Мембранные эффекты и иммуномодулирующая активность антиоксидантов мегосина и рометина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН . ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени академика A.C. Садыкова

На правах рукописи УДК 547.554:577.352

Ионов Максим Владимирович

Мембранные эффекты и иммуиомодулирующая активность антиоксидантов мегосина и рометина

02.00.10.—Бноорганичесхая химия, химия природных п физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент-2000

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. акад. A.C. Садыкова АН РУ и на кафедре биофизики Национального Университета Узбекистана им. М. Улугбеха.

Научный руководитель: доктор биологических наук М.В. Замараем

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Ш.С Азимова кандидат биологических наук, с.н.с. Д А* Мусаходжаева

Ведущая организация:

Институт Биохимии АНРУ

Зашита состоится .^ДЗОООг. в ^-^Час. на заседании

Специализированного Совета Д 015.2i.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте биоорганической химии АН РУ, по адресу 700143, Ташкент, пр. X. Абдуллаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганичесхой химии АН РУ.

Автореферат разослан 2000г.

Ученый секретарь ■'■-'.." ^ л

Специализированного Совета,

доктор биологических паук OJL Саатмуратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Дктуп.и.ность проблемы. Госсипол - полифенольное соединение растений рода Gossypium L. Его производные, в частности мегосин, проявляют антивирусную, антибактериальную, противоязвенную активности [Исмаилов, 1987; Выпова и др., 1990; Bushunov et al., 1995]. Кроме того, было показано, что данные соединения являются активаторами процессов регенерации при разнообразных патологиях [Ганиева и др., 1982; Рябченко н др., 1983].

Широкий спектр фармакологической активности госсипола и его производных в значительной степени определяется их иммуномодулирующим действием, основой которого может служить ре&чизация антиоксидантной активности, а также способность влиять на ионный гомеостаз. В частности, одно из производных госсипола -мегосин, является одним из препаратов регулирующих активность иммунокомпетентных клеток и в то же время обладающих высокой антиоксидантной активностью [Гордиенко 1995]. Для данного препарата показана также высокая интерферониндуцирующая активность [Асланов и др., 1988].

Несмотря на многочисленные работы по изучению иммуномодулирующей активности госсиполь и его производных механизмы их действия на клеточном и мембранном уровне исследованы недостаточно. В связи с вышеизложенным изучение механизма действия соединений на основе госсипола в целях создания новых эффективных, малотоксичных, водорастворимых и фармакологически перспективных препаратов направленного действия приобретает особую актуальность.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выявление механизма взаимосвязи мембранотропных эффектов и иммуномодулирующей активности мегосина и его водорастворимого комплекса с ПВП - рометина. В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

П выявить особенности взаимодействия мегосина и рометина с модельными и биологическими мембранами;

П исследовать влияние мегосина и рометина на гомеостаз Са:+ в тимоцнтах;

П изучить влияние рометина на пул ядросодержащих к.~еток тимуса и селезен :и на фоне возрастного иммунодефицита;

Принятые сокращения АЛ - арахпцоновач кислота, АО - актиоксиданты, ДК диеновые коньюгаты, ДМСО • димсгнлсульфоксид, ДМФХ - днмирнстонл фосфатндилхолин, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, ИКК иммунокомпстентные клетки, [Са~4]„ - концентрация ионов кальция в цитозоле, МДА малоновый диальдегид, ОФ - окислительное фосфорнлнрование, ПВП пол ивинпл пиррол илон. ПОЛ - перскисное окисление лнпндов. ХТЦ хлортетрациклин, ЭПР - элекгрошюпграмапштимй резонанс, ЭР эндоплазматичсский ретикулум, ЯСК - «дросодгржащке клетки

■ исследовать влияние рометина на фосфолипидный состав, процессы перекисного окисления липидов, активность катал азы и энергетические параметры митохондрий печени в условиях токсического гепатита;

Ш изучить влияние рометина на Са2<-гомеостаз и энергетический обмен тимоцитов при токсическом гепатите как вторичной иммунодефицитной патологии.

Научная новизна работыт Методом ЭПР-спиновых зондов установлено, что мегосин и рометин уменьшают подвижность углеводородных сегментов молекул фосфолипидов липидного матрикса мембран. Впервые методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии изучено взаимодействие мегосина и рометина с модельными липидными системами. Установлено образование гетерогенных фаз с индивидуальными термодинамическими параметрами. Методом ЭПР и ДСК обнаружено снижение мембранной активности мегосина при его иммобилизации на полимере-носителе, что, видимо, обусловлено постепенным высвобождением молекулы мегосина из комплекса с ПВП. С использованием [иС]-меченых мегосина и рометина установлено время-зависимое связывание находящегося в комплексе с ПВП мегосина с мембранами митохондрий, в отличие от свободного мегосина, для которого такой динамики не обнаружено.

