Синтез ковалентных конъюгатов декстран - пространственно-затрудненные фенолы и изучение их антирадикальной активности тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

На правах рукописи

РГБ ОД

I о ;.;лл и

АРЕФЬЕВ Денис Викторович

(

СИНТЕЗ КОВАЛЕНТНЫХ КОНЪЮГАТОВ ДЕКСТРАН -

ПРОСТРАНСТВЕННО-ЗАТРУДНЕННЫЕ ФЕНОЛЫ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

Специальность 02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор БИЛИБИН А.Ю.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор ВЛАСОВ Г.П.

кандидат химических наук, НИКИФОРОВ В.А.

Ведущая организация: НИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург).

Защита диссертации состоится " АО- ООО г. в/£исов на

заседании диссертационного совета Д.002.72.01 при Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, Санк1-Петербург, Большой пр. В.О., 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

2000 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Института высокомолекулярных соединений РАН, доктор химических наук

Н.П. Кузнецова

Общая характеристика работы.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Проблема создания конъюгатов на основе гидрофильных полимеров и различных биологически-активных веществ (БАВ) представляется весьма актуальной. Появляющиеся в последнее время высокоэффективные биокатализаторы, полимерные лекарственные и иммуноактивные средства, полимерные биорегуляторы роста и т.п.- свидетельство интереса ученых к этой проблеме. Среди возможных преимуществ таких высокомолекулярных систем следует отметить обеспечение пролонгированного действия, увеличение эффективности биологически активного вещества, корректировку растворимости, повышение стабильности и снижение уровня токсичности БАВ и др.

Среди БАВ особое место занимают антиоксиданты (АО) - вещества, способные в малых концентрациях тормозить свободнорадикальное окисление различных органических соединений. Доказательство общности физико-химических свойств и поведения свободных радикалов в химических и биологических системах способствовало росту интереса к антиоксидантам как к регуляторам интенсивности протекания свободнорадикальных процессов в этих системах. Синтетические антиоксиданты из класса пространственно-затрудненных фенолов (ПЗФ), которые давно используются для стабилизации полимеров и масел, благодаря высокой эффективности и незначительной токсичности нашли широкое применение в медицине и биологии как аналоги природных антиоксидантов (известные препараты: пробукол, дибунол, феноксан и др.).

Конъюгаты антиоксидантов и полимеров представляют собой удобные системы для исследования взаимного влияния гидрофильной полимерной матрицы и гидрофобного низкомолекулярного вещества. Это обусловлено наличием уникальной возможности экспресс-тестирования эффективности АО по их антирадикальной активности (АРА), позволяющей установить зависимость этой активности от различных параметров макромолекулярной системы.

В последних работах по изучению конъюгатов ПЗФ и синтетических гидрофильных полимеров (сополимеры винилпирролидона, ПВС), выполненных на кафедре высокомолекулярных соединений СПбГУ совместно с ИВС РАН, было показано, что в такой системе появляется ряд полезных свойств (водорастворимость, способность к рН-зависимому гидролизу, пролонгация действия). Замена синтетических полимеров на природный полисахарид декстран, широко опробированный в качестве полимера-носителя БАВ, может придать системе ценные дополнительные свойства (биодеградируемость, биосовместимость, повышение гидрофильное™ и др.). Таким образом, решение в рамках указанной проблемы таких задач как изучение влияния структуры конъюгатов на их физико-химические свойства позволит целенаправленно изменять активность БАВ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Научная новизна исследования заключается в разработке подхода к созданию полимерных антиоксидантных систем, высокая эффективность которых в воде и водноорганических средах достигается сочетанием гидрофильной матрицы декстрана и фрагментов ПЗФ.

Впервые синтезированы и охарактеризованы конъюгаты пространственно-затрудненных фенолов и полисахарида декстрана, различающиеся природой ковалентной связи декстран-ГОФ, молекулярной массой и степенью замещения гликозидных звеньев декстрана.

Установлено, что в водных растворах по мере увеличения степени замещения гликозидных звеньев декстрана происходит компактизация макромолекул конъюгатов за счет гидрофобных взаимодействий фрагментов ПЗФ.

Разработана методика определения АРА в воде и водноорганических средах с использованием водорастворимого стабильного радикала - натриевой соли сульфокислоты 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ-SOjNa). С помощью предложенного метода выявлена корреляция между параметрами конъюгатов (степень замещения гликозидных звеньев, молекулярная масса, природа и длина спейсера) и их АРА.

Показано, что АРА синтезированных ковалентных конъюгатов определяется природой и длиной связи ПЗФ-декстран и для ряда конъюгатов значительно превосходит АРА низкомолекулярных ПЗФ.

Предложен и подтвержден катион-радикальный механизм взаимодействия свободных радикалов (ДФПГ-SOjNa, ДФПГ) с ПЗФ в воде и водноорганических средах.

Высокая АРА конъюгатов ПЗФ-декстран позволяет считать их перспективными антиокислительными системами, потенциально обладающими ценными фармакологическими свойствами.

Личный вклад автора состоит в непосредственном получении экспериментальных данных, вошедших в текст диссертации, а также активное участие в формулировке задач данной работы, выработке методологии исследования и интерпретации полученных результатов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ.

Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на международных и российских симпозиумах и конференциях:

«Синтез, исследование свойств, модификация и переработка

высокомолекулярных соединений» (Казань, 1996 г.)

"New Approaches in Polymer Synthesis and Macromolecular Formation"

(СПб, 1997)

"Biodegradable Plastics and Polymers" (Стокгольм, 1998)

"23 Annual Polymer Degradation Discussion Group Meeting" (Salford,

Англия, 1998 г.).

«Биоантиоксидант» (Москва, 1998).

Научная сессия Учебно-научного центра химии СПбГУ (СПб, 1998).

Основное содержание работы изложено в 10-х печатных работах: 3 статьях и 7 тезисах докладов конференций.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы 138 наименований. Работа изложена на 171 страницах машинописного текста, включает 14 рисунков и 5 схем, содержит 29 таблиц.

Во введении к работе дано обоснование актуальности темы исследования, сформулированы цель и задачи работы. Выбор в качестве объектов исследования антиоксидантов из класса ПЗФ и полисахарида декстрана определялся следующими позициями:

1. Литературными данными о возможности создания конъюгатов (синтетический гидрофильный полимер - ПЗФ), обладающих антирадикальной активностью на уровне низкомодекулярныхПЗФ.

2. Возможностью с помощью полимераналогичных превращений на основе функциональных производных ПЗФ создавать коньюгаты с различной природой связи ПЗФ - декстран с разным содержанием фрагментов ПЗФ в цепи, с использованием декстрана с разной молекулярной массой.

3. Применением в качестве гидрофильного полимера декстрана (О-ОН), имеющего ценные фармакологические свойства.

Литературный обзор состоит из трех разделов. В первой части дана краткая характеристика химических свойств декстрана и областей его использования, обсуждаются способы создания конъюгатов декстран-БАВ. Во второй части обзора рассмотрены механизмы действия природных и синтетических АО в биологических системах, методы синтеза полимерных АО с использованием гидрофильных полимеров. Третий раздел литературного обзора посвящен известным методам оценки АРА антиоксидантов.

В экспериментальной части приведены характеристики исходных веществ, описаны способы синтеза функциональных производных ПЗФ, конъюгатов на их основе, а также изложены физико-химические методы исследования структуры и свойств конъюгатов.

В третьей главе излагаются результаты работы, отражающие этапы последовательного решения поставленных задач: синтез конъюгатов декстран-ПЗФ с различными параметрами (тип связи, содержание фрагментов ПЗФ в цепи, молекулярная масса); изучение гидрофильности и характеристической вязкости растворов конъюгатов; изучение АРА конъюгатов.

Основное содержание работы.

СОЗДАНИЕ КОНЪЮГАТОВ ДЕКСТРАН -ПЗФ.

Для синтеза конъюгатов были выбраны образцы декстрана, молекулярная масса которых составляла 1500, 6000, 10000, 18000, 40000, 70000, 200000. В работе использованы функциональные производные ПЗФ, полученные по известным и впервые разработанным методикам (табл.1):

Таблица 1. Пространственно-затрудненные фенолы, использованные для синтезов конъюгатов.

