КР спектроскопия и анализ динамики лазерного фотообесцвечивания, как методы исследования функционально-значимых изменений структуры белковых молекул тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

Введение.

Глава 1. КР спектроскопия в исследованиях белковых молекул.

§ 1. Техника КР спектроскопии.

1.1. История развития КР.

1.2. Основы теории КР спектроскопии.

§ 2. Особенности строения и функционирования белковых макромолекул.

2.1. Основы строения белков.

2.2. Взаимодействие белков с лигандами.

2.3. Особенности структуры белков в твердом состоянии.

2.4. Влияние органических растворителей на структуру и функции белков.

2.5. а-Химотрипсин и растительные токсины, как молекулярные машины.

§ 3. Исследование структуры и функциональных групп белков по данным КР спектроскопии.

3.1. КР спектры белков.

3.2. Определение вторичной структуры белков по спектрам в области колебаний амид I и амид III.

3.3. Установление структуры бокойых цепей .{.;.

3.4. Анализ низкочастотной спектральной области.:.

Быстрое развитие лазерное техники и лазерных технологий в последние несколько десятков лет послужило причиной появления огромного количества направлений в физике, химии, биологии и медицине, явившихся базовой основой для развития новых методов биофизики, физической химии и биохимической физики. В настоящее время методы лазерной физики являются реально незаменимыми при решении широкого круга исследовательских и прикладных задач. На стыке лазерной физики и биологии возникло новое направление исследований - лазерная спектроскопия биологических макромолекул.

Исследование структуры белков является одной из наиболее важных задач при изучении биологических молекул, так как в подавляющем большинстве случаев функциональная активность белков связана с их структурой. Опираясь на данные о структуре белков-ферментов, в частности, становится возможным создавать лекарственные препараты направленного действия с заведомо известной активностью и синтезировать новые химические препараты.

Организация молекулы белка не является случайной. Белки - сложные структуры с элементами периодичности чрезвычайно чувствительные к большому числу внешних факторов. Белок представляет собой сложную колебательную систему с запрограммированными функциями и, по сути, является молекулярной машиной, в которой перемещение отдельных функциональных групп имеет направленный характер и зависит от их структуры. Молекулы белков состоят из одинаковых элементов - аминокислот. Всего различных аминокислот двадцать, а общее число аминокислотных остатков в белке может достигать нескольких тысяч. Эти особенности делают белки похожими по химическому составу, так что основные различия между белками связаны с их размерами и структурой.

В особый класс белковых молекул выделяются белки-ферменты -биологические катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Их объединяет общая глобальная функция - осуществление превращения веществ в организме, направленное на регуляцию обмена веществ. Функционирование каждого отдельного фермента направлено на преобразование определенного субстрата. Так, например, 6 протеазы катализируют расщепление пептидных связей в белках и пептидах. Особенности структуры и функций одного белка являются характерными и для других белков-ферментов того же типа.

Большое внимание, особенно в последнее время, уделяется разработке и получению лекарственных препаратов на основе иммунотоксинов. Функционирование последних тесно связано с их структурой. Так, например, известно, что для успешного воздействия растительного токсина рицина на клетку должно происходить разделение молекулы токсина на две части, сопровождающееся разрывом дисульфидной связи между ними.

Оптические методы исследования все чаще применяются в исследованиях биологических объектов, а также биомедицинской диагностике и терапии [I, 2, 3]. Методы лазерной спектроскопии позволяют получать прямую информацию о структуре и подвижности функциональных групп биомолекул.

Лазерные источники света характеризует одновременное сочетание нескольких свойств. К ним относятся: узкая ширина полосы лазерного излучения, высокая мощность излучения и когерентность. Только сочетание этих свойств позволяет успешно проводить эксперименты по различным видам спектроскопии биологических молекул.

Лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния света (КР) является одним из самых информативных методов исследования конформации белков, наряду с рентгеноструктурным анализом и спектроскопией ЯМР. Основные преимущества метода следующие. КР спектроскопия в равной степени пригодна для исследования жидкостей, растворов, газов, пленок, поверхностей, волокон, твердых веществ и кристаллов. Кроме того, количества веществ, необходимые для исследования этим методом ограничены лишь поперечными размерами сфокусированного лазерного луча. Следует отметить, что при использовании некогерентных источников возбуждения достичь размера пятна фокусировки, сравнимого с таковым от лазерного источника, невозможно. Узкая спектральная ширина линии лазерного возбуждения и использование многоканальной системы регистрации позволяет измерять КР спектры в диапазоне от 10 до 4000 см"1. Вместе с тем, высокая мощность лазерного излучения обеспечивает получение информативных спектров даже при небольших 7 концентрациях вещества, поскольку в видимом диапазоне белки практически прозрачны. Однако, многие белковые молекулы могут быть получены лишь в незначительных концентрациях, и поэтому повышение эффективности светосбора и оптимизация оптических схем КР спектрометров представляет собой отдельную важную задачу. Методы КР спектроскопии позволяют получать уникальную информацию о структуре различных связей (пептидных, дисульфидных и т.д.) в молекулах белков.

Несмотря на малый коэффициент поглощения белков в видимой области, вопрос о воздействии лазерного излучения на молекулы белка очень актуален. Это, в частности, связано с тем, что в КР спектрах практически всех веществ присутствует широкополосный фон, интенсивность которого уменьшается во времени при облучении образца. Последнее обстоятельство наводит на мысль о возможности деструктивного воздействия лазерного излучения на исследуемое вещество. Для контроля температуры образца при облучении могут быть использованы различные методы. Оптические методы регистрации температурного поля позволяют добиться высокой точности измерений и регистрировать изменение температуры в малых объемах вещества.

Цель и задачи диссертационной работы

Целью диссертационной работы является разработка комплексного подхода для решения задачи определения функционально-значимых изменений структуры белковых молекул, происходящих при их переходе в различные агрегатные состояния и взаимодействии с веществами, способными изменить их пространственную конфигурацию; разработка модели фотообесцвечивания образцов и развитие новых методов диагностики молекул этим методом.

