Окисление гликозаминогликанов в карбоксипроизводные и их конъюгация с аминами

Хайбрахманова, Эльвира Азаматовна

Окисление гликозаминогликанов в карбоксипроизводные и их конъюгация с аминами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Хайбрахманова, Эльвира Азаматовна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Уфа МЕСТО ЗАЩИТЫ

2008 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.03 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Окисление гликозаминогликанов в карбоксипроизводные и их конъюгация с аминами»

Автореферат диссертации на тему "Окисление гликозаминогликанов в карбоксипроизводные и их конъюгация с аминами"

На правах рукописи

□03455379

Хайбрахманова Эльвира Азаматовна

ОКИСЛЕНИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В КАРБОКСИПРОИЗВОДНЫЕ И ИХ КОНЪЮГАЦИЯ С АМИНАМИ

02 00 03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

о 5 ДЕК 2008

Уфа - 2008

003455379

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте нефтехимии и катализа РАН.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент

Понеделькина Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, доцент

Казакова Оксана Борисовна

доктор химических наук, доцент Кондратенко Римма Минибаевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт органической химии им. Н.Д Зелинского РАН

Защита диссертации состоится 23 декабря 2008 г. в «1400» ч. на заседании диссертационного совета Д 002.062.01 в Учреждении Российской академии наук Институте нефтехимии и катализа РАН по адресу: 450075, Уфа, проспект Октября, 141. Тел./факс: (347)2312750, e-mail: ink@anrb ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии наук Института нефтехимии и катализа РАН.

Автореферат разослан 17 ноября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических тук, профессор

Булгаков Р.Г.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.1 Гликозаминогликаны (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты и гепарин) - гетерополисахариды линейного строения содержатся в межклеточном матриксе соединительной ткани животных и человека, выполняют важные функции в живых организмах, являются действующим веществом ряда лекарственных средств, обладающих репаративно-регенеративными, противовоспалительными и антикоагулянтными свойствами. Введение дополнительной карбоксигруппы в гликозаминогликаны позволяет расширить их синтетические возможности и повысить фармакологическую нагрузку на макромолекулу. В связи с этим получение селективно окисленных по первичной гидроксигруппе гликозаминогликанов, модификация полиуронидои различными фармакофорами, исследование структуры и биологических свойств полученных соединений представляется актуальной задачей.

Цель работы. Селективное окисление гиалуроновой кислоты, хондроитин-4-сульфата и дерматансульфата по первичной гидроксигруппе до карбоксильной реагентом NaOCl-NaBr-TEMPO, конъюгация окисленной гиалуроновой кислоты с аминами, установление строения конъюгатов и изучение их биодеградируемости.

Научная новизна. Найдены условия селективного окисления гиалуроновой кислоты с исчерпывающей конверсией гидроксиметильных групп в карбоксильные. Показано, что окисление гипохлоритом натрия, катализируемое 2,2,6,б-тетраметилпиперидин-1-оксилом (TEMPO), является радикальным процессом. Установлено, что карбоксг-гиалуроновая кислота проявляет повышенную ферментоустойчивосгь in vitro к действию тестикудярной гиалуронидазы. Синтезированы новые конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты с фармакозначимыми аминами, исследована их ферментативная биодеградируемость. Синтезированы конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты и гепарина с З'-азидо-З'-дезокситимидином. Путем катализированного TEMPO окисления смеси хондроитин-6-сульфат/дерматансульфат из пупочных канатиков новорожденных и последующего хроматографического разделения продуктов выделен индивидуальный хондроитин-6-сульфат, не подвер1шощийся окислению, и получены гибридные полисахариды, состоящие из фрагментов хондроитин-6-сульфата и окисленного дерматансульфата. Окислением смеси хондроитин-4-сульфат/хондроитин-6-сульфат получены гибридные макромолекулы, звенья

1 Автор выражает глубокую благодарность директору ИНК РАН, член-корр. РАН Усеину Мсметовичу Джемилеву за выбор направления исследования и содействие в процессе выполнения работы.

которых состоят из хондроитин-6-сульфата и окисленного по первичным гидроксигруппам хондроитин-4-сульфата.

Практическая значимость. Получены обладающие пониженной ферментативной биодеградируемостью карбокси-гиалуроновая кислота и ее конъюгаты с фармакозначимыми аминами, которые могут представить интерес в качестве медпрепаратов пролонгированного действия. Синтезированы конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты и гепарина с широко используемым в терапии ВИЧ-инфекции З'-азидо-З'-дезокситимидином, которые могут найти применение в профилактических мероприятиях по предотвращению распространения ВИЧ-инфекции.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на Всероссийской конференции «Современные проблемы органической химии» (Новосибирск, 2007) и XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007).

Публикации. Г1о материалам диссертации опубликовано две статьи и тезисы двух докладов на конференциях, выдан патент и получены решения на выдачу трех патентов РФ.

Обьем и структура диссертации. Диссертация включает введение, литературный обзор на тему «Окисление полисахаридов по первичным гидроксигруппам», обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, приложение и список литературы из 137 ссылок. Работа изложена на 111 страницах и содержит 5 таблиц и 20 рисунков.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте нефтехимии и катализа РАН в соответствии с научным направлением Института по теме «Химия стероидов, токоферолов и природных полисахаридов» (№ гос. регистр. 0120.0 850046) при финансовой поддержке Отделения химии и наук о материалах РАН по программе «Биомолекулярная и медицинская химия» (проект «Модифицированные гликозаминогликаны как потенциальные лекарственные средства для химиотерапии ВИЧ-инфекции и опухолевых заболеваний»).

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией органического синтеза ИНК РАН доктору химических наук, профессору Виктору Николаевичу Одинокову за научные консультации, внимание и помощь, оказанные на всех этапах выполнения работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Гиалуроновая кислота (НА) и смесь хондроитин-6-сульфат/дерматансульфат (CS-6/DS) получены щелочной экстракцией из пупочных канатиков

новорожденных; смесь хондроитин-4-сульфат/\ондроитин-6-сульфат (CS-4/CS-6) выделена из хрящевой ткани; дсрматапсульфат (DS) выделен из кожи свилей. Полученные гликозаминогликаны очищены анионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Гепарин (HEP) выделен из фармакопейного препарата.

Для окисления первичных гидроксильных групп гликозаминогликанов использован реагент NaOCl-NaBr-TEMPO (Н20, рН 10.2, 0±2°С).

1. Окисление гиалуроновон кислоты

Сообщалось,2 что при взаимодействии гиалуроновой кислоты с гипохлоритом натрия в присутствии каталитических количеств TEMPO и NaBr [соотношение реагентов (CH2OH):NaOCl:NaBr:TEMPO=l:3:0.2:0.011, рН 10.2, 0±2°С, 66 мин] в атмосфере азота образуется окисленная па 78% по первичным гидроксилышм группам карбокси-гиалуроновая кислота. Следует отметить, что авторы придерживались методики, по которой предварительно рН раствора смеси полисахарид-ТЕМРО-ЫаВг доводили до 10, рН гипохлорита - до 9, затем последний по каплям добавляли к раствор)' субстрата.

Окисление НА нами проводилось в атмосфере воздуха, при соотношении реагентов (CH2OH):NaOCl :NaBr:TEMPO= 1:1.9:0.2:0.011, конц. раствор гипохлорита (1.19-1.83 М) в один прием добавляли в раствор смеси HA-NaBr-ТЕМРО (методика 1). При этом рН реакционной среды достигал значения 12-13, после чего титрованием 1.0 н. HCI устанавливали рН на уровне 10.2, который поддерживали в ходе реакции (60 мин) с помощью 0.1 н. NaOH. В этих условиях удалось нацело превратить первичные гидроксильные группы НА в карбоксильные (схема 1).

Схема 1.

СООН„ N'aOCl-NaBr-TEMPO Г00Нп -J\°"!J-0

Звено Звено GlcA Звено N-ацетил-

D-глюкуроновой N-ацетнл- D-глюкозаминуроновой

кислоты (GlcA) D-глюкозаммна (GlcNAc) кислоты (GlcNAcA)

НА карбокси-НА

Выделенная из раствора осаждением в метанол карбокси-гиалуроновая кислота (карбоксн-НА) исследована 1D и 2D методами ЯМР 'Н и ,3С (COSY, TOCSY, HSQC).3 В спектре ЯМР |3С карбокси-НА (табл. 1) в области слабого

2 Jiang В , Drouet Е , Milas М, Rinaudo М. Study on TEMPO-mediated selective oxidation of hyaluronan and effects of salts on the reaction kinetics. // Carbohydr. Res. - 2000. - Vol. 327. - P. 455-461.

' Автор благодарит профессора А С. Шашкова (ИОХ им. Н.Д. Зеяпнского РАН, г. Москва) за помощь в получении и интерпретации спектральных данных (прибор Bruker DRX-500).

поля присутствуют три синглета, два из которых (5 176.4 и 176.1 м.д.) отвечают карбоксильной и ацетамидной группам, присутствовавшим в исходной НА, а третий синглет (5 175.3 м.д.) свидетельствует о превращении гидроксиметильной группы в карбоксильную. Отсутствие в спектре ЯМР 13С карбокси-НА сигнала группы СНгОН (8 62.0 м.д.) доказывает ее исчерпывающее окисление. Таким образом, в структуру карбокси-НА входят звенья Э-глюкуроновой кислоты (С1сА) и Л'-ацетилглюкозаминуроновой кислоты (01сХАсА). Для СИсКАсА, соединенной с остатками ИсА Р(1-4)- и Р(1-3)-гликозидными связями, спектральные характеристики получены впервые.

Таблица 1. Спектры ЯМР 'Н и 13С (8, м.д.) НА и карбокси-НА

Атомы в звеньях НА карбокси-НА

вкА йШАс 61сА СТсЫАсА

5с 5н 5с 6н 8с 5н 6с 8н

1 104.6 4.46 102.0 4.55 104.2 4.48 101.7 4.55

2 74.0 3.34 55.8 3 83 73.6 3.34 55.5 3.87

3 75.1 3.58 84.0 3.73 74 8 3.59 82.7 3.77

4 81.4 3.74 69.9 3.51 81.7 3.70 72.0 3.61

5 77.8 3.72 76.9 3.47 77.6 3.70 77.1 3.78

6 176.4 62.0 3.71, 3.91 176 4 175.3

ШСОСНз 176.1 176.1

ЫНСОСНз 24 0 2.01 23.7 2.03

В звене ИсА сигналы атомов углерода и протонов в спектрах ЯМР 'Н и 13С карбокси-НА практически не изменились по отношению к соответствующим сигналам в спектрах исходной НА, а в звене 01сЫАсА наибольшее смещение в слабое поле по отношению к ИсКАс исходной НА претерпели сигналы углеродных атомов С4 (Д8 2.1 м.д.) и С5 (А8 0.2 м.д.), а также сигналы соответствующих протонов Н4 (Д5 0.10 м.д.) и Н5 (Д8 0.31 м.д.). При незначительном сдвиге в слабое поле сигнала НЗ (Д8 0.04 м,д.) резонанс соответствующего СЗ заметно сместился в сильное поле (Д8 1.3 м.д.) (табл. 1). Спектральные данные свидетельствуют о том, что свойственная природной НА 4С)-конформация сохранилась как в звеньях 01 сЛ, так и в звеньях ОсЫАсА.

2. Конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты с фармакозначимыми аминами

Конъюгацию карбокси-НА с рядом фармакологически значимых аминов [5-аминосалициловой (1а), 4-аминосалициловой (1Ь), антраниловой (1с) и п-аминобензойной (М) кислотами, п- (1е) и о-аминофенолами (10, п-

аминобензолсульфамидом (стрептоцидом) л-амшюбензолсульфацетамид-

натрием (сульфацил-натрием) (111). этиловым эфиром л-аминобензойной кислоты (анестезином) (1Г), Р-днэтпламипоэ1 иловым эфиром и-аминобензойной кислоты (новокаином) (1]), 1-фенил-2,3-диметил-4-амииопиразолоном-5 (4-аминоантипирином) (1к), а также гндразидом изоникотиновой кислоты (изоииазидом) (II)] проводили с помощью 1-этил-3-[3-(диметиламино)прогшл]карбодиимида (ЕБС) при мольном соотношении реагентов (СООН):1 а-1:ЕОС= 1:0.5:0.37 в водной среде (рН 4.7-4.8, 20-22°С, 1 ч). В этих условиях получены соответствующие амиды 2а-1 (схема 2), которые выделяли из реакционной смеси осаждением в охлажденный до 0°С метанол.

Схема 2.

¿-СИ,

¡|.( , /

соон соон о 1:ис сомни

карбокхн-НА

2а-1

поос

соон он

1а(противо- lb (противо- 1с (метаболизм Id (витамин

Н1) le (прекурсор

воспалительное) туберкулезное) триптофана) Д™ параиетамола)

_ ft ''у ^—SO.NHj ^-SOjNNaCOCH^ —^-COOC3lIs —^

lg (антимикробное) lh(антимикробное) Ii (местно- lj (местно-

1 f (метаболизм __а, анестезирующее) анестезирующее

триптофана) ' comí—

COOCHJCIIJ^CjH^J

11(прОТИВО-

lk (аналог анальгина) туберкулезное)

В отличие от коиъюгатов природной НА4 конъюгаты карбокси-НА (2а-1) обладай и повышенной растворимостью в воде и меньшей вязкостью, в них практически отсутствовали ацилмочевины - продукты присоединения карбодиимида по карбоксигруппам полиуроновых кислот.

В спектрах ЯМР 'Н коиъюгатов 2а-1 в области 8 6.92-8.74 м.д. присутствовали сигналы ароматических протонов, о гвечающие остаткам соответствующего амина Два синглета в области S 2.01-2.03 м.д. спектра ЯМР 'Н коиъюгатов 2а-1 отвечали метальным протонам ацетампдной группы немодифицированных и модифицированных аминами звеньев GlcNAcA. Содержание амидных звеньев

4 Понеделькина И.Ю, Одиноков В Н., Вахрушева Е.С., Голикова М.Т., Халилов J1.M, Джемилев У.М. Модификация гналуроновой кислоты ароматическими аминокислотами. // Биоорг химия -2005.-Т. 3] -№1 -С 90-95.

(конверсию обеих карбоксигрупп в амидные) определяли из соотношения приведенных к одному протону суммарных интенсивностей характеристических сигналов остатка амина (8 6.92-8.74 м.д.) и метальных протонов ацетамидной группы (5 2.01-2.03 м.д.) (табл. 2). У некоторых конъюгатов (2а.с,е,|) общая конверсия практически совпадала со значением, полученным из отношения интенсивности сигнала 5 2.03 м.д. к сумме интенсивностей сигналов в области 6 2.01-2.03 м.д. Это означает, что сигнал 5 2.03 м.д. относится к модифицированному звену С1сЫЛсА. Незначительное содержание или отсутствие модифицированных звеньев 01сА (найдено по разности между общей конверсией и содержанием модифицированных звеньев СПсНАсА) свидетельствует о более высокой реакционной способности звена ОсЫАсА по сравнению со звеном С1сА.

Таблица 2. Спектральные характеристики и содержание модифицированных аминами звеньев (% мольн., в расчете на моносахаридное звено) в конъюгатах 2а-I, полученных при соотношении (С00н):1а-1:ЕРС=1:0.5:0.37_

Конъюгат Общее содержание амидных звеньев Содержание модифициро ванных звеньев 01сЫАсА Содержание модифициро ванных звеньев СЛсА Характеристические сигналы остатков аминов в спектрах ЯМР 'Н конъюгатов, 8, м.д.

2а 23 23 0 7.82,7.51 (с, .7=9.01 Гц), 6 96 (с, J=9.09 Гц)

2Ь 30 26 4 7.80 (с, J=9.\2 Гц), 7.18, 7.03 (с, J=7.82 Гц)

2с 19 19 0 8.24,7.93 (с, ./=7.29 Гц), 7.54 (с, 7=8.77 Гц), 7.26

2d 36 * * 7.98, 7.63

2е 25 25 0 7.33, 6.92 (с,./=7.87, 8.90 Гц)

2f 35 24 11 7.51, 7.20, 7.01 (с, ./=7.76, 8.17, 7.77 Гц)

2g 30 * * 7.95, 7.76 (с,7=7.65, 8.80 Гц)

2h 20 * * 7.95, 7.77 (с. J=7.00 и 7 38 Гц)

2i 31 23 8 8.08,7 72(c,J=8.75, 8.98 Гц)

2j 30 27 3 8 03, 7.66

2k 35 27 8 7 61,7.43 (с, 7=7.7 Гц)

21 35 * * 8.74, 7.82

*Сигналы протонов метальных групп в звеньях СЛсКАсА и 01сЛ выходили одним уширенным синглетом.

Характерный для конъюгатов природной НА экранирующий магнитно-анизотропный эффект ароматического кольца ариламидной группы модифицированного звена на метальные протоны ацетамидной группы звена глюкозамина4 в спектрах ЯМР 'н конъюгатов 2а-1 наблюдался лишь при высоких

коиверсиях карбоксильных групп в ариламидные. Например, в спектрах ЯМР 'Н 2е и 2к с конверсией 81 и 90% наряду с основным сигналом метальных протонов ацетамндной группы 6 2.03 м.д. появлялся дополнительный сильнопольный сигнал (8 1.71 для 2е и 1.82 м.д. для 2к). Это обстоятельство учитывали при определении конверсии, суммируя интенсивности обоих сигналов.

3. Конъюгаты карбоксн-гналуроновой кислоты и гепарина с З'-азидо-З'-дезокситимнднном

З'-Азидо-З'-дезокситимидин (AZT) - один из широко применяемых в терапии ВИЧ-инфекции антивирусных препаратов из класса нуклеозидных ингибиторов обратной транекриптазы. Нами осуществлена конъюгация карбоксн-НА (5) и FIEP (6) с AZT. Известно, что HEP проявляет аффинность к УЗ-домену гликопротеина 120 (gp 120, одного из белков оболочки вириона ВИЧ) и оказывает ингибирующее действие на рост и репликацию вируса, поэтому можно ожидать синергизма противовирусного действия фармакофора и полимерной матрицы.

С этой целью AZT был превращен в гемисукцинат 3, карбоксильная группа которого была активирована трансформацией в соответствующий NHS-эфир 4 путем взаимодействия с ¿V-niflpoKCucyKUHiiifMUfloM, катализированного дициклогексилкарбодиимидом (DCC) (схема 3). Взаимодействием карбокси-НА (5) и HEP (6) с 0,Ь-лизином в присутствии EDC получены со-аминоамиды 7 и 8 соответственно, которые очищены трехкратным переосаждением из воды метанолом. Их образование подтверждено спектром ЯМР 'Н и нингидринной реакцией па свободные аминогруппы. Поскольку реакция соединений 5 и 6 с a-N-ацетилпроизводным лизина в тех же условиях не протекала, можно заключить, что амиды 7 и 8 образовались по а-аминогруппе D.L-лизина. Сочетанием ю-аминоамидов 7 и 8 с эфиром 4 получены целевые конъюгаты 9 и 10 соответственно, очищенные трехкратным переосаждением из воды метанолом.

Содержание ковалентно связанного AZT в конъюгатах 9 и 10 определяли из соотношения приведенных к одному протону суммарных интенсивностей сигналов метальных протонов остатка AZT (5 1.98 м.д.) и метальных протонов ацетамндной группы (8 2.01-2.03 м.д.) (для конъюгата 9) или сигналов 8 1.98 м.д. и аномерных протонов углеводного остова (8 5.1-5.5 м.д.) (для конъюгата 10) в спектрах ЯМР 'Н. Оно составило для конъюгатов 9 и 10 соответственно 35% и 90% в расчете на дисахаридное звено.

Схема 3.

НООС(СН,),СОО

n-ocoich^jco

ÇH,

N. 3

R-COOH

МНгСН(СООН)(СН,)дСН,Гт,

R-CONHCH(COOH)(CH2)3CH2NH: 7,8

5,6

он

7 (или 8)

R-tOMICIKCOOMKCIl

(б, 8,10)

4. Биодеградируемость карбокси-гиалуроновой кислоты н ее конъюгатов

Содержание звеньев С1сА в природной НА и в карбокси-НА практически одинаково и составляет 49.5 и 50.9 % мольн. соответственно (определено карбазоловым методом в 87% Н2804 по реакции Дише), из чего следует, что СЛсХАсА не вносит своего вклада в интенсивность характерного для ОсА хромофора (К 530 нм).

С появлением нового структурного звена можно ожидать изменений в биологических свойствах карбокси-НА по сравнению с природной НА, например, биосовместимости и биодеградируемости. Пониженная биодеградируемость является полезной функцией производных НА, поскольку целью химической модификации полимеров чаще всего является пролонгирование терапевтического действия связанных с полимерной матрицей лекарственных средств. Нами предложен спектрофотометрический метод определения степени ферментативной биодеградации карбокси-НА тестикулярной гиалуронидазой (НАазой) относительно нативной НА (биодеградируемость НА принимали за 100%). Сущность метода заключается в определении относительного поглощения хромофоров (к 530 нм), которые образуются в реакции Дише из (51сА, содержащейся в продуктах ферментативного расщепления карбокси-НА и НА.

При концентрации НАазы 3 у.е./мл, близкой к концентрации в сыворотке крови человека,5 карбокси-НА практически не деградировала по сравнению с

5 Delpech В., Bertrand Р, Chauzy С An indirect enzymoimmunological assay for hyaluronidase. // J. Immunol. Methods. - 1987. - V. 104. - P. 223-229.

интактной НА. Биодеградируемость карбокси-НА постепенно возрастала с увеличением концентрации фермента. Однако, даже при концентрации НАазы 120 у.е./мл относительная биодеградируемость карбокси-НА не превышала 26% (рис. !)■

Рис. 1. Зависимость биодеградируемости (%) in vitro карбокси-НА относительно нативной НА от концентрации НАазы (у.е./мл), 37°С, 20 ч, цитратный буфер - 30 мМ _ лимонная кислота/150 мМ

3 30 60 120 Na2HP04/150MMNaCl,pH6.3

Концентрация НАзы, v.e.lm

Возможно, низкая ферментативная биодеградируемость связана с тем, что GlcNAcA в составе карбокси-НА не является сайтом для специфического узнавания НАазой. Данное предположение согласуется с принятым в литературе механизмом действия НАазы на природную НА, согласно которому взаимодействие остатка глутаминовой кислоты в НАазе протекает именно с остатком А'-ацетил-Г>-глюкозамина, принимающего под влиянием фермента конформацию ванны.