Впервые проведено сравнительное исследование влияния мегосина и рометина на Са2*-гомеостаз в тимоцитах. Установлено дозозависимое увеличение цитозольного кальция в присутствии мегосина и рометина. Методом ингибиторного анализа установлено, что [Са3+]щ-повышающий эффект изученных соединений обусловлен увеличением проницаемости плазматических мембран, а при более высоких концентрациях - выходом Са.2* из митохондрий и эндоплазматического ретикулума, влиянием на кальмодулинзависимые процессы и метаболизм арахидоновой кислоты. Отмечено снижение -модулирующей активности рометина по сравнению с мегосином.

Установлено иммуностимулирующие действие рометина в условиях возрастного иммунодефицита, которое проявляется в увеличении массы тимуса и числа ядросодержащих клеток тимуса и селезенки.

На модели животных с токсическим гепатитом впервые установлено, что рометин способствует уменьшению накопления лизофосфолипидов и продуктов ПОЛ, приводит к повышению активности ферментов антиоксидантной системы зашиты клетки, восстановлению энергетических параметров митохондрий печени и тимоцитов, росту уровня внутриклеточного Са2*.

Выполненные исследования выявили взаимосвязь между антиоксидантной, Са2'-модулирующей активностями и биологическими эффектами рометина.

Научно - практическая значимость работы. Результаты, представленные в работе, расширяют представления о механизме действия мегосина и его водорастворимого комплекса с ПВП - рометина и могут быть использованы при создании более эффективных и менее токсичных лекарственных препаратов, получаемых на основе госсипола. Выполненные исследования позволяют рекомендовать рометин для дальнейших фармакологических исследований в качестве иммуностимулятора.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на: Республиканской научной конференции "Актуальные проблемы развития биооргакической химии в Узбекистане" (Ташкент, 1998), на Международной конференции РАН "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, Россия 1998), на Ц-Международной конференции молодых химиков "Проблемы развития биоорганической химии" (Наманган 1998), на конференции молодых химиков Узбекистана (Ташкент 2000), на И-Международном семинаре "Митохондрия и миопатия" (Галле, Германия, 2000), на международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино 2000).

Ш&ЗШШШЗг По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 журнальные статьи.

Структура диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (204 ссылки). Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 25 рисунков и 13 таблиц.

Работа выполнена в . соответствии с планом научно-исследовательских работ Института, бйоорганической химии им. акад. Садыкова А.С. АН РУ.

Автор выражает свою искреннюю признательность академику Т.Ф. Арипову за постоянный интерес к работе и ценные советы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты проводились на белых беспородных крысах массой 150-200 г. и белых беспородных мышах массой 25-30 г.

В работе были использованы производные госсипола - мегосии и рометин, синтезированные и .любезно предоставленные сотрудниками лаборатории полифенолов ИБОХ АН РУ. Структурные формулы соединений приведены на рис. 1. В качестве растворителя мегосина использовали диметилсульфоксид, а в случае рометина - бидистили-розанную воду. В работе были использованы концентрации веществ, равные по количественному содержанию мегосина.

Митохондрии выделяли из печени крыс по общепринятой методике [5спе1е1ег, 1948]. Тимоциты выделяли из тимуса крыс и мышей по ранее описанному методу [Сукочева, 1996].

б

Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре Вгикег (ФРГ), с использованием двух типов зондов, локализующихся на разной глубине бислоя. Парамеф Б, характеризующий ориентацию зонда и параметр т„ характеризующий его подвижность в бислое, расчитывали согласно Гаффни Д. Д. [1979].

Взаимодействие производных госсипола с мультилзмеллярными дисперсиями из липосом изучены на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4, по методике, описанной ранее в работе Розенштейна ИЛ. {1987].

Эксперименты по связыванию [|4С]-рометина и [мС]-мегосина с мембранами митохондрий проводили методом фильтрования на нитроцеллюлозных фильтрах "Миллипор" [Романов, 1989]. Радиоактивность определяли в толуольном сцинцилляторе ЖС-107 на счетчике "Бета-1".

Для измерения количества мембраносвязанного Са2* к клеткам, добавляли 20 мкМ хлортетрациклина (ХТЦ) и инкубировали 60 мин. Флуоресценцию ХТЦ регестрировали на спектрофлуориметре СФР-1 при длине волны возбуждения 405 нм, регистрации - 530 нм.