В диссертационной работе решаются следующие задачи:

1. Создание и оптимизация оптической схемы лазерного КР спектрометра с целью повышения его чувствительности.

2. Анализ эффекта "инверсии" функции а-химотрипсина в органических растворителях и выявление физических причин усиления этого эффекта в присутствии краун эфира. 8

3. Сравнение структуры растительных токсинов в водной среде (данные КР спектроскопии) и кристаллических образцах (данные рентгеноструктурного анализа). Определение структурных особенностей дисульфидных связей в молекулах растительных токсинов.

4. Оценка теплового воздействия лазерного излучения на жидкости и растворы при измерении КР спектров.

5. Разработка модели фотообесцвечивания водных растворов биологических молекул и сыворотки крови человека с целью проведения диагностики структуры молекул.

6. Разработка методики измерения и обработки кинетик фотообесцвечивания жидкостей и растворов.

Научная новизна

1. Методом КР спектроскопии впервые проведено исследование особенностей структуры растительных токсинов в водной среде и структурных изменений белка-фермента а-химотрипсина, связанных с "инверсией" функции.

2. Установлено, что белок-фермент а-химотрипсин может находиться, по крайней мере, в трех основных конформационных состояниях, которые соответствуют водному раствору, безводному окружению (органические растворители, лиофилизованный образец) и взаимодействию белка с 18-краун-6 в безводном окружении.

3. Впервые предложена модель, позволяющая описать процесс фотообесцвечивания растворов, опирающаяся на гипотезу о флуоресцентной природе широкополосного фона в КР спектрах.

4. Показано, что анализ кинетик фотообесцвечивания растворов биополимеров и сыворотки крови человека может быть применен для разработки принципиально нового метода диагностики структуры молекул.

5. Предложена новая модификация метода тепловой линзы, позволяющая одновременно с регистрацией КР спектров измерять локальный нагрев жидкостей, индуцированный лазерным излучением. Предложенный метод не уступает по точности известным методам измерения слабых нагревов и обладает рядом преимуществ.

Практическая ценность 9

Созданные экспериментальные установки позволяют проводить исследования структуры молекул белков в растворах, суспензиях и твердом состоянии методом КР спектроскопии и с помощью анализа кинетик фотообесцвечивания; с высокой точностью измерять нагрев жидкостей и растворов, вызванный лазерным излучением. Установки могут быть использованы для решения широкого круга задач в различных областях химии, биологии и медицины. Лазерное возбуждение позволяет выявлять имеющие функциональное значение структурные изменения биологических макромолекул.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, шести глав и заключения. Работа изложена на 133 страницах, включает 47 рисунков, 3 таблицы и список литературы из 203 наименований.

Основные результаты работы;

1. Проведена оптимизация оптической схемы лазерного КР спектрометра с целью повышения чувствительности установки и предложена методика обработки КР спектров.

2. В результате лазерного воздействия на водные растворы рицина, агглютинина рицина и связывающей субъединицы рицина происходит "выжигание" фона в КР спектрах, имеющее, по всей видимости, флуоресцентную природу. Методом время

113 разрешенной флуоресцентной спектроскопии измерены кинетики флуоресценции растворов растительных токсинов. Они хорошо аппроксимируются двухэкспоненциальным затуханием с временами жизни флуоресценции 0,8+0,1 и 4,1+0,1 не.

3. Согласно предложенной модели фотообесцвечивания (в предположении о флуоресцентной природе фона), уменьшение интенсивности фона не является многоэкс потенциальной зависимостью, а описывается интегрально заданной функцией. Кинетики фотообесцвечивания водных растворов токсинов могут быть хорошо аппроксимированы с использованием предложенной модели "выжигания". Различия в кинетиках фотообесцвечивания при непрерывном и импульсном возбуждении, по-видимому, связаны с различными термодиффузионными процессами, индуцированными лазерным излучением.

4. Молекулы а-химотрипсина в зависимости от микроокружения могут находиться в различных конформационных состояниях. Обнаружены три следующих основных состояния. Первое - отвечает водному раствору белка, второе - лиофилизованному ферменту и образцу в органических растворителях, третье - а-химотрипсину в присутствии 18-краун-6. Отличия первого и второго состояний заключаются в различии во вторичной структуре белка и конформации его дисульфидных мостиков. Во втором и третьем состояниях различается состояние поверхностных аминогрупп белка.

5. Метод лазерной КР спектроскопии позволяет определить особенности структуры молекул растительных токсинов в функционально-активном состоянии и, в этом смысле, является дополнительным по отношению к методу рентгеноструктурного анализа, предоставляющему информацию о структуре белков в кристаллах. Методом КР спектроскопии показано, что вторичная структура связывающей субъединицы рицина и конформация дисульфидных мостиков растительных токсинов различны в функционально-активном состоянии и кристалле. Получено, что дисульфидный мостик, соединяющий связывающую и активную субъединицы рицина, имеет транс-гош-транс конформацию.

6. Разработана методика и создана экспериментальная установка для высокочувствительного измерения нагрева слабо поглощающих жидкостей

114 лазерным излучением. Предложенная схема эксперимента обладает рядом преимуществ по сравнению с известными классическими схемами и позволяет определять изменения температуры образца вплоть до 10"6 К. Показано, что нагрев водных растворов белков в концентрациях с«10 мг/мл и сыворотки крови человека лазерным излучением с длиной волны X«500 нм, мощностью у

Р х 100 мВт и интенсивностью /«10 кВт/см составляет 65+4 мК и 1,5+0,3 К, соответственно. Отсюда следует, что возрастание интенсивности широкополосного фона в КР спектре сыворотки крови на начальном этапе облучения, по всей видимости, связано с проявлением процессов термодиффузии.

Защищаемые положения

1. Эксперименты по лазерному фотообесцвечиванию удовлетворительно описываются в рамках модели фотообесцвечивания водных растворов белков, построенной в предположении флуоресцентной природы фона в КР спектрах с использованием данных лазерной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением.

