Математическое моделирование процессов эксклюзионной жидкостной хроматографии полидисперсных, изомеризующихся и ассоциирующих полимерных систем тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.19 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.I

I. ИССЛЕДОВАНИЕ СЛОЖНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ

МЕТОДОМ ЭЖХ (обзор литературы)

П. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

НЕВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ

§ I. Классификация калибровочных процедур

§ 2. Определение ММР полимеров на основе полной коррекции хроматограмм на "приборное уширение" с использованием калибровочной зависимости по первым четырем статистическим моментам хроматограмм полимеров

§ 3» Определение молекулярно-массового

•лл. • распределения олигоыеров . 'i- v.

§ 4. Хроматографическая порометрия

Ш. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ

§ I. Определение кинетических и равновесных констант изомеризующихся белков

§ 2. Определение кинетических констант ассоциации и диссоциации белков

Хроматография макромолекул представляет обширный раздел современной жидкостной хроматографии и является одним из наиболее эффективных методов фракционирования, анализа синтетических полимеров и биополимеров. Одним из главных направлений ее применения в области синтетических полимеров является исследование полидисперсных макромолекул. Это связано с тем, что механические, термические и реологические свойства полимерных материалов, определяющие режимы их переработки и экспериментальные характеристики ,в значительной мере зависят от полидисперсности полимеров и, прежде всего, от их молекулярно--массового распределения (ММР). Классические методы определения полидисперсности полимеров, такие как дробное осаждение и растворение, из-за громоздкости и невысокой точности не в состоянии обеспечить потребности массового анализа. Мало пригоден для этих целей и метод скоростной седиментации из-за сложности его аппаратуры и относительно невысокой производительности. Новый скоростной метод определения диффузионных коэффициентов макромолекул, основанный на квазиупругом рассеянии лазерного излучения, может быть использован для анализа полидисперсности макромолекул лишь в случае несложных унимодальных распределений, что в реальных условиях встречается не так уж часто. Поэтому естественным выглядит обращение к хроматографическим методам, в частности, к эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ). Однако, используемый для определения ММР полимеров и олигомеров метод ЭЖХ встречается с трудностями при анализе узкодисперсных по молекулярной массе полимеров вследствие значительного вклада б хроматограммы приборного уширения. Поэтому развитие методов коррекции хроматограмм на приборное уширение, осуществляемое в настоящей работе, является одним из важнейших вопросов ЭЖХ полимеров применительно к определению ММР как олигомеров, так и собственно полимеров. Хроматографические методы позволяют не только исследовать сложные макромолекулярные системы, если известна поровая структура используемого сорбента. Они позволяют также ставить и решать обратную задачу - определение норовой структуры сорбента, используя в качестве "зондов" охарактеризованные по размерам макромолекулы.

Классические методы изучения поровой структуры - ртутная порометрия, адсорбция паров инертных растворителей и малоугловое рентгеновское рассеяние, мало пригодны для хромато-графических сорбентов, так как они либо не позволяют проводить порометрию набухающих сорбентов, либо сложны в экспериментальном и интерпретационном смысле. Поэтому создание новых методов изучения порометрии сорбентов, прежде всего набухающих, имеет большое значение для разработки высокоэффективных сорбентов для хроматографии биополимеров и водорастворимых полимеров.

Дальнейшее расширение области применения ЭЯХ связано с возможностью исследования этим методом кинетики систем из взаимодействующих частиц, например, кинетику полимеризации макромолекул. В рамках возникающих при этом проблем большой интерес представляет поведение изомеризующихся и ассоциирующих белков в элюенте на фоне хроматографического процесса и связь этого поведения с кинетикой соответствующих реакций изомеризации и ассоциации. Важность и актуальность таких задач определяется простотой объектов исследования, что позволяет рассматривать их как модельные задачи для подхода к определению хроматографическим методом кинетики полимеризации макромолекул. Кроме того они представляют самостоятельный интерес, который определяется ролыо ассоциации в проявлении биологической активности белковых молекул. Особенно ярко выражена роль обратимых реакций ассоциации-диссоциации при осуществлении метаболического контроля ферментативной активности. Смещение равновесия между активной и неактивной формами фермента, имеющими различную степень ассоциации, является одним из вероятных механизмов контроля активности для многих ферментов. В настоящей работе решается задача определения равновесных и кинетических констант изомеризации и ассоциации белков методом Э1Х.

Таким образом, актуальность выполненной работы связана с развитием и уточнением метода прецизионного анализа ТЛ1ЛР полимеров с помощью эксклюоионнок хроматографии, разработкой метода хроматографической порометрии сорбентов, в том числе набухающих, и созданием методов исследования равновесных и кинетических характеристик взаимодействующих и изомеризующих-ся макромолекул с помощью ЭЖХ.

Целью диссертации является развитие метода ЗЖХ на основе математического моделирования хроматографического процесса для решения следующих задач:

I) прецизионного определения Ш£Р олигомеров и полимеров на основе учета приборного уширения с коррекцией хроматограмм по первым четырем статистическим моментам,

2) исследования пористой структуры сорбентоЕ методом ШГХ,

3) хроматографического исследования взаимодействующих ыакромолекулярных систем: изомеризующихся и ассоциирующих.

Научная новизна материалов диссертации заключается в следующем:

- впервые осуществлена наиболее полная коррекция эксклюзион-ной хроматограммы макромолекул на приборное уширение с использованием параметров распределения Пирсона для хроматограмм узкодисперсных стандартов и калибровки хроматографа по первым четырем статистическим моментам хроматограмм;

- на основе коррекции хроматограммы предложен более точный метод интерпретации хроматограммы в ММР полимеров, в том числе с индексом полидисперсности менее 1,1;

- предложен новый метод интерпретации эксклюзионной хроматограммы олигомеров с частично разрешенными пиками, в котором учитывается зависимость инкремента показателя преломления и дисперсии пика от степени полимеризации;

- разработан новый метод хроматографической порометрии сорбентов на основе универсальной калибровки;

- впервые разработана методика определения равновесных и кинетических констант изомеризующихся и ассоциирующих макромолекул с помощью ЭЖХ.

На защиту выносятся следующие положения диссертации:

- прецизионное определение ММР полимеров осуществляется на основе полной коррекции хроматограмм на приборное уширение, включающей восстановление функции приборного уширения с использованием представления хроматограмм узкодисперсных стандартов распределениями из семейства Пирсона;

- разработка метода определения МНР олигомеров, основанного на сопоставлении модельной хроматограммы, полученной с учетом зависимости инкремента показателя преломления от степени полимеризации ,и реальной эксклюзионной хроматограммы олигомера;

- использование универсальной калибровки хроматографической колонки, связывающей коэффициент распределения макромолекул между фазами сорбента с 'соотношением среднего размера макромолекул и размера пор сорбента для хроматографической поро-метрии;

- решение прямой задачи зависимости формы эксклюзионной хроматограммы как функции хроматографических и кинетических параметров изомеризующихся и ассоциирующих макромолекул и соответствующих обратных задач с целью определения равновесных и кинетических констант реагирующих макромолекул.

Практическая ценность работы заключается в создании алгоритмов и ЭВМ-программ коррекции хроматограмм полимеров и олигомеров на приборное уширение, хроматографической поромет-рии сорбентов и определения кинетических и равновесных констант изомеризующихся и ассоциирующих макромолекул. Эти программы и алгоритмы были опробованы и применены для анализа ММР узкодисперсных полистирольных полимеров и олигомеров и полиамидокислот ГШ, для определения поровой структуры ряда набухающих и ненабухающих сорбентов и определения кинетики ассоциации лизоцима и фосфолипазы А^ из яда среднеазиатской кобры.

Работа состоит из введения, I раздела с обзором литературных данных, II раздела, посвященного определению ММР олигомеров и собственно полимеров,и хроматографической лорометрии сорбентов, Ш раздела, посвященного исследованию кинетики взаимодействующих макромолекулярных систем, приложения, в котором приводится условие визуального разделения пиков в хроматографии, заключения и списка литературы.

Нумерация формул по разделам автономная, причем первый индекс соответствует номеру раздела.

I. ИССЛЕДОВАНИЕ СЛОЖНЫХ ЙЛКРОМОЛ^.КУЛЯРНЫХ СИСТЕМ

МЕТОДОМ ЗКХ.

ОО'зор литературы)

I. В настоящее время хроыатографическис методы широко используются для анализов как синтетических, так и биополимеров. При этом для решения разных задач применяются те или иные разновидности хроматографии, такие как адсорбционная, эксклюзионная, обратнофазная, ионообменная, как в обычном, так и в микроколоночном вариантах, а также тонкослойная хроматография. Б данной работе рассматриваются возможности применения только эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЗКХ) к таким задачам исследования полимеров и биополимеров, которые требуют слошюй интерпретации и вторичной обработки экспериментальных данных и связаны с дальнейшим развитием теории хроматографического процесса.

Теория хроматографии основывается на физических закономерностях, связанных со стохастичностью хроматографического процесса, особенностями его гидродинамики, кинетики и нелинейности изотермы сорбции ,/1-6/. Б этих работах, в частности, показано, что стохастичность хроматографического процесса обусловлена вероятностным распределением молекул анализируемого вещества между подвижной и неподвижной фазами системы. При этом в качестве функции распределения выступают нормированные соответствующим образом концентрации вещества в каждой фазе. Соответствующее описание кинетики, при котором обмен молекулами между фазами выражается через вероятности их сорбции и десорбции, заключается в следующем. Если вероятность сорбции одной

- ю молекулы ь -го сорта б единицу времени есть (частота сорбции), то число молекул , сорбирующихся б элементе объема д\/ хроштографической системы в течение времени át (то есть переходящих в неподвижную фазу), пропорционально вероятности сорбции одной молекулы: Mi^iiQoíAVCí&t, (i.i) где o¿ - доля подвижной фазы в элементе объема Л V . Доля неподвижной фазы при этом составляет: б = I - об. л/

Если ввести вероятность десорбции A¿ , то по аналогии с (I.I) можно получить выражение для числа молекул Af ¿ I -го сорта, переходящих из неподвижной фазы в подвижную за время A t в элементе объема А V tf/'ÚMpAVC'iAt. (1.2)

При выводе уравнений (I.I) и (1.2) считалось, что в общем случае как вероятность -Я ¿ , так и вероятность могут зависеть от концентраций С¿ и С¿ исследуемого компонента соответственно в подвижной и неподвижной фазах. Вычитая уравнения (I.I) и (1.2), переходя к пределу при и учитывая, что неподвижная фаза занимает объем /3 А V , получим уравнение, описывающее кинетику процесса сорбции-десорбции / 7 / с помощью вероятностей и Á¿ :

0i^c.-p^ci. ал)

Если в уравнениях (I.I) и (1.2) имелась в виду численная концентрация, то в уравнении (1.3) может использоваться и весовая.

Б простейшем случае, когда вероятности J\¿ и A¿ не зависят от концентраций, имеет место линейная кинетика. Для полноты описания хроматографического процесса к уравнению кинетики (1.3) добавляется уравнение баланса, учитывающее гидродинамические свойства процесса: где и - скорость движения растворителя в каналах подвижной фазы колонки; Т)I - коэффициент молекулярной диффузии в растворе молекул I -го сорта. В уравнении (1Л) перенос вещества в подвижной фазе и его конвективное перемешивание г описывается членом ( И V 6/диффузионное размывание -членом А - оператор Лапласа), а массообмен между фазами - членом £ . Если поперечный перенос вещества в подвижной фазе (как диффузионный, так и конвективный) описывать с помощью коэффициента квазидиффузии Т)ч ¿' ;и считать, что вектор 11 имеет только одну составляющую и*. ? направленную вдоль колонки, зависящую лишь от расстояния^ до оси колонки, то уравнение (1.4) можно упростить и система (1.3) - (1Л) принимает следующий вид:

Л-Г) + 3 (7 Цл

И" *>1 дх1 Я\. Чкдг^дч*' (к)дх * ^ эг' (1-5) п л / г/ о^Л П л / г/ и ' р

-где - радиус колонки; D¿)¿ - коэффициент диффузии, характеризующий размывание вещества только в продольном направлении.

Если скорость потока И считать постоянной как по сечению колонки, так и вдоль нее, а все отклонения от нее рассматривать как случайные, описываемые коэффициентом продольной квазидиффузии ^ , то описание хроматографического процесса выглядит более простым: - 2

Ш-ъ и

Н ~ 1>1 Зх1 дх сс дт дСх

1.6) = X ^г Сс - С1

Н - р

Входящие во второе уравнение системы (1.6) вероятности сорбции и десорбции представляют собой величины, обратно пропорциональные средним временам пребывания молекул в каждой из фаз хроматографической системы на протяжении одного акта сорбции-десорбции. Поэтому они определяют скорость межфазного массообмена. Конечность величин А; и Л1 отражает невозможность мгновенного перехода молекул из одной фазы в другую. В этом случае уравнения (1.6) описывают хроматографический процесс с неравновесной кинетикой. Б случае равновесной хроматографии, который,в основном, и рассматривается в данной работе, левая часть второго уравнения системы (1.6) обращается в нуль и отношение вероятностей сорбции и десорбции пропорционально коэффициенту распределения и:

2± - £. с± = ки. (!•?)

X сс С1 - сС

Здесь коэффициент распределения Кс1 между фазами системы определяется отношением концентрации макромолекул в неподвижной и подвижной фазах. Более строгое определение коэффициента распределения будет дано б разделе п, где, б частности, будет рассмотрено изменение свободной энергии макромолекул при переходе из одной (разы б другую.

Разновидность хроматографического метода, б котором роль неподвижной фазы играет макропористый сорбент, адсорбционно инертный по отношению к молекулам хроматографируемого вещества, называется эксклюзионной хроматографией, если размеры пор соизмеримы с размерами молекул. Этот термин эквивалентен термину ГПХ (гель-проникающая хроматография) и вытесняет последний.

Рассмотрим подробнее поведение полимерного раствора в хроматографической колонке в процессе хроматографирования. Все виды хроматографического анализа предпочтительно выполнять в условиях термодинамического равновесия. В этом случае поведение полимерного раствора может быть проанализировано в деталях, если каждую макромолекулу рассматривать как термодинамическую систему. Вероятность нахождения такой системы в данном состоянии определяется значениями ее свободной энергии р и температуры Т :

М = е ~ Р// К Т, где /< - постоянная Больцмана.

Свободная энергия является характеристикой макроскопического состояния термодинамической системы. Изменение свободной энергии может происходить как за счет изменения внутренней энергии системы, так и за счет изменения энтропии. Стабильным состоянием системы является состояние с минимумом свободной энергии. Для полимерного раствора в хроматографической колонке это состояние соответствует некоторому термодинамически выгодному распределению макромолекул между подвижной и неподвижной фазами.