Для измерения уровня цитозольного кальция тимоцитов • использовали флуоресцентный зонд - Рига/2АМ при длине волны возбуждения 337 нм, регистрации - 496 нм. [Са2+]„ рассчитывали как описано ранее в работе Сукочевой О.А. [1996].

Скорость дыхания и параметры окислительного фосфорнлирования митохондрий в присутствии исследуемых соединений определяли по Чансу на полярографе ЬР-7 при 37°С с помощью кислородного электрода Кларка [Мохова, 1987]

СЕаСЯ,50,0№

кн-с:: он

он сн-»ш-св3с&>$о,оы>

I

сн, сн,

сн, сн,.

мн-сн он

ОН СН^Ш-СН,СН,5030К»

СН, СВ,

сн,* сн,

X

У

Рис. 1. Молекула мегосвна - I, коиплекс рометвв - II, X - Ы-поливнвншгарролвдон (8000), V - мегосин. Соотношение Х:У -9:1.

Ионную проницаемость мембран митохондрий исследовали по энергонезависимому набуханию митохондрий в нзоосмотических растворах по методике [Brierley, 1974]

Содержание белка определяли по биуретовой реакции [Gomal,

1949].

Количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки подсчитывали з камере Горяева, по методике описанной ранее в работе Выповой НЛ. [1994].

Токсический гепатит у исследуемых животных вызывали путем подкожного введения 1 мл 50% масляного раствора ССЦ через день в течении 10 дней.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ПХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование взаимодействия мегоснна и рометнна с биологическими и модельными мембранами.

Методом ЭПР, с использованием двух типов зондов разной локализации было показано, что добавление возрастающих количеств

мегоснна и роме-тина х образцам митохондрий приводит к росту значений параметра тс, характеризующего микро вязкость окружения нитроксильного фрагмета зонда, что говорит об

Рис. 2 Влияние мсгосяка а рометяна на время вращэ- уменьшении под-телыюЯ корреляции (Те) зонда I в мембранах митохондрий. важности углеводородных сегментов молекул фосфолипидов и свидетельствует о глубоком проникновении молекул исследуемых соединений в бислой. Однако следует отметить, что при равной концентрации действующего !]©чала в обоих препаратах эффект рометнна выражен значительно слабее (рис 2).

Методом дифференциальной сканирующей мнкрокаллориметрии было установлено, что как и в случае с мегосином под действием рометнна бислойная структура мультиламеллярной дисперсии разделяется на две фазы с определенными термодинамическими параметрами (рис 3).

О 100 200 300 400 500 -ысросин -О—ромвтин нм/мр.валка

Такой результат свидетельствует о взаимодействии молекулы мегосина. с определенной труппой молекул димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) мультиламеллярной дисперсии. Появление пика высокотемпературной фазы обусловлено тем, что взаимодействие, мегосина с полярной частью молекул ДМФХ, образующих бислои, приводит к формированию кластеров, для плавления которых требуется более высокая температура.

Однако, следует отметить, что для рометина ответ был выражен несколько слабее и равный эффект достигается лишь по истечении определённого времени после смеси препарата с липидами, по-видимому, по мере того, как молекулы мегосина отщепляются от ПВП и переходят & липидный матрикс мембраны.

Полученные методом ДСК данные о мембранной активности изученных препаратов коррелируют с результатами полученными методом ЭПР. Ярко выраженный временной характер взаимодействия рометина с липидами, повидимому, не является результатом перераспределения соединения в мембране, а следствием постепенного перехода в мембрану низхомолекулярного компонента из состава комплекса с ПВП.

Рис.4. Динамика связывания С-мегосина и С-ромепша с мембранами митохондрий. Количество меченных мегосина и рометина в среде инкубации 10 нмоль/мг белка.

С целью проверки этого предположения было исследовано взаимодействие радиоактивных молекул мегосина и рометина с мембранами во времени. Как следует из данных, представленных на рис. 4, действительно имеет

место время-зависимое связывание рометина с мембранами митохондрий, в отличие от свободного мегосина, для которого такой динамики не обнаружено.

2. Влияние мегссина и рометина на распределение внутриклеточного

Са:* в тимоцнтах .

В связи с полученными данными сб изменении мембранной активности мегосина при его "посадке" на ПВП представляло интерес изучить влияние препарата на функциональные параметры ИИК, в частности на Са2+-гомеостаз, т. к. известно, что повышение внутриклеточ-

160

15»

2 мин

Рис. 5. Влияние мегосина и рометина нз содержание цитозольного кальция. 1 - 10 мкМ мегосина, 2-100 мкМ рометина.

ного кальция в клетках, в частности тимоцитах, приводит к активации специфических функций.

