Конъюгаты полиуроновых кислот с ароматическими аминами и 4-аминоантипирином тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

Арасланова Диляра Ильдусовна

Конъюгаты иолиуроновых кислот с ароматическими аминами и 4-аминоантипирином

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 АВГ 2014

Уфа - 2014

005551837

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте нефтехимии и катализа Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент

Понеделькина Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, доцент

Кондратенко Римма Минибаевна ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ (г. Уфа)

кандидат химических наук Салихов Шамиль Мубаракович научный сотрудник ФГБУН Институт органической химии УНЦ РАН (г. Уфа)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Защита диссертации состоится 16 сентября 2014 г. в «1400» часов на заседании диссертационного совета Д 002.062.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук по адресу: 450075, Уфа, проспект Октября, 141. Тел./факс: (347)2842750, e-mail: ink@anrb.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института нефтехимии и катализа Российской академии наук. Автореферат размещен на сайтах ИНК РАН и ВАК Министерства образования и науки РФ.

Автореферат разослан « / » августа 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук, профессор

Шарипов Г.Л.

Общая характеристика работы Актуальность темы. Полисахариды растительного происхождения — полиуроновые кислоты имеют большое значение в питании, медицине и других областях человеческой деятельности. Альгановая (из бурых водорослей) и пектовая (из фруктов и овощей) кислоты являются природными полисахаридами, обладают противовоспалительными, противоязвенными, антиканцерогенными, антиметастатическими свойствами, применяются для выведения тяжелых металлов из организма. Кислотным гидролизом альгиновой кислоты получают поли-а-(1-И)-Ь-гулуроновую и поли-/М 1 ->4)-и-маннуроновую кислоты, щелочной деэтерификацией пектина - поли-а-(1->4)-Б-галактуроновую, региоселективным С(6)-окислением крахмала и целлюлозы - поли-а-(1—»4)-0- и поли-/3-(1 —>4)-0-глюкуроновые кислоты. Природные и полусинтетические полиуроновые кислоты применяются в качестве полисахаридных носителей для биоактивных молекул. Несомненный интерес для медицины представляют конъюгаты полиуроновых кислот с фармакологически значимыми аминами. Их рассматривают как лекарственные препараты нового поколения с пролонгированным терапевтическим эффектом направленного действия. В этой связи синтез новых конъюгатов полиуроновых кислот с фармакозначимыми аминами, изучение их структуры и свойств представляется актуальной задачей.

Работа выполнена в соответсттош с планом НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института нефтехимии и катализа Российской академии наук по теме: «Направленные трансформации природных и синтепгческих токоферолов, тритерпеноидов, экдистероидов и полисахаридов» № Гос. регистрации 01201168019.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлся синтез новых конъюгатов альгиновой, поли-а-(1—>4)-Ь-гулуроновой, поли-уЗ-(1->4)-0-маннуроновой, поли-а-(1^4)-Б-галактуроновой и поли-а-(1->4)-В-глюкуроновой кислот с фармакозначимыми аминами, установление их структуры и биологической активности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• получить полигулуроновую и полиманнуроновую кислоты кислотным гидролизом альгиновой кислоты, полиглюкуроновую кислоту - С(6)-окислением водорастворимого картофельного крахмала реагентом №ОС1-№Вг-2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1 -оксил (ТЕМРО-окисление);

• синтезирован, конъюгаты полиуроновых кислот с аминами;

• исследовать структуру конъюгатов методами одно- ('Н, ПС) и двумерной ('Н-'Н COSY, 'Н-,3С HSQC) ЯМР спектроскопии;

• выявить биомедощинские свойства конъюгатов.

Научная новизна. Новые конъюгаты альгиновой, поли-а-(1->4)-Ь-гулуроновой, поли-у5-(1-^4)-0-маннуроновой, поли-а-(1-»4)-В-галактуроновой и поли-а-(1-Я)-Б-глюкуроновой кислот с фармакозначимыми ароматическими аминами (о-аминофенол, и-аминофенол, 4-аминосалициловая, 5-аминосалициловая кислоты, n-аминобензойная, о-аминобензойная кислоты) и 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразол-5-оном (4-аминоантипирин) синтезированы под действием 1-этил-З-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) и охарактеризованы содержанием амидных звеньев. Показано, что конъюгаты полиглюкуроновой кислоты с аминами содержат изоуреидные звенья, образование которых удается избежать или существенно снизить путем проведения конъюгации в присутствии КДИ и N-гидроксибензотриазола (HOBt).

Нерегулярное распределение модифицированных (В) и ^модифицированных (А) звеньев в конъюгатах полиуроновых кислот, проявляющееся в расщеплении сигналов их пиранозного цикла в 'Н, 13С ЯМР спектрах, впервые предложено характеризовать последовательностью триад звеньев с центром A (AAA, ААВ, BAA, ВАВ) и В (ВВВ, ABA, ABB, ВВА).

При исследовании ТЕМРО-окисления водорастворимого крахмала гипохлоритом натрия установлено, что в отсутствие бромида натрия как со-катализатора образуются только продукты частичного окисления крахмала, тогда как полигулуроновую кислоту в этих условиях получить не удается. В продуктах окисления крахмала впервые идентифицированы альдегид-гидратные группы. С помощью спектров ЯМР структура частично окисленного крахмала, не содержащего звеньев С, охарактеризована содержанием триад: ВВВ (54% мольн.), ABA (20%), ААВ+ВАА (12%) и ВАВ (14%).

Практическая значимость. Выявлены анальгезирующая активность коныогата альгиновой кислоты с 4-аминоантипирином и антирадикальные свойства конъюгатов полигулуроновой, полиманнуроновой и полигалактуроновой кислот с аминофенолами.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на Международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2009), XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Москва, 2011), XIV Молодежной конференции по

органической химии (Екатеринбург, 2011), Всероссийской молодежной конференции «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Уфа, 2012), Всероссийской научной конференции «Теоретические и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификации и переработки полимеров» (Уфа, 2013) и VI Международной школе-конференцнн студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложение в естествознании» (Уфа, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи и тезисы семи докладов на конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает введение, литературный обзор на тему «Химическая модификация растительных полиуронидов», обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, приложение и список литературы из 133 ссылок. Работа изложена на 104 страницах и содержит 12 таблиц и 9 рисунков.

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией органического синтеза ИНК РАН доктору химических наук, профессору Виктору Николаевичу Одинокову за научные консультации, внимание и помощь, оказанные на всех этапах выполнения работы.

Автор выражает благодарность заведующему лабораторией структурной химии ИНК РАН доктору химических наук, профессору Халилову Леонарду Мухибовичу за неоценимую помощь при идентификации полученных соединений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В работе использовали альгиновуго кислоту (1), выделенную из бурых водорослей Laminaría digitata. Кислотным гидролизом альгиновой кислоты получали поли-а-(1—>4)-Ь-гулуроновую (2) и поли-уЗ-(1->4)-Б-маннуроновую (3) кислоты; последняя содержала -10% кислоты 2. Поли-а-(1-»4)-0-глюкуроновую кислоту (6) получали С(6)-окислением водорастворимого крахмала 5 (ГОСТ 1016376) реагентом МаОС1-ЫаВг-2,2,6,6-тетраметилпш1сридишш-1-оксил (ТЕМРО) в водной среде (рН 10.2). Поли-а-(1->4)-0-галактуроноая кислота (4) (из цитрусового пектина), ТЕМРО, NaOCl, КДИ, п-аминофенол, 4- и 5-аминосалнциловые кислоты - фирмы Acrus, остальные реактивы - о-аминофенол, п- и о-аминобензойные кислоты и 4-аминоантипирин - марки ч.д.а.

Спектры ЯМР полиуроновых кислот и их конъюгатов регистрировали на спектрометре Bniker AVANCE 400 (рабочая частота для ЯМР 'Н 400.13 МГц, для ЯМР 13С 100.62 МГц) для растворов в D20, внутренний стандарт - ацетон.

1. Конъюгаты альгиновой, полигулуроиовой и полиманнуроновой кислот

Альгинаты представляют собой нерегулярные полисахариды, состоящие из остатков О-маннуровой и Ь-гулуроновой кислот, соединенных между собой р- и а-гликозидными связями, соответственно.

Реакцией альгиновой кислоты 1 с фармакологически значимыми ароматическими аминами [и-аминофенолом (а), о-аминофенолом (Ь), 4-аминосалициловой (с), 5-аминосалициловой (с!), и-аминобензойной (е), о-аминобензойной кислотами (1)] в водной среде, рН 4.75 под действием водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида

(Ме2Н(СН2)з^С=МЕ1, КДИ) получены соответствующие конъюгаты 1а-1Г (схема 1). Однако их анализ на содержание и распределение в полисахаридной цепи модифицированных звеньев был затруднен вследствие нерегулярности структуры альгиновой кислоты, а также низкой растворимости конъюгатов и высокой вязкости их водных растворов.

чл^ ИППГ

полк-Ь-гулуроновач кислота

|С4-гонфРГмаДи*

на ^ ноос А ,7

)ЛК-Г)-киНН>рОНО коя •С^конформация, п-20

1 + Аг^

АгНЫОС

г + АгКН,

ЧП Агшос: А и

За-ЗГ °Н

Ззено А Чвено 8

Кислотным гидролизом кислоты 1 были получены низкомолекулярные (п -20) поли-а-( 1 —>4)-Ь-гулуроновая (2) и поли-р-(1->4)-0-маннуроновая (3) кислоты. Взаимодействием кислот 2 и 3 с эквимолярным количеством соответствующего амина а-Г в присутствии КДИ синтезированы их конъюгаты

2a-2f и 3a-3f (схема 1). Спектральные характеристики кислоты 2 и ее конъюгатов 2a-2f приведены в табл. L, кислоты 3 и ее конъюгатов 3a-3f- в табл. 2.

