Кооперативные эффекты при связывании паров водно-органических смесей β-лактоглобулином и поли-N-6-аминогексилакриламидом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

МИРОНОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

КООПЕРАТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРИ СВЯЗЫВАНИИ ПАРОВ ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЕЙ р-ЛАКТОГЛОБУЛИНОМ И ПОЛИ-1Ч-6-АМИНОГЕКСИЛАКРИЛАМИДОМ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань - 2004

Работа выполнена на кафедре физической химии Химического института им. A.M. Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина".

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Горбачук Валерий Виленович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Маленков Георгий Георгиевич

Ведущая организация:

кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник Зуев Юрий Федорович

Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии

наук

Защита состоится "28" октября 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.03 в Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Бутлсровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, КГУ, научная часть.

Автореферат разослан " " сентября 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 212.081.03 кандидат химических наук, доцент

Казымова М.А.

2

14ого

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Термодинамическое изучение кооперативного влияния гидратации на рецепторные свойства твердых белков и гидрофильных полимеров, а также факторов, влияющих на этот процесс, позволяет глубже понять роль воды в способности белков связывать субстраты и выявить важные критерии, которым должны удовлетворять полимерные рецепторы для того, чтобы их рецепторные свойства были биоподобны. Знание этих критериев необходимо для молекулярного дизайна биоподобных и биосовместимых полимеров, применяемых в качестве сенсоров, а также для транспорта лекарств и создания искусственных тканей в медицинских целях. Кооперативные эффекты с участием воды известны для кинетики ферментативных реакций, для связывания белками воды из водно-органических смесей, а также для термотропных фазовых переходов гидрофильных полимеров и процессов сворачивания белков в нативную структуру. Большая часть этих данных получена для растворов, из-за чего их интерпретация существенно затруднена доминирующим вкладом дегидратации субстрата перед его связыванием белком или полимером. Данные о влиянии внешних факторов (температура и присутствие примесей) на кооперативный эффект гидратации для белков в отсутствие жидкой фазы и о существовании аналогичного кооперативного эффекта для полимеров в литературе отсутствуют.

Цель работы. Целями диссертационной работы являлось:

- установление закономерностей кооперативного влияния гидратации на сорбционные свойства стеклообразного гидрофильного сшитого полимера с целью оценки степени биоподобности его рецепторных свойств

- изучение влияния температуры и примесей липидов на кооперативный эффект гидратации при связывании белком углеводородов

Научная новизна и выносимые па защиту положения. В диссертационной работе впервые обнаружен биоподобный кооперативный эффект при связывании паров органических соединений сшитым гидрофильным полимером. Показано, что с ростом гидратации его сродство к гидрофобным и относительно крупным гидрофильным сорбатам, так же как и в случае белков, кооперативно возрастает и достигает насыщения.

Впервые обнаружено, что увеличение температуры от комнатной (298 К) до физиологической приводит к уменьшению порога по гидратации, выше которого происходит эффективное связывание субстратов белком. Впервые обнаружен синергизм во влиянии гидратации и примесей липидов, присутствующих в белке, на его сорбционное сродство. Показано, что данный эффект не связан с растворением сорбатов в отдельной фазе липидов.

Практическая значимость работы состоит в том, что на основа-

нии ее результатов становится возмо

Мс. НАЦ1

бИБЛКОТЁМ

риев, необходимых для молекулярного дизайна полимеров, обладающих биоподобными рецепторными свойствами, с целью создания на их основе сенсоров, не уступающих по селективности и чувствительности сенсорам на основе белков. Данные о влиянии липидов и температуры на рецептор-ные свойства белка обеспечивают фундаментальную основу для решения проблем распознавания запахов в биологических системах, удерживания ароматических добавок и вредных веществ пищевыми продуктами.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на I, II и III Научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ (Казань, 2000, 2001 и 2003 гг.), на итоговых конференциях КГУ (Казань, 2002 и 2003 гг.), на XIV Международной конференции по химической термодинамике (Санкт-Петербург, 2002 г.), на II Международном симпозиуме "Молекулярный дизайн и синтез супрамолеку-лярных архитектур" (Казань, 2002 г.), на II Междисциплинарной конференции НБИТТ-21 (Петрозаводск, 2003), на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), на II Международном симпозиуме "Реагирующие полимеры в негомогенных системах в расплавах и на межфазных границах" (Дрезден, Германия, 2003 г.).

Работа выполнена на кафедре физической химии Химического института им. A.M. Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина" под руководством доктора химических наук В.В. Горбачука при поддержке гранта УРФИ (проект N 015.05.01.16), совместного гранта CRDF и Российского Министерства образования "Basic Research & Higher Education" (REC-007), РФФИ-тат. (No.03-03-96188) и АНТ (No.7-7.1-60/2001 и No.7-7.3-209/2003).

Личный вклад автора. Автором диссертации было выполнено 90% экспериментальной работы. Доля участия автора при написании статей -30% от объема публикации, при написании тезисов конференций - 50%.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и тезисы 10 докладов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит 43 рисунка и 32 таблицы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, обсуждение результатов), выводов, списка литературы из 112 наименований и приложения.

В первой главе собраны и систематизированы литературные данные о термодинамике взаимодействий белков и полимеров с органическими соединениями и водой из паровой фазы и из растворов. Приводятся литературные данные об известных кооперативных эффектах, наблюдаемых для белков и полимеров. Обсуждаются различные сорбционные модели, созданные для описания сорбции на белках и полимерах. Во второй главе описаны объекты исследования и экспериментальные методики, приме-

нявшиеся в ходе выполнения настоящей работы. В третьей главе обсуждаются полученные экспериментальные данные. Для двухкомпонентных систем проводится анализ влияния температуры и примесей липидов на сорбционные свойства высушенного белка, и анализируются биоподоб-ность высушенного сшитого гидрофильного полимера путем сравнения его сорбционных свойств со свойствами ранее изученных белков. Для трехкомпонентных систем анализируется сходство кооперативного влияния гидратации на рецепторные свойства белков и изученного полимера, обсуждается влияние температуры и примесей липидов на кооперативный эффект гидратации. Кроме того, сопоставляется влияние "водоподобных" органических растворителей на сорбционные свойства полимера и белка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты исследования и метод измерения

В качестве объектов исследования были выбраны твердые белки Р-лактоглобулин (БЛГ) из коровьего молока (Armor Proteines), коллаген из бычьих сухожилий (Sigma) и гидрофильный синтетический сшитый полимер поли-Ы-б-аминогексилакриламид (ПНАГАА) (Aldrich):

-f^t"

с

СГ NH(CH2)6NH2

Полимер, имевший форму гранул со средним диаметром 100 цм, изучался без дополнительной очистки. Препарат БЛГ, содержащий 75 масс. % р-лактоглобулина, 15% других белков, 0.6% лактозы и 1.2% липидов (в основном жиров и жирных кислот), исследовался в двух состояниях: без предварительной очистки и после удаления липидов хлороформом при комнатной температуре. Коллаген изучался только в обезжиренном состоянии. Согласно данным ИК-спектроскопии, полосы поглощения амида 1 и амида II в спектре обезжиренного БЛГ и препарата, содержащего примеси липидов, совпадали, что свидетельствует об отсутствии необратимой денатурации белка при обезжиривании в данных условиях.

В качестве сорбатов использовались терпены а- и у-терпинен (Aldrich) (>97% основного компонента), терпинолен (Fluka) (>90%) и различные органические растворители, отличающиеся размером, формой и групповым составом молекул (степень чистоты >99%).

Сорбция органических соединений в двух- и трехкомпонентных системах изучалась статическим методом парофазного газохроматогра-фического анализа. Время, необходимое для достижения сорбционного равновесия после дозирования сорбатов и зависящее, главным образом, от скорости испарения сорбатов, составляло 3-11 дней. Активность сорбата определялась как отношение высоты хроматографического пика в системах с сорбентом к высоте пика над чистым растворителем.

Степень осушки белков и полимера перед дозированием сорбатов определялась с помощью микротермогравианализатора MGDTD-17S (SETARAM). Погрешность определения гидратации сорбентов составляет 0.002 г Н20/г сорбента (0.002 А).

