибупрофеном, а также противоопухолевые свойства конъюгата гепарина с таурином.

1. Vercruysse К.Р., Prestwich G.D. Hyauronate derivatives in drug delivery.// Therapeutic Drug Carrier Systems. - 1998. - Vol. 15. - № 5. - P. 513-555.

2. Laurent T.C., Fraser R.E. Hyaluronan // The FASEB J. 1992. - Vol. 6 - P. 2398-2404.

3. Carbohydrate analysis. A practical approach. / Edited by M.F. Chaplin, J.F. Kennedy. Oxford, Washington DC: IRL Press, 1986.

4. Sugahara K., Schwartz N., Dorfman A. Biosynthesis of hyaluronic acid by Streptococcus. II J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254. - № 14. - P. 6252-6261.

5. Van de Rijn I. Streptococcal hyaluronic acid: proposed mechanisms of degree and loss of synthesis during stationary phase. II J. Bacteriol. 1983. -Vol. 156. -№ 3. - P. 1059-1065.

6. Abetamann V., Kern H. F., Elsaesser H.-P. Differential expression of thehyaluronan receptors CD44 and RHAMM in human pancreatic cancer cells. // Clin. Cancer Res. 1996. - Vol. 2. - P. 1607-1618.

7. Scott J.E., Heatley F., Moorcroft D., Olavesen A.H. Secondary structures of hyaluronate and chondroitin sulphates. A 1H n.m.r. study of NH signals in dimethyl sulphoxide solution. // Biochem. J. 1981. - Vol. 199. - P. 829832.

8. Scott J.E., Heatley F. Detection of secondary structure in glycosaminoglycans via the !H n.m.r. signal of the acetamido NH group. // Biochem. J. 1982. - Vol. 207. -P. 139-144.

9. Scott J.E., Heatley F. Secondary structure of of Hyaluronate in solution. //

10. Biochem. J. 1984. - Vol. 220. - P. 197-205.

11. Scott J.E., Heatley F., Wood B. Comparison of Secondary Structures in Water of Chondroitin-4-sulfate and Dermatan sulfate: Implications in the Formation of Tertiary Structures. // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 15467-15474.

12. Coster L, Hernnas J, Malmstrom A. Biosynthesis of dermatan sulphate proteoglycans. The effect of beta-D-xyloside addition on the polymer-modification process in fibroblast cultures. // Biochem J. 1991. - Vol. 276.- № 2. P. 533-539.

13. Scott J.E. Supramolecular organization of axtracellular matrix glycosaminoglycans in vitro and in the tissues. // The FASEB J. 1992. -Vol.6.-P. 2639-2645.

14. Casu В., Choay J., Ferro D.R., Gatti J., Jacquinet J.-C., Petitou M., Provasoli A., Ragazzi M., Sinay P., Torri G. Controversial glycosaminoglycan conformation. // Nature. 1986. - Vol. 322. - № 6076. - P. 215-216.

15. Ferro D.R., Provasoli A., Ragazzi M. Conformer populations of L-iduronic acid residues in glycosaminoglycan sequences. // Carbohydr. Res. 1990. -Vol. 195,-№2.-P. 157-167.

16. Hagner-McWhirter A., Lindhal U., Li J. Biosynthesis of heparin/heparan sulphate: mechanism of epimerization of glucuronyl C-5. // Biochem. J. 2000. V. 347. P. 69-75.

17. Lindahl U., Backstron G., Thunberg L., Leder I.G. Evidence for a 3-0-sulfated D-glucosamine residue in the antithrombin-binding sequence of heparin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980.-Vol. 77.-№ 11.-P. 65516555.

18. Lindahl U., Lidholt K., Spillman D., Kjellen L. More to "heparin" than anticoagulation. // Thrombosis Res. 1994. - Vol. 75. - P. 1-32.

19. Sanderson P.N., Huckerby T.N., Nieduszynski I.A. Conformational equilibria of alpha-L-iduronate residues in disaccharides derived from heparin. //Biochem. J. 1987. - Vol. 243. - P. 175-181.