В спектрах ]Н ЯМР конъюгатов 2а и За с w-аминофенолом в области ароматических протонов присутствовало всего два сигнала, тогда как в спектрах конъюгатов с несимметрично замещенными ароматическими аминами наблюдалась более сложная картина (табл. 1, 2). Вместе с тем, в спектрах

конъюгатов кислот 2 и 3 с п-аминобензойной кислотой в области ароматических протонов 5 7.57-7.93 м.д. (для 2е) и 7.75-7.88 м.д. (для Зе) вместо ожидаемых двух сигналов симметрично расположенных

ароматических протонов (Н-2', Н-6') и (Н-3', Н-5') наблюдалось несколько сигналов различной интенсивности, что обусловлено, по-видимому, присутствием продуктов самоконденсации остатков и-аминобензонной кислоты - л-карбокси(олигофениламидо)фениламид-ных групп (рис. 1).

В 'Н ЯМР, 'Н-13С HSQC спектрах конъюгатов 2a-2f и 3a-3f наблюдалось расщепление сигналов протона Н-4. Сигналы в сильном поле были близки к сигналу исходной кислоты и отвечали звену А, тогда как сигналы в модифицированных звеньях В находились в более слабом поле (табл. 1,2). Содержание модифицированных звеньев В находили из ЯМР спектров по формуле В=/в//А+/в (/а и /в - интенсивность сигналов протонов, отнесенных к звеньям А и В). Для конъюгатов 2a-2f использовали интенсивность сигнала аномерного протона Н-1 в 'Н ЯМР спектрах, а для конъюгатов 3a-3f - интегральную интенсивность протонов в кросс-пиках Н-4/С-4, найденную контурным интегрированием в 'Н-13С HSQC спектрах с помощью стандартной программы TOPSPIN 2.1 «Bruker». Результаты определения содержания звеньев В в конъюгатах 2a-2f и 3a-3f представлены в табл. 1 и 2. Более высокое содержание звеньев В в конъюгатах 2a-2f свидетельствует о большей реакционной способности полигулуроновой кислоты 2 относительно полиманнуроновой кислоты 3.

Я. С , 7.5 : МД. Рис. J. Фрагмент 'Н ЯМР спектра конъюгата 2е с л-аминобензойной кислотой.

Таблица 1. Содержание звеньев В и спектры 'Н ЯМР кислоты 2 и ее конъюгатов

*[2

Кислота 2 и ее Содержание Химические сдвиги, ил.

коиьюгаты звеньев В, % Н-1 11-2 Н-3 Н-4 Н-5 Ндг

1 - 4.97 3.84 3.93 4.05 4.39 -

2а 50 4.97 5.13 3.88 3.98 А: 4.04 В: 4.14 4.19 4.25 4.51 4.70 6.85 (Н-3',Н-5') 7.25 (Н-2', Н-6')

2Ь 44 5.01 5.16 3.90 3.97 А: 4.04 В: 4.17 4.29 4.43 4.70 6.92 (Н-3',Н-5') 7.15 (Н-4') 7.47 (Н-6')

2с 50 5.03 5.21 3.89 3.96 А: 4.04 В: 4.14 4.18 4.24 4.52 4.70 7.02 (Н-5') 7.29 (Н-6') 7.79 (Н-2')

2й 70 5.00 5.13 3.89 3.95 А: 4.04 В: 4.13 4.17 4.26 4.42 4.70 6.86 (Н-6') 7.41 (Н-2') 7.71 (Н-3')

2е Смесь продуктов 5.015.21 3.82-4.70 7.57-7.93

2Г 40 4.97 5.15 3.89 3.95 А: 4.03 В: 4.15 4.39 4.70 7.15 (Н-4') 7.42 (Н-3') 7.79 (Н-5') 8.17 (Н-2')

= 0.045 ммоль/мя, 2:а-Г:КДИ = 1:1:0.75, Н20, рН 4.7-4.8,20-25"С , 1 Ч

блица 2 Содержание звеньев В и спектры *Н ЯМР кислоты 3 и ее конъюга ■ЗГ

Кислота 3 и ее Содержание Химические сдвиги, м.д.

конъюгаты звеньев В, % н-х Н-2 Н-3 Н-4 Н-5 Нлг

3 _ 4.55 3.94 3.67 3.80 3.65 -

За 35 4.35 4.40 3.87 3.55 А: 3.65 В: 3.96 3.80 4.02 6.68 (Н-3', Н-5') 7.28 (Н-2', Н-6')

ЗЬ 20 4.37 4.46 3.90 3.63 А: 3.73 В: 4.00 3.82 4.00 7.67 (Н-3',Н-5') 8.00 (Н-2', Н-6')

3с 36 4.49 4.60 3.87 3.57 А: 3.69 В: 3.97 3.81 4.04 6.97 (Н-5') 7.11 (Н-6') 7.74 (Н-2')

за 45 4.55 4.60 3.86 3.61 А: 3.66 В: 3.95 3.78 4.01 6.82-6.87 (Н-6') 7.23-7.40 (Н-2') 7.68-7.75 (Н-3')

Зе 25 4.72 3.91 3.60 А: 3.70 В: 3.97 3.82 4.04 7.75-7.88

ЗГ 35 4.55 3.87 3.61 А: 3.69 В: 3.96 3.78 4.02 7.27 (Н-»') 7.46 (Н-3') 7.86 (Н-5') 8.17 (Н-2')

*[3] = 0.045 ммоль/мл, 3:а-ГКДИ = 1:1:0.75, Н20, рН 4.7-4.8, 20-25°С , 1 ч

В спектрах конъюгатов 2а-2Г и За-ЗГ наблюдалось расщепление сигналов не только протона Н-4, но и связанного с ним атома углерода С-4. Причиной расщепления сигналов Н-4/С-4 являлось, по-видимому, нерегулярное

распределение в полисахаридной цепи звеньев А и В, которые могут образовать гомогенные (ААА и ВВВ) и негомогенные (альтернантные) триадные последовательности с центром А (ВАА, ААВ и ВАВ) или В (ВВА, ABB и АВА). Распределение триад звеньев в полисахаридной цепи определяет микроструктуру (конформацию) н поведение макромолекул в растворе, их физико-химические и биологические свойства. Типы и содержание триад являются структурной характеристикой нерегулярных полисахаридов. Их можно идентифицировать по сигналам в 'Н и |3С ЯМР спектрах и определить содержание из относительной интенсивности характеристических сигналов центрального звена в триаде. При этом сумма всех триад с центром В (или А) должна соответствовать содержанию звеньев В (или А), а вероятности последовательностей, являющихся зеркальными отражениями одна другой, должны быть равны, т.е. ААВ=ВАА, ВВА=АВВ и АВ=ВАа. Примерами полисахаридов, композиционная гетерогенность которых охарактеризована триадными последовательностями звеньев с помощью метода ЯМР, являются альгиновая кислотаь и пектин0. По отношению к конъгогатам полиуроновых кислот такая характеристика не применялась.

Для демонстрации возможности спектрально характеризовать композиционную неоднородность нами получены конъюгаты кислот 2 и 3 с 4-аминоантипирином (4-ААП) - 2g-2n и 3g-3I с различным содержанием модифицированных звеньев В (схема 2, табл. 3), которые были исследованы методами 1D ('Н и 13С) и 2D ('Н-13С HSQC) ЯМР спектроскопии.

(Гр Схема г

_о

соон JTTn U^ö I У о

-Ü, + °АС' ÄiOoilOoJ-ra

звено А звепо В

1-4, 6 (звено А) 4-ААП lg, 2g-2m, 3g-3k, 4g, 6g

В качестве характериспгчных сигналов в спектрах 'Н и 13С ЯМР были выбраны сигналы Н-4 и С-4 как наиболее чувствительные к изменениям в структуре коныогатов. Каждый сигнал Н-4 звеньев В в спектрах 'Н ЯМР

' Математическое описание структуры сополимеров в терминах переходных вероятностей, отражающих микроструктуру цепи, приведено в книге Н. А. Платэ, А.Д. Литмановлч, О. В. Ноа, Макромолекулярные реакции, М.-.Химия, 1977, 256 с. ь А. И. Усов, Успехи химии, 1999, 68, 1051.

с Н. Grasdalen, О. Е. Bakoy, В. Larsen, Carbohydr. Res., 1988, 184, 183.

находился в более слабом поле относительно соответствующего сигнала звеньев А. Смещение сигналов С-4 звеньев В в спектрах "С ЯМР происходило в сильное поле (табл. 3). В спектрах ШС)С конъюгатов 2g-2m и 3g-3k (табл. 3) кросс-пик Н-4/С-4 расщеплялся на несколько сигналов различной интенсивности. Контурным интегрированием находили интенсивность каждого из сигналов Н-4/С-4 в НБС^С спектре и по формуле В=/в//а+4 рассчитывали содержание звеньев В в 2$>-2т и 3g-3k.

На примере конъюгата 2к (55% звеньев В) продемонстрирована методика определения типа и содержания триад методом ЯМР. В Н5<ЗС спектре конъюгата 2к наблюдалось 7 кросс-пиков Н-4/С-4 (рис. 2).

KüKbiitfíT Лк

-3

Рис. 2. Фрагменты спектров HSQC конъюгатов 2к и Зк в области сигнала Н-4/С-4.