2. Переход рицина из кристаллического состояния в водный раствор (функционально-активное состояние) сопровождается преобразованием структуры S-S мостиков из гош-гош-гош в гош-гош-транс и транс-гош-транс конформации, а также структурным изменением связывающей субъединицы.

3. Структурные изменения молекулы белка а-химотрипсина, связанные с эффектом "инверсии" функции в органических растворителях и его усилением в присутствии краун эфира, состоят в увеличении содержания (3-структуры, переходе дисульфидных мостиков из гош-гош-транс в гош-гош-гош конформацию, усилении внешних водородных связей аминокислотных остатков тирозина и изменении состояния поверхностных аминогрупп белка.

4. Нагрев водных растворов белков в концентрациях с «10 мг/мл и сыворотки крови человека лазерным излучением с длиной волны X«500 нм, мощностью Р х 100 мВт и интенсивностью / « 10 кВт/см2 (типичные параметры, используемые при измерении КР спектров) составляет 65+4 мК и 1,5±0,3 К, соответственно.

115

В заключение мне хотелось бы выразить большую признательность и благодарность своему научному руководителю А. Ю. Чикишеву за неугасающее внимание и интерес к проведенным исследованиям, и помощь в выполнении работы.

Особенно я хотел бы отметить огромную роль в выборе тематики научных исследований, которую сыграл профессор Н. И. Коротеев.

Я благодарен И. К. Сакодынской, А. Г. Тоневицкому, И. И. Агапову, Ю. А. Савочкиной, М. Г. Гангардту, Н. Ф. Карякиной и Е. И. Дементьевой за предоставление образцов и плодотворное обсуждение результатов, В. В. Шувалову,

B. И. Шмальгаузену, Ю. М. Романовскому, А. П. Разживину, В. В. Шубину,

C. С. Букалову и А. А. Карабутову за полезные дискуссии.

116

Заключение

Практически сразу после открытия лазеров КР спектроскопия стала использоваться, как инструмент для диагностики различных веществ. Однако лазерная КР спектроскопия в первую очередь является многоаспектной задачей взаимодействия лазерного излучения с веществом.

В настоящей диссертационной работе на основе лазерной КР спектроскопии разработан комплексный подход к исследованию биологических макромолекул, находящихся в различных состояниях. Биомолекула может быть представлена в виде механического аналога, как сложная колебательная система, обладающая огромным числом степеней свободы. Лазерное излучение, возбуждая макромолекулу и рассеиваясь, несет в себе уникальную информацию о всевозможных колебаниях этой системы. Обработка спектральных данных позволяет определить структуру функционально важных элементов биомолекулы. Таким образом, разработанный подход может быть использован для изучения связи между функциями биологических молекул и их структурой.

В результате воздействия лазерного излучения на вещество при измерении КР спектров, имеет место ряд синхронных физических явлений, влияющих на регистрируемый сигнал. К ним относится нагрев вещества и связанные с ним процессы термодиффузии, а также эффект фотообесцвечивания образца, причины которого до сих пор окончательно не выяснены.

В отличие от рентгеноструктурного анализа, метод лазерной КР спектроскопии предоставляет информацию о структуре молекул в функционально-активном состоянии.

1. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. -Саратов: Издательство Саратовского университета, 1998. 384 с.

2. Tuchin V.V. Lasers and fiber optics in biomedicine. // Laser physics, 1993, v.3, №3, pp.767-820; №4, pp.925-950.

3. Tuchin V.V. Lasers light scattering in biomedical diagnostics and therapy. // Journal of • Laser Applications, 1993, v.5, №2, 3, pp.43-60.

4. Smekal A. Quantentheorie der dispersion. // Naturwissenschaften, 1923, v.l 1, pp.873. 875.

5. Ландсберг Г.С. Избранные труды, Изд. АН СССР, 1958, стр. 101-110.

6. Мандельштам Л.И. Полное собрание трудов, т.1, Изд. АН СССР, 1947, стр. 293, 305.

7. Raman C.V., Krishnan K.S. Theory of light scattering in liquids. // Philosophical Magazine, 1928, v.5, №29, pp.498-512.

8. Плачек Г. Релеевское рассеяние и раман-эффект. Перевод с немецкого А.С. Компанейца и Е.М. Лифшица. Под редакцией профессора Л. Розенкевича. -Харьков-Киев: Государственное научно-техническое издательство Украины, 1935,- 172 стр.

9. Сущинский М.М. Спектры комбинационного рассеяния молекул и кристаллов. -М.: Наука, 1969.

10. Бранд Дж., Эглинтон Г. Применение спектроскопии в органической химии. Перевод с английского М.: Мир, 1967.

11. Гилсон Т., Хендра П. Лазерная спектроскопия КР в химии. Перевод с английского М.: Мир, 1973.117

12. Колебательная спектроскопия. Современные воззрения. Тенденции развития. Перевод с английского, под редакцией А. Барнса, У. Орвилл-Томаса, М.: Мир, 1981.

13. Brandmuller J., Moser Н. Einfuhrung in die Ramanspektroskopie. Darmstadt, 1962.

14. Carey P.R. Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopies. New York: Academic Press, 1982.

15. Fluorescence Filter Selection Guide for Microscopy. 7th ed., Omega Optical, Inc., 1998, www.omegafilters.com.

16. Holographic Notch and SuperNotch® Filters. Kaiser Optical Systems, Inc., 1999, www.kosi.com.

17. Precision Interference Filters. Omega Optical, Inc., 1998, www.omegafdters.com.

18. Tedesco J.M., Owen H., Pallister D.M., Morris M.D. Principles and spectroscopic applications of volume holographic optics. // Analytical Chemistry, 1993, v.65, №9, pp.441A-449A.

19. Carrabba M.M., Spencer K.M., Rich C., Rauh D. The utilization of a holographic Bragg diffraction filter for Rayleigh line rejection in Raman spectroscopy. // Applied Spectroscopy, 1990, v.44, №96 p. 1558.

20. Schoen C.L., Sharma S.K., Helsley C.E., Owen H. Performance of a holographic supernotch filter. //Applied Spectroscopy, 1993, v.47, №3 pp.305-308.

