Мессбауэровская спектроскопия гемоглобинов и железо-декстановых комплексов с различной молекулярной структурой. Биофизические и биомедицинские аспекты тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.14 ВАК РФ

УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРС^ЕТ

2 1 АЯГ Ш

МЕССБАУЭРОВСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ГЕМОГЛОБИНОВ И ЖЕЛЕЗО-ДЕКСТРАНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ С РАЗЛИЧНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРОЙ. БИОФИЗИЧЕСКИЕ И БИОМЕДИЦИНСКИЕ АСПЕКТЫ.

01.04.14 - Теплофизика и молекулярная физика 03.00.02 - Биофизика

На правах рукописи

Оштрах Михаил Иосифович

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Екатеринбург - 2000

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории прикладной биофизики кафедры "Физические методы и приборы контроля качества" физико-технического факультета Уральского государственного технического университета - УПИ.

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук, профессор

Селезнев В.Д. Доктор физико-математических наук, профессор

Шайтан К.В. Доктор физико-математических наук, профессор Овчинников В.В.

Ведущая организация: Институт химической физики РАН (г. Москва).

Защита состоится 16 июня 2000 г. в 15-00 часов на заседании специализированного совета Д 063.14.06 при Уральском государственном техническом университете - УПН (620002, Екатеринбург, УГТУ, ауд. И, главный учебный корпус).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уральского государственно»: технического университета.

Автореферат разослан 16 мая 2000 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор физико-математических наук А / Пилипенко Г.И.

М-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время одной из фундаментальных является проблема лекулярно - физических основ жизненных процессов. В данной проблеме одной из кнейших является задача выяснения механизмов функционирования различных ологических макромолекул на основе изучения их атомно-молекулярной структуры, лки - самые сложные из известных молекул. Они выполняют в организме различные нкции, например, ферментативные и транспортные, необходимые для обеспечения жизни, еди различных белков особое место занимают металлосодержащие белки, в частности, лезосодержащие. В этих белках ион металла может находиться в активном центре лекулы и обеспечивать ее функционирование либо выполнять пассивную роль, являясь ьектом транспортирования или депонирования. Наиболее яркими представителями этих ух групп железосодержащих белков являются гемоглобины и ферритины. Интерес к этим жам постоянно растет. Их исследуют специалисты различных областей науки. Такое имание к гемоглобину и ферритину не случайно. Гемоглобин осуществляет транспорт лекулярного кислорода в организме и моделирует ряд ферментативных свойств, условленных электрон-конформационным взаимодействием. Ферритин обеспечивает тсание железа в организме в нетоксичной форме, а ряд его моделей - железо-<страновых комплексов - оказались одними из наиболее эффективных препаратов для 1Сния железодефицитных анемий. Состояние ионов железа в обоих белках связано с их нкциональными свойствами. Поэтому выяснение связи состояния иона железа, пекулярной структуры и функции является чрезвычайно важным для понимания *анизмов функционирования белка.

Электронная структура железа может быть своеобразным индикатором каких-либо ленений в структуре белка. Поэтому мессбауэровская спектроскопия является одним из 1 более информативных методов изучения. Возможности метода в обнаружении малых 1енений электронной структуры железа позволяют получить уникальную информацию. ;сь открываются широкие перспективы использования как самой мессбауэровской жтроскопии, так и фундаментальных подходов к изучению структурно -функциональной имосвязи в биомолекулах не только в биофизических, но и в биомедицинских ледованиях. Поскольку связь изменений молекулярной структуры, состояния иона железа 1ессбауэровских параметров железосодержащих белков и их моделей еще недостаточно чена ввиду большой сложности проблемы, это направление представляет немалый -ерес.

Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению связи молекулярной структуры, состояния иона железа и мессбауэровских параметров железосодержащих биомолекул и их моделей применительно к биофизическим и биомедицинским задачам на примере исследования гемоглобинов и железо-декстрановых комплексов с различной молекулярной структурой.