Влияние температуры и примесей липидов на сорбцию органических соединений высушенным р-лактоглобулином

Изотермы сорбции ацетонитрила и декана на высушенном жирном, (1.2 масс. % липидов) и высушенном обезжиренном р-лактоглобулине (остаточная гидратация 0.05 И), полученные при различных температурах, показаны на рис. 1. Изотермы сорбции представляют собой зависимость состава твердой фазы А от активности сорбата в системе Р/Рр. Полученные изотермы сорбции были формально аппроксимированы с помощью известных в литературе моделей.

Рис. 1. Изотермы сорбции ацетонитрила высушенным жирным (1.2 масс. % липидов) и обезжиренным Р-лактоглобулином (БЛГ) (0.05 h). На вставке приведен увеличенный фрагмент изотермы сорбции ацетонитрила. Здесь и далее, данные для сывороточного альбумина человека (САЧ) взяты из работ V.V. Gorbatchuk, М.А. Ziganshin, B.N. Solomonov Biophys.Chem.i999, 81, 107-123 и V.V. Gorbatchuk, М.А. Ziganshin, B.N. Solomonov, M. D. Bo-risoverJ Phys. Org. Chem. 1997,10,901-907.

Изотермы сорбции ацетонитрила, полученные как для жирного, так и обезжиренного БЛГ, имеют схожую форму с аналогичными данными для сывороточного альбумина человека (САЧ) (0.01 h, содержание липидов 0.2%), рис. 1А. Сорбция декана на высушенном БЛГ была обнаружена только для белка, содержащего примеси липидов, рис. 1В. Это согласуется с полученными ранее данными для практически не содержащего жиров высушенного САЧ, который оказался неспособным связывать монофункциональные органические соединения, мольный объем которых превышал 80 мл/моль (мольный объем декана - 195 мл/моль). Высокая селективность

БЛГ к паре ацетонитрил/декан опровергает предположение о существенной сорбции на поверхности раздела белок - газ и согласуется с имеющимся в литературе мнением о том, что сорбция воды и малых органических молекул осуществляется в объеме твердой фазы белка.

Увеличение температуры от 298 К до физиологической 309.5 К и далее до 323 К приводит к падению сорбции ацетонитрила высушенным ß-лактоглобулином, рис. 1А, что согласуется с литературными данными по влиянию температуры на сорбцию воды белками. Изотермы сорбции декана на высушенном БЛГ с примесями жиров при температурах 298 К и 309.5 К практически совпадали, рис. 1В.

Липиды довольно сложным образом влияют на связывание ацетонитрила высушенным БЛГ, увеличивая его при активностях сорбата до 0.2, рис. 1А (вставка), и уменьшая при активностях ацетонитрила выше 0.4, рис. 1А. Подобный эффект липидов был бы невозможен, если бы они существовали в белке в виде отдельной фазы. Анализ коэффициентов активностей декана и ацетонитрила в фазе липидов, экстрагированных из БЛГ, показал, что существованием отдельной фазы липидов можно объяснить сорбцию 70% добавленного декана (при Р/Р„ = 0.18) и всего 0.3% увеличения сорбции ацетонитрила (при Р/Р(, = 0.026) за счет присутствия в белке липидов. Из этого следует, что, по крайней мере, часть липидов не образует в белке отдельную фазу.

Влияние температуры и примесей липидов на сорбционные свойства гидратированных ß-лактоглобулина и коллагена

Влияние гидратации, температуры и примесей липидов на сорбци-онное сродство БЛГ к декану и терпенам изучалось в системах "белок + вода + этанол + углеводород" в отсутствие жидкой фазы. Объемное соотношение жидких углеводорода, этанола и воды, дозируемых на БЛГ, составляло 0.9 : 9.0 : 90.1. В случае систем с коллагеном, дозируемый раствор состоял из воды (94 об %) и диоксана (6%). Доля органических компонентов была выбрана такой, чтобы, с одной стороны, свести к минимуму их влияние на сорбцию воды белком, а с другой, чтобы они имели достаточно высокую активность. Этанол использовался в качестве разбавителя углеводорода для уменьшения ошибки дозирования, и его влияние на сорбционное сродство БЛГ к углеводородам не превышало 5%. Изотермы сорбции терпенов, декана и этанола на БЛГ, а также диоксана на коллагене приведены на рис. 2 и 3 в координатах: отношение количества связанного сорбата к его активности А/(Р/Ро) против гидратации белка, h. Величина А/(Р/Ро) представляет собой сорбционное сродство белка или коэффициент распределения сорбата между его чистой жидкостью и фазой белка. Сложные формы изотерм сорбции изученных сорбатов на гидратированном ß-лактоглобулине не позволили подобрать уравнение для их аппроксимации. Изотермы сорбции диоксана на коллагене были аппроксимированы моди-

фицированным уравнением Хилла, предложенным более 100 лет назад для описания кооперативной сорбции кислорода растворенным в воде гемоглобином.

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.0 01 0.2 0.3 0.4

Л, г НгО/г белка Ь, г Н20/г белка

Рис. 2. Влияние гидратации и температуры на сорбционное сродство А/(Р/Рц) обезжиренного (А, В и Б) и жирного (С) [3-лактоглобулина к углеводородам и этанолу в четырехкомпонентных системах при 298, 309.5 и 318 К. Объемное соотношение углеводорода, воды и этанола в дозируемой жидкой смеси 0.9 : 90.1 : 9.0, соответственно.

Из представленных рис. 2 и 3 изотерм видно, что влияние гидратации на сорбционное сродство БЛГ к углеводородам и коллагена к диокса-ну существенно отличается от ее влияния на сродство БЛГ к этанолу. Для углеводородов наблюдается ступенчатая изотерма с порогом по гидратации белков, выше которого происходит кооперативный рост их сорбцион-ного сродства к сорбатам с выходом на максимум или насыщение, рис. 2 и 3. В случае этанола сорбционное сродство сначала падает, а затем немного возрастает, рис. 2Б. Аналогичная зависимость формы изотермы сорбции от размера сорбата была ранее обнаружена при изучении сорбции парообразных двухкомпонентных систем "вода + органический растворитель" (соотношение компонентов 94:6, соответственно) на САЧ. Присутствие в БЛГ примесей липидов не сказывается на форме изотерм сорбции, рис. 2С. Причиной ступенчатой зависимости сродства белка от его гидратации яв-

ляется клатратообразование в тройных системах "белок + вода + органический компонент", сопровождаемое фазовым переходом белка при достижении пороговой гидратации. В литературе имеются модельные представления и сведения о клатратообразовании в системах подобного типа, полученные методом РСА.

Повышение температуры от 298 К до физиологической не влияет, в пределах ошибки эксперимента, на величину максимального сорбционного сродства изученных белков, но уменьшает порог по гидратации (степень гидратации, соответствующая увеличению сродства белка наполовину) на 0.03-0.08 И как для жирного и обезжиренного БЛГ, так и для коллагена, рис. 2А-С и 3. Причиной этого может быть то, что белку для связывания углеводородов требуется достижение определенной активности, а не содержания воды. Эта интерпретация соответствует современным представлениям о влиянии воды на кинетику ферментативных реакций. При увеличении температуры до 318 К происходит возрастание порога по гидратации, что вызвано, по всей видимости, денатурацией белка, рис. 2С. Сродство гидратированного БЛГ к этанолу, присутствовавшему в этих же системах, практически не зависит от изменения температуры, рис. 20.

2.0

1.1.5

•а

с о

21.0

г £

$"0.5

0.0

О 298 К

♦ 309 К х

л

г

0.0

0.1 0.2 /), г НгО/г белка

0.3

Рис. 3. Влияние гидратации на сорб-ционное сродство А/(Р/Рц) обезжиренного коллагена к диоксану в трехкомпонентных системах с водой при 298 и 309 К. Объемное соотношение компонентов добавляемой жидкой смеси диоксана и воды составляет 6:94.

