Мембранный иммуносенсор для анализа белков и вирусов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

РГ5 0Д

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ АНАЛИТИЧЕСКОГО ПРИБОРОСТРОЕНИЯ

На правах рукописи УДК 537.533.3

ТЕРОВСКИЙ Владимир Борисович МЕМБРАННЫЙ ИММУНОСЕНСОР ДЛЯ АНАЛИЗА БЕЛКОВ И

ВИРУСОВ

Специальность 01.04.01 - Техника физического эксперимента, физика приборов, автоматизация физических исследований

I

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санкт-Петербург - 1993 г.

Работа выполнена в лаборатория биофизических методов исследований Института аналитического приборостроения РАН

Работа выполнена без научного руководителя

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук

A.Н.Черкасов,

кандидат биологич: сгззх наук

B.Н.П1елзгедин

Вадуиая организация - Институт ядерной физики РАН

Защита состоится ^^ 1993 г. в {/_ часов на заседании

специализированного Совета К.003.53.01 при Институте аналитического приборостроения РАН по адресу: 198103. С-Пэгербург, Рижский пр., д.26.

С диссертацией ¡можно ознакомиться в библиотеке ИАД.

Автореферат разослан___ 1993 т.

Учаннй саЕрагарь специализированного Совета, кандидат физико-математических наук

А.Г.Каыанев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акт^альность_пвобле|та. В настоящее время в аналитической химии большое распространение получило направленна, связанное с разработкой и применением биосенсоров - устройств, сочетающих' высокую специфичность биологических реакций с простотой и оперативность» электрохимических, оптических и других методов. Основные области, где они успешно используются - контроль состояния окружающей среды, клинический анализ, контроль биотехнологических процессов. Сочетание широкого и быстро растущего рынка сбыта и важности решаемых социальных задач (особенно для нашей страны, где подобное оборудование практически не выпускается) определяет актуальность задач, связанных с разработкой биосенсоров.

Одной из наиболее перспективных областей применения биосснсо-ров является иммунный анализ. Особый интерес представляет иммуно-потенциометрический (ИГО метод, в основа которого лежит регистрация изменений потенциала, происходящих в. результате гетерогенной реакции образования иммунного комплекса.' Он характеризуется простотой, оперативностью, отсутствием метки, возможностью использования в проточных системах и создания автоматических устройств. Возможно также применение этого метода для изучения взаимодействия между антигенами (АГ> и антителами (АТ) на границе твердой фазы.

Недостатками ИП метода, препятствующими его внедрению в практику, являются большой разброс характеристик иммуноэлектродов (ГО) и относительно низкая (по сравнению, например, с иммуно^ерментным анализом) чувствительность.

ШяИ_И_ззшчи_исслеао§ания. Целью настоящей работы являлась разработка систематического подхода к проблеме повышения воспроизводимости изготовления ГО и расширение области применения ИП метода, как за счет новых объектов анализа (кнтактных вирусов), так и путем увеличения концентрационной чувствительности. Основными задачами исследований были.-

определение основных параметров, оказывающих влияние на величину отклика ГО и его кинетические характеристики и построение соответствующих математических моделей;

изучение возможностей приборной реализации ИП метода и оптимизации его характеристик;

разработка ИП мембранных ГО для определения широкого круга объектов - в частности, белков и интзктных вирусов.

Б§£НИ§я_новизна. В работе получены следующие новые научные результаты:

показана возможность определения Ш методом интактных вирусов (на примере вируса гриппа);

обнаружен эффект повышения чувствительности аналитических мембранных устройств при создании перепада давления на измерительной мембране за счет удаления части растворителя и увеличении вследствие этого локальной концентрации определяемого вещества вблизи мембраны;

путем анализа предложенной математической модели кинетики отклика ГО и сравнения ее выводов с экспериментальными результатами показано, что измерения в разработанной проточной ячейке могут проводиться в кинетическом режима;

построена математическая модель отклика Ю с пористой мембраной и предложен алгоритм оптимизации условий измерения с учетом выводов построенной подели;

разработан неразрушаощий метод спектрофотометрического определения связанного с мембраной белка.

