Масс-спектрометрическое исследование реакций дейтероводородного обмена ионов биоорганических молекул с дейтероаммиаком с использованием радиочастотного сегментированного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

ЧУДИНОВ Алексей Владимирович

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ДЕЙТЕРОВОДОРОДНОГО ОБМЕНА ИОНОВ БИООРГАНИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ С ДЕЙТЕРОАММИАКОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАДИОЧАСТОТНОГО СЕГМЕНТИРОВАННОГО КВАДРУПОЛЯ В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ИОННОГО РЕАКТОРА

01 04 17 — химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёндй,£т01р|нр 2007 кандидата физико-математических наук

003 158Т6В

Черноголовка 2007 г

Работа выполнена в Филиале Института энергетических проблем химической физики РАН в лаборатории «Масс-спектрометрия в энергетике и экологии»

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор физико-математических наук Зеленов Владислав Валерьевич

кандидат физико-математических наук Сурин Алексей Константинович

доктор физико-математических наук Морозов Игорь Иллиодорович

Институт проблем химической физики РАН

Защита диссертации состоится «34 »0/СЛ1 2007 г в часов на

заседании диссертационного совета Д 002 112 01 при Институте энергетических проблем химической физики РАН по адресу 119334 Москва, Ленинский проспект, 38, корпус 2, ИНЭПХФ РАН, актовый зал

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова РАН

Автореферат разослан «

» с€м П ¿¿й^эЛ 2007 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002 112 01 кандидат химических наук

Николаева М И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность'.

1 Перспектива расширения аналитических возможностей метода масс-спектрометрии, как инструмента для изучения особенностей газофазной конформационной структуры биологических ионов

2 Информация об устойчивых конформационных состояниях биомолекул в газовой фазе имеет как фундаментальную, так и практическую ценность Сюда можно включить

• изучение влияния водной среды на процесс организации и функционирования биологических макромолекул,

• уточнение природы внутримолекулярных взаимодействий, ведущих к формированию нековалентных структур в биологических системах

3 Потребность в определении мест селективного протонирования в газофазных ионах белков и полипептидов для более глубокого понимания механизмов перехода таких ионов в вакуум в современных источниках ионизации МАЬВ1 и ЕБ1

Целью настоящей работы является:

Исследование возможности использования сегментированного радиочастотного квадруполя, расположенного в атмосферном интерфейсе времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов, в качестве ион-молекулярного реактора для изучения кинетики реакций Н/Б-обмена в биоорганических ионах

Для достижения поставленной цели были сформулированы задачи:

• Разработка методики численной обработки временной последовательности экспериментально полученных масс-спектров дейтерированных продуктов для вычисления кинетических параметров реакций изотопного обмена

• Реализация экспериментального метода исследования, включая

a) Определение величин подвижности ионов аминокислот и полипептидов в продольном электрическом поле сегментированного радиочастотного квадруполя

b) Исследование кинетики НЛЭ-обмена ряда биомолекулярных ионов с дейтерированным аммиаком внутри сегментированного радиочастотного квадруполя при задании времени контакта этих ионов с газом-реагентом напряженностью продольного электрического поля и последующим детектированием ионов-продуктов времяпролетным масс-спектрометром с ортогональным вводом ионов

Основные защищаемые положения:

• Методика численной обработки масс-спектров молекулярных ионов аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе протекания процесса Н/Б-обмена в этих ионах

• Механизм стабилизации ион-молекулярных комплексов ионов аминокислот с молекулами дейтероаммиака через диссипацию избыточной энергии на внутренних степенях свободы этих комплексов

• Эффективные константы скорости реакции Н/Б-обмена в ионах аминокислот, усредненные по всем наблюдаемым процессам НЛЭ-замещений и находящиеся в диапазоне ~10~п-10"10 см3с"', при использовании дейтерированного аммиака в качестве дейтерирующего агента

• Разрешение групп активных атомов водорода, участвующих в реакциях Н/Э-обмена с разными скоростями, в ионах грамицидина Б и лейцин-энкефалина

Научная новизна:

• Предложена оригинальная методика расчета кинетических параметров НЛЭ-обмена, которая использует связь наблюдаемых интенсивностей масс-спектральных линий с концентрацией активных центров исходного иона-реагента Разработанный подход применим для сложных биоорганических молекул, для которых изотопное распределение является неразрешенным

• Продемонстрированы возможности сегментированного радиочастотного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора для исследования H/D-обмена в биомолекулярных ионах

Научная и практическая ценность:

• Разработанный метод определения кинетических параметров процесса H/D-обмена в сложных биоорганических ионах является универсальным Он применим для широкого круга ионов биомолекул и газов-реагентов

• Сегментированный радиочастотный квадруполь, предлагаемый в качестве молекулярно-ионного реактора для изучения H/D-обмена, может применяться как атмосферный интерфейс во времяпролетных масс-спектрометрах с целью расширения их аналитических возможностей

Личный вклад автора

Автором разработана численная методика для исследования кинетики реакций изотопного обмена при масс-спектрометрическом детектировании продуктов реакции Автор непосредственно участвовал в обосновании, постановке и проведении всех экспериментов, их интерпретации и обобщении полученных результатов

Апробация работы:

Результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях Международная конференция "Desorption-2004", Санкт-Петербург, Россия, 2004, 2-я Международная семинар-школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород , 2004, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых), Международная конференция американского масс-спектрометрического общества, Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, San Antonio, USA, 2005, I Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», Москва, 2005, Конференция «Научные школы Черноголовки -

молодежи», Черноголовка, 2006, 3-я Международная конференция-школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 2007, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых)

Объем и структура диссертации:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы Объем диссертации составляет 110 страниц, включая 42 рисунка и 7 таблиц Список литературы содержит 101 наименование

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснованы выбор и актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная новизна и практическая значимость

Глава 1. Литературный обзор. Сдечан обзор по результатам экспериментов, подтверждающих возможность существования устойчивых конформационных состояний у биомолекулярных ионов в газовой фазе Дано краткое описание методов исследования газофазных конформационных структур белковых молекул с использованием масс-спектрометрии Сделан детальный обзор по исследованию конформационных состояний молекулярных ионов белков и полипептидов в газовой фазе с использованием реакций газофазного НЮ-обмена с последующим масс-спектрометрическим детектированием образующихся продуктов Описаны преимущества и особенности методики, используемой в диссертационной работе

Глава 2. Методика проведения экспериментов. Описана экспериментальная установка Приведен список используемых реактивов Описана процедура проведения экспериментов и подходы, используемые при изучении

кинетики химических процессов методом времяпролетной масс-спектрометрии

Экспериментальная установка представляет собой времяпролетный масс-спектрометр с ортогональным вводом ионов (о-ВПМС) Ионы аминокислот и полипептидов получают в источнике ионизации электрораспылением В качестве молекулярно-ионного реактора используется сегментированный радиочастотный квадруполь (RFQ) (рис 1), находящийся во второй ступени дифференциальной откачки атмосферного интерфейса о-ВПМС Ионы попадают внутрь реактора из первой ступени дифференциальной откачки атмосферного интерфейса о-ВПМС (рис 1(1)) Под действием эффективного потенциала радиочастотного поля (рис 1(7)) и соударений с молекулами газа ионы стягиваются к оси RFQ Под действием постоянного продольного электрического поля (рис 1(6)) ионы двигаются с постоянной дрейфовой скоростью в атмосфере буферного газа ко входу во времяпролетный масс-анализатор Основной составляющей буферного газа является N2 газовой завесы источника ESI Время нахождения ионов внутри RFQ определяется формулой

t = l¡ кЕ, (1)

где /=17 см длина квадруполя, Е - напряженность продольного электрического поля, к - подвижность исследуемых ионов в электрическом поле

Измерение подвижности в электрическом поле ионов девяти аминокислот {Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Туг, Lys), а также двух- и однозарядных ионов грамицидина S, однозарядных ионов лейцин-энкефалина и двухзарядных ионов полипептида HR2 проводилось непосредственно в процессе выполнения работы по методике, разработанной ранее В диссертации приводится описание этой методики и таблица с полученными значениями ионных подвижностей

I МП].