Вероятности нахождения макромолекул во время хроматогра-фического процесса в каналах подвижной фазы VI/^ и в порогом объеме сорбента определяются следующими соотношениями:

Л/т - —— е" Рт//кТ

5 Vo^-Vp где ^ и - значения свободной энергии макромолекул в каждой фазе. Отношение времен нахождения макромолекул в фазах системы определяется отношением этих вероятностей: и/*,, ts + (1.9) где ~Ь - время пребывания макромолекул в колонке.

Статистический характер хроматографического процесса позволяет рассматривать вероятности И^ и )А/& также как отношение числа молекул Пт и Из , находящихся в фиксированный момент времени в каждой фазе^к их общему числу П.т-ь/г$

П1

Ш - /ст —

ИЛ =

Пз

Б Пт + Пх

Значения Пт и /1$ могут быть выражены через концентрации С и С вещества в фазах системы:

Г ^

1 - / -— т и ух. >

Пг = , где ^ - масса макромолекулы. В этом случае формула (1.9) принимает вид

1± - Уя (1.П)

Ьт ]/0 с

Таким образом,

Ь. = Уе. (Ы2) у- \/ ^

-т. 1/0 где Кс1 - коэффициент распределения между фазами системы, определенный соотношением (1.7).

Сравнение (1.10) и (1.11) дает выражение коэффициента распределения как функции изменения свободной энергии макромолекул при переходе из одной фазы в другую: — л Г/к Т

1\с1 = е . (1.13)

Таким образом, коэффициент распределения К<£ определяется различием А Я" между значениями свободной энергии макромолекул в подвижной и неподвижной фазах хроматографической системы. Изменение свободной энергии макромолекул, происходящее при переходе из каналов подвижной фазы колонки в поры сорбента, может относиться как к изменению энтропии, так и к изменению энтальпии. Так,взаимодействие между сегментами макромолекул и стенками пор приводит к изменению энтальпии макромолекул. Комбинированное изменение энтропии и энтальпии увеличивает свободную энергию макромолекулы при попадании в пору, если энергетическое взаимодействие между сегментами макромолекул и матрицей сорбента является отталкивающим. В этом случае Л положительна, меньше, чем И/^и для макромолекулы более "выгодно" находиться в одном из каналов подвижной фазы, чем в норовом объеме сорбента. При таком взаимодействии Кс1 меньше единицы. Если сорбенты инертны по отношению к анализируемому веществу, то есть нет изменения энтальпии при попадании макромолекулы в пору (взаимодействие со стенками отсутствует), уменьшение энтропии приводит к возрастанию свободной энергии. Следовательно, в этом случае также , И^М^и Кс(< I . Обе эти ситуации типичны для эксклюзионной жидкостной хроматографии. В последнем случае имеет место идеальная ЭЯХ, а в первом случае осуществляется ЭЖХ на сорбентах, несовместимых с полимерами в данном растворителе.

Если энергетическим взаимодействием между полимером и сорбентом является притяжение, то свободная энергия макромолекулы при попадании в пору может как возрастать, так и убывать. Возрастание будет иметь место, если уменьшение энтальпии недостаточно для компенсации уменьшения энтропии. В этом случае, как и выше, Л/-">0 , И4<Щп и ^¿/<1. Свободная энергия будет уменьшаться, когда уменьшение энталыши перекрывает уменьшение энтропии. Тогда Д ^<0, \fiZs > и Если первый случай может классифицироваться как ЭЬ'Х, сопровождающаяся слабой адсорбцией, то последний соответствует адсорбционной хроматографии.

2. В ЗЗяХ полимеров помимо закономерностей общехроматографического характера имеются свои специфические особенности, связанные с разнообразием исследуемых объектов, сорбентов и условий проведения анализа. В их основе лежит необходимость перехода от удерживаемых объемов, получающихся в результате хроматографического эксперимента, к соответствующим молекулярным массам. Существуют различные концепции механизма хроматографического разделения вещества. Основными предпосылками этих концепций являются различные физические причины зависимости удерживаемых объемов от молекулярной массы, скорости элюции, концентрации раствора, его температуры, растворителя и особенности структуры молекул анализируемого вещества.

В геометрической концепции / 8-10 / учитывается соизмеримость размеров макромолекул и пор сорбента. На основании этого оценивается допустимый для проникновения макромолекул объем пор. При этом исследуются различные модели пор: сферические, щелевидные, набор пересекающихся сфер разных диаметров и сферические и эллиптические формы макромолекул.

Б диффузионной концепции / II-12 / процесс рассматривается как существенно неравновесный. Этим объясняется его зависимость от скорости элюции. В такой концепции считается, что разделение макромолекул происходит из-за различия в скоростях их диффузии.

В гидродинамической концепции / 13 / рассматриваются условия, при которых результаты ЭНХ-эксперимента могут быть объяснены за счет гидродинамического разделения макромолекул в потоке.

Рассмотрим более подробно термодинамическую концепцию / 14-18 /, в которой закономерности ЭЖХ выводятся в условиях равновесия с учетом конформационных изменений макромолекул при переходе из одной фазы в другую, а именно, две наиболее апробированные опытом модели, развитые в рамках этой концепции: модель эквивалентных сфер и конформа-ционную модель. Б первой из них / 16 / используется эффективный "хроматографический размер" макромолекул. При этом учитывается, что гибкоцегшые макромолекулы являются статистическими ансамблями элементарных сегментов, распределенных в пространстве по определенному закону. Для линейных макромолекул в равновесных условиях этот закон распределения близок к гауссову. В модели предполагается, что каждой макромолекуле можно сопоставить статистический ансамбль эквивалентных сфер с радиусами К , распределенный по закону: у^О м^г^УЧ1^2^ (хл,) ьг где Г\си - усредненный по ансамблю (1.14) квадрат радиуса эквивалентной сферы.

Предполагается также, что для фиксированной сферы из ансамбля эквивалентных сфер доступны по размерам все поры сорбента, размеры которых не меньше радиуса данной сферы Я . Суммарный объем, доступный для сферы радиуса Я , есть

Уасс,и = ( 4^(1)¿г, (Ы5) где - плотность функции распределения пор по их размерам.

Таким образом, в равновесных условиях общий доступный размер^лор для макромолекулы со среднеквадратичным радиусом определяется следующим образом: со ос> , //2

Vq.cz = Vp\( \ ')с1Я, (1.16)

I/ 0 я где Ур - полный объем пор сорбента.

Пользуясь формулой (1.16), легко определить коэффициент распределения

Кс1 = \/асс/]/р • (1.17)

В работах / 16, 2Г: / рассматривалось также время Т^с пребывания макромолекулы в каждой конформации. Если это время много больше среднего времени Т ее пребывания в зерне сорбента на протяжении одного акта сорбции-десорбции ), то можно считать, что макромолекула пребывает в каждой конформации с вероятностью, определяемой распределением (1.14), и каждую из возможных конформации можно рассматривать как "замороженную". Авторами работ / 16-19 / показано, что и при других соотношениях Т.к и Т можно пользоваться выражением (1,14). Механизм разделения макромолекул по размерам в модели эквивалентных сфер можно назвать молекулярно-ситовым. Здесь макропористый сорбент играет роль молекулярных сит, "просеивание" через которые зависит от соотношения эффективных хроматографических размеров макромолекул и пор сорбента. Описание этого эффекта с помощью равенства (1.16) выглядит наиболее естественным, если в качестве сорбента использовать пористые стекла или сили-кагели, для которых понятие поры более реально, чем для гелей. ЭВМ-расчеты, проведенные для установления адекватности теоретических и экспериментальных значений Va.cc , показали / 16 /, что наилучшие результаты получаются при где ^л / - среднеквадратичный радиус инерции макромолекулы. Таким образом, среднеквадратичный радиус эквивалентной сферы, которой можно моделировать макромолекулу в ЭЖХ-зкспери-менте, следует считать равным 2(Кг), то есть близким к половине максимального расстояния между сегментами данной макромолекулы^ У/2 Н = 1,7 /?* ^ ) /15/.

В рамках этой модели приближенно оценивается также диффузионная подвижность макромолекул в каналах пористого тела (для некоторых модельных форм каналов).

В работах Касасса / 17-19 / сформулирована модель равновесного механизма разделения в ЭЕХ, основанная на учете информационных изменений, происходящих с макромолекулами при межфазных переходах. Для отыскания вероятности \А/ попадания макромолекулы в нору сорбента в рамках этой модели задается геометрическая структура пористой среды (цилиндрические, щеле-видные, сферические поры) и рассматриваются случайные блуждания сегментов макромолекул в одной из пор сорбента при условии, что сегменты не соприкасаются с границей поверхности. Каждый возможный путь случайного блуждания рассматривается как одна из возможных конформаций макромолекулы. Множество всех таких путей соответствует множеству макромолекулярных конформаций, разрешенных внутри данной поры. Описывая случайные блуждания диффузионным уравнением, Касасса получил для различных моделей пористой среды следующие выражения для вероятности попадания гибкоцепной макромолекулы в поры сорбента радиуса Ъ из каналов неподвижной фазы (то есть для коэффициента распределения Кс1 ): I) случай сферических пор:

Л т-4 Ъ

2) случай цилиндрических пор:

3) случай щелевидных пор:

2 Л

КЛ - I £ 77~-7г <«р[- ^^ - 7 (1.21) где^т 171-ш корень уравнения ( У0 - функция

Бесселя 1-го рода нулевого порядка).

Эти зависимости сравнивались с экспериментальными данными ЗЕК на сферосиле / Г7 / и на пористых стеклах / 21 / с узким распределением по размерам пор. При этом наилучшее совпадение получалось для модели щелевидной поры.

Зависимость вероятности попадания макромолекулы в пору фиксированного размера от размеров макромолекулы показывает, что элюционные кривые, полученные в Э32Х, содержат информацию о размерах молекул и полидисперсности исследуемых полимерных образцов. Наряду с этим, связь, существующая внутри каждого гомологического ряда, менду среднеквадратичным радиусом макромолекул ( К1 /^ж их молекулярной массой

М I 22 / = //5/У ^ (1.22 ) где ^ и й- - константы Марка-Куна-Хаувинка, ^ - константа Флори), позволяет получать информацию также и о молеку-лярно-массовых характеристиках полимеров - их ММР и средних молекулярных массах (СМИ). Определение этих характеристик является одной из основных задач метода ЭIX полимеров.

Для дальнейшей интерпретации хроматографических экспериментов необходимо использовать присущую данной хроматогра-фической системе молекулярно-массовую зависимость

А/=М([/), (1.23) связывающую значения удерживаемых объемов V полимергомо-логов с их молекулярной массой. Описанная процедура, а также зависимость (1.23) называется калибровочной. Во П разделе подробно описаны способы ее определения.

3. Основная сложность интерпретации хроматограмм заключается в том, что они отражают не истинные распределения по молекулярным массам, а искаженные. Это связано с размыванием зон полимергомологов в хроматографической системе. Поэтому для определения ШР желательно ликвидировать это искажение, скорректировать хроматограмму на "приборное уширение". Интерпретации хроматограмм, связанные с учетом "приборного уширения',' имеют три уровня. Все они основываются на использовании интегрального уравнения Фредгольма первого рода: [г№(У)-&(у, \/)сК/, (1-24) впервые в Э)КХ введенным Л.Тангом /25 / и называемым его именем. В этом уравнении /г(V)- экспериментальная хроматограм-ма№(9)- хроматограмма образца в таком виде, какой бы она имела в отсутствие нежелательных процессов, приводящих к размыванию полимергомологов, V/ и - удерживаемые объемы, ограничивающие хроматограмму, (т(У, V)- функция приборного уширения, имеющая смысл хроматограммы полимергоыолога, первый статистический момент которого есть V . Тангом же был предложен метод решения уравнения (1.24), использующий конкретный вид искомой функции \М(\/), предполагая, что она может быть хорошо аппроксимирована полиномом следующего вида: у/(?) = екр[-р*(у- ч0)1]-£ (У-Уо)Ч, (1.25)

I - о где КI - коэффициенты полинома; р и К - два дополнительных параметра. Для этого интегрируется уравнение Танга с некоторым заданным ядром Сг(У, У) и предложенным видом функции \А/(у). После этого из получающейся системы алгебраических уравнений, выведенных при различных значениях V , находят величины , р и \/о и тем самым хроматограмму V) » скорректированную на "приборное уширение1'. Для успешной реализации этого метода необходимо знать ядро описывающее размывание полимергомологов при их хроматографирова-нии. Танг и Смит / 23, 2>-\ / предложили гауссовый вид этой функции, дисперсия которой считалась постоянной и определялась непосредственно из хроматограммы. В дальнейшем Тангом учитывалась зависимость дисперсии от удерживаемых объемов / 25 /, и был показан экстремальный характер этой зависимости (с максимумом при некотором значении удерживаемого объема).

- г>\

Гамилеком и Рэем / 26 / был предложен свой способ определения дисперсии, основанный на сравнении некоторой средней молекулярной массы (например, средневесовой Мы ) образца, полученной при интерпретации хроматограммы, с этой же средней молекулярной массой образца, полученной независимым методом.

Предположение о симметричном (в данном случае - гауссовом) характере размывания хроматографической зоны является принципиальной неточностью, сознательно допускаемой на первом уровне интерпретации, связанной с коррекцией хромато-грамм на "приборное уширение", так как на самом деле размывание хроматограым асимметрично из-за некоторой неравновесности ЭЕХ-процесса и концентрационных эффектов. Относительная погрешность £ в определении средних молекулярных масс, связанная с пренебрежением асимметрией размывания, оценивается / 2? / следующим образом = \{Сг\-Ь иг3 ¿п 10} (1.2б) где 5 - площадь сечения подвижной фазы колонки; Т3 - время запаздывания в установлении термодинамического равновесия между фазами; - тангенс угла наклона касательной к калибровочной кривой с осью V . Эта оценка показывает, что погрешность 6 не зависит от длины колонки, увеличиваясь с увеличением скорости элюции и площади сечения колонки и с понижением селективности колонки (пропорциональной I /). К повышению значения погрешности 6 приводит также увеличение диаметра зерен сорбента и уменьшение диффузионной подвижности элюируемых макромолекул, так как при 3 этом возрастает значение с .

Исправляет описанные недостатки использование в уравнении Танга асимметричного ядра / 28-52 /, что приводит к следующим уровням интерпретации. Так, Гамелеком и Волком / 53 / была развита процедура коррекции значений средних молекулярных масс, полученных на предыдущем уровне интерпретации, на основе корректировки коэффициентов молекуляр-но-массовой калибровочной зависимости. Б этом случае исправленные значения, например, средневесовой молекулярной мае-сы Мы- определяются следующим образом: ы), с1-27) где М^- средневесовая молекулярная масса, полученная на предыдущем уровне интерпретации, а $& - параметр, определяющий степень скошенности ( бклллгйг^ ) хроматограымы, а именно разность между первым статистическим моментом хрома-тограммы (ее "центром тяжести") и положением ее максимума, деленная на стандартное отклонение . Такая коррекция позволяет говорить о втором уровне учета "приборного ушире-ния" при интерпретации хроыатограмм.