Карбокси-НА является нетоксичным соединением: при внутрижелудочном введении мышам в дозе >2 г/кг никаких отклонений от нормального состояния животных не наблюдалось."

Биодеградируемость конъюгатов карбокси-НА (2а-1) под действием НАазы оценивали относительно природной НА (100%) по разработанной нами для карбокси-НА методике, основанной на реакции Дише. Подобно карбокси-НА, биодеградируемость конъюгатов 2a-J значительно ниже природной НА и зависит от природы и содержания остатка амина (рис. 2).

Рис. 2. Биодеградируемость конъюгатов 2а-(

6 Анализ на токсичность выполнен в лаб. конструирования биологически активных веществ ИНК РАН.

С увеличением конверсии карбоксигрупп в амидпые биодетрадируемость конъюгатов повышалась (рис. 3, конъюгаты 2е и 2к). Возможно, это связано с тем, что под влиянием увеличивающегося содержания заместителей конформация макромолекулы изменяется таким образом, что доступность (1—>4)-гликозидных связей, по которым НАаза расщепляет полисахарид, увеличивается.

» 8 25 55 75 81 О Ю 21 55 74 80

содержание остатков алина 1е в коныогате 2е, % содержание остатков аника 1к в конъюгате 2Н %

а 6

Рис. 3. Биодсградируемость конъюгатов 2е (я) и 2к (б) в зависимости от содержания остатка амина

Следует отметить, что для водорастворимых конъюгатов природной НА с теми же аминами наблюдалась обратная зависимость: с увеличением конверсии биодсградируемость снижалась.7

5. Окисление хондроитинсульфатов

Хондроитинсульфаты из пупочных канатиков представляют собой смесь (2:1) Св-б и 08 (Св-б/ТО), из хрящей - смесь (3:2) Св-4 и Св-б (С8-4/С8-6). Соотношение компонентов в смесях определено методом ЯМР 'Н из отношения интегральных интенсивностей с Игнатов метильных протонов МеСОЫ-групп [8 2.01 (С8-4), 2.03 (Св-б) и 2.09 м.д. (Ов)]. Такие смеси не удается разделить препаративными методами, в том числе методом анионообменной хроматографии. Если увеличить полярность макромолекул Эв или С8-4 путем введения дополнительной карбоксигруппы с помощью окисления первичной гидроксигруппы в галактозаминовых звеньях, то можно ожидать, что разделение смесей будет достигнуто хроматографически на анионообменной ДЕАЕ-целлюлозе.

Для получения в чистом виде Св-6 и окисленных Ов и С8-4 нами было предпринято окисление смесей С8-4/С8-6 и С8-6Я>8. Окисление осуществляли по методике 1, использованной нами для получения карбокси-НА. По отношению к

1 Лукина Е.С. Конъюгация гликозаминогликанов с аминами и карбоновыми кислотами: Дис. канд. хим. наук. - Уфа, 2007. - 110 с.

Э8 и С8-4 соотношение реагентов составило субстрат№ОСШаВг:ТЕМРО= 1:5.8:0.62:0.032, продолжительность реакции 1.5 ч.

После окисления смеси С8-4/С8-6 и выделения суммарных окисленных продуктов из реакционной массы осаждением в метанол продукт окисления подвергали хроматографичсскому разделению на фракции, при этом использовали ступенчатую элюцию с изменением концентрации КаС1 от 0.2 до 1 М с шагом 0.05. Было получено 5 фракций, причем элюирование происходило преимущественно при пониженных концентрациях №С1. Очевидно, снижение ионной силы свидетельствует о происходящей при окислении деструкции полисахаридов. При исследовании каждой фракции методом ЯМР установлено, что разделения смесей достичь не удалось. Фракции содержали один продукт 11, состоящий из фрагментов Св-б и окисленного но первичным гидроксигруппам Св-4 (карбокси-С8-4) в различных соотношениях. В спектре ЯМР |3С продукта 11 сигналы первичных гидроксигрупп (б ~62 м.д.) и альдегидных групп (8 -200 м.д.) отсутствовали, что свидетельствовало о полном превращении СН2ОН-групп С8-4 в карбоксильные. На основании данных спектроскопии ЯМР и хроматографии мы предположили, что продукт 11 является гибридным, состоящим из фрагментов С 8-6 и карбокси-С8-4 (схема 4).

Схема 4.

ОН NHAi ОН NH»t

Для подтверждения образования гибридных макромолекул эквимольная смесь НА/НЕР была окислена в тех же условиях (подобно CS-6, HEP содержит сульфоэфирные группы вместо первичных гидроксигрупп). Предварительно было показано, что НА элюируется 0.4 M NaCl, a HEP - 0.8 M NaCI, после окисления и хроматографирования на ДЕАЕ-целлюлозе карбоксн-НА элюировалась 0.3-0.5 M NaCI, HEP после обработки реагентом олюировался 0.8 M NaCl, как и интактный HEP.

Смесь НА/НЕР после окисления была фракционирована хроматографически. ЯМР анализ каждой фракции показал, что в элюатах с 0.3-0.5 M NaCl содержалась карбокси-НА, а в элюатах с 0.7 и 0.8 M NaCl - продукты 12а и 126, представляющие собой гибриды из последовательностей карбоксн-НА и HEP

(схема 5). Профиль элюции 12а и 126 отличался от такового для карбоксп-НА, что стало главным доказательством образования гибридных полисахаридов.

Схема 5.

карбокси-НА 12а=(НЛ/НЕР=3.7),

12б=(НА/НЕР=):9)

Аналогично смесям CS-4/CS-6 и НА/НЕР была окислена смесь CS-6/DS. После хроматографирования продуктов окисления этой смеси на ДЕАЕ-целлюлозе методом ЯМР было обнаружено, что фракции с 0.5-0.6 М NaCl содержали индивидуальный CS-6 (выход 35%). Остальные фракции, элюированные 0.4-0.45 М NaCl, содержали, по-видимому, гибридные полисахариды 13, состоящие из фрагментов CS-6 и DS, окисленного не только по первичным гидроксигруппам звена галактозамина, но и по С2-С3 связи звена идуроновой кислоты (IdoA) с образованием двух карбоксигрупп (схема 6). В спектре ЯМР 13С гибрида 13 сигнал атомов углерода первичных гидроксигрупп (8 ~63 м.д.) отсутствовал, что свидетельствовало о полном превращении СНзОН-групп DS в карбоксильные; а вместо ожидаемых пяти сигналов карбонильных групп [двух MeCON-групп, двух СООН-групп (в GlcA и IdoA) и одной СООН-группы] наблюдались 8 сигналов различной интенсивности (5 176.5, 176.0, 175.7, 175.2, 175.0, 174.6, 174.0 и 173.6 м.д.), два из которых отвечали карбоксигруппам звена IdoA, окисленного по С2-С3 связи.

Схема 6.

С целыо поиска условий исключающих или уменьшающих расщепление С2-С3 связи в звене идуроновой кислоты было предпринято катализируемое TEMPO окисление индивидуального дерматансульфата, выделенного из кожи свиней.

Окисление DS по методике 1, использованной для получения карбокси-НА (DS:NaOCl:NaBr:TEMPO= 1:1.9:0.2:0.011, 1 ч) привело к продукту, в спектре ЯМР |3С которого присутствовал отвечающий первичным гидроксигруппам сигнал (5 -63 м.д.) с меньшей, чем для интактного DS, интенсивностью, что свидетельствовало о неполном окислении СН2ОН-групп. Из отношения интенсивностей сигналов, отвечающих атому углерода С2 в интактных (8 53.0 м.д.) и окисленных звеньях DS (52.0 м.д.) в спектре ЯМР 13С была определена конверсия ClbOII-ipynn в карбоксильные (~40%). В спектре ЯМР 'Н частично окисленного DS наблюдалось появление дополнительного слабопольного сигнала небольшой интенсивности с 5 5.20 м.д. В корреляционном спектре HSQC ему соответствовал сигнал с 8 87.8 м.д., отвечающий гидратированной форме альдегидной группы С6Н(ОН)2 в звене окисленного галактозамина.

Для повышения конверсии первичных гидроксигрупп DS реакция окисления была проведена при большей концентрации гипохлорита и при соотношении реагентов DS:NaOCl:NaBr:TEMPO=l:3:0.2:0.011. В этих условиях окисление СН2ОН-групп прошло нацело (в спектре ЯМР ,3С продукта отсутствовал сигнал 8 ~63 м.д.), а в области карбонильных атомов углерода присутствовали три синглета (8 175.2, 173.2 и 172.9 м.д.). С помощью корреляционных 2D спектров были выполнены отнесения всех сигналов исходного и окисленного DS (табл. 3).

Таблица 3. Спектры ЯМР 'Н и С (8, м.д.) природного и окисленного DS

Атомы в звеньях DS Окисленный DS

IdoA CJalNAc IdoA GalNAc

бс 6н 5с 8ц 8с бн 8с 8н

1 103.8 4.87 103 0 4 67 104.0 4.80 102.0 4.60

2 70.5 3.50 53.0 4.05 70.0 3 423 4 8 52.0 4.05

3 72.0 3.90 77.0 3.95 72.0 3.833.88 74.0 4.12

4 80 5 4.10 77.5 4.67 82.0 3.923.97 78.0 4.95

5 70.3 4.67 76 0 3.80 70.5 4.674.80 76.0 4.00

6 173.6 63.0 3.653.85 173.2 172.9 87.8- СН(ОН>2 5.20 СНЮН),

ШСОСНз 175.3 175.2

NHCOCHj 22.5 2.09 22.5 2.09

В звене IdoA сигналы атомов углерода и протонов в спектрах ЯМР 'Н и 13С окисленного DS практически не изменились по отношению к соответствующим сигналам в спектрах исходного DS. Как и в случае карбокси-НА, в окисленном звене галактозамина наибольшее смещение претерпели сигналы углеродного атома СЗ - в сильное поле (Д5 3.5 м.д.) и соответствующего протона НЗ - в слабое поле (Д8 0.28 м.д.). При незначительном сдвиге в слабое поле сигнала С4 (AS 0.5 м.д.) сигнал соответствующего протона заметно сместился в слабое поле (Д5 0.28 м.д.). Интенсивности сигналов 6 87.8 м.д. в спектре ЯМР 13С и 8 5.20 м.д. в спектре ЯМР 'Н увеличились, что свидетельствовало о возросшем содержании альдегидных групп в окисленном DS [50% в расчете на дисахаридное звено, определено из соотношения интенсивностей сигналов 8 5.20 м.д. (С6Н(ОН)2) и 8 4.95 м.д. (Н4 в окисленном звене галактозамина)]. Из-за присутствия звеньев окисленного галактозамина разной природы (гидрата альдегида и карбоновой кислоты) наблюдалось удвоение сигналов протонов в звеньях IdoA. Наличие альдегидной группы подтверждено образованием основания Шиффа по реакции с анилином (Хтах 287 нм и плечо в области 350-380 нм в УФ-спектре).

При дальнейшем увеличении количества гипохлорита (DS:NaOCl:NaBr:TEMPO=l :5.8:0.2:0.011) наблюдалось расщепление С2-С3 связи. Таким образом, в отличие от гиалуроновой кислоты, при ТЕМРО-окислении DS не удалось селективно окислить первичные гидроксигруппьг в карбоксильные.