Четыре сигнала Н-4 (8 4.10, 4.17, 4.21 и 4.26 м.д.), коррелирующие с сигналом 5 80.2 м.д. С-4, были отнесены к триадам с центром А. Сигнал Н-4 (8 4.10 м.д.), наиболее близкий к кросс-пику Н-4/С-4 звена А (5 4.05/80.0 м.д.) в спектре интактной кислоты 2 (табл. 3), соответствовал триадам AAA. Следующие сигналы (8 4.17/80.2 и 4.21/80.2) отвечали Н-4/С-4 центрального звена триад ВАА+ААВ. Последний сигнал (8 4.26/80.2 м.д.) отнесен к триадам ВАВ. Подобным образом было сделано отнесение сигналов для триад с центром В: 8 4.25/77.9 м.д. - ABA, 8 4.32/78.1 м.д. - ВВА+АВВ и 8 4.37/78.1 м.д. - ВВВ. Содержание каждой из триад находили из отношения интенсивности каждого сигнала протонов в спектре HSQC к их суммарной интенсивности 1А+1в (100%) (табл. 3). Сумма триад с центром В (49%) удовлетворительно отвечала содержанию звеньев В (55%). О достоверности полученных результатов свидетельствовало равенство вероятностей последовательностей АВ (0.48) и ВА (0.47), рассчитанных по формулам, приведенным в работе".

*Н. А. Плата, А.Д. Литманович, О. В. Ноа, Макромолекулхрпыереакции, М.:Химия, 1977, 256 с.

В НБС^С спектре конъюгата Зк (56% звеньев В) сигнал Н-4/С-4 расщеплялся на 6 сигналов (рис. 2). Их отнесение было выполнено по аналогии с конъюгатом 2к. Однако точность распределения триад в конъюгате Зк была ниже, что обусловлено, по-видимому, примесью (-10%) конъюгата 2к.

Для остальных образцов конъюгатов типы триад и их содержание были рассчитаны аналогично образцу 2к и приведены в таблице 3.

Таблица 3. Спектры 'Н и ПС ЯМР кислот 2 и 3 и их конъюгатов 2g-2n\ 3§-ЗГ, содержание звеньев В в конъюгатах (в расчете на 100 сахаридных звеньев)_

Кислота 2 и ее конъюгаты ' Время реакции, сек В, % бн-^см, М.Д. Триады (%) Кислота 3 и ее конъюгаты Время реакции,сек В, % 5Н-4;5С-4, М.д. Триады (%)

2 0 0 4.05 / 80.0 ААА (100) 3 0 0 3.80/78.0 ААА (100)

Ч 20 6 4.07 / 80.2 4.22/79.6 4.31/78.0 ААА (80) ААВ+ВАА (14) АВА (6) 40 14 3.88/77.9 3.94/78.0 4.0/77.8 4.09/74.1 4.14/74.0 ААА (70) ААВ+ВАА (11) ВАВ (5) АВА (5) ВВА+АВВ (9)

2Ь 40 15 4.10/80.0 4.24/80.1 4.25/77.8 4.30/77.7 ААА (71) ВАВ (13) АВА (6) ВВА+АВВ (10) зь 80 22 3.87 / 77.9 3.96/77.8 4.10/73.8 4.13/73.9 ААА (69) ВАВ (14) АВА (7) ВВА+АВВ (10)

а 60 29 4.07 /80.0 4.20 / 80.0 4.25/77.6 4.30 / 77.7 ААА (66) ВАВ (14) АВА (7) ВВА+АВВ (13) 31 165 35 3.88 /78.0 4.10-4.13 /74.1 ААВ+ВАА (70) АВА (30)

2]" 150 40 4.08/80.2 4.16/79.9 4.26/78.2 4.37 /78.3 ААА (32) ААВ+ВАА (28) ВВА+АВВ (28) ВВВ (12) 31 345 46 3.89/78.0 4.12/74.0 ВАВ (52) АВА (48)

2к 360 55 4.10/80.2 4.17,4.21 /80.2 4.26/80.2 4.25 / 77.9 4.32/78.1 4.37/78.1 ААА (14) ВАА+ААВ (27) ВАВ (10) АВА (12) ВВА+АВВ (24) ВВВ (13) Зк 600 56 3.9-3.94/78.0 4.00/78.0 4.09/74.2 4.14/74.0 4.20/74.3 ААВ+ВАА (35) ВАВ (8) АВА (11) ВВА+АВВ (41) ВВВ (5)

21 600 60 4.10/80.1 4.17/80.0 4.25 / 80.2 4.25/78.0 4.32/77.9 4.37/78.0 ААА (8) ВАА+ААВ (22) ВАВ (15) АВА (13) ВВА+АВВ (26) ВВВ (16) 31 1200 100 4.09/74.0 ВВВ (100)

1т 900 80 4.24 / 80.0 4.26/78.3 4.35/78.0 ВАВ (13) ВВА+АВВ (23) ВВВ (64)

2п 1200 100 4.27/78.3 ВВВ (100)

*[2,3] = 0.045 ммоль/мл, 2,3:4-ААП:КДИ = 1:1.5:1.5, Н20, рН 4.7-4.8, 20-25°С , 1ч (для 2g-2m, Зg-Зк); 2,3:4-ААП:КДИ = 1:4:2, Н;0, рН 4.7-4.8, 20-25°С , 1ч (для 2п, 31)

Для описания микроструктуры

зе 40 so so мо

£одержаяие иаджфжЕмроаайимя заеиье»В»И

Рис. 3. Экспериментальные вероятности (♦, А) частоты встречаемости А-центрирова1шых триад в конъюгатах 2g-2n и рассчитанные по Бернулли (линии 1,2,3).

Для триад AAA: ♦ ,/; для триад ААВ+ВАА: 2; для триад ВАВ. А, 3.

композиционно неоднородных полисахаридов можно применить статистическую модель Бернулли. Для образцов 2g-2n были построены зависимости

экспериментальной вероятности (Р) встречаемости триад с центром А, а по Бернулли рассчитаны их вероятности для

экспериментально найденного содержания звеньев В. Как видно, найденные экспериментально вероятности встречаемости

А-центрированных триад

удовлетворительно совпали с рассчитанными по Бернулли (рис. 3), что свидетельствовало о случайном распределении звеньев в частично модифицированных конъюгатах 2g-2n.

Таким образом, конъюгаты полигулуроновой и полиманнуроновой кислот с 4-ААП впервые с помощью спектров НЯрС охарактеризованы распределением триадных последовательностей звеньев в полисахаридной цепи (табл. 3). Из таблицы 3 также видно, что при одной и той же продолжительности реакции содержание звеньев В в соответствующих конъюгатах было практически одинаковым, что свидетельствует о близкой реакционной способности полигулуроновой 2 и полиманнуроновой 3 кислот в реакции с 4-ААП (в отличие от ароматических аминов).

2. Конъюгаты полигалактуроновой кислоты

В последнее время проявился интерес к полигалактуроновой кислоте как

биомедицинскому материалу. В литературе сообщалось о синтезе ее

кватернизированных и сульфонированных производных, а также кросс-сшитых с

низкомолекулярной гиалуроновой кислотой гибридных полисахаридов,

перспективных для контролируемой доставки лекарств" и профилактики спаечных

«ь

процессов после хирургических операции .

' I. Simkovic, R. Mendichi, I. Uhliankova, Carbohydr. Polym., 2008,74, 611.

ь H.-H. Peng, J.-W. Chen, T.-P. Yang, C.-F. Kuo, Y.-J. Wang, M.-W. Lee, J. Bioact. Compat. Pol., 2011,26,552.

Конъюгацией полигалактуроновой кислоты 4 с ароматическими аминами а-Г нами получены соединения 4а-4{ (схема 3), от которых можно ожидать проявления антиоксидантных, противовоспалительных и анальгезирующих свойств.

Схема 3

1СООН0 1^0

-лгкнЩ!. Н0^Г1 Р

'(соон а.Г2 'Н^о

4 4а-4Г

Аг как в схеме 1

Содержание модифицированных звеньев В в конъюгатах 4а-4Г найдено из отношения интенсивностей приведенных к одному протону сигналов ароматических протонов ариламидных групп в области 5 6.77-8.24 м.д. 'Н ЯМР и одного из протонов пиранозного цикла (Н-2, Н-3 или Н-4) (табл. 4). Отнесение сигналов протонов выполнено с помощью 'Н и 'Н-13С НБС?С спектров.

Таблица 4. Содержание звеньев В и спектры 'Н ЯМР кислоты 4 и ее коныогатов 4а-4^. _

Кислота 4 и ее конъюгаты Содержание звеньев В, % Химические сдвиги, м.д.