Использование же асимметричных функций в качестве ядра уравнения Танга приводит к наиболее полному третьему уровню учета "приборного уширения". Сложность заключается в подборе такого ядра. Оно должно быть достаточно близким к истинной функции приборного уширения и, что особенно важно, иметь достаточно простой и удобный вид для практического использования. С этой целыо рядом авторов в работах / 34-38 / апробировались следующие функции: а) модифицированный гауссиан: у7) = \/7 1/¿)/2(Уг], (1-28) б) конволюция гауссиана с экспонентом:

Ш V) -1 \ьхр (- г/?) ЩО[- ^^(1.25 ) о в) асимметричный гауссиан: V)- у) ¡///г (Г2], (1.30) г) композиция гауссиана с полиномами Эрмита: д) ряды Эджворда, Грамма-Шарлье и композиции с ними гауссианов: где / (УУ) - гауссиан; Ап - известные функции статистических моментов.

Таким образом, подбирая параметры в (1.28) - (1.32) , можно рассчитывать МНР и СММ полимеров, используя уравнение Танга и калибровочные зависимости. Однако функции вида (1.28) - (1.32), несмотря на вариацию параметров, значительно отличаются от их экспериментального аналога - хромато-грамм полимергомологов, а при использовании рядов (1.32) остается открытым вопрос, на каком члене ряд следует оборвать, чтобы получить достаточно хорошее приближение к эксперименту. При этом часто оказывается, что увеличение числа членов ряда приводит к ухудшению результата. Отсюда можно сделать вывод, что выбор функции описывающей приборное уширение, должен носить не случайный характер, а органически вытекать из закономерностей хроматографического процесса.

4. Дальнейшее развитие метода ЭЕХ позволило использовать его для изучения обратимо взаимодействующих, а именно изоме-ризующихся, комплексообразуюш,их и ассоциирующих макромолекул. Это оказалось важным для изучения биополимеров. Так, при определении молекулярной массы биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.) необходимо учитывать взаимодействие их макромолекул между собой и связанное с ним образование ассоциатов, изомеров и комплексов. При известной же молекулярной массе биополимера хроматографический эксперимент позволяет делать выводы о характере взаимодействия, о константах равновесия изомеризации, ассоциации или комплексообразо-вания белков.

Исследование ассоциации белков играет важную роль в биофизике, так как ассоциация тесно связана с биологической функцией белков. Особенно ярко выражена роль обратимых реакций ассоциации-диссоциации при осуществлении метаболического контроля ферментативной активности. Смещение равновесия между активной и неактивной формами фермента, имеющими различную степень ассоциации, при изменении температуры, рН или при связывании низкомолекулярного лиганда, - таков один из вероятных механизмов контроля активности для многих ферменtob / 39 /.

Для исследования ассоциации белков удобно пользоваться транспортными методами анализа, такими как седиментация, электрофорез, хроматография.

Первое сообщение о таких работах было сделано Гильбертом / 4-0 / в Фарадеевском обществе в 1955 году. В нем идет речь о возможности электрофоретического и седиментационного изучения обратимо взаимодействующих белков. При этом обращалось внимание на нелинейность дифференциальных уравнений, описывающих эти взаимодействия, изучалась асимптоматика поведения решения для некоторых частных случаев. 1

В основе метода Гильберта, развитого им совместно с Джен-кинсом в работах / 40-42 /, лежит предельное упрощение математической задачи, связанной с седиментацией ассоциирующих молекул. Первоначально развитый для седиментации'метод Гильберта в дальнейшем был применен также в 3IX Бетуни, Акерсом и Циммерманом / 43-45 /. Используемые упрощения заключаются в двух предположениях:

1) скорости реакции ассоциация-диссоциация бесконечно велики

2) размывание хронатографической зоны, не связанное с процессом ассоциации, отсутствует.

В этом случае уравнения, описывающие ЭНХ-ироцесс при наличии ассоциации типа М^ пМ (без промежуточных ассоциатов), имеют следующий вид: г г ^ К п. Lti ~ w (1.^3) г г п

- Kn.Cn. + Ki L/ . г-Ч^ II djA dx dU -гЪ du н - с/x

Здесь и [ц, - концентрации, соответственно мономера и /1 -мера; V} и Щ, - скорости движения но хроматографиче-ской колонке мономера и ¡1 -мера; К^ и Кп,- кинетические константы реакций ассоциации и диссоциации.

В качестве начального условия используют, как правило, "ступеньку", которой описывается задний или передний фронт широкой зоны, а именно:

С, = С,°[1-Х(*Л , С^с:й-Х(т)] (1.54) Х(х) - Функция Хевисайда).

Использование широкой зоны связано с тем, что если белок вводить в хроматографическую колонку в виде узкой зоны, она будет со временем размываться, концентрация внутри нее уменьшаться и, в силу нелинейности системы (1.57), доля белковых мономеров в зоне будет расти, а скорость движения зоны падать. Таким образом, узкая зона с ассоциирующими белковыми молекулами при хроматографировании движется с переменной, постепенно понижающейся скоростью /46/. Это создает дополнительные трудности при интерпретации результатов эксперимента. Поэтому в Э1Х экспериментах с ассоциирующими белковыми молекулами предпочтительней работать с широкими зонами, размывание которых не оказывает существенного влияния на концентрацию в них белка и сказывается, главным образом, лишь на краях зоны. При этом за движением зоны удобно следить, наблюдая перемещение ее переднего и заднего центроидов /46/.

Кроме условия (1.34) в начальный момент времени предполагается условие равновесия, то есть

С{ ~ Кп С^ .

Ясно, что предположение о бесконечных скоростях реакции, приводит к тому, что из теории Гильберта невозможно определить кинетические константы К\ и Кц, и можно говорить только о константе равновесия и -к л п. •

1.35)

В этом случае, сложив оба уравнения (1.32) и воспользовавшись соотношением (1.34), получают уравнение, в которое входит только V/ . Решение этого уравнения выглядит так: О при я/^ < го / 1 1Г - осН ) ' " > иул %

Г. в остальных случаях

Выражение для Са в этом случае может быть получено из соотношения (1.35).

График функции С, (^^/¿^приведен на рис.: т 1

Рис. I

Из соотношения (1.38) определяется скорость движения фронта V : г О ri-i

1Г| + У~п к п. L i.

1 + к'пСГ*1 '

Формула (1.37) показывает, что скорость фронта заключена в интервале между г^ и t^ (см.рис.1).

Для удобства дальнейшего анализа полученного решения Гильберт и Дженкинс ввели безразмерную переменную S" :

ЛГп- х/6

В этом случае общая концентрация белка

С = С, + Са = {к'4 ^(¡éf-J) - А (h-ф. (I -33)

Если рассматривать хроматограмму на выходе из колонки, то есть при фиксированном OQ-t , где -L - длина колонки, то формула (1.38) представляет собой зависимость концентрации от времени или от удерживаемого объема. На практике удобнее рассматривать не сам профиль фронта хроматограммы, а производную от него C(ó'). При этом можно определить такое значение S'-Smitij при котором С (5) достигает максимума:

Формула (1.39) показывает, что при /1=2 зависимость унимодальна, при /1=3 в этой зависимости могут появиться два лика. В этом заключается один из основных результатов теории Гильберта-Дженкинса. Однако, два пика могут появиться только в том случае, когда полная концентрация белка на плато превышает концентрацию, соответствующую С^т'/г- Поэтому отсутствие второго максимума не является критерием того, что реакция идет по схеме М^Мс пренебрежимо малыми концентрациями промежуточных ассоциатов. При наличии двух максимумов но формуле (1.39) может быть оценена степень ассоциации IV по значению удерживаемого объема, соответствующего минимуму. По значению же концентрации С~Ст1а в этой точке может быть определена константа равновесия г 2(п2-1) -,п~< п-г / Сщсп -I [(Япч)п]п

К =

Попытки отказаться от упрощающих предположений, присущих методу Гильберта-Дненкинса, были предприняты рядом авторов. В основном это относится к работам Акерса, Циммермана, Халь-ворсона, Канна и Кокса /46-48, 50-56/.

В этих работах предварительно задача формулировалась в наиболее общем виде (находясь в рамках ограничений Гильберта) следующим образом. Пусть в данной хрокатографической системе взаимодействуют ассоциаты до порядка (ъ . Кроме того, пусть каждый ^ -мер имеет в среднем /7?у изомерных форм, которые могут возникнуть при наличии симметрии связей ассоциирующих единиц /49/ и существенно отразятся на молекулярном размере, что;в свою очередь, скажется на коэффициенте распределения

КЛу = Уаес, у /Ур} где Va.ce/ij - доступный объем нор для ^ -мера, находящегося в [ -м изомерном состоянии. Уравнение для определения концентрации мономера в этом случае выглядит так: где V - текущий объем элюции; £ у- — р ~ доля доступного объема компонента б общем объеме колонки;

Кц - константы равновесия. Предполагается, что в началь-о ный момент времени существует равновесие между компонентами, а именно

Таким образом, в данной постановке задачи требуется определ / лить величины ¿у , , и /г , считая оС , р , /77/ известными параметрами. В упомянутых работах предлагаются следующие пути решения этой задачи методом Э1Х.

Если для простоты считать, что изомерные формы отсутствуют, то, поскольку коэффициент распределения К.(1 всей системы является средневесовым коэффициентом распределения компонент, можно его определить формулой

Кс1 = X Кс1; С-/С (1.40) / У где С0 - общая концентрация белка на плато. Дальнейшая задача исследования заключается в следующем: используя информацию, полученную из хроматографического эксперимента, определяют для белка с начальной концентрацией С0 число ассоциатов, их концентрации С; , стехио и метрические константы реакции ассоциации К^ , распределение по молекулярным массам (или стоксовым радиусам) ассоциатов в данном растворе. Рассмотрим наиболее общий подход к решению этой проблемы, предложенный Акерсом. В этом иод-ходе описывается процедура определения числа компонентов в системе без предварительного предположения о природе реакции. Он основан на вариации пористости сорбента (геля) в колонках.

Фундаментальным вопросом исследования ассоциации макромолекул методом Э1Х является вопрос о влиянии присутствия матрицы геля на течение реакции в системе. Большое количество экспериментов с различными белками и гелями, проведенных, в частности, Акерсом с сотрудниками /57, 58/, указывают на то, что матрицы геля не влияют на поведение системы •в колонке. Особенно убедительно этот вопрос решен в работе /59/.

Согласно формуле (1.40)

1<с1х = X ^ } (1.41) где. индекс "х " относится к гелю данной пористости; весовая доля ^ -мера в системе. Для каждой колонки пористость ее геля по отношению к молекулнрно-ситовому поведению можно охарактеризовать с помощью универсальной калибровочной зависимости коэффициента распределения от стоксового радиуса молекул. Характерной особенностью всех калибровочных функций является то, что коэффициенты распределения как функции сток-совых радиусов и калибровочных констант геля являются линейно-независимыми /58/. Это видно из следующих рассуждений. Полный доступный объем Часе для молекулы радиуса и при нормальном распределении ^(Ъ) пор по размерам определяется следующим образом; и со

Уасс = Vp 14>(l)dl = Vp где tto , So - калибровочные параметры для данного геля (они являются параметрами распределения Гаусса т(%)). Таким образом,

Cl^Clo+ So ttfe'd (Kd); (I .42 )

1-1 1 где Vij-e - обратная к -Vi¿-с функция.

Акерс сам исследовал ряд белков, а некоторые данные взял из литературы и показал, что наблюдается хорошее совпадение формулы (1.42) для довольно широкого класса гелей (аггрозы, сефадекса, Gr -75, &-I00, G--25, &-50, G-200, эластина). Поэтому калибровку (1.42) часто называют калибровкой Акерса. Если же наполнить колонку смесью двух гелей, то коэффициент распределения в этом случае будет иметь вид

Kd=uri Kdi +(i-uri)Kdt=ur1 Vife (-^ff1) + где "V^i и (/-^i) - соответственно доли внутреннего объема пор, связанные с каждым из двух гелей; ß-oi , ¿ol - калибровочные константы каждого из гелей. Так как линейная комбинация функций Ol^-C сама не является функцией того же класса, то не существует отличных от нуля постоянных ¿^ и ¿2. таких, что

Б этом смысле и понимается линейная независимость калибровочных функций. Конкретно это означает, что в случае смеси гелей для нельзя подобрать калибровочные константы <2о и ё0 такие, чтобы

В уравнениях (1.4-1) коэффициенты распределения зависят от -стоксового радиуса ^ -мера и от параметров, характеризующих гель с индексом "х которые можно определить независимо для каждой колонки калибровкой по известным образцам. Таким образом, уравнения (1.41) содержат 2 гь неизвестных /у и Кс1х. Следует иметь в виду дополнительное П- А соотношение У I; = 1 .

Поэтому экспериментальные данные, полученные на Яп-1 колонке с гелями различной пористости определяют все параметры // и ¿2/ для данной системы, после чего концентрации

00 / г / г компонента определяются из соотношения "// • определения стехиометрии и равновесных констант данной ассоциирующей системы выполняют вышеописанную процедуру для каждой из серий различных начальных концентраций С0 . Общее число компонентов в данной взаимодействующей системе можно определить и независимым образом. Это важно знать, так как в ассоциирующих системах некоторые из компонентов обычно присутствуют в ничтожных количествах и необходимо определить, сколько компонентов надо учитывать в расчетах. Для этого эксперимент проводится для М различных начальных концентраций в А/" колонках с гелями различной пористости. В этом случае аналогом уравнений (I.4I) является уравнение, которое удобно записать в матричной форме

Kd^F-Kd, (I.«) где Kd-{(Kdx)¿l F = {fo},Kct = {KJJX}три матрицы; индекс с относится к определенной начальной концентрации C0¿ ; í - i + И ; X - i -г- }\f) j - i -f- ¡г.

Если предположить, что М ж больше /2, , то ранг матрицы h равен рангу матрицы Kd (поскольку миноры матрицы Kd отличны от нуля в силу отмеченной выше линейной независимости коэффициентов распределения). Таким образом, определение числа ti сводится к определению ранга экспериментально построенной матрицы Kd . Следует также отметить, что в случае, когда MN, из матричного уравнения (1.43) можно определить матрицы F и Kd .