- . г-q Рис. 1, Схема молекулярно-

|\п.л -Iii 'l" ' fv ■■■ "" í ,-i ,

i |ft ix^. . / ионного реактора: i -

г/ ¡ '!".' . . . .'..', / протоиированные ионы

иол ипептидов;2 - баллон с " ННННШНПШШ дейтерирующей смесью; 3 -

Т? игольчатый вентиль для

Г подачи дейтерирующей смеси

^ ¡ ^ S/' в реактор; 4 - датчик

давления ra ía а реакторе; 5 -радиочастотный квадруполь ÍRFQH

6 принципиальная электрическая схема подачи поеюйнного электрического поля на RFQ; 7 принципиальная электрическая схема подачи радиочастотного электрического поля на RFQ: 8 - орто-время-пролетный масс-спектрометр.

Для проведения реакций H/D-обмена внутрь RFQ через игольчатый вентиль рис. 1(3) подавалась дейтерирующая смесь, представляющая собой ND;,. разбавленный в N:. Концентрация дейтерируюшего агента в реакторе рассчитывалась по формуле;

IND,] = , (2)

где ср- содержание в дейтерирующей смеси и долях; р- давление в реакторе, бар; рп- остаточное давление воздуха в реакторе в отсутствие подачи дейтерирующей смеси, бар; n¡- число Лошмидта (п, = 2.44 х IО'1' см" бар"1).

Все расчеты кинетики реакции в работе производили, пренебрегая переносом ионов вдоль оси RFC) за счет продольной диффузии на основании малости его вклада, что следует из выполнения неравенства;

4кО/(кЕ)2 <0,1 (3)

где D - коэффициент диффузии, а к - эффективная константа реакции. I [еравенство (3) остаётся справедливым практически во всех случаях.

Глава 3. Модельное описание кинетики H/D-обмена в про тонированных ионах аминокислот и по.ш пептидов. Выведещ уравнение, связывающее

наблюдаемую зависимость изотопного распределения относительных интенсивностей в масс-спектральных линиях исследуемого иона с изменением содержания атомов дейтерия (D) в независимых реакционных центрах Предложена кинетическая модель обратимого протекания реакций H/D-обмена и на ее основе предложен метод расчета кинетических параметров H/D-обмена Оценена чувствительность этого метода

Величина сдвига изотопного распределения в результате реакции H/D-обмена может быть выражена через относительные интенсивности масс-спектральных пиков изотопного распределения иона в виде

V(0=Zy (4)

J

где Ij - относительная интенсивность у-го пика Иону, содержащему только самые легкие изотопы в уравнении (4), присваивается порядковый номер у=О Здесь и далее мы будем предполагать равенство относительных интенсивностей пиков в масс-спектре их относительным концентрациям в долях от суммарной концентрации наблюдаемых ионов-продуктов

J

Процесс H/D-обмена представляет собой сумму химических реакций, приводящих к накоплению атомов D в независимых реакционных центрах ионов биомолекул

Л (0=2>М0+8, (5)

где п" - количество активных атомов в ¿-том независимом центре, n,(t) -относительная концентрация атомов D в /-том центре в момент времени t, параметр 5 введен для учета природных изотопов, присутствующих в исходных ионах (5=т)(0)) Каждая функция n,(t) является решением системы дифференциальных кинетических уравнений, описывающих кинетику изменения относительной концентрации атомов D в /-том центре по всем возможным продуктам

Для больших молекул белков в высоких зарядовых состояниях пики отдельных ионов в изотопном распределении могут быть неразрешимы В этом случае предлагается метод вычисления величины сдвига изотопного распределения с использованием следующего выражения

Мшах IZ

JМ l{t,M /z)i{M /z)

= *--M«nn> (6)

}l(t,M/z)d(M/z)

мтт / г

где I(M/z) - интенсивность масс-спектра в точке с абсциссой M/z, величина Мтт соответствует молекулярной массе иона, содержащего только самые легкие изотопы, а Мтах - самые тяжелые В диссертационной работе приводится доказательство справедливости уравнения (6)

Для численной обработки экспериментальных данных по кинетике H/D-обмена в работе использовано аналитическое выражение, следующее из рассмотрения реакции замещения каждого отдельного атома Н на атом D, как независимого процесса Уравнение (5) с точки зрения предлагаемой модели будет иметь вид

= (7)

где

К?* =а^[К03] + (1-а)А;,я[М03] + ^ф[Н] (8)

В уравнениях (7) и (8) а - относительное содержание D в ND3 (0<а<1), kf, к" - константы скорости прямой и обратной реакций H/D-обмена, происходящих в результате взаимодействия исследуемых ионов с молекулами аммиака, для каждого /-того атома Н Для учета возможной обратной реакции H/D-обмена, происходящей в результате взаимодействия с водородсодержащими примесями в реакторе, в уравнении (8) присутствует член к1'{Н]

На основании уравнения (7) при анализе полученных в работе зависимостей т|ж"(0, пример которых представлен на рис 2, использовалось выражение

При этом величина Р, соответствует числу атомов Н, обменивающихся с г-тым набором одинаковых, с точки зрения достигаемой точности измерения, констант скорости Количество наборов кинетических параметров (а„Ь,) в модельном выражении (9) определялось из адекватности описания экспериментальных данных выбранной зависимостью в пределах экспериментальных ошибок Критерием такой адекватности является соответствие величины минимального значения функционала при заданном числе наборов (а„ Ь,)

числу точек на экспериментальной зависимости - Л" В уравнении (10) о„ соответствует измеренному опытным путем среднеквадратичному отклонению экспериментальных результатов от среднего значения величины тГЧО при заданном постоянном I

(9),

где

(Ю)

р, мкбар

36 6 29 2 24 8 219 201 191

Рис. 2. Зависимости г|(/) для протонированных ионов гистидина, полученные при разных давлениях дейтерирующей смеси в реакторе

оо

о

2

4

6

8

<:, мс

Оценка чувствительности выбранной методики при разрешении скоростей протекания H/D-обмена на разных реакционных центрах показывает, что порог такого разрешения при величинах а„, достигаемых в нашей работе, соответствует константам скорости химической реакции, которые различаются примерно в четыре раза

Глава 4. Экспериментальные результаты и их обсуждение. Приведены экспериментальные данные по исследованию кинетики химических процессов, протекающих при взаимодействии ионов девяти аминокислот (Ala, Asp, Arg, Glu, His, Ile, Lys, Pro, Туг) и трех полипептидов (лейцин-энкефалин, грамицидин S, пептид HR2) с молекулами ND¡ Предложена схема образования стабильных ион-молекулярных комплексов ионов семи аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Туг, Pro, His) с молекулами дейтероаммиака, наблюдаемых в полученных масс-спектрах На основании предложенной схемы выведены выражения для аппроксимации экспериментальных зависимостей относительной интенсивности масс-спектральных пиков комплексов от времени контакта С использованием полученных выражений определены константы скорости реакций комплексообразования для пяти аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Туг) Приведены результаты обработки масс-спектральных линий с помощью методики, описанной выше, с целью получения величин констант скорости H/D-обмена, специфичных для индивидуальных активных атомов

4.1 Кинетика образования нековалентносвязанных комплексов ионов аминокислот с ND3

Помимо продуктов H/D-обмена протонированных ионов аминокислот и полипептидов в экспериментально полученных масс-спектрах наблюдались пики, соответствующие по M/z устойчивым ион-молекулярным комплексам протонированных аминокислот с ND3 (рис 3)