ШХНЦЭЯ^_1Шактцческая_значимость. На основе эф£екта повышения чувствительности ИЭ при частичной ультрафильтращш пробы разработан запущенный авторским свидетельством на изобретение способ' определения белков и вирусных частиц, реализованный в макете имму-нопотенциометра с проточной ячейкой. Он характеризуется возможностью специфического обнарух<ения вируса гриппа в концентрации до 10® частиц^мл со временем измерения порядка нескольких минут. Применение ГО для определения интактных вирусов, показывает, что имму-нопотенциометрия может явиться универсальным методом быстрого обнаружения широкого спектра антигенов.

ЛШ20бация_работи. Результаты, вошедшие в диссертацию, докладывались на симпозиума "Инструментальные катоды исследования в физиологии и биохимии" (Ленинград, 1985) и Всесоюзной конференции "Состояние и развитие мембранной техники" (Дивноморск, 1989). По тема диссертации опубликовано 6 печатных работ, получено одно авторское свидетельство СССР.

5ХЕХК1ХШ.И_ебьем_0}1СС22тации. Диссертация состоит из введения, ? раэдалов, заключения и приложений. ШЕёУЗ.Езэаел содораит обзор литературы по истории развития и современному состоянию ИП »»топа, обоснование выбора направления к задачи исследований. Краткое ОПЛСЗНИв ПЦШ'ЙНЯВЕИХСЯ МОТОШК И ЭКСГЮрИгамТЧГ.ЬНЫУ УСТПН0Р1Г.

приведено во_втоЕОИ_ЕЗэделе. Здесь же проводится сравнительное. рассмотрение результатов, полученных при определении Еируса гриппа е различных электродных ячейках. В_третьсн_В-33£елд на основа простейшей математической модели гетерогенной реакции образования иммунного комплекса проведен анализ кинетики КЭ и из сопоставления с экспериментальными данными сделан вывод о том, что процесс в проточной _ электродной ячейке проходит в кинетическом режима. §_2§1§§В1°М-Е§Э5§5§ описывается влияние частичной ультрафильтрации пробы на отклик ГО и применение обнаруженного эффекта в прото--чных электродных ячейках. Пя1УЙ_Ваздел посвящен рассмотрению отклика ИЭ с термодинамической точки зрения. На основе построенной в этом разделе математической модели предложен алгоритм оптимизации параметров (условий) измерения. Для контроля одного из таких пара-мэтров - количества иммобилизованных АТ - был разработан спектро-<$отометрический метод определения связанного с мембраной белка, описанный в_иесгом_ваз£еле диссертации. В_седьмон_разделе приведены сведения об АГ, определявшихся ИИ методом, и обсуждаются факторы, влияющиэ на характеристики ГО, а также возможности развития метода.

Диссертационная работа изложена на 101 странице машинописного текста, иллюстрирована 27" рисунками и И таблицами, список литературы содержит 57 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая схема установки для ИП измерений приведена на рис.1. Она состоит из электродной ячейки, содержащей индикаторный (имиу-ночувствительныЯ) электрод (ГО) я сравнительный электрод (СЭ), и регистрирующего прибора. Для регистрации сигнала использовались самопишущий потенциометр ЖС-4-003 или двухкоординатный самописец ЕпсИт 620.02 (ГДР). Для согласования выходного сопротивления электродной ячейки со входом самописца применялся усилитель постоянного тока У5-9. ГО и СЭ содержат внутренний хлорсеребряный электрод и мембрану (использовались два одинаковых мембраны: ультра$ильтра-ционныа, типа "Влашшор", из ацетата целлюлозы). С мои5раноП ГО были связаны АТ к определяемому штамму вируса гриппа. И измерительная и электродные камеры заполнялись раствором электролита энного и того га состава Ошда всего этз бил 0,05 И натрнй-|ос}чтниз