В работе /58/ Акерс приводит экспериментальные данные, полученные на трех колонках, заполненных соответственно сефа-дексом От -75, & -200 и смесью этих сефадексов. в пропорции, обеспечивающей среднюю плотность декетрана, близкую к сефа-дексу G- -100. В качестве образцов использовались: У -глобулин, цитохром С, миоглобин, овальбумин, трипсин, табачная мозаика и ряд других белков. Полученные результаты подтвердили одно из основных предположений метода - линейную независимость калибровочных кривых.

Экспериментальная трудоемкость описанного подхода, которую отмечает и Акерс, заставила его обобщить этот метод, применив конструкцию одной колонки с искусственным градиентом пористости геля. Экспериментальное обоснование возможности метода градиента пористости дано в работе /60/. Б этой работе описывается установка для ультрафиолетового сканирования границы зоны вдоль колонки. Здесь же дано убедительное подтверждение невлияния присутствия гелевой матрицы на ход реакции в системе, а также равенство скоростей движения центроидов передней и задней границы зоны вдоль колонки. Однако предложенный метод также требует очень сложного эксперимента с использованием новой техники. Дальнейшее развитие теории ЭК ассоциирующих систем шло по линии учета влияния диффузного размывания хроматографической зоны и отказа от предположения о бесконечно больших скоростях реакции ассоциация-диссоциация. Важность учета хроматографического размывания видна из следующих схематических рисунков (рис.2) /58, 61/.

Рис. 2

Рис. 2(а) относится к модели Гильберта для ассоциации -химотрипсина (мономер-димер-тример), рис. 2(6) представляет собой экспериментальный результат. Качественное отличие теории и эксперимента бросается в глаза. Система дифференциальных уравнений /51-55/, описывающих хроматографиче-ский процесс ассоциирующей системы, например, типа мономер--П- мер (без промежуточных ассоциатов), выглядит, в отличие от системы (1.25), следующим образом:

Нелинейный характер этой системы не позволяет найти аналитическое решение без каких-либо предположений типа тех, которые были сделаны Гильбертом. Поэтому в работах /51-55/ описываются методы численного решения такого типа систем на ЭВМ и приводятся результаты этих решений. Однако проводить численное решение системы тина (1.44) можно только в том случае, когда известны все коэффициенты, входящие в эту систему, а именно, , , ^ , ъГп, и в том числе те параметры, которые требуется определить: и • Перебор параметров К^ и К п. в надежде получить совпадение численного решения с экспериментальной хроматограммой (считая даже известной стехиометрию реакции) является безнадежным ввиду того, что при каждом наборе параметров приходится заново численно решать систему дифференциальных уравнений в частных производных параболического тина (1.44), что занимает много машинного времени. Поэтому в перечисленных выше работах изучается лишь влияние изменения тех или иных параметров на характер получающейся при этом хроматограммы, то есть решается прямая задача ассоциации. В этих работах было отмечено существенное влияние на вид хроматограммы как кинетических констант Кс , так и коэффициентов дисперсии /.I и коэффициентов распределения Кс(-С , входящих неявным образом в систему (1.43). Возможность решения обратной задачи в этих работах не обсуждается. В работе Хальвор-сона и Акерса /50/, относящейся к обратимой изомеризации лизоцима, на основе аналитического построения асимптотики решения системы дифференциальных уравнений, описывающих этот процесс, делается попытка решения обратной задачи, то есть определение кинетических констант /К^ и К¿> . Это стало возможным ввиду того, что случай изомеризации существенно проще случая ассоциации в силу линейности задачи.

В связи с проблемами, отмеченными в данном обзоре, перед автором были поставлены следующие задачи:

1) разработать'метод коррекции хроматограмм на приборное уширение, лишенный недостатков, связанных с некоторым произволом в выборе функции приборного уширенин, неадекватностью ее экспериментальному аналогу - хроматограммам полимергомо-логов и сложностью практического использованиями применить его для хроматографического определения ?.ШР полимеров и олигомеров;

2) разработать метод хроматографической порометрии сорбентов;

3) провести математическое моделирование хроматографи-ческого процесса обратимо взаимодействующих макромолекуляр-ных систем и на его основе решить обратную задачу определения кинетических и равновесных констант изомеризующихся и ассоциирующих белков. гвауднствЕШя езшзтш

СССР нагни В. II. Лзнина

П. ЭКСКЛЮоИОНПЛЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НЕВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ МАКРОМЕЛШЯРНЫХ СИСТЕМ

§ I. Классификация калибровочных процедур

Методы эксклюзионнои жидкостной хроматографии широко используются при определении молекулярно-массовых распределений (МНР) и средних молекулярно-массовых характеристик полимеров, как в условиях производства, так и при изучении свойств новых полимеров /56-58/ (в том числе и биополимеров). Хотя методы ЗЕХ. не являются, вообще говоря, абсолютными для определения ЬШР, тем не менее различные способы интерпретации хроматограмм (часто с использованием ЭВМ) позволяют получать г.ШР исследуемого образца. При этом в зависимости от того, какой информацией обладает исследователь и какова цель его работы, необходимо пользоваться тем или иным способом интерпретации. Однако в любом случае при исследовании полимеров методом ЭЮ£ большое значение имеет калибровочная процедура хроматографическок системы, дающая возможность перейти от удерживаемых объемов V к молекулярным массам М полимера.

Для удобства приведем классификацию возможных калибровочных процедур, в которую входят как общепринятые и хорошо известные процедуры (пп. 1-3), так и разработанные автором (пп. 4-5).

I. Одной из самых важных является прямая процедура определения калибровочной зависимости хроыатографической системы при наличии охарактеризованных узкодисперсных стандартов исследуемого полимера.

Этот случай является наиболее простым и удобным при определении »MP. Необходимая при этом калибровочная зависимость

M=m(V) (2.I) получается хроматографированием стандартов и нанесением точек, абсциссами которых являются удерживаемые объемы пиков этих хроматограмы, а ординатами /'5S7

M = (MurMn;)i/Z.

Здесь А/^г- средневесовая молекулярная масса (ГШ); Мп-среднечисленная ММ, значения которых являются маркировочными данными стандартов. Далее с помощью одной из процедур сглаживания, осуществляемой обычно на ЭВМ, через полученные точки проводится калибровочная кривая. Если пренебречь приборным уширением (учет влияния которого рассматривается ниже), ММР исследуемого полимерного образца можно найти из условия

F(V)clV- с£(M)dM, (2.3) где - хроматограмма полимера; ^(М) - ненормированное

4P r.liViX .

Тогда нормированное V.MP ¿^М) определяется следующим образом: J/y j F(v)dv о

Обычно используют калибровочную зависимость, связывающую не

И с V , а jM с / : t0M = f(V). (2.5)

Это связано с тем, что при ЗЕХ но многим причинам удобно пользоваться калибровкой, для которой в достаточно широком диапазоне изменения удерживаемых объемов V эта зависимость близка к линейной. Если в качестве искомой функции выбрать не ^(М), а распределение по логарифмам молекулярных масс определяемое следующим образом:

2.6) то л

2.7) о

Видно, что при линейности калибровочной зависимости (2.5) (когда с^М/ЙИесть константа).,распределение по логарифмам молекулярных масс V является простым зеркальным отображением хроматограммы (поскольку с увеличением М уменьшается И и Л^М/ЛУ отрицательная константа) с заменой V на М в соответствии с калибровочной зависимостью (2.5). С этим фактом связано одно из преимуществ использования линейной калибровочной зависимости. Следует отметить, что распределение ^(^М)содержит в себе ту же информацию, что и распределение ^(М) ; они взаимно однозначно связаны друг с другом соотношением С^ ^Л/) —

2. Для определения калибровочной зависимости можно воспользоваться хроматограммой одного образца при условии, что она охватывает требуемый диапазон удерживаемых объемов (то есть, чтобы образец был достаточно широкодисперсен).

Дополнительным необходимым условием является его полная охарактеризованное^, то есть известное дифференциальное или интегральное LIMP. С этой целью проще всего сопоставить интегральную, предварительно нормированную хроматограмму стандарта и его интегральное 'Л'Р Q(M). Функция Q(Mj показывает весовую долю макромолекул, входящих в состав полимера и имеющих молекулярную массу, меньшую, чем Гл. Функция Ф()/) показывает весовую долю макромолекул, выходящих из колонки с объемом элюции, меньшим, чем V . Для тех значений V , которым соответствует молекулярная масса М, должно быть справедливо равенство

Q(M) + <P(V)=i, (2.6)

Рис. 3. Определение калибровочной зависимости по широкодисперсному полимерному стандарту с известным ЖР. которое и позволяет провести калибровку колонки. На практике более удобно определять не При этом равным ординатам соответствует пара абсцисс М и V , дающая точку на калибровочной кривой. Графическое пояснение описанной процедуры дано на рис. 3. Основная неточность в определении LIMP полимера по калибровочной зависимости, найденной таким способом, будет вноситься погрешностью, с которой определено МИР полимерного стандарта.

3. Очень часто исследователь не имеет охарактеризованных узкодисперсных фракций изучаемого полимера. Однако, если • известны его константы Марка-Куна-Хаувинка в том растворителе, в котором происходит хроматография, то можно воспользоваться калибровкой по узкодисперсным стандартам другого полимера.

В этом случае необходимо воспользоваться общей для всех полимеров в данном растворителе на данной колонке универсальной калибровочной зависимостью Бенуа /60/:

M-[,j]=f0(v), (2.s) где I tj] - характеристическая вязкость узкодисперсных полимерных стандартов в исследуемом растворителе. Эта зависимость была получена по аналогии с тем, что сфера радиуса (3/(4 Ji)-■ M///JJ^вращается и движется в растворе так же, как и соответствующая ей макромолекула с молекулярной массой М и характеристической вязкостью [fj] , и в предположении, что такая же ситуация имеет место и в порах сорбента. Это означает, что в качестве размера, характеризующего макромолекулы (независимо от их формы и внутренней структуры), в 3F1 мокно воспользоваться произведением М . Правомочность выбора МОр в качестве размера для различных типов макромолекул в ЭЖХ обоснована в работах /60, 61/, а также в экспериментах других авторов /62, 63/. В соответствии с этим можно говорить о принципе универсальном (то есть общей для всех макромолекул) калибровки хроматографических систем в т.

Учитывая зависимость Марка-Куна-Хаувинка С^]=КМ , для одного и того же объема элюции можно написать кмлн-к'м"/", рло) где штрихованные величины относятся к полимеру, стандарты которого используются, а нештрихованные - к исследуемому полимеру. Из соотношения (2.10) легко получить калибровочную зависимость (цМ для исследуемого полимера: где калибровочная зависимость, получаемая экспериментально по стандартам (см.п.1).

4. При использовании универсальной калибровки Бенуа необходимо знание констант Марка-Куна-^аувшша исследуемого полимера в данном растворителе. т'1сли они не известны, то их можно определить хроматографическим методом по средним моле-кулярно-массовым характеристикам /М^-, Мп или нескольких образцов исследуемого полимера, полученных независимыми методами. Хотя такая принципиальная возможность обсуждалась ранее /64/, мы приведем более удобный алгоритм определения констант Марка-Куна-Хаувинка, доведенный до ЭВМ-программы, и варианты его применения. Поскольку со

F(y)M(V)olV, о

Мп- V J F(v)/M(v)dv,

2.12) о оо К j F(v) М л()/) с! V, здесь F(V) - нормированная хроматограмма), то с учетом универсальной калибровочной зависимости (2.10) можно записать

М = i оо ij a+i a+i a+i a+d

F(v)M I/ 0 со a+i к

F(v)M~*+*dV, (2.13) i a ¡y л+i ^ a+i j о aJaJft) F(V)M' dV, или полимерных стандартов, используя калибровочную зависимость (v)

I Щ-Ю со

СС+1

Мй=| с а+1 м

2.14) У а оо а(а'+1) а + 1 И с

Б этом случае величины не зависят от неизвестной величины К . Здесь индексы с и ^ определяют номера образцов исследуемого полимера, для которых фигурирующие в левых частях равенств средние характеристики известны. Аналогично модно записать соотношения для Мп'с/М1у } Мъгс/М^у ^¡/[ц] • Отличие лишь в том, что в равенствах (2.15) индексы I и ^ могут, вообще говоря, совпадать. Во все, полученные таким образом уравнения входит одно неизвестное - константа Марка-Куна

Хаувинка О- исследуемого полимера. Поскольку система уравнений избыточна, то определять из нее константу Сс целесообразно методом наименьших квадратов, а именно, из условия минимума функции л 11 / ^Ч (&) \ 2 до-ь (1- ^), (2.1б) где 1Ь - число охарактеризованных полимеров; ^¿у - одна из комбинаций, стоящих в левых частях полученных уравнений; /и.1\(&)- выражения, стоящие в правых частях. После определения таким образом константы Марка-Куна-Хаувинка ОС можно на основании уравнений (2.14) найти константу К • Для этого необходимо минимизировать функцию г(«)= (I- ) , 1 где^71/; - одна из средних характеристик С -го образца; соответствующее ей выражение, стоящее справа в уравнениях (2.14).

По найденным таким образом константам !,;арка-Куиа-Хаувин-ка по формуле (2.11) определяется калибровочная зависимость. При отыскании констант Марка-Куна-Хаувинка ¿2, и К с помощью описанной процедуры необходимо учитывать, что для каждого образца не обязательно иметь все средние молекулярно-ыассовые характеристики (достаточно иметь какую-либо одну); хотя надежность результатов повышается с увеличением числа охарактеризованных образцов, можно использовать данные только для двух образцов, имея для каждого из них по какой-либо надежно определенной средней молекулярно-массовой характеристике. Однако, если использовать две средние характеристики только для одного образца, то, как показывают проведенные нами численные эксперименты на ЭВМ, результаты оказываются менее надежными.

5. Предложим еще один способ определения констант "арка-Куна-Хаувинка, когда ШР исследуемого полимера близко к логарифмически нормальному /65/ или, в случае небольших полидис-персностей 1Л (£¿^1,5), к распределению Шульца /66/. Используя связь между распределением С^ £ по логарифмам молекулярных масс и обычным ГЛГЛР ^ (М):

2.18) можно выражение для средневязкоетной молекулярной массы полимера

М1 = ( \м Ч (м) ) > (2Л9) о переписать следующим образом:

00 /1 Л л 4 аС-иМ

М/^ - ( ) е гМ))" (2.20)

После замены переменной М=Х' последнее выражение запишется в более удобной форме

Му=(| еахр(х)с{х)\ (2.21)

В случае логарифмически нормального ¡ШР (ОС- Хс) п м = (2.22)

1 } {2тсЪ 9 где С"2 - дисперсия распределения, 0Со--£п.Мо- значение .¿пМ. , приходящееся на максимум распределения.