Название сокращение

X

-сно 4-гидрокси-3,5-днтрет.бутилбен1а.1ьдегнд АлФ

-СНС1, 4-гидроксн-3,5-детрет.бутлбеызальдихлордд ХФ

-СН2СН2СООН Р-(4-гвдрокси-3,5-дттегбутилфешиОпропионовая кислота КФ

-СН2Вг 4-5роымстл-2,6-дигрег.б>тнл фенол БФ

-СН2ОСН2СН2ОН 2,6-детрсг.бутил^Ч2-гадроксиэтоксиметил)фенол ЭГФ

-СН2ОСН2СН2То8* 3,5-дтрсг.бутил-4-гидроксн-1-[2-(4-метилфеш1Ясулъфонилоксн)зтоксиметил]6ензад ТЭГФ

-СН2ОСН2СН2СН2СН2ОН* 2,6-днгрет.бутил-4Ч4- пщроксибугоксиметнш)фенол БГФ

-СН2ОСН2СН2СН2СН2То5* 3,5-дитрет.6утил-4-п1Дрокси-1-2-{2-(4-метилфенилсульфоннлокси)6уп)ксимегил|6енэол ТБГФ

* синтезированы впервые

На схеме I приведены реакции, с помощью которых были получены конъюгаты с различным типом связи ПЗФ-декстран. В результате варьирования условий синтеза были получены конъюгаты с разной степенью замещения гликозидных звеньев (у). Эта величина представляет собой долю (%) монозамещенных гликозидных звеньев декстрана к их общему количеству. Значение у определяли спектрофотометрически по максимуму полосы поглощения в области 260-290 им с использованием в качестве стандарта соответствующей модели. Структуру и состав синтезированных конъюгатов были подтверждены данными УФ- и ПМР-спектроскопии. Отсутствие примесей (ПЗФ, катализаторов) подтверждали с помощью гельпроникающей хроматографии (сефадекс ЬН-20, элюент - спирт:вода(1:1).

+ --о

„сн2

он

N

он

О-ОН т=9- 1230

т

+ НО— СН2СН2СООН —

Схема 1.

+ НО—СН2О(СН2СН2)ПТ05

п=1,2

\7 коньюгат I но-ЪксИ^^О

коньюгат П СН2СН2С00—D

коньюгат Ш сн2о—d

конъюгатГУ, V CH20(CH2CH2)n0-D

Конъюгаты с ацетальной связью ПЗФ-декстран (I).

Создание ацетальной связи ПЗФ-декстран проводили с использованием альдегидного производного ГОФ (АлФ) и более реакционноспособного гем -дихлорида ПЗФ (ХФ). Варьирование при синтезе катализатора (H2SO4, HCl, п-ТСК, CHjCOOH, п-диметиламинопиридин (ДМАП)), растворителя (ДМСО, ДМФА, ФА), температуры (40-100 °С), времени реакции (2-72 час) не привело к получению конъюгатов со степенью замещения гликозидных звеньев выше 3 мол %. Это обстоятельство, по-видимому, обусловлено особенностью структуры реагентов - декстрана и ПЗФ с объемными трет.бутильными группами, которые и создают стерические препятствия для осуществления реакции ацеталирования. Косвенно это подтверждается вьадкой степенью замещения (20 мол %) в контрольном опыте ацеталирования декстрана бензальдегидом.

Таким образом, в выбранных условиях реакции ацеталирования не удалось достичь варьирования у в широких пределах, что не позволило провести систематическое исследование физико-химических свойств этих конъюгатов.

Конъюгаты со сложноэфирной связью ПЗФ-декстран (П).

С использованием карбоксипроизводного ПЗФ (КФ) и конденсирующего агента дициклогексилкарбодиимида (ДТ (ПС), различных катализаторов (пиридин, ДМАП), в растворителе ДМСО при 20 °С были получены конъюгаты со сложноэфирной связью ПЗФ-декстран. При варьировании соотношения и концентрации реагентов, а также времени реакции в присутствии катализатора ДМАП были получены конъюгаты с содержанием ковалентно связанного КФ до 47.7 мол%.

Конъюгаты с простой эфирной связью ПЗФ-декстран. (Ш, IV, V)

н H2CH2C00—D

н НгО—О (Щ) н HjCKCHjCHzino-D n=l (IV)

n=2 (V)

Для создания простой эфирной связи ГОФ-декстран было использовано бромметиленовое производное ПЗФ (БФ), которое является активным реагентом в реакции нуклеофильного замещения.

Из рис. 1, где представлена зависимость степени замещения гликозидных звеньев декстрана БФ от времени, видно, что взаимодействие в ДМСО проходит быстро и с достаточно высокой степенью превращения.

t, час.

Рис.1 Зависимость степени замещения декстрана БФ (у, %) от времени реакции (t, ч.); [декстран]= 131 г/л, [БФ]= 0.175 мол/л, Т=20 °С.

Для получения конъюгатов с различными спейсерами, содержащими простую эфирную связь, были использованы специально синтезированные тозилатные производные ПЗФ (ТЭГФ, ТБГФ), различающиеся пара-алкильным заместителем (таблица 1).

При варьировании условий модификации декстрана (ММ 10000-200000) тозилатными производными ПЗФ (соотношение реагентов, основание, температура) были получены конъюгаты, различающиеся по молекулярной массе декстрана, длине спейсера, степени замещения глшсозидных звеньев декстрана.

Таким образом, использование различных функциональных производных ПЗФ и декстрана с молекулярной массой в пределах 1500-200000, варьирование условий введения ПЗФ позволило создать несколько серий конъюгатов, различающихся типом связи ГОФ-декстран, длиной спейсера, молекулярной массой, степенью замещения гликозидных звеньев.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОНЪЮГАТОВ.

Харзктеристистическая вязкость растворов конъюгатов.

Наличие в структуре конъюгатов гидрофобных фрагментов ПЗФ определяет сродство полимерных производных к различным органическим растворителям.

В апротонном растворителе ДМСО все полученные конъюгаты растворимы независимо от степени замещения гликозидных звеньев. Граница растворимости в воде и в водноорганических средах, обусловленная для

конъюгатов гидрофобными взаимодействиями фрагментов ПЗФ в макромолекулах, зависит как от у, так и от молекулярной массы декстрана.

Коньюгаты со степенью замещения до у = 10% растворимы в воде, до у ~ 24% в водном спирте и водном диоксане. При дальнейшем росте величины у коньюгаты могут растворяться в диоксане, хлороформе, бензоле, например, при у = 47,7%. Доя конъюгатов, полученных на основе декстрана с молекулярной массой 200000, границы указанных выше величин у снижаются примерно на

Для того, чтобы оценить как взаимодействие гидрофобных фрагментов ПЗФ влияет на поведение макромолекул конъюгатов в воде (по сравнению с органическими средами) было проведено вискозиметрическое исследование растворов в воде и в ДМСО. Из рис. 2 и табл. 2 видно, что в ДМСО для водорастворимых конъюгатов (у<10%) величина характеристической вязкости изменяется незначительно. При дальнейшем увеличении у наблюдается некоторое падение величины [т|], особенно для образцов конъюгатов Ш.

Рис. 2 Зависимость характеристической вязкости конъюгатов 11, ММ=40000 (1) и конъюгатов Ш, ММ=70000 (2) и ММ=40000 (3) в ДМСО при 25°С от степени замещения гликозидных звеньев (у).

Характеристическая вязкость в воде для водорастворимых конъюгатов при увеличении у до 10% имеет тенденцию к снижению в 1,7 раза в сравнении с исходным декстраном. Наблюдаемый ход зависимости может быть объяснен компактизацией макромолекул модифицированного декстрана, связанной с увеличением гидрофобное™ конъюгатов по мере роста количества фрагментов ПЗФ в цепи.

Данные таблицы 2 наглядно демонстрируют увеличение соотношения характеристических вязкостей конъюгатов в ДМСО и в воде, что также свидетельствует о компактизации макромолекул конъюгатов при увеличении у. При этом не наблюдается существенной разницы для конъюгатов П и Ш.

2%.

О 5 10 15 20 25 30

у, %

Таблица 2. Характеристическая вязкость конъюгатов П и Ш.