буфер рн=7,4, с 0,15 М НасI). Были разработаны несколько конструкций электродных ячеек, которые различались, в основной, способом введения пробы и наличием или отсутствием принудительного перемешивания в измерительной камере. Лучшие результаты были получены при использовании проточной электродной ячейки, конструкция которой представлена на рис.2.*

На рис.3 приведены примеры отклика ИЭ в проточной ячейке на введение растворов, содержащих вирус гриппа в различных концентрациях, полученных разведением инактивированной гриппозной вакцины (титр РГА - 1:4096, содержание гемагглгаинина-27 ккг/мл). Специфичность отклика ИЭ подтверждалась отсутствием реакции на введение альбумина (10 мг^нл) и иммуноглобулина (общий ¡ев человека, НИИЭМ им. Пастера). ИЭ не реагировал также на введение вируса гриппа другого штамма.

Рис.1.Схема установки для ИП измерений. 1-измерительная камера; 2-иммуночувствительная мембрана; 3-электродная камера .ГО; 4,5-внутренний электрод (лд/АдС1); б-регистрируг>щий прибор; 7-элактро-дная камера СЭ-. 8-сравнительная мембрана.

Название "проточная ячейка" здесь характеризует скорее не реши измерения (хотя она и может использожатся в проточном режиме), а способ введения пробы путем вытеснения предыдущего раствора из измерительной камеры.

Реакция между АГ и АТ в нормальных условиях является практически необратимой из-за очень низких значений константы скорости диссоциации комплекса. Поэтому при насыщении всех связывающих центров на поверхности мембраны ИЭ перестает реагировать на дальнейшее увеличение концентрации АГ в измерительной камере. В этом случае мембрана может быть регенерирована в условиях, способствующих диссоциации комплекса, например, в растворе с низким значением ри.

Как видно из рис.3, величина отклика ИЗ в проточной электродной ячейке не зависит тренний электрод САд/АдС1); от концентрации вируса (при 5-выход пробы; 7-внутренняя достаточно высоком ее значе-камара СЭ; 8-сравнительная нии), а скорость изменения мембрана, 9-вхоя пробы; 10- потенциала является функцией отверстия для заполнения этой концентрации. Насыщение электродных камер. происходит, по-ьидимому, при

заполнении всех активных сайтов на мембране. Но, когда концентрация АГ достаточно низка, насыщения мембраны не происходит и она сохраняет свою чувствительность (рис.36). В описываемых экспериментах насыщающая концентрация вирусных частиц лажала в пределах между разведениями 1:10* и 1:10е* исходной вакцины. Концентрационная чувствительность ИЭ при измерениях в проточной ячейка оказалась очень высокой: как видно из рис.36, в некоторых случаях удается зарегистрировать отклик на разведение исходной вакцины в 10* раз. (Если оценить содержание вируса в вакцине в 10и, то при этом измеряемой количество вируса составляет Ю'-Ю"1 частии).

Ч 3

Рис.2.Конструкция проточной электродной ячейки. 1-измерительная камера; 2-иммуночув-ствительная мембрана; 3-вну-тренняя камера ГО; 4,6-вну-

/ Рис.3. Отклик иммуноэлектрода в проточной ячейка, а) "насыщающая" концентрация вируса. Концентрация вируса (разведение исходной вакцины): 1 - 1:10я; 2 - 1:10е. Кривая 2 получена после регенерации мембраны, б) "ненасыщающая" концентрация вируса. Концентрация вируса (разведение исходной вакцины): 1 - 1:10°; 2-1:107; 3 - 1:10е. Кривые получены на одной мембране (баз регенерации) в указанном порядке. Стрелками отмечены моменты введения пробы.

2. Кинетика_отклика_Ю.