Присутствие в гидратирован-ном БЛГ всего 1.2 % примесей ли-пидов более чем вдвое увеличивает

его сродство к изученным углеводородам и этанолу при гидратациях выше пороговой, рис. 2С (для этанола данные не показаны). При этом экспериментальное значение сорбционного сродства жирного гидратированного БЛГ оказывается в несколько раз выше, чем рассчитанное по аддитивной схеме "сродство жирного высушенного БЛГ + сродство гидратированного обезжиренного БЛГ". На основании данных о коэффициентах активностей изученных сорбатов в экстрагированных из БЛГ липидах, были рассчитаны количества этих сорбатов, способные раствориться в отдельной фазе липидов в БЛГ, если таковая существует. Они оказались в несколько раз ниже, чем наблюдаемый прирост сорбционной емкости гидратированного БЛГ за счет присутствия липидов. Это свидетельствует о наличии синер-

гизма во влиянии гидратации и примесей липидов на рецепторные свойства БЛГ.

Сорбционные свойства высушенного сшитого поли-Г^-6-аминогексил-акриламида

Изотермы сорбции паров органических растворителей на высушенном поли-Ы-б-аминогексилакриламиде (ПНАГАА) (остаточная гидратация 0.015-0.066 h) при 298 К представлены на рис. 4 как зависимость сорбции А изученных сорбатов от их термодинамической активности Р/Рц. Высушенный полимер не связывает циклогексан. Сорбция бензола и этилацета-та лишь ненамного превышает величину экспериментальной ошибки.

Рис. 4. Изотермы сорбции паров органических соединений высушенным ПНАГАА (0.0150.066 И) при 298 К. Данные для БЛГ (0.05 И) взяты из рис. 1 А, а для САЧ (0.01 И) - из литературы (см. подпись к рис.1).

Форма полученных изотерм сорбции (рис. 4) типична для стеклообразных полимеров. На изотермах сорбции соединений с наименьшим размером молекул (метанол и аце-тонитрил) при низких активностях наблюдается выпуклый лэнгмюровский участок, обусловленный их сорбцией в так называемом свободном объеме полимера. Точка перегиба на этих изотермах отвечает переходу полимера из стеклообразного в резиноподобное (высокоэластичное) состояние. Изотермы сорбции более крупных сорбатов (2-пропанол, пропионитрил, диоксан, бензол), размер которых не позволяет им проникнуть в свободный объем полимера без его пластификации, имеют вогнутую форму во всем интервале активностей. Изотермы более сложной формы, состоящие из двух вогнутых участков, наблюдаются для 1-пропанола и, в меньшей степени, этанола. Возможная причина этого - наличие кооперативного перехода в стеклообразном полимере в

04 06

Р1Р0

процессе связывания сорбата. Полученные изотермы сорбции были аппроксимированы с помощью известных в литературе моделей.

В отличие от ПНАГАА, на изотермах сорбции для высушенных белков САЧ (лит. данные) и БЛГ имеется лэнгмюровский участок при низких активностях всех изученных сорбатов, рис. 4. Кроме того, изотермы сорбции ацетонитрила на БЛГ и САЧ, не имеющие точек перегиба, рис. 4В, а также литературные данные, свидетельствуют о том, что белки, в отличие от ПНАГАА, сохраняют стеклообразное состояние при высоких активностях органических растворителей.

Для ПНАГАА и ранее изученного САЧ при низких активностях сорбатов (P/Po < 0.2) наблюдается практически одинаковый эффект исключения сорбатов по объему: их сорбционное сродство резко падает с ростом размеров молекул сорбата в изученных гомологических сериях спиртов и нитрилов, рис. 4. Но при высоких активностях сорбатов (Р/Рп > 0.4) ПНАГАА гораздо менее селективен к размеру их молекул, чем альбумин, что вызвано более высокой пластификацией полимера при сорбции изученных органических растворителей. Однако эта пластификация является довольно ограниченной, поскольку ПНАГАА, так же как и альбумин, лучше сорбирует 1 -пропанол, чем 2-пропанол даже при высоких активностях сорбатов. Жидкие растворители имеют обратную селективность к этой паре сорбатов.

Наблюдаемый при низких активностях сорбатов, когда ПНАГАА еще сохраняет стеклообразное состояние, сильный эффект исключения сорбатов по объему, свидетельствует о том, что стеклообразный ПНАГАА обладает сорбционными свойствами, близкими к белковым. Это позволяет ожидать для него наличие биоподобного кооперативного влияния гидратации на его рецепторные свойства.

Влияние гидратации на сорбционное сродство ПНАГАА к парообразным органическим соединениям

Для оценки биоподобности рецепторных свойств поли-N-ö-аминогексилакриламида был изучено влияние гидратации на сорбционное сродство ПНАГАА к парообразным сорбатам в тройных системах "полимер + вода + органический сорбат" в отсутствие жидкой фазы. Дозируемая в ампулы с осушенным полимером жидкая смесь содержала 6 об. % органического соединения и 94 % воды. Полученные изотермы сорбции показаны на рис. 5 как зависимость сорбционного сродства ПНАГАА А/(Р/Ро) от его гидратации h. Для сравнения также приведены изотермы сорбции для гидратирояанного САЧ в тех же системах.

Из сравнения рис. 2, 3 и 5А видно, что, так же как и в случае с САЧ и БЛГ, изотермы сорбции наименьших по размеру сорбатов этанола и ацетонитрила в присутствии паров воды существенно отличаются по форме от изотерм сорбции более крупных соединений. Гидратация лишь незначи-

тельно увеличивает сродство ПНАГАА к этанолу и ацетонитрилу. В то же время с ростом гидратации ПНАГАА для более крупных сорбатов наблюдается такой же кооперативный рост его сорбционного сродства с выходом на насыщение, что и в случае белков БЛГ, коллагена и ранее изученного САЧ. При этом максимальное сходство в форме изотерм сорбции для ПНАГАА и САЧ наблюдается в трехкомпонентных системах с диоксаном и бензолом, которые являются наихудшими пластификаторами ПНАГАА среди изученных растворителей. Пропанолы, чья способность пластифицировать ПНАГАА выше, чем у диоксана с бензолом, но ниже, чем у аце-тонитрила и этанола, занимают промежуточное положение по степени сходства в форме изотерм сорбции для гидратированного полимера и белка, рис. 5В.

Ь, г Н20/г рецептора Ь, г Н20/г рецептора

Рис. 5. Влияние гидратации на сорбционное сродство А/(Р/Ро) ПНАГАА к парам органических соединений при 298 К. Содержание органического компонента в дозируемой жидкой водно-органической смеси, добавленной к предварительно осушенному полимеру, составляет 6 об. %. Пунктирные линии представляют собой изотермы сорбции для САЧ (лит. данные). На вставке рис. 5В сопоставлена сорбция пропанолов на САЧ и ПНАГАА.

Полученные изотермы сорбции аппроксимировались модифицированным уравнением Хилла, представляющим собой частный случай уравнения для описания кооперативных явлений в биологических системах:

А/(Р/Рп) = {А/(Р/РгЯ„п+[Л/(Р/Ро)),а, СИ"/(\ +СИМ) (I)

где [А/(Р/Ро)]тЫ - сродство полимера ниже порога по гидратации, равное сродству в высушенном состоянии, [А/(Р/Рп)]яа, - сродство ПНАГАА при бесконечно высокой гидратации, N - параметр кооперативное™, С - константа связывания. В табл. 1 приведены полученные параметры, но вместо константы связывания С приведена величина пороговой гидратации, соответствующая влажности полимера на полувысоте изотермы, рассчитанная по уравнению = ехр(-(1пС)/Ы).

Табл. 1. Аппроксимационные параметры изотрем сорбции паров органических соединений в трехкомпонентных системах с гидратированным ПНАГАА при 298 К, рассчитанные по уравнению (1)._______

Сорбат [А/(Р/Р0)]тт ммоль/г [А/(Р/Ра)]т, ммоль/г N г/г <5"

МеСЫ 2.0' 3.1 3.0 0.25е 0.06

ЕЮН 2.3Ь 4.2 2.4 0.14 0.05

1- РЮН 0.47 2.4 5.0 0.12 0.02

2-РгОН 0.19 2.8 5.0 0.13 0.02

Диоксан 0.12 3.3 5.8 0.21 0.01

Бензол 0' 0.71 6.9 0.16 0.03

с-С6Н)2 0" <0.054 4.0 0.14 0.08

"Стандартное отклонение для нормализованного наикратчайшего расстояния между экспериментальными точками и теоретической кривой. ''Среднее значение сорбционного сродства А/(Р/Рп) для между первыми тремя экспериментальными точками с наименьшей гидратацией. 'Оценено с большой ошибкой (~40%). ''Сорбции в пределах ошибки эксперимента не обнаружено.