При использо-пашш Са2+-чув-

ствительного флуоресцентного зонда Бига-2/АМ было показано, что мегосин (1-50 мкМ) дозозависимо увеличивал [Са24]*, тимоцитов при их инкубации в

CaJt-

содержащей среде. Этот эффект зависел как от дозы препарата, так и от времени. Максимальные значения достигались в течение 3-5 мин, которые

[Са24||, кМ

200

150 ■■

100

Рис. 5 Изменение [Са2*]ш тимоцитов при

добавлении 20 мкМ мегосина. 1 - в среде, содержащей 1,2 мМ СаСЬ, 2 - в бескальциевой среде, 3 - на фоне 0,4 мМ М^ + 0,1 мМ верапамила.

сохранялись в течении последующих 5 мин наблюдения. Аналогичная динамика изменения [Са:+]ш наблюдается и при действии рометина, но количественные значения совпадали при 10-кратном увеличении концентрации рометина по отношению к мегосину (рис. 5).

С целью выяснения возможного механизма действия мегосина на [Са2+]ш было иследовано его влияние на фоне

блокаторов Са2+-каналов верапамила и ионов (рис. 5). Как следует из представленных данных, блокирование Са2+-каналбв верапамилом или №2+ приводит к снижению [Са2+]ш за счет торможения поступления Са2+

извне. Добавление

им 20 мкМ мегосина в

10)4- этих условиях при-

водит к заметному повышению [Са2+]ш,. что может свидетельствовать об увеличении проницаемости мембран при действии мегосина не опосредованного влиянием на Са2+-каналы.

Исследования, выполненные в среде без добавления Са2+, показали, что

200* ■

100-1-

1 НИН

Рис. 6. Изменение [Са1+]ш тимоцитов при последовательном добавлении 50 мкМ мегосина и ингибитора кальмодулина - 3 мкМ 11.24571

мегосин также увеличивал [Са2+]ш, однако менее интенсивно, чем в среде с Са**" (рис. 5), что по-видимому, связано с высвобождением Са:+ из внутриклеточных пулов.

Как следует из рис. 6, рост [Са2*]ь, вызванный добавлением ингибитора кальмодулина 1*24571 (3 мкМ), снижался в присутствии высоких концентраций мегосина (50-100 мкМ), что может указывать на влияние этих агентов на одни и те же Са2+-транспортирующие структуры или механизмы их регуляции.

Поскольку известно, что стимуляции клеток митогеном сопровождается изменением содержания арахидоновой кислоты, было высказано предположение, что в основе отмеченного выше эффекта госсипола лежит ингибирование липооксигеназного пути окисления АА.

Рис. 7. Кинетика изменения [Са2*]* тамоцитов крыс при последовательном добавлении МХ5А и 20 мкМ мегосина - А; 20 мкМ мегосина и №Х}А - Б.

В связи с этим, нами были проведены эксперименты с использованием ингибитора липооксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты - ЬЛХгА (10 мкМ), который блокировал повьппение [Са2+]|„, вызванное мегосином (рис. 7А). С другой стороны, добавление ЖНЗА на фоне мегосина также не приводило к увеличению [Са2+]щ (рис. 7Б), что, возможно, связано с действием данных соединений на одни и те же метаболические пути.

Аналогичные по направленности результаты были получены и для рометина, однако в целом они свидетельствуют о его более "мягком" воздействии по сравнению с мегосином на гомеостаз Са2+ в клетке.

Таким образом исследуемые соединения в низких концентрациях (мегосин 1-10 мкМ, рсметнн - в 2 раза более высоких) вызывают небольшое увеличение [Са2+]щ и благодаря этому могут оказывать

активирующее влияние на ИНК. В этом диапазоне концентраций данные соединения не ингибируют кальмодулинзависимые процессы и, как было установлено нами в отдельной серии экспериментов, не оказывают влияния на дыхание и ОФ митохондрий, что косвенно свидетельствует о низкой их токсичности.

3. Иммуномодулнрующий эффект рометина.

Иммуномодулирующее действие госсипола и его производных может быть обусловлено не только влиянием на Са-гомеостаз ИКК, но и их способностью регулировать ПОЛ, поскольку известно, что активация ИКК сопровождается выработкой активных форм кислорода, а продукты окисления липидов, в частности лейкотриены, являются регуляторами активности ИКК.

Для мегосина и в еще большей степени для рометина была показана высокая .антиокислительная активность. Как следует из рис. 8, рометин уже при концентрации 2,5 нмоль/мг белка вызывает 40% ингибирование накопления продуктов ПОЛ, в то время как для мегосина подобный '

эффект достигался при концентрации, почти в 4 раза более высокой.