Реакция образования иммунного комплекса в раствора может быть записана в виде:

к

А + В —Ь. АВ

гдз А - антитело, В - антиген, АВ - иммунный комплекс, и к - соответственно'константы образования и диссоциации комплекса. В случае гетерогенной раакши, когда АТ иммобилизованы на поверхности мембраны, а АГ находится в раствора, вместо концентрации Ш необходимо рассматривать концентрацию активных сайтов [а Тогда скорость реакции образования комплекса определяется выражением:

где [в] и Га"в] - соответственно, концентрации активных

сайтов на мембране, АГ в растворе вблизи мембраны и иммунного ком-

плакса. Процесс диффузии АГ к мембране описывается уравнением: ,[В] ,[В]

- = О —— , (2.2)

а о хг

где Э - коэ$$ишент диффузии свободного компонента в раствора и -расстояние до поверхности мембраны. Начальное и граничные условия этого уравнения имеют вид:

М

В„ ПРИ 1=0;

•И

= 0 при х > <1;

Ох

«В

•И

х=0

ах

-.[в] х [И - Н) ♦ .фЪ],

х=0 х=0

где с1 - расстояние до сравнительной мембраны, [а*В^ - решение уравнения (2.1) с начальным условием ■ 0 при 1,в0> Рассмат-

ривались два предельных случая уравнения (2.2): а) бесконечно быстрой химической реакции и б) медленной химической реакции.

а) В случга бесконечно быстрой химической реакции ( ^ ™ о при к=о, ь>о) скорость образования комплекса определяется потоком растворенного компонента к плоскости мембраны:

"В

¿я

В„0

х*=0

г!

г»=0

(2п+1)2Л20 4?

а его концентрация на поверхности мембраны во время I равна:

I _

[А"В1 - Г N.¿1 - —В0 ) --

I ] 3 ■ л2 (2п+1>

1 -

(2п+1Г7ГО

п=0

Максимальная скорость диффузионного процесса в момент 1-0: «э[А*в] 2Вп0

n.

при

9\.

б) В случае, когда скорость реакции образования комплекса

О

значительно ниже скорости диффузионного процесса, концентрация и скорость образования комплекса на мембране равны:

г -1 «Г "И .

[А В] - А" 1 - в и - - мХое

I- •> С»

с! [ЛИВ]

<н

где А* " концентрация активных сайтпг. на мембране при ^о. (Индекс • показывает, что в данном случае .'-¡чь идет о поверхностной концентрации). Скорость максимальна в начальный момент времени:

/ • Из сравнения выражений для скорости можно

вывести критерий определения лимитирующей стадии процесса в нача-

* О

льный момент времени. Если к.А„В80 > 2 - во , то в рассматриваемой

с1

системе имеет насто диффузионный режим, а если неравенство имеет обратный знак - кинетический. Признаком того, что реакция идет под диффузионным контролем, также может быть постоянство величины

РИ

! : (Т^ В]| ] при разных концентрациях растворен-(¡ь 1=0) |1-» а>]

ного компонента .Это отношение в диффузионном режиме вообще не зависит от концентрации свободного компонента, а зависит только от параметра а и от коэффициента диффузии. Применение описанных критериев к экспериментальным результатам позволяет сделать вывод о гон, чМ 6 проточной электродной ячейке достигается кинетический рож&М, с 1:0 время как в непроточных ячейках лимитирующей стадией явкэгей ййффузйя АГ в раствора.