6. Исследование системы NaOCi-NaBr-TEMPO как реагента селективного окисления первичных гидроксильных групп в полисахаридах

Согласно предложенному в литературе ионному механизму,2 основным окислительным реагентом является нитрозоний-катион, образующийся из TEMPO под действием гипогалогенитов (схема 7). Для окисления 1 моль-экв первичного спирта требуется 2 моль-экв нитрозоний-катиона, при этом образуется гидроксиламин ТЕМРО-Н, который окисляется гипогалогенигами до нитрозоний-катиона. Поскольку при окислении спирта образуется карбоновая кислота, авторы считают, что показателем, позволяющим оценить кинетику реакции, является расход NaOH, необходимый для поддержания рН среды на уровне 10.2 (скорость окисления по этому показателю составила 4.4 мкмоль/мин).

Схема 7.

он о

RCIIy-Oll + 20Hal = RC0011 + |1г0 + 2Hnl

При окислении НА в выбранных нами условиях (методика 1) в момент добавления NaOCl к раствору смеси HA-NaBr-TEMPO значение рН некоторое время находилось в пределах 12-13, при этом была зафиксирована хемилюминесценция (ХЛ), что может свидетельствовать об участии в окислении радикальных частиц. Следует отметить, что при исследовании реагента NaOCl-NaBr-TEMPO без субстрата в аналогичных условиях также была зафиксирована XJ1, но меньшей интенсивности, чем в присутствии НА. Из этого следует, что НА в сильнощелочных условиях способствует генерации радикалов из NaOCl или сама является источником радикалов различного типа, в том числе короткоживущих амидильных (из нестабильных галогенацетамидов), изомеризующихся в углеродцентрированные радикалы.8

Наряду с контролем расходования NaOH осуществляли контроль расхода NaOCl (спектрофотометрически по интенсивности максимума поглощения гипохлорита X 292 нм) (рис. 4а). Для окисления НА оказалось достаточно 1.1 моль-экв NaOCl, причем на поддержание рН реакционной смеси израсходовалось только 48% NaOH от расчетного количества. В продукте окисления - карбокси-НА, согласно данным ЯМР 13С, не содержались первичные гидроксигруппы (в спектре полностью отсутствовали сигналы в области 8 -62.0 м.д.). Таким образом, несмотря на низкую скорость расходования NaOH (2.00±0.05 мкмоль/мин, ср.: 4.4 мкмоль/мин стр. 16) при использовании практически эквимольного количества NaOCl достигнуто исчерпывающее окисление НА.

При окислении НА в условиях с предварительным доведением каждого из растворов HA-NaBr-TEMPO и NaOCl до рН 10.2 (методика 2) в момент их

8 Hawkins C.L., Davies М J. Degradation of hyaluronic acid, poly- and monosaccharides, and

model compounds by hypochlorite: evidence for radical intermediates and fragmentation. // Free

Rad. Biol. & Med - 1998. - Vol. 24. - № 9. - P. 1396-1410.

смешивания рН устанавливался не выше 11, XJ1 при этом не зарегистрирована. Скорость расходования NaOH была несколько ниже, чем при проведении реакции по методике 1 (1.47±0.01 мкмоль/мин). Расход NaOCl был значительно меньше -всего -0.38 моль-экв (рис. 46), конверсия гидроксигрупп НА в карбоксильные не превышала 40% [определено из спектра ЯМР |3С окисленной НА по соотношению интенсивностей сигналов атомов С4 в звене jV-ацетилглюкозамина (5 69.7 м.д.) и Л'-ацетилглюкозаминуроновой кислоты (5 72.0 м.д.) и из ИК-спектра окисленной НА, переведенной из натриевой соли в Н+-форму с помощью катионита Dowex 50W-X4, по соотношению интенсивностей полос поглощения в области 1740 см"' (СООН-группа) и 1550 см"' (C-N)]. Сопоставив количество пошедшего на окисление НА гипохлорита и значение конверсии в методиках 1 и 2, мы предположили, что кислород воздуха участвует в процессе окисления. Действительно, в условиях, аналогичных методике 1, но в атмосфере Аг (методика 3), при расходе NaOCl 1.4 моль-экв и практически такой же скорости расходования NaOH (1.78±0.04 мкмоль/мин), конверсия составила всего 56% (рис. 4в). Следует отметить, что при взаимодействии НА с NaOCl в отсутствие TEMPO окисления не наблюдалось, а расход NaOCl составил всего лишь 0.028 моль-экв (рис. 4г).

¡2 500

Рис. 4. Расходование NaOCl в реакции окисления НА:

(а) конц. раствор NaOCl в один прием добавляют в раствор HA-NaBr-TEMPO (методика 1);

(о) растворы HA-NaBr-TEMPO и NaOCl перед смешиванием доводят до рН 10 2 (методика 2);

(в) в условиях методики 1, но в атмосфере Аг (методика 3);

(г) в условиях методики 1 в отсутствие

TEMPO

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

время, мнн

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что кинетические кривые расходования №ОН не отражают реальной скорости процесса накопления карбоксигрупп в НА. Из литературы известно, что разложение гипохлорита в водных растворах (в которых даже при низких рН присутствует НОС1, рКа=7.44) сопровождается понижением рН вследствие накопления НС1 по реакции: ОСГ + НОС1 ->Ог + 2СГ + Н+ или 2НОС1 -> 02 + 2Н+ + 2СГ. Известно также, что гипогалогениты и галогенигы легко разлагаются под действием температуры, освещения, катализаторов. При подкислении раствора гипохлорита натрия

выделяются '02 и С12,9 а при катализированном металл-порфириновыми

комплексами окислении хлоритом натрия обнаружено выделение Ог. достаточное

для протекания процесса в режиме радикального автоокисления.

В связи с этим по методикам 1 и 2 были проведены реакции NaOCl с TEMPO, NaOCI с NaBr и смеси NaOCl-NaBr с TEMPO. Реакции контролировались по расходованию NaOH и спектрофогометрически по интенсивности поглощения раствора NaOCl при X 292 нм (рис. 5). Несмотря на отсутствие субстрата, во всех опытах для поддержания рН 10.2 требовалось добавление NaOH. В реакции NaOCl с TEMPO по методике 1 с увеличением концентрации TEMPO скорость расходования NaOH возрастала, в реакции NaOCl и NaBr количество NaBr не влияло на расход NaOH, а в системе NaOCl-NaBr-TEMPO синергизма совместного действия TEMPO и NaBr на разложение NaOCl не наблюдалось. В опытах с предварительным доведением рН растворов до 10.2 (методика 2) скорость расходования NaOH была несколько выше, чем в соответствующих опытах по методике 1 (табл. 4).

Таблица 4. Скорости расходования №ОН в системах №ОС1-ТЕМРО, ХаОС1-№Вг и №ОСШаВг-ТЕМРО при различных соотношениях реагентов (Н20, 0°С, рН 10.2)_____________________

Соотношение реагентов NaOCl TEMPO Скорость расходования NaOH, мкмоль/мин Соотношение реагентов NaOChNaBr Скорость расходования NaOH, мкмоль/мин Соотношение реагентов NaOCl:NaBr:TEMPO Скорость расходования NaOH, мкмоль/мин

1.9.0.011 0 61±0 01 (0 74"±0 03) 1.9.0.2 1.04+0.04 1 90.2:0.011 0 79±0.01 (0 97*'±0 06)

1 9 0 033 0.67±0.02 1.9.0.4 1 04±0 04 1.9 0.2.0.033 0.72±0 01

1.9 0 066 0.8Ш.02 1 9 0.6 1 00±0 03 1.9 0 2:0 066 0.82±0.01

1.9:0.11 0 99±0.04

* соотношения реагентов указаны такими же, как в присутствии субстрата скорости расходования №ОН в условиях смешивания реагентов по методике 2.

В спектре УФ отмечено прохождение кривых поглощения через максимумы, обусловленные, по-видимому, образованием хромофора с экстинкцией (б), превышающей значение для ЫаОС! (СЮ~ е292 =350 М~'-см"!) (рис. 5а-г).

s Khan A U., Kasha M Singlet molecular oxygen evolution upon simple acidification of aqueous hypochlorite- Application to studies on the deleterious healdi effects of chlorinated drinking water. // Proc. Natl. Acad. Set USA - 1994. - V. 91 - P. 12362-12364

10 Slaughter L M, (Tollman J.P., Eberspacher T A., Brauman J I. Radical autoxidation and autogenous O2 evolution in manganese-porphyrin catalyzed alkane oxidations with chlorite. // Inorg. Chem. - 2004. - V 43 - № 17 - P. 5198-5204.

Ат 0,86-

0.64-

а /

0,62-

0.80-

0.78-

0.76-

0.74-

0,72-

0,70- 1 г*

0,68-

0,66- У

0,64- Ь-

0,62-

Рис. 5. Изменение поглощения (Агп) растворов в ходе реакции (0°С, рН 10.2): (я) ШОС1:ТЕМРО=1.9.0 011 (методика 1);

(£)ЫаОС1:КаВг=1.9:0.2 (методика 1); («) №ОС1 :ЫаВг:ТЕМРО= 1.9:0.2:0.011 (методика 1);

(г) №ОС1:МаВг:ТЕМРО=1.9.0 2:0.011 (методика 2)

-.г

Время, мин

Наиболее вероятным хромофором в этой реакции является СЮ', который мог образоваться по реакции атомарного кислорода с С12: О' + С12 —> СЮ' + СГ (CIO* е292=990±70 М'см"1).11 Известно, что СЮ* легко осуществляет дегидрогенирование С-Н связи с образованием С-радикалов: СЮ" + RH —> НСЮ + R*. Максимумы наиболее выражены в реакции NaOC] с TEMPO (рис. 5а) и NaOCJ-NaBr с TEMPO при смешивании реагентов по методике 1 (рис. 5в). Таким образом, количество образующегося СЮ' зависит как от воздействия TEMPO, так и от стартовых условий процесса.

В реакции NaOCl с TEMPO при X 359 нм наблюдали прохождение кривой поглощения через максимум, отвечающий образованию СЮ2 (s359=l250 M''-см"1) (рис. 6) в результате наиболее вероятной реакции Ог + СГ + М СЮ2 + М (где М -другая молекула, на которой происходит продолжение цепи).

0,28 0,26 0,2* 0,22 0,20 0.18

Рис. 6. Изменение поглощения (Am) раствора в ходе реакции NaOCl с TEMPO (0°С, рН 10.2, NaOCl:TEMPO= 1.9:0.011).

Время, мнн

Из полученных результатов можно сделать вывод, что NaBr и TEMPO катализируют разложение NaOCl. Поскольку для системы NaOCl-NaBr-TEMPO зарегистрирована ХЛ, а в отсутствие TEMPO ХЛ не наблюдалась, можно предположить, что NaBr и TEMPO катализируют разложение NaOCl по

" Никитин И.В. Химия кислородных соединений галогенов. - М.:Наука. - 1986. - 104 с.

различным механизмам, причем TEMPO способствует образованию радикальных частиц, наиболее вероятно, атомарного кислорода и СЮ'-радикала.