Конъюгат, (ММ = 40000) у,% Гп1дмсо, Дл/г [Т|]н20, дл/г [л1дмс<у[п]н20

0 0,22 0,16 1,4

Ш 4,0 0,23 0,13 1,7

6,2 0,23 0,11 2,0

7,3 0,22 0,10 2,1

9,4 0,21 0,09 2,4

0 0,22 0,16 1,4

ц 2,6 0,22 0,15 1,5

3,9 0,23 0,14 1,6

5,8 0,24 0,13 1,8

9,7 0,26 0,10 2,6

Проявление гидрофобности макромолекул конъюгатов было зафиксировано при спектротурбидиметроическом титровании, проведенном в водно-диоксановой смеси с осадителем диоксаном. На примере конъюгатов Ш (рнс. 3) показано, что при увеличении у линейно растет количество осадителя, необходимого для достижения точки мутности. При этом растворимость конъюгатов падает с ростом молекулярной массы.

Рис. 3 Зависимость количества осадителя (9) в системе диоксан:вода, необходимого для достижения точки мутности в растворах конъюгатов Ш с молекулярной массой 10000 (1), 40000 (2) и 200000 (3) от степени замещения гликозидных звеньев (у).

Антирадикальная активность (АРА) конъюгатов.

Определение АРА в отношении свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ).

Высокая реакционная способность ПЗФ в отношении радикалов с активным центром на кислороде (ROO», НО» и др.) определяет их свойства как антиоксидантов (схема 2):

В ряде работ было установлено [Бурлакова 1995, Гурвич 1995], что для ангиоксидантов из класса ПЗФ существует корреляция между АРА в отношении свободного радикала ДФГГГ и антиоксидантной активностью (АОА), определенной различными методами. Таким образом, взаимодействие ПЗФ со свободным радикалом ДФПГ может служить тестом количественной оценки антиоксидантных свойств ПЗФ (схема 3):

Схема 3.

Оценка АРА синтезированных конъюгатов и низкомолекулярных моделей в отношении свободного радикала ДФПГ была проведена путем сравнения констант скорости их взаимодействия в смешанном растворителе диоксан-вода при 20 °С в условиях псевдопервого порядка при 20-кратном избытке антиоксиданта. Реакцию проводили до 20% конверсии ДФПГ с начальной концентрацией 1-10"5м/л. Концентрацию ДФПГ определяли по изменению оптической плотности реакционной смеси при 520 нм во времени.

Выбор в качестве среды для проведения кинетических измерений водного диоксана определялся растворимостью в нем конъюгатов (до у < 24%), а также устойчивостью ДФПГ в этой среде как на воздухе, так и в прцессе кинетических опытов в кювете спектрофотометра при облучении (Х=520 нм).

Изучение АРА конъюгатов II и низкомолекулярнык аналогов, в качестве которых выбраны КФ и соответствующая калиевая соль (Феноксан), показало, что константа скорости реакции ДФПГ с конъюгатом несколько выше (табл. 3). Феноксан был использован для кинетических исследований в качестве низкомолекулярной модели ПЗФ также и для других серий конъюгатов, поскольку он растворялся в водноорганических средах и в воде. Необходимо отметить, что декстран, будучи инертным по отношению к ДФПГ, ведет себя аналогичным образом и в механической смеси как с КФ, так и с водорастворимым Феноксаном. Константы скорости реакции этих ангиоксидантов с ДФПГ ие изменяются в присутствии декстрана.

Таблица 3. Константы скорости реакции антиоксидантов со свободными радикалами в водном диоксане (1:1, об/об).

Антиоксиданты Растворимость в К, л/моль-с

воде ДФПГ ДФПГ-ЗО^а

Дексгран + 0 0

Феноксан

+ 10,0+0,5 3,0±0,2

КФ

- 3,4±0,2 1,2±0,05

Феноксан + декстран (1:10) + 10,0+0,5 3,0+0,2

КФ + декстран (1:10) - 3,4±0Д 1,2±0,05

Конъюгат II, (ММ=40000, у = 10,4%) + 12,5±0,8 3,5+ОД

Более значительная разница в значениях констант скорости реакции конъюгата с ДФПГ наблюдается по мере увеличения содержания воды в смешанном растворителе (рис. 4) (максимальное и минимальное содержание воды в смешанном растворителе ограничивалось растворимостью ДФПГ и антиоксидантов).

Содержание воды в смешанном растворителе, мол.%

Рис. 4. Зависимость констант скоростей взаимодействия ДФПГ с КФ (1) и с конъюгатом П (у = 10,4%, ММ 40000) (2) от состава смешанного растворителя.

Видно, что изменение состава среды при взаимодействии ДФПГ с анпкл-лидантами приводит в обоих случаях как к росту констант скоростей, так и к увеличекшо разницы между ними.

Таким образом, среда, в данном случае водноорганическая, в значительной степени влияет на скорость реакций антиоксидантов с ДФПГ, причем конъюгаты оказываются намного чувствительнее к изменению ее состава. Это иллюстрируется также сравнением результатов табл. 3 с данными, полученными для конъюгата П и КФ в менее полярных и гидрофобных растворителях (табл. 4).

Таблица 4. Константы скоростей реакции ДФПГ с антиоксидантами в различных растворителях.

Антиоксидант К, л/моль ■ с

хлороформ бензол диоксан

КФ Конъюгат П, у = 47,7% ММ 40000 0,188^0,009 0,153 ±0,008 0,142 ±0,008 0,083 ±0,005 0,056 ± 0,004 0,135 ± 0,007

В случае использования хлороформа и бензола константа скорости реакции для КФ превосходит эту величину для конъюгата, тогда как в диоксане (табл. 4) и в водном диоксане (табл. 3) наблюдается обратная зависимость.

Определение АРА в отношении водорастворимого свободного радикала -натриевой соли 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилсульфокислоты (ДФПГ-ЮзЫа).

Результаты, полученные при изучении антирадикальной активности антиоксидантов в полярной водноорганической среде показали, что при максимальном содержании воды в смешанном растворителе конъюгаты имеют наиболее высокие константы скорости взаимодействия с ДФПГ в сравнении с низкомолекулярным Феноксаном. В связи с этим представлялось логичным изучить АРА в воде, охватив весь диапазон растворителей: диоксан, смесь диоксан-вода, вода, и оценить, таким образом, влияние полимерной матрицы (декстрана) на АРА в зависимости от полярности среды. Кроме того, разработка простого экспресс-метода определения АРА в воде представляет особый интерес, поскольку эта среда наиболее приближена к биологическим системам.

С целью исследования АРА в воде и водноорганических средах был специально синтезирован водорастворимый аналог ДФПГ - натриевая соль 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразилсульфокислоты (ДФПГ-БОзКа). Было установлено (табл. 3), что ДФПГ-80эКа в смешанном растворителе является менее активным по сравнению с ДФПГ примерно в 3 раза независимо от реагирующего антиоксиданта.

Контрольными опытами было показано, что ДФПГ-80з№ устойчив в течение 24 часов в водных растворах, что позволяет его успешно использовать для кинетических исследований наряду с ДФПГ. Растворимость обоих свободных радикалов ДФПГ и ДФПГ-БОзКа в водном диоксане позволила провести для них сравнительное изучение АРА.

С использованием свободного радикала ДФПГ-80з№ в водном диоксане было изучено влияние некоторых параметров конъюгатов (молекулярная масса, у) на константы скоростей их реакции с ДФПГ-ЗОзКа (рис. 5).

и * 8 л

с;

° 6 £

2-

*---

:*—^

-1—'—I—>—I—■—1—■—1—1—I

6 8 10 12 14 16

У, %

Рис. 5. Зависимость констант скорости ДФПГ-50з№ (К) с конъюгатами Ш (1-4) и П (5) от степени замещения гликозидных звеньев (у) для различных молекулярных масс (вода-диоксан 1:1 об.):

(1) - 10000; (2) - 40000; (3) - 70000; (4) - 200000; (5) - 40000;* - Феноксан.

Из рис.5 видно, что константы скорости конъюгатов II мало зависят от у, тогда как для конъюгатов Ш вплоть до у = 12% наблюдается более высокая антирадикальная активность, чем для Феноксана. При дальнейшем увеличении степени замещения конъюгатов их АРА становится даже ниже активности Феноксана. Повышение молекулярной массы образцов конъюгатов с 10000 до 200000 приводит к двухкратному снижению констант скорости их реакции с ДФПГ- ЗОзИа.