20. Mulloy В., Forster M.J., Jones Ch., Davies D.B. N.m.r. and molecular-modeling studies of the solution conformation of heparin. // Biochem. J. -1993.-Vol. 293.-P. 849-858.

21. Mikhailov D., Mayo K.H., Vlahov I., Toida Т., Perlin A., Linhardt R.J. NMR solution confonnation of heparin-derived tetrasaccharide. // Biochem. J. 1996. - Vol. 318. - P. 93-102.

22. Mikhailov D., Linhardt R. J., Mayo K.H. NMR solution conformation of heparin-derived hexasaccharide. // Biochem. J. 1997. - Vol. 328. - P. 5161.

23. Hricovini M., Guerrini M., Bisio A. Structure of heparin-derived tetrasaccharide complexed to the plasma protein antithrombin derived from NOEs, J-coupling and chemical shifts. // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 261.-P. 789-801.

24. Mulloy В., Forster M.J. Conformation and dynamics of heparin and heparan sulfate. // Glycobiology. 2000. - Vol. 10.-№ 11.-P. 1147-1156.

25. Cavalieri F., Chiessi E., Paci M., Paradossi G., Flabiani A., Cesaro A.11

26. Conformational dynamics of hyaluronan in solution. С NMR study of oligomers // Macromolecules. 2001. - Vol. 34. - P. 99-109.

27. Hricovini M., Guerrini M., Bisio A., Petitou M., Torri G., Casu B. Conformation of heparin pentasaccharide bound to antithrombin III. // Biochem. J. 2001. - Vol. 359. - P. 265-272.

28. Nieduszynski I.A. Conformation of the mucopolysaccharides. // Biochem. J. 1973.-Vol. 135.-P. 729-733.

29. Scott J.E., Tigwell M.J. Periodate Oxidation and Shapes Glycosaminoglycuronans in Solution. // Biochem. J. 1978. - Vol. 173. -P. 103-114.31 .Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна. 2005. С. 478.

30. Johns D.B., Rodgers K.E., Donahue W.D. Reduction of adhesion formation by postoperative administration of ionically cross-linked hyaluronic acid. // Fertil. Steril. 1997. - Vol. 68. - № 1. - P. 37-42.

31. Kyotaro H. Hair nourishing cosmetic. //Пат. JP 63215617. 1988*.

32. Imperatori D. Promo I. Compound for protecting nourishing and treatinghair, scalps eyelashes and nails. //Пат. ЕР 0378519. 1990*.

33. Gazzani G. Composition having hair stimulation activity. // Пат. ЕР 297455. 1989*.

34. Damian J.G. Hyaluronic acid-urea pharmaceutical compositions utilized for treatment of diseases of cutis // Пат. US 5631242. 1997*.

35. Falk R.E. et al. Formulations containing hyaluronic acid // Пат. US 6114314.2000*.

36. Самойленко И.И., Самойленко О.И. Улучшенная медицинская форма человеческого интерферона: суппозитории. // Пат. РФ 2142898. Б.И. № 11 (2000).

37. Самойленко И.И., Самойленко О.И., Хорошева Т.В., Мордвинцева Э.Ю., Хмеленко Т.И. Вводимая перорально, ректально или интравагинально композиция, содержащая живые бактерии. // Пат. РФ 2182008. Б.И. № 6 (2002).

38. Ceschel G.C., Maffei P., Lombardi B.S., Ronchi C., Rossi C. Development of a mucoadhesive dosage form for vaginal administration. // Drug Dev. lnd. Pharm. 2001. - Vol. 27. - № 6. - P. 541-547.

39. Matsumoto Y., Yamamoto I., Watanabe Y., Matsumoto M. Enhancing effect of viscous sodium hyaluronate solution on the rectal absorption of morphine. // Biol. Pharm. Bull. 1995. - Vol. 18. - № 12. - P. 1744-1749.

40. Moor A.R., Willoughby D.A. Hyaluronan as a drug delivery system for diclofenac: a hypothesis for mode of action. II Int. J. Tissue React. 1995. -Vol. 17.-№4.-P. 153-156.