С помощью ЭПР-спектроскопии показано, что реакция TEMPO с гипогалогенитами (рН 10.2, 0°С, 1 ч) в отсутствие субстрата не приводит к нитрозоний-катиону (интенсивность ЭПР-сигнала не изменялась в пределах ±15% в течение всего времени реакции). Следовательно, гипогалогениты не способны окислять TEMPO до нитрозоний-катиона, что противоречит схеме 7 (стр. 17). В то же время, TEMPO быстро расходуется в процессе окисления НА. После удаления НА из реакционной массы осаждением в спирт и откачивания при пониженном давлении падоеадочной водно-спиртовой смеси в УФ-спектре остатка не обнаруживались максимумы поглощения, характерные для TEMPO (^шах 247 нм), нитрозоний-катиона (широкий максимум с центром X 235 нм) или гидроксиламина ТЕМРО-Н (/.,TiaN 270 нм). Принимая во внимание результаты УФ-спектроскопии и высокие константы скорости взаимодействия TEMPO с углеродцентрированными радикалами (4.8-108-1.2-109 M''-с"1),12 наиболее вероятной представляется рекомбинация TEMPO с радикалами, генерируемыми в реакции гликозаминогликанов с гипогалогенитами.8

На основании экспериментальных результатов и анализа литературных данных, нами предположено, что процесс окисления НА носит радикальный характер, хорошо объясняющий образование гибридных макромолекул при окислении смесей гликозаминогликанов.

Таким образом, механизм окисления НА можно представить следующим образом: TEMPO, NaBr и НА катализируют распад NaOCl с образованием электронно-возбужденного синглетного кислорода 'О и радикала СЮ', инициирующих отрыв атома водорода от С-Н связей в первичных гидроксильных группах НА с образованием С-радикалов (R"), которые с участием кислорода (из воздуха или генерируемого самой окислительной системой при проведении реакции в инертной атмосфере) превращаются в альдегиды (схема 8). Альдегидные группы затем окисляются в карбоксильные молекулярным кислородом согласно общепринятому радикально-цепному механизму.

12 Beckvvith A.L.J., Bovvry V.W, Ingoid K.(J. Kinetics ofnitroxide radical trapping. I. Solvent Effects. IIJ Am. Chem. Soc. - 1992. -V. 114-P. 4983-4992.

Схема 8

NaOCI

TEMPO, NaBr, HA

Ю II CIO'

r-ch2oh '"(и[|()")'> r-ch-oh

R-CH,OH

ООН

R-CH-OII

jC ii

R-C-H-R-C-OH

R-CH-OH

-R-CH-OH

R~C"'°"> R-&-OH+ R-CH-OH

о он

R-CH-OII

-O.

ВЫВОДЫ

1. Найдены условия селективного окисления гиалуроновой кислоты с исчерпывающим превращением гидроксиметильных групп в карбоксильные действием гипохлорита натрия, катализированного 2,2,6,6-теграметилпиперидин-1-оксилом (TEMPO) и NaBr. Синтезирована карбокси-гиалуроновая кислота, устойчивая in vitro к действию фермента тестикулярной гиалуронидазы.

2. Впервые синтезированы конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты с фармакологически значимыми аминами. В зависимости от природы амина и условий конъюгации конверсия карбоксигрупп в амидные составила 19-90% в расчете на сахаридное звено. Установлено, что в структуре карбокси-гиалуроновой кислоты активность карбоксильных групп в звене N-ацетилглюкозаминуроновой кислоты выше, чем в звене D-глюкуроновой кислоты.

3. Синтезированы конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты и гепарина с используемым в терапии ВИЧ-инфекции З'-азидо-З'-дезокситимидином.

4. Исследована биодеградируемость конъюгатов карбокси-гиалуроновой кислоты относительно природной гиалуроновой кислоты под действием тестикулярной гиалуронидазы. Установлено, что ферментативная биодеградируемость конъюгатов карбокси-гиалуроновой кислоты возрастает с увеличением конверсии карбоксигрупп в амидные, но тем не менее уступает биодеградируемости природной гиалуроновой кислоты.

5. При окислении смеси (3:2) хондроитин-4-сульфат/хондроитин-6-сульфат реагентом NaOCI-NaBr-TEMPO в водной среде с последующим хроматографическим разделением продуктов окисления выделены гибридные

полисахариды, состоящие из хондроитин-6-сульфата и окисленного по первичным гидроксигруппам хондроитин-4-сульфата. Их образование подтверждено получением в тех же условиях гибридных молекул из эквимольной смеси гиалуроновой кислоты и гепарина.

6. Окислением смеси (2:1) хондроитин-6-сульфат/дерматансульфат реагентом NaOCl-NaBr-TEMPO и последующей колоночной хроматографией на анионообменной ДЕАЕ-целлюлозе получены не подвергшийся окислению хондроитин-6-сульфат (с выходом 35%) и гибрид хондроитин-6-сульфата с окисленным дерматансульфатом. Показано, что окисление гидроксиметильных групп в звене Ж-ацетил-4-сульфогалактозамина дермагансульфата протекает неселективно: наряду с образованием карбоксильных и альдегидных групп происходит расщепление связи С2-С3 в звене идуроновой кислоты.

7. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие об участии радикалов в процессе селективного окисления гликозаминогликанов реагентом NaOCl-NaBr-TEMPO: (а) обнаружена хемилюминесценция; (б) показано участие кислорода; (в) методами УФ- и ЭПР-спектрометрии установлено, что TEMPO катализирует разложение NaOCl с образованием 'О и СЮ", инициирующих отрыв атома водорода от С-Н связей первичных гидроксильных групп.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ

ПУБЛИКАЦИЯХ

1. ИЛО. Понеделькина, В.П. Одиноков, Э.А. Саитгалина, У.М. Джемилев. Устойчивость in vitro окисленной гиалуроновой кислоты к тестикулярной гиалуронидазе. // Доклады АН. 2007, Т.417, № 4, С. 557-560.

2. И.Ю. Понеделькина, В.П. Одиноков, Э.А. Саитгалина, Е.С. Лукина, У.М. Джемилев. Конъюгация З'-азидо-З'-дезокситимидина с гепарином. ¡/Доклады АН. 2008, Т.419, № 4, С. 512-515.

3. И.Ю. Понеделькина, Э.А. Саитгалина, Е.С. Лукина, О.В. Иванова, В.Н. Одиноков, У.М. Джемилев. Способ получения модифицированного дерматансульфата. Патент РФ № 2318833. 2008 г. Опубл. 27.05.2007. Бюл. № 15.

4. И.Ю. Понеделькина, Э.А. Саитгалина, Е.С. Лукина, В.Н. Одиноков, У.М. Джемилев. Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостыо. Заявка на патент РФ № 2007112594. Положительное решение от 07.06.07 г.

5. И.Ю. Понеделькина, И.Ф. Суфияров, Е.С. Лукина, Э.А. Саитгалина, В.Н. Одиноков, У.М. Джемилев. Способ получения обладающих пониженной

растворимостью в воде пленочных материалов на основе модифицированных аминосалициловыми кислотами карбоксисодержащих полисахаридов. Заявка па патент РФ № 2007111417. Положительное решение от 13.06.07 г.

6. И.Ю. Понеделькина, Э.А. Хайбрахманова, Е.С. Лукина, В.Н. Одиноков, У.М. Джемилев. Способ получения хондроитин-6-сульфата из пупочных канатиков новорожденных. Заявка на патент РФ № 2008106677. Положительное решение от 20.05.08 г.

7. И.Ю. Понеделькина, Э.А. Саитгалина, Е.С. Лукина, В.Н. Одиноков. Полусинтетические биоматериалы на основе окисленной гиалуроновой кислоты. // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Современные проблемы органической химии», г. Новосибирск, 2007. С. 163.

8. Э.А. Саитгалина, И.Ю. Понеделькина, Н.К. Патрушева, Э.Ф. Мухаметьянова, В.Н. Одиноков. Гибридизация гликозаминогликанов при окислении в системе 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил (TEMPO)-NaCIO-NaBr-НгО. // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, г. Москва, 2007. С. 246.

Работы 1-5, 7, 8 опубликованы под фамилией Саитгалина.

Соискатель: , ''"

ХАЙБРАХМАНОВА ЭЛЬВИРА АЗАМАТОВНА

ОКИСЛЕНИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В КАРБОКСИИРОИЗВОДНЫЕ И ИХ КОНЪЮГАЦИЯ С АМИНАМИ

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Лицензия №0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 15.11.2008 г. Бумага офсетная Отпечатано на ризографе. Формат 60x84^. Усл.-печ л. 1,57. Уч-изд. л. 1,86.

Тираж 100 экз. Заказ №397.

450000, г. Уфа, ул Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗРАВА»

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Хайбрахманова, Эльвира Азаматовна

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ОКИСЛЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ

ПО ПЕРВИЧНЫМ ГИДРОКСИГРУППАМ

1Л. Окисление кислородсодержащими реагентами

1.2. Окисление галогенсодержащими реагентами

1.3. Окисление 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксилом (TEMPO) и его оксоаммониевыми солями

1.3.1. Представление о механизме окисления TEMPO

1.3.2. Окисление гипохлоритом, катализированное TEMPO

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1. Окисление гиалуроновой кислоты

2.2. Конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты с фармакозначимыми аминами

2.3. Конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты и гепарина с З'-азидо

3' - дез окситимид ин ом

2.4. Биодеградируемость карбокси-гиалуроновой кислоты и ее конъюгатов

2.5. Окисление хондроитинсульфатов

2.6. Исследование системы NaOCl-NaBr-TEMPO как реагента селективного окисления первичных гидроксильных групп в полисахаридах

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Методы анализа

3.2. Получение гликозаминогликанов

3.2.1. Гиалуроновая кислота (НА) и хондроитинсульфаты (смесь CS-6/DS) из пупочных канатиков новорожденных

3.2.2. Дерматансульфат (DS) из кожи свиней

3.2.3. Хондроитинсульфаты из хрящевой ткани (смесь CS-4/CS-6).

3.2.4. Гепарин (HEP)

3.3. Получение карбокси-НА (методика 1)

3.4. Конъюгаты карбокси-НА с аминами

3.5. Конъюгат карбокси-НА с З'-азидо-З'-дезокситимидином

3.6. Конъюгат HEP с З'-азидо-З'-дезокситимидином

3.7. Определение биодеградируемости карбокси-НА при различных концентрациях гиалуронидазы

3.8. Определение биодеградируемости конъюгатов карбокси-НА

3.9. Окисление смеси CS-4/CS

3.10. Окисление смеси НА/НЕР

3.11. Окисление смеси CS-6/DS

3.12. Окисление DS

3.13. Окисление НА

3.13.1. Окисление НА с предварительным доведением рН растворов HA-NaBr-TEMPO и NaOCl (методика 2).

3.13.2. Окисление НА в атмосфере аргона (методика 3)

3.13.3. Взаимодействие НА с NaOCl в присутствии NaBr (без TEMPO)

3.14. Исследование реагента NaOCl-NaBr-TEMPO

3.14.1. Взаимодействие NaOCl с TEMPO

3.14.2. Взаимодействие NaOCl с NaBr

3.14.3. Взаимодействие NaOCl с NaBr и TEMPO

3.14.4. Получение нитрозоний-катиона и исследование его стабильности

3.14.5. Получение гидроксиламина ТЕМРО-Н

ВЫВОДЫ

Введение диссертация по химии, на тему "Окисление гликозаминогликанов в карбоксипроизводные и их конъюгация с аминами"

Гликозаминогликаны (гиалуроновая кислота, дерматансульфат, хондроитин-4- и -6-сульфаты, гепарин), - гетерополисахариды линейного строения, — содержатся в межклеточном матриксе соединительной ткани животных и человека, выполняя важные функции в живых организмах. Они являются действующим веществом ряда лекарственных средств, обладающих репаративно-регенеративными, противовоспалительными и антикоагулянтными свойствами.