Вычислив М^ по формуле (2.21) с учетом (2.22), получим чл д , а2а/2 М/? = Мое . (2.23)

Положив в (2.23) СС - I, получим, согласно (2.19), выражение для М-их:

9 (2.24) при & ~ -I получим выражение для М^ :

Мп=м0е . (2.25)

Формулы (2.24) и (2.25) показывают, что (Т2=^пи, где И= М<ьо-/Мгь ~ полидисперсность образца.

Исключение из формул (2.23) - (2.25) дисперсии дает следующие зависимости: д . 1-сс

МгЧМ™Мл

М<1 = МГА , ' (2.26) дг? = м^ м»*-, м0 = (й^: последнее из которых хорошо известно и широко используется /55/.

Пользуясь полидисперсностыо полимерного образца 1С , выражения (2.26) можно переписать иначе:

МГ

М/7 = Мо и

В частности, для гибкоцепных полимеров константа изменяется в пределах от 0,5 до I, и из формул (2.26) следует, что М^ принимает значения в интервале от \!М0 Мы АО Мы.

Формулами (2.26) - (2.27) можно успешно пользоваться в ряде случаев: а) Для определения характеристической вязкости образца по одной из следующих формул: у] = К Мп М^ , (а)

Ц =К М^ МоаС1'а), (б) (2.28) км;*1 м«"* (в)

Формулы (2.28) получены с использованием уравнения Парка-Куна-Хаувинка К . Чтобы ими пользоваться, необходимо знать константы К и (X. , а также какую-либо пару из средних молекулярно-массовых характеристик: М-иГ3 Мц Мо. В ряде случаев для определения Мо можно использовать хро-матограмму данного образца в любом растворителе на колонке с калибровочной зависимость», близкой к линейной. Б этом случае, как уже отмечалось выше, определив по калибровочной зависимости молекулярную массу, соответствующую максимуму хроматограммы, получим Мо (при условии, если приборное уширение не приводит к его сдвигу). Принимая во внимание, что для хроматографии требуется значительно меньшее количество анализируемого вещества, чем для вискозиметрии, можно заключить, что в некоторых случаях удобно определять характеристическую вязкость по формулам (2.28). б) Для определения констант ','арка-Куна-Хаувинка с использованием приведенных формул необходимо знать характеристические вязкости двух образцов изучаемого полимера в данном растворителе, а также их Мп и Мыг{одну из последних можно заменить Мо , определив ее, например, по хроматограмме). Получаемые при этом формулы имеют следующий вид:

Mwi \ о zfMm Мш\+о(ЬЬи /Ма.Л(й02Ь. d - Щ ( Muí Мпг) <4 Мыг / ИП2 J fj?]z 'llúfMlLl /Мм ). íMm Мш ) ^Mvrz/ MnzJ " Ч ( MÍa)Z MhJ (2.29) i

К^ЦЪ'Мщ -AW, (2.30) где индекс I относится к первому образцу, а индекс 2 - ко второму.

В случае, когда полидисперсности образцов отличаются слабо, вместо формулы (2.29) можно воспользоваться приближенной формулой для вычисления :

2.31) где

С1о =

Млп - Ц Мт

2.32) нулевое приближение, определяемое по зависимости от о

1д Щ-^Уъ

2.33) характеризует относительную погрешность, вносимую при определении константы СС по формуле (2.32) вместо формулы (2.29). Если, например, полидисперсности образцов отличаются в 1,5 раза, а их молекулярные массы в 10 раз, то различие между ¿2 и а0 составит Э%. Б случае равных полпдисперснос-тей (Х-йо.

Чтобы сравнить средневязкостные молекулярные массы, получаемые при использовании логарифмически нормального ММР и распределения Шульца, формулу для определения М^ из /66/ . преобразуем к более удобному для сравнения с (2.26) виду:

На рис. 4- приведены графики зависимости относительного м. = м ^

1 ГШ где Г (ОС)гамма-функция.

-4-Х расхождения сГ- —^ ^ значении Мп , полученных из лога

Мг1 с рифмически нормального МмР и распределения Шульца, из которых видно, что при полидисперспости ^-<1,5 величина не превышает 2%. Поэтому в случае небольших полидисперсностей, даже если заранее известен тип гП;;Р - по Шульцу, можно пользоваться формулами (2.26) - (2.2Н) и следствиями из них.

Справедливость формул (2.28) - (2.31) была проверена на полистирольных стандартах фирмы " IVatets" Б смеси диметилфор-мамида с 0,04 U Llbx и 0,005 М щавелевой кислоты. При этом использовались константы Марка-Куна-Хаувинка, найденные из хро-матографического эксперимента по методике, описанной в п. 'к Сопоставление результатов расчета и измерений приведено в таблице I:

CD ta к к cd о о cd cá

4J О

КЛ ^

• C\J

C\J ГА о а

C\J

О ^

ГА С\!

• ГО í\J

СМ О tí I o^ с\1 '-N О

C\J NN

N/ •

C\J

О 4—' г» О

I си

КО il

СО-3" Рч О- I \

- о ъ

CD !—! Ч

V0 0* о it C4J-3- о 1 - о С 1—1

II о\

СО ¡1 ÍH

VD D- 1 \

О У - О R О Hft w: л ен о о и

OD 03 m и cd ^ о

CD К fc* О

CD ЕЧ Я

Оч cd я К tï4 cd о ►тЧ ин о к cd cd

Л сН о е

С\]< С\Г M

OJ г» о к л о к о h--« cd cd r< со

О C\J^ К • 'О СМ^

J со

К4. со

О о к cd о t-^-t о •-г»

Cd S

Он tri

00 см' с\г

OJ г» о I

X CD а «

CD cd ¿3 M со га ГА О

СО г» о со со Ъ о о

О Л

Г" о

Я"

CD РЭ cd

Он о о о о о

OJ "к о о о [>

О 40 с=з со

Хорошее совпадение рассчитанных и измеренных величин говорит о возможности использования приведенных формул в случае унимодальных симметричных распределений по логарифму ММ.

Если при вычислении характеристической вязкости по уравнению Марка-Куна-Хаувинка воспользоваться в качестве средней молекулярной массы средневесовой, а не средневязкоетнок, то ,цопускаемую при этом относительную погрешность 6 можно вычислить исходя из формулы (2.28-а): а(1-Ю/2 И

- 1

2.35) ии= 2,0

Рис. 5

Графики зависимости 6 от ¿^ для разных значений полидисперсности приведены на рис. 5, из которого видно, что, начиная с И, ~ 1,5, погрешность, вносимая только заменой Мг^ на Миг может превышать десятки процентов (повышаясь для жесткоцепных макромолекул).

Отличие формул типа (2.26) - (2.28) от аналогичных формул, полученных для других распределений (включая и распределение Шульца) /66/, заключается в их простоте и удобстве использования.

§ 2. Определение ММР полимеров на основе полной коррекции хроматограмм на "приборное .уширение" с использованием калибровочной зависимости по первым четырем статистическим моментам хроматограмм полимеров

Б этом параграфе решается задача коррекции хроматограмм на приборное уширение с использованием пирсонова характера размывания полимергомологов и на основе этого определяется ММР полимеров. Для ее решения представим в начальный момент времени раствор исследуемого вещества, являющегося, как правило, либо сложной смесью различных компонентов, либо смесью полимергомологов, вводимый в хроматографическую систему обычно в виде узкой зоны, суперпозицией дельта-функций:

Щ = Г 1(^)1 (2.36) 4) г 1 где {■ [X, 1)\ = С. д-(-х).

Здесь функция описывает распределение ¿' -го полимергомолога в хроматографической колонке в любой момент времени. Если бы в процессе хроматографирования зона индивидуального полимергомолога не размывалась, то функция ^ (х^) описывала бы продвижение этой зоны в виде дельта-функции по хроматографической колонке со скоростью , определяемой размерами молекул полимергомолога, а именно,

2.37)

В терминах удерживаемых объемов, принятых в хроматографии, выражение (2.37) на выходе из колонки запишется следующим образом

1(у)=с1 ^(у-у-,), (2.38) где - удерживаемый объем, соответствующий I -му поли-мергомологу, СI - его статистический вес. В формуле (2.38) фигурирует только одна переменная (в отличие от двух переменных формулы (2.37)), так как на выходе колонки значение фиксировано. При непрерывном распределении полимергомологов, хроматограмма, получающаяся на выходе из колонки, должна представляться не суммой вида (2.36), а интегралом: го

Р(у) = I V) ¿V, (2 - 39) гд- статистический вес полимергомолога, выходящего с удерживаемым объемом V . Таким образом, хроматограмма ь(У) представляет в этом случае не что иное, как функцию \А/(у). Такое превращение узкой зоны на входе колонки в широкую зону на выходе из нее в данном случае связано исключительно с распределением молекул по размерам.

Однако в действительности идеальные соотношения (2.37) и (2.38), а, следовательно, и (2.3?) не имеют места, так как зона каждого гомолога по мере продвижения но колонке претердевает размывание. В основе этого размывания лежит статистический характер хроматографического процесса на всех стадиях: от массообмена между фазами до гидродинамического и диффузионного перемешивания вещества при движении вдоль колонки, а также размывание во внеколоночных коммуникациях хроматографа: блоках ввода и вывода раствора, насосах , соединительных капиллярах. В этом случае при непрерывном распределении поли-мергомологов хроматограмма индивидуального гомолога на выходе из колонки будет представляться уже не функцией S'^V- V), а более сложной функцией двух переменных G-(VjV). Первая переменная в этой функции есть удерживаемый объем, являющийся аргументом хроматограммы данного полимергомолога, а вторая переменная - первый статистический момент (математическое ожидание) этой хроматограммы, - используется для идентификации этого полимергомолога (ее роль играет индекс L при дискретном распределении). Соотношение, аналогичное (2.39)» теперь должно быть записано так:

Иг

F(v)= \w(v)&(Kv)dv, (2.40) где Vj и - удерживаемые объемы, ограничивающие хрома-тограмму исследуемого образца; ^(у) ~ хроматограмма, а W(V) - хроматограмма образца в таком виде, какой она должна иметь в отсутствие процессов, приводящих к размыванию хро-матограмм полимергомологов, то есть дт/ункция, описывающая статистические веса полимергомологов и отвечающая, следовательно, в конечном счете за Ш/1Р исследуемого полимерного образца. Поскольку ЭКХ полимеров основана на разделении полимергомологов по размерам их молекул, то все остальные процессы, связанные с размыванием и, следовательно, препятствующие этому разделению, являются нежелательными. Их следует по возможности ограничивать, а при интерпретации хроматограмм учитывать. Задачей коррекции хроматограммы на приборное уширение и является поэтому решение уравнения (2.40), то есть нахождение функции по известной хроматограмме и известной функции приборного уширения представляющей хроматограммы полимергомологов на выходе из колонки, имеющие различные первые статистические моменты.

Остановимся подробней на характере интегрального уравнения, описывающего приборное уширение хроматограммы. Уравнение (2.40) для определения интересующей нас функции V/(V) , являющееся уравнением Фредгольма первого рода, как было отмечено в разделе I, было впервые в Э31Х предложено Л.Тангом и с тех пор часто называется его именем. Необходимо заметить, что в общем случае постановка задачи о решении интегрального уравнения Фредгольма первого рода не является корректной /67/. Однако, ее можно сделать корректной, если показать, что для точного значения существует единственное решение уравнения принадлежащее компактному множеству 'ТИ' в том пространстве функций, в котором ищется решение /67/. Будем искать решение уравнения (2.40), в соответствии с физическим смыслом этого решения, в метрическом пространстве непрерывных функций с чебышевской метрикой /68/. Существование единственности решения ^(у) докажем следующим образом. Предположим, что существуют два решения уравнения (2.40): и №¿(1/).

Тогда функция - является решением однородного интегрального уравнения

Чг

2.41)

Поскольку функция неотрицательна, то, чтоОы удовлетворить уравнению (2.41), функция И1&(у) должна быть либо нулем, либо знакопеременной функцией. Пусть область, в которой функция знакопостоянна. Выберем в качестве V такой удерживаемый объем I/* , для которого функция как функция от V равна нулю в области кг7 и положительна в области (в силу определения функции V) это всегда можно сделать). Тогда, поскольку равенство (2.41) должно выполняться тождественно при всех V , то есть в том числе и при V = V , можно записать Уз уг г* |7) /ГГ

Второе слагаемое в равенстве (2.42) обращается в пуль, так как в области [У^ У.х] функция О (У* первом же слагаемом подинтегральное выражение знакопостоянно. Следовательно, в области [У^ У3] должно выполняться условие УУ^О . Продолжая эти рассуждения, можно показать, что №^-¿7 во всей области

147, что и доказывает единственность решения уравнения (2.40).

Решение уравнения (2.40) осуществляется на ЭВМ методом перебора функций в некотором множестве м , выбор которого основывается на физических соображениях, накладывающих ограничения на вид функций Ниже множество будет описано подробнее. Метод перебора заключается б решении прямой задачи для данного класса корректности й последующей минимизации невязки /67/, то есть модуля разности величин, стоящих в левой и правой частях уравнения (2.40). На практике решению уравнения (2.40) должно предшествовать определение функции нриоорного уширения б-(к у). Остановимся подробнее на возможности экспериментального определения функции приборного уширения. Аналитический вид ядра уравнения (2.40) &(у?\/) а. рч1ог1 неизвестен, а асимпто-* тические решения дифференциальных уравнений, описывающих хроыатографический процесс, настолько громоздки, что использовать их для целей интерпретации экспериментальных данных неразумно. Поэтому, проводя коррекцию хроматограмм па приборное уширепие, в качестве функции обычно используют пункцию Гаусса, которая с точки зрения математики удобна в обращении, а с точки зрения хроматографии близка к истинной. На этом уровне коррекции значения средних молекулярных масс определяются на 5-20/э точнее, чем без коррекции. В тех же случаях, когда требуется более точное определение ШЛР и средних молекулярно-массовых характеристик полимеров, учитывают степень несоответствия функции Гаусса истинной функции приборного уширения и зависимость ее параметров от удерживаемого объема. Причиной этого несоответствия является, главным образом, асимметрия приборного уширения (его скошенность -ькшыгс^ ) /28-30/. Учет скошенности и связанная с ней дополнительная коррекция средних молекулярных масс приводит к повышению точности на Ъ-Т/о по сравнению с предыдущим уровнем интерпретации /33/. При этом следует подчеркнуть, что дополнительная коррекция в этом случае касается обычно не ШДР, а только средних М1:!.