Н-1 Н-2 Н-3 Н-4 Н-5 ИДг

4 4.99 3.71 3.92 4.35 4.70 -

4а 41 4.98 5.11 3.72 3.95 4.08 А: 4.36 В: 4.44 4.70 4.98 6.83 (Н-3\ Н-5') 7.22 (Н-2', Н-6')

41) 46" 4.99 5.13 3.70 3.96 4.09 А: 4.35 В: 4.40 4.47 4.52 4.54 4.70 4.99 6.77 (Н-3') 6.84 (Н-5') 7.07 (Н-4') 7.53 (Н-6')

4с 47 5.00 5.10 3.73 3.93 А: 4.32 В: 4.38 4.42 4.49 4.70 5.00 6.93 (Н-2') 7.04 (Н-6') 7.70 (Н-5')

4(1 62" 5.01 3.77 3.99 А: 4.37 В: 4.47 4.70 5.01 6.88 (Н-3') 7.41 (Н-2') 7.71 (Н-6')

4е 40 5.00 5.14 3.71 3.93 А: 4.35 В: 4.39 4.49 4.56 4.70 5.00 7.48-7.86

41 53 5.00 5.15 3.71 3.94 А: 4.35 В: 4.43 4.50 4.54 4.70 5.00 7.20 (Н-4') 7.48 (Н-3') 7.87 (Н-5') 8.24 (Н-2')

4*1'

** Отнесения сигналов выполнены с помощью 'Н-13С Н5<2С спектров

По реакционной способности кислота 4 сопоставима с полигулуроновой

кислотой 2. Растворимость конъюгатов 4а-4Г в воде была хуже, чем конъюгатов

2я-Ии За-ЗГ

Для демонстрации применимости разработанного на конъюгатах кислот 2 и 3 с 4-ААП метода определения структуры конъюгатов в терминах триадных последовательностей нами синтезирован конъюгат (4g) полигалактуроновой кислоты с 4-ААП (75% остатков 4-ААП) (схема 2). По спектру HSQC (рис. 4) найдено содержание звеньев В, установлены типы и содержание триад для конъюгата 4g (табл. 5). Протон Н-4 представлен четырьмя сигналами с 5 4.36, 4.43, 4.49 и 4.55 м.д. (табл. 5, рис. 4). Наиболее интенсивный из них (5 4.55 м.д.) коррелировал с сигналом 5С 75.6 м.д. (спектр HSQC) и принадлежал, очевидно, звеньям В в триадах ВВВ (их содержание 50% мольн.) (табл. 5). Сигнал (5 4.49 м.д.), отвечал звену В в триадах ВВА+АВВ, суммарное содержание которых составило 23%. Сигнал 8 4.33 м.д. для звена А в последовательности AAA совпадал с сигналом Н-4 в спектре кислоты 4 (5 4.35 м.д., табл. 4). Сигнал с 5 4.36 м.д. может быть отнесен к звену А в триадах ААВ+ВАА=16%, а сигнал с 5 4.43 м.д., вероятно, соответствует звеньям А и В в триадах ВАВ и ABA (ВАВ+АВА=11%). Содержание звеньев В определяется суммой всех триад с центром В: В=(ВВА+АВВ)+АВА+ВВВ.

Однако только сумма триад ВВВ и (ВВА+АВВ) (50%+23%=73%) наиболее близка к содержанию звеньев В (75%), найденному по интенсивности сигналов ароматических протонов. Из этого следует, что триады ABA в конъюгате 4g отсутствуют. Таким образом, триады в конъюгате 4g распределены следующим образом: 50% ВВВ, 23% (ВВА+АВВ), 11% ВАВ и 16% (ААВ+ВАА) (табл. 5). Содержание триад с центром А удовлетворительно совпало с рассчитанным по Бернулли (табл. 5), что свидетельствует в пользу случайного распределения звеньев А и В в конъюгате 4g.

Таблица 5. Характеристические сигналы протона Н-4 и атома С-4, содержание и

"t

k+ABB

t-

-и

•76 •78

4.6 44 Í2 4.0 грет

Рис. 4. Фрагмент спектра HSQC конъюгата 4g в области сигнала Н-4/С-4.

8 /8 Н-4 С-4. на Типы триад Содержание триад, % мольн. Вероятности трнад по Бернулли, %

4.36/78.0 ААВ+ВАА 16 14

4.43 / 77.8 ВАВ 11 9

4.49 / 75.6 ВВА+АВВ 23 28

4.55/75.6 ВВВ 50 42

3. ТЕМРО-окисление картофельного крахмала

Селективное окисление полисахаридов гипохлоритом натрия в водной среде под действием нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1-оксила (TEMPO) и бромида натрия является наиболее эффективным методом получения полусинтетических полиуроновых кислот, перспективных для практического применения. Этим методом были окислены как водорастворимые (крахмал, пуллулан, амилодекстрин), так и нерастворимые в воде полисахариды (целлюлоза, хитин).

Окислением реагентом NaOCl/NaBr/TEMPO при 5°С, рН 10 картофельный крахмал 5 превращен в поли-а-О-глюкуроновую кислоту3 6 (схема 4). Для выяснения необходимости применения бромида натрия при получении кислоты 6 нами исследовано окисление крахмала в отсутствие бромида. Установлено, что при различных соотношениях реагентов, 20-40 °С и рН 10.2 образуются только продукты частичного окисления крахмала 7-19, содержащие звенья А, В и С (схема 4).

Схема 4

7-19

Содержание (%) звеньев В в образцах 7-19 после их обработки катионитом Боууех 50 и высушивания было определено кислотно-основным титрованием и рассчитано по формуле (1):

^И ОН ОН хЮО

= ТГГ^--ХАЛ/162 + ЛГ-¿Р- (1)' ГДе " татр ХаОН (М/да

\т "НаОН НМН + К'НаОН

объем №ОН (дм3), пошедший иа титрова1ше образца, т — масса сухого образца (г), 162 молярная масса (г/'моль) глюкозы (звено А); М - молярная масса звена В, равная 176.

При соотношении реагентов 5:№ОС1:ТЕМРО=1:(1.3-2.0):0.01, 20°С и концентрации крахмала 0.027-0.045 моль/л содержание звеньев В составило 7-20% (табл. 6). При увеличении ЫаОС! в три раза содержание звеньев В составило 30% (образец 12). Увеличение времени, температуры реакции до 30-40°С и концентрации реагентов также способствовало увеличению образования звеньев В,

8 А. Е. J. De Nooy, А. С. Besemer, H.van Bekkum, Carbohydr. Res. 1995, 269, 89.

вплоть до 73% (табл. 6). Повышение температуры свыше 40°С и увеличение концентрации реагентов приводило к сильной деструкции крахмала и образованию побочных продуктов, тогда как полиглюкуронат 6 даже в этих условиях не был обнаружен в продуктах реакции.

Таблица 6. Условия окисления и характеристика образцов 7-19 частично-

В 5 £ с Конц. крахмала [моль/л] Молярное соотношение реагентов l:NaOCl:TEMPO t ГС] Зремя [min] В [%], кислотно-основное титрование С [%]* Сумма В+С [%]" В [%], (В 1 cj-C А [%], 100-(В+С)

7 0.027 1 1.8:0.01 20 18 18 21 41 20 61

8 0.037 1 2.0:0.01 20 17 20 11 33 22 69

9 0.045 1 1.3:0.01 20 5 7 5 12 7 88

10 0.045 1 1.3:0.01 20 10 14 23 34 11 63

11 0.045 1 1.8:0.01 20 8 16 37 50 13 47

12 0.045 1 3.0:0.01 20 10 30 13 42 29 57

13 0.027 1 1.8:0.01 30 5 21 24 47 23 55

14 0.027 1 1.8:0.01 30 30 32 20 53 33 48

15 0.037 1 2.0:0.01 30 30 60 16 78 62 24

16 0.045 1 2.2:0.01 30 10 42 22 53 31 34

17 0.125 1 1.9:0.01 30 40 73 7 87 80 20

18 0.125 1 1.9:0.01 40 5 30 9 42 33 61

19 0.125 1 1.9:0.01 40 10 48 7 52 45 45

a) Наддено из интегральной интенсивности сигналов для Н-

b) Найдено из интегральной интенсивности сигналов для Н-

■С(6) протонов при -С(5) протонов при

5.26-5.33 м.д. 4.07-4.17 м.д.

продуктов были

Для всех окисления 7-19 зарегистрированы протонные спектры, некоторые из которых показаны на рис. 5. В качестве модельных выбраны образцы 15 и 17 с наиболее разрешенными спектрами 'Н ЯМР и охарактеризованы с помощью 1D и 2D ЯМР спектроскопии ('Н-'Н COSY, 'Н-'3С HSQC). Их спектральные характеристики, а также спектры крахмала 5 и полиглюкуроната 6 [получен в присутствии бромида (схема 4)], представлены в табл. 7.

Рис. 5. Н ЯМР спектры крахмала 5, полиглюкуроната 6, частично окисленных образцов 8-11,15,17-19.

Таблица 7. Отнесения сигналов в 'Н и 13С ЯМР спектрах крахмала 5,

Соединения

5 .. 6 15 17

ü < Химические сдвиги, м.д.

о Р Я К н С Н С Н С Н С

1 5.40 100.4 5.60 97.6 5.40, 5.45 (А) 5.49, 5.56 (В) 97.7, 98.1 (В) 99.1-99.3 (А) 5.39, 5.45 (А), 5.51,5.60(3) 97.1,97.8 (В) 99.3 (А)

2 3.65 72.2 3.52 72.5 3.63 (А) 3.56(B) 71.7 3.56-3.58 71.7

3 3.96 74.0 3.98 73.7 3.96 73.3 4.00 72.9

4 3.65 77.4 3.69 76.2 3.65-3.70 75-7-76.2 3.65-3.72 76.0 (В), 76.4-76.6 (А)

5 3.84 72.2 4.04 73.0 3.84 (А), 4.04-4.10 (В) 70.3(A), 73.0 (В+С) 3.84 (А), 4.10(B) 70.3 (А), 72.0-72.5 (В)

6 3.80 (Ь) 3.88(a) 61.1 - 176.6 3.78-3.86 (а,Ь, А) 5.28, 5.33 (С) 60.8-61.3 (А) 87.6 (С), 175.6-176.5 (В) 3.78-3.80 (а,Ь, А) 5.26, 5.31 (С) 60.2 (А), 176.1 (В)

В аномерной области (5 5.26-5.60 м.д. ) *Н ЯМР спектров образцов 15 и 17 наблюдался набор сигналов (рис. 5). Два из них (область 5.26-5.33 м.д.) коррелировали с сигналами атомов углерода (5 -87 м.д.) и, следовательно, принадлежали Н-С(6) протонам альдегид-гидратных групп (6,6-дигидроксиметиновых групп, звенья С) (схема 4). Сигналы свободных альдегидных групп в области 5 -200 м.д. в 13С ЯМР спектрах отсутствовали. Дополнительные к аномерным сигналам с 5 5.40 (для крахмала 5) и 5.60 м.д. (для полиглюкуроната 6), сигналы с 5 5.45, 5.49, 5.51, 5.56 м.д. в 'Н ЯМР спектрах образцов 15 и 17 в 'Н-'Н COSY спектрах имели кросс-пики с сигналами в области 5 3.46-3.56 м.д., принадлежащими протонам Н-2, и их следует отнести к протонам Н-1 в каждом из звеньев А, В и С образцов 15 и 17. Ранее сигналы (8 5.45, 5.49, 5.51, 5.56 м.д.) относили к Н-6 протонам альдегид-гидратных или гемиацетальных групп, образующихся в реакции альдегидных групп со спиртовыми группами крахмала3. Однако в спектрах COSY ни один из этих сигналов не коррелировал с Н-5 протонами, что свидетельствовало об отсутствии гемиацетальных групп в 15,17. Таким образом, впервые сделано правильное отнесение аномерных сигналов Н-1 в спектрах частично окисленных продуктов крахмала.