Сходство в форме изотерм сорбции для ПНАГАА и САЧ предполагает и одинаковый механизм связывания сорбатов в этих системах. Как уже говорилось, для белков им является клатратообразование. Сопоставление коэффициентов активности диоксана, бензола и циклогексана в воде показало, что селективность гидратированного полимера к паре бен-зол/циклогексан, рассчитанная как отношение соответствующих величин [А/(Р/Ро)]ш (табл. 1), равна 13, что сравнимо с селективностью чистой

жидкой воды (отношение коэффициентов активности этих сорбатов в воде равно 33). Однако сравнение селективностей ПНАГАА и воды к паре ди-оксан/бензол (4.6 и 461, соответственно) представляет полимер как гораздо более гидрофобную жидкую среду. Это противоречие можно объяснить, если предположить клатратообразующий механизм связывания гидратиро-ванным полимером субстратов, поскольку известно, что селективность клатратообразования зависит от комплементарности субстрата рецептору.

Наблюдаемый порог по гидратации при связывании "плохих" пластификаторов согласуется с имеющимися в литературе данными об антипластификации полиамидов водой при низких гидратациях, которая сохраняет полимер в стеклообразном состоянии. При гидратациях ниже пороговых, в ПНАГАА содержится менее одной молекулы воды на один мономер, имеющий две протоноакцепторные группы. При таких соотношениях вода не разрушает существующую в ПНАГАА, который имеет избыток протоноакцепторных групп, сетку водородных связей, стабилизирующую стеклообразное состояние изученного полимера и препятствующую связыванию крупных сорбатов. Однако при достижении пороговой гидратации, полимерная цепь ПНАГАА, вероятно, становится достаточно гибкой для того, чтобы стало возможным связывание "плохих" сорбатов. Постоянство сорбционного сродства ПНАГАА при гидратациях выше пороговых свидетельствует о вторичной антипластификации полимера в изученных трехкомпонентных системах. Следовательно, можно говорить о фазовом переходе полимера в области пороговой гидратации из одного стеклообразного состояния в другое, обладающее более высоким сродством к изученным сорбатам.

Влияние "водоподобиого" органического соединения на сорбционные свойства ПНАГАА

Для лучшего понимания роли воды в биоподобном поведении полимера как рецептора в настоящей работе было изучено влияние "водопо-добных" органических растворителей этанола и ацетонитрила на сорбцию "плохих" растворителей диоксана и бензола высушенным ПНАГАА.

Было обнаружено, что, так же как и в случае с САЧ, этанол и ацето-нитрил увеличивают сорбционное сродство ПНАГАА к бензолу и диокса-ну без заметного порога по активности или содержанию, рис. 6. При этом их влияние на сорбционное сродство к диоксану сравнимо с влиянием воды, а в случае с бензолом даже в несколько раз выше. Для САЧ активирующий эффект гидратации был значительно выше эффектов этанола и ацетонитрила. Видимо, это связано с большим вкладом пластификации полимера этанолом и ацетонитрилом в сравнении водой.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0 6 0 8 1 0 PIP в ЕЮН PIP о MeCN

Рис. 6. Влияние этанола и ацетонитрила на сорбционное сродство А/(Р/Рп) высушенного ПНАГАА (0.013 А) к парам бензола при 298 К. Дозируемый жидкий раствор содержал 6 об. % бензола и 94 об. % ацетонитрила или этанола. Пунктирные линии представляют собой изотермы сорбции для САЧ (лит. данные).

Постоянное увеличение сорбционного сродства ПНАГАА к бензолу и диоксану с ростом активности ацетонитрила указывает на пластификацию полимера, рис. 6В. В системах с этанолом наблюдается участок насыщения сорбционного сродства ПНАГАА, подобный тому, что был получен ранее для альбумина, свидетельствующий об антипластификации, рис. 6А. При этом в тройных системах с этанолом обнаружен обратный кооперативный эффект бензола и диоксана на сорбцию полимером этанола в сравнении с его сорбцией в двухкомпонентной системе, рис. 7А, соответствующий дополнительному связыванию до 10 молекул этанола на 1 молекулу бензола или диоксана. Для ацетонитрила формы изотерм сорбции на ПНАГАА в трех- и двухкомпонентных безводных системах совпадали, что свидетельствует об отсутствии антипластификации в данных системах, рис. "7В.

В литературе существует мнение, что антипласгификация полиамидов возможна лишь в том случае, если сорбат не разрушает сетку водородных связей, стабилизирующую стеклообразное состояние полимера. В ПНАГАА имеется недостаток протонодонорных групп, вследствие чего протоноакцепторный ацетонитрил, в отличие от этанола и воды, не способен выступать в качестве антипластификатора. В результате этого, в трех-компонентных системах с двумя органическими сорбатами биоподобное поведение ПНАГАА наблюдается только в системах с этанолом.

Рис. 7. Влияние диоксана и бензола на сорбцию паров этанола (А) и ацето-нитрила (В) высушенным ПНАГАА (0.013 И) при 298 К. Дозируемый жидкий раствор содержал 6 об. % бензола или диоксана и 94 об. % этанола.

Обнаруженные в трехкомпонентных системах с ПНАГАА кооперативные эффекты проиллюстрированы с помощью структурной схемы на рис. 8. На этом рисунке состояние А соответствует высушенному сшитому гидрофильному полимеру, обладающему сильным эффектом исключения сорбата по объему. При гидратациях ниже порогового уровня полимер находится в антипластифицированном состоянии В, в котором он обладает низким сродством к "плохим" сорбатам. Дальнейшая гидратация приводит к кооперативному росту сорбционного сродства полимера к "плохим" сорбатам и, вероятно, к воде за счет стабилизации сетки водородных связей в гидратированном полимере "плохим" сорбатом, заполняющим в этой сетке потенциально пустые участки ограниченного размера (процесс В-С). Процесс А-0 при низком содержании этанола (<0.05 молекул этанола на мономер) дает частично пластифицированное состояние полимера, в котором положения молекул этанола и "плохого" сорбата независимы. Относительное расположение этих сорбатов, вероятно, становится зависимым при более высоком содержании этанола, когда приходится до одной молекулы этанола на два мономерных остатка (процесс Б-Е). В этих условиях происходит увеличение сорбции полимером этанола, вызванное присутствием малых количеств "плохих" сорбатов диоксана и бензола, которое, вероятно, приводит к стабилизации сетки водородных связей в системе полимер-этанол.

Подобная схема применима также-для описания' кооперативных взаимодействий Р-лактоглобулина, коллагена и ранее изученного альбумина с водно-органическими смесями. Для альбумина данную схему можно применить и для описания взаимодействий с двумя органическими компонентами, за исключением состояния И, поскольку обратный коопе-

ративный эффект плохих сорбатов на сорбцию этанола альбумином начинается при более низких активностях этанола.

Рис. 8. Схематичное изображение биоподобного кооперативного влияния гидратации и влияния этанола на связывание "плохого" сорбата (субстрата) поли-Ы-6-аминогексилакриламидом. (А) высушенный ПНАГАА; (В) ПНАГАА, гидратированный ниже порогового уровня, когда на один мономер приходится менее одной молекулы воды; (С) гидратированный ПНАГАА, в котором на две протоноакцепторных группы приходится более одной молекулы воды, когда "плохой" сорбат (субстрат) заполняет потенциально пустые участки в сетке водородных связей; (Э) частично пластифицированный ПНАГАА, с содержанием этанола менее одной молекулы на двадцать мономерных остатков, когда молекулы "плохого" сорбата связывается независимо от этанола; (Е) ПНАГАА, содержащий менее одной молекулы этанола на два мономерных остатка, когда молекулы "плохого" сорбата заполняют потенциально пустые участки в сетке водородных связей полимера.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые изучено влияние температуры на сорбцию органических соединений гидратированными белками. Для р-лактоглобулина и коллагена обнаружено, что при увеличении'температуры от комнатной (298 К) до физиологической (309.5 К) происходит уменьшение порога гидратации, выше которого наблюдается эффективное связывание органических субстратов этими белками.

2. Впервые изучено влияние примесей липидов на сорбционные свойства высушенного и гидратированного белка. Обнаружен синергизм во влиянии гидратации и примесей липидов, присутствующих в |3-лактоглобулине, на кооперативный рост его сорбционного сродства к углеводородам.