Из представленных выше данных (рис. 4) видно, что при переходе от водноорганической среды в чистую воду константы скорости взаимодействия

конъюгатов с ДФПГ-вСЬКа должны превзойти аналогичную величину для Фенохсана. Ожидаемая закономерность была подтверждена серией экспериментов с различными конъюгатами (табл. 5). При этом можно заметить, что различие в константах скоростей реакции для конъюгатов определяется как природой спейсера ПЗФ-декстран, так и его длиной. Максимальная величина К найдена для конъюгата со сложноэфирной связью декстран-ПЗФ (II).

" Таблица 5. Константы скорости реакции конъюгатов II-V (у ~ 9%, ММ 40000) и Феноксана с ДФПГ-БОзИа в воде.

Серия конъюгата Конъюгат но-О-х К, л/моль-с

П -СН2СН2СООО 1100±50

III -СН200 270±13

IV -сн2осн2сн2оо 356±18

V -СН20(СН2СН2)200 28,5±1,5

Феноксан -сн2сн2соок 35,7±1,2

Декстран + Феноксан (10:1) -с.н2с.н2соок 35,7±1,2

Как и в случае с ДФПГ, смесь декстран-феноксан при реакции с ДФПГ-вОзКа имела такую же константу скорости, что и сам Феноксан.

Анализ полученных данных позволяет заключить, что в воде и в водноорганической среде при использовании обоих свободных радикалов повышенная АРА конъюгатов, в которых ПЗФ ковалентно связаны с декстраном, обусловлена возможным влиянием полимерной матрицы на ПЗФ.

Влияние полимерной природы конъюгатов на их АРА в водноорганических средах и в воде.

Известно, что скорость радикальных реакций, как правило, мало зависит от характера среды. Однако при изучении взаимодействия полимерных и низкомолекулярных антиоксидантов как с ДФПГ (рис. 4), так и с ДФЕГ-БОзИа (рис. 6) было обнаружено, что скорость реакции быстро растет с увеличением полярности среды.

Такое сильное влияние среды на скорость взаимодействия ДФПГ-80з№ и антиоксидантов противоречит принятому радикальному механизму переноса атома водорода от молекулы ПЗФ к ДФПГ (схема 2).

содержание воды^об. %

Рис. 6 Зависимость констант скоростей взаимодействия ДФПГ-БОзЫа с Феноксаном (1) и различными конъюгатами, ММ 40000 (2-4) от состава смешанного растворителя диоксан-вода:

(2) - конъюгат II, у =9.7%

(3) - конъюгат III, у =9.4%

(4) - конъюгат IV, у =9.6%

В связи с этим нами было сделано предположение, что в водных средах механизм этой реакции для обоих свободных радикалов протекает через промежуточную стадию образования катион-радикала (схема 4):

Схема 4.

Известно, что если взаимодействие проходит через стадию образования катион-радикала, то кинетические зависимости описываются уравнением Грюнвальда-Уинстейна:

Log К/Ко = m-Y, где

Y - мера ионизирующей способности растворителя

m - степень чувствительности реакции к смене ионизирующей силы растворителя

К - константа скорости реакции

Ко - константа скорости реакции в стандартном растворителе (80% этанол).

Для подтверждения катион-радикального механизма данной реакции были измерены константы скорости ДФПГ-БОзКа с Феноксаном в смесях растворителей (диоксан-вода). Данные представлены на рис. 7 в виде логарифмической зависимости полученных констант от Y (данные для Y взяты из работ Grunvald Е.).

Y

Рис. 7. Логарифмическая зависимость констант реакции ДФПГ-50з№ и Феноксана (1о£>К) от ионизирующей способности смешанного растворителя диоксан-вода. Коэффициент корреляции 0,992.

Полученная линейная зависимость свидетельствует о соответствии кинетических зависимостей уравнению Грюнвальда-Уинстейна и, следовательно, подтверждает катион-радикальный механизм реакции. Значение т в уравнении, найденное из графика (рис. 7), составило 0,46+0,03.

Одним из возможных объяснений большей АРА конъюгатов по сравнению с низкомолекулярным Феноксаном при их взаимодействии со свободными радикалами в водных средах может являться наличие сольватной оболочки в декстране, а, следовательно, и в конъюгатах на его основе. Известно, что свойства воды в сольватной оболочке гидрофильных полимеров отличаются от свойств обычной воды повышенной ионизирующей способностью, которая связана с разной ориентацией и подвижностью молекул воды, с разрушением водородных связей между ними. На наш взгляд ковалентно связанные с

декстраном молекулы ПЗФ в водных растворах, скорее всего, находятся в сольватной оболочке, в которой и протекает их взаимодействие со свободным радикалом.

Таким образом, большая ионизирующая способность сольватной оболочки дексграна способствует большей стабилизации переходного состояния (катион-радикального) для конъюгатов по сравнению с переходным состоянием низкомолекулярного Феноксана в обычной воде. Это объясняет большую активность конъюгатов в воде и снижение их АРА при уменьшении содержания воды в смешанном растворителе (рис. 6).

Для того, чтобы оценить величину ионизирующей способности сольватной оболочки декстрана в чистой воде, было сделано допущение об одинаковой активности реакционных центров Феноксана и конъюгата (Шфенокан = Шконъюгзт). Кроме того, был принят во внимание факт нерастворимости декстрана в смешанном растворителе диоксан-вода (8:2 об/об) и, следовательно, отсутствие в этом случае сольватной оболочки. Расчет ионизирующей способности сольватной оболочки декстрана был сделан согласно уравнению по данным для конъюгата 11, ММ 40000, у =9,7:

_____-= га

, где

Кн2о - константа скорости реакции ДФПГ-ЗОзМа с конъюгатом в воде К'

- константа скорости реакции ДФПГ-БОз^ с конъюгатом в смеси диоксан:вода (8:2, об/об), полученная экстраполяцией и составляющая 0,36+0.03 л/моль с

У я - ионизирующая способность сольватной оболочки декстрана У* - ионизирующая способность смешанного растворителя диоксан-вода 8:2, об/о б ш = 0,46±0.03

Полученное большое значение иолнизирующей способности сольватной оболочки декстрана (Ух = 6,7 ±0,4) в два раза превосходящее табличное значение для чистой воды (У = 3,493), можно объяснить деструктуризацией воды в сольватной оболочке декстрана. Именно этот процесс приводит к снижению энергетических затрат на разрушение водородных связей при сольватации катион-радикала. Следует отметить, однако, что величина Уэ не является строгой термодинамической величиной, но может быть использована при исследовании реакций в цепях полимеров.

Влияние сольватной оболочки на реакцию ДФИГ-БОзИа с конъюгатами можно проследить, меняя длину спейсера ПЗФ-декстран.

Из данных табл. 5 видно, что конъюгаты П имеют наибольшую величину константы реакции с ДФПГ-5(}^а, тогда как для конъюгатов Ш-ГУ константа скорости реакции в 3 раза ниже. Специально синтезированный конъюгат V, имеющий более длинный спейсер, как и ожидалось, имеет константу скорости реакции того же порядка, что и низкомолекулярный Феноксан. Это можно объяснить тем, что реакционный центр конъюгата V (фрагмент ПЗФ) в данном случае выведен из сольватной оболочки декстрана.

Влиянием сольватной оболочки на взаимодействие конъюгатов с ДФПГ-вОзЫа объясняется и экстремальный характер зависимости констант скорости этой реакции от молекулярной массы декстрана (рис. 8). Согласно литературным данным по мере увеличения молекулярной массы декстрана растет объем сольватной оболочки в воде и, следовательно, скорость реакции ДФПГ-вОэКа с конъюгатами должна увеличиваться. Однако, начиная с некоторого значения молекулярной массы, по-видимому, сказываются сгерические препятствия для такого взаимодействия, обусловленные макромолекулярной природой, и константы скорости реакции постепенно снижаются.

Молекулярная масса

Рис. 8 Зависимость констант скорости реакции конъюгатов II (у~9%) с ДФПГ-80зКа в воде от молекулярной массы декстрана.

Антирадикальная активность конъюгатов на основе синтетических гидрофильных полимеров в отношении других радикалов.

Для подтверждения высказанного предположения о катион-радикальном механизме взаимодействия ДФПГ-БОзЫа и ПЗФ в воде, а также влияния сольватной оболочки гидрофильных полимеров на скорость этого взаимодействия, были проведены дополнительные эксперименты. Были получены константы скорости взаимодействия в воде ПЗФ с различными реагентами, которые, согласно литературным данным, однозначно реагируют с ПЗФ по радикальному и по катион-радикальному механизму.