Научная новизна. В работе впервые проведен комплекс исследований по изучению связи микроструктурных особенностей гемоглобинов и железо-дексграновых комплексов, физических параметров и биологических функций данных биомолекул. Основным методом исследования выбрана мессбауэровская спектроскопия, позволяющая с высокой точностью измерять параметры железосодержащих объектов, характеризующие электронную и магнитную структуру железа. Дополнительными методами исследования являются: квантово-химические теоретические оценки электронной структуры и мессбауэровских параметров, измерение сродства гемоглобина к кислороду и электрон-позитронная аннигиляция (методики измерения угловых корреляций аннигиляционного излучения и времени жизни позитронов). В частности, в работе впервые исследованы нормальные гемоглобины человека с различной молекулярной структурой, в том числе модифицированной; обнаружены отличия параметров мессбауэровских спектров у гемоглобинов с различной молекулярной структурой; исследована форма линий мессбауэровских спектров гемоглобина; впервые проведен учет неэквивалентности электронной структуры Ре(Н) в а-, |3- и у-субъединицах гемоглобинов; впервые проведеп; теоретическая оценка неэквивалентности электронной структуры Ре(11) и мессбауэровски; параметров для моделей а- и р-субьсдиниц в дезоксигемоглобине и для дезоксимиоглобина; предложена интерпретация особенностей мессбауэровских спектров оксигемоглобина ка» следствие различия молекулярной и электронной структур активных центров I неидентичных субъединицах белка; впервые исследованы гемоглобины больньп злокачественными заболеваниями системы крови, обнаружены отличия параметра мессбауэровских спектров здоровых и больных людей; выявлены отличия в молекулярной I электронной структурах и функциональных свойствах гемоглобинов больных лейкозами 1 эритремией; впервые проведено исследование действия у-излучения, электронов \ микроволнового нагрева на оксигемоглобин методами мессбауэровской спектроскопии 1 спектроскопии времени жизни позитронов; получены новые данные о структурны: изменениях оксигемоглобина при облучении; предложена схема процессов радиолиз; оксигемоглобина; впервые проведено комплексное исследование железо-декстрановы! комплексов методами мессбауэровской спектроскопии и аннигиляции позитронов

шаружены микроструктурные особенности в ряду жслезо-декстрановых комплексов, ¡падающих различным эффектом в организме.

Научная и практическая ценность. В работе развит подход к изучению методом ;ссбауэровской спектроскопии железосодержащих биомолекул и их моделей, требующий юта взаимосвязи малых отличий в структуре молекул и в электронной структуре ионов глеза. Полученные экспериментальные и теоретические результаты свидетельствуют о оможности использования такого подхода при интерпретации мессбауэровских спектров вличных гемоглобинов, ферритинов и их моделей, что позволяет получить новую [формацию об исследуемых объектах.

Автор защищает следующие группы результатов:

1. Результаты исследования нормальных фетального и взрослого гемоглобинов иювека, отличающихся молекулярной структурой и функциями, и нормального взрослого моглобина человека, модифицированного молекулярными эффекторами и путем юфильной сушки. Результаты проведенных квантово-химических расчетов для моделей зоксимиоглобина и субъединиц тетрамерного дезоксигемоглобина. Наличие взаимосвязи хсбауэровских параметров, электронной структуры железа и стереохимии активного :нтра в нормальных гемоглобинах человека с различной молекулярной структурой, связь обенностей мессбауэровских спектров гемоглобинов и их микроструктурных обенностей.

2. Результаты исследования гемоглобинов больных злокачественными заболеваниями стемы крови (лейкозами и эритремией). Полученные значения мессбауэровских [раметров, характеризующие трансформацию электронной структуры железа в :сигемоглобинах больных и небольшие структурные отличия в области активного центра, торые должны оказывать влияние на функциональные свойства белка. Результаты мерения сродства к кислороду, показавшее его отличие для гемоглобинов больных окачественными заболеваниями системы крови.