21. Букалов C.C. Спектроскопия комбинационного рассеяния пластических кристаллов карборанов; фазовые переходы и молекулярная подвижность. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук, -М., 1986.

22. American Chemical Society Symposium Series, №102: Multichannel Image Detectors, . edited by Talmi Y. Washington, D.C.: ACS, 1979.

23. Princeton Instruments Catalog of High Perfomance Digital CCD Cameras. Princeton Instruments Inc., January, 1997.

24. Savoie R„ Pigeon-Gosselin M. Emission spectra of rare gas discharge lamps for the calibration of Raman spectrometers with excitation at 488.0 and 514.5 nm. // Canadian Journal of Spectroscopy, 1983, v.28,№4, pp.133-138.118

25. Loader J. Basic Laser Raman Spectroscopy. Heyden, London, 1970.

26. Craig N.C., Levin I.W. Calibrating Raman spectrometers with plasma lines from the argon ion laser. // Applied Spectroscopy, 1979, v.33, №5, pp.475-476.

27. Julien C., Hirlimann C. Calibration of a Raman spectrometer using the Kr+ laser plasma lines. // Journal of Raman Spectroscopy, 1980, v.9, №62, pp.62-67.

28. Физический энциклопедический словарь. M.: Советская энциклопедия, 1962, т.2, стр.420.

29. Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия, 1962, т.5, стр.105.

30. Smith W.J., Modern Optical Engineering. McGraw-Hill, New York, 1990, 2nd ed„ p.24.

31. Longhurst R.S. Geometrical and Physical Optics. Longmans, Green and Co., London, 1967.

32. Thevenon A., Flamand J., Laude J.P., Touzet B. // SPIE Proc., 1988, v.815, №136, pp.

33. Battey D.E., Slater J.B., Wludyka R., Owen H., Pallister D.M., Morris M.D. Axial transmissive /71.8 imaging Raman spectrograph with volume-phase holographic filter and grating. // Applied Spectroscopy, 1993, v.47, №11, pp.1913-1919.

34. Dong J., Dinakarpandian D., Carey P.R. Extending the Raman analysis of biological samples to the 100 micromolar concentration range. // Applied Spectroscopy, 1998, v.52, №8, pp. 1117-1122.

35. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Теория поля. M.: Наука, 1988.

36. Anfinsen С.В. Principles that govern the folding of protein chains. // Science, 1973, v. 181, №96, pp.223-230.

37. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного ' катализа. М.: Высшая школа, 1977.

38. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. Перевод с английского -М.: Мир. 1980

39. Хохлов А.Р. Статистическая физика макромолекул. М.: Наука, 1989.

40. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. М.: Мир, 1982.42. ■ Рубин А.Б. Биофизика, т.1: Теоретическая биофизика. М.: Высшая школа, 1987.119

41. Волькенштейн М.В. Молекулярная биофизика. М.: Наука, 1975.

42. Волькенштейн М.В. Биофизика. М.: Наука, 1988.

43. Chikishev A.Yu., Koroteev N.I., Otto С., Greve J. Polarization-sensitive CARS of the Amide I band of pure and liganded chymotrypsin. // Journal of Raman Spectroscopy, 1996, v.27, pp.893-896.

44. Torreggiani A., Fini G. Raman spectroscopic studies of ligand-protein interactions: the binding of biotin analogues by avidin. // Journal of Raman Spectroscopy, 1998, v.29, pp.229-236.

45. Clarkson J., Palfey B.A., Carey P.R. Probing the chemistries of the substrate and flavin ring system of p-hydroxybenzoate hydroxylase by Raman difference spectroscopy. // Biochemistry, 1997, v.36, pp. 12560-12566.

46. Karube I., Nakomoto Y., Suzuki S. Photocontrol of urease activity in spiropyran collagen membrane. // Biochimica et Biophysica Acta, 1976, v.445, pp.774-779.

47. Willner 1., Rubin S., Riklin A. Photoregulation of papin activity through anchoring photochromic azo groups to the enzyme backbone. // Journal of the American Chemical Society, 1991, v.l 13, pp.3321-3325.

48. Westmark P., Kelly J., Smith B. Photoregulation of enzyme activity. Photochromic, • transition state analogue inhibitors of cysteine and serine proteases. // Journal of the

49. American Chemical Society, 1993, v.l 15, pp.3416-3419.

50. Willner I., Willner B. Photoswitchable biomaterials as grounds for optobioelectronic devices. // Bioelectrochem. Bioenerg., 1997, v.42, pp.43-57.

51. Weston D.G., Kirkham J., Cullen D.C. Photo-modulation of horseradish peroxidase activity via covalent attachment of carboxylated-spiropyran dyes. // Biochimica et

52. Biophysica Acta, 1999, v.1428, pp.463-467.

53. Poole P.L., Finney J.L. Sequential hydration of a dry globular protein. // Biopolymers, 1983, v.22, pp.255-260.

54. Griebenow K., Klibanov A.M. Lyophilization-induced reversible changes in the . secondary structure of proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v.92, №24,pp. 10969-10976.

55. Prestrelski S.J., Tedeschi N., Arakawa Т., Carpenter J.F. Dehydration-induced conformational transitions in proteins and their inhibition by stabilizers. // Biophys. J., 1993, v.65, pp.661-671.

56. Prestrelski S.J., Arakawa Т., Carpenter J.F. Separation of freezing- and drying-induced denaturation of lyophilized proteins using stress-specific stabilizers. // Arch. Biochem. Biophys., 1993, v.303, pp.465-473.

57. Dong A., Prestrelski S.J., Allison S.D., Carpenter J.F. Infrared spectroscopic studies of lyophilization- and temperature induced protein aggregation. // J. Pharm. Sci., 1995, v.84, pp.415-424.

58. Yu N-T. Comparison of protein structure in crystals, in lyophilized state, and in solution by laser Raman scattering. III. a-Lactalbumin. // Journal of the American Chemical Society, 1974, v.96:14, pp.4664-4668.