е в о

в § 4

93 Н о <и ег

в . Ч 2 о И

АярН

130

135

134 136 138 140

С)

152 / 156 160

[АврН N0/

Д I,

140

145 Шг

150

155

160

Рис. 3. Интенсивности дейтерированных ионов (Аяр+Н+) и стабилизированных нековалентносвязанных комплексов этих ионов с молекулами Ы03 (пики продуктов со степенью дейтерирования г и соответствующие им комплексы обозначены на рисунке символами Б,) Масс-спектр, представленный в качестве примера, получен при проведении исследования Н/Б-обмена в ионах (Ахр+Н+), концентрация [И03] = 2 2 х 1012 см"3, время реакции £ = 8 3 мс

Была предложена схема процессов, приводящих к появлению масс-спектральных линий комплексных ионов аминокислот с дейтероаммиаком

А+ + Ш3 к+ > А 1ЧН3+*

А ИН3+* к~ ) А+ +ЫН3 А >Мз+*+М ^ ) А Ш3+ + М* А 1ЧН3+ + М* кт > А ИНз+* + М

(П)

В представленной схеме А - это ион аминокислоты, А ЫН3 - комплексный ион В качестве М, как предполагалось первоначально, выступают степени свободы молекул буферного газа, с которыми происходят процессы обмена энергией, приводящие к стабилизации или возбуждению комплексных ионов Из решения системы дифференциальных уравнений, соответствующих механизму химических реакций (схема (11)) получено выражение,

описывающее динамику изменения относительных интенсивностей масс-спектральных линий стабильных комплексов, исходя из условия квазиравновесности для концентрации возбужденных комплексов

Ш NHJ

ksk+[ NH3] + /Ucr

1-ехр

k_+ks[M]

[M]t

(12)

о 0 60 40 2 0 0

0

4 6

/, мс

Рис. 4. Зависимости относительной интенсивности нековалентносвязанных комплексов протонированных ионов Asp с ND3 (/ANH<) от

времени реакции, полученные при разных давлениях

Из аппроксимации наблюдаемых временных зависимостей относительной интенсивности масс-спектральных линий комплексов (рис 4) выражением (12) найдены значения параметра

К

(13)

k_+ks[M]

для ионов пяти аминокислот Ala, Asp, Glu, Ile и Туг при нескольких давлениях Зависимости К"11 для Asp, Glu и Ile оказались линейными по давлению (рис 5) Для остальных ионов аминокислот соответствующие комплексы получались в очень малых количествах, и данных, на основании которых можно было бы сделать определенные утверждения о характере таких зависимостей, недостаточно Исходя из наблюдающихся зависимостей K?ff от р, имеющих линейный характер, предложен механизм комплексо-образования, при котором в качестве третьего тела - М(схема(11)) участвуют внутренние степени свободы самих комплексов Предположение о механизме внутренней диссипации избыточной энергии в ион-молекулярных комплексах сделано на основании того, что в противном случае зависимости К^должны быть квадратичны по давлению

Все полученные экспериментальные зависимости Keí< от давления были аппроксимированы выражениями линейной регрессии, и с учетом уравнения (2) были рассчитаны величины эффективных констант комплексообразования для ионов аминокислот Asp, Ala, Glu, Ile и Туг - Xе Полученные величины сведены в табл 1

300-

200

Sí

30 36 р, мкбар

Рис. 5. Зависимости К^ от давления в реакторе, полученные для ионов аминокислот Asp, Ile и Glu

Таблица 1. Эффективные константы скорости комплексообразования протонированных аминокислот с ND3

Аминокислота j^xlo15, cmy1

Asp 14 5±0 2

Ala 2 0±0 3

Glu 4 1±0 2

Ile 8 6±0 2

Туг 9 1±0 8

4.2 Кинетика Н/О-обмена в ионах аминокислот

Полученные зависимости г|(7) для всех исследованных протонированных ионов аминокислот в пределах погрешностей экспериментальных измерений удовлетворительно описываются уравнением Т1 (0 = а(1 - ехр(- Ы)) + 5 (14)

Правильность такого описания подтверждается соответствием величины минимального значения функционала (10) числу экспериментальных точек для всех исследованных аминокислот

Кривые г|(0 для всех аминокислот были аппроксимированы модельной зависимостью (14) Исходя из величин параметров аяЬ (уравнение (14)),

15

полученных при разных давлениях дейтерирующей смеси, и с учетом величины максимально наблюдаемой степени Н/Б-обмена - Р, для всех аминокислот были рассчитаны величины констант Кв (уравнение (9)) К° = ак°,

где к° - константа скорости Н/О-обмена в ионе аминокислоты, усредненная по всем активным атомам водорода, принимающим участие в наблюдаемом процессе Рассчитанные значения представлены в табл 2 Полученные величины близки к величинам центроспецифичных констант скорости НЛ> обмена, которые приводятся другими авторами

Таблица 2. Эффективные константы скорости НЯЭ-обмена и энергии сродства к протону исследованных аминокислот

Аминокислота P PA, ккал моль"1 Ä^xlO10, см3 с"1

Ala 4 215 5 2 35±0 05

Asp 5 217 2 3 0±0 5

Glu 5 2182 1 6±0 2

Ile 4 2193 4 0±0 1

Pro 3 220 0 1 7±0 3

Туг 4 221 3 3 0±0 3

His 4 236 1 2 9±0 2

Lys 5 238 0 0 8±0 1

Arg 2 251 2 0 7±0 1

В некоторых работах указывается на возможность корреляции скорости НЛЗ-обмена с разностью в энергиях сродства к протону между Дей-терирующим агентом и ионом аминокислоты В связи с этим значения констант скорости К° (табл 2) были отложены от соответствующих величин разностей в энергиях сродства к протону, ДРА, между аммиаком (РАН0^ =204

ккал моль"1) и ионом аминокислоты (табл 2) Результат представлен на рис 6

'u

S 30

о ** "в X

15i

00

I I

В Ala

-< Asp

"• Glu

■ lie a Pio

* Tyr

* His

* Ljs

■ Arg

Рис. 6. Значения К , отложенные от соответствующих значений АРА для протони-рованных аминокислот

J0 20 30 40

АРА, ккал моль*

Как видно из рис 6, аминокислоты Lys и Arg, обладающие самыми большими величинами АРА, имеют наименьшие значения К" В аминокислоте His скорость H/D-обмена сильно превышает величину, ожидаемую на основании величины ее энергии сродства к проюну По-видимому, высокая скорость реакции H/D-обмена в ионе His объясняется тем, что реакция протекает через мостиковый водородносвязанный комплекс, образованный молекулой ND-, между атомами азота амино- и имидазольной функциональных групп (рис 7)

/

N — СИ-С—ОН

I

СПг

V>i\

1>—n —сн-с—он

в I.

H-N.

Рис. 7. Реакция H/D-обмена i мостиковом комплексе, образованном ионом His с молекулой ND-!