Ьисокая концентрационная чувствительность ИЭ в ячейке проточного типа объясняется двумя отличительными особенностями процесса измаран

1) способом введения пробы, связанным с полной заменой раствора е изг-арительноП камере, при котором концентрация вируса в начальный некзнт врамвни одинакова во всей >:аиаре и отсутствует не содарк&зий сируса слой около меибраны;

2) исыезШин давлением« возникающим при введет'.!! пробы в иэ-№ритдяь<№1> кзтру, которое приводит к ультрафильтрами (УФ) чорзз I«.•.(«г-рпну - уйжляип некоторого обшм р.-.стг.тигпля и локальному

о

О ° о0 0 о О ,

о

о

О': о

о

р<

6=6,

в

увеличение концентрации определяемого вещества вблизи мембраны (Рис.4). Насколько нам известно, это первое (и пока единственное) описание использования УФ непосредственно в процесса измерения для повышения чувствительности аналитических приборов. Для непосредственной оценки влияния УФ на отклик ГО необходимо сравнить результаты, полученные в условиях', различающихся только величиной перепада давления на мембране. С этой цель» была использована комбинированная электродная ячейка, которая позволяет проводить измерения как в обычном режиме, так и в режиме УФ. На рис.5 представлены последовательно полученные на одной мембране результаты введения в комбинированную электродную ячейку пробы с одинаковой концентрацией АГ в обычном режима (1) и в режиме УФ (2). Из сравнения кривых видно, что УФ повышает величину отклика ИЭ и крутизну переднего фронта, а также уменьшает время задержки. 3|.1>ект УЗ, как это видно из рис.4, эквивалентен повышенно концентрации АГ в пробе во.

Описанное в этом раздела использование змекта УФ для повышения чувствительности мембранных электродов, по-видииому, коааэг найти достаточно влрокоа прменеш» и в отношении других объектов химического гматза. Бели ¡аз искусственно у по/п 1ч ит ь гремя существования парозлда давлений на макбра-нэ или пропускать через ультрзмльтрзтюннув электродную ячейку больше обшш анлкостеИ (няиршсэр, природных или сгочтк г^д), го

Рис.4. Увеличение локально й концентрации вещества вблизи мембраны в результата УФ. 1-электродная камера; 2 -измерительная камера; 3-мемб-рана; Р1|Р1- давленйе, Р4<Рг; О- вирус; о - молекула растворителя; (стража показывает направление потока растворителя); в-концантрация вируса <во-шшентрация в пробе); «-расстояние от мембраны.

можно рассчитывать добиться очень высокой чувствительности, ограниченной только величиной дрейфа потенциала электрода.

Рис.5. Влияние УФ на отклик Ю. Отклик ГО на введение гриппозной вакцины в разведении 1:10s: 1 - без УФ, 2-е УФ. Кривые 1 и 2 получены последовательно на одной мембране (без регенерации).

4^М0|ВДЬ_о1к®ка_ГО_с_повистой_меибЕан6й.

Ключевой проблемой в развитии ИП метода является повышенно воспроизводимости характеристик ГО. Для ее решения требуется систематический анализ факторов, определяющих отклик ГО, в число которых входят ионный состав и рн среды, электрохимические свойства мембран (электродов), компонентов иммуноспецифической реакции и т.д. Такой анализ может бнгь проведен исходя из математической модэли отклика ИЭ с пористой мембраной, содержащей фиксированные электрические заряды. Согласно положениям так называемой теории BSC (Теорзлла-Мейера-Сиверса) мембранный потенциал представляет собой сумму двух поверхностных потенциалов (потенциалов Доннана), возникающих за счет распределания зарядов в примембранном слое раствора, и диффузионного потенциала, • возникающего между двумя прикамбраиными слоями электролита (Рис.6):

Сур - - ¿4>di *■ ■ * дФи

Схема образования потенциала в ИП ячейке с двумя мембранами приведена на рис.?. Разность потенциалов в такой системе может быть представлена Ь виде:

д* - - * ьФвг - ¿*Di * ♦ дФиг

Рис.в. Схема образования мзмбранного потенциала 1 - электролит 1; 2 - электролит 2; 3 - мембрана; &Фа , -поверхностный погеншал; а^,. - диффузионный потенциал.