3. Результаты исследования процессов структурных нарушений в оксигемоглобине « естественной деградации, действии ионизирующего излучения и микроволнового грева. Определенный по данным мессбауэровской спектроскопии состав продуктов зрушения оксигемоглобина, предложенную схему радиолиза белка, показанное различие йствия на оксигемоглобин излучения разной энергии и типа (у-лучи и электроны), щученные параметры времени жизни позитронов для оксигемоглобина при естественной градации и действии ионизирующего излучения, выявленную их корреляцию с нформационным состоянием гемоглобина, показанную связь изменений параметров с

изменением структуры всей молекулы под действием ионизирующего излучения.

4. Результаты изучения микроструктурных особенностей ряда железо-декстрановых комплексов, являющихся фармацевтически важными моделями белка ферритина. Полученные данные, характеризующие различия в структуре "железного" ядра комплексов, возможное влияние на структуру "железного" ядра эффектов старения и выявленную примесь двухвалентного железа. Проведенный анализ мессбауэровских параметров с учетом известных представлений о мелкодисперсных частицах оксигидроксидов железа. Полученные оценки параметров электрон-позитронной аннигиляции, позволившие выявить структурные особенности в декстрановой оболочке, а именно, ее проницаемости для ионов хлора, плотности и ветвистости декстрана.

Данная работа выполнена в рамках программ МинВУЗа РСФСР "Человек и свет" и "Человек и окружающая среда. Проблемы охраны природы", программы МинВУЗа СССР "Кристалл" ("Взаимодействие мессбауэровского излучения с веществом"), госбюджетных тем "Изучение действия ионизирующего излучения на гемоглобин методами ядерной гамма-резонансной спектроскопии и аннигиляции позитронов", "Закономерности взаимосвязи структуры и функциональных свойств некоторых железосодержащих и мезогенных объектоЕ живой и неживой природы", грантов Российского Фонда Фундаментальных Исследований "Исследование гемоглобина и других компонент крови методами мессбауэровскок спектроскопии и аннигиляции позитронов. Биофизический и биомедицинский аспекты" (Ж 94-04-13772) и "Исследование гемоглобина, других компонент крови и их моделей методами мессбауэровской спектроскопии и аннигиляции позитронов. Биофизический г биомедицинский аспекты" (№ 97-04-49482).

Апробация работы. Результаты работы представлены и доложены на: 1-о\ Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Международных конференциях пс применению эффекта Мессбауэра (Алма-Ата, СССР, 1983; Лёвен, Бельгия, 1985; Мельбурн Австралия, 1987; Будапешт, Венгрия, 1989; Нанкин, Китай, 1991; Ванкувер, Канада, 1993 Римини, Италия, 1995; Рио-де-Жанейро, Бразилия, 1997; Гармиш-Партенкирхен, Германия 1999); Европейских конгрессах по ядерной медицине (Хельсинки, Финляндия, 1984; Лондон Великобритания, 1985; Гослар, Германия, 1986; Милан, Италия, 1988; Страсбург, Франция 1989; Вена, Австрия, 1991); Третьем Всесоюзном совещании "Ядерно-физические методь анализа в контроле окружающей среды" (Томск, 1985); Всесоюзном симпозиум« "Механизмы действия ионизирующего излучения на структуру и функции белков" (Львот 1986); Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987); Школ« молодых ученых "Взаимодействие мессбауэровского излучения с веществом" (Лиманчик