Из отношения интенснвностей сигналов (5 5.26-5.33 м.д.) и сигналов аномерных протонов (Н-1) (5 5.39-5.60 м.д.) в образцах 7-19 найдено содержание альдегид-гидратных звеньев С (табл. 6). Высокое содержание звеньев С наблюдалось в образцах, полученных при низкой концентрации реагентов (0.037-

" Y. Kato, R.Matsuo, A. Isogai. Carbohydr. Polym. 2003, 51, 69.

0.045 моль/л) и непродолжительном времени окисления. При более высокой концентрации реагентов (0.125 моль/л) содержание звеньев С не превысило 7-9%.

Таким образом, в отсутствие бромида достигается только частичное окисление крахмала, и в продуктах окисления наряду с карбоксильными звеньями образуются альдегид-гидратные звенья, присутствие которых снижает вязкость растворов модифицированного крахмала, увеличивает растворимость и прозрачность растворов. Имеются сведения об улучшении пленкообразующих и когезионных свойств такого модифицированного крахмала, что востребовано в текстильной, бумажной и строительной промышленности. Действием аминов на частично окисленный крахмал можно ввести JV-алкиламинные группы, а под действием диаминов получить кросс-сшитые полисахариды.

Для определения в образцах частично окисленного крахмала содержания звеньев В наряду с кислотно-основным титрованием нами был также использован метод ЯМР. Интенсивность уширенного сигнала в области 4.07-4.17 м.д. отвечала суммарному содержанию звеньев В+С, а звенья С определены из интенсивности протонов Н-6 в области 5.26-5.33 м.д. За вычетом из В+С содержания звеньев С получали содержание звеньев В, которое удовлетворительно совпало с результатами кислотно-основного титрования (табл. 6). Содержание неокисленных звеньев А следовало из разности 100-(В+С) (табл. 6).

Для образца 17, содержащего наименьшее количество звеньев С (7%, табл. 6) с использованием метода ЯМР была определена его композиционная

Для определения типа и содержания триад была использована аномерная область 'Н и 13С ЯМР спектров 17. В 'Н ЯМР спектре наблюдалось четыре сигнала для протонов Н-С(1): 5.39, 5.45, 5.51 и 5.60 м.д. (рис. 6) с относительной интенсивностью 12, 14, 20 и 54% соответственно. Наиболее интенсивный сигнал при 5.60 м.д., коррелирующий с 8С 97.1 м.д., совпадал с химсдвигом полиглюкуроната 6 (табл. 7) и был отнесен к звеньям В в гомогенной триаде ВВВ (54%); соседний сигнал (8 5.51 м.д., 6С 97.8

Рис. 6.1- Фрагмент 'Н ЯМР спектра образца 17 в области аномерных протонов; 2 - пики деконволюции.

м.д.) с интенсивностью 20% был также отнесен к звеньям В, поскольку суммарная интенсивность этих двух сигналов (74%) была близка к содержанию звеньев В (73%), найденного кислотно-основным титрованием (табл. 6).

Сигнал с 5 5.51 м.д. был идентифицирован после определения содержания триад с центром А. Триады AAA в образце 17 отсутствовали, поскольку в его спектре 13С ЯМР не обнаружен сигнал при 100.4 м.д. Уширенный сигнал при 5.39 м.д. в 'Н ЯМР спектре с интенсивностью 12% может быть отнесен к ААВ+ВАА триадам. Оставшийся сигнал при 5.45. м.д. с интенсивностью 14% следует отнести к ВАВ триадам (рис. 6). В 13С ЯМР спектре плохо разрешенный сигнал при 99.3 м.д. отвечал всем триадам с центром А. Определив содержание триад с центром А, сигнал при 5.51 м.д. с интенсивностью 20% мы отнесли к триадам ABA, поскольку только при этом условии, как было сказано выше (стр.9), выполнялось равенство вероятностей АВ=ВА.

Таким образом, на 100 сахаридных звеньев образца 17 приходится 54% триад ВВВ, 20% ABA, 12% (ААВ+ВАА) и 14% ВАВ. Его структуру можно представить следующей формулой:

ВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВВ

4. Конъюгаты полиглюкуроновой кислоты

Ранее сообщалось о модификации аминами (бензиламином, н-гексиламином, н-додециламином) поли-/?-(1-»4)-глюкуроновой кислоты, полученной ТЕМРО-окислением целлюлозы, тогда как модификация поли-а-( 1 —>4)-0-глюкуроновой кислоты 6, получаемой ТЕМРО-окислением крахмала, до наших исследований не проводилась.

Взаимодействием кислоты 6 с аминами а-Г под действием КДИ получены

Аг ках в схеме t

Отнесения сигналов конъюгатов 6а-6Т выполнены с помощью Ш и Ю спектров и представлены в табл. 8. Содержание ариламидных звеньев В в

конъюгатах ба-6Г (табл. 8) найдено из соотношения приведенных к одному протону интенсивностей сигналов ароматических протонов в области 5 6.35-7.88 м.д. и сигналов аномерных протонов в области 5 5.12-5.58 м.д. В отличие от конъюгатов кислот 1-4, в конъюгатах 6а-6С наряду с ариламидными наблюдались изоуреидные звенья Б как результат присоединения КДИ по карбоксигруппам 6 (схема 5).

При проведении реакции кислоты 6 с КДИ и НОВ! в отсутствие амина нами обнаружено, что ДГ-гидроксибензотриазол (НОВ!) предотвращает образование О-ацилизомочевин. Это позволило в ряде случаев снизить содержание изоуреидных звеньев О, однако при этом уменьшалось и содержание звеньев В (конъюгат 6с в табл. 8).

Таблица 8. Содержание звеньев В, звеньев Б и спектры !Н ЯМР кислоты 6 и ее конъюгатов 6а-6Г

Кислота 6 и ее конъюгаты Содержали е звеньев В,% Содержани е звеньев % Химические сдвиги, м.д.

П-1 Н-2 н-з Н-4 Н-5 н4г

6 - - 5.59 3.51 3.95 3.67 4.02 -

6а 64 11 5.12-5.56 3.60 3.94 3.70-3.87 4.05-4.56 6.35-6.55 (Н-З, Н-5) 6.78-7.52 (Н-2, Н-6)

£Ь 88 10 5.26-5.55 3.46 3.94 3.60-3.70 4.06-4.36 6.50 (Н-З) 6.63 (Н-5) 6.94 (Н-4) 7.62 (Н-6)

6с 58 40 5.15-5.55 3.53 3.94 3.55-3.85 4.05-4.35 7.07 (Н-2) 7.23 (Н-6) 7.76 (Н-5)

35» 25

6(1 53 8 5.27-5.57 3.54 3.94 3.55-3.78 4.06-4.36 7.17 (Н-З) 7.24 (Н-2) 7.78 (Н-6)

43е 6

53" 10

бе 38е 30 5.25-5.55 3.52 3.94 3.65-3.87 4.05-4.35 7.67 (Н-З, Н-5) 7.87 (Н-2, Н-6)

6Г 46 5 5.35-5.57 3.46 3.95 3.62-3.71 4.06-4.32 7.21 (Н-З) 7.46 (Н-5) 7.65 (Н-4) 7.88 (Н-6)

а. найдено из соотношения приведенных к одному протону интенсивностей сигналов в области 5 2.75 м.д. и сигналов аномерных протонов в области 5 5.12-5.74 м.д.; Ь. конъюгат получен при соотношении 6:с:КДИ:НОВ1 = 1:1:0.75:0.75; с. конъюгат получен при соотношении 6:с1:КДИ:НОВ1 = 1:1:0.75:0.75; (1. конъюгат получен при соотношении 6:с1:КДИ:НОВ1 = 1:1:0.75:0.75, рН=6.0; е. конъюгат получен в присутствии НОРМ (6:е:КДИ:НОГ» = 1:1:0.75:0.75).

В отличие от конъюгатов 6а-6Г с ароматическими аминами конъюгат с 4-ААП (схема 2) не содержал звеньев Б (табл. 8). Характеристический сигнал Н-4/С-4 в спектре Н8(ЗС 6g расщеплялся на шесть сигналов, что свидетельствовало о неоднородности конъюгата 6g (рис. 7). Согласно разработанному на конъюгатах полигулуроновой кислоты 2 спектральному определению структуры

полисахаридной цепи, с помощью НБС^С ЯМР спектров было установлено распределение модифицированных (В) и немодифицированных (А) звеньев в полисахаридной цепи конъюгата 6g в виде триад с центрами А и В (табл. 9).