41. Барабаш JI.C., Барабаш H.A., Журавлева И.Ю. Биопротезы клапанов сердца: проблемы и перспективы. Кемерово. 1995.

42. Бычков С.М. Новые данные о гепарине. // Вопросы медицинской химии. -1981.-№6.-С. 726-735.

43. Lapierre F., Holme К., Lam L. Chemical modification of heparin that diminish anticoagulant but preserve its heparanase-inhibitory, angiostatic, anti-tumor and anti-metastatic properties. // Glycobiology. 1996. - Vol. 6. -№ 3. - P. 355-366.

44. Rider C.C. Chemical modification of heparin that diminish anticoagulant but preserve its heparanase-inhibitory, angiostatic, anti-tumor and anti-metastatic properties. // Glyconj. J. 1997. - Vol. 14. - № 5. -P. 639-642.

45. Harrop H.A., Rider C.C. Heparin and its derivatives bind to H1V-1 recombinant envelop glycoproteins, rather than to recombinant HIV-1 receptor, CD4.II Glycobiology.- 1998.-Vol. 8.-№2.-P. 131-137.

46. Яжебински Дж., Тонска С. О некоторых комплексных соединениях гепарина. Гравиметрическое и колориметрическое определениямукополисахарида в виде комплексов с некоторыми красителями. // Acta. Pol Pharm. 1986. - Vol. 43. - № 5. - P. 454-460.

47. Понеделькина И.Ю., Карабанов Ю.Р., Башкатов С.А., Джемилев У.М., Вахитов В.А., Давлетов Э.Г., Гатауллин Н.Г., Костромина Л.Е., Ижбульдин Р.И., Чемерис А.В., Щекин С.В. Способ формирования гепаринизированной поверхности. // Пат. РФ 2155593. № 25 (2000).

48. Понеделькина И.Ю., Сибагатуллин Н.Г., Башкатов С.А., Джемилев У.М., Плечев В.В., Гатауллин Н.Г., Абу Хашум Маджид М., Суфиярова Р.Ш., Парфенова Т.И. Способ получения протезов кровеносных сосудов. // Пат. РФ 2241414. № 34 (2004).

49. Diakun G.P., Edwards Н.Е., Allen J.C., Phillips G.O., Gundall R.B. A simple purpose-built fluorimeter for the titrimetric assay of glycosaminoglycans. II Anal Biochem. 1979. - Vol. 94. - P. 378-382.

50. Mabe P., Valiente A., Soto V., Cornejo v., Raimann E. Evaluation of reliability for urine mucopolysaccharidosis screening by dimethylmethylene blue and Berry spot tests. // Clin. Chim. Acta. 2004. - Vol. 345. - № 1. -P. 135-140.

51. Tadashi U., Yoshiaki Т., Shinji N. Water insoluble biocompatible hyaluronic and polyion complex and method of making the same. // Пат. ЕР 0544259A1. 1992*.

52. Denuziere D., Ferrier 0., Damour 0., Domard A. Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes: biological properties. // Biomaterials. 1998. - Vol. 19. - P. 1275-1285.

53. Denuziere A., Ferrier D., Domard A. Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes. Physico-chemical aspects. // Carbohydr. Polym. 1996. - Vol. 29. - P. 317-323.

54. Denuziere A., Ferrier D., Damour 0. Interaction between chitosan and glycosaminoglycans (chondroitin sulfate and hyaluronic acid): physicochemical and biological studies. // Ann. Pharm. Fr. 2000. - Vol. 58. -№ l.-p. 47-53.

55. Kofuji K., Ito Т., Marata Y., Kawashima S. Effect of chondroitin sulfate on the biodegradation and drug release of chitosan gel beads in subcutaneous air pouches of mice. //Biol. Pharm. Bull. 2002. - Vol. 25. - № 2. - P. 268271.

56. Baumann H., Keller R. Partially cationized cellulose for non-thrombogenic membrane in the presence of heparin and endothelial-cell surface-heparansulfate. II J. Membr. Sci. 1991.-Vol. 61.-P. 253-268.,

57. Xinghang M., Fazal M.S., Wan K.S. Heparin binding on poly(L-lysine)-immobilized surface. II J. Colloid Interface Sci. 1991. - Vol. 147. -№ 1. -P. 251-261.