987); Всесоюзном совещании по прикладной мессбауэровской спектроскопии ("Волга",

988); Уральской научно-технической конференции "Применение мессбауэровской пектроскопии в материаловедении" (Ижевск, 1989); Первой Республиканской конференции Новые физические методы в медицине" (Ворошиловград, 1990); 1Х-ой Юбилейной научно-рактической конференции Уральского политехнического института (Свердловск, 1990); [атино-Американской конференции по применению эффекта Мессбауэра (Гавана, Куба, 990); 5-ом Конгрессе Всемирной федерации ядерной медицины и биологии (Монреаль, Канада, 1990); 10-ом Международном биофизическом конгрессе (Ванкувер, Канада, 1990); (семирных конгрессах по медицинской физике и биомедицинской технике (Киото, Япония, 991; Рио-де-Жанейро, Бразилия, 1994; Ницца, Франция, 1997); Международных онференциях по аннигиляции позитронов (Жомбатели, Венгрия, 1991; Пекин, Китай, 1994; Канзас Сити, США, 1997); Международном симпозиуме "Нестабильные ядра и частицы как онды в физике и химии" (Вако, Япония, 1992); Международных симпозиумах по ромышленному применению эффекта Мессбауэра (Отсу, Япония, 1992; Йоханнесбург, ЭАР, 1996); 4-ом Международном симпозиуме по аналитическим методам, системам и тратегиям в биотехнологии (Нурдвийкерхоут, Нидерланды, 1992); Российско-германском еминаре по мессбауэровской спектроскопии (Сергиев Посад, Россия, 1992); 2-ой (альневосточной конференции по медицинской и биологической технике (Пекин, Китай, 993); Международном научном семинаре "Ядерные методы в структурной химии" Будапешт, Венгрия, 1994); Симпозиумах по радиационной химии (Балатоншеплак, Венгрия, 994; Тата, Венгрия, 1998); Международных симпозиумах по ядерным квадрупольным заимодействиям (Провиденс, Род Айлеид, США, 1995; Пиза, Италия, 1997; Лейпциг, "ермапия, 1999); Международных конференциях по бионеорганической химии (Любек, 'ермания, 1995; Иокогама, Япония, 1997); 5-ом Международном семинаре по химии юзитрона и позитрония (Лиллафюред, Венгрия, 1996); 28-ом Польском семинаре по ннигиляции позитронов (Яриодьтовек, Польша, 1996); 12-ой Конференции "Физические 1етоды в координационной и супрамолекулярной химии" (Кишинэу, Молдова, 1996); Деждународных симпозиумах по ионизирующей радиации и полимерам (Гваделупа, Франция, 1996; Вайнбёла, Германия, 1998); Конгрессе по молекулярной медицине (Берлин, ермания, 1997); Конференции с международным участием "Медицинская физика - 97. 1овые технологии в радиационной онкологии" (Обнинск, Россия, 1997); Всероссийской опферепции "Применение ядерно-физических методов в магнетизме и материаловедении" Ижевск, Россия, 1998); 11-ой Международной конференции по сверхтонким заимодействиям (Дурбан, ЮАР, 1998); ХХ1У-ом Европейском конгрессе по молекулярной

спектроскопии (Прага, Чехия, 1998); 8-ой Европейской конференции по спекгроскопии биологических молекул (Энсхеде, Нидерланды, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 107 работ, включая 42 статьи и 65 тезисов докладов. Основные статьи приведены в конце автореферата.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка литературы из 533 наименований. Она изложена на 277 страницах, включая 100 рисунков и 50 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обсуждается актуальность темы диссертации, обосновывается выбор объектов исследования, обсуждается научная новизна, формулируются дели и задачи исследования.

ГЛАВА 1. МИКРОСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИХ БИОМОЛЕКУЛ И ИХ МОДЕЛЕЙ КАК ОБЪЕКТ ИЗУЧЕНИЯ МЕТОДОМ МЕССБАУЭРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ.

Первая глава представляет собой аналитический обзор литературных данных о структуре, функциях, а также о результатах исследования физическими методами микроструктурных особенностей в различных гемоглобинах, ферритинах и жслезо-декстрановых комплексах.

В первом параграфе рассмотрена структурно-функциональная связь в железосодержащих биомолекулах.