Таблица 9. Характеристические сигналы конъюгата 6g и характеристика триадных последовательностей в конъюгате 6g

8 15 Н-1 С-4, мл. Тип триад Содержание триад, % мольн. Вероятности триад по Бернуллн,%

3.66/77.7 ААА 7 6

3.70/77.4 ААВ+ВАА 15 19

3.73/76.6 ВАВ 9 14

3.80/76.4 АВА 7 10

3.86/76.0 ВВА+АВВ 20 29

3.90/76.7 ВВВ 43 22

•И) 3 ■> 3.7. :з;.6: (Фт

Рис. 7. Фрагмент ИБОС спектра бе;

Как видно из табл. 9, содержание триад с центром А в коньюгате 6g удовлетворительно совпало с рассчитанным по Бернулли, что свидетельствует об их случайном распределении. Содержание триад с центром В не совпадало с рассчитанным по Бернуллн, возможно, из-за большей погрешности интегрирования сигналов Н-4/С-4, относящихся к звеньям В.

5. Анальгезирующие свойства конъюгата альгиновой кислоты с 4-амп11оантнш1рнном

Известно, что конъюгаты гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата) с 4-ААП обладают анальгезирующими свойствами3. Нами получен конъюгат (lg) альгиновой кислоты с 4-ААП (см. схему 2), содержащий 100% мольн. звеньев В (или 56% масс, остатков 4-ААП).

Острая токсичность конъюгата 1" была исследована на мышах в дозе >5000 мг/кг, введенной порциями внутрижелудочно. Никаких отклонений от нормального состояния животных за время наблюдения обнаружено не было. Эти результаты свидетельствуют, что конъюгат является нетоксичным и оно пригодно для клинического применения.

Конъюгат испытали на анальгезирующую активность в сравнении с анальгином при внутрижелудочиом и внутрибрюшинном способах введения. Исследование проводили на модели "уксусных корчей", вызванных внутрибрюшным введением ~1%-ной уксусной кислоты (1 мл) мышам массой 2025 г. Регистрировали время наступления "уксусных корчей" (сокращения брюшины животных) и подсчитывали их количество в течение 15 минут. Конъюгат в дозе 40

' И. Ю. Понеделькина, Е. С. Лукина, Р. Ш. Суфиярова, В. Н. Одиноков. Химия природа, соед., 2012, 4, 583.

мг/кг массы вводили за 1, 3, 6 и 24 ч до введения мышам уксусной кислоты. В качестве препарата сравнения использовали анальгин в дозе 20 мг/кг.

Таблица 10. Анальгезирующая активность конъюгата 1™

Вещество Время, Количество уксусных корчей в течение 30 минут после введения (Время наступления уксусных корчей, сек) % ннгибирования по отношсккю к контролю

Внутрижелудочное Впутрибргошиппое Внутрижелудочное Внутрибрю-шинное

Контроль 29.314.4 (271.3139.1) 29.3+4.4 (271.3139.1) -

1 11.514.2 (456.7+68.9) 12.3+4.8 (478.3+145.3) 60.8 58.0

Анальгин 3 13.5+1.4 (420.0160.7) 12.8+2.5 (338.3+100.9) 53.9 56.3

б 10.812.3 (313.3153.5) 10.212.1 (401.7172.5) 63.1 65.2

24 13.414.9 (406.0+119.3) - 54.3 -

1 13.212.0 (350.0+55.5) 8.512.8 (396.7+85.7) 54.9 71.0

18 3 9.312.2 (520.0176.2) 9.011.9 (395.01105.2) 68.3 69.3

6 15.514.0 (298.3185.9) 11.211.5 (361.71102.1) 48.1 61.8

24 20.215.9 (418.0133.6) - 31.1 -

Испытания показали, что при внутрибрюшинном введении раствора за 1 и 3 часа до введения животным уксусной кислоты конъюгат оказывал

обезболивающее действие более эффективно, чем анальгин. Ингибирование корчей на 69-71% было эффективней по сравнению с контролем (табл. 10).

Следует отметить, что водный раствор конъюгата 1% стабилен по консистенции и цветности в течение 1 месяца, тогда как водный раствор анальгина желтел через 4-6 ч.

6. Антирадикальная активность конъюгатов полигулуроновой и полигалактуроиовой кислот

Фенольным соединениям свойственна антирадикальная активность, поэтому конъюгаты полигулуроновой, полиманнуроновой и полигалактуроиовой кислот, содержащие гидроксифениламидные группы, были изучены в качестве ловушек радикалов.

Антирадикальную активность измеряли по способности взаимодействовать со стабильным радикалом ДФПГ (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) (схема 6) и характеризовали показателем 1С50 (концентрация вещества, при котором гибнет 50% радикала).

г ' Схема 6

ДФПГ

Таблица 11. Антирадикальная активность конъюгатов

Амин 1С для конъюгатов 50 полигулуроновой к-ты 2, мкмоль звена В/мл (доля от 1С для ионола) 40 ' 1С5о для конъюгатов полимаынуроновой к-ты 3, мкмоль звена В /мл (доля от для ионола) 1С для конъюгатов 50 полигалэктуроновой к-ты 4, мкмоль звена В /мл (доля от 1С для ионола)

а 0.07(1/3) 0.26(1/11) 0.41 (1/17)

Ь 0.32(1/14) не проявлял антирадикальных свойств 0.33 (1/14)

% ингибирования, [С1 = ЗЗОмкг/мл

с 7 19 9

й 17 21 11

4-ЛЛП 4 4 5

1С50 для ионола = 0.023 мкмоль/мл

Наиболее эффективной ловушкой радикалов оказался конъюгат 2а полигулуроновой кислоты с п-аминофенолом, конъюгаты с салициловыми кислотами и 4-аминоантипирином были малоактивными (табл. 11).

Выводы

1. Впервые синтезированы конъюгаты альгиновой, поли-а-(1—>4)-Ь-гулуроновой, поли-/?-(1—>4)-В-маннуроновой, поли-а-(1—>4)-0-галактуроиовой и иоли-а-(1—>4)-0-глюкуроновой кислот с биологически активными ароматическими аминами (о- и и-аминофенолами, 4- и 5-аминосалициловыми, о- и п-ашшобензойными кислотами) и 1-фенил-2,3-диметил-4-ам1шопиразол-5-оном (4-аминоантипирином) в водной среде под действием водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)иропил]карбодиимида.

2. Методами спектроскопии ЯМР 'Н и 'Н-13С ШС)С найдено, что в зависимости от условий реакции содержание модифицированных звеньев в синтезированных конъюгатах составляет от 5 до 100%. Конъюгаты с п-аминобензойной кислотой включают звенья с олигомерными фениламидными группами, а конъюгаты полиглюкуроновой кислоты с ароматическими аминами наряду с ариламидными содержат изоуреидоэфирные звенья, образование которых

обусловлено взаимодействием карбоксильных групп субстрата с карбодиимидом. Их содержание снижается при проведении реакции конъюгации в присутствии N-гидроксибензотриазола.

3. На основании анализа спектров ЯМР *Н и 'Н-13С HSQC установлено, что модифицированные звенья (звенья В) в конъюгатах полиуроновых кислот нерегулярно распределены в полисахаридной цепи. На примере конъюгатов с 4-аминоантипирином впервые показано, что нерегулярность их структуры может быть охарактеризована содержанием триадных последовательностей звеньев из модифицированных (В) и немодифицированных (А) звеньев с центральным звеном В (ВВВ, ABA, ABB, ВВА) и звеном A (AAA, ААВ, BAA, ВАВ).

4. Каталитическим региоселективным Сб-окислением водорастворимого картофельного крахмала реагентом ЫаОС1-2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1-оксил (TEMPO) в водно-щелочной среде в присутствии NaBr как сокатализатора получена поли-а-(1—>4)-0-глюкуроновая кислота. Показано, что в отсутствие бромида продуктом является частично окисленный крахмал, содержащий звенья с непрореагировавшими 6-гидроксиметильными, 6-карбоксильными, 6,6-дигидроксиметиновыми (альдегид-гидратными) группами. Содержание последних возрастает при окислении разбавленных (<0.04 моль/л) растворов крахмала. С помощью двумерных 'Н-13С HSQC и 1Н-'Н COSY ЯМР спектров впервые сделано отнесение сигналов аномерных протонов частично окисленного крахмала.

5. Выявлены анальгезирующая активность конъюгата альгиновой кислоты с 4-аминоантипирином в дозе 40 мг/кг (на модели «уксусных корчей», вызванных у мышей) и антирадикальная активность конъюгатов полигулуроновой, полиманнуроновой и полигалактуроновой кислот с аминофенолами.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Д. И. Арасланова, И. Ю. Понеделькина, Т. В. Тюмкина, В. Н. Одиноков. Конъюгаты полигулуроновой и полиманнуроновой кислот с 4-аминоантипирином: определение с помощью спектров 'Н-13С HSQC триад звеньев и их распределение в полисахаридной цепи. // Химия природных соедин. - 2014. - №2. - С. 197-200.

2. I. Yu. Ponedel'kina, D. I. Araslanova, Т. V. Tyumkina, E. S. Lukina, V. N. Odinokov. Partially Oxidized Potato Starches from Bromide-Free TEMPO-Mediated Reaction: Characterization of Monosaccharide Composition. // Starch. - 2014. - V.66. -№5-6.-P. 444-449.