58. Scott J.E. The precipitation of polyanions by long-chain aliphatic ammonium salts. I I Biochem. J. 1961. - Vol. 81. - P. 418-424.

59. Стейси M., Баркер С. Углеводы живых тканей. Пер. с англ. М: Мир, 1965. (Stacey М., Barker S. Carbohydrates of living tissues. D. Van Nostrand Company LTD, London, 1964.)

60. You N., Oya Т., Sato I. Chemically modified hyaluronic acid or salts thereof, and a process for producing thereof. // Пат. US 6673919. 2004*.

61. Warren C., Manley G. Chemically modified hyaluronic acid or salts thereof, and a process for producing thereof. // Clin. Chim. Acta. 1981. - Vol. 116.3. P. 369-380.

62. Szejtli J., Dosa E. Local anaesthetic salts of chondroitinsulfate compounds. //Пат. US 4105760.1978*.

63. Glass J.R., Dickerson K.T., Stecker K., Polarek J.W. Characterization of a hyaluronic acid Arg-Gly-Asp peptide cell attachment matrix. // Biomaterials. - 1996. - Vol. 17. - P. 1101-1109.

64. Keuren J.F., Wielders S.J., Driessen A., Verhoever M., Hendriks M., Lindhout T. Covalently-bound heparin makes collagen thromboresistant. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004. - Vol. 24. - № 3. - P. 613-617.

65. Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo M. Study on TEMPO-mediated selective oxidation of hyaluronan and the effects of salt on the reaction kinetics. // Carbohydr. Res. 2000. - Vol. 327. - P. 455-461.

66. Crescenzi V., Francescangeli A., Renier D., Bellini D. New hyaluronan chemical derivatives. Regioselectively C(6) oxidized products // Macromolecules. 2000. - Vol. 34. - P. 6367-6372.

67. Cera C., Terbojevich M., Cosani A., Palumbo M. Antracycline antibiotics supported on water-soluble polysaccharides: Synthesis and physicochemical characterization. II Int. J. Biol. Macromol. 1988. - Vol. 10.-P. 66-73.

68. Barbucci R., Cialdi G., Magnani A. Novel heparin-like sulphated polysaccharides. // Пат. WO 39525751. 1995*.

69. Magnani A., Albanese A., Lamponi S., Barbucci R. Blood-interaction performance of differently sulphated hyaluronic acids. // Thromb. Res. -1996. Vol. 81. - № 3. - P. 383-395.

70. Cen L., Neoh K.G., Li Y., Kang E.T. Assessment of in vitro bioactivity of hyaluronic acid and sulfated hyaluronic acid functionalized electroactive polymer. // Biomacromolecules 2004. - Vol. 5. - № 6. - P. 2238-2246.

71. Chen G., Ito Y., Imanishi Y., Magnani A., Lamponi S., Barbucci R. Photoimmobilization of sulfated hyaluronic acid for antithrombogenciti. // Bioconj. Chem. 1997. - Vol. 8. - № 5. - P. 730-734.

72. Nadkarni V.D., Toida T.G., Van C.L., Schubert R.L, Weiler J.M., Hansen K.P., Caldwell E.O., Linhart R.J. Preparation and biological activity of N-sulfonated chondroitin and dermatan sulfate derivatives. // Carbohydr. Res. 1996.-Vol. 290.-P. 87-96.

73. Maruyama Т., Toida Т., Imanari Т., Yu G., Linhard R. Conformational changes and anticoagulant activity of Chondroitin Sulphate Following its O-sulfonation. // Carbohydr. Res. 1998. - Vol. 306. - P. 35-43.

74. Yates E.A., Santini F., Guerrini M., Naggi A., Torri G., Casu B. // 'H and 13C NMR spectral assignments of the major sequences of twelve systematically modified heparin derivatives. // Carbohydr. Res. 1996. -Vol. 294.-P. 15-27.

75. Toida Т., Maruyama Т., Ogita Y. Preparation and anticoagulant activity of fully O-sulphonated glycosaminoglycans. I I Int. J. Biol. Macromol. 1999. -Vol. 26.-№4.-P. 233-241.