В качестве водорастворимого свободного радикала, реагирующего с ПЗФ исключительно по традиционному радикальному механизму (перенос атома водорода) был выбран нитрозодисульфонат калия (НДСК).

КОзЭ^ЭОзК

КОэЭ^ЗОзК

I

он

В случае простого радикального взаимодействия НДСК с полимерным ПЗФ в воде, сольватная оболочка полимера не должна оказывать влияния на скорость этого процесса, поскольку среда на эту реакцию практически не влияет. Поэтому следует ожидать, что константы скорости реакции для низкомолекулярного ПЗФ будут равны или больше аналогичных величин для полимерного производного ПЗФ.

Таблица 6. Константы скорости реакции в воде ПЗФ с различными реагентами, Т= 20 "С.

Антиоксидант Реагент / К, л/молс

ДФПГ-БОзКа НДСК (БОзКЬМО* К3|Те(СМ)б] рН = 7,7

Конъюгат II, у= 9.7 %, ММ 40000 1100±50 0,42±0,03 79±3

Феноксан 35,7+1,2 0,83+0,05 26±2

Полученные данные (табл. 6) подтверждают наше предположение. Так, конъюгат II с нитроксильным радикалом реагирует в 2 раза медленнее феноксана.

Для гексацианоферрата калия (III), реагирующего с ПЗФ по катион-радикальному механизму, наблюдается другое соотношение констант скорости реакции для низкомолекулярного и полимерного ПЗФ.

При реализации катион-радикального механизма реакции наличие сольватной оболочки макромолекулярной цепи должно увеличивать скорость этой реакции. Из табл. 6 видно, что конъюгат реагирует с Кз[Ре(СМ)б] быстрее, чем Феноксан. Сравнении констант скоростей реакции низкомолекулярного и полимерного ПЗФ с ДФПГ-80з№ и К3[Те(СМ)б] показывает, что в последнем случае разница значительно меньше. Возможно это объясняется большой разницей в величинах энергий исходных состояний ДФПГ-803№ и Кэ[Ре(С>0б] в воде. В случае ДФПГ-ЗОзИа эта величина больше из-за наличия в нем гидрофобных фрагментов ДФИГ-ЗОзИа. Отсюда можно сделать вывод, что наибольшее влияние на скорость реакции ДФПГ-БОзЫа с ПЗФ оказывает

именно стабилизация в переходном состоянии реагента (аниона ДФПГ-вСЬШ), а не катион-радикала ГОФ.

Влияние сольватной оболочки на реакцию в воде конъюгатов ПЗФ-гидрофильный полимер со свободным радикалом ДФПГ-ЭСЬЫа бьшо подтверждено при использовании конъюгатов на основе сополимера винилпирролидона с кротоновой кислотой и ПВС. Данные представлены в табл. 7.

Таблица 7. Константы скорости реакции конъюгатов с ДФПГ-803Ка в воде, Т = 20 "С.__

Конъюгаты К, л/мол-с

280±8

¿Иг А 70±2

Феноксан 35,7 ±1,2

Конъюгаты на основе гидрофильных полимеров также как и на основе декстрана оказались более активными в реакции с ДФПГ-БОзКа в воде по сравнению с низкомолекулярным Феноксаном.

Таким образом, изучение в воде АРА для низкомолекулярных и полимерных ПЗФ, различающихся полимером-носителем, при использовании различных реагентов подтвердило ускоряющее влияние сольватной оболочки на исследуемую реакцию, что связано с возможным протеканием ее по катион-радикальному механизму.

ВЫВОДЫ.

1. Взаимодействием полисахарида дексграна с функциональными производными пространственно-затрудненных фенолов (ПЗФ) синтезирован ряд ранее не описанных ковалентных конъюгатов, обладающих антирадикальной активностью.

2. Разработаны методики, позволившие путем варьирования условий синтеза создать конъюгаты, различающиеся природой ковалентной связи ПЗФ-декстран (ацетальная, сложноэфирная, простая эфирная), степенью замещения гликозидных звеньев (до 47.7% мол), молекулярной массой(1500, 6000, 10000, 18000,40000, 70000, 200000).

3. Впервые разработана методика определения антирадикальной активности в воде и водноорганических средах с использованием водорастворимого стабильного радикала - натриевой соли сульфокислоты 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразила.

4. Предложен и подтвержден катион-радикальный механизм взаимодействия натриевой соли сульфокислоты 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила с пространственно-затрудненными фенолами в воде и водноорганических средах.

5. Показано, что антирадикальная активность ковалентных конъюгатов декстран-ПЗФ значительно превосходит антирадикальную активность низкомолекулярных ПЗФ в водноорганических средах. Установлено, что антирадикальная активность исследуемых антиоксидантов зависит от полярности среды, а в случае конъюгатов определяется также молекулярной массой дексграна и природой связи ПЗФ-декстран.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Домнина Н.С., Комарова Е.А., Арефьев Д.В., Назарова О.В., Кочегкова И.С. Антиокислительные свойства полимерных пространственно-затрудненных фенолов на основе сополимеров N-винилпирролидона.// Высокомол. соед., сер. А, 1997, Т. 39, № 10, с. 1573-1577.

2. Арефьев Д.В., Домнина Н.С., Комарова Е.А., Арефьева Г.В., Рахматуллина E.H., Билибин А.Ю. Синтез и антирадикальная активность конъюгатов декстрана и р-(4-гидрокси-3,5-дитрет.бутилфенил)пропионовой кислоты.// Журн. Прикл. химии,1999, Т.72, вып.З., с.670-673

3. Arefiev D.V., Domnina N. S., Komarova E.A., Bilibin A.Yu. Sterically hindered phenol-dextran conjugates: syntesis and radical scavenging activity // Europ. Polymer J., 1999, V.35, N 2, p. 279-284.

4. Арефьев Д. В., Домнина НС. Создание конъюгатов декстрана с пространственно-затрудненным фенолом и изучение их антиокислительной и антирадикальной активности // Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений, Казань, 1996,

5. Arefiev D.V., Domnina N. S., Komarova E.A., Arefieva G.V., Bilibin A.Yu. Synthesis and properties of covalently bounded conjugates of dextran and sterically hindered phenols // New approaches in polymer synthesis and macromolecular formation // SPb, Russia, 1997, P-130.

6. Арефьев Д.В. Синтез и свойства конъюгатов биополимера декстрана и пространственно - затрудненных фенолов.// Научная сессия 275 лет основания Санкт-Петербургского университета, СПб, СПбГУ, 1998, с. 205206.

7. Домнина Н.С., Комарова Е.А., Арефьев Д.В., Назарова О.В., Лебединцева О.В., Белохвостова А.Т. Антиокислительная активность водорастворимых полимерных пространственно-затрудненных фенолов // Биоангиоксидант, М., 1998, с. 38.

8. Арефьев Д.В., Домнина Н.С., Комарова Е.А. Коньюгаты пространственно-затрудненного фенола и декстрана: синтез и свойства // Биоантиоксидант, М„ 1998, с. 23.

9. Domnina N., Arefiev D., Komarova E., Bilibin A. Dextran as antioxidant's activity carrier // Int. Workshop on biodegradable plastics and polymers, Stockholm, 1998, P-152.

10. Arefiev D., Domnina N., Komarova E., Bilibin A. The radical scavenging activity of polymeric antioxidants in water // 23 Annual polymer degradation discussion group meeting, Salford, England, 1998, P-l

c. 147.

ЛР № 040815 от 22.05.97.

Подписано к печати 2000 г. Формат бумаги 60X90 1/16. Бумага офсетная.

Печать ризографическая. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 1239. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ с оригинал-макета заказчика. 198904, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр. 2.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Декстран - носитель биологически активных веществ

1.2. Природные и синтетические фенольные соединения как 27 антиоксиданты.

1.2.1. Свободнорадикальный механизм окисления углеводородов.

1.2.2. Природные антиоксиданты.

1.2.3. Синтетические антиоксиданты.

1.2.4. Полимерные формы ПЗФ.

1.3. Основные методы изучения антирадикальной активности

1.3.1. Манометрический метод.

1.3.2. Хемилюминесцентный метод.

1.3.3. Методы с применением ЭПР.

1.3.4. Методы с использованием стабильных радикалов.