3. Впервые получены изотермы сорбции, характеризующие зависимость сорбционного сродства полимера к органическим соединениям от степени его гидратации в отсутствие жидкой фазы. Обнаружено биоподобное кооперативное влияние гидратации на сорбционное сродство сшитого поли-Ы-6-аминогексилакриламида по отношению к крупным сорбатам.

4. В трехкомпонентных системах с участием сшитого поли-Ы-б-аминогексилакриламида и двух летучих органических компонентов обнаружено биоподобное кооперативное влияние "плохих" пластификаторов на сорбцию этанола полимером.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Mironov N.A. Effects of hydration, of lipids and of temperature on the binding of the volatile aroma terpenes by beta-lactoglobulin powders / N.A. Mironov, V.V. Breus, V.V. Gorbatchuk, B.N. Solomonov, T. Haertle II J. Agric. Food Chem. - 2003. - V.5, N4. - P.2665-2673.

2. Gorbatchuk V.V. Biomimetic cooperative interactions of dried cross-linked po!y(N-6-aminohexylacryIamide) with binary mixtures of solvent vapors / V.V. Gorbatchuk, N.A. Mironov, B.N. Solomonov, W.D. Habicher // Biomacro-molecules. - 2004. - V.5.- P. 1615-1623.

3. Миронов H.A. Сопоставление супрамолекулярных свойств производного полиакриламида и сывороточного альбумина человека / Н.А. Миронов, В В. Горбачук, Б.Н. Соломонов // Тез. докл. I Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 20-21 октября 2000. - С.62.

4. Миронов Н.А. Влияние гидратации, температуры и примесей липидов на рецепторные свойства твердого р-лактоглобулина / Н.А. Миронов, В.В. Горбачук, Б.Н. Соломонов // Тез. докл. II Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 5-6 декабря 2001. - С.58.

5. Миронов Н.А. Биоподобность сорбционных свойств поли-6-аминогексилакриламида / Н.А. Миронов, В.В. Горбачук, Б.Н. Соломонов // Тез. докл. XIV Международной конференции по химической термодинамике. - Санкт-Петербург, 1-5 июля 2002. - С.433.

6. Mironov N.A. Effect of hydrophobic hydration on binding properties of poly(acrylic acid 6-aminohexyIamide) / N.A. Mironov, V.V. Gorbatchuk, V.V. Breus, B.N. Solomonov, W.D. Habicher // Abstracts of the second international symposium: Molecular design and synthesis of supramolecular architectures. -Kazan, Russia, 27-31 August, 2002. - P.83.

7. Миронов H.A. Биоподобность рецепторных свойств поли-6-аминогексилакриламида / H.A. Миронов, В.В. Горбачук, Б.Н. Соломонов, В.Д. Хабишер // Тез. докл. III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 14-15 февраля 2003. - С.57.

8. Миронов Н.А. Роль гидрофобной гидратации в биоподобности рецепторных свойств сшитого гидрофильного полимера / Н.А. Миронов, В.В. Горбачук // Тез. докл. II Междисциплинарной конференции НБИТТ-21. -Петрозаводск, Россия, 23-25 июня 2003 г. - С.69.

9. Миронов Н.А. Влияние гидратации, температуры и примесей липидов на сорбционные свойства твердого (З-лактоглобулина / Н.А. Миронов, В.В. Горбачук, Б.Н. Соломонов // Тез. докл. XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Достижения и перспективы химической науки, Т. 1. - Казань, 21-26 сентября 2003 г. - С. 73.

10. Миронов Н.А. Роль гидратации в функционировании биоподобного полимера как рецептора / Н.А. Миронов, В.В. Горбачук, Б.Н. Соломонов // Тез. докл. XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Материалы и нанотехнологии, Т.З. - Казань, 21-26 сентября 2003 г. - С.283.

11. Gorbatchuk V.V. Thermodynamic criteria of biomimic properties of supramolecular receptors / V.V. Gorbatchuk, M.A. Ziganshin, N.A. Mironov // Тез. докл. XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Российско-французский симпозиум "Супрамолекулярные системы в химии и биологии", Т.4. - Казань, 21-26 сентября 2003 г. - С. 27.

12. Gorbatchuk V.V. Biomimic receptor properties of the cross-linked hydro-philic polymer without imprinting / V.V. Gorbatchuk, N.A. Mironov // Abstract of the second international symposium "Reactive polymers in inhomogeneous systems, in melt and the interfaces". - Dresden, Germany 28 September - 1 October, 2003. - LI5.

116738

РНБ Русский фонд

2005^4 14020

Лицензия на полиграфическую деятельность №0128 от 08.0б.98г. выдана Министерством информации и печати Республики Татарстан Подписано в печать 21.09.2004 г. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л.1,25. Тираж 100. Заказ 206.

Минитипография института проблем информатики АН РТ 420012, Казань, ул.Чехова, 36.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Структурные особенности белков и полимеров как рецепторов.

1.2. Термодинамика сорбции воды и органических соединений на твердых белках и полимерах.

1.2.1. Сорбция в двухкомпонентных системах белок + сорбат и полимер + сорбат. Математические модели сорбции.

1.2.2. Сорбция и кооперативные эффекты в трехкомпонентных системах белок или полимер + вода + органический компонент.

1.2.3. Влияние температуры на сорбционные свойства твердых белков, на их каталитическую активность и рецепторные свойства в водных растворах.

1.3. Кооперативные эффекты с участием белков и полимеров, непосредственно не связанные с сорбцией.

1.3.1. Влияние воды на кинетику ферментативных реакций и взаимодействие антиген - антитело. Эффекты памяти белков (история гидратации).

1.3.2. Кооперативные фазовые переходы термотропных полимеров в водных растворах и водно-органических смесях.

1.4. Влияние липидов на стабильность и рецепторные свойства белков

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Подготовка образцов для определения изотерм сорбции.

2.3. Методика определения изотерм сорбции паров органических соединений.

2.4. Определение коэффициентов распределения органических соединений между их чистой жидкостью и раствором в липидах.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Влияние температуры и примесей липидов на сорбцию органических соединений высушенным (3-лактоглобулином.

3.2. Влияние гидратации, температуры и примесей липидов на рецеп-торные свойства Р-лактоглобулина и коллагена.

3.3. Влияние структуры органических соединений на их сорбцию высушенным поли-И-б-аминогексилакриламидом в бинарных системах. Оценка биоподобности сорбционных свойств высушенного поли-Ы-6-аминогексилакриламида.

3.4. Влияние гидратации на сорбционное сродство поли-Ы-б-аминогексилакриламида к парообразным органическим соединениям

3.5. Влияние органического компонента на рецепторные свойства по-ли-И-б-аминогексилакриламида.

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. Термодинамическое изучение кооперативного влияния гидратации на рецепторные свойства твердых белков и гидрофильных полимеров, а также факторов, влияющих на этот процесс, позволяет глубже понять роль воды в способности белков связывать субстраты и выявить важные критерии, которым должны удовлетворять полимерные рецепторы для того, чтобы их рецепторные свойства были биоподобны. Знание этих критериев необходимо для молекулярного дизайна биоподобных и биосовместимых полимеров, применяемых в качестве сенсоров, а также для транспорта лекарств и создания искусственных тканей в медицинских целях. Кооперативные эффекты с участием воды известны для кинетики ферментативных реакций, для связывания белками воды из водно-органических смесей, а также для термотропных фазовых переходов гидрофильных полимеров и процессов сворачивания белков в нативную структуру. Большая часть этих данных получена для растворов, из-за чего их интерпретация существенно затруднена доминирующим вкладом дегидратации субстрата перед его связыванием белком или полимером. Данные о влиянии внешних факторов (температура и присутствие примесей) на кооперативный эффект гидратации для белков в отсутствие жидкой фазы и о существовании аналогичного эффекта для полимеров в литературе отсутствуют.