В связи с вышесказанным представляло интерес Изучить как реализация анти-оксидантных л. Са2* - модулиру-■ ющих свойств рометина влияет на популяцию тимоцитов при старении организма, как им-

мунодефицитном состоянии в условиях которого усиливаются процессы ПОЛ.

В экспериментах выполненных нами, совместно с лабораторией фармакологии ИБОХ, было установлено иммуностимулирующее действие рометина. При однокра,«ом внутрибрюшннном введении препарата

Рис. 9. Влияние мегосина и рометина на уровень накопления ТБК-ахтавных продуктов ПОЛ в митохондриях печени крыс.

мышам в дозе 25 мг/кг, количество ядросодержащих клетох тимуса и селезенки достоверно увеличивалось через 3 суток после введения препарата (табл. 1).

Таблица 1.

Масса тимуса и количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки мыши, под влиянием рометина в различные сроки после внутрибрюшинной инъекции.

Условия эксперимента Тимус Селезенка

Колич.ЯСК (млн кл/мл) ИС Масса тимуса, мг Колич. ЯСК (млн кл/мл) ИС

Контроль 37±3.7 — 66.5 90±5.1 —

9 Через 48 часов 44±2.2 1.19 79.8 10Ü4.6 1.25

а Через 72. часа 100±6.5 2.70 86.6 174±8.1 1.93

а Через 96 часов 101±4.3 2.73 87.2 131±10 1.46

Однократное введение. ИС — индекс стимуляции.

Индекс стимуляции (отношение показателя опытной группы к контрольной) составил 2,73 для клеток тимуса и 1,93 - для ЯСК селезенки.

На фоне, увеличения количества ядросодержащих клеток, увеличивалась масса тимуса, стимулированных рометином крыс по сравнению с массой тимуса контрольных животных.

На основе полученных нами предварительных результатов можно предположить, что в условиях in vivo рометин реализуя АО свойства, а также способность влиять на Са2* гомеостаз приводит к активации метаболизма, дифференцироЕхе й пролиферации лимфоцитов, поскольку известно, что ионы кальция являются непосредственными участниками передачи сигнала внутрь клетки в результате которого запускается каскад биохимических реакций,; -завершающихся репликацией ДНК, пролиферацией или дифференцировкой.

Известно, что развитие целого ряда заболеваний, сопровождается усилением процессов ПОЛ, усугубляющих патологический процесс. К таким заболеваниям относится и токсический гепатит. В условиях токсического гепатита, при котором развиваются вторичные иммунодефицитные состояния, нами при введении рометина были выл злены положительные эффекты не только в первично пораженном органе печени, но и в ИКК. Было установлено, что в дозе 50 мг/кг массы животных при внутрибрюшинном введении и 100 мг/кг массы при пероральном введении на фоне гепатита рометин снижает накопление продуктов ПОЛ и лизофосфолипидов, повышает активность каталазы, и нормализует функциональные параметры мип .гондрий печени (табл 2).

Таблица 2.

Содержание продуктов ПОЛ. и активность каталазы в митохондриях печени здоровых крыс, больных гепатитом и леченных рометином

Условия эксперимента Количество продуктов ПОЛ, нмоль/мг белка Активность каталазы мкМ Н2Ог/мин/мг. б.

ДК МДА

Контроль 0.39*0.04 0.017±0.009 7.622 ±1.0

гепапп- 0.67±0.05 0.315±0.14 3.125 ±0.1

рометин 50 мг/кг в/б 0.48±0 04 0.024±0.008 1 8.958 ±1.0

рометин 100 мг/кг рег. оз 0.6Ш.01 0.041^0.015 7.366 ±0.8

В ИКК (тимоцитах) при введении рометина также отмечалось улучшение параметров ОФ (табл. 3) и нормализация Са2+-гомеостаза, на фоне развития гепатита.

! Таблица 3

Параметры энергетического метаболизма тимоцитов здоровых крыс, . больных гепатитом и леченных рометином.

Условия эксперимента Усув V •олиг . УДНФ Уда« Удах.

Контроль 18.2 8.1 24.3 31.2 14.1

Гепатит 16.2 14.1 21.2 23.6 . 11.2

Рометин 50мг/кг в/б 17.8 14.0 20.3 28.6 16.2

Рометин 100мг/кг per. os 14.3 12.8 26.2 33.4 20.1

С использованием ХТЦ - флуоресцентного зонда, на мембраносвязанный Са2\ было показано, что при токсическом гепатите происходит резкое опустошение митохондриального и немитохондриального пулов Са2\ Введение рометина приводило к увеличению как митохондриального, так и немитохондриального Са2+ пулов (рис. 10).