Поиску асимметричных функций, описывающих приборное уширение, достаточно близких к истинной и в то же время имеющих удобный и несложный для расчетов аналитический вид, посвящен ряд работ /69-71/. Рассмотрим этот же вопрос с новой точки зрения, позволяющей получать результаты в пределах воспроизводимости хроматографического эксперимента, почти полностью исключая погрешности, связанные с приборным уширением /72/. В основе предлагаемого метода лежит доказанный ранее /70/ пирсоновый характер хроматографического размывания, в соответствии с которым каждый полимер-гомолог, проходя через хроматографическую колонку, размывается, образуя кривую, представляющую собой одно из распределений семейства Пирсона /73/. Это семейство распределений наиболее часто встречается при описании физических явлений и может быть полностью охарактеризовано своими первыми четырьмя статистическими моментами. Поэтому, отыскав четыре момента хроматограмм узкодисперсных образцов во всем диапазоне удерживаемых объемов V , можно для каждого значения V найти распределение Пирсона, характеризующее хроматографическое размывание.

Для получения моментов распределения предположим, что узкодиснерсные полимерные стандарты, используемые для калибровки хроматографа, в пределах погрешности ЗЖХ-экспери-мента можно рассматривать как логарифмически нормальные (нами, в частности, использовались полистирольные стандарты фирмы " М/а^ет^") > которых по логарифмам молекулярных масс имеет вид (2.22). В этом случае, как следует из формул

2.24) и (2.25), маркировочные значения ^аи Мк/атан-дартов полностью восстанавливают это распределение, а именно

ТаГ /Мгь),

2.«)

Х0= -1п.М0~{Ь1(М*гМп) и, следовательно, ММР.

Используя калибровку данной хроматографической системы и восстановленное 1?ШР, можно при помощи стандартной операции замены переменной И на V получить хроматограмму, которая соответствовала бы данному стандарту в отсутствие хрома-тографического размывания. Если калибровочную зависимость задать в виде

2.44) то искомая хроматограмма /г(У), определяемая условием

1'(\/)с/ К= 1, (М) с(М; (2.45) может быть найдена, в соответствии с (2.18) и (2.22), по формуле £ К^СГ ¿V ■ (2.46)

Сравнивая полученную таким образом хроматограмму, лишенную размывания, с реальной, можно найти разности их статистических моментов ( I = 2, 3, 4), каждую из которых можно рассматривать как соответствующий момент функции V) описывающей размывание в колонке полимергомологов, хрома-тограммы которых в отсутствие размывания представляются дельта-функциями. Проделав эту процедуру со всеми калибровочными стандартами, можно получить значения высших моментов размывания во всем диапазоне удерживаемых объемов. В результате, наряду с обычной калибровкой хроматографа по максимумам хроматографических пиков или по первым моментам хроматограмм , мы получаем калибровку по их первым четырем моментам. В соответствии с результатами работы /64/, эта калибровка является универсальной для данной хроматографи-ческой системы, то есть пригодной для любых исследуемых методом ЗИ, полимеров.

Точность при определении высших моментов меньше, чем при определении первого момента. Появляющаяся при определении моментов относительная погрешность Д связана с погрешностью в определении как абсциссы А^ , так и ординаты А^ соответствующих точек хроматографических пиков

Д = Д х + Д^ ^ (2.47) причем Д ос ~ 1 Ду •

Погрешность Ау общая для всех моментов, а Аос увеличивается вместе с номером момента пропорционально ему. Соотношение (2.47) показывает, что даже для четвертого момента вклад Дэс в Д меньше половины. А если учесть, что в современном хроматографическом эксперименте Д^ меньше 1%, то ясно, что погрешность в определении значений высших моментов не превышает допустимых норм.

Описанная выше методика проведения коррекции хроматограмм на приборное уширение была опробована для характеристики хроматографической системы, состоящей из четырех колонок, и анализа на ней ряда стандартных полимеров и их механических смесей. Эксперименты проводились на жидкостном хроматографе Хй-1304 при скорости элюции 50 мл/час. Б качестве элюента использовался тетрагидрофуран. Колонки длиной 60 см и внутренним диаметром 0,4 см из нержавеющей стали были упакованы макропористыми стеклами со средним диаметром частиц 25-32 мкм. Диаметр пор стекол в каждой из колонок был следующим: 180, 120, 45, 26 нм. Концентрация пробы составляла I мг/мл.

Рис. 6

На рис. 6 приведена калибровочная зависимость хроматографической системы, полученная по полистирольным стандартам. На рис. 7 показаны калибровочные зависимости второго, третьего и четвертого моментов хроматограмм полистирольных гомологов, найденные для этой системы. Сложный вид зависимостей, приведенных на рис. 7, вызван нелинейным характером калибровки по первому моменту (рис. 4). ь, (счёп)¿

В качестве множества перебираемых с помощью ЭВМ функций рассматривалось множество кусочно-постоянных неотрицательных функций с некоторыми шагами А V но оси I/ , которые можно варьировать в зависимости от требуемой точности вычислений и затрачиваемого на вычисления времени. При этом тот факт, что величина шагов Д^ ограничена снизу разностью удерживаемых объемов, соответствующих двум соседним. полимергомологам (с номерами, отличающимися на единицу), а ординаты этих функций очевидно ограничены сверху, показывает требуемую для корректности компактность перебираемых функций. б

Рис. 8. Хроыатограммы I смеси (а) и 11 смеси (б):

I - экспериментальная, 2 - откорректированная

На рис. 8 приведены хроматограмш-' механических смесей иолистирольных стандартов, дающие унимодальный и бимодальный пики, а также их вид после проведения коррекции на приборное умирепие. Характеристики компонентов первой смеси: М^ 20800, Мп,= 2С000 и М^- 36000, М^ = 33000. Характеристики компонентов второй смеси: Мъг= 200000, Ми = 193000 и М^~ 498000, М, = 404(100. Весовые

0,51, £¿=0,49

Члг~ 1 • 1ц соотношения компонентов в смесях: ^ и Я1 ~ ^'^'б, 0,504 соответственно.

Как видно из рис. 8, нескорректированные на размывание хроматограммы не дают правильной информации о составе смесей. Данные таблицы 2 также показывают, что значения М^М^ М^/Мц

Таблица 2

Результаты обсчета хроматограмм стандартов и их смесей

Анализируемые образцы Стандартные средние "лМ Рассчитанные средние Ш ч

Миг МЛ Миг ^ МП. без коррекции с коррекцией

Ми-- и м* П-По Но ' {00% Мъг М*. /¡¡-Миг и-ий Ко '{00%

ПС-98000 10000 9600 1,042 9700 5450 1,780 70,9 10300 9550 1,078 3,5

ПС-20500 20800 20200 1,040 18500 15000 1,233 18,6 21050 20300 1,037 0,3

ПС-50000 51000 49000 1,041 52700 46450 1,135 5",0 50050 48050 1,042 0,1

ПС-196000 200000 193000 1,036 188500 165750 1,124 8,5 197350 188300 1,048 1,2

ПС-450000 498000 404000 1,233 491600 400100 1,299 0,3 492000 401000 1,227 0,5

I смесь ПС 28300 24800 1,141 28600 22600 1,265 10,3 29900 25000 1,159 1,6

П смесь ПС 350200 261950 1,337 336200 226000 1,488 11,3 350200 256500 1,365 ? т С , л. I ( искажаются на 20-40;;3 независимо от нолидисперсности. В то же время из рис. £ и данных таблицы 2 видно, что скорректированные на размывание хроматограммы правильно отражают состав анализируемых смесей и дают для них значения молеку-лярно-массовых характеристик Мы /М ^ (см.табл.2), отличающиеся от истинных не более, чем на '¿-5%.

Рис. 9. молекулярно-массовые распределения и о л и с т и р о льных с м е с е й

Заметное отклонение полидисперсности от заданной для ИС~ -9800 объясняется выходом соответствующей ему хроматограм-мы в области удерживаемых объемов, в которой резко ухудшается селективность хроматографической системы (область, близкая к пределу проницаемости хроматографической системы). По этой же причине для ПС-9800 наблюдается наибольшее отклонение и для скорректированной полидисперсности от заданной. С этой точки зрения пользоваться линейной калибровочной зависимостью лучше. На рис. 9 приведены соответствующие хроматограммам рис. 8 рассчитанные МНР полистирольных смесей.

Описанная выше методика коррекции опробовалась также на охарактеризованном ранее /74/ широкодисперсном полистироль-ном образце Р5 -706 (1А.Ъ. Ь1ъИопъ1 Вичеаи о/ 51зпс/а2с/з), исследуемом методом микроколоночной хроматографии /75/. Б таблице 3 приведены результаты расчетов и данные из работы /74/.

Таблица 3

По литературным данным Без коррекции 0 коррекцией

М п 136,5 х Ю3 108 х Ю3 (148-5) х Ю3

М*г (278-5) х 103 324 х Ю3 (273-5) х М3

11з таблицы видно, что положительный эффект коррекции весьма значительный, что говорит в пользу описанной выше методики .

Таким образом, использование калибровки по 4-м статистическим моментам хроматограмм иолимергомологов позволяет, осуществлять прецизионный метод определения ;.ШР полимеров.

§ Определение молек.улярно-массового распределения олигомеров

Одним из наиболее современных методов исследования МИР и других характеристик олигомеров является ЗЕК. Информативность метода "Э1Х существенно повышается при использовании высокоэффективных хроматографических колонок, которые, будучи соединенными в серии, образуют хроматографические системы с эффективностью Д/>10000 теоретических тарелок. При высокоэффективной ЭЗКХ (БЭКХ) вся хроматограмма олиго-мера или хотя бы ее часть разделяется на соответствующие олигомергомологам отдельные пики. Отличительной особенностью ВЭЖХ является то, что экспериментальные хроматограммы позволяют непосредственно наблюдать дискретный характер М.';1Р олигомеров и по 'размерам: пиков на хроматограмме определять вид МНР. К сожалению, экспериментально не всегда возможно достичь полного разделения всех без исключения олигомергомологов. В условиях ВЭУ;"Х высокого разрешения (без использования рецикла) удается добиться хорошего разделения (с коэффициентом разделения Кд >4 )^для олигомергомологов со степенью полимеризации р ^ 20 . В обычных условиях получаемые для олигомеров хроматограммы имеют вид, представленный на рис. 10, и поэтому возникает необходимость применения аналитических или графических процедур

Рис. 10 разбиения хроматограмм на пики, соответствующие индивидуальным олигомергомологам.

Существенным недостатком обычно используемых для этой цели процедур является искусственный и упрощенный их характер, приводящий к существенным погрешностям в определении ММР и не дающий простого и удобного критерия правильности проводимой интерпретации. Предлагаемый автором способ определения LIMP олигомеров лишен этих недостатков и, хотя требует применения вычислительной техники для его реализации, достаточно прост и ясен. Применение же быстродействубщих ЭВМ позволяет, как будет показано ниже, его полностью автоматизировать.

Определению МНР из хроматограмм обязательно предшествует процедура коррекции этих хроматограмм на приборное уширение. В основе этой процедуры лежит подтверждаемый экспериментально такт, что хроматограммы олигомергомологов разных степеней полимеризации являются симметричными и имеют не общую пирео-нову (как в случае полимеров), а гауссову форму /76/, то есть ли) где (j(y,Vp)- хроматограмма р -мера, нормирование которой дает функцию приборного уширения G[V, V) , фигурирующую в уравнении (2.40), Ар vi (Тр - максимальная ордината и стандартное отклонение пика олигомергомолога со степенью полимеризации р , выходящего с удерживаемым объемом Vp другой особенностью ВЭЖХ олигомеров является возможность проведения калибровочной процедуры по положениям максимумов разрешившихся пиков известных степеней полимеризации р . Таким образом, хроматограмма высокого разрешения обеспечивает самокалибровку колонок для олигомеров данного тина и для анализа их SviLIP нет необходимости в специальной калибровочной процедуре.

Третьей особенностью в Э1Х олигоыеров является зависимость чувствительности детектирования (отношения величины сигнала детектора к концентрации олигомергомолога) от степени полимеризации.

Получаемая из эксперимента хроматограмма олигомсра h (У) может быть достаточно точно представлена суперпозицией гауссовых кривых

Р^Ртах p-i 1 7

2.49) где 1 - диапазон изменения степеней полимеризации олигомергомологов в образце.

Процедура проведения наиболее полного исследования ?,ГР олигомеров может быть условно разделена на три этана /77/:

1) представление экспериментальной хроматограммы как суммы гауссовых пиков отдельных олигомергомологов;

2) коррекция соотношения площадей пиков на зависимость чувствительности детектора к концентрации от р ;

3) собственно определение М'.'Р и средних молекулярно-массовых характеристик.

На первом этапе хроматограша олигомсра представляется как суперпозиция гауссианов Ур) . Каждый олигомергомолог характеризуется при этом тремя величинами: положением максимума Ур , стандартным отклонением и амплитудой /\р . Если нахождение этих величин для полностью разрешенных пиков не представляет труда, то в случае частично или полностью перекрывающихся пиков задача резко усложняется тем, что вклад в эти величины вносят соседние пики. Менее всего перекрывание влияет на Ур , поэтому в нервом приближении производится поиск параметров и Ар , а величины Ур определяются методом последовательных приближений, принимая за начальное приближение калибровочную зависимость, которая в нашем случае имеет вид

Vp = v(p) (2.50) и определяется по полностью и частично разрешенным пикам на хроматограмме. Аппроксимированная затем одним из известных способов (например, полиномом невысокой степени), калибровочная зависимость позволяет определять Vp и для неразделив-шихся пиков высокомолекулярной части олигомера.

Поиск (у обычно отличается тем обстоятельством, что на хроматограмме олигомеров пики низкомолекулярных олигомергомо-логов (хотя бы двух) разрешаются так, что для них с достаточной степенью достоверности можно экспериментально определить (Ур . Для того, чтобы выяснить истинный вид зависимости (Jp от р , на первом этапе предполагается, что при 31Х (Г-const (см., например, /78/) или имеется простейшая (линейная) зависимость <ЗГр от Vp

- ъ где параметры б^ и найдены экспериментально и относятся, например, к мономеру, ]/0 - удерживаемый объем, соответствующий р=ртах1 - соответствующее ему стандартное отклонение, варьируемое в процессе счета. При каждом , регулирующем угол наклона прямой (2.51), задача сводится к определению амплитуд гауссианов Ар , которое осуществляется методом наименьших квадратов, то есть путем минимизации невязки

К Ртаэс Л , . 2 р = 4 I где индексом отмечены выбираемые на хроматограмме (У) точки, в которых необходимо добиться наилучшего совпадения с рассчитываемой кривой, К - число таких точек.

Эта задача равносильна решению системы из ртах линейных алгебраических уравнений, которую коротко можно записать в векторной форме

5А=- Т . (2.53)

Здесь А = - вектор, составленный из искомых амплитуд, б= ] ~ симметричная матрица размером ргпах х Ртах элементами которой служат величины где

2.55) К

2.56)

Решая систему (2.53), например, методом Гаусса /'79/, можно при сделанных выше предположениях определить все параметры гауссианов, которыми аппроксимируются пики полимергомологов.