Цель работы. Целями диссертационной работы являлось:

- установление закономерностей кооперативного влияния гидратации на сорб-ционные свойства стеклообразного гидрофильного сшитого полимера с целью оценки степени биоподобности его рецепторных свойств

- изучение влияния температуры и примесей липидов на кооперативный эффект гидратации при связывании белками углеводородов

Научная новизна и выносимые на защиту положения. В диссертационной работе впервые обнаружен биоподобный кооперативный эффект при связывании паров органических соединений сшитым гидрофильным полимером. Показано, что с ростом гидратации его сродство к гидрофобным и относительно крупным гидрофильным сорбатам, так же как и в случае белков, кооперативно возрастает и достигает насыщения. При этом биоподобность рецептор-ных свойств гидратированного полимера по отношению к изученным сорбатам выражена тем больше, чем меньше их способность пластифицировать высушенный полимер. Наблюдаемые результаты позволили сделать вывод в пользу образования клатратов вода + органический компонент + полимер.

Впервые показано, что увеличение температуры от комнатной (298 К) до физиологической (309.5 К) приводит к уменьшению порога по гидратации, необходимого для эффективного связывания субстратов белкам. Впервые обнаружен синергизм во влиянии гидратации и примесей липидов, присутствующих в белке, на его сорбционное сродство. Показано, что данный эффект не связан с растворением сорбатов в отдельной фазе липидов.

Практическая значимость работы состоит в том, что на основании ее результатов становится возможным выявление структурных критериев, необходимых для молекулярного дизайна полимеров, обладающих биоподобными рецепторными свойствами, для создания на их основе сенсоров, не уступающих по селективности и чувствительности сенсорам на основе белков. Данные о влиянии липидов и температуры на рецепторные свойства белка обеспечивают фундаментальную основу для решения проблем распознавания запахов в биологических системах, удерживания ароматических добавок и вредных веществ пищевыми продуктами.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит 43 рисунка и 32 таблицы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, обсуждение результатов), выводов, списка литературы из 112 наименований и приложения.

1. Впервые изучено влияние температуры на сорбцию органических соедине ний гидратированными белками. Для Р-лактоглобулина и коллагена обнаруже но, что при увеличении температуры от комнатной (298 К) до физиологической (309.5 К) происходит уменьшение порога по гидратации, выше которого проис ходит эффективное связывание органических субстратов этими белками.2. Впервые изучено влияние примесей липидов на сорбционные свойства вы сушенного и гидратированного белка. Обнаружен синергизм во влиянии гидра тации и примесей липидов, присутствующих в |3-лактоглобулине, на коопера тивный рост его сорбционного сродства к углеводородам.3. Впервые получены изотермы сорбции, характеризующие зависимость сорб ционного сродства полимера к органическим соединениям от степени его гид ратации в отсутствие жидкой фазы. Обнаружено биоподобное кооперативное влияние гидратации на сорбционное сродство сшитого поли-Ы-6-

аминогексилакриламида по отношению к крупным сорбатам.4. В трехкомпонентных системах с участием сшитого поли-М-б аминогексилакриламида и двух летучих органических компонентов обнаружено биоподобное кооперативное влияние плохих пластификаторов на сорбцию эта нола полимером.

1. Haertle T. Probing the fatty acid binding site of p-lactoglobulins / D. Frapin, E. Dufour, T. Haertle // J. Prot Chem. - 1993. - V. 12. - P.443-449.

2. Sawyer L. P-Lactoglobulin binds palmitate within its central cavity / S.-Y. Wu, M.D. Perez, P. Puyol, L. Sawyer // J. Biol. Chem. - 1999. - V.274. - P.170-174.

3. Pevsner J. Odorant-binding protein, characterization of ligand binding / J. Pevsner, V. Hou, A.M. Snowman, S.H. Snyder // J. Biol. Chem - 1990. - V.265. -P.6118-6125.

4. Allen K.N. An experimental approach to mapping the binding sites of crystalline proteins / K.N. Allen, C.R. Bellamacina, X. Ding, C.J. Jeffery, C.Mattos, G.A. Petsko, D. Ringe // J. Phys. Chem. -1996. - V.100, N7. - P.2605-2611.

5. Fitzpatrick P.A. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent / P.A. Fitz- patrick, A.C.U.Steinmetz, D.Ringe, A.M.Klibanov // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - V.90, N18. - P.8653-8657.

6. Fitzpatrick P.A. X-ray crystal structure of cross-linked subtilisin Carlsberg in water vs. acetonitrile / P.A. Fitzpatrick, D. Ringe, A.M. Klibanov // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994. - V.198, N2. - P.675-681.

7. Schmitke J.L. Organic solvent binding to crystalline subtilisin 1 in mostly aque ous media and in the neat solvents / J.L. Schmitke, L.J. Stern, A.M. Klibanov // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998. - V.248, N2. - P.273-277.

8. Klibanov A.M. The crystal structure of subtilisin carlsberg in anhydrous diox- ane and its comparison with those in water and acetonitrile / J.L. Schmitke, L.J. Stern, A.M. Klibanov // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1997. - V.94. - P.4250-4255.

9. Wang Z. X-ray studies on cross-linked lysozyme crystals in acetonitrile-water mixtures / Z. Wang, G. Zhu, M. Qian, M.S hao, Y.Jia, Y. Tang // Biochim. Bio phys. Acta - 1998. - V. 1384. - P.335-344.

10. Zhu G. X-ray studies on two forms of bovine p-trypsin crystals in neat cyclo- hexane / G.Zhu, Q. Huang, Z. Wang, M. Qian, Y. Jia, Y. Tang // Biochim. Bio phys. Acta. - 1998. -V.1429. -P.142-150.

11. Yennawar N.H. X-ray crystal structure of y-chymotrypsin in hexane / N.H. Yennawar, H.P. Yennawar, G.K. Farber // Biochemistry - 1994. - V.33. -P.7326-7336.

12. Yennawar H.P. A structural explanation for enzyme memory in nonaqueous solvents / H.P. Yennawar, N.H. Yennawar, G.K. Farber // J. Am. Chem. Soc. -1995.-V.117,N2.-P.577-585.

13. Sellergen B. Polymer- and template-related factors influencing the efficiently in molecularly imprinted solid-phase extractions / B. Sellergen // Trends Anal. Chem. - \999. - V.18. -P.164-174.

14. Haupt K. Molecularly imprinted polymers and their use in biomimetic sensors / K. Mosbach, K. Haupt // Chem. Rev. - 2000. - V.100. - P.2495-2504.

15. Dickert F.L. Molecular imprints in chemical sensing - detection of aromatic and halogenated hydrocarbons as well as polar solvents / F.L. Dickert, P. Forth, P. 1.ieberzeit, M. Tortschanoff// J. Anal. Chem. - 1998. - V.360. - P.759-762.

16. Dickert F.L. Molecular imprints as artificial antibodies - a new generation of chemical sensors / F.L. Dickert, P. Lieberzeit, M. Tortschanoff // Sensors and Actuators В - 2000. - V.65. - P . 186-189.

17. Kulkarni M.G. Molecularly imprinted polymers mimics of chymotrypsine. 1. Cooperative effect and substrate specificity / B.S. Lele, M.G. Kulkarni, R.A Mashelkar // React. Func. Polym. - 1999. - V.39. - P.37-52.

18. Horkay F. Swelling behavior of emulsion polymer particles: comparison between fully cross-linked and partially cross-linked poly(acrylate) latexes / F. Horkay, D.H. Craig // Polym. Bull. - 1998. - V.41. - P.231-237.

19. Dworak A. Polyglycidol-block-poly(ethylene oxide)-block-polyglycidol: synthesis and swelling properties / A. Dworak, G. Baran, B. Trzebicka, W. Walach // Reactive and Functional Polymers - 1999. - V.42. - P.31-36.

20. Russell AJ. The role of hydration in enzyme activity and stability: 1. Water adsorption by alcohol dehydrogenase in a continuous gas phase reactor / F. Yang, A. J. Russell // Biotechnol. Bioeng. - 1996. - V.49. - P.700-708.

21. Hnojewyj W.S. Further studies on the sorption of H20 and D20 vapors by ly- sozyme and the deuterium-hydrogen exchange effect / W.S. Hnojewyj, L.H. Reyerson // J. Phys. Chem. - 1961. - V.65. - P. 1694-1698.

22. Brausse G. Water adsorption and dielectric properties of lyophilized hemoglobin / G. Braurse, A. Mayer, T. Nedetzka, P. Schlect, H. Vogel // J. Phys. Chem. - 1968. - V.72. - P.3098 - 3105.