76. Bossennec V., Petitou M., Perly B. 'H-n.m.r. investigation of naturally occurring and chemically oversulphated dermatan sulphates. Identificationof minor monosaccharide residues. // Biochem. J. 1990. - Vol. 267. - № 3. -P. 625-630.

77. Inoue Y., Nagasawa K. Selective N-desulfation of heparin with dimethyl sulfoxide containing water or methanol. // Carbohydr. Res. 1976. - Vol. 46. -№ 1.-Р. 87-95.

78. Baumann H., Scheen H., Huppertz В., Keller R. Selective N-desulfation of heparin with dimethyl sulfoxide containing water or methanol. // Carbohydr. Res. 1998. - Vol. 308. - P. 381-388.

79. Hara S., Yoshida K., Ishihara M. Process for producing desulfated polysaccharide, and desulfated heparin. // Пат. US 6545136 B. 2003*.

80. Hricovini M., Guerrini M., Torri G., Piani S., Ungarelli F. Conformational analysis of heparin epoxide in aqueous solution. An NMR Relaxation Study. // Carbohydr. Res. 1995. - Vol. 277. - P. 11-23.

81. Naggi A., Cristofano В., Bisio A., Torri G., Casu B. Generation of anti-factor Xa active, 3-O-sulfated glucosamine-rich sequences by controlled desulfation of oversulfated heparins. // Carbohydr. Res. 2001. - Vol. 336. -P. 283-290.

82. Santini F., Bisio A., Guerrini M. Modifications under basic conditions of the minor sequences of heparin containing 2,3 or 2,3,6 sulfated D-glucosamine residues. // Carbohydr. Res. 1997. - Vol. 302. - P. 103-108.

83. Benedetti L.M., Stella V.J., Topp E.M. Microspheres of hyaluronic acid esters fabrication methods and in vitro hydrocortisone release. // J. Controll. Rel. - 1990. - Vol. 13. - P. 33-41.

84. Kyyronen K., Hume L., Benedetti L., Urtti A., Topp E., Stella V. Methylprednisolone esters of hyaluronic acid in ophthalmic drug delivary: in vitro and in vivo release studies. //Int. J. Pharm. 1992. - Vol. 80. - P. 161.

85. Hume L., Topp E.M., Stella V. Steroid ester of hyaluronic acid in the treatment of rheumatoid arthritis. // Pharm. Res. 1990. - Vol. 7. - P. 174.

86. Hunt J.A., Joshi H.N., Stella V.J., Topp E.M. Diffusion and drug release in polymer films prepared from ester derivatives of hyaluronic acid. // J. Controll. Rel.- 1990,- Vol. 12.-P. 159-169.

87. Perbellini A., Ventura C. Use of retinoic esters of hyaluronic acid for the differentiation of totipotent stem cells. // Пат. WO 2004063364. 2004*.

88. You N., Oya Т., Sato I. Chemically modified hyaluronic acid or salts thereof, and a process for producing thereof. // Пат. US 6673919. 2004*.

89. Takehisa M., Minoo M., Katsukiyo S. Photcurable glycosaminoglycan derivatives, crosslinked glycosaminoglycans and method of production thereof. //Пат. US 5763504. 1998*.

90. Petitou M., Lormeau J.C., Choay J. Selective O-acylation of glycosaminoglycans for use in pharmaceuticals. // Пат. FR 2634485. 1990*.

91. Foley K.M., Amaya E., Griffin C.C. Heparin derivatives. // Пат. ЕР 0256880. 1988**.

92. Sportoletti G., Baglioni A. Glucosaminoglycanes modifies possedant une activite antipemique et pratiquement exempts dune activite antivite anticoagulation. // Пат. FR 8112070. 1981*.

93. Sportoletti G., Pagella P. Modified glucosaminoglucans having antithrombotic activity. //Пат. US 4717719.1988**.

94. Lopalco L., Ciccomascolo F., Lanza P., Zopetti G., Caramazza I., Leoni F., Beretta A., Siccardi A. Anti-HIV type 1 properties of chemically modified

95. Патент взят на сайте: http://www.espacenet.com.