В последние годы проявляется повышенный интерес к селективному окислению первичной гидроксильной группы полисахаридов до карбоксильной. Найдены каталитические методы с использованием в качестве катализаторов стабильных нитроксильных радикалов в сочетании с такими окислителями, как гипохлориты, хлориты, молекулярный кислород, пероксид водорода. Известны примеры окисления в мягких условиях мальтодекстрина, циклодекстрина, хитина, хитозана, целлюлозы и ее эфиров, крахмала и других глюканов с получением соответствующих полиуроновых кислот. Из гликозаминогликанов окисление по гидроксиметильной группе известно лишь для гиалуроновой кислоты. В связи с этим изучение каталитического окисления гликозаминогликанов гипохлоритом натрия в присутствии TEMPO, исследование физико-химических и биологических свойств гликозаминогликанов с дополнительными карбоксильными группами и получение на их основе конъюгатов с фармакозначимыми аминами представляется актуальной задачей.

В результате выполнения данной работы найдены условия селективного окисления гиалуроновой кислоты со 100% конверсией гидроксиметильных групп в карбоксильные. Показано, что окисление гликозаминогликанов Автор выраэ/сает глубокую благодарность директору ИНК РАН, член-корр. РАН Усеину Меметовичу Дэ/селшлеву за выбор направления исследования и содействие в процессе выполнения работы. гипохлоритом натрия, катализируемое TEMPO, является радикальным процессом. Установлено, что карбокси-гиалуроновая кислота проявляет повышенную ферментоустойчивость in vitro к действию фермента тестикулярной гиалуронидазы. Синтезированы новые конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты с фармакозначимыми аминами, исследована их ферментативная биодеградируемость. Синтезированы конъюгаты карбокси-гиалуроновой кислоты и гепарина с антивирусным препаратом З'-азидо-З'-дезокситимидином, применяемым в терапии ВИЧ-инфекции.

При ТЕМРО-окислении смесей хондроитинсульфатов с последующим хроматографическим разделением продуктов получены индивидуальный хондроитин-6-сульфат и гибридные полисахариды.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте нефтехимии и катализа РАН в соответствии с научным направлением Института по теме «Химия стероидов, токоферолов и природных полисахаридов» (№ гос. регистр. 0120.0 850046), при финансовой поддержке Отделения химии и наук о материалах РАН по программе «Биомолекулярная и медицинская химия» (проект «Модифицированные гликозаминогликаны как потенциальные лекарственные средства для химиотерапии ВИЧ-инфекции и опухолевых заболеваний»).

Заключение диссертации по теме "Органическая химия"

ВЫВОДЫ

1. Найдены условия селективного окисления гиалуроновой кислоты с исчерпывающим превращением гидроксиметильных групп в карбоксильные действием гипохлорита натрия, катализированного 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1 -оксилом (TEMPO) и NaBr. Синтезирована карбокси-гиалуроновая кислота, устойчивая in vitro к действию фермента тестикулярной гиалуронидазы.

5. При окислении смеси (3:2) хондроитин-4-сульфат/хондроитин-6-сульфат реагентом NaOCl-NaBr-TEMPO в водной среде с последующим хроматографическим разделением продуктов окисления выделены гибридные полисахариды, состоящие из хондроитин-6-сульфата и окисленного по первичным гидроксигруппам хондроитин-4-сульфата. Их образование подтверждено получением в тех же условиях гибридных молекул из эквимольной смеси гиалуроновой кислоты и гепарина.

6. Окислением смеси (2:1) хондроитин-6-сульфат/дерматансульфат реагентом NaOCl-NaBr-TEMPO и последующей колоночной хроматографией на анионообменной ДЕАЕ-целлюлозе получены не подвергшийся окислению хондроитин-6-сульфат (с выходом 35%) и гибрид хондроитин-6-сульфата с окисленным дерматансульфатом. Показано, что окисление гидроксиметильных групп в звене Л^-ацетил-4-сульфогалактозамина дерматансульфата протекает неселективно: наряду с образованием карбоксильных и альдегидных групп происходит расщепление связи С2-С3 в звене идуроновой кислоты.

7. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие об участии радикалов в процессе селективного окисления гликозаминогликанов реагентом NaOCl-NaBr-TEMPO: (а) обнаружена хемилюминесценция; (б) показано участие кислорода; (в) методами УФ- и ЭПР-спектрометрии установлено, что TEMPO катализирует разложение NaOCl с образованием *0 и СЮ', инициирующих отрыв атома водорода от С-Н связей первичных гидроксильных групп.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Хайбрахманова, Эльвира Азаматовна, Уфа

1. Шорыгин П.П., Хаит Э.В. Нитрование целлюлозы азотной кислотой и двуокисью азота. 1.ЖОХ- 1937. - Т. 7. -№ 1 - С. 188-192.

2. Yackel Е.С., Kenyon W.O. The oxidation of cellulose by nitrogen dioxide. // J. Am. Chem. Soc. 1942. - Vol. 64. - P. 121-127.

3. Павлюченко М.П., Ермоленко И.Н., Капуцкий Ф.И. К вопросу механизма окисления целлюлозы двуокисью азота. // ЖПХ— 1960. — № 33.-С. 1385-1391.

4. Painter T.J. Preparation and periodate oxidation of С-6-охуcellulose: conformational interpretation of hemiacetal stability. // Carbohydr. Res. — 1977.-Vol. 55.-P. 95-103.

5. De Nooy A.E.J., Pagliaro M., van Bekkum H. Autocatalytic oxidation ofprimary hydroxy 1 functions in glucans with nitrogen oxides. // Carbohydr.

6. Res. 1997.-Vol. 304.-P. 117-123.

7. Муллагалиев И.Р., Кабальнова H.H., Галиаскарова Г.Г., Покало Е.И., Шерешовец В.В., Монаков Ю.Б. Окислительная деструкция хитозана при озонировании. И ЖПХ- 1997. Т. 70. - С. 1709-1712.

8. Argulles-Monal W., Peniche С.С. Preparation of novel polyampholyte from chitosan and citric acid. // Macromol. Chem. Rapid Commun. — 1993. — Vol. 14.-№ 12.-P. 735-740.

9. Широкова Е.Н. Окисление арабиногалактана под действием пероксида водорода и персульфата калия в водной среде: Дис. канд. хим. наук. -Уфа, 2003.-140 с.

10. Gonda R., Tomoda M., Ohara N., Takada K. Arabinogalactan core structure and immunological activities of ukonan C, an acidic polysaccharide from the rhizome of Curcuma longa. // Chem. Pharm. Bull. — 1993. — Vol. 16. — №3. -P. 235-238.

11. Бадыкова JI.А. Взаимодействие арабиногалактана сибирской лиственницы с 5-аминосалициловой кислотой, 4-аминосалициловой кислотами и гидразидом изоникотиновой кислоты. Дис. канд. хим. наук. Уфа, 2007. - 145 с.

12. Edye L.A., Meehan G.V., Richards G.N. Influence of Temperature and pH on the Platinum Catalysed Oxidation of Sucrose. // J. Carbohydr. Chem. — 1994.-Vol. 13.-№2.-P. 273-283.

13. Aspinall G.O., Nicolson A. The catalytic oxidation of European larch e-galactan. II J. Chem. Soc. 1960. - P. 2503-2507.

14. Verraest D.L., Peters J.A., van Bekkum H. The platinum-catalyzed oxidation of inulin. // Carbohydr. Res. 1998. - Vol. 306. - №1-2. - P. 197-203.

15. Роговин З.А. Химия целлюлозы. M.: Химия. - 1972. — 520 с.

16. Whistler R.L., Schweiger R. Oxidation of Alginic Acid with Hypochlorite at Different Hydrogen Ion Concentrations. II J. Am. Chem. Soc. — 1958. Vol. 80. -№21. -P. 5701-5704.

17. Besemer A.C., van Bekkum H. Dicarboxy-Starch by Sodium Hypochlorite/Bromide Oxidation and Its Calcium Binding Properties. // Starch. 1994. - Vol. 46. - № 3 - P. 95-101.

18. Besemer A.C., van Bekkum H. The Catalytic Effect of Bromide in the Hypochlorite Oxidation of Linear Dextrins and Inulin. // Starch. 1994. -Vol. 46. - № 3 - P. 101-106.

19. Курамшина A.P. Окислительная деструкция хитозана под действием диоксида хлора и пероксида водорода в присутствии солей металлов переменной валентности: Дис. канд. хим. наук. — Уфа, 2007. — 125 с.

20. Pagliaro M. Autocatalytic oxidations of primary hydroxy 1 groups of cellulose in phosphoric acid with halogen oxides. // Carbohydr. Res. — 1998. -Vol. 308.-P. 311-317.

21. Бикбулатов И.Х. Безотходное производство хлоргидрииов. — М.: Химия. 2000. - 167 с.

22. Лебедев O.JL, Казарновский С.Н. Каталитическое окисление алифатических аминов перекисью водорода. II ЖОХ- 1960. Т. 30. -№5.-С. 1631-1635.

23. Розанцев Э.Г., Шолле В.Д. Успехи химии нитроксильных радикалов. // Усп. химии. 1971. - Т. 40. -№ 3. - С. 417-443.

24. Keana J.F.W. Newer Aspects of the Synthesis and Chemistry of Nitroxide Spin Labels. // Chem. Rev. 1978. - Vol. 78. - № 1. - P. 37-64.

25. Bowman D.F., Gillan Т., Ingold K.U. Kinetic applications of electron paramagnetic resonance spectroscopy. III. Self-reactions of dialkyl nitroxide radicals. II J. Am. Chem. Soc. 1971. - Vol. 93. -№ 24. - P. 6555-6561.

26. Goldstein S., Samuni A. Kinetics and mechanism of peroxyl radical reactions with nitroxides. // J. Phys. Chem. A. 2007. - Vol. 111. - № 6. -P. 1066-1072.

27. Wright P.J., English A.M. Scavenging with TEMPO* to identify peptide-and protein- based radicals by mass spectrometry: advantages of spin scavenging over spin trapping. // J. Am. Chem. Soc. — 2003. Vol. 125. - № 28.-P. 8655-8665.

28. De Nooy А.Е.J., Besemer А.С., van Bekkum H. On the Use of Stable Organic Nitroxyl Radicals for the Oxidation of Primary and Secondary Alcohols. // Synthesis — 1996. — Vol. 10.-P. 1153-1174.

29. Semmelhack M.F., Schmid C.R. Nitroxyl-Mediated Electrooxidation of Amines to Nitriles and Carbonyl Compounds. // J. Am. Chem. Soc. — 1983. — Vol. 105.-P. 6732-6734.

30. Hunter D.H., Barton D.H.R., Motherwell W.J. Oxoammomium salts as oxidizing agents: 2,2,6,6-tetramethyl-l-oxopiperidinium chloride. // Tetrahedron Lett. 1984. - Vol. 25. - № 6. - P. 603-606.

31. Adam W., Saha-Moller C.S., Ganeshpure P.A. Synthetic Applications of Nonmetal Catalysts for Homogeneous Oxidations. // Chem. Rev. 2001. -Vol. 101.-№ 11.-P. 3499-3548.