23. Bull H.B. Adsorption of water vapor by proteins / H.B. Bull // J. Am. Chem. Soc. - 1944. - V.66, N9. - P.1499-1507.

24. Zografi G. Water vapor sorption by peptides, proteins and their formulations / S.L. Shamblin, B.C. Hancockb, G. Zografi // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics - 1998. - V.45. - P.239-247.

25. Gregory R.B. Protein hydration and glass transition behavior, in: R. B. Gregory (Ed.), Protein-Solvent Interactions / R.B. Gregory. - New York: Marcel Dekker Inc., 1995.-P.191-263.

26. Brunauer S. Adsorption of gases in multimolecular layers / S.Brunauer, P.H. Emmett, E.Teller // J. Am. Chem. Soc. - 1938. - V.60, N2. - P.309-319.

27. Boki K. Structural analysis of collagen fibers by nitrogen adsorption method / K. Boki, N. Kawasaki, K. Minami, H. Takahashi // J. Colloid Interface Sci. -1993.-V.157.-P.55-59.

28. Boki K. Moisture sorption properties of collagen varied in polarity and porous structure by alkali-treatment. / K. Boki, N. Kawasaki, H. Takahashi // J. Colloid Interface Sci . - 1993. - V.161.-P.148-154.

29. Vrentas J.S. Hysteresis effects for sorption in glassy polymers / J.S. Vrentas, CM. Vrentas // Macromolecules - 1991. - V.24. - P.2404-2412.

30. Vrentas J.S. Sorption in glassy polymers / J.S. Vrentas, CM. Vrentas // Macromolecules - 1996. - V.29. - P.4391-4396.

31. Dlubek G. Humidity-induced plasticization and antiplasticization of Polyamide 6: af)ositron lifetime study of thelocal free volume / G. Dlubek, F. Redmann, R. Krause-Rehberg // J. Appl. Polym. Sci. - 2002. - V.84. - P.244 - 255.

32. McDowell C.C. Acetone sorption and uptake kinetic in poly(ethylene terephtha- late) / C.C McDowell, B.D. Freeman, G.W. McNeely // Polymer - 1999. -V.40.-P.3487-3499.

33. Ogilby P.R. Oxygen diffusion in glassy polymer films: effect of other gases and changes in pressure / L. Poulsen, P.R. Ogilby // J. Phys. Chem. A - 2000. -V.104.-P.2573-2580.

34. Stern S.A. Representation of gas solubility in glassy polymers by a concentration-temperature superposition principle / Y. Mi, S. Zhou, S.A. Stern // Macro-molecules - 1991. - V.24. - P.2361 -2367.

35. Favre E. Sorption of organic solvents into dense silicone membranes / E. Favre, R. Clement, Q.T. Nguyen, P. Schaetzel, J. Neel // Chem. Soc. Faraday Trans. -1993.-V.89.-P.4347-4353.

36. Sarti G.C. Solubility and diffusivity of ethanol in PTMSP: effects of activity and polymer aging / F. Doghieri, D. Biavati, G.C. Sarti // Ind. Eng. Chem. Res. - 1996 - V.35. - P.2420-2430.

37. Benson S.W. Surface areas of proteins. II. Adsorption of non-polar gases / S.W. Benson, D.A. Ellis // J. Am. Chem. Soc. - 1950. - V.72. - P.2095-2102.

38. Gorbatchuk V.V. Vapor sorption of organic compounds on human serum albumin / V.V. Gorbatchuk, M.A. Ziganshin, B.N. Solomonov, M.D. Borisover // J. Phys. Org. Chem. - 1997. - V.10. -P.901-907.

39. Gorbatchuk V.V. Supramolecular interactions of solid human serum albumin with binary mixtures of solvent vapors / V.V. Gorbatchuk, M.A. Ziganshin, B.N. Solomonov // Biophys. Chem. - 1999. - V.81. - P.107-123.

40. Castro G.R. Properties of soluble a-chymotrypsin in neat glycerol and water / G.R. Castro // Enzyme Microb. Technol. - 2000. - V.27. - P. 143-150.

41. Nemat-Gorgani M. Effect of organic solvents on stability and activity of two related alfcohol dehydrogenases: a comparative study / M. Miroliaei, M. Nemat-Gorgani // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2002. - V.34. - P.169-175.

42. Остоловский Е.М. Молекулярная организация структуры сывороточного альбумина человека / Е.М. Остоловский, А.Д. Боцянский, Н. Борисенко, Н.В. Толкачева // Биополимеры и клетка. - 1990. - Т.6, N5. - 59-64.

43. Abundo M. A stochastic model for the sigmoidal behaviour of cooperative biological systems / M. Abundo, L. Accardi, A.F. Agro, G. Mei, N. Rosato // Bio-phys. Chem. - 1996. - V.58, N3. - P.313-323.

44. Эдсолл Дж. Биотермодинамика. / Дж. Эдсолл, X. Гатфренд. - М.: Мир, 1986.-296 с.

45. Perutz M.F. Mechanism of the cooperative effects in hemoglobin revisited / M.F. Perutz, A.J. Wilkinson, M. Paoli, G.G. Dodson // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. - 1998. - V.27, N1. - P . 1-34.

46. Bettati S. T state hemoglobin binds oxygen noncooperatively with allosteric effects of protons, inositol hexaphosphate, and cloride / S. Bettati, A. Mozzarelli // J. Biol. Chem. - 1997. - V.272, N51. - P.32050-32055.

47. Mozzarelli A. Cooperative oxygen binding to Scapharca inaequivalvis hemoglobin in the crystal / A. Mozzarelli, S. Bettati, С Rivetti, G.L. Rossi, G. Colotti, E. Chiancone // J. Biol. Chem. - 1996. - V.271, N7. - P.3627-3632.

48. Gorbatchuk V.V. Homotropic cooperative binding of organic solvent vapors by solid trypsin / V.V. Gorbatchuk, M.A. Ziganshin, N.A. Mironov, B.N. Solo-monov //Biochim. Biophys. Acta- 2001. - V.1545. - P.326-338.

49. Xiwen H. Study of the nature of recognition in molecularly imprinted polymer selective for 2-aminopyridine / Z. Jie, H. Xiwen // Anal. Chim. Acta - 1999. V.381.-P.85-91.

50. Mashelkar R.A. Enhancing adsorptive separations by molecularly imprinted polymers: Role of imprinting techniques and system parameters / V.P. Joshi, M.G. Kulkarni, R.A Mashelkar // Chem. Eng. Sci. - 2000. - V.55. - P.1509-522.

51. Ladbury J.E. Just add water! The effect of water on the specificity of protein- ligand binding sites and its potential application to drug design / J.E. Ladbury // Chemistry & Biology - 1996. - V.3. - P.973-980.

52. Ke T. On enzymatic activity in organic solvents as a function of enzyme history / T. Ke, A.M. Klibanov // Biotechnol. Bioeng. - 1998. - V.57, N6. - P.746-750.

53. Orozco M. Theoretical methods for the description of the solvent effect in bio- molecular systems / M. Orozco, F.J. Luque // Chem. Rev. - 2000. - V.100, N11.-P.4187-4225.

54. Hailing P.J. High-affinity binding of water by proteins is similar in air and in organic solvents / P.J. Hailing // Biochim. Biophys. Acta. - 1990. - V.1040. -P.225-228.

55. Borisover M.D. Thermodynamics of water binding by human serum albumin suspended in acetonitrile / M.D. Borisover, V.A. Sirotkin, B.N. Solomonov // Thermochim. Acta. - 1995. - V.254, N1-2. - P.47-53.

56. Borisover M.D. Interactions of human serum albumin suspended in water- organic mixtures / M.D. Borisover, V.A. Sirotkin, B.N. Solomonov // Thermo chim. Acta. - 1996. - V.284, N2. - P.263-277.

57. Sirotkin V.A. Effect of chain length on interactions of aliphatic alcohols with suspended human serum albumin / V.A. Sirotkin, M.D. Borisover, B.N. Solo monov // Biophys. Chem. - 1997. - V.69. - P.239-248.

58. Parker M.C. Measuring enzyme hydration in nonpolar organic solvents using NMR / M.C. Parker, B.D. Moore, A.J. Blacker // Biotechnol. Bioeng. - 1995. -V.46.-P.452-458.