Рис.7. Схема образования потенциала ИЭ. 1,5 - электродный камеры; 2-мэмбрала с АТ; 3 - измерительная 1самера; 4 -сравнительная мембрана (др. обозначения см. на рис.6).

Окончательное выражение для ьф, с учетом равзнства концентраций электролита в электродных камерах и предположения о равенства плотности зарядов на немодифицироваявых сторонах мембран ва« о ), имеет вид:

Ьф - £

РТ

4. /в' *

1п~

* т/е"Т

4с т |9

о 1 I

- +К-1Г.-Г—

А

4с

+ -/<Эг *

4с' 1 1

-г |6> I + У в* +

4с"

+ т 1г»-о

-т Э

О 1 1 1

+ /в1 ♦ 4с1

где г.

и - и

к п

и - и

к п

Iе,I - 1011 + тв

/в* +■ 4сг - /е*Т

4с"

/вг + 4с1 + у/©1 + 4с1 + г

1 1

: + "с1 + то[|0г1 - Iе, |)

с4 и с - концентрации электролита соответственно в электродных и измерительной камерах; в± и £>г - плотности поверхностного заряда соответственно на немодифицированной и модифицированной АТ сторонах мембраны; ик и ип ~ подвижности ионов электролита в мембрана (к - коион, п - противоион). Образование на поверхности мембраны комплекса АГ-АТ приводит к изменению поверхностной плотности заряда о. Заменив в формуле &2 на новое значение о", получим новое значение мембранного потенциала дФ**, Отклик ГО представляет собой разность конечного и начального значений потенциала: V = ьф™ -На рис.8-11 приведены теоретические зависимости величины отклика ГО от параметров системы, рассчитанные по указанным формулам.

На основе анализа модели ГО предлагается примерный алгоритм оптимизации режима измерения. ■

1. Определение параметров £>1, то из зависимости мембранного потенциала от концентрации.электролита. При этом определяется как функция от количества иммобилизованных АТ,

2. Выбор оптимальной концентрации электролита (рис.8).

3. Выбор оптимальной концентрации иммобилизованных АТ (рис.9).

Рис.8. Влияние концентрации электролита на отклик ЙЭ. at(M): 0,001(1-5); 0,01(6,7); ех(Ю: 0,001(1-3); 0,0001(4-7); е"(И): 0,1(1-4); ,0,01(5-7); ro¡ -0,2(1); 0(2); -0,2(3-5); 0,4(6); -0,4(7).

Рис.9. Зависимость отклика ИЭ от плотности поверхностного заряда сравнительной мембраны. тоО,2; с(М): 0,001(1 -4); 0,01(5-7); М): 0,0001 (2-5,7); 0,001(1-6); в"( Н); 0,01(1,3); 0,001(2,7); О, 1(4-6).

Рис.10.Зависимости отклика ИЭ от изменения плотности поверхностного заряда мембраныС,"калибровочные кривые").

а) фе,; то-0,2; с(М): 0,001(1-5,7); 0,01(6);

0(М): 0,01(1,4); 0,001(2,3,5-7); 02<М): 0.0001(1,7); 0,001С 2, 4,6); 0,01(3); 0,1(5).

б) в"<Ог; го*0,2; с(М): 0,001(1-4,8,7); 0,01(5);

в(Ю: 0,0001(1); 0,001(2); 0,01(3-7); е2(М): 0,01(1,3); 0,1(2,5,6); 0,001(4); 0,0001(7).

Рис.11.Зависимость отклика ИЭ от плотности (исходной) поверхностного заряда рабочей мембраны.

а) e">e2i то-0,2; с(М): 0,001(1-3); 0,1(4-6); 0,01(7-9); е^М): 0,01(1,6,9); 0,0001(2,4,7); 0,1(3,5,8);

б) в*<вг; 1д(е"/ег1— 0,8; ^„-0,2; сСМ): 0,001(1-4); 0,01(5, 6); et(H): 0,01(1,6); 0,1(2); 0,0001(3,5); 0,001(4).