Ml

4.3 Кинетика Н/О-обмена в ионах полипептидов

При численной обработке экспериментальных результатов исследования кинетики Н/О-обмена в ионах полипептидов возникают неопределенности в установлении максимальной степени дейтерирования, характерной для данного иона полипептида вследствие более сложного характера изотопных распределений этих ионов, чем у протонированных аминокислот Поэтому точные числа активных атомов Н (обозначение Р, в уравнении (9)), участвующих в реакции Н/Т)-обмена в ионах полипептидов,

не определялись Таким образом, полученные для протонированных полипептидов константы скорости реакции имеют физический смысл суммарной скорости Н/В-обмена активных атомов /-той группы, обменивающихся с неразличимым с точки зрения погрешности измерений скоростями, при единичной концентрации N03

Из уравнения (9) следует связь между определяемым из эксперимента произведением а1Ь1 и кинетическими параметрами реакции Н/В-обмена

арг =аА:в[>ГО,]/; (15)

Выражение, стоящее справа от знака равенства, имеет смысл скорости обмена /-той группы атомов Н при заданной постоянной концентрации молекул К03 Исходя из линейной зависимости этого выражения от концентрации М)3, было найдено значение константы скорости реакции Н/В-обмена /-той группы активных атомов И К. = ак"Р:

Далее величину К, использовали в качестве сравнительной характеристики реакционной активности независимых центров протекания Н/В-обмена в ионах полипептидов Значения К„ полученные в работе для всех исследованных форм ионов полипептидов, сведены в табл 3

Таблица 3. Константы скорости Н/В-обмена в реакционных центрах ионов полипептидов

Полипептид Заряд иона в элементарных единицах К,х1010, см3«:"1 К2х10и, см3«:"1

Грамицидин 5 +2 1 7±0 1 1 6±0 2

+1 0 016±0 001 —

Лейцин-Энкефалин +1 1 5±0 1 ~0 01

Пептид НК2 +2 1 4±0 1 —

В двухзарядном ионе грамицидина £ ([С8+2Н]+2) обнаружено два вида активных атомов Н, различающихся по скорости протекания для них реакции Н/В-обмена Из сравнения масштаба Н/В-обмена в каждой из двух групп кинетически эквивалентных атомов Н в [С8+2Н]+2 видно, что

18

концентрация атомов, участвующих в реакции с меньшей скоростью, выше (рис 8)

' ВД=<гг(1-ехр(-4,0)

12

0 6-

00

Рис. 8. Оценка относительного содержания атомов Н, Н/Б-обмен которых описывается кинетическими параметрами а) (а\,Ь\) и Ь) (а2,Ь2) в ионах [С8+2Н]+2

12

I, мс

В однозарядном ионе грамицидина 5 ([СБ+Н]") наблюдается более медленная скорость реакции Н/О-обмена по сравнению с [С8+2Н]+2 (табл 3) По-видимому, это свидетельствует о том, что в результате кулоновских сил, возникающих между двумя положительными зарядами, иону [С8+2Н]+2 соответствует более развернутая форма, что приводит к увеличению интенсивности Н/Б-обмена В [С8+Н]+ такое взаимодействие отсутствует Заряд иона при этом сильнее стабилизирован за счет формирования водородных связей, вследствие чего доступ молекул к подвижным атомам Н затруднен

2 4-,

Рис. 9. Зависимости т](7) полученные для [Ьеи-Епк+Н]+ при

максимальных давлениях дейтерирующей смеси

и мс

В ионе лейцин-энкефалина ([Ьеи-Епк+Н]+) также обнаружено две группы атомов Н, участвующих в реакции ПЛЭ-обмена с разными скоростями Так как константы скорости реакции в этих группах

различаются на три порядка величины, то на зависимости г|(/), построенной от Int (рис 9), отчетливо возникают дополнительные точки перегиба

В ионе полипептида HR2 групп активных атомов Н, участвующих в реакции H/D-обмена с разными скоростями, выделено не было (табл 3)

Выводы

1 Разработана методика численной обработки масс-спектров протонированных аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе их взаимодействия с дейтерирующим агентом Методика применена для получения информации о кинетике реакций H/D-обмена в независимых реакционных центрах молекулярных ионов девяти аминокислот и трех полипептидов Учтено естественное изотопное распределение и реакция обратного обмена

2 Определены ионные подвижности в электрическом поле ионов девяти аминокислот {Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Туг, Lys), а также одно- и двухзарядных ионов грамицидина S, однозарядного иона лейцин-энкефалина и двухзарядного иона полипептида HR2

3 С использованием радиочастотного квадруполя с продольным электрическим полем в качестве химического реактора и орто-ВПМС в качестве детектора исследованы процессы комплексообразования протонированных аминокислот с молекулами ND3, протекающие параллельно процессам H/D-обмена Для семи ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Туг, Pro, His) установлено образование ион-молекулярных комплексов с молекулами ND3 Для пяти ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Туг) определены константы скорости комплексообразования На основании зависимости кинетики комплексообразования от давления предложен механизм стабилизации комплексов через диссипацию избыточной энергии на внутренние степени свободы самого комплекса

4 Исследована кинетика реакций H/D-обмена ионов девяти аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Туг, Lys) Определены эффективные константы скорости H/D-обмена, величины которых находятся в диапазоне от 7x10"11 (для

Arg) до 4x10'10 cmV (для Ile) Проанализирована связь констант скорости H/D-обмена с разностями в энергиях сродства к протону реагентов 5 Исследована кинетика реакций H/D-обмена в газовой фазе ионов полипептидов GS, Leu-Enk и HR2 и определены эффективные константы скорости, соответствующие групповому обмену кинетически эквивалентных активных атомов H Установлено, что в [GS+2H]4"2 присутствует два вида активных атомов Н, различающихся по реакционной способности на порядок Установлено, что в [Leu-Enk+H]+ присутствует также два вида активных атомов Н, различающихся по реакционной способности на три порядка Для иона [HR2+2H]"1"2 различающихся констант скорости не выявлено

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах: Статьи в реферируемых научных журналах:

1 Чудинов А В , Сулименков И В , Козловский В И , Брусов В С , Пихтелев А Р, Зеленов В В, «Исследование кинетики реакций газофазного дейтероводородного обмена протонированных молекул аминокислот с ND3 с использованием радиочастотного газонаполненного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора», Масс-спектрометрия 4, 2007, 19-30

2 Чудинов А В , Зеленов В В , Козловский В И, Сулименков И В , «Исследование мест протонирования в газофазных ионах полипептидов методом H/D-обмена с использованием радиочастотного сегментированного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора», Масс-спектрометрия 4,2007, 131-138

Тезисы докладов:

1 Kozlovski VI, Soulimenkov IV , Brusov V S , Pikhtelev A R, Chudmov A V , Dodonov A F , "Study of biomolecule ion/reagent gas molecule reactions in the segmented RFQ interfaced to the O-TOF MS", Scientific Program and Abstracts of the 10th International Conference "Desorption-2004", Saint-Petersburg (Russia), 2004, P 125

2 Чудинов А В , Козловский В И, Сулименков И В , Брусов В С , Додонов А Ф, "Реакции дейтероводородного обмена в ионах аминокислот при взаимодействии с молекулами дейтероаммиака", Материалы 2го международного семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород (Россия), 2004, С 251-252

3 Chudmov А V, Souhmenkov I V, Kozlovski VI, Pikhtelev A R, Brusov V S , Dodonov A F , "Probmg a Protonation Sites in Peptides and Ammo Acids by H/D Exchange Reaction m RFQ Ion Guide of O-TOF MS", Proceedings of the 53ld ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, San Antonio (USA), 2005

4 Чудинов А В , Козловский В И, Сулименков И В , "Исследование газофазных ион-молекулярных реакций H/D обмена электроспрейных ионов пептидов с ND3 с помощью O-TOF MS с сегментированным радиочастотным квадруполем", Материалы всероссийской конференции с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы", Москва (Россия), 2005

5 Чудинов А В , Зеленов В В , Козловский В И , «Исследование газофазного дейтероводородного обмена с участием ионов аминокислот и пептидов, как метод анализа структуры биомолекул», Программа и сборник трудов конференции «Научные школы Черноголовки - молодежи», Черноголовка (Россия), 2006 С 80-81

6 Чудинов А В , Сулименков И В , Козловский В И , Пихтелев А Р , Зеленов В В, «Исследование кинетики реакций газофазного H/D-обмена протонированных пептидов с молекулами ND3 с использованием радиочастотного газонаполненного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора», Материалы 3-ей международной Конференции-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород (Россия), 2007, С 162-163

Заказ № 235/09/07 Подписано в печать 25 09 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \vw\v с/г ги , е-тсн1 т/о@с/г ги

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1 Конформационная структура белков.