3. Д. И. Тимофеева*, И. Ю. Понеделькина, Jl. М. Халилов. Карбодиимидная конъюгация полигалактуроновой кислоты с аминами. // Международная конференция «Актуальные проблемы химии природных соединений»,- Ташкент. -2009. С. 242.

4. Д. И. Тимофеева*. Окисление растительных полисахаридов реагентом NaOCl-2,2,6,6-тетраметилпииеридиний-1-оксил (TEMPO). Исследование моносахаридного состава продуктов. //XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. - Москва. - 2011. С. 169.

5. Д. И. Тимофеева , И. Ю. Понеделькина. Конъюгаты полигалактуроновой кислоты с фармакозначимыми аминами. // XIV Молодежная конференция по органической химии. - Екатеринбург. - 2011. С. 228.

6. Е. С. Лукина, Д. И. Тимофеева*, И. Ю. Понеделькина. Исследование продуктов ТЕМРО-окисления крахмала. // XIV Молодежная конференция по органической химии. - Екатеринбург. - 2011. С. 163.

7. Арасланова Д. И., Понеделькина И. Ю. Модифицированные полигалактуронаты: особенности ЯМР спектров, применимые для определения триадных последовательностей звеньев в полисахаридной цепи // Всероссийская молодежная конференция «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений». — Уфа. - 2012. С. 81.

8. Арасланова Д.И., Богданова М.А., Ромадова И.В., Понеделькина И.Ю., Губайдуллин И.М. Конъюгаты полигулуроновой и полиманнуроновой кислот с 4-аминоантипирином: распределение звеньев в полисахаридной цепи // Всероссийская научная конференция «Теоретические и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификации и переработки полимеров». - Уфа. -2013. С. 3.

9. Богданова М.А., Арасланова Д.И., Понеделькина И.Ю., Губайдуллин И.М., Сафин P.P. Определение типа распределения триадных последовательностей звеньев в полисахаридной цепи // VI Международной школе-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложение в естествознании». — Уфа. — 2013. С. 281.

* Тимофеева Д.И. сменила фамилию на Арасланову Д. И.

Лицензия №0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 21.07.2014 г. Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Уч.-изд.л.1,5. Тираж 130 экз. Заказ №116

Типография ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА» 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИИ И КАТАЛИЗА РАН

На правах рукописи

04201460757

Арасланова Диляра Ильдусовна

КОНЪЮГАТЫ ПОЛИУРОНОВЫХ КИСЛОТ С АРОМАТИЧЕСКИМИ АМИНАМИ И 4-АМИНОАНТИПИРИНОМ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

02.00.03 - Органическая химия

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент И.Ю. Понеделькина

Уфа 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список принятых сокращений...................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 5

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. МОДИФИКАЦИЯ ПОЛИУРОНОВЫХ КИСЛОТ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ................................................................ 8

1.1. Альгиновая кислота. Нахождение в природе, строение, свойства и

применение........................................................................................................................................8

1.2. Модифицированная альгиновая кислота................................................................11

1.3. Пектин и полигалактуроновая кислота. Строение, нахождение в природе и применение..............................................................................................................24

Модифицированные пектин и полигалактуроновая кислота........ 27

1.5 Поли-а-( 1 ->4)-Ь-гулуроновая и поли-/?-(1—>4)-0-маннуроновая кислоты. Получение, применение, свойства,

модификация.................................................................... 32

1.6 Поли-а-( 1 -4)-глюкуроновая кислота из картофельного

крахмала......................................................................... 34

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................................37

2.1. Конъюгаты альгиновой, полигулуроновой и полиманнуроновой кислот......................................................................................................................................................38

2.2. Конъюгаты полигалактуроновой кислоты................................................................47

2.3. ТЕМРО-окисление картофельного крахмала......................................................50

2.4. Конъюгаты полиглюкуроновой кислоты................................................................57

2.5. Анальгезирующие свойства конъюгата альгиновой кислоты с 4-аминоантипирином..................................................................................................................60

2.6. Антирадикальная активность конъюгатов полигулуроновой и полигалактуроновой кислот................................................................................................61

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ................................................................63

3.1. Получение полиуроновых кислот..............................................................................63

3.1.1. Выделение альгината натрия из бурых водорослей Laminaria digitata........................................................................................................................................................63

3.1.2. Получение полигулуроновой и полиманнуроновой кислот из альгиновой кислоты..................................................................................................................64

3.1.3. Получение Na соли полигалактуроновой кислоты..........................................64

3.2. Синтез конъюгатов альгиновой, полигулуроновой и полиманнуроновой кислот....................................................................................................65

3.2.1. Конъюгаты с ароматическими аминами..................................................................65

3.2.2. Конъюгат с 4-аминоантипирином....................................................................................66

3.3. Синтез конъюгатов полигалактуроновой кислоты..........................................68

3.3.1. Конъюгаты с ароматическими аминами..................................................................68

3.3.2. Конъюгат с 4-аминоантипирином....................................................................................68

3.4. Окисление водорастворимого картофельного крахмала............................68

3.4.1. Определение содержания звеньев глюкуроновой кислоты в частично окисленном крахмале методом кислотно-основного титрования........................................................................................................................................69

3.5. Поли-а-(1->4)-0-глюкуроновая кислота и ее конъюгаты........................70

3.5.1 Синтез поли-а-(1—>4)-0-глюкуроновой кислоты окислением

крахмала....................................................................................................................................................70

3.5.2. Синтез конъюгатов с ароматическими аминами................................................70

3.5.3. Синтез конъюгата с 4-аминоантипирином............................................................71

3.6. Определение антирадикальной активности конъюгатов полигулуроновой, полиманнуроновой и полигалактуроновой

кислот....................................................................................................................................................71

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................73

ЛИТЕРАТУРА............................................................................................................................75

ПРИЛОЖЕНИЕ..............................................................................................................................88

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК альгиновая кислота

поли-в поли- а-{ 1 —>4)-Ь-гулуроновая кислота

поли-М поли-/?-(1—>4)-0-маннуроновая кислота

поли-Са поли-а-( 1 —>4)-0-галактуроновая кислота

поли-с*-С1 поли-а-( 1 —>4)-В-глюкуроновая кислота

поли-/?-С1 поли-/?-(1 —>4)-В-глюкуроновая кислота

КДИ 1 -этил-3 - [3 -(диметиламино)пропил] карбодиимид

4-ААП 1 -фенил-2,3-диметил-4-аминопиразол-5-он (4-аминоантипирин)

НОВ! 7У-гидроксибензотриазол

ТЕМРО 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил

ДФПГ 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразильный радикал

рве фосфатный буфер

МЕв 2-морфолинэтансульфоновая кислота

NHS Ы-гидроксисукцинимид

М-гидроксисульфосукцинимид

ИВМ искусственный внеклеточный матрикс

NAD+ никотинамидадениндинуклеотид

СБ Р-циклодекстрин

1)МР перйодинан Десс-Мартина

Б1С Н 1Ч-диизопропилкарбдиимид

ГК гиалуроновая кислота

Б1РЕА диизопропилэтиламин

ТВА трет-бутиловый спирт

СНР8 2-хлор-2-гидрокси-1 -пропансульфонат

вТМАС 2,3-глицидилтриметиламмоний хлорид

4-АТР 4-аминотиофенол

ВВЕДЕНИЕ

Полиуроновые кислоты, относящиеся к полисахаридам растительного происхождения, имеют большое значение в питании, медицине и других жизненно важных областях человеческой деятельности. Альгиновая (из бурых водорослей) и пектовая (из фруктов и овощей) кислоты обладают противовоспалительными, противоязвенными, антиканцерогенными,

антиметастатическими свойствами, применяются для выведения тяжелых металлов из организма. Кислотным гидролизом альгиновой кислоты получают поли-сс-(1—>4)-Ь-гулуроновую и поли-/?-( 1 —И)-0-маннуроновую кислоты, щелочной деэтерификацией пектина - поли-а-(1—>4)-В-галактуроновую, селективным С(6)-окислением крахмала и целлюлозы - поли-ог-(1—>4)-0- и поли-1 -^4)-0-глюкуроновые кислоты. Природные и полу синтетические полиуроновые кислоты применяются в качестве полисахаридных носителей для биоактивных молекул. Несомненный интерес для медицины представляют конъюгаты полиуроновых кислот с фармакологически значимыми аминами. Их рассматривают как лекарственные препараты нового поколения с пролонгированным терапевтическим эффектом направленного действия. В этой связи синтез новых конъюгатов полиуроновых кислот с биологически активными аминами, изучение их структуры и свойств представляется актуальной задачей.

Целью исследования являлся синтез новых конъюгатов альгиновой, поли-аг-(1-»4)-Ь-гулуроновой, поли-/?-(1—>4)-0-маннуроновой, поли-аг-(1->4)-0-галактуроновой и поли-«-(1—>4)-0-глюкуроновой кислот с фармакозначимыми аминами, установление их структуры и биологической активности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить полигулуроновую и полиманнуроновую кислоты кислотным гидролизом альгиновой кислоты, полиглюкуроновую кислоту - С(6)-

окислением водорастворимого картофельного крахмала реагентом NaOCl-

МаВг-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил (ТЕМРО-окислением);

- синтезировать конъюгаты полиуроновых кислот с аминами;

- исследовать структуру конъюгатов методами одно- ('Н, 13С) и двумерной

('Н-'Н COSY, ^-"С HSQC) ЯМР спектроскопии;

- выявить биомедицинские свойства конъюгатов.