§!.!Йнтвдль_!содачесхва_СБязанного_с_н^

Одним из основных факторов, определяющих характеристики ИЭ и их воспроизводимость, является количество иммобилизованных на мембране AT. Причем, если кинетические параметры отклика ГО определяется концентрацией активных AT, то величина отклика зависит от плотности заряда на поверхности, т.е., от общего количества связанного с мембраной белка, безотносительно к его активности. В настоящей работе предложен быстрый неразрушающий метод определения общего количества белка на мембране, основанный на регистрации спектров поглощения. Все измерения проводились на спектрофотометра "Specord шо" (ГЛР>. На рис. 12 приведен дифференциальный спектр поглощения двух чистых мембран и спектры мембран, содержащих разное количество иммуноглобулина, относительно чистой мембраны. Количество белка определяется по высоте появляющегося в спектре поглощения мембраны пика в области 280 нм. Для вычисления высоты

пика пользовались формулой: ДЕ - ECK э

ЕС X +ДХЭ + ЕСХ -ДХ5 о о

где е - поглощение, хо - длина волны, соответствующая положению максимума пика. При вычислении по этой формуле участок кривой поглощения в области пика аппроксимируется отрезком прямой.

Описанный метод позволяет проследить динамику десорбции балка с мембраны в процессе измерений, промывки, регенерации и хранения. Так было показано, что ейнжение величина отклика КЭ при последова-

£

0,015 \

OßlO \

С, 005 1 1 1

и МО 2Z0 320

а) Я, им

£ 0JH5 У

о,т -1\ //2\\

0,605 У/Ж

0 5) I 1

ш 2S0 320 j), им

Рис.12. Поглощение мембран УАМ-200.

а) дифференциальный спектр двух "чистых" мембран;

б) спектры намбран с ИГ. Сорбция в течение 16 часов из раство-. ров балка с концентрацией: 1-1,6 ю>нл; 2-1,2 мг-'мл; 3-0,8 нг^мл.

тельных рагенерзшях связано скорее с десорбцией АТ с мембраны, чем с их инактивацией.

5акхо2ы1_определящив_ха2аетеристики_ГО1._и §отимизации_мето2а.

Сведения о результатах применения описанных ИЗ к различным системам АГ-АТ собраны в таблице:

АГ, определявшиеся Ш методом. Таблица.

Исходный препарат ¡Максимальная

Антиген

антител чувствительность

Гриппозная вакцина t¿o из сыворотки Разведение

(штамм Nib-4), петуха исходной вакцины

(титр РГА - 1:4098) 1: 10®

Озальбумин ¡ge из кроличьей Ю-7 г/мл

сыворотки

Вирус табачной Иммунная сыворотка Разведение кон-

мозаики (концентрат) кролика центрата 1:10*

Лифтерийный АТ, очищенные аффин- 10"а г/мл

анатоксин ной хроматографией

Стафиллококковый АТ, очищенные аффин- 10"" г/мл |

анатоксин ной хроматографией

Гриппозная дивакцина АТ (моноклонэльные) Разведение

A-'Khgb; А/Ленинград, к мя-белку вируса исходной вакцины

(титр РГА - 1:102-4) гриппа 1:10®

Кон не; ¡г ?аты вируса: АТ (моноклонау;ышо) РлзйЯДвШШ кон-

А/Дгнкнгрзд 1024) ■С hC'ji componen t ц-эитрзта 1:10я

Г^'Ллнинграц (1: 2048) вируса гриппа

ЙНСУПИЧ *ИЧ гг,ИЧ1,И> АГ < ?«!!1жлснал! ütíU и:)'"3 с-пя

к инсулину ...............................