96. Патент взят на сайте: http://www.usptogov/patft.heparins with diminished anticoagulant activity. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - Vol. 10. - № 7. - P. 87-93.

97. Francesco V., Aurelio R. Crosslinked carboxy polysaccharides. // Пат. ЕР 0341745В1. 1989*.

98. Maelson Т., Lindqvist B. Crosslinked hyaluronate gels, their use and method for producing them. // Пат. WO 9009401. 1990*.

99. Katukiyo S., Yoshio U., Kenkyush T. Crosslinked hyaluronic acid and its use.//Пат EP 0161887.1985*.lH.Tomihata K., Ikada Y. Crosslinking hyaluronic acid with water-soluble carbodiimide // J. Biomed. Mater. Res. 1997. - Vol. 37. - № 2. - P. 243251.

100. Del Soldato P., Torri G., Bolla M., Mazzoni G., Monopoli A., Naggi A. Nitro-derivatives of low molecular weight heparin. // Пат. EP ,1340771. 2003*.

101. Bolla M., Monopoli A., Del Soldato P., Torri G., Naggi A., Cacu B. Nitro-derivatives ofepoxyheparin. //Пат. EP 1340772 Al. 2003*.

102. Moczar E., Hornebeck W. A lipophilic heparin derivative protects elastin against degradation by leucocyte elastase. // Int. J. Biol. Macromol. 1991. -Vol. 13.-№4.-P. 261-262.

103. Clayette P., Moczar E., Mabondzo A., Martin M., Toutain В., Marce D., Dormont D. Inhibition of human immunodeficiency virus infection by heparin derivatives. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - Vol. 12. - № l.-P. 63-69.

104. Kuo J., Swann D.A., Prestwich G.D. Chemical modification of hyaluronic acid by carbodiimides. // Bioconj. Chem. 1991. - Vol. 2. - № 4. - P. 232241.

105. Taylor R.L., Conrad H.E. Stoichiometric depolimerization of polyuronides and glycosaminoglycuronans to monosaccharides following reduction of their carbodiimide-activated carboxyl groups. // Biochemistry. 1972. -Vol. 11. -№ 8. - P. 1383-1388.

106. Mikolajczyk M., Kielbasinsky P. Recent development in the carbodiimide chemistry. // Tetrahedron. 1981. - Vol. 37. - P. 233-284.

107. Williams A., Ibrahim I.T. Carbodiimide chemistry. Recent advances. // Chem. Rev. 1981. - Vol. 6. - P. 589-636.

108. Nakajima N., Ikada Y. Mechanism of amide formation by carbodiimides for bioconjugation in aqueous media. // Bioconj. Chem. 1995. - Vol. 6. -P. 123-130.

109. Pouyani Т., Kuo J., Harbison G.S., Prestwich G.D. Solid-state NMR of acylureas derived from the reaction of hyaluronic acid with isotopically-labeled carbodiimides. // J. Am. Chem. Soc. 1992. - Vol. 114. - P. 59725976.

110. Inoe Y., Nagasawa K. Solid-state NMR of acylureas derived from the reaction of hyaluronic acid with isotopically-labeled carbodiimides. // Carbohydr. Res. 1982.-Vol. 111.-P. 113-125.

111. Pouyani Т., Prestwich G.D. Functionalized derivatives of hyaluronic acid oligosaccharides: Drug carriers and novel biomaterials. // Bioconj. Chem. -1994. Vol. 5. - № 4. - P. 339-347.

112. Bulpitt C.A., Sherwood Ch.H., Sadozai Kh.K. Tiol-modified hyaluronan. // Пат. US 6620927. 2003*.

113. Pumphrey C.Y., Theus A.M., Li Sh., Parrish R.S., Sanderson R.D. Neoglycancs, carbodiimide-modified glycosaminoglycans. // Cancer Res. -2002. Vol. 62. - P. 3722-3728.

114. Akima К., Iwata Y., Matsuo K., Watari N. Combination of hyaluronic acid with medicinal ingredient and production thereof. // Пат. ЕР 0506976 Bl. 1992*.