59. Gilli P. Enthalpy - entropy compensation in drug - receptor binding / P. Gilli, V. Ferretti, G. Gilli, P.A. Borea // J. Phys. Chem. - 1994. - V.98. - P.1515-1518.

60. Setford SJ. Immunosensing in organic and mixed aqueous-organic phase envi ronments / S. J. Setford // Trends Anal. Chem. - 2000. - V. 19. - P.330-339.

61. Klibanov A.M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? / A.M. Klibanov // Trends. Biotech. - 1997. - V.15. - P.97-101.

62. Cerovsky V. Free chymotrypsin-catalyzed synthesis of peptide bond in aliphatic alcohols with low water content / V. Cerovsky, K. Martinek // Collect. Czech. Chem. Commun. - 1989. - V.54. - P.266-276.

63. Partridge J. Activity and mobility of subtilisin in low water organic media: hy dration is more important than solvent dielectric / J. Partridge, P.R. Dennison, B.D. Moore, P.J. Hailing // Biochem. Biophys. Acta - 1998. - V.1386. - P.79-89.

64. Hailing P.J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis / P.J. Hailing // Enzyme Microb. Technol. - 1994. - V.16. - P. 178-206.

65. Yang F. The role of hydration in enzyme activity and stability: 2. Alcohol de hydrogenase activity and stability in a continuous gas phase reactor / F. Yang, A.J. Russell // Biotechnol. Bioeng. - 1996. - V.49, N6. - P.709-716.

66. Barzana E. Enzyme-catalyzed, gas-phase reactions / E. Barzana, A.M. Kli banov, M. Karel // Apll. Biochem. Biotechnol. - 1987. - V.15, N1. - P.25-34.

67. Parker M.C. In situ hydration of enzymes in non-polar organic media can increase the catalytic rate / M.C. Parker, B.D. Moore, A.J. Blacker // Biocatalysis. -1994.-V.10.-P.269-277.

68. Russell A.J. Antibody-antigen binding in organic solvents / A.J. Russell, L.J. Trudel, P.L. Skipper, J.D. Groopman, S.R. Tannenbaum, A.M. Klibanov // Bio-chem. Biophys. Res. Commun. - 1989. - V.158, N1. - P.80-85.

69. Giraudi G. Solvent effect testosterone-antitestosterone interaction / G. Giraudi, С Baggiani // Biochim. Biophys. Acta - 1993. - V.l 157. - P.211-216.

70. Urry D.W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers / D.W. Urry // J. Phys. Chem. В -1997. -V.101.-P.11007-11028.

71. Galaev I.Y. 'Smart' polymers and what they could do in biotechnology and medicine / I.Y. Galaev, B. Mattiasson // TIBTECH - 1999. - V.17. - P.335-340.

72. Urry D.W. Engineering protein-based machines to emulate key steps of metabolism (Biological energy conversion) / D.W. Urry, S.Q. Peng, L.C. Hayes, D. McPherson, J. Xu, T.C. Woods, D.C. Gowda, A. Pattanaik // Biotech. Bioeng. -1998.-V.58.-P.175-190.

73. Barron A.E. Bioinspired polymeric materials: in-between proteins and plastics / A.E. Barron, R.N. Zuckermann // Curr. Opin. Chem. Biol. - 1999. - V.3. -P.681-687.

74. Shibayama M. Thermal properties of copolymer gels containing N- isopropylacrylamide / M. Shibayama, S. Mizutani, S. Nomura // Macromole-cules - 1996. -V.29. - P.2019-2024.

75. Mukae К. Swelling of poly(N-isopropylacrylamide) gels in water-alcohol ( d - C4) mixed solvents / K. Mukae, M. Sakurai, S. Sawamura, K. Makino, S.W. Kim, I. Ueda, K. Shirahama // J. Phys. Chem. - 1993. - V.97. - P.737-741.

76. Chatterji P.R. Swelling and deswelling pathways in non-ionic poly(N— isopropylacrylamide) hydrogels in presence of additives / D. Dhara, P.R. Chatterji // Polymer - 2000. - V.41. - P.6133-6143.

77. Koga S. Effect of hydrophobic substances on the volume-phase transition of N- isopropylacrylamide gels / S. Koga, S. Sasaki, H. Maeda // J. Phys. Chem. В -2001.-V.105.-P.4105-4110.

78. Chatterji P.R. Effect of hydrotropes on the volume phase transition in poly(N- isopropylacrylamide) hydrogel / D. Dhara, P.R. Chatterji // Langmuir - 1999. -V.15.-P.930-935.

79. Yoshida M. Volume phase transitions of poly(acryloyl-L-proline methyl ester) gels in response to water-alcohol composition / A. Hiroki, Y. Maekawa, M. Yoshida, K. Kubota, R. Katakai // Polymer - 2001. - V.42. - P.1863-1867.

80. Berliner L.J. Fatty acids and retinoids bind independently and simultaneously to (3-lactoglobulin / M. Narayan, L.J. Berliner // Biochemistry - 1997. - V.36. -P.1906-1911.

81. Popot J.-L. Helical membrane protein folding, stability, and evolution / J.-L. Popot, D.M. Engelman // Annu. Rev. Biochem. - 2000. - V.69. - P.881-922.

82. Creamer L.K. Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine pMactoglobulin / L.K. Creamer // Biochemistry -1995.-V.34.-P.7170-7176.

83. Pierre A. Principes pour un procede industriel de fractionnement des proteines du lactoserum. / A. Pierre, J. Fauquant // Le Lait - 1986. - V.66. - P.405-419.

84. Perrin D.D. Purification of laboratory chemicals / D.D. Perrin, W.L.F. Ar- marego, D.R. Perrin. - Oxford: Pergamon Press, 1980.

85. A.C. СССР G 01/30/16 SU 1567973 Al. Устройство отбора и ввода проб равновесного пара в газовый хроматограф / В.В. Горбачук, А. Смирнов, И.М. Вишняков, Б.Н. Соломонов, А.И. Коновалов. - Опубл. 1990, Бюл. N20.

86. Lencka M. Verified vapor pressure data, vol. 1 / M. Lencka, A. Szafranski, A. Maczynski. Warszawa: PWN, 1984.

87. Boublik T. The vapour pressures of pure substances / T. Boublik, E. Hala, V. Fried. -Amsterdam: Elsevier, 1973.

88. Henderson S.M. A basic concept of equilibrium moisture / S.M. Henderson // Agr. Eng. - 1952. - V.33. - P.29-32.

89. Avnir D. Chemistry in noninteger dimensions between two and three. II. Fractal surfaces of adsorbents / D. Avnir, D. Farity, P. Pfeifer // J. Chem. Phys. - 1983. -V.79,N7.-P.3566-3571.

90. Burova T.V. Conformational stability and binding properties of porcine odorant binding protein / T.V. Burova, Y. Choiset, C.K. Jankowski, T. Haertle // Biochemistry-1999.-V.3 8 . -P . 15043-15051.

91. Akerstrom B. Lipocalins: unity in diversity / B. Akerstrom, D.R. Flower, J.-P. Salier // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. - V. 1482. - P. 1-8.

92. Crouzet J. Determination of apparent binding constants for aroma compounds with p-lactoglobulin by dynamic coupled column liquid chromatography / E. Jouenne, J. Crouzet // J. Agric. Food Chem. - 2000. - V.48. - P.5396-5400.

93. Haertle T. p-Lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites / E. Dufour, M.C. Marden, T. Haertle // FEBS Letters - 1990. -V.277.-P.223-226.

94. Eckert C.A. Compilation and correlation of limiting activity coefficient of nonelectrolytes in water / S.R. Sherman, D.B. Trampe, D.M. Bush, M. Schiller, C.A. Eckert, A.J. Dallas, J. Li, P.W. Carr // Ind. Eng. Chem. Res. - 1996. -V.35.-P.1044-1058.

95. Carr P.E. Critical evaluation of predicted and measured gas-liquid partition coefficient in n-hexadecane / P.E. Carr, A.J. Dallas // J. Phys. Chem. - 1994. -V.98. - P.4927-4939.

96. Bishop R. Designing new lattice inclusion hosts / R. Bishop // Chem. Soc. Rev. -1996.-V.25.-P.311-319.