1.2 Анализ газофазной конформационной структуры биологических молекул физическими методами с использованием масс-спектрометрии.

1.2.1 Методы активированной фрагментации.

1.2.2 Измерения сечений рассеяния многозарядных ионов белков.

1.3 Анализ газофазной конформационной структуры биологических молекул химическими методами с использованием масс-спектрометрии.

1.3.1 Реакции переноса протонов при анализе конформационных состояний ионов белков.

1.3.2 Реакции образования нековалентносвязанных ион-молекулярных комплексов протонированных полипептидов.

1.4 Использование реакций газофазного H/D-обмена для исследования конформационной структуры биомолекул.

1.4.1 Механизм протекания реакций газофазного H/D-обмена.

1.4.2 Вычисление центроспецифичных констант скорости Н/0-обмена.

1.4.3 Эксперименты по исследованию конформационных состояний протонированных белков методом H/D-обмена.

Глава 2. Методика проведения экспериментов.

2.1 Экспериментальная установка тгг.-.-.т.7.г.

2.2 Реагенты и реактивы.

2.3 Приготовление дейтерирующей смеси и растворов для электрораспыления.

2.4 Методика проведения реакций H/D-обмена.

2.4.1 Использование радиочастотного квадруполя в качестве ион-молекулярного реактора.

2.4.2 Измерение коэффициентов подвижности протонированных ионов аминокислот и полипептидов.

2.4.3 Анализ влияния продольной диффузии на наблюдаемую кинетику реакций, изучаемых с помощью RFQ.

Глава 3. Модельное описание кинетики H/D-обмена в протонированных ионах аминокислот и полипептидов.

3.1 Связь кинетики H/D-обмена с наблюдаемым распределением интенсивностей изотопных пиков в масс-спектре.

3.2 Модель независимого H/D-обмена для каждого отдельного активного атома водорода.

3.3 Алгоритм обработки экспериментальных данных.

Глава 4. Экспериментальные результаты и их обсуждение.

4.1 Кинетика образования нековалентносвязанных комплексов ионов аминокислот с ND3.

4.2 Кинетика H/D-обмена в ионах аминокислот.

4.3 Кинетика H/D-обмена в ионах полипептидов.

4.3.1 Определение кинетических параметров H/D-обмена в ионах полипептидов.

4.3.2 Грамицидин S.

4.3.3 Лейцин-Энкефалин.

4.3.4 Полипептид HR2.

Выводы.

За последние годы значительно выросло значение масс-спектрометрических методов анализа в областях науки, связанных с исследованием сложных биоорганических молекул. В основном это произошло благодаря введению в рутинную практику методов мягкой ионизации таких, как ионизация электрораспылением (ESI) и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI), которые позволили переводить молекулярные ионы биологических макромолекул в газовую фазу без сопутствующих процессов образования ионов-фрагментов. Новые методы ионизации в сочетании с универсальностью масс-спектрометрического метода анализа привели к тому, что сейчас его значение для биологии трудно переоценить. Например, масс-спектрометры высокого разрешения с преобразованием Фурье такие, как масс-спектрометры, использующие ион-циклотронный резонанс (FT-ICR), а также, с недавнего времени, масс-спектрометры с орбитальной ионной ловушкой (Orbitrap), позволяют определять молекулярные веса биологических соединений с точностью, недостижимой другими методами. Помимо этого, использование тандемной масс-спектрометрии открывает практически неограниченные возможности при расшифровке первичной аминокислотной последовательности белков и полипептидов.

В последнее время внимание исследователей все больше привлекает перспектива^ расширения^ аналитических - возможностей метода масс-спектрометрии, как инструмента для изучения особенностей конформационной структуры биологических ионов, а в том числе и исследование конформационных состояний этих ионов в газовой фазе. Методы исследования газофазных конформационных структур биомолекул с использованием масс-спектрометрии можно условно разделить на физические и химические. Наиболее распространенным физическим методом является метод измерения подвижности ионов белка в электрических полях в газовой фазе, который часто называют методом ионной хроматографии по аналогии с жидкостной или газовой. Суть этого метода заключается в определении сечений рассеяния молекул инертных газов на ионах белка; при этом величины найденных сечений определяются в основном геометрией таких ионов. Таким образом, на основании измеренных значений сечений рассеяния можно делать общие выводы о геометрической форме белковых ионов. Помимо этого, различие величин этих сечений у разных конформационных структур позволяет проводить качественное разделение последних по их подвижности.

Из химических методов наибольший интерес представляет метод дейтероводородного (H/D) обмена, который основан на том, что молекулы белков обладают активными протонами, которые могут быть замещены на дейтерий в результате взаимодействия с дейтерирующим агентом. С химической точки зрения этот процесс аналогичен кислотно-основным реакциям, протекающим с молекулами белков в растворах. Скорость такого процесса сильно зависит от стерической доступности подвижных протонов, участвующих в реакции. Таким образом, различие скоростей H/D-обмена отдельных активных атомов водорода дает возможность анализа конформационного состояния.

Первые эксперименты по газофазному H/D-обмену на ионах белков были проведены только в начале 90-х, хотя похожая методика исследований в растворах применяется уже довольно давно. Первоначально для анализа полу^ющихся дейтерированных^фракций .использовали, метод-ЯМР, но------- впоследствии с появлением источников мягкой ионизации метод масс-спектрометрии стал более предпочтительным. Стоит отметить, что, несмотря на внешнее сходство, методики определения конформационной структуры с использованием H/D-обмена в растворе и в газовой фазе существенно различаются как с точки зрения практической реализации, так и с точки зрения механизмов протекающих при этом процессов.

Традиционно в газовой фазе реакции H/D-обмена проводят в ячейке ион-циклотронного резонанса с последующим детектированием дейтерированных фракций на масс-спектрометре FT-ICR. Среди других методов, описанных в литературе, метод с применением FT-ICR является, пожалуй, самым распространенным и дает наиболее воспроизводимые данные. Очевидное достоинство FT-ICR заключается в том, что при его использовании достигаются рекордные времена реакции за счет захвата ионов в /С/?-ячейке. Однако можно отметить, что этот метод все же имеет два недостатка. Первое, это разделение во времени процесса H/D-обмена и детектирования образующихся дейтерированных продуктов, так как для детектирования требуется предварительная откачка из /СЛ-ячейки газов-реагентов. Второе, это щ необходимость оперировать низкими давлениями дейтерирующей смеси ~10" -10'5 Торр, чтобы избежать больших потерь ионов. Метод, предлагаемый в нашей работе, позволяет избежать этих недостатков.

В нашей работе в качестве реактора для проведения реакций H/D-обмена с ионами белков и полипептидов предлагается радиочастотный сегментированный квадруполь, расположенный в интерфейсе времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов. При этом время реакции задается напряженностью продольного электростатического поля вдоль оси квадруполя, а детектирование образующихся дейтерированных фракций осуществляется времяпролетным масс-анализатором. Представляемая конструкция обеспечивает взаимодействие ионов белка с дейтерирующим агентом с последующим ^.непрерывным детектированием— продуктов реакции и, кроме того, работает при относительно высоких давлениях ~10'2 Торр.

Актуальность:

1. Перспектива расширения аналитических возможностей метода масс-спектрометрии, как инструмента для изучения особенностей газофазной конформационной структуры биологических ионов.

2. Информация об устойчивых конформационных состояниях биомолекул в газовой фазе имеет как фундаментальную, так и практическую ценность. Сюда можно включить:

• изучение влияния водной среды на процесс организации и функционирования биологических макромолекул,

• уточнение природы внутримолекулярных взаимодействий, ведущих к формированию нековалентных структур в биологических системах.