В результате выполненной работы синтезированы новые конъюгаты альгиновой, поли-0:-(1—>4)-Ь-гулуроновой, поли-/?-(1—>4)-0-маннуроновой, поли-а-(1->4)-0-галактуроновой и поли-а-(1->4)-0-глюкуроновой кислот с фармакозначимыми аминами [оаминофенол, я-аминофенол, 4-аминосалициловая, 5-аминосалициловая кислоты, гс-аминобензойная, о-аминобензойная (антраниловая) кислоты и 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразол-5-он (4-аминоантипирин)] и охарактеризованы содержанием амидных звеньев. Показано, что при карбодиимидной конъюгации под действием 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида полиглюкуроновой кислоты с аминами наряду с амидными образуются изоуреидные звенья — продукты присоединения карбодиимида по карбоксигруппам. Найдено, что избежать образование изоуреидных звеньев удается проведением конъюгации в присутствии N-гидроксибензотриазола.

Нерегулярное распределение немодифицированных (А) и модифицированных (В) звеньев в конъюгатах полиуроновых кислот,

1 13

проявляющееся в расщеплении сигналов пиранозного цикла в Н, С ЯМР спектрах, впервые охарактеризованы триадами звеньев с центром A (AAA, ААВ, BAA, ВАВ) и с центром В (ВВВ, ABA, ABB, ВВА).

При исследовании ТЕМРО-окисления гипохлоритом натрия водорастворимого картофельного крахмала установлено, что в отсутствие бромида натрия как со-катализатора образуются только продукты частичного окисления крахмала, тогда как полиглюкуроновую кислоту в этих условиях получить не удается. В продуктах окисления крахмала впервые идентифицированы альдегид-гидратные группы. С помощью спектров ЯМР

структура одного из образцов частично окисленного крахмала, не содержащего звеньев С, впервые охарактеризована содержанием триад звеньев ВВВ (54% мольн.), ABA (20%), ААВ+ВАА (12%) и ВАВ (14%).

Получены обладающие анальгезирующей активностью конъюгаты альгиновой кислоты с 4-аминоантипирином.

Важные для антиоксидантной защиты организма антирадикальные свойства по отношению к дифенилпикрилгидразильному радикалу проявляли конъюгаты полигулуроновой, полиманнуроновой и полигалактуроновой кислот с аминофенолами.

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией органического синтеза ИНК РАН доктору химических наук, профессору Виктору Николаевичу Одинокову за научные консультации, внимание и помощь, оказанные на всех этапах выполнения работы.

Автор выражает благодарность заведующему лабораторией структурной химии ИНК РАН доктору химических наук, профессору Халилову Леонарду Мухибовичу за неоценимую помощь при идентификации полученных соединений.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. МОДИФИКАЦИЯ ПОЛИУРОНОВЫХ КИСЛОТ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Строению, свойствам, применению и химической модификации полиуроновых кислот растительного происхождения - альгиновой, пектовой, поли-а-( 1 ->4)-Ь-гулуроновой, поли-J3~( 1 ->4)-0-маннуроновой, поли-а-{ 1 —>4)-D-галактуроновой и поли-о:-(1—>4)-0-глюкуроновой кислот посвящен ряд обзоров [1-10]. В данном обзоре обобщаются сведения по химической модификации полиуроновых кислот за последние 20 лет.

1.1. Альгиновая кислота. Нахояадение в природе, строение, свойства и

применение

Альгиновые кислоты (АК) представляют собой линейные сополимеры двух типичных для низших растений (водорослей) уроновых кислот: D-маннуроновой (М) и L-гулуроновой (G), связанных между собой а- и Р~ (1—>4)-гликозидными связями.

В природе АК находится в виде натриевой соли - альгината натрия. АК извлекается из бурой альги (водоросли РкаеоркуШ) путем вымачивания в щелочном растворе с последующим осаждением из экстракта минеральной кислотой или превращением в водонерастворимый альгинат кальция. Обработкой последнего минеральной кислотой получают альгиновую кислоту высокой чистоты.

Химический состав и молекулярная масса альгината зависят от времени сбора, возраста и вида водорослей, используемых в качестве сырья, а также от способов выделения [7]. В процессе биосинтеза АК сначала образуется поли-D-маннуроновая кислота, звенья которой под действием полиманнуронан-С-5-эпимеразы частично трансформируются в звенья поли-Ь-гулуроновой кислоты [11]. Соотношение М- и G-кислот в молекуле АК варьирует, причем имеются участки полисахарида, состоящие только из D-маннуроновой кислоты (блоки поли-М), или участки из остатков L-гулуроновой кислоты (блоки поли-G), или участки с чередующимися остатками M и G. Это обстоятельство влияет на физико-химические свойства альгинатов, вязкость их водных растворов и способность к гелеобразованию, а также на биологическую активность [8]. Обнаружено, что молодые водоросли содержат больше полиманнуровой кислоты, а зрелые - полигулуроновой. Пластичность водорослей зависит от поли-М, а жесткость - от поли-G. Развитию методов исследования и изучению структурных особенностей альгиновой кислоты уделяется большое внимание.

Для изучения структуры АК приобрели большое значение недеструктивные физико-химические методы, например, спектроскопия ЯМР [8]. С помощью методов ЯМР удается определить соотношение мономеров M/G в молекулах АК и охарактеризовать их распределение. Из отношения интенсивностей сигналов аномерных протонов кислот M и G в 'Н ЯМР спектрах АК находят соотношение M/G, которое зависит от источника выделения и изменяется в широких пределах (0.25 - 2.2). Из протонных спектров можно также найти относительное содержание четырех возможных пар мономеров ММ, MG, GM, GG [12]. Еще

1 1 ____1 л ______

большими возможностями обладает метод С ЯМР спектроскопии. Из 1JC ЯМР спектров не только находят соотношение M/G и содержание ММ, MG, GM, GG, но и определяют триадные последовательности звеньев с центром M - МММ, MMG, GMG, GMM и с центром G - GGG, GGM, MGM, MGG [13]. В спектрах ЯМР наблюдается расщепление сигналов аномерных атомов углерода до восьми линий, которые можно отнести к восьми теоретически возможным триадам, а из

относительной интенсивности этих линий рассчитать содержание триад каждого типа[8].

В полисахаридах, состоящих из двух типов звеньев, распределение триад можно описать с помощью статистики Бернулли или Маркова первого и второго порядка [14]. На основании экспериментальных данных установлено, что альгинатная цепь лучше описывается с помощью статистики второго приближения Маркова, а вероятность нахождения определенного типа мономерных остатков (М или С) зависит от вида двух предшествующих мономерных остатков.

Свойства альгината как высокозаряженного полиэлектролита и комплексона, образующего очень вязкие водные растворы даже при умеренных концентрациях, позволяют применять его в качестве загустителя в пищевом производстве, для изготовления фотографических пленок, извлечения различных металлов (в ионизированной форме) из загрязненной воды [15]. Из альгинатов изготавливают натрий-, кальций- и устойчивые к воспламенению кальций-хромовые альгинатные волокна. Альгинаты проявляют аффинность по отношению к различным энзимам, таким как пектиназа, липаза, фосфолипаза амилаза и глюкоамилаза, что используется для очистки этих ферментов методом аффинного осаждения [16]. Альгинат применяется в фармакологии в качестве носителя лекарственных средств, например, для капсулирования инсулина [17], дипиридамола [18] и других субстанций [19]. Структурно сходные с внеклеточным матриксом тканей альгинатные гидрогели, в том числе гибридные (то есть в смеси с другими биополимерами типа хитозана [20]), или наночастицы АК в поли-[2-(диэтиламино)этилметакрилате[21]), используются для заживления ран, доставки вакцин, лекарств и в тканевой инженерии [22, 23].

АК и альгинаты широко применяются в медицине в качестве антацидных средств. Препарат «Топалкан» обладает вспенивающим эффектом, формирует гель на поверхности жидкого содержимого желудка. Покрывая слизистую, препарат начинает действовать быстро (через 6-14 минут) и его действие продолжается 2-4 часа; применяется при эзофагитах и рефлюкс-эзофагитах [24].

На основе АК или ее натрий-кальциевых солей известны фармакопейные препараты «Альгимаф» (в сочетании с сульфаниламидным препаратом «Мафенид») и «Альгипор» (в сочетании с антисептиком фурацилином) -ранозаживляющие средства с резорбтивным и регенерирующим действием [25]. Из альгинатного волокна производятся стерильные повязки для обработки раневых поверхностей с обильным отделением экссудата - «Супрасорб-А» [26] и «Калтостат» [27]. В последнее время появились два новых препарата для лечения болезней желудочно-кишечного тракта: «Гевискон» и «Канальгат». «Гевискон» — антацидное средство, которое влияет на нормальный процесс пищеварения в желудке [28, 29], попадая в желудок, успокаивает раздраженный пищевод после первого глотка, образует эластичный гелевый «барьер», защищая стенки пищевода от агрессивного желудочного содержимого. «Канальгат» применяется для лечения желудочно-кишечных патологий у ликвидаторов аварии на ЧАЭС [9, 30]. На основе альгината производится клей для зубных протезов «Рго1ейх»(Германия) с адгезивными свойствами.

1.2. Модифицированная альгиновая кислота

Реакцией с янтарным ангидридом получают эфир (1) по гидроксильным группам АК (схема 1). Одновременно дополнительно к карбоксигруппам АК (3.9 ммоль/г) вводятся сукцинатные группы (4 ммоль/г). Более гидрофобный по сравнению с эфиром 1 конъюгат (3) АК с пальмитиновой кислотой синтезируют следующим образом: взаимодействием АК с 2-хлорэтиламином в щелочной среде получают содержащее 1.75 ммоль/г �