Данный эффект может быть результатом двух причин: а) реализацией АО свойств рометина, что приводит к стабилизации мембраны и препятствуй ч опустошению Са2+-пула; б) увеличением

А Б В Г

Антмицян А Анмиицин А Анлалицин А Антшицут А

Рис. 10 Интенсивность флуоресценции ХТЦ при последовательном добавлении антимицнна А и BHQ. А-контроль, Б-при токсическом гепатите, В-при введении рометина 50 мг/кг, Г-при введении рометина per. os. 100 мг/кг

цнтозольного кальция за счет индукции его входа извне, что может приводить к перераспределению кальция н накоплению его во внутриклеточных компартментах.

Таким образом, на двух, моделях иммунодефицитных состояний нами было установлено иммуностимулирующее действие рометина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В экспериментах, выполненных с. применением спин-меченных зондов различной локализации в бислое, нами было установлено, что мегосин и рометин уменьшают подвижность углеводородных сегментов молекул фосфолипидов бислоя в результате встраивания молекул препаратов в липидный матрикс мембран. При этом в случае рометина наблюдается снижение мембранной активности препарата.

Метом ДСК были установлены однонаправленные изменения структурной организации мембран, характеризующиеся образованием гетерогенной системы с двумя пиками температуры фазового перехода. Согласно термодинамическим характеристикам, высокотемпературная фаза состоит из участков модельной мембраны, обогащенных молекулами мегосина, которые в случае рометина, по-видимому, постепенно переходят в мембрану из комплекса с ПВП. Это предположение основывается на выявленной нами временной зависимости изменения

термодинамических параметров липосом в случае с рометином и отсутствии таковой для мегосина. Кроме того, нами установлено, что сам по себе ПВП не вызывает структурных изменений в мембране.

Эксперименты по связыванию [|4С]-меченных рометина и мегосина с биологическими мембранами, также выявили временной характер связывания рометина с мембранами. Такая динамика не проявляется в случае мегосина. В совокупности все эти данные по исследованию взаимодействия мегосина и рометина с мембранами, свидетельствуют о том, что однонаправленные структурные изменения вызываемые данными соединениями, являются результатом внедрения молекул мегосина в бислой. 1

Исследование влияния мегосина и рометина на кальциевый гомеостаз тимоцитов, как один из возможных механизмов регуляции активности ИКК, показало, что данные соединения дозозависимо увеличивают концентрацию цитозольного кальция, и в зависимости от концентрации этот эффект достигается за счет активации входа Са2+ извне, опустошения его внутриклеточных пулов, в результате увеличения кальциевой проницаемости мембран, ингибирования кальмодулин-зависимых процессов и влияния на метаболизм АА.

Иммуномодулирующее действие госсипола и его производных может быть обусловлено не только влиянием на Са2+-гомеостаз ИКК, но и их способностью регулировать ПОЛ. Дня мегосина и еще в большей степени - для рометина была показана высокая антиокислительная активность. Рометин уже в концентрации 2,5 нмоль/мг белка вызывает 40% ингибирование накопления продуктов ПОЛ, в то время как для мегосина подобный эффект достигался при концентрации, почти в 4 раза более высокой.

При оцеьке иммуномодулирующих свойств рометина на модели возрастного иммунодефицита, было установлено увеличение массы тимуса, а также количества ЯСК тимуса и селезенки. При исследовании влияния рометина на развитие хронического гепатита, при котором развиваются вторичные иммунодефицитные состояния, были выявлены положительные эффекты не только в первично пораженном органе печени, но и в ИКК. Было установлено, что на фоне гепатита рометин снижает накопление продуктов ПОЛ и лизофоефолипидов, повышает активность катал азы и нормализует функциональные параметры митохондрии печени.

В ИКК (тимоцитах) как также отмечалось улучшение параметров ОФ митохондрий и нормализация Са2*-гомеостаза при введении рометина,

на фоле развитая гепатита. Так, если при токсическом гепатите отмечалось резкое опустошение митохондриального пула Са2+, то при введении рометина отмечается увеличение как митохондриального, так и немитохондриального пулов Са5\ Таким образом, иа двух моделях иммунодефицитных состояний нами было установлено иммуностимулирующее действие рометина.

В целом, суммируя полученные данные можно заключить, что рометин реализуя как антиоксидантные, так и Са5+-модулирующие свойства, в условиях гп vivo проявляет иммуностимулирующее действие, что позволяет его рекомендовать для дальнейших фармакологических исследований в качестве иммуностимулятора.