3. Потребность в определении мест селективного протонирования в газофазных ионах белков и полипептидов для более глубокого понимания механизмов перехода таких ионов в вакуум в современных источниках ионизации: MALDI и ESI.

Целью настоящей работы является:

Исследование возможности использования сегментированного радиочастотного квадруполя, расположенного в атмосферном интерфейсе времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов, в качестве ион-молекулярного реактора для изучения кинетики реакций H/D-обмена в биоорганических ионах.

Для достижения поставленной цели были сформулированы задачи:

• Разработка методики численной обработки временной последовательности экспериментально полученных масс-спектров дейтерированных продуктов для вычисления кинетических параметров реакций изотопного обмена.

• Реализация экспериментального метода исследования, включая: a) Определение величин подвижности ионов аминокислот и полипептидов в продольном электрическом поле сегментированного радиочастотного квадруполя. b) Исследование кинетики H/D-обмена ряда биомолекулярных ионов с дейтерированным аммиаком внутри сегментированного радиочастотного квадруполя при задании времени контакта этих ионов с газом-реагентом напряженностью продольного электрического поля и последующим детектированием ионов-продуктов времяпролетным масс-спектрометром с ортогональным вводом ионов.

Основные защищаемые положения:

• Методика численной обработки масс-спектров молекулярных ионов аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе протекания процесса H/D-обмена в этих ионах.

• Механизм стабилизации ион-молекулярных комплексов ионов аминокислот с молекулами дейтероаммиака через диссипацию избыточной энергии на внутренних степенях свободы этих комплексов.

• Эффективные константы скорости реакции H/D-обмена в ионах аминокислот, усредненные по всем наблюдаемым процессам H/D-замещений и находящиеся в диапазоне ~10"n-10'10 cmV1, при использовании дейтерированного аммиака в качестве дейтерирующего агента.

• Разрешение групп активных атомов водорода, участвующих в реакциях H/D-обмена с разными скоростями, в ионах грамицидина S и лейцин-энкефалина.

Научная новизна'.

• Предложена оригинальная методика расчета кинетических параметров H/D-обмена, которая использует связь наблюдаемых интенсивностей масс-спектральных линий с концентрацией активных центров исходного иона-реагента. Разработанный подход применим для сложных биоорганических молекул, для которых изотопное распределение является неразрешенным.

• Продемонстрированы возможности сегментированного радиочастотного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора для исследования H/D-обмена в биомолекулярных ионах.

Научная и практическая ценность:

• Разработанный метод определения кинетических параметров процесса H/D-обмена в сложных биоорганических ионах является универсальным и применим для широкого круга ионов биомолекул и газов-реагентов.

• Сегментированный радиочастотный квадруполь, предлагаемый в качестве молекулярно-ионного реактора для изучения H/D-обмена, может применяться как атмосферный интерфейс во времяпролетных масс-спектрометрах с целью расширения их аналитических возможностей.

Личный вклад автора'.

Автором разработана численная методика для исследования кинетики реакций изотопного обмена при масс-спектрометрическом детектировании продуктов реакции. Автор непосредственно участвовал в обосновании, постановке и проведении всех экспериментов, их интерпретации и обобщении полученных результатов.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях: Международная конференция "Desorption-2004", Санкт-Петербург, Россия, 2004; 2-я Международная семинар-школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород , 2004, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых); Международная конференция американского масс-спектрометрического общества, Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, San Antonio, USA, 2005; I Всероссийская конференция с международным^ участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», Москва, 2005; Конференция «Научные школы Черноголовки - молодежи», Черноголовка, 2006; 3-я Международная конференция-школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 2007, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых).

Публикации:

Основные результаты работы изложены в 2 публикациях в реферируемом отечественном журнале и в 6 тезисах докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 110 страниц, включая 42 рисунка и 7 таблиц. Список литературы содержит 101 наименование.

Выводы

1. Разработана методика численной обработки масс-спектров протонированных аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе их взаимодействия с дейтерирующим агентом. Методика применена для получения информации о кинетике реакций H/D-обмена в независимых реакционных центрах молекулярных ионов девяти аминокислот и трех полипептидов. Учтено естественное изотопное распределение и реакция обратного обмена.

2. Определены ионные подвижности в электрическом поле ионов девяти аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, lie, Pro, Tyr, Lys), а также одно- и двухзарядных ионов грамицидина S, однозарядного иона лейцин-энкефалина и двухзарядного иона полипептида HR2.

3. С использованием радиочастотного квадруполя с продольным электрическим полем в качестве химического реактора и орто-ВПМС в качестве детектора исследованы процессы комплексообразования протонированных аминокислот с молекулами ND3, протекающие параллельно процессам H/D-обмена. Для семи ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, lie, Туг, Pro, His) установлено образование ион-молекулярных комплексов с молекулами ND3. Для пяти ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, Не, Туг) определены константы скорости комплексообразования. На основании зависимости кинетики комплексообразования от давления предложен механизм стабилизации комплексов через диссипацию избыточной энергии на внутренние степени свободы самого комплекса

4. Исследована кинетика реакций H/D-обмена ионов девяти аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, lie, Pro, Tyr, Lys). Определены эффективные константы скорости H/D-обмена, величины которых находятся в диапазоне от 7х10"и (для Arg) до 4хЮ"10 см3с"' (для Не). Проанализирована связь констант скорости H/D-обмена с разностями в энергиях сродства к протону реагентов.

5. Исследована кинетика реакций H/D-обмена в газовой фазе ионов полипептидов GS, Leu-Enk и HR2 и определены эффективные константы скорости, соответствующие групповому обмену кинетически эквивалентных активных атомов Н. Установлено, что в [GS+2H] присутствует два вида активных атомов Н, различающихся по реакционной способности на порядок. Установлено, что в [Leu-Enk+H]+ присутствует также два вида активных атомов Н, различающихся по реакционной способности на три порядка. Для иона [HR2+2H]+2 различающихся констант скорости не выявлено.

1. Ленинджер А. Основы биохимии. Москва «Мир», Т. 1, 1985, 137-226.

2. Wolynes P.G., "Biomolecular folding in vacuo", Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 92, 1995,2426-2427.

3. Suckau D., Shi Y., Beu S.C., Senko M.W., Quinn J.P., Wampler III F.M., McLafferty, "Coexisting stable conformations of gaseous protein ions", Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90,1993,790-793.

4. Wood T.D., Chorush R.A., Wampler III F.M., Little D.P., O'Connor P.B., McLafferty F.W., "Gas-phase folding and unfolding of cytochrome с cations", Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 92,1995,2451 -2454.

5. McLafferty F.W., Guan Z., Haupts U., Wood T.D., Kelleher N.L., "Gaseous conformational structures of cytochrome c", J. Am. Chem. Soc. 120, 1998, 47324740.

6. Jarrold M.F., "Unfolding, refolding, and hydration of proteins in the gas phase", Acc. Chem. Res. 32,1999, 360-367.

7. Hoaglund-Hyzer C.C., Counterman A.E., Clemmer D.E., "Anhydrous protein ions", Chem. Rev. 99,1999, 3037-3079.

8. Clemmer D.E., Hudgins R.R., Jarrold M.F., "Naked protein conformations: cytochrome с in the gas phase", J. Am. Chem. Soc. 117, 1995, 10141-10142.

9. Shelimov K.B., Clemmer D.E., Hudgins R.R., Jarrold M.F., "Protein structure in vacuo: gas-phase conformations of BPTI and cytochrome c", J. Am. Chem. Soc. 119,1997,2240-2248.