Описываемый метод использовался для интерпретации хромато-граммы олигостиролыюго стандарта фирмы " [Ьетсса,1хх

США) с М/ъ- 600 на колонке, наполненной узкой фракцией (с диаметром нор: 25 ^ с[р 4 32 мкм) стиролдивипилбензольного геля 232 (Институт макромолекулярной химии, Прага, ЧССР). Примеры сопоставления правой и левой частей соотношения (2.49) при сг0=<х2 и <Г0 = 0,2 (счет.) даны на рис. II ( I - экспериментальная хроматограмма, 2, 3 - рассчитанные при СГ0 - су2 и (Г0 =0,2 (счет.) соответственно).

4 2 1 2 ' 3

АО

50

60

70

Ц счёты

Рис. II

Варьируя параметр 6"0 в уравнении (2.51), можно найти зависимость невязки Д от (Го . Вид такой зависимости приведен на рис. 12.

1Д 40 ^ счеты \

1А СГ^ счёты

О 0.2 0.6 1

Рис. 12

Из рис. 12 видно, что, несмотря на выраженный минимум при ^ = 0,45 (счет.), суммарная невязка Д на всю хромато-грамму остается значительной. Это проявляется в расхождении экспериментальных и расчетных хроматограмм, хотя и не менее выраженном в приведенном примере, чем при ^ - сгг и <3^ ~ = 0,2 (счет.). В то же время из рис. II видно, что, например, при (У*, = 0,2 (счет.) участок хроматограммы, относящийся к олигомергомологу с р = 5, хорошо совпадает с соответствующим участком рассчитанной хроматограммы. Расчеты показывают, что при (Г0 - 0,4 (счет.) совпадают участки дли р - 7, при <3^, = 0,45 (счет.) - для р - 8 и т.д.

Перебирая таким образом волизи где участки , можно определить области Д V и 21 хорошо согрч ласуются друг с другом. Этим способом определяется последовательность величин <Тр , по которой с помощью квадратичной интерполяции строится зависимость Ър от Ур , приведенная для описанного выше примера на рис. 13. Г счёту

Рис. 13

На завершающей стадии первого этапа корректируется калибровочная зависимость (2.50), выбранная ранее в качестве первого приближения. В качестве второго приближения принимается калибровочная зависимость того же вида, скорректированная на небольшие отклонения максимумов пиков экспериментальной и рассчитанной кривой с использованием калибровочной зависимости первого приближения хроматограмм. Эта процедура повторялась в цикле заданное число раз. В результате было замечено, что третья и все дальнейшие корректировки практически не оказывают влияния на рассчитываемую хроматограмму.

В качестве примера на рис. 14 приведены окончательные результаты расчета, проведенные по первому этапу, для описанного выше олигостирольного стандарта. Экспериментальная и рассчитанная кривые практически не отличаются одна от другой во всей области удерживаемых объемов за исключением области с р - 2 и р - 3, что можно, по-видимому, отнести за счет наличия в образце низкомолекулярной примеси.

На втором этапе определяется концентрационный профиль для расчетной хроматограммы с учетом зависимости чувствительности детектора от степени полимеризации. Например, в приведенном выше примере полагалось, что молекулярная экстинкция при длине волны Я = 255 нм не зависит от р , а зависимость

50-55 60 65 70 У меты

45

Рис. 14 инкремента показателя преломления линейным уравнением /80/ описывается

2.57) где В^ — ^/дС ~ мл/мг для высокомолекулярного полистирола в а - 0,77 мл/мг определялась из условия прохождения зависимости (2.57) при р - I через значение 0,17мя/мг (этиленбензол в ТГФ). Значение концентрационного профиля С(У) в точках оС - I * К получается как суперпозиция скорректированных гауссианов по формуле

Ь &Р (V, Уг)/( дп/дС)р 1.

Подобным же образом корректируются площади /р гауссианов, которые соответствуют весовым долям олигомергомологов в общей массе олигомера, то есть дифференциальному весовому ЮР.

На третьем этапе найденные площади '(р гауссианов используются для расчета дифференциальных и интегральных распределений по степеням полимеризации различных типов:

1) дифференциальное весовое

Рта ос и(р) = Гр/рГ Гр! (2-55)

2) интегральное весовое

Р Рта?с

1мг(р)= Л /р/И !р, и р=1 ' х р=4

3) дифференциальное численное рта^с > Р

Рта?с

Р Р /ПСС

Полученные для приведенного выше полистирольного образца ММР представлены на рис. 15. Эти распределения, характеризующие образец не в непрерывном, а в дискретном спектре значений р , представляют собой гистограммы.

0.15

0.1

0.05 0

Я'иг

I- о о Q W

0.5

1 5 iö ПГр 1 5 W IS p 1 5 Ю lip I i 10 \5 p

Рис. 15

Степени полимеризации различных усреднений и соответствующие им средние молекулярные массы определяются по формулам:

-°U2a 0

0.15

0.1

0.05 л <?• ■■----1 ■. ■. i ■ и я по

00

Qn

0.5 i.i ■ о о lj оооа j' • ■1 ■ * 1 ^ ■

Рк = р-рта-х.

Z- гРр р=ч

КН

Р' Ртах: Р г, ГРР к-г

2.63) к-2

Р- ртах K-i/P-Pmait

М к= £ ГР + MfJ /Z Гр (pH + Mf), (2.64) где "к = 1, 2, 3, . соответствуют р/г, р-цт, pz • • • и /Wo,

• • • М0- молекулярная масса повторяющегося звена, М ^ - молекулярная масса концевых Функциональных групп.

В таблице 4 приведены средние значения р и М и их отношений, полученные из хроматограмм олигостирольного стандарта ( Мц = 600), из которой видно, что средние значения Миг/Мпг I »2 , то есть олигостирольный стандарт существенно полидисперсен.

Таблица 4

Результаты расчетов средних молекулярных параметров олигостирола ( /%,= 600) из хроматограмм, полученных с использованием рефрактометрического и спектрофото-метрического детекторов

Детек-' тор рп ргсг Рг Р%+1 М1 Мы Мы-Мги М* Мг

Рефрактометр 5,62 6,68 7,63 8,45 584 655 753 875 1,15 1,14 1,11

Спектрофотометр 5,54 6,71 7,72 8,58 576 658 803 852 1,21 1,15 1,11

Зная, что образец синтезирован по анионному механизму, можно, согласно теории /66/, использовать распределение Пуассона

Яа(р)-еРаР-/Р!' (2-б5) которым описывается ММР анионного полимера. В этом случае

Для описанного выше примера 5,5 , что, согласно формуле (2.66), дает ^^/¡^ = 1.18 и в пределах 2% отклонения соответствует экспериментально полученной величине 1,20.

Следует отметить две особенности описанного выше метода. Первая заключается в том, что олигомеры в исследуемой смеси должны отличаться друг от друга только числом мономерных звеньев. Другая особенность заключается в довольно точном определении зависимости СГ = » которая получается в процессе приведения в соответствие правой и левой частей уравнения (2.49). Отметим также, что эта процедура не всегда обязательна. В таблице 5 приведены результаты расчета средних р и М для некоторых значений СГ0 в уравнении (2.51).

Таблица 5

Хирай-ч// териетшиъ 2 4 6

Го Р п Р'ЦГ

Рг Рх+1

М*

МолГ

М* М1+1

0,2 5,56 6,61 7,55 8,55

0,4 5,63 6,68 7,62 8,45

0,45 5,63 6,68 7,62 8,44

0,5 5,63 6,68 7,62 8,44

578 687 784 869

585 655 782 878

586 695 752

878 с о г

695 752

О 9° и (о з5

0,8 5,6 6,68 7,60 8,41

587 695 ТЛ

875

588 695 750 873

М^/Мп, Мг/Мы Ит/Мг

1,189 1,141 1,108

1,187 1,1 1,10

1,186 1,140 1,108

1,186 1,140 1,108

1,183 1,137 1,107 5

Из сравнения столбцов таблицы 5 видно, что максимальные различия расчетных величин не превышают хотя сходимость ординат расчетной и экспериментальной хроматограмм существенно зависит от СГ0 (см.рис. 12). Однако, для правильного оире-деделения ММР эта процедура обязательна.

Отметим в заключение, что все описанные выше три этапа, включая и поиск зависимости 0"=<Г('Ур), проводились автоматически в рамках одной ЭВМ-программы на БЭСМ-б.

Таким образом, использование описанной процедуры определения ММР олигомеров позволяет считать метод высокоэффективной ЗКХ практически абсолютным методом молекулярно-массового анализа олигомеров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В предлагаемой работе подтверждается, что метод эксклю-зиоиной жидкостной хроматографии является важнейшим современным инструментом исследования свойств макромолекул, с помощью которого могут быть решены сложные задачи изучения полимеров, биополимеров и используемых в хроматографии сорбентов. Определение функции приборного уширепия, проводимое наиболее полно с использованием калибровки хроматографичес-кой колонки по четырем статистическим моментам хроматограмм узкодисперсных стандартов, аппроксимируя их распределениями из семейства Пирсона, позволяет надежно определять ;;;Г.Р оли-гомеров и полимеров, в том числе и узкодисперсных. На форму хроматограмм последних особенно влияет приборное уыирепие. правильная интерпретация хроматограмм олигомеров позволяет точно определять доли всех входящих в него олнгомергомологов не только в области, где они полностью или частично разделяются, но и в неразделенной области хроматограммы. Использование универсальной калибровочной зависимости коэффициента распределения между фазами сорбента от соотношения размеров макромолекул и пор позволяет достаточно точно проводить поро-метрию сорбентов, в том числе набухающих, часто применяемых в хроматографии и недоступных для норометрии другими методами.

Математическое моделирование хроматографических процессов обратимо изомеризующихся и ассоциирующих макромолекулярных систем позволяет определять константы равновесия и кинетики этих реакций как в случае димеризации, так и в случае более сложной стехиометрии.

Адекватность теории и эксперимента проверялась путем сравнения результатов решения прямой и обратной задач ассоциации и изомеризации для модельных систем.

По результатам работы могут быть сделаны следующие выводы:

1) Метод SEX позволяет надежно определять константы Llapica-Куна-Хаувишса полимерных образцов в конкретных растворителях, если известны их средние молекулярно-массовые характеристики.

2) Полная коррекция хроматограмм па приборное уширение, основанное па универсальной калибровке хроматографической системы по четырем статистическим моментам хроматограмм узкодисперсных фракций с последующим их восстановлением распределениями из семейства Пирсона позволяет надежно определять ШР полимеров как широко-, так и узкодисперсных.

3) Определение зависимости дисперсий хроматограмм олиго-мергомологов и инкремента показателя преломления от степени полимеризации позволяет (с использованием ЭВМ) точно и быстро представить хроматограмму суперпозицией хроматограмм олиго-мергомологов с целью определения МНР олигомеров в случае частично разделившихся и нераздедившихся пиков.

4) Математическое моделирование хроматографического процесса обратимо взаимодействующих макромолекулярпых систем позволяет определять равновесные и кинетические константы изо-меризующихся и ассоциирующих макромолекул; этим методом были определены константы изомеризации лизоцима в гуанидинхлориде и ассоциации фосфолипазы А-. аРИЛОЗлЕНИЕ

Условие визуального разделения пиков в хромат01'рафии

Одной из типичных задач хроматографии является исследование состава многокомпонентных смесей. Ири этом качество разделения двух компонентов обычно характеризуют их разрешением К к : г-У,

2(<Г{ + 0ь) ' (ил) где \4-Vj ~ А \/ - разность удерживаемых объемов компонентов, а (Г4 и .02 - их стандартные отклонения. Чем больше , тем разделение лучше. Необходимое для требуемого разделения значение Кц зависит от отношения амплитуд пиков А. - Л^/Л^ и их дисперсий. При визуальном разделении на хроматограмме наблюдаются три экстремума: два максимума и минимум между ними. Эту ситуацию удобно исследовать па примере двух пиков гауссовой формы. Такое рассмотрение проводилось нами ранее в работе /93/, где было получено приближенное условие визуального разделения для близких значений о* и • Обширная графическая иллюстрация зависимости разделения от величины Кц и соотношения амплитуд А ири одинаковых дисперсиях компонентов приведена в монографии /3/. Однако для некоторых практических целей необходимо знать условие разделения двух пиков при существенном различии их дисперсии. В частности, такая задача возникает в хроматографии полимеров, когда требуется обнаружить и идентифицировать небольшую примесь в анализируемом полидисперсном образце. Некоторые нетривиальные результаты, полученные при решении этой задачи, и послужили поводом для данной публикации.

Рассмотрим суперпозицию двух гауссианов i^W2 (У-Vzf

FW^e" -f Л2е . 0,2)

Необходимым условием их визуального разделения, как уже говорилось, является существование трех экстремумов у функции F(K). Приравнивая нулю производную этой функции, получим следующее уравнение:.

2 (J 1-к д 1 где обозначено $ = /^ ^ у ~} & ~ д^ • Требуется найти те значения параметра Кц , при которых уравнение (п.З) с переменной К имеет три корня. Функция, стоящая слева, представляет собой параболу, направленную ветвями вверх при G" > I и ветвями вниз при I и пересекающую ось К в точках и К2- (при (Г = I парабола превращается в прямую, проходящую через начало координат). Изменение не влияет на положение точек пересечения параболы с осью К . Эта парабола при 0" > I, а также функция, стоящая в правой части уравнения (п.З), представлены на рис. 30 кривыми I и 2. Если эти кривые пересекаются в трех точках, то на хромато-грамме будут наблюдаться три экстремума. Именно этому условию и соответствует рис. 31. Если же кривые имеют точку касания, например, при слиянии точек I и П на рис. 31, то визуального разделения пиков не будет. Эта ситуация наблюдается при некотором критическом значении - , являющимся предельным для визуального разделения никое:

СГ\|2

0 + СГ) где < определяется из уравнения

12

П.4) п.5)

Формулы (п.4) и (п.5) позволяют построить зависимость криот отношения амплитического значения коэффициента туд никое А при различных значениях СГ = . В частности, при А = СГ величина всегда равна 0,5.

Рис. 31)

Эта зависимость при некоторых значениях А приведена на рис. 32. Построение проведено только в области А>1, поскольку при значении А0< I и фиксированном СГ^ совпадает со значением К* при А = 1/А0> I иС= 1/сг0 .