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Исходные вещества, их получение и характеристики.

2.2. Синтез конънм атов.

2.2.1. Конъюгаты I с ацетальной связью ЙЗФ— декстран.

2.2.2. Конъюгаты II со сложнрэфирной связью ПЗФ-декстран.

2.2.3. Конъюгаты Ш-У с простой эфирной связью ПЗФ-декстран.

2.2.4. Конъюгат поливинилового спирта и БФ.

2.2.5. Конъюгат сополимера винилпирролидона с кротоновой кислотой и гидразида-(4-гидрокси-3,5-дитрет.бутилфенил)пропионовой кислоты.

2.3. Методы анализа полимерных продуктов.

2.4. Методика изучения антирадикальной 85 активности.

2.4.1 Антирадикальная активность в отношении свободных радикалов

ДФГ1Г и ДФПГ-80з1Ма.

2.4.2. Антирадикальная активность в отношении нитрозодисульфоната калия.

2.4.3. Антирадикальная активность в отношении гексацианоферрата калия (III).

Глава 3. Обсуждение результа то в

3.1. Синтез конъюгатов.

3.1.1. Синтез конъюгатов с ацетальной связью.

3.1.2. Синтез конъюгатов со сложноэфирной связью.

3.2.3. Синтез конъюгатов с простой эфирной связью.

3.2. Спектральные характеристики конъюгатов.

3.3. Объекты исследования:синтезированные конъюгаты и низкомолекулярные модели.

3.4 Физико-химические свойства конъюгатов.

3.4.1. Характеристическая вязкость растворов конъюгатов.

3.4.2. Антирадикальная активность конъюгатов.

ВЫВОДЫ

Высокомолекулярные соединения играют большую роль в функционировании живых организмов. Так, многие молекулы природных соединений представляют собой конъюгаты низкомолекулярных веществ с высокомолекулярными соединениями. Связи в таких конъюгатах могут быть ковалентные, ионные или координационные. В качестве примера можно привести гемоглобин - транспортный белок, который наряду с белковой частью (глобином) содержит железопорфириновую группировку (гем) [I].

В 50-60 годы идея живой природы о функционировании молекул природного происхождения в виде конъюгатов была с успехом применена учеными для создания полимерных форм биологически активных веществ (БАВ). В качестве полимерной основы были использованы не только биополимеры (целлюлоза, крахмал, хитозан и др.), но и водорастворимые синтетические полимеры (поливинилпирролидон, полиакриловая кислота, ПВС и др.) [2,3]. На их основе были созданы высокоэффективные биокатализаторы, иммуноактивные средства, полимерные производные различных низкомолекулярных биорегуляторов, биоцидов и т.п.[4-8] Полимерные системы такого типа предназначены как для функционирования вне организма, так и внутри после введения в него. При этом иммобилизуемое биологически активное вещество может быть как низкомолекулярным, так и полимерным. 4

Среди преимуществ таких высокомолекулярных систем следует отметить корректировку растворимости, обеспечение пролонгированного действия, повышение стабильности биологически активного вещества, снижение уровня его токсичности и др. Например, искусственные биокатализаторы, как правило, отличаются большой устойчивостью к денатурирующим воздействиям и возможностью многократного использования [6].

Для полимеров медико-биологического назначения, используемых в качестве полимерных носителей или модификаторов, предъявляют специфический комплекс требований к их химическому строению и физико-химическим характеристикам [5]. К настоящему времени известен широкий круг таких полимеров, которые в исходном или модифицированном виде содержат функциональные группы, легко вступающие в различные химические реакции [4]. Можно выделить основные способы иммобилизации биологически активных веществ:

1. Связывание молекул БАВ с макромолекулами полимера-носителя за счет адсорбционного взаимодействия, за счет биоспецифического взаимодействия, а также за счет образующейся химической связи (ковалентной, ионной, координационной)

2. Использование процессов полимеризации и сополимеризации, а также поликонденсации и полиприсоединения с участием мономеров, содержащих БАВ.

3. Использование методов механической иммобилизации (включение в гель, микрокапсулирование и др.).

Несмотря на достаточно широкий круг работ и успехи в этой области, не все проблемы, связанные с созданием конъюгатов БАВ с синтетическими или природными полимерами, решены [8]. К числу актуальных проблем относится вопрос взаимного влияния природы полимера на активность БАВ и иммобилизованного БАВ на поведение матричного полимера.

Очень важным обстоятельством при создании полимерных конъюгатов является природа связи между полимером и БАВ [5,9]. Набор химических связей, используемых для присоединения БАВ к полимерам-носителям, достаточно велик. В зависимости от целей, для которых использутог БАВ, синтезируют конъюгаты с различной степенью лабильности связи полимер-БАВ.

Существенным моментом при использовании конъюгатов является форма, в которой они могут реализовать свою активность. Во-первых, БАВ может выделяться из конъюгата с различной скоростью в зависимости ог условий (рН, температура), то есть действовать по 6 принципу "депо". Именно способность к постепенному гидролизу определяет эффективность полимерных производных регуляторов роста и развития растений. Во-вторых, в ряде случаев, например, для иммуномодуляторов, активность коньюгатов будет проявляться только в полимерной форме [5].

Среди БАВ особое место занимают антиоксиданты - вещества, способные в малых концентрациях тормозить свободнорадикальное окисление различных органических соединений [10]. В последние десятилетия было показано, что синтетические антиоксиданты, например, пространственно-затрудненные фенолы (ПЗФ), которые давно используются для стабилизации каучуков и резин, могут защищать от окисления жиры, пищевые продукты. Высокая эффективность и нетоксичность ПЗФ способствовала их применению в медицине и биологии как аналогов природных антиоксидантов (биоантиоксидантов) [11,12]. В немногочисленных работах было показано, что создание полимерных производных ПЗФ на основе синтетических гидрофильных полимеров позволило реализовать известные преимущества макромолекулярных систем, а также придать ПЗФ водорастворимость [13-16]. Использование природных гидрофильных полимеров, например, декстрана в качестве основы коньюгатов ПЗФ-полимер могло бы способствовать появлению у конъюгата таких ценных свойств как гидролизуемость, биодеградируемость, нетоксичность. 7

Таким образом, проблема создания конъюгатов различных БАВ представляется весьма актуальной, и решение в ее рамках таких задач как изучение взаимовлияния с одной стороны, иммобилизованного БАВ на поведение полимерной матрицы, а с другой - природы полимера на активность БАВ, открывает возможность целенаправленно изменять эффективность БАВ.

Основная цель работы заключалась в синтезе и исследовании закономерностей создания новых полимерных конъюгатов на основе биополимера декстрана и ПЗФ и в изучении влияния структуры конъюгатов декстран-ПЗФ на их физико-химические свойства, в том числе, на антирадикальную активность в воде и в водноорганических средах.

Для реализации указанной цели были поставлены и выполнены следующие задачи:

1. Разработать методы введения функциональных производных ПЗФ в полимерную цепь декстрана, позволяющие варьировать тип связи ПЗФ-декстран, длину спейсера, содержание фрагментов ПЗФ в конъюгатах.

2. Оценить зависимость растворимости в воде, величины характеристической вязкости, гидрофильно-гидрофобного баланса конъюгатов от их строения. 9

выводы.

1. Взаимодействием полисахарида декстрана с функциональными производными пространственно-затрудненных фенолов (ПЗФ) синтезирован ряд ранее не описанных ковалентных конъюгатов, обладающих антирадикальной активностью.

2. Разработаны методики, позволившие путем варьирования условий синтеза создать конъюгаты, различающиеся природой ковалентной связи ПЗФ-декстран (ацетальная, сложноэфирная, простая эфирная), степенью замещения гликозидных звеньев (до 47.7% мол), молекулярной массой(1500, 6000, 10000, 18000, 40000, 70000, 200000).

3. Впервые разработана методика определения антирадикальной активности в воде и водноорганических средах с использованием водорастворимого стабильного радикала - натриевой соли сульфокислоты 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила.

4. Предложен и подтвержден катион-радикальный механизм взаимодействия натриевой соли сульфокислоты 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила с пространственно-затрудненными фенолами в воде и водноорганических средах.