115. Danishefsky I., Siskovic E. Conversion of carboxyl groups of mucopolysaccharides into amides of amino acid esters. // Carbohydr. Res. -1971.-Vol. 16.-P. 199-201.

116. Calias P., Miller R. Conversion of carboxyl groups of mucopolysaccharides into amides of amino acid esters. // Пат. US 6610669. 2003*.

117. Prestwich G.D., Marecak D.M., Marecak J.F., Vercruysse K.P., Ziebell M.R. Controlled chemical modification of hyaluronic acid: Synthesis, application and biodegradation of hydrazide derivatives. II J. Controll. Rel. -1998.-Vol. 53.-P. 99-105.

118. Pouyani Т., Prestwich G.D. Functionalized derivatives of hyaluronic acid. //Пат. US 5616568. 1997*.

119. Pouyani Т., Prestwich G.D. Method for making Functionalized derivatives of hyaluronic acid. //Пат. US 5652347. 1997*.

120. Kirker K.R., Luo Y., Nielson J.H., Shelby J., Prestwich G.D. Glycosaminoglycan hydrogel films as bio-interactive dressings for wound healing. // Biomaterials. 2002. - Vol. 23. - № 17. - p. 3661-3671.

121. Shu X.Z., Liu Y., Roberts M.C., Prestwich G.D. Disulfide Cross-Linked Hyaluronan Hydrogels. // Biomacromolecules. ~ 2002. Vol. 3. - P. 13041311.

122. Pouyani Т., Harbison G.S., Prestwich G.D. Novel hydrogels of hyaluronic acid: Synthesis, surface and solid-state NMR. // J. Am. Chem. Soc. 1994. -Vol. 116.-№ 17.-P. 7515-7522.

123. Vercruysse K.P., Marecak D.M., Marecak J.F., Prestwich G.D. Synthesis and in vitro degradation of new polyvalent hydrazide cross-linked hydrogels of hyaluronic acid. // Bioconj. Chem. 1997. - Vol. 8. - № 5. - P. 686-694.

124. Chang Ch.H., Liu H.C., Lin C.C., Chou C.H., Lin F.H. Gelatin-chondroitin-hyaluronan tri-copolymer scaffold for cartilage tissue engineering. //Biomaterials. 2003. - Vol. 24. - P. 4853-4858.

125. Taguchi Т., Ikoma Т., Tanaka J. An improved method to prepare hyaluronic acid and type II collagen composite matrices. // J. Biomed. Mater. Res. 2002. - Vol. 61. - № 2. - P. 330-336.

126. Zhang L., Ma D., Wang F., Zhang Q. The modification of scaffold in building artificial dermis. // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2002. - Vol. 30. - № 4. - P. 319-332.

127. Laemmel E., Penhoat J. Heparin immobilized on proteins usable for arterial prosthesis coating: growth inhibition of smooth-muscle cells. // J. Biomed. Mater. Res. 1998. - Vol. 39. - № 3. - P. 446-452.

128. Hennink W.E., Feijen J., Ebert C.D., Kim S.W. Covalently bound conjugates of albumin and heparin: synthesis, fractionation and characterization. // Thromb. Res. 1983. - Vol. 29. - № 1. - P. 1-13.

129. Chandy Т., Das G.S., Wilson R.F. Rao G.H. Surface-immobilized biomolecules on albumin modified porcine pericardium for prevention thrombosis and calcification. // Int. J. Artif. Organs. 1999. - Vol. 22. - № 8.-P. 547-558.

130. Sakurai K., Miyazaki K., Kodera Y., Nishimura H., Shingi M., Inada Y. Anti-inflammatory activity of superoxide dismutase conjugated with sodium hyaluronate. // Glycoconj. J. 1997. - Vol. 14. - № 6. - P. 723-728.

131. Wang A., Cao Т., Tang H., Liang X., Salley S.O., Ng K.Y. In vitro haemocompatibility and stability of two types of heparin-immobilized silicon surfaces. // Colloid. Surf. Biointerfaces. 2005. - Vol. 43. - № 3. -P. 245-55.