59. Agapov I.I., Brandt N.N., Cherednikova E.Yu., Chikishev A.Yu., Dement'eva E.I.,

60. Chen M.C., Lord R.C., Mendelsohn R. Laser-excited Raman spectroscopy of biomolecules. IV. Thermal denaturation of aqueous lysozyme. // Biochimica et Biophysica Acta, 1973, v.328, pp.252-260.

61. Griebenow K., Klibanov A.M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents. // Biotechnology and Bioengineering, 1997, v.53, №4, pp.351-362.

62. Ahern Т.J., Klibanov A.M. The mechanism off irreversible enzyme inactivation at 100°C. // Science, 1985, v.228, pp.1280-1284.

63. Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. // Trends in Biochemical Sciences, 1989, v. 14, pp.141-144.

64. Dabulis K., Klibanov A.M. Dramatic enhancement of enzymatic activity in organic solvents by lyoprotectants. // Biotechnology and Bioengineering, 1993, v.41, pp.566571.

65. Dordick J.S. Designing enzymes for use in organic solvents. // Biotechnology Progress, 1992, v.8, №4, pp.259-267.

66. Triantafyllou A.O., Wehtje E., Aldercreutz P., Mattiasson B. Effects of sorbitol addition on the action of free and immobilized hydrolytic enzymes in organic media. // Biotechnology and Bioengineering, 1995, v.45, pp.406-414.122

67. Volkin D.B., Staubli A., Langer R., Klibanov A.M. Enzyme thermoinactivation in anhydrous organic solvents. // Biotechnology and Bioengineering, 1991, v.37, pp.843853.

68. Reinhoudt D.N., Eendebak A.M., Nijenhuis W.F., Verboom W., Kloosterman M., Schoemaker H.E. The effect of crown ethers on enzyme-catalyzed reactions in organic solvents. // Journal of Chemical Society, Chemical Communications, 1989, №7, p.399-400.

69. Sakodinskaya I.K., Sorokina E.M., Efremova N.V., Topchieva I.N. Enzymic activity of polymer-protein complexes in water-miscible organic solvents. // Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 1999, v.25, №6, pp.387-390.

70. J. Biol. Chem., 1988, v.263, pp.11264-11626.

71. Sasaki Т., Kise H. Effects of calcium ion on the catalytic activity of a-chymotrypsin in organic solvents. // Biosci. Biotech. Biochem., v.58, pp.1050-1053.

72. Broos J., Martin M.N., Rouwenhorst I., Verboom W., Reinhoudt D.N. Acceleration of enzyme-catalyzed reactions in organic solvents by crown ethers. // Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 1991, v.l 10, pp.222-225.123

73. Broos J., Sakodinskaya I.K., Engberson J.F.J., Verboom W., Reinhoudt D.N. Large activation of serine proteases by pretreatment with crown ethers. // J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1995, pp.255-256.

74. Broos J., Engberson J.F.J., Sakodinskaya I.K., Verboom W., Reinhoudt D.N. Activity and enantioselectivity of serine proteases in transesterification reactions in organic media. // Journal of Chemical Society, Perkin Trans., 1995, v.I, pp.2899-2905.

75. Van Unen D.J., Engberson J.F.J., Reinhoudt D.N. Large acceleration of a-chymotrypsin-catalyzed dipeptide formation by 18-crown-6 in organic solvents. // Biotechnology and Bioengineering, 1998, v.59, pp.553-556.

76. Van Unen D.J., Engberson J.F.J., Sakodinskaya I.K., Reinhoudt D.N. Crown ethers activation of cross-linked subtilisine Carlsberg crystalls in organic solvents. // Journal of Chemical Society, Perkin Trans., 1998, v.I, pp.3341-3343.

77. Sakodinskaya I.K., Ryabov A.D. Crown ether activates cholesterol oxidase in low water media. // Biotechnology Letters, 2000, v.22, pp. 173-176.

78. Zaks A., Klibanov A.M. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v.82, №10, p.3192-3196.124

79. Harper N., Dolman M., Moore B.D., Hailing P.J. Acid-base control for biocatalysis in organic media: new solid-state proton/cation buffers and an indicator. Chemistry, 2000, v.6, №11, pp.1923-1929.

80. Zacharis E., Hailing P.J., Rees D.G. Volatile buffers can override the "pH memory" of subtilisin catalysis in organic media. // Proceedings of National Academy of Science of USA, 1999, v.96, №4, pp.1201-1205.

81. Tsukada H., Blow D.M. Structure of alpha-chymotrypsin refined at 1.68 Angstroms resolution. // Journal of Molecular Biology, 1985, v.184. p.703.

82. Blevins R.A., Tulinsky A. The refinement and the structure of the dimer of alpha-chymotrypsin at 1.67 Angstroms resolution. // Journal of Biological Chemistry, 1985,• v.260, p.4264.

83. Gorbunoff M.J. Tyrosine environment differences in the chymotrypsins. // Biochemistry, 1971, v.10, pp.250-257.

84. Byler D.M., Susi H. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra. // Biopolymers, 1986, v.25, №3, pp.469-487.

85. Susi H., Byler D.M. Resolution-enhanced Fourier transform infrared spectroscopy of . enzymes. // Methods Enzymology, 1986, v. 130, pp.290-311.

86. Lord R.C., Yu N.T. Laser-excited Raman spectroscopy of biomolecules. 11. Native ribonuclease and alpha-chymotrypsin. // Journal of Molecular Biology, 1970, v.51, №2, pp.203-213.

87. Chikishev A.Yu., Lucassen G.W., Koroteev N.I., Otto C., Greve J. Polarization sensitive coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy of the amide I band ofproteins in solutions. // Biophysical Journal, 1992, v.63, pp.976-985.

88. Izatt R.M., Izatt N.E., Rossieter B.E., Christensen J.J., Haymore B.L. Cyclic polyether-protonated organic amine binding: significance in enzymatic and ion transport processes. // Science, 1978, v. 199, №4332, pp.994-996.