154

5. Показано, что антирадикальная активность ковалентных конъюгатов декстран-ПЗФ значительно превосходит антирадикальную активность низкомолекулярных ПЗФ в водноорганических средах. Установлено, что антирадикальная активность исследуемых антиоксидантов зависит от полярности среды, а в случае конъюгатов определяется также молекулярной массой декстрана и природой связи ПЗФ-декстран.

1. Николаев А.Ф., Охрименко Г.И. Водорастворимые полимеры,- Л .: Химия,1979.-144 с.

2. Полимеры медицинского назначения,- М.:ИНХС АН СССР, 204 с. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений,- М.: Наука, 1984,- 261 с.

3. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. -М.: Химия, 1986.-296 с.

4. Торчилин В.П. Иммобилизованные ферменты в медицине,- М.: Знание, 1986.-28 с.

5. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры,- СПб.: Гиппократ, 1993,- 264 с.

6. Shtilman M.I. Immobilization on polymers.- Tokyo: VSP Utrecht, 1993.-479 p.

7. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo/- M.: Наука, 1992,- 110 c.

8. Свиридов Б.В., Скворцов В.Ю., Атауллаханов Р.И. и др.1.. '

9. Синтетические высокомолекулярные иммуномодуляторы на основе модифицированных сополимеров винилпирролидона//

10. Иммунология,- 1986,- N 2,- С. 25-27.

11. Назарова О.В., Домнина Н.С., Комарова Е.А., Панарин Е.Ф. Водорастворимые полимерные антиоксиданты.//Ж. прикл. химии. -1994,-Т. 67,-N5,-С.843-845.

12. Карпова C.B. Домнина Н.С. Комарова Е.А. Синтез полимерных производных пространственно-затрудненных фенолов и изучение их поведения в водных средах.// Ж. прикл. химии.- 1995,- Т. 68.-N3,- С.494-498.

13. Мусатов П.П., Михайлов Д.А., Рогинский В.А. Сб. Материалов конф. "Биоантиоксидант".-Москва, 1993.-ч. I,-210с. Розенфельд E.JI. Декстран, его особенности и значение как заменителя плазмы крови//Усп. Биол. Химии.-1958.~ № 3,- С.366-387.

14. Федоров H.A., Козинер В.Б. Механизм действия полиглюкина.- М.: Медицина, 1974.

15. Преображенская М.Е. Декстраны и декстраназы//Усп. Биол. Химии,-M.- 1975.-Т. 16,-С. 214-235.

16. Валуев Л.И. Полимерные системы для контролируемого выделения инсулина// Высокомолек. Соед.-1995.- Т.37,- № 11- С. 1960-1968.

17. Лившиц B.C., Курганов Б.И. Принципы создания полимерныхсистем с саморегулируемым высвобождением лекарственныхсредств// Хим.-фарм.ж.-1990,- N2,- С. 150.

18. Лившиц B.C., Заиков Г.Е. Лекарственные формы на основебиодеструктирующихся полимеров// Хим.-фарм. ж.- 1991.-№ 1,- С.15.25.

19. Papini P. Feroci M., Auzzi G. Sintesi di un derivato acetilsalicilico del destrano e studio sulla sua attivita farmacológica// Ann. Chim.-1969-Vol. 59,-p. 1043-46

20. Хомяков К.П., Ушаков С.H., Вирник А.Д., Роговин З.А. Синтез эфира декстрана и пелентановой кислоты// ХПС.-1965.- вып. 4.- С. 245-246.

21. Васильев А.Е. Синтез декстрановых производных аналогов эледоизина//Ж. Общ. Химии.-1973,- Т. 43,-№ П.- С.2529-2532. Harboe E., Johansen M., Larsen С. //Farmaci. Sei. Ed.-1988,- Vol. 16,-p. 73

22. Артемова Ю.В., Вирник А.Д., Яковлев В.А., Роговин З.А. Синтез водорастворимого производного декстрана, содержащего химически присоединенный витамин РР// ЖВХО.-1975,- Т.20.- N5,-С.599.

23. Manuel Sanchez-Chaves, Felix Arranz Preparation of dextran -bioactive compound adducts by the direct esterification of dextran withbioactive carboxylic acids// Polymer.-1997- Vol.38.- N 10,- p.2501-2505

24. Васильев A.E. Присоединение производных у-амм номасляной кислоты к декстраиу// Ж. Общ. Химии.-1980,- Т.50.-№ 7,- С. 16401648.

25. Reiner R.H., Batz H.G.// Makromol. Chetn.-1981- Vol.182.- N 6.- p. 1641-1648

26. Domb J., Linden G., Polacheck L., Benita S.Nystatin Dextran conjugates: synthesis and characterization// J. Polym. Sci. Polym. Chem.-1996- Vol. 34,- p. 1229-1236

27. Козулицына Т.Н., Хомяков К.П., Вирник А.Д. и др. //Вопр. Мед. Химии.-1968.-вып. 14,- С.375.

28. Gumargalieva K.Z., Shipunova O.V., Zaikov G.E. Biodégradation of polymer compounds based on cross-linked dextranes// Intern. J. Polym. Mater.-1995- Vol.30.- p. 213-224

29. Хомяков К.П., Вирник А.Д., Роговин З.А. Синтез сульфопропилового и З-хлор-2-оксипропилового эфиров декстрана// ХПС.-1966,- N3,- С.213-214.

30. Иозегт A.A., Горделянова Л.Н., Ивин Б.А. Синтез замещенныхамидов и гидразинов карбоксиметилаубазидана// Ж. Общ. Химии.1992.-Т.62,-№ 8,-С. 1869-1877.

31. Иозеп A.A., Бессонова Н.К., Пассет Б.В. Синтезкарбоксиэтилдекстрана// Ж. Прикл. Хим.-1998,- Т.71,- № 2,- С.320.322.

32. Трушина М.Н., Хомяков К.П., Вирник А.Д. и др. Исследование радиозащитного действия полимерной соли цистамина и сульфопропилового эфира декстрана// Вопр. Мед. Химии.-1970,- Т. 16.-С.195.

33. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов вбиологических мембранах,- М.: Наука, 1972.- 272с.

34. Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине/А.Н.Ерин,

35. В.И.Скрыпин, JI.JI. Прилипко и др.-Рига.: Зинатне, 1988,-176с.

36. Свободные радикалы в живых системах. Сер. Биофизика. Итогинауки и техники/М.: ВИНИИТИ, 1991,- Т.29.-С.252.

37. Скулачев В. П. О биохимических механизмах эволюции и роликислорода// Биохимия.-1998,- Т.6.- N11.- С. 1570-1579.

38. Чудинова В.В., Алексеев С.Н. и др. Перекисное окисление липидови механизм антиоксидантного действия витамина Е//Биоорг.химия,- 1994.-Т.20,- N10,- С. 1029.

39. Эмануэль Н.М., Заиков Г.Е., Крицман В.А. Цепные реакции,- М.: Наука, 1989,- 335с.

40. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и ратологии /Труды Моск. общества испытателей природы.- Т.LVII.-отдел биологический,- М.: Наука, 1982.- 240с.

41. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты// Успехи химии.-1985.-Т.54,-N9.-C. 1540-1558.

42. Перикисное окисление и стресс/В.А. Барабой и др.-СПб.:Наука, 1992,- 148с.

43. Фенольные соединения и их биологические функции/- М.: Наука, 1968,- 348с.

44. Парфенов Э.А., Смирнов Л.Д. Успехи и перспективы создания лекарственных препаратов на основе аскорбиновой кислоты// Хим,-фарм. ж.-1992.-Т.26,-N9-10,- С.4-17.

45. Дончеико Г.В. Биохимия убихиноиа (Q), -Киев: Наукова думка, 1988.-240 с.

46. Материалы всесоюзных конференций "Биоантиоксидант". -1983, 1986, 1989-М.

47. Физико-химические основы применения фенольных соединений в химии и биологии/ Эмануэль Н.М. Фенольные соединения и их биологические функции. -М., Наука, 1968. -274с. Материалы международных конф. «Биоантиоксидант». —1993, 1998. -М.

48. Пути синтеза и изыскания противоопухолевых препаратов/ -М, Медгиз, под ред. А.Я. Берлина.-1962. -105с.

49. Биохимические и физико-химические основы биологического действия радиации/ Бурлакова Е.Б., Дзантиев Б.Г., Сергеев Г.Б., Эмануэль Н.М. -М.: МГУ,- 1957. -Юс.

50. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте/ Бурлакова Е.Б., Алексеенко А.Б., Молочкина E.H. и др. -М.: Наука, 1975.-214с.

51. Хохлов А.И., Ярыгин К.Н., Бурлакова Е.Б. Синтетические фенольные антиоксиданты полифункциональные модуляторы биологических мембран// Биол. мембраны. -1989. -Т.6. -N2. -С. 133142.

52. Дурнев А.Д., Середин С.Б. Антиоксиданты как средства защиты генетического аппарата// Хим-фарм. ж. -1990. -N2. -С.92-99.

53. EipmoB В.В., Никифоров Г.Л., Володькин А.А. Пространственнозатрудненные фенолы. М, Химия.- 1972,- 352с.

54. Davies D, Goldsmith Н, Gupta A, Lester G.// J. Chem. Soc.-1965.p.4926

55. Scott G. Atmospheric oxidation and antioxidants, Amsterdam-London-New York, 1965,- 265p.

56. АС СССР, N 1376511, 1995, Б. И. №29

57. АС СССР, N 891702, 1981, Б.И. N47

58. Домнина Н.С., Комарова Е.А., Арефьев Д.В., Назарова О.В. и др. Антиокислительные свойства полимерных пространственно-затрудненных фенолов на основе сополимеров N-винилпирролидона// Высокомол. соед. -1997. -Т.70. 6. -С. 10221026

59. Александрова В.А., Котлярова Е.Б, Один А. П. и др Антимутагенная активность тройных сополимеров диаллильногоряда.//Радиационная биология. Радиоэкология.-1995,- Т.35.- N5,-С. 746-751

60. Alexandra va V.A., Ryzhkov D.V, Obukhova G. V. et al Macrotnolecular design of cationic polyelectrolytes on the chitosan basis for achievinent of high antimutagenic efficiency at gamma-irradiation.// Macromol. Symp. -1998. -V. 130. -P. 1-17

61. Гурвич Я. И. Арзаманова И.Г, Заиков Г.Е. Экспериментальные методы оценки эффективности стабилизаторов.// Хим. физика.-1996,-Т. 15,-N 1-С. 54-71.

62. Эмануэль Н.М., Бучаченко А.А. Химическая физика старения и стабилизации полимеров. М, Химия- 1982,- 359с. Цепалов В.Ф., Харитонов В.В., Гладышев Г.П., Эмануэль Н.М.//Кинетика и катализ,-1977-Т18-С. 1261.

63. Шляпников Ю.А., Кирюшкин Г.А., Марьин А.П., Антиокислительная стабилизация полимеров. М, Химия -1986.-252с,

64. Гладышев Г.П., Цепалов В.Ф. Тестирование химических соединений как стабилизаторов полимерных материалов// Успехи химии —1975. -Т. 44. -вып 10.-С. 1830-1850

65. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов./ Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников JIM. и др.- М.: Наука, 1966. -121с.

66. Фархутдинов P.P., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине-Уфа, 1996.-104с.

67. Hovard L.A, Furimsky Е. Arrenius parainetres for reaction of tert-butylperoxy radicals with some hindered phenols and aromatic amines// Canad. J. Chem. -1973- Vol. 51 -p. 3738

68. Тавадян Л.А., Мардоян В.А., Налбандян А.Б. Изучение методом электронного парамагнитного резонанса реакционной способности третичных бутильных перекисных радикалов в жидкой фазе //Докл. АН СССР -1981. -Т.259. -N 5. -С. 1143-1147

69. Bennet J.Е., Brunton J., Forrester A.R.,Fullerton J.D. Reactivity and structure of N-phenylnaphth -1-ylamines and related compounds. Part 1. Reactions with alkylperoxyl radicals// J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. -1983-p. 1477-1480.

70. Westfahe J. S., Carman C.J., Layer R.W. Electron spin resonance study of phenolic antioxidants. Correlation of organic free radical stability with antioxidant activity// Rub. Chem. & Technol.-1972.-V.45. -p. 402408

71. Походенко В.Д. Феноксильные радикалы. -Киев.: Наук, думка, 1969.-124с.

72. Походенко В.Д., Белодед А.А., Кошечко В.Г. Окислительно-восстановительные реакции свободных радикалов. -Киев.: Наук, думка, 1977. -92 с.

73. Бродский А.И., Походенко В.Д., Хижный В.А., Калибабчук Н.Н. О механизме превращения пара-алкил -ди-орто-трет. бутилфеноксильных радикалов// Докл. АН СССР. -1966.-Т. 1.69.-С.339-345

74. Походенко В.Д., Калибабчук Н.Н. Радикальные реакции 2,6-дитрет.бутил-4-СН2К-фенолов// Ж.Орг.Химии.-1969,- Т. 5, вып. 8. -С. 1413-1418

75. Cook C.D., Norcross С.В. Oxidation of hindered phenols. VII. Solvent effects on the disproportionation of certain phenoxy radicals// J. Amer. Chem Soc. -1959. -V. 81. -p. 1176-1180

76. Розанцев Э.Г., Шолле В.Д. Органическая химия свободных радикалов. М, Химия,- 1979,- 344 с.

77. Bowry V. W., Ingold K. U. Extraordinary kinetic behavior of the a-tocopheroxyl (vitamin E) radicals//. Org. Chem. 1995.- V.60.-P. 54565467

78. Арзаманова И.Г., Логвиненко P.M., Гуревич Я.А. и др. Влияние пара-заместителей на реакционную способность бифенолов// ЖФХ —-1973. -Т.47. -С.707-708

79. Арзаманова И.Г., Найман М.И., Гуревич Я.А. и др. Реакционная способность и строение 4,4'-метиленбисфенолов// ЖФХ. -1979. -Т. 53. -Вып.4-С. 1007-1009

80. Никифоров Г.А., Дюмаев K.M., Володькин A.A., Ершов В.В. Ингибиторы свободнорадикальных реакций// Изв. АН СССР, сер. хим.-1962. -N10,- С. 1836-1842

81. Володькин A.A., Портных Н.В., Ершов В.В. Восстановление алкил-(4-окси-3,5-дитрет.бутилфенил)кетонов боргидридом натрия// Изв. АН СССР, сер. хим.- 1968.- N2,- С.220-222

82. Ершов В.В., Пиотровский К.Б, Тупикина H.A. и др. Синтез иингибирующая активность функциональных производных 2,6дитрет.бутилфенола// Изв. АН СССР, сер. хим. -1976. -N5.- С. Г1177 ßО

83. Володькин A.A., Никифоров Г.А. 2,6-дитретг еАорганическом синтезе стабилизаторов для ;

84. Химикаты для полимерных материалск

85. Органикум: практикум по орг. химии/ Г.Беккер, В. Бергер, Г Домшке и др. пер. с нем.- М.: Мир, 1979,- Т.2

86. Яновская JT. А., Юфит С.С., Кучеров В.Ф. Химия ацеталей.- М.: Наука.-1975.-275 с.

87. Бурмистров С.О., Опарина Т.И., Прокопенко В.М., Арутюнян А.В. Антиоксидантная активность сыворотки крови: Сравнение разных методов определения// Клин. лаб. диагностика. -1997,- N11.- С. 1417

88. Днепровский А.С. Темникова Т. И., Теоретические основы органической химии JI, Химия,- 1979,- 520 с.

89. Grunvald E.,Winstein S. The correlation of solvolysis rates //J.Am. Chem. Soc. -1948. -V.70. -P.846.

90. Yasushi M., Noriaki Т., Hiromi K. Raman spectroscopic study of water in aqueous polymer solutions //J. Phys. Cliem. -1993,- V.97. -P. 1390313906

91. Terada T, Maeda Y, Kitano H. Raman spectroscopic study on water in polymer gels. //J.Pliys. Chem. -1993. -V.97. -P.3619-3622. de Gennes, P.G. In scaling concepts in polymer physics; Cornell University Press: Ithaca.- 1979

92. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии. М, Мир,- 1991.- 763с.

93. Cook С., Gilmav N. Oxidation of hindered phenols. Effect of 4-substituents upon the behavior of 2,6-di-t-butylphenoxy radicals // J. Org. Chem. -1960. -V.25. -P. 1429.

94. Cannon R.D. Electron transfer reactions, L.-Boston.- 1980 ,-125p Тодрес 3. В. Ион-радикалы в органическом синтезе М.- 1986. -231с.