132. Venkataramani E.S., Senatore F.A., Feola M.L., Tran R.M. Nonthrombogenic small-caliber human umbilical vein vascular prosthesis. // Surgery. 1986. - Vol. 6. - P. 735-741.

133. Zhao Y., Zhao R., Shangguan D., Xiong S., Liu G. Three novel high performance affinity chromatographic media for the separation of antithrombin III from human plasma. // Biomed. Chromatogr. 2001. - Vol. 15.-№8.-P. 487-492.

134. Akima K., Iwata Y., Matsuo K., Warari N. Compound for medicinal ingredient and hyaluronic acid and process for producing the same. // Пат US 5733891. 1998*.

135. Luo Y., Prestwich G.D. Hyaluronic acid N-hydroxysuccinimide: a useful intermediate for bioconjugation. // Bioconjug. Chem. - 2001. - Vol. 12.-P. 1085-1088.

136. Luo Y.K., Prestwich G.D. Synthesis and selective cytotoxicity of hyaluronic acid antitumor bioconjugate. // Bioconjug. Chem. - 1999. -Vol. 10.-P. 755-763.

137. Moon H.T., Lee Y. K., Han J. K., Byun Y. A novel formulation for controlled release of heparin-DOCA conjugate dispersed as nanoparticls in polyurethane film. // Biomaterials. 2001. - Vol. 22. - P. 281-289.

138. Byun Y.R., Moon H.T. Hydrophobic multicomponent heparin conjugates, a preparing method and a use thereof. // Пат. WO 0234312. 2002*.

139. Ионин Б.И., Ершов Б.А., Кольцов А.И. ЯМР-спектроскопия в органической химии. JL: Химия, 1983.

140. Jermyn М.А. Increasing the sensitivity of the anthrone method for carbohydrate // Anal Biochem. 1975. - Vol. 68. - P. 332-335.

141. Jacobson B.S., Fairman K.R. A colorimetric assay for carbodiimides commonly used in peptide synthesis and carboxyl group modification. // Anal. Biochem. 1980. - Vol. 106. - P. 114-117

142. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии. -Пер. с англ. М: Мир, 1981 (White A., Handler Ph., Smith Е., Hill R. Principles of biochemistry. McGraw-Hill, Inc., 1978.

143. Платэ H.A., Васильев A.E. Физиологически активные полимеры. -Химия: М., 1986. С.296.

144. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. -Гиппократ: СПб, 1993. С.264.

145. Кунафин М.С., Хасанов А.Г., Понеделькина И.Ю., Джемилев У.М. Способ защиты анастомозов при резекциях кишечника. Пат. РФ № 2192256. Б.И.№ 31 (2002).

146. Карабанов Ю.Р., Камалов А.Р., Понеделькина И.Ю., Башкатов С.А., Джемилев У.М. Способ профилактики реокклюзий при операциях на магистральных сосудах. Пат. РФ № 2185171. Б.И. № 20 (2002).

147. Тринус Ф.П., Мохорт Н.А., Клебанов Б.М. Нестероидные противовоспалительные средства. Киев: Здоровье, 1975. - С. 278.

148. Ghost А.К., Hirasawa N., Lee Y.S., Kim Y.S.Inhibition by acharan sulphate of angiogenesis in experimental inflammation models. // British J. Pharm. 2002. - Vol. 137. - P. 441-448.

149. Колла В.Э., Сыропятов Б .Я. Дозы лекартвенных средств и химических соединений для лабораторных животных. М.: Медицина. - 1998. С. 263.

150. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина.-1990. С. 384.

151. Методы химии углеводов: flep. с англ. М.: Мир, 1967. Под редакцией Н.А. Кочеткова (Methods in Carbohydrate Chemistry. New York, London: Academic Press, 1962-1965, Editors: R.L. Whistler, M.L. Wolfrom).

152. Кочетов Г.А. Практическое руководство no этимологии. M.: Высшая школа, 1980. - С. 204.

153. Сусленникова В.М., Киселева Е.К. Руководство по приготовлению титрованных растворов. Ленинград: Химия, 1978. - С 184.