Анализ кривых, приведенных на рис. 32, показывает, что при I, существует такое отношение амплитуд пиков (а именно, А >С ), которому соответствует три критических значения Кц* . Например, при (Г = 6 и Л = 6,5 Ке* -= 0,22, =0,38 и = 0,62. Если то разделения нет, если К^ < Кц , то разделение наблюдается; в области < Кц<С разделение также отсутствует, а начиная с К^ = , разделение вновь появляется и растет вместе с ^ . Таким образом,

Рис. 33 видно, что при увеличении расстояния 4 У между пиками в некотором диапазоне Л V визуальное разделение может уменьшаться и даже совершенно исчезнуть. Существуют две области визуального разделения: при К^ < К /г ^ и

К^Жв • Это проиллюстрировано на рис. 33, где приведена суперпозиция двух гауссианов при различном расстоянии между ними. Отчетливо видны две области визуального разделения и область между ними, в которой разделения нет. Такая картина объясняется возможностью существования трех различных точек касания кривых I и 2 на рис. 31, соответствующих различным значениям глубины минимума параболы при изменении . Зависимости, приведенные на рис. 32, показывают также наличие огибающей при (Г> I, мажорирующей все семейство кривых и позволяющей найти критические значения сразу для всех значений СГ . Кривая, соответствующая СГ = I, представляет самостоятельный интерес, так как она позволяет определять для любого отношения амплитуд пиков при одинаковых дисперсиях.

1. Шилов Н.А., Липень Л.К., Вознесенский С.А. Основные закономерности динамики сорбции. - ЖРФХО, 1929, т.61, C.1.07-III8.

2. Дубинин М.М. Физико-химические основы сорбционной техники. М.-Л.: ОНТИ, 1935. - 536 с.

3. Радушкевич Л.В. Теория динамики адсорбции на реальном зерненом адсорбенте. ДАН СССР, 1947, т. 57, Ш 5,с. 471-474.

4. Giddings J.С. Dynamics of chromatography, P. 1. -New York: Dekker, 1965. 323 p.

5. Калинычев A.M., Золотарев П.П. Динамика размывания хрома-тографической зоны при нелинейной изотерме адсорбции, -1ФХ, 1974, т. 48, № I, с. I38-I4I.

6. De Ligny G.L., Hammers W.E. Diffusive and convective dispersion in chromatography i^ecent developments. -J. Chromatogr., 1977, v. 141, N 1, p. 91-105.

7. Vilenchik L.Z., Belenkii B.G. Comments on the theoretical basis of gel permeation chromatography of polymers.

8. J. Chromatogr., 1971, 56, p. 13-22.

9. Porath J. Some recently developed fractionation procedures and their application to peptide and protein hormones. -Pure and Appl. Chem., 19&3, v. б, И 2, p. 233-238.

10. Ackers G.Ii. Molecular exclusion and. restricted diffusion processes in molecular-sieve chromatography. Biochem., 1964, v. N p. 723-730.

11. Germans J.J. Flow Rate Dependence of GPC. J. Polym. Sci., 1968, v. 46, p. 1217-1226.

12. Di Marzio E.A., Guttman C.M. Separation by flow and its application to gel permeation chromatography.

13. J, Chromatogr., 1971, v. 55, N 1, p. 83-97«

14. Ginzburg B.Z., Cohen D. Calculation of internal hydrostatic pressure in gels from the distribution coefficients of non-electrolytes between gels and solutions. -Trans. Farad. Soc., 1964, v. 60, p. 185-197.

15. Беленький Б.Г., Биленчик Л.З. Хроматография полимеров. -И.: Химия, 1978. 344 с.

16. Casassa E.F., Tagami J. An equilibrium theory for exclusion chromatography of branched and linear polymer chains. Macromolecules, 1969, v. 2, N 1, p. 14-26.

17. Casassa E.F. Gel permeation chromatography and thermodynamic equilibrium. Separ. Sci., 1971, v. 6, N 2, p. 305-319.

18. Zimm B. Dynamics of polymer molecules in dilute solution: viscoelasticity, flow birefrigence and dielectric loss. -J. Chem. Ph^s., 1956, v. 24, N 2, p. 269-278.

19. Yau W.W., Malone C.P., Suchan H.L. Separation mechanisms in gel permeation chromatography. Separ. Sci., 1970, v. 5, N 3, p. 259-271.

20. Цветков B.H., Эскин B.E., Френкель С.Я. Структура макромолекул в растворах. М.: Наука, 1964. - 719 с.

21. Tung L.H., Moore J.С., Knight G.W. Method of calculation molecular weight distribution function from gel permeation chromatograms. П. Evalution of the method by experiments. J. Appl. Polym. Sci., 1966, v. 10, N 9,p. 1261-1270.

22. Tung L.H., Runyon T.R. Calibration of instrumental spreading for GPC. J. Appl. Polym. Sci., 1969, v. 13, N 11, p. 2397-2409.

23. Tung L.H. Calculation molecular weight distribution funktion from gel permeation chromatograms. ffl . Application of the method. J. Appl. Polym. Sci., 1966, v. 10,1. N 9, p. 1271-1283.

24. Hamielec A., Ray W. An analytical solution to Tung's axial dispersion equ/ation. J. Appl. Polym. Sci., 1969, v. 13, N 6, p. 1319-1321.

25. Виленчик Л.З. Исследования в области теории гель-проникающей хроматографии полимеров. Диссертация на соисканиеученой степени кандидата физико-математических наук. -Л.: 1974. 191 с.

26. Balke S., Hamieles A. Polymer reactors and molecular weight distribution. J. Appl. Polym. Sci., 19&9, v. N 7, P- 1381-1420.

27. Shape of the chromatographic band for individual species and its influence on gel permeation chromatographic results/Novikov D.D., Taganov N.G., Korovina G.V., Entelis S.G. J. Chromatogr., 1970, v. 53, N 1,p. 117-124.

28. Метод обработки гель-хроматограмм с учетом размывания: аппроксимационный способ решения уравнения Фредгольма1.рода/ Кислов Е.Н., Зотиков Э.Г., Подосенова Н.Г., Пономарева Е.Л., Будтов В.П. Высокомолек. соед., 1978, т. А20, Ш 8, с. 1910-1913.

29. Chilcote D.D. Guidelines for the development of a computer scheme to identify chromatographic peaks.

30. J. Chromatogr., 1974, v. 99, p. 243-256.

31. Rosen E.M., Provder 'i1. 'l'he instrument spoading correction in GPC. Separ. Sci., 1970, v. 5, N 4, p. 485-521.

32. Smith W.W. Mathematical analysis of GPC data. J.,Appl. Polym. Sci., 1967, v. 11, p. 639-657.

33. Gilbert G.A. General discussion. Discus. Farad. Soc., 1S55, N 20, p. 68-71.

34. Gilbert G.A., Jenkins R.C.L. Boundary problems in the sedimentation and electrophoreses of complex systems in rapid revex'sible equilibrium. Nature, 1956, v. 177,1. N 4514, p. 855-854.

35. Gilbert G.A. Sedimentation and elecrophoresis of interacting substances. Proc. Roy. Soc., 1959, v. A250,1. N 1262, p. 577-388.

36. Ackers G. Studies of protein ligand binding by gelpermeation techniques. Meth. Enzyraolog., 1973, v. D27, p. 441-455.

37. Zimmerman J.K ., Ackers G.K. Molecular sieve studies of interacting protein systems. J. Biolog. Chem., 1971,v. 246, N 4, p. 1078-1087.

38. Bethune J.L., Kegeles G. Countercurrent distribution of chemically reacting systems. J. Phip. Chem., 1961»v. 65, N 3, p. 433-438.

39. Ackers G. Analytical gel chromatography of proteins.

40. Advances'Protein Chem., 197Q, v. 24, p. 343-446.

41. Halvorson H.R., Ackers G.K. Molecular sieve studies of interacting protein systems. J. Biolog. Chem., 1974» v. 249, N 3, p. 967-973.

42. Cann J.R., Oates D.C. Theory of electrophoresis and sedimentation for some kinetically controlled interactions. Biochemistry, 1973, v. 12, N 6, p. 1112-1119.

43. Ackers G.K., Thompson. Determination of stoichiome and equilibrium constants for reversibly associating systems by molecular sieve chromatography. Proc. Eat. Acad. Sci., 1965, v. 53, N 2, p. 342-349.

44. Ackers G.K. Molecular sieve studies of interacting protein systems. J. Biolog. Chem., 1967, v. 242,p. 3257-3258.

45. Brumbaugh E.E., Ackers G.K. Molecular sieve studies of interacting protein systems. J. Biolog. Chem., 1968, v. 243, N 24, p. 6315-6324.

46. Ackers G.K. Molecular sieve studies of interacting protein systems. J. Biolog. Chem., 1967, v. 242, N 8, p. 5026-5054.59« Yau W.W., Kirkland J.J., Bly D.D. Modern size-exclusion liquid chromatography. New York: John Wiley & Sons, 1979. - 476 c.

47. Grubisic Z., Repp P., Benoit H. A universal calibration for gel-permeation chromatography. J. Polym. Sci., 1967, v. 85, p. 755-759.

48. Benoit H., Grubisic Z., Rempp P., Decker D., Ziliox J.G. Liquid-phase chromatographic study of branched and linear polystyrenes of known structure. J. Chim. Phys., 1966, v. 65, N 11, p. 1507-1514.

49. Coll H., Gilding D.K. Universal calibration in gel-permeation chromatography. J. Polym. Sci., 1970, A-2,v. 8, p. 89-103.

50. Atkinson C.M.L., Dietz R. Gel permeation chromatography: Universal calibration for polypropylene. Makromolek. Chemie, 1976, Bd. 177, s. 213-231.

51. Нефедов И.11., Лавренко П.Н. Транспортные методы в аналитической химии полимеров. Л.: Химия, 1979. - 232 с.

52. Berger H.L., Shultz A.R. Gel permeation chromatograms: Approximate relation of line shape to polymer polydis-persity. J. Polym. Sci., 1965, v. A3, N 10,p. 364-3-3648.

53. Френкель С.Я. Введение в статистическую теорию полимеризации. М.-Л.: Наука, I965. - 267 с.

54. Тихонов А.Н. Математическая физика и автоматизация обработки наблюдений. В кн: Современные проблемы математической физики и вычислительной математики. - М.: Наука, 1982, с. 292-301.

55. Люстерник Л.А., Соболев В.И. Элементы функционального анализа. М.: Наука, 1965. - 520 с.

56. Виленчик Л.З., Колегов В.И., Беленький Б.Г. Динамика размывания хроматографической зоны. Ж. физ. химии, 1972, т. 46, с. III4-III8.

57. Беленький Б.Г., Виленчик Л.З. Хроматография полимеров. -М.: Химия, 1978. 340 с.

58. Grushka Е. Characterization of exponentially modified gaussian peak in chromatography. Anal. Chem., 1972, v. 4, N 11, p. 1733-1738.

59. Heitz ?/., Coupek J. Gel chromatography. Ill . Separating efficiency. Macromol. Chem., 1967, v. 105, N 1,p. 280-284.

60. Молекулярно-массовый анализ олигомеров с помощью высокоэффективной эксклюзионной жидкостной хроматографии/ Нефедов П.П., Куренбин О.И., Жмакина Т.П., Лазарева М.А., Беленький Б.Г. Высокомолек. соед., 1981, т. А24, № 8, с. I77I-I779.

61. Bombaugh K.J., Dark W.A., Levangie R.F. Application of gel chromatography to small molecules. П . Separ. Sci.,1968, v. N p. 575-392.

62. Фаддеев Д.К., Фаддеева В.Н. Вычислительные методы линейной алгебры. М.-Л.: Наука, 1963. - 734 с.

63. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров. -М.: Наука, 1973. 350 с.

64. Ritter Ii.L., Drake L.C. Pore-size distribution in porous materials. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed., 1945, v. 17,1. К 11, p. 782-791.

65. Brunauer S., Emmett P.H., Teller E. Adsorption of gases in multimolecular layers. J. Amer. Cñem. Soc., 1938, v. 60, N 2, p. 309-319.

66. Киселев A.B., Лукьянович В.M., Порай-Кошиц Е.А. Результаты комплексного изучения структуры адсорбентов и катализаторов при помощи адсорбционного, малоуглового рентгеновского и электронно-микроскопического методов.

67. В сб.: Методы исследования структуры высокомолекулярных и пористых тел. М.: Изд. АН СССР, 1958, с. I6I-I79.

68. Freeman D.H., Poinescu I.С. Particle porosimetry by inverse gel permeation chromatography. Analyt. Chem., 1977, v. 49, N 8, p. 1183-1188.

69. Halasz I., Martin K. Porengröben von Pestkörpern. -Angew. Chem., 1978, v. 90, Ж 12, s. 954-961.

70. Горбунов A.A., Соловьев Л.Я., Пасечник В.А. Определение характеристик пористой структуры сорбентов методом гель-проникающей хроматографии полимеров. Высокомолек. соед., т А26, É 5, с. 980-985.

71. Виленчик Л.З., Куренбин О.И., Беленький Б.Г. Хроматогра-фическая порометрия. ДАН СССР, 1980, т. 250, № 2,с. 381-383.

72. Хроматографическая порометрия сорбентов для жидкостной хроматографии/ Виленчик Л.З., Куренбин О.Й., Жмакина Т.П., Юрченко B.C., Беленький Б.Г. I. физ. химии, 1981,т. 55, № I, с. 182-187.

73. Belenkii B.G., Vilenchik L.Z. Modern Liquid Chromatography of Macromolecules. Amsterdam: Elsevier, 1983. -432 p.

74. Виленчик Л.З., Жмакина Т.П., Беленький Б.Г. Общая универсальная калибровка в эксклюзионной хроматографии полимеров. Высокомолек. соед., 1984, Т.А26, № 2, с. 416-418.

75. Гидратация сшитых карбоксильных сополимеров и особенности их пространственного строения/ Юрченко B.C., Пасечник В.А., Кузнецова Н.Н., Рожецкая К.М., Соловьева Л.Я., Самсонов Г.В. Высокомолек. соед., 1979, т. A2I, № I,с. 179-187.

76. ГПХ взаимодействующих систем. I-А/ Виленчик Л.З., Куренбин О.И., Готлиб Ю.Я., Беленький Б.Г. Биофизика, 1977, т. 22, 4, с. 582-588.

77. ГПХ взаимодействующих систем. I-Б/ Куренбин О.И., Виленчик Л.З., Готлиб Ю.Я., Беленький Б.Г. Биофизика, 1977, т. 22, №. 4, с. 589-593.

78. Ackers G.K. Molecular sieve studies of interacting protein systems. J. Biolog. Ghem., 1968, v. 243, N 8, p. 2056-2064.

79. Самарский А.А. Теория разностных схем. M.: Наука, 1977. - 653 с.

80. Определение кинетических констант ассоциации и диссоциации белков/ Куренбин О.И., Виленчик Л.З., Готлиб Ю.Я., Беленький Б.Г. Биофизика, 1979, т. 24, Ш 2, с.222-228.

81. Киркленд Дк. Современное состояние жидкостной хроматографии. М.: Мир, 1974. - 325 с.