10. Shelimov K.B., Jarrold M.F., ""Denaturation" and refolding of cytochrome с in vacuo", J. Am. Chem. Soc. 118, 1996,10313-10314.

11. Counterman A.E., Clemmer D.E., "Large anhydrous polyalanine ions: evidence for extended helices and onset of a more compact state", J. Am. Chem. Soc. 123,2001, 1490-1498.

12. Gill A.C., Jennings K.R., Wyttenbach Т., Bowers M.T., "Conformations of biopolymers in the gas phase: a new mass spectrometric method", Int. J. Mass Spectrom. 195/196,2000, 685-697.

13. Wyttenbach Т., Helden G., Bowers M.T., "Gas-phase conformation of biological molecules: bradykinin", J. Am. Chem. Soc. 118, 1996, 8355-8364.

14. Shelimov K.B., Jarrold M.F., "Conformations, unfolding and refolding of apomyoglobin in vacuum: an activation barrier for gas-phase protein folding", J. Am. Chem. Soc. 119,1997,2987-2994.

15. Westermeier R., Naven Т., "Proteomics in practice", Wiley-VCH Verlag-GmbH Weinheim, 2002.

16. McLuckey S.A., Goeringer D.E., "Slow heating methods in tandem mass spectrometry",./. Mass Spectrom. 32,1997,461-474.

17. Reid G.E., Simpson R.J., O'Hair R.A.J., "Probing the fragmentation reactions of protonated glycine oligomers via multistage mass spectrometry and gas phase ion molecule hydrogen/deuterium exchange", Int. J. Mass Spectrom. 190/191, 1999, 209-230.

18. Dongre A.R., Jones J.L., Somogyi A., Wysocki V.H., "Influence of peptide composition, gas-phase basicity, and chemical modification on fragmentation efficiency: evidence for the mobile proton model", J. Am. Chem. Soc. 118, 1996, 8365-8374.

19. Johnson R.S., Martin S.A., Biemann K., "Collision-induced fragmentation of (M+H)+ ions of peptides. Side chain specific sequence ions", Int. J. Mass Spectrom. 86,1988, 137-154.

20. Vachet R.W., Asam M.R., Glish G.L., "Secondary interactions affecting the dissociation patterns of arginine-containing peptide ions", J. Am. Chem. Soc. 118, 1996,6252-6256.

21. Rockwood A.L., Busman M., Smith R.D., "Coulombic effects in the dissociation of large highly charged ions" International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 111, 1991, 103-129.

22. Yu H., Murata К., Hedrick J.L., Almaraz R.T., Xiang F., Franz A.H., "The disulfide bond pattern of Salmon egg lectin 24K from the chinook salmon oncorhynchus tshawytscha", Arch. Biochem. Biophys. 463,2007, 1-11.

23. Wu Q., Orden V.S., Cheng X., Bakhtiar R., Smith R.D., "Characterization of cytochrome с variants with high-resolution FTICR mass spectrometry: correlation of fragmentation and structure", Anal Chem. 61, 1995,2498-2509.

24. Loo J.A., Edmonds C.G., Smith R.D., "Primary sequence information from intact proteins by electrospray ionization tandem mass spectrometry." Science 248, 1990,201-204.

25. Schey K.L., Durkin D.A., Thornburg K.R., "Design and performance of inline surface-induced dissociation device in a four-sector mass-spectrometer", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6,1995,257-263.

26. McCormack A.L., Jones J.L., Wysocki V.H., "Surface-induced dissociation of multiply protonated peptides", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 3, 1992, 859-862.

27. Mabud M.A., Dekrey M.J., Cooks R.G., "Surface-induced dissociation of molecular ions", Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 67,1985,285-294.

28. Sleno L., Volmer D.A., "Ion activation methods for tandem mass spectrometry", J. Mass Spectrom. 33,2004, 1091-1112.

29. McMahon T.B., Tonner D.S., Tholmann D., "Spontaneous unimolecular dissociation of small cluster ions, (H30+)Ln and СГ(Н20)П (n = 2-4), under fourier transform ion cyclotron resonance conditions",/. Phys. Chem. 98,1994,2002-2004.

30. Covey Т., Douglas D.J., "Collision cross sections for protein ions", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 4, 1993, 616-623.

31. Chen Y., Collings B.A., Douglas D.J., "Collision cross sections of myoglobin and cytochrome с ions with Ne, Ar and Kr", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8, 1997, 681-687

32. И. Мак-Даниель, Э. Мэзон., Подвижность и диффузия ионов в газах. Москва «Мир» 1976,426 с.

33. Javahery G., Thomson В., "A segmented radiofrequency-only quadrupole collision cell for measurements of ion collision cross section on a triple quadrupole mass spectrometer", J. Am. Chem. Soc. 8, 1997, 697-702.

34. Matthew J.B., "Electrostatic effects in proteins" Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14,1985,387-417.

35. Bohme D.K., Fennelly P., Hemsworth R.S., Schiff H.I., "Preferred direction of proton transfer between C2H7+ and CO, CH4, N20, and C2H4 at 300 K", J. Am. Chem. Soc. 95,1973, 7512-7513.

36. Cheng X., Wu Z., Fenselau C., "Collision energy dependence of proton-bound dimmer dissociation: entropy effects, proton affinities and intramolecular hydrogen-bonding in protonated peptides", J. Am. Chem. Soc. 115, 1993,4844-4848.

37. Kaltashov I.A., Fenseau C.C., "A direct comparison of "first" and "second" gas phase basicities of the octapeptide RPPGFSPF", J. Am. Chem. Soc. 117, 1995, 9906-9910.

38. Wu Z., Fenselau C., "Proton affinity of arginine measured by the kinetic approach", Rapid Commun. Mass Spectrom. 6,1992,403-405.

39. Andersen U.N., Bojesen G., «The order of lithium ion affinities for the 20 common a-amino acids. Calculation of energy-well depth of ion-bound dimmers», J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1997, 323-327.

40. Schnier P.D., Gross D.S., Williams E.R., "On the maximum charge state and proton transfer reactivity of the peptide and protein ions formed by electrospray ionization", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6,1995,1086-1097.

41. Gross D.S., Williams E.R., "Structure of gramicidin S (M+H+X)2+ ions (X=Li, Na, K) probed by proton transfer reactions", J. Am. Chem. Soc. 118, 1996, 202-204.

42. Chouwdhury S.K., Katta V., Chait B.T., "An electrospray-ionization mass spectrometer with new features", Rapid. Commun. Mass Spectrom. 4,1990, 81-87.

43. Smith R.D., Light-Wahl K.J., "The observation of non-covalent interactions in solution by electrospray ionization mass spectrometry: promise, pitfalls and prognosis", Biol. Mass Spectrom. 22,1993,493-501.

44. Klassen J.S., Blades A.T., Kebarle P., "Determinations of ion-molecule equilibria involving ions produced by electrospray. hydration of protonated amines, diamines, and some small peptides" J. Phys. Chem. 99,1995,15509-15517.

45. Rodriguez-Cruz S.E., Klassen J.S., Williams E.R., "Hydration of gas-phase gramicidin S M+2H.2+ ions formed by electrospray: the transition from solution to gas-phase structure", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8,1997, 565-568.

46. Rodriguez-Cruz S.E., Klassen J.S., Williams E.R., "Hydration of gas-phase ions formed by electrospray ionization", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 1999, 958968.

47. Zhan D., Rosell J., Fenn J.B., "Solvation studies of electrospray ions -method and early results", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 1998, 1241-1247.

48. Stephenson J.L., Jr., McLuckey S.A., "Gaseous protein cations are amphoteric", J. Am. Chem. Soc. 119,1997,1688-1696.

49. Stephenson J.L., Jr., McLuckey S.A., "Counting basic sites in oligopeptides via gas-phase ion chemistry", Anal. Chem. 69, 1997,281-285.