89. Olsnes S., Rapak A., Wesche J. Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A-chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. // Journal of Biological Chemistry, 1999, v.274, №48, pp.34443-34449.

90. Lord J.M., Roberts L.M. Toxin entry: retrograde transport through the secretory pathway. // Journal of Cell Biology, 1998, v.140, №4, pp.733-736.

91. Roberts L.M., Lord J.M., Lamb F.I., Pappin D.J.C. The primary sequence of Ricinus communis agglutinin. Comparison with ricin. // Journal of Biological Chemistry, 1985,v.260, №29, pp. 15682-15686.

92. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Temiakov D.E., Agapov I.I., Saward S., Palmer R.A. Preliminary crystallographic characterization of ricin agglutinin. // Proteins, 1997, v.28, №4, pp.586-589.

93. Pohl P., Antonenko Y., Evtodienko V.,. Pohl E., Saparov S., Agapov I., Tonevitsky A. Membrane fusion mediated by ricin and viscumin. // Biochimica et Biophysica Acta,• 1998, v.1371,№1, pp.11-16.

94. Lord R.C., Yu.N-T. Laser-excited Raman spectroscopy of biomolecules. I. Native lysozyme and its constituent amino acids. // Journal of Molecular Biology, 1970, v.50, №2, pp.509-524.

95. Harada I., Takeuchi H. Raman and ultraviolet resonance Raman spectra of proteins and related' compounds. // In Spectroscopy of Biological Systems, edited by Clark R.J.H.• and Hester R.E., p.l 13. New York: Wiley, 1986.126

96. Tu A.T. Peptide backbone conformation and microenvironment of protein side chains. // In Spectroscopy of Biological Systems, edited by Clark R. J.H. and Hester R.E., pp.47- 111.- New York: Wiley, 1986.

97. Thomas G.J., Jr. In Biological Applications of Raman Spectroscopy, v.l: Raman Spectra and the Conformations of Biological Macromolecules, edited by Spiro T.G., p. 136. New York: Wiley, 1987.

98. Li H., Hanson C., Fuchs J.A., Woodward C., Thomas G.J., Jr. Determination of the pKa values of active-center cysteines, cysteines-32 and -35, in Escherichia coli thioredoxin by Raman spectroscopy. // Biochemistry, 1993, v.32, pp.5800-5808.

99. Austin J.C., Jordan Т., Spiro T.G. Ultraviolet resonance Raman studies of proteins. // In Advances in Spectroscopy, edited by Clark R.J.H. and Hester R.E., v.20, Part A, pp.55127. New York: Wiley, 1993.

100. Miura Т., Thomas G.J., Jr. In Subcellular Biochemistry, edited by Biswas B.B. and Roy S., v.24: Proteins: Structure, Function and Engineering, pp.55-99. New York: Plenum1. Press, 1995.

101. Overman S.A., Thomas G.J., Jr. Novel vibrational assignments for proteins from Raman spectra of viruses. // Journal of Raman Spectroscopy, 1998, v.29, pp.23-29.

102. Tsuboi M., Thomas G.J., Jr. Raman scattering tensors in biological molecules and their assemblies. // Applied Spectroscopy Reviews, 1997, v.32(3), pp.263-299.

103. Yu T.J., Lippert J.L., Peticolas W.L. Laser Raman studies of conformational variations ' of poly-L-lysine. //Biopolymers, 1973, v.12, pp.2161-2176.

104. Pezolet M., Pigeon-Gosselin M., Coulombe L. Laser Raman investigation of the conformation of human immunoglobulin G. // Biochimica et Biophysica Acta, 1976, v.453, pp.502-512.

105. Lippert J.L., Tyminski D., Desmeules P.J. Determination of the secondary structure of proteins by laser Raman spectroscopy. // Journal of the American Chemical Society, 1976, v.98, pp.7075-7080.

106. Berjot M.J., Marx J., Alix A.J.P., Determination of the secondary structure of proteins from the Raman amide I band: the reference intensity profiles method. // Journal of Raman Spectroscopy, 1987, v. 18, pp.289-300.

107. Alix A.J.P., Pedanou G., Berjot M. Fast determination of the quantitative secondary structure of proteins by using some parameters of the Raman amide I band. // Journal of Molecular Structure, 1988, v. 174, pp. 159-164.

108. Tsuboi M., Suzuki M., Overman S.A., Thomas G.J., Jr. Intensity of the polarized Raman band at 1340-1345 cm"1 as an indicator of protein a-helix orientation: application to Pfl filamentous virus. // Biochemistry, 2000, v.39, pp.2677-2684.

109. Sugeta IT, Go A., Miyazawa T. Vibrational spectra and molecular conformations of dialkyl disulfides. // Bulletin of Chemical Society of Japan, 1973, v.46, №11, pp.34073411.

110. Kitagawa Т., Azuma Т., Hamaguchi K. The Raman spectra of Bence-Jones proteins. Disulfide stretching frequencies and dependence of Raman intensity of tryptophan residues on their environments. // Biopolymers, 1979, v. 18, №2, pp.451-467.

111. Weiss-Lopez B.E., Goodrow M.H., Musker W.K., Nash C.P. Conformational dependence of the disulfide stretching frequency in cyclic model compounds. // Journalof the American Chemical Society, 1986, v. 108, pp. 1271-1274.

112. Yoshida H., Matsuura H. Density functional study of the conformations and vibrations of 1,2-dimethoxyethane. // Journal of Physical Chemistry A, 1998, v. 102, pp.26912699.128

113. Thornton J.M. Disulphide bridges in globular proteins. // Journal of Molecular Biology, 1981, v.l51, pp.261-287.

114. Bicknell-Brown E., Lim B.T., Kimura T. Laser Raman spectroscopy of adrenal iron-sulfur apoprotein: the anomalous tyrosine residue at position 82. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 1981, v. 101, №1, pp.298-305.