Величина отклика, а, следовательно, и концентрационная чувствительность ИЭ определяется рн и ионным составом среды, характеристиками используемых мембран, свойствами самих компонентов иммуноспа-цифической реакции и т.д. Кратко анализируется влияние этих факторов и возможности их варьирования для оптимизации характеристик метода. Дальнейшее развитие ИП метода несомненно требует более широких экспериментальных и теоретических разработок в области электрохимии мембран. Основной проблемой здесь является установление точного вида зависимости возникающего потенциала от непосредственного результата иммуноспеди^ической реакции - образования комплекса АГ-АТ.

ВЫВОДЫ

1. Показана возможность применения иммунопотенциомотрии для объектов различной природы, в том числе (впервые), - для интактных вирусов.

2. Обнаружен не описанный до настоящего времени эффект повышения чувствительности аналитических мембранных устройств при удалении части растворителя из пробы избыточным давлением и увеличении вследствие этого локальной концентрации определяемого вещества вблизи мембраны. Разработан защищенный авторским свидетельством способ определения белков и вирусных частиц на оснобо описанного эффекта.

3. Создан макет и мну и о по тем 1шо иат ра, пригодный для проведения ИП измерений в разных режимах - стационарном, проточном, ультрафильтрационном •

4. Построена математическая модель кинетики отклика КЗ и из сопоставления ез с экспериментальными результатами показало, что скорость-лимитирущей стадией является реакция образования комплекса АГ-АТ на поверхности мембраны.

5. Построена математическая модель отклика ИЭ с пористой мембраной, проведен анализ влияния на величину отклика параметров системы, предложен алгоритм оптимизации условий (параметров) измерения.

6. Разработан неразрушавдий метод спекгрофотометрического определения связанного с мембраной белка, применимый для контроля иммобилизации АТ на мембране.

Работы, опубликованные го темз диссертации.

f

1.Рейфман-Л.С. - руководитель темы, Нефедов П.П., Чачевичкин В.Н., Теровский В.Б., Евстрапов A.A., Матисен К.Л., Сизов А.Л., Куренко-ва И.М., Иумкова Л. В. Бшаналитические метода и приборы на принципах иммуноспецифических взаимодействий. - Закл. отчет по теш 0148, 127НИР-И, м гос. per. 0S41C0. - Л.: ЕЮ АН СССР, 1985, 153 с.

2.Теровский В.Б., Рейфман Л.С., Полякова Т.Н. Аналитический нэтод определения веществ на основа иммуноспецифических взаимодействий. - В кн.: Научное приборостроение. Л.: Наука, 1987, с. 19-22.

3.A.c. 1147153 (СССР). Способ определения концентрации белковых веществ или вирусных частиц ✓ Александров М.Л., Теровский В.Б., Рейфман Л. С., Полякова Т. И., Нефедов П. П., Крашение А. И., Носков Ф.С.

4.Теровский В. Б. Влияние концентрации электролита и плотности поверхностного заряда на потенциал иммуноэяектрода с пористой мембраной. - X.анал. химии, 1989, т.44, н 8, с.1447-1451.

5- Теровский В.Б. Модель отклика иммуноэлектрода с пористой мембраной. - Х.анал. химии, 1990, т. 45, к 9, с. 1815-1819.

6. Михайлова Т. А., Теровский В. Б. Сдектрофотометрическое определение связанного с мембраной белка. - Тез. докл. Всес. конф. "Состояние и развитие мембранной техники.", Дивноморск. 1989, - М., 1989, С.74.

7. Теровский В. Б., Михайлова Т. А. Сдектрофотометрическое определение связанного с мембраной белка. - Ред. к."Лаб.дело" - М., 1989, -Деп. в ВИНИТИ 4 мая 1989, м 2909-889.

8. Полякова Т. И., Теровский В. Б. Применение мембран в качестве чувствительного элемента' иммуноэлектродов. - Тез. докл. Всес. конф. "Состояние и развитие мембранной техники.Дивноморск, 1989, -М., 1939, С. 73.

СОИСКАТЕЛЬ:

ФАП э.133 т.80 24.08.93