32. Bobbitt J.M., Flores M.C.L. Organic nitrosonium salts as oxidants in organic chemistry. // Heterocycles 1988. - Vol. 27. - № 2. - P. 509-534.

33. Голубев В.А., Розанцев Э.Г., Нейман М.Б. О некоторых реакциях свободных иминоксильных радикалов с участием неспаренного электрона. 11 Известия АН. Сер. хим. — 1965. —№11. С. 1927-1936.

34. Endo Т., Miyazawa Т., Shiihashi S., Okawara М. Oxidation of hydroxide ion by immonium oxide. // J. Am. Chem. Soc. 1984. - Vol. 106. - P. 38773878.

35. Голубев B.A., Бориславский B.H., Александров A.JI. Механизм окисления первичных и вторичных спиртов оксопиперидиниевыми солями. // Известия АН. Сер. хим. 1977. - №9. - С. 2025-2034.

36. Semmelhack M.F., Schmid C.R., Cortes D.A. Mechanism of the oxidation of alcohols by 2,2,6,6-tetramethylpiperidine nitrosonium cation. // Tetrahedron Lett. 1986. - Vol. 27. - № 10. - P. 1119-1122.

37. Bailey W.F., Bobbitt J.M., Wiberg K.B. Mechanism of the oxidation of alcohols by oxoammonium cations. // J. Org. Chem. — 2007. Vol. 72. — № 12.-P. 4504-4509.

38. Rychnovsky S.D., Vaidyanathan R. TEMPO-Catalyzed Oxidations of Alcohols Using m-CPBA: The Role of Halide Ions. II J. Org. Chem. 1999. -Vol. 64.-№ 1.-P. 310-312.

39. De Nooy A.E.J., Besemer A.C., van Bekkum H. Highly selective nitroxyl radical-mediated oxidation of primary alcohol groups in water-soluble glucans. // Carbohydr. Res. 1995. - Vol. 269. - P. 89-98.

40. MiyazawaT., Endo T. Oxidation of diols with oxoaminium salts. // J. Org. Chem. 1985. - Vol. 50. - № 20. - P. 3930-3931.

41. Ma Z., Bobbit J.M. Organic oxoammonium salts. 3. A new convenient method for the oxidation of alcohols to aldehydes and ketones. // J. Org. Chem. 1991.-Vol. 56.-№21.-P. 6110-6114.

42. Голубев B.A., Сень В.Д., Кулык И.В., Александров A.JI. Механизм кислотного диспропорционирования дитрет.алкилнитроксильных радикалов. // Известия АН. Сер. хим. 1975. - №10. - С. 2235-2241.

43. Jiang N., Ragauskas A.J. Cu(II)-catalyzed selective aerobic oxidation of alcohols under mild conditions. // J. Org. Chem. 2006. - Vol. 71. - № 18. -P. 7087-7090.

44. Yang G., Ma J., Wang W., Zhao J., Lin X., Zhou L., Gao X. Heterogeneous Cu-Mn oxides mediate efficiently TEMPO-catalyzed aerobic oxidation of alcohols. // Catal. Lett. 2006 - Vol. 112. - № 1-2. - P. 83-87.

45. Wang N., Liu R., Chen J., Liang X. NaN02-activated, iron-TEMPO catalyst system for aerobic alcohol oxidation under mild conditions. // Chem. Commun. 2005. - Vol. 14. - № 42. - P. 5322-5324.

46. Cella J.A., Kelley J.A., Kenehan E.F. Nitroxide-Catalyzed Oxidation of Alcohols Using m-Chloroperbenzoic Acid. A New Method. // J. Org. Chem. 1975.-Vol. 40.-№ 12.-P. 1860-1862.

47. Lin F., Peng W., Xu W., Han X., Yu B. A facile preparation of urinates via selective oxidation with TEMPO/KBr/Ca(OCl)2 under aqueous conditions. // Carbohydr. Res. 2004. - Vol. 339. - № 6. - P. 1219-1223.

48. Davis N.J., Flitsch S.L. Selective oxidation of monosaccharide derivatives to uronic acids. // Tetrahedron Lett. 1993. - Vol. 34. - № 7. - P. 1181-1184.

49. Zhao M.M., Lil J., Mano E., Song Z.J., Tschaen D.M. Oxidation of primary alcohols to carboxylic acids with sodium chlorite catalyzed by TEMPO and bleach: 4-methoxyphenylacetic acid. // Org. Synth. 2005 - Vol. 81. - P. 195-199.

50. Einhorn J., Einhom C., Ratajczak F., Pierre J.-P. Efficient and Highly Selective Oxidation of Primary Alcohols to Aldehydes by N-Chlorosuccinimide Mediated by Oxoammonium Salts. // J. Org. Chem. -1996.-Vol. 61.-№21.-P. 7452-7454.

51. Miyazawa T.M., Endo T. Oxidation of benzyl alcohol by Fe(III) mediated by nitroxyl radical. II J. Mol. Catal. 1985. - Vol. 31. -№ 2. -P. 217-220.

52. Zhao X.-F., Zhang C. Iodobenzene Dichloride as a Stoichiometric Oxidant for the Conversion of Alcohols into Carbonyl Compounds; Two Facile Methods for Its Preparation. // Synthesis 2007. - Vol. 4. - P. 551-557.

53. Chen F.-E., Kuang Y.-Y., Dai H.-F., Lu L., Huo M. A Selective and Mild Oxidation of Primary Amines to Nitriles with Trichloroisocyanuric Acid. // Synthesis 2003. - Vol. 17. - P. 2629-2631.

54. Miller R.A., Hoerrner R.S. Iodine as a Chemoselective Reoxidant of TEMPO: Application.to the Oxidation of Alcohols to Aldehydes and Ketones. // Org. Lett. 2003. - Vol. 5. - № 3. - P. 285-287.

55. Liu R.-H., Liang X.-M., Dong C.-Y., Hu X.-Q. Transition-Metal-Free: A Highly Efficient Catalytic Aerobic Alcohol Oxidation Process. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - Vol. 126.-№ 13. - P. 4112-4113.

56. Liu R.-H., Liang X.-M., Dong C.-Y., Wang X.-J., Hu X.-Q. Highly Efficient Catalytic Aerobic Oxidations of Benzylic Alcohols in Water. // J. Org. Chem. 2005. - Vol. 70. - № 2. - P. 729-731.

57. Cecchetto A., Fontana F., Miniscia F., Recupero F. Efficient Mn-Cu and Mn-Co-TEMPO-catalysed oxidation of alcohols into aldehydes and ketones by oxygen under mild conditions. // Tetrahedron Lett. — 2001. — Vol. 42. — №38. -P. 6651-6653.

58. Herrman W.A., Zoller J.P., Fischer R.W. The selective catalytic oxidation of terminal alcohols: a novel four-component system with MTO as catalyst. // J. Organomet. Chem. 1999. - Vol. 579. -№ 1. - P. 404-407.

59. Dijksman A., Arends I.W.C.E., Sheldon R.A. Efficient ruthenium-TEMPO-catalysed aerobic oxidation of aliphatic alcohols into aldehydes and ketones. II Chem. Commun. 1999.-Vol. 16.-P. 1591-1592.

60. SemmelhackM.F., Chou C.S., Cortes D.A. Nitroxyl-mediatedelectrooxidation of alcohols to aldehydes and ketones. // J. Am. Chem. Soc. -1983.-Vol. 105.-№ 13.-P. 4492-4494.

61. Fabbrini M., Galli C., Gentili P., Macchitella D. An oxidation of alcohols by oxygen with the enzyme laccase and mediation by TEMPO. // Tetrahedron Lett. — 2001. — Vol. 42.-P. 7551-7553.

62. Jetten J.M., van den Dool R.T.M., van Hartingsveldt W., Besemer A.C. Process for selective oxidation of cellulose. // Пат. WO 0050463. 2000.

63. Gilhespy M., Lok M., Baucherel X. Polymer-supported nitroxyl radical catalyst for selective aerobic oxidation of primary alcohols to aldehydes. // Chem. Commun. 2005. - Vol. 8. - P. 1085-1086.

64. Ferreira P., Phillips E., Rippon D.5 Tsang S., Hayes W. Poly(ethyleneglycol)-supported nitroxyls: branched catalysts for the selective oxidation of alcohols. // J. Org. Chem. — 2004. Vol. 69. — № 20. -P. 6851-6859.

65. Sheldon R.A., Arends I.W.C.E., ten Brink G.-J., Dijksman A. Green,

66. Catalytic Oxidations of Alcohols. II Acc. Chem. Res. 2002. - Vol. 35. - P. 774-781.

67. Bragd P.L., van Bekkum H., Besemer A.C. TEMPO-mediated oxidation of polysaccharides: survey of methods and applications. // Top. Cat. 2004. -Vol. 27.-№ 1-4.-P. 49-66.

68. Heeres A., van Doren H.A., Gotlieb K.F., Bleeker I.P. Synthesis of a- and p-D-glucopyranuronate 1-fluoride: intermediates in the synthesis of D-glucuronic acid from starch. // Carbohydr. Res. 1997. - Vol. 299. - P. 221227.

69. Thomaides J.S., Cimecioglu A.L., Harkins D.E., Luczak K.A. Use of amide or imide co-catalysts for nitroxide mediated oxidation. // Пат. US 6540876. 2000.

70. Stevens C.V., Meriggi A., Booten K. Chemical Modification of Inulin, a Valuable Renewable Resource, and Its Industrial Applications. // Macromolecules — 2001. Vol. 1. - № 1.-P. 1-16.

71. Kato Y., Matsao R., Isogai A. Oxidation process of water-soluble starch in TEMPO-mediated system. // Carbohydr. Polym. 2003. - Vol. 51. - № 1 .P. 69-75.

72. Chang P.S., Robyt J.F. Oxidation of primary alcohol groups of naturally occurring polysaccharides with 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidine oxoammonium ion. II J. Carbohydr. Chem. — 1996. Vol. 15. - P. 819-830.

73. Isogai A., Kato Y. Preparation of polyuronic acid from cellulose by TEMPO-mediated oxidation. // Cellulose 1998. - Vol. 5. - P. 153-164.

74. Bordenave N., Grelier S., Coma V. Advances on selective C-6 oxidation of chitosan by TEMPO. // Biomacromolecules 2008,- Vol. 9. - № 9. - P. 2377-2382.

75. Муринов К.Ю. Окислительная деструкция хитозана под действием гипохлорита и хлорита натрия, пероксида водорода: Дис. канд. хим. наук. Уфа, 2002. - 128 с.

76. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli С., Cosani A., Terbojevich М. 6-Oxychitins, novel hyaluronan-like regiospecifically carboxylated chitins. // Carbohydr. Polym. 1999. - Vol. 39. - № 4.- P. 361-367.

77. Isogai A. Chitin Nanocrystals Prepared by TEMPO-Mediated Oxidation of a-Chitin. // Biomacromolecules 2008 - Vol. 9 - № 1. - P. 192-198.

78. Yoo S.H., Lee J.S., Park S.Y., Kim Y.S, Chang P.S., Lee H.G. Effects of selective oxidation of chitosan on physical and biological properties. // Int. J. Biol. Macromol. 2005. - Vol. 35. - № 1-2. - P. 27-31.