115. Stewart В., de Groot J., Brameld J., Hester R.E. Protein structure from Raman and . ultraviolet resonance Raman spectroscopy. // In Laser Scattering Spectroscopy of

116. Biological Objects, edited by Stepanek J., Anzenbacher P. and Sedlacek B. Prague: SNTL, 1987, pp.229-248.

117. Takesada H., Nakanishi M., Hirakawa A.Y., Tsuboi M. Hydrogen-deuterium exchange of the tryptophan residues in bovine a-lactalbumin. // Biopolymers, 1976, v. 15, pp.1929-1938.

118. Verduin B.J.M., Prescott В., Thomas G.J., Jr. RNA-protein interactions nd secondary structures of cowpea chlorotic mottle virus for in vitro assembly. // Biochemistry, 1984, v.23, pp.4301-4308.

119. Shidlovskaya E.G., Schimansky-Geier L., Romanovsky Yu.M. Nonlinear vibrations in a 2-dimensional protein cluster model with linear bonds. // Zeitschrift fur Physikalische Chemie, 2000, v.214, №1, pp.65-82.129

120. Молекулярная динамика ферментов. Под редакцией Романовского Ю.М. и Эбелинга В. М.: Издательство Московского университета, 2000.

121. Brown K.G., Erfurh S.C., Small E.W., Peticolas W.L. Conformationally dependent " low-frequency motions of proteins by laser Raman spectroscopy. // Proc. Natl. Acad.

122. Sci. USA, 1972, v.69, pp.1467-1469.

123. Genzel L., Keilmann F., Martin T.P., Winterling G., Yacoby Y., Fronlich H., Makinen M.W. Low-frequency Raman spectra of lysozyme. // Biopolymers, 1976, v.15, pp.219225.

124. Peticolas W.L. Low frequency vibrations and the dynamics of proteins and polypeptides. // Methods Enzymology, 1979, v.61, pp.425-458.

125. Colaianni S.E.M., Nielsen O.F. Low-frequency Raman spectroscopy. // Journal of Molecular Structure, 1995, v.347, pp.267-283.

126. Urabe H., Sugawara Y., Ataka M., Rupprecht A. Low-frequency Raman spectra of lysozyme crystals and oriented DNA films: dynamics of crystal water. // Biophysical Journal, 1998, v.74, pp. 1533-1540.

127. Biscar J.P., Dhall P., Pennison J. Resolved Raman spectra of human serum albumin. // Physics Letters, 1972, v.39A, №2, pp.111-113.

128. Biscar J.P., Kollias N. Light scattering from albumins. // Chemical Physics Letters, 1974, v.24, №4, pp.563-564.

129. Kollias N., Biscar J.P. Pseudo-Raman broad band of stacked benzene molecules. // Chemical Physics Letters, 1974, v.26, №1, p.82-84.

130. Pogorelov V.E., Salivon G.I. // Proceedings of XX Congress AMPERE, Tallinn, 1978, p.472.

131. Yu N-T., Bando M., Kuck J.F.R., Jr. Fluorescence/Raman intensity ratio for monitoring the pathologic state of human lens. // Investigative Ophthalmology and Visual Science, 1985, v.26, ;№1, pp.97-101.

132. Букалов С.С., Лейтес Л.А. О так называемом "фоне" в спектрах КР. // Оптика и спектроскопия, 1984, т.56, вып.1, стр.10-12.130

133. Jeziorowski H., Knozinger H. Laser induced electronic excitation of surface hydroxide ions and scattering background in laser Raman spectra of oxide surfaces. // Chemical Physics Letters, 1977, v.51, №3, pp.519-522.

134. Splett A., Splett Ch., Pilz W. Dynamics of the Raman background decay. // Journal of Raman Spectroscopy, 1997, v.28, pp.481-485.

135. Гачковский В.Ф. // ДАН, 1960, т.133, №6, c.1358.

136. Гачковский В.Ф. // ДАН, 1962, т.143, №1, с.150.156'.Гачковский В.Ф. // Журнал структурной химии, 1970, т.11, №6, с.1072.

137. Dickson R.M., Cubitt А.В., Tsien R.Y., Moerner W.E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. // Nature, 1997, v.388, pp.355-358.

138. Creemers T.M., Lock A.J., Subramaniam V., Jovin T.M., Volker S. Photophysics and optical switching in green fluorescent protein mutants. // PNAS, 2000, v.97, №7,pp.2974-2978.

139. Biscar J.P., Kollias N. Pseudo-Raman behavior of the scattering broad band of BSA. // Polymers Letters, 1973, v.l 1, pp.725-729.

140. Larsson K., Hellgren L., A study of the combined Raman and fluorescence scattering from human blood plasma. // Experientia, 1974, v.30, pp.481-483.

141. Simhi R., Gotshal Y., Bunimovich D., Sela B-A., Katzir A. Fiber-optic evanescent-wave spectroscopy for fast multicomponent analysis of human blood. // Applied Optics, 1996, v.35, pp.3421-3425.

142. Berger A.J., Itzkan I., Feld M.S. Near-infrared Raman spectroscopy of human whole blood and serum. // SPIE, 1997, v.2982, pp.87-90.

143. Verma S.P., Wallach D.F.H., Philippot J.R., Zanca M., Bonnet B. Abnormal Raman scattering by plasma of patients with cancer. // Journal of the National Cancer Institute, 1987, v.78, №3, pp.587-589.131

144. Wenchong L. Some fluorescence observation on the cancernation tissue and the blood of cancer patients. // SPIE, 1989, v. 1054, pp. 196-199.

145. Verma S.P. Method of using resonance Raman spectroscopy for detection of malignancy disease. // United States Patent, 1989, №4832483.

146. Berger A.J., Itzkan I., Feld M.S. Feasibility of measuring blood glucose concentration by near-infrared Raman spectroscopy. // Spectrochimica Acta, Part A, 1997, v.53, pp.287-292.

147. Madhuri S., Aruna P., Summiya Bibi M.I., Gowri V.S., Koteeswaran D., Ganesan S. Ultraviolet fluorescence spectroscopy of blood plasma in the discrimination of cancer from normal.//SPIE, 1997, v.2982, pp.41-45.