50. Cheng X., Fenselau C., "Target-capture and ion/molecule reactions in high-energy collisions between protonated polypeptide ions and hydrogen-containing target gases", J. Am. Chem Soc. 115, 1993, 10327-10333.

51. Caldwell K.A., Giblin D.E., Hsu C.S., Cox D., Gross M.L., "Endohedral complexes of fullerene radical cations", J. Am. Chem. Soc. 113,1991, 8519.

52. Ross M.M., Callahan J.H., "Formation and characterization of carbon mol.-helium (C60He+)'\ J. Phys. Chem. 95, 1991, 5720.

53. Т.Е. Wales, J.R. Engen, «Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics», Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170,2006.

54. Schaaff T.G., Stephenson J.L., Jr., McLuckey S.A., "Gas phase H/D exchange kinetics: DI versus D20", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11,2000,167-171.

55. Balta В., Basma M., Aviyente V., Zhu C., Lifshitz C., "Structures and reactivity of gaseous glycine and its derivatives", International Journal of Mass Spectrometry 201, 2000, 69-85.

56. Rozman M., Bertosa В., Klasinc L., Srzic D., "Gas phase H/D exchange of sodiated amino acids: why do we see zwitterions?", Journal of the American Society for Mass Spectrometry 17,2006,29-36.

57. Rozman M., Srzic D., Klasinc L., "Gas-phase interaction of protonated lysne with water", International Journal of Mass Spectrometry 253,2006,201-206.

58. Dookeran N.N., Harrison A.G., "Gas-phase H-D exchange reactions of protonated amino acids and peptides with ND3", Journal of Mass Spectrometry 30, 1995, 666-674.

59. Koster G., Soskin M., Peres M., Lifshitz C., "Ion/molecule reactions of protonated diglycine: an electrospray ionization flow tube experiment", International Journal of Mass Spectrometry 179/180, 1998, 165-171.

60. Koster G., Lifshitz C., "H/D exchange reactions of protonated diglycine; an electrospray ionization-flow tube reactor experiment", International Journal of Mass Spectrometry 182/183, 1999,213-220.

61. Green M.K., Lebrilla C.B., "The role of proton-bridged intermediates in promouting hydrogen-deuterium exchange in gas-phase protonated diamines, peptides and proteins", International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 175,1998,15-26.

62. Jaroszewski L., Lesyng В., "Ab initio study of proton transfer in H3N-H-NH3.+ and [H3N-H-OH2]+", Chemical Physics Letters 175, 1990, 282-288.

63. Farneth W.E., Brauman J.I., "Dynamics of proton transfer involving delocalized negative ions in the gas phase", Journal of the American Chemical Society 98, 1976,7891-7898.

64. He F., Marshall A.G., "Weighted quasi-Newton and variable-order, variable-step Adams algorithm for determining site-specific reaction rate constant", J. Phys. Chem. A 104,2000, 562-567.

65. Разникова M.O., Разников B.B., «Определение степени активности Н-атомов ионов полифункциональных соединений по масс-спектрам H/D-обмена», Химическая Физика 24,2005, 13-18.

66. Разникова М.О., Разников В.В., «Новый подход к анализу кинетики процессов H/D-обмена активных атомов водорода полифункциональных соединений», Масс-спектрометрия 3,2006, 193-200.

67. Reuben B.G., Ritov Y., Geller О., McFarland M.A., Marshall A.G., Lifshitz C., "Applying a new algorithm for obtaining site specific rate constants for H/Dexchange of the gas phase proton-bound arginine dimer", Chemical Physics Letters 380,2003,88-94.

68. B.E. Гмурман, Теория вероятностей и математическая статистика, Москва «Высшая школа», 1998,323 с.

69. Geller О., Lifshitz С., "Applying a new algorithm to H/D exchange of multiply protonated cytochrome c", Int. J. of Mass Spectrom. 233,2004,125-129.

70. Lifshitz C., "A review of gas-phase H/D exchange experiments: the protonated arginine dimmer and bradykinin nonapeptide systems", International Journal of Mass Spectrometry 234,2004,63-70.

71. Xiao H., Kaltashov I.A., Eyles S.J., "Indirect assessment of small hydrophobic ligand binding to a model protein using a combination of ESI MS and HDX/ESI MS", Journal of the American Society for Mass Spectrometry 14, 2003, 506-515.

72. Kogan A., Ustyuzhanin P., Reuben B.G., Lifshitz C., "Hydrogen/deuterium exchange of monomers and dimmers of leucine enkephalin", International Journal of Mass Spectrometry 213,2002, 1-4.

73. Freitas M.A., Hendrickson C.L., Emmett M.R., Marshall A.G., "Gas-phase bovine ubiquitin cation conformations resolved by gas-phase hydrogen/deuterium exchange rate and extent", Int.J. of Mass Spectrom. 185-187, 1999, 565-575.

74. Wyttenbach Т., Bowers M.T., "Gas phase conformations of biological molecules: the hydrogen/deuterium exchange mechanism", Journal of the American Society for Mass Spectrometry 10, 1999, 9-14.

75. Zhang Z., Li W., Guan S., Marshall A.G., "Higher-order structure of gas-phase peptides from gas-phase H/D exchange experiments" Proceedings of the 44th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Portland, OR, 1996; p 1061.

76. Jurchen J.C., Cooper R.E., Williams E.R., "The role of acidic residues and sodium ion adduction on the gas-phase H/D exchange of peptides and peptide dimers", Journal of the American Society for Mass Spectrometry 14, 2003, 14771487.

77. Mao D., Douglas D.J., "H/D exchange of gas phase bradikinin ions in a linear quadrupole ion trap", Journal of the American Society for Mass Spectrometry 14, 2003,85-94.

78. Chipuk J.E., Jennifer B.S., "Gas-phase hydrogen/deuterium exchange of 5'-and 3'-mononucleotides in a quadrupole ion trap: exploring the role of conformation and system energy", Journal of the American Society for Mass Spectrometry 18, 2007,724-736.

79. Evans S.E., Lueck N., Marzluff E.M., "Gas phase hydrogen/deuterium exchange of proteins in an ion trap mass spectrometer", Int. J. of Mass Spectrom. 222,2003,175-187.

80. Geller 0., Lifshitz С., "An electrospray ionization-flow tube study of H/D exchange in the protonated serine dimmer and protonated serine dipeptide", Int. J. of Mass Spectrom. 227,2003, 77-85.

81. Ustyuzhanin P., Ustyuzhanin J., Lifshitz C., "An electrospray ionization-flow tube study of H/D exchange in protonated serine", International Journal of Mass Spectrometry 223-224,2003,491-498.

82. Kaltashov I.A., Doroshenko V.M., Cotter R.J., "Gas phase hydrogen/deuterium exchange reactions of peptide ions in a quadrupole ion trap mass spectrometer", PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 28, 1997, 53-58.

83. Gerlich D. Inhomogeneous RF fields: a versalite tool for the study of processes with slow ions, in Advances in Chemical Physics Series, LXXXII (Eds.: Cheuk-Yiu N., Michael В.), John Willey&Sons, 1992.

84. Tolmachev A.V., Chernushevich I.V., Dodonov A.F., Standing K.G., "A collisional focusing ion guide for coupling an atmospheric pressure ion source to a mass spectrometer", Nuclear-Instruments and Methods in Physics Research В 124, 1997,112-119.

85. Семиохин И.А., Страхов Б.В., Осипов А.И. Кинетика гомогенных химических реакций. Издательство Московского Университета 1986, стр. 107.

86. Хастед Д. Физика атомных столкновений. Москва: «Мир», 1965, стр.642-665.

87. Бейнон Д. Масс-спектрометрия и ее применение в органической химии. Москва: «Мир», 1964, стр. 500-652.