79. Tahiri C., Vignon M. TEMPO-oxidation of cellulose: Synthesis and characterization of polyglucuronans. // Cellulose 2000. - Vol. 7. - P. 177188.

80. Saito Т., Isogai A. TEMPO-Mediated Oxidation of Native Cellulose. The Effect of Oxidation Conditions on Chemical and Crystal Structures of the Water-Insoluble Fractions. // Biomacromolecules — 2004. — Vol. 5. — № 5. — P. 1983-1989.

81. Besemer A.C., Bragd P., Gunnars S., Jaschinski T. Oxidized polymeric carbohydrates and products made thereof. // Пат. US 6635755. 2003.

82. Saito Т., Kimura S., Nishiyama Y., Isogai A. Cellulose Nanofibers Prepared by TEMPO-Mediated Oxidation of Native Cellulose. // Biomacromolecules -2007.-Vol. 8. -№ 8.-P. 2485-2491.

83. Davis W.E., Barry A. J., Peterson F.C. King A.J. X-Ray Studies of Reactions of Cellulose in Non-Aqueous Systems. II. Interaction of Cellulose and Primary Amines. // J. Am. Chem. Soc. 1943. - Vol. 65. - № 7. - P. 12941299.

84. Da Silva Perez D., Montanari S., Vignon M.R. TEMPO-mediated Oxidation of Cellulose III. // Biomacromolecules 2003. - Vol. 4. - № 5. - P. 14171425.

85. Van Brussel D.L., Besemer A.C. High molecular weight oxidised cellulose. //Пат. ЕР 1215217. 2000.

86. Gomez-Bujedo S., Fleury E., Vignon M.R. Preparation of Cellouronic Acids and Partially Acetylated Cellouronic Acids by TEMPO/NaCIO Oxidation of Water-Soluble Cellulose Acetate. // Biomacromolecules — 2004. Vol. 5. — №2.-P. 565-571.

87. Kato Y., Habu N., Yamaguchi J., Kobayashi Y., Shibata I., Isogai A., Samejima M. Biodegradation of p-1,4-linked polyglucuronic acid (cellouronic acid). // Cellulose 2002. - Vol. 9. - P. 75-81.

88. Shibata I., Isogai A. Depolymerization of cellouronic acid during TEMPO-mediated oxidation. // Cellulose 2003. - Vol. 10.-P. 151-158.

89. Shibata I., Isogai A. Nitroxide-mediated oxidation of cellulose using

90. TEMPO derivatives: HPSEC and NMR analyses of the oxidized products. // Cellulose 2003. — Vol. 10.-P. 335-341.

91. Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo M. Study on TEMPO-mediated selective oxidation of hyaluronan and effects of salts on the reaction kinetics. // Carbohydr. Res. 2000. - Vol. 327. - P. 455-461.

92. Crescenzi V., Francescangeli A., Renier D., Bellini D. New Hyaluronan Chemical Derivatives. Regioselectively C(6) Oxidized Products. // Macromolecules. 2000. - Vol. 34. - P. 6367-6372.

93. Francescangeli A. Biological activity of C6-oxidized hyaluronic acid: antibacterial properties of the Zn(II) salt. // J. Bioactive and Compatible Polymers 2003. - Vol. 18. - № 3. - P. 229-235.

94. Hawkins C.L., Davies M.J. Degradation of hyaluronic acid, poly- and monosaccharides, and model compounds by hypochlorite: evidence for radical intermediates and fragmentation. // Free Rad. Biol. & Med. 1998. -Vol. 24. -№ 9. - P. 1396-1410.

95. Rees M.D., Hawkins C.L., Davies M.J. Hypochlorite and superoxide radicals can act synergistically to induce fragmentation of hyaluronan and chondroitin sulphates. // Biochem. J. 2004. - Vol. 381. - P. 175-184.

96. Rees M.D., Pattison D.I., Davies M.J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. // Biochem. J. 2005. - Vol. 391. - P. 125-134.

97. Rees M.D., McNiven T.N., Davies M.J. Degradation of extracellular matrix and its components by hypobromous acid. // Biochem. J. — 2007. -Vol. 401.-P. 587-596.

98. De Nooy A.E.J., Rori V., Masci G., Dentini M., Crescenzi V. Synthesis and preliminary characterization of charged derivatives and hydrogels from scleroglucan. // Carbohydr. Res. 2000. - Vol. 324. - P. 116-126.

99. Fraschini С., Vignon M.R. Selective oxidation of primary alcohol groups of P-cyclodextrin mediated by 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-l-oxyl radical. // Carbohydr. Res. 2000. - Vol. 328. - P. 585-589.

100. Crescenzi V., Hartmann M., de Nooy A.E.J., Rori V., Masci G., Skjak-Brask G. Epimerization of Nonnatural Uronans with Mannuronan C-5-Epimerases To Obtain Alginatelike Polysaccharides. // Biomacromolecules 2000. - Vol. l.-P. 360-364.

101. Huang L., Teumelsan N., Huang X. A Facile Method for Oxidation of Primary Alcohols to Caboxylic Acids and its Application in Glycosaminoglycan Synthesis. // Chem. Eur. J. — 2006. Vol. 12. — № 20. — P. 5246-5252.

102. Bragd P.L., Besemer A.C., van Bekkum H. TEMPO-derivatives as catalysts in the oxidation of primary alcohol groups in carbohydrates. // J. Mol. Catal. 2001. - Vol. 170. - P. 35-42.

103. Lemoine S., Thomazeau C., Joannard D., Trombotto S., Descotes G., Bouchu A., Queneau Y. Sucrose tricarboxylate by sonocatalysed TEMPO-mediated oxidation. // Carbohydr. Res. 2000. - Vol. 326. - P. 176-184.

104. Bragd P.L., Besemer A.C., van Bekkum H. Bromide-free TEMPO-mediated oxidation of primary alcohol groups in starch and methyl a-D-glucopyranoside. // Carbohydr. Res. 2000. - Vol. 328. - P. 355-363.

105. Besemer A.C., Jetten J.M., Jaschinski T. van Den D.R.T.M. Process for producing nitrosonium ions. // Пат. US 6875861. 2000.

106. Komen J.L., Weerawarna S.A., Jewell R.A. Hypochlorite free method for preparation of stable carboxylated carbohydrate products. // Пат. US 7109325.2006.

107. Понеделькина И.Ю., Одиноков B.H., Вахрушева E.C., Голикова М.Т., Халилов JI.M., Джемилев У.М. Модификация гиалуроновой кислоты ароматическими аминокислотами. // Биоорг. химия. — 2005. -Т. 31.-№ 1.-С. 90-95

108. Pouyani Т., Prestwich G.D. Functionalized derivatives of hyaluronic acid oligosaccharides: Drug carriers and novel biomaterials. // Bioconj. Chem. —1994.-Vol. 5.-№4.-P. 339-347.f

109. Rider C.C. The potential for heparin and its derivatives in the therapy and prevention of HIV-1 infection. // Glycoconj. J. — 1997. — V. 14. — № 5. -P. 639-642.

110. Clayette P., Moczar E., Mabondzo A., Martin M., Toutain В., Marce D., Dormont D. Inhibition of human immunodeficiency virus infection by heparin derivatives. II AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. -V. 12. -№ 1. -P. 63-69.

111. Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acids. // J. Biol. Chem. 1947.-V. 167.-P. 189-198.

112. Delpech В., Bertrand P., Chauzy C. An indirect enzymoimmunological assay for hyaluronidase. // J. Immunol. Methods. -1987.-V. 104.-P. 223-229.

113. Markovic-Housley Z, Schirmer T. Structural evidence for substratej assisted catalytic mechanism of bee venom hyaluronidase, a major allergen of bee venom. In: Carbohydrate Bioengineering: Interdisciplinary

114. Approaches. Cambridge, UK: The Royal Society, 2002. Editors: Teeri T.T., Svensson В., Gilbert H.J., Feizi T.

115. Лукина E.C. Конъюгация гликозаминогликанов с аминами и карбоновыми кислотами: Дис. канд. хим. наук. — Уфа, 2007. — 110 с.

116. Ibert М., Marsais F., Merbouh N., Bruckner С. Determination of the side-products formed during the nitroxide-mediated bleach oxidation of glucose to glucaric acid. // Carbohydr. Res. 2002. - Vol. 337. - P. 10591063.

117. Bossennec V., Petitou M., Perly B. 'H-n.m.r. investigation of naturally occurring and chemically oversulohated dermatan sulphates. // Biochem. J. — 1990.-V. 267-P. 625-630.

118. Сорокин А.Б., Хенкин A.M., Шилов A.E. Влияние основания на окисление алканов гипохлоритом натрия при катализе тетрамезитилпорфирином Fe (III): ускорение и изменение селективности реакции. // Кинетика и катализ — 1992. — Т. 33 — Р. 524530.

119. Никольский Б.П., Крунчак В.Г., Львова Т.В., Пальчевский В.В., Сосновский Р.И. Спектрофотометрическое исследование устойчивости растворов гипохлорита и хлорноватистой кислоты. II ДАН СССР -1970.-Т. 191.-№6.-С. 140-142.

120. Никольский Б.П., Крунчак В.Г., Пальчевский В.В., Сосновский Р.И. Механизм процессов саморазложения растворов гипохлорита и хлорноватистой кислоты. И ДАН СССР- 1971. -Т. 197. -№ 1. -С. 1324-1326.

121. Adam L.C., Gordon G. Hypochlorite ion decomposition: effects of temperature, ionic strength, and chloride ion. // Inorg. Chem. 1999. - V. 38 -№ 6. - P. 1299-1304.

122. Slaughter L.M., Collman J.P., Eberspacher T.A., Brauman J.I. Radical autoxidation and autogenous O2 evolution in manganese-porphyrin catalyzed alkane oxidations with chlorite. // Inorg. Chem. — 2004. — V. 43 — № 17.-P. 5198-5204.

123. Никитин И.В. Химия кислородных соединений галогенов. — М.:Наука,- 1986.- 104 с.

124. Alfassi Z.B., Huie R.E., Mosseri S., Neta P. Kinetics of one-electron oxidation by the CIO radical. // Radiat. Phys. Chem. 1988. - V. 43 - № 1. -P. 85-88.

125. Beckwith A.L.J., Bowry V.W., Ingold K.U. Kinetics of nitroxide radical trapping. 1. Solvent Effects. // J. Am. Chem. Soc. — 1992. — V. 114 — P. 4983-4992.

126. Галимов Д.И. Фуллерены Сбо и С70 высокоэффективные тушители электронно-возбужденных состояний соединений разной химической природы: Дис. канд. физ.-мат. наук. - Уфа, 2007. — 86 с.

127. Васильев Р.Ф. Хемилюминесценция в растворах. // Оптика и Спектроскоп. 1965. - Т. 18. -№. 2. - С. 236-245.

128. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. — М.: Высшая школа. 1980. - С. 204.

129. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии. Пер. с англ. М: Мир. - 1981 (White A., Handler Ph., Smith Е., Hill R. Principles of biochemistry. McGraw-Hill, Inc., 1978).

130. Whittaker R.G., Bender V.J., Reilly W.G., Moghaddam M. Therapeutic compound-fatty acid conjugates. Pat. US 5952499. 1999.

131. Paleos C.M. Ready reduction of some nitroxide free radicals with ascorbic acid. II J. C. S. Chem. Comm. 1977. - V. 7 - P. 345-346.