148. Rein A.J., Saperstein D.D., Pines S.H., Radlick P.C. Blood plasma investigations by resonance Raman spectroscopy: detection of carotenoid pigments. // Experientia, 1976, v.32, №10, pp.1352-1354.

149. Verma S.P., Philippot J.R., Bonnet В., Sainte-Marie J., Moschetto Y., Wallach D.F.H. Raman studies of structural rearrangements induced in human plasma lipoprotein carotenoids by malondialdehyde. // Lipids, 1985, v.20, №12, pp.890-896.

150. Wolfbeis O.S., Leiner M. Mapping of the total fluorescence of human blood serum as a new method for its characterization. // Analytica Chimica Acta, 1985, v. 167, pp.203' 215.

151. Xu X., Meng J., Hou S. The characteristic fluorescence of the serum of cancer patients. // Journal of Luminescence, 1988, v.40&41, pp.219-220.

152. Гусев В.Э., Карабутов A.A. Лазерная оптоакустика. -M.: Наука, 1991.

153. Hutchins D.A. Non-contact ultrasonic transducers for NDT. // Nondestructive Testing Communications, 1983, v.l, №2, pp.37-53.

154. Liebe R.C.C., Moore R.S., Whinnery J.K. Low absorption measurements by means of the thermal lens effect using an He-Ne laser. // Applied Physics Letters, 1964, v.5, №7, pp.141-143.

155. Long M.E., Swofford R.L., Albrecht A.C. Thermal lens technique: a new method of absorption spectroscopy.// Science, 1976, v.l91, №4223, pp. 183-185.132

156. Boccara A.C., Fournier D., Jackson W., Amer N.M. Sensitive photothermal deflection technique for measuring absorption in optically thin media. // Optics Letters, 1980, v.5, pp.377-379.

157. Tarn A.C. Applications of photoacoustic sensing techniques. // Reviews of Modern Physics, 1986, v.58, №2, pp.381-431.

158. Brueck S.R.J., Kildal I., Belanger L.J. // Optics Communications, 1980, v.34, p. 199.

159. Jackson W.B., Amer N.M., Boccara A.C., Fournier D. Photothermal deflection spectroscopy and detection. // Applied Optics, 1981, v.20, pp.1333-1344.

160. Roger J.P., Gleyzes P., El Rhaleb H., Fournier D., Boccara A.C. Optical and thermal characterization of coatings. // Thin Solid Films, 1995, v.261, pp. 132-13 8.

161. Ash E.A., Ameri S., Neuman V., Petts C.R. Photo-displacement imaging. // Electronics Letters, 1981, v.17, №10, pp.337-338.

162. Miranda L.C.M. Photodisplacement spectroscopy of solids: theory. // Applied Optics, 1983, v.22, №18, pp.2882-2887.

163. Commandre M., Roche P. Characterization of optical coatings by photothermal deflection. // Applied Optics, 1996, v.35, №25, pp.5021-5034.

164. Pershin S.M., Bunkin A.F. Detection of water heating by second harmonic Nd:YAG laser pulses using spontaneous Raman scattering spectrum. // Optics and spectroscopy, 1999, v.87, №3, pp.376-379.

165. Матвеев A.H. Оптика. M.: Высшая школа, 1985.

166. Виноградова М.Б., Руденко О.В., Сухоруков А.П. Теория волн. 2-ое издание. -М.: Наука, 1990.

167. Звелто О. Физика лазеров. -М.: Мир, 1979.

168. Palmer С. Diffraction grating handbook. 4th edition, New York: Richardson Grating Laboratory, 2000.

169. Wilson H.W. The infrared and Raman spectra of a- and (3-pinenes. // Applied Spectroscopy, 1976, v.30, №2, pp.209-212.

170. Savitzky A., Golay M.J.E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. // Analytical Chemistry, 1964, v.36, №8, pp. 1627-1639.133

171. Press W.H, Teukolsky S.A. Savitzky-Golay smoothing filters. 11 Computers in Physics, 1990, v.4, №6, pp.669-672.

172. Разживин А.П., Михайлюк И.К. Способ вычитания низкочастотного фона из массивов (спектральных) данных биологического происхождения. // Депонированная рукопись в ВИНИТИ, -М., 2000, 22 стр.

173. Палто С.П. Эффекты молекулярного поля в пленках Ленгмюра-Блоджетт: оптика и Штарк-спектроскопия. // Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук.-М., 1998.

174. Матвеев А.Н. Молекулярная физика. -М.: Высшая школа, 1987.

175. Бутковский А.Г. Структурная теория распределенных систем. -М.: Наука, 1977.

176. Бутковский А.Г. Характеристики систем с распределенными параметрами. -М.: Наука, 1979.

177. Tonevitsky A.G., Zhukova O.S., Mirimanova N.V., Omylyanenko V.G., Timofeeva N.V., Bergelson L.D. Effect of gangliosides on binding, internalization and cytotoxic activity of ricin. // FEBS Letters, 1990, v.264, №2, pp.249-252.

178. Levitt M., Greer J. Automatic identification of secondary structure in globular proteins. // Journal of Molecular Biology, 1977, v.l 14, pp. 181-293.

179. Брандт H.H., Молодоженя B.B., Сакодынская И.К., Чикишев АЛО. КР спектроскопия комплекса триса-(гидроксиметил)аминометана с краун-эфиром. // Журнал Физической Химии, 2000, т.74, №11, с.2051-2055.

180. Mlsna D., Monzingo A.F., Katzin В.J., Ernst S., Robertus J.D. Structure of recombinant ricin A chain at 2.3 A. // Protein Science, 1993, v.2, №3, p.429-435.

181. Rutenber E., Katzin B.J., Ernst S., Collins E.J., Mlsna D., Ready M.P., Robertus J.D.

182. Crystallographic refinement of ricin to 2.5 A. // Proteins, 1991, v. 10, №3, p.240-250.

183. Тучин B.B., Миронычев А.П. Оптико-акустическая спектроскопия в биологических и медицинских исследованиях. // Зарубежная радиоэлектроника, 1986, №9, с.51-73.