ВЫВОДЫ

1. На биологических и модельных мембранах, а также иммунокомпетентных клетках исследованы мембранотропные, антиоксидантные, [Са^т-модулирующие и ряд других эффектов производных госсипола - мегосина и его водорастворимого комплекса с ПВП - рометина,

2. Установлено, что мегосин, и в меньшей степени - рометин, проникая в гидрофобную область мембран митохондрий, увеличивают микровязкость липидного матрикса мембран. Показано что данные соединения вызывают однонаправленные структурные изменения липидного бислоя из димиристоилфосфатидилхолина, выражающиеся в образовании гетерогенных фаз с индивидуальными термодинамическими параметрами, причем эффект рометина выражен слабее мегосина. "

3. Обнаружено, что [14С]-рометин в отличие от [мС]-мегосина, проявляет время-'зависимый: характер взаимодействия с мембранами, что свидетельствует о постепенном высвобождении мегосина из комплекса с поливинилпирролидовом.

4. Показано, что мегосин и рометин дозозавчсимо увеличивают [Caí+]¡n тимоцитов за счет активации входа Са2* извне и опустошения внутриклеточных пулов (эндоплазматического ретикулума и митохондрий) в результате изменения Са2* проницаемости мембран, ингибирования кальмодулинзависимых процессов й влияния на метаболизм арахидоновой кислоты.

5. Установлено иммуностимулирующее действие рометина при однократном внутриброшинном введении мышам (25 мг/кг) на фоне возрастного иммунодефицита. Показано увеличение количества ядросодержащих клеток тимуса п селезенки; индекс стимуляции составил

2,73 для клеток тимуса, 1,93 для ЯСК селезенки, масса тимуса увеличилась до 87 мг против 66 мг в контроле.

6. Рометин при внутрибрюшинном и пероральном введении в дозе 50 и 100 мг/кг массы, соответственно, эффективно снижает содержание продуктов перекисного окисления липидов, повышает активность катал азы, нормализуя энергетические параметры митохондрий печени и тимоцитов, гомеостаз кальция в изолированных клетках при хроническом гепатите.

7. Выполненные исследования выявили взаимосвязь между антиоксидантной, Са^-модулирующей активностями и биологическими эффектами рометина. л

СПИСОК ОПУКЛИКОВАНЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ионов М.В., Тукфатулина И.И., Салахутдинов Б А., Замараева М.В., Арипов Т.Ф. Сравнительное исследование динамики взаимодействия мегосина и рометина сг модельными мембранами^/ Доклады Академии Наук РУз. № 10.19$8. С. 35-38.

2. Гордиенко Н.В., Ионов МБ., Абрамов А.Ю., Замараева МБ., Гагельганс А.И., Арипов Т.Ф. Действие иммуномодулятора мегосина на Са2+ гомеостаз тимоцитовУ/ Журнал Теоретической и клинической медицины. № 1.2000. С. 38-44.

3. Ионов М.В., Гордиенко ИВ., Абрамов AJO., Замараева М.В., . Исследование влияния иммуномадулзторов на клеточный гомеостаз кальция методом спектрофлуориметрииУ/ Химия природных соединений Спец. выпуск. 2000. С. 162-164.

4. Гордиенко Н.В., Ионов'MB., Абрамов А.Ю., Замараева МБ., ' Арипов Т.Ф. Влияние мегосина и его комплекса с поливинилпирролидоном на перераспределение ионов CaJ+ в тимоцитахУ/ Международная конференция РАН "Рецепция и .внутриклеточная сигнализация". Пущино. 21 - 25 сентября. 1998. С. 212-215.

5. Ионов МБ., Гордиенко Н.В., Абрамов А.Ю., Замараева MB., Арипов Т.Ф. Влияние производных госсипола на кальциевый гомеостаз тимоцитов крыс Л Н-Международная конференция молод ых химиков. "Проблемы биоорганичсской химии". Наманган. 23 - 25 ноября. 1998. С 16-17.

6. Mareninova OA., Gordienko N.V., Tochtaeva I.T., Abramov A.Y., Ionov M.V., Zamaraeva M.V., Hagelgans A.I. The Interfluence cf New Water-

soluble Antioxidant - Rometin on Lipid Peroxidation, Activity of Phospholipases and Respiratory Parametrs of Mitochondria under Experimental HepatitsV/ European Journal of Medical Research. 2000. Vol. 5. P. 59.

7. Гордиенко H.B., Ионов M.B., Абрамов АЛО., Замараева М.В., Арипов Т.Ф. Влияние нового антиоксиданта рометина на энергетику и Са2* гомеостаз тимоцитов в условиях эксперементального гепатита.// Международная конференция РАН "Митохондрии и активные формы кислорода". ГТущино. 6-9 июня. 2000. С. 21-25.

М.В. Ионопклнг "Мегосин ва рометин антиаксидантларининг мембранага таъемри за иммунмодул фоаллиги" ишшшвг Кис^ача мазмуни

Госсиполнинг *осилалари булган мегосин ва унинг сувда эрувчи поливинилпирролидоили (ПВП) комплекс! - рометиннинг мембранага Са1* ионлари гомеосгази хамда тимоцит ва митохондрияларнинг энергетик парзметрларига циёсий таъсири урганилди.

Сканерловчи дифференциал микрокалориметрич у сули ёрдамида мегосин ва рометиннинг аник; термодинамик параметрларга эга булган икки липид фазасини х,ссил килиши курсатилган. ЭПР спин зондлари ситали мегосин ва рометиннинг мембрананинг липидли матрицадаги фосфолипид молекуларшшиг углеводород цисмининг харакатчанлигини камайтира олишини курсатиб беради. Рометиннинг мембранага нисбатан фаоллигининг мегосинга Караганда кам?йиб.бориши аниаданган булиб, бу камайиш мегосин молекулаларининг ПВП билан хосил долган комплексидан аста-сеюш сик^б чицариши оркали тушунтирилади.

>^окайра мембранасигатг ртказа олиш кобилиягининг ошиши оркали мегосин ва рометиннинг иштирокида (1-10 мкМ) цитозолдаги калцийнинг доза га боглик, купайиши аниманди. Бу купайиш юкорлре^ ' концентрацияларда митохондрия ва эндоплазматик ретикулумдан чикдш хамда калмодулинга боглиц жараёнлар ва арахидон хислотасшшнг метоболизми туфайли руй беради. Рометиннинг Са2* модулловчи фаоллигининг мегосинга нисбатан сусайиши к^йд цилинди.

Рометиннинг иммунстимулловчи таъсирга эга була олиши курсатиб берилди. Рометинни 25 мг/кг концентрацияда ёши утиши

билан иммунокамчиликка эга булган хайвон организмига киритиш тимус салмогининг ва талон *амда тимусдаги ядрога эга булган эужайраларнинг сотши ошишига олиб келиши аншианди.

Ромегиннинг таъсири СС1« туфайли келиб чиадан сурункалг сари»; касал, болида хам урганилди. Рометин липидларкинг перикс оксидланиши мадсулотларшгинг ва лизофосфолипидлар тугслаиишининг сусайишига, ^ужайранинг антиоксидант ^имоя воситаси тупламилаш ферментларнинг фаоллипши ортишига, жигар ва тимоцит митохондрикларининг энергетик параметларини тикланишига, ^ужайра ичидаги Са1* концентрациясшшнг ортишига олибкелади.

1^улга кирктилган натижаларга асосланиб, рометинни кейинги фармаколопгк тадцикотлар учун иммуностимулятор воситаси сифатида 1фллаш мумкин..

Membrane effects and iminunomodulating activity of antioxidants megoslnandj-ometin lonovM.V.

. Comparative study cf the effects of gossypol derivatives, megosine and its water-soluble complex with polyvinylpyrrolidone (PVP) - rometine, on membrane structure, Ca^omeostasis and respiratory parameters of thymocytes and mitochondria have been performed.

Using differential scanning microcallorimetry method it was shown that. megosin and rometin caused the formation of two lipid phases with distinct thermodynamic parameters. Election spin resonance (ESR) signals of spin probes indicated a decrease in the mobility of the hydrocarbon segments of membrane matrix phospholipid molecules upon treatment by megosine and rometine. Lower membrane activity of rometine compared, to megosine was found to be due to a gradual release of megosine molecules from its complex with PVP as was revealed by radioisotope label technique.

It was found that doze-dependent increase in thymocytes cytosolic Ca2* in the presence of megosine and rometine (1-10 mkM) was caused by increased cell plasma membrane Ca^-permeability. However, at the higher concentrations of the drugs the increase in Cai+ was found to be not only due to plasma membrane Ca2+-permeability increase, but also due to a release of Ca2+ from

mitochondria and endoplasmic reticulum. The higher doses affected also the calmodulin-dependent processes and metabolism of arachidonic acid. Ca2+-modulating activity of rometine was lower compared to that of megosine.

An immunomodulating effect of rometine has been established. The injection of rometine to the mice with age immunodeficiency at a dose of 25 mg/kg produced an increase in thymus mass as well as in the number of nucleated cells in the thymus and spleen.

Rometin was also studied on experimental CCI«-induced hepatitis model. Lipid peroxidation products content, lysophospholipids accumulation were decreased, while the enzymatic activity of catalase increased upon treatment with rometin. As a consequence, the energetic parameters of liver mitochondria and thymocytes have recovered, and the intracellular Ca2+-concentration has elevated.

Based on the results obtained, rometin has been recommended as an immunostimulating agent for the further pharmacological studies.