Второй параграф посвящен описанию структуры, функций и физических параметров гемоглобина и их анализу. Структура нормального взрослого гемоглобина А представляет собой тетрамер, образованный двумя парами а- и ^-субъеданиц (Рис. 1). Активным центром гемоглобина является железопорфириновый комплекс (гем), в центре которого расположен ион Ре(1Г) (Рис. 2, а). Структура локального окружения гема (Рис. 2, б) может оказывать влияние на электронную структуру Ре(П) и, тем самым, дополнительно влиять на связь Ре(11)-02 и функциональные свойства белка. На основании данных различных исследований показаны отличия молекулярной структуры, функциональных свойств и стереохимии активных центров для различных гемоглобинов и миоглобинов (миоглобин - мономер, близкий по структуре к (5-субъедишще гемоглобина). Проведен качественный анализ

б

Рис. 1. Структура молекул тетрамера гемоглобина (в) и [3-субъединицы гемоглобина (б).

СН5 СН:СНг

—с—с —^ I \=

I н, н2 I I

-сн,

-СН:СНг

снг си3

ь

соон

Рис. 2. Структура гема (а) и его локального окружения в р-субъединице гемоглобина (б).

озможного влияния электронной структуры Ее(П) и стереохимии активного центра на |ункциональные свойства гемоглобинов с различной молекулярной структурой. Приведены езультаты исследования гемоглобинов и миоглобинов различными физическими методами, увствительными к структуре белков.

Третий параграф посвящен анализу данных мессбауэровской спектроскопии гмоглобина и миоглобина и результатов теоретических расчетов с целью выявления связи ессбауэровских параметров, электронной и молекулярной структур активного центра в азличных белках. Мессбауэровские параметры изомерный сдвиг (8) и квадрупольное асщепление (АЕд) связаны соответственно с плотностью электронов и с градиентом иектрического поля на ядре 57Ре. Эти параметры позволяют характеризовать электронную груктуру иона железа. Изменение молекулярной структуры активного центра может ривести к изменению геометрии связей и, следовательно, электронной структуры Ре(П).

Однако, как показал проведенный анализ, до недавнего времени не уделялось должного внимания проблеме связи малых структурных изменений в гемоглобине и миоглобине с небольшими отличиями мессбауэровских параметров, хотя отдельные экспериментальные и теоретические исследования свидетельствовали о наличии такой связи.

В четвертом параграфе описана структура белка ферритина и его моделей - железо-декстрановых комплексов. Ферритин представляет собой сферическую молекулу с внешним диаметром 10-12 нм, состоящую из железосодержащего ядра диаметром порядка 7-8 нм и оболочки из 24 белковых субъединиц (Рис. 3). Ядро ферритина представляет собой

полиядерный комплекс оксигидроксида Ре(Ш), состав которого может бьггь описав формулой (РеООН)8 • РеО • 0Р03Н2. Одна молекула ферритина может содержать до 450( атомов железа. "Железное" ядро ферритина интенсивно изучается различными методами однако до сих пор нет ясности в том, какова его реальная структура. Сначал: предполагалось, что ядро может состоять из небольших кристаллитов, позднее был сделш вывод о том, что ядро представляет собой полиэдр одного типа, есть предположение с слоистой структуре ядра (Рис. 4).

Наиболее распространенными моделями ферритина являются железо-декстрановьи комплексы. По структуре они повторяют "железное" ядро ферритина, содержащее РеООН которое вместо белка окружено оболочкой из декстрана (синтезируемой бактериям! линейной (1-6)-поли-1Э-глюкозы). Согласно данным дифракции электронов структура ядр: в ферритине более схожа с ферригидритом (5Ре203 • 9Н20), в то время как в железо-декстрановом комплексе Имфероне ядро по структуре ближе к акагениту (Р-РеООН).

Рис. 3. Структура молекулы ферритина. N означает И-конец белковой цепи, Е - указывает на положение спирали Е.

Рис. 4. Предполагаемые структуры железосодержащего ядра в ферритине: а -структура плоского слоя атомов железа и кислорода с фосфатными группами и б - упаковка слоя в молекуле ферритина; в - варианты структуры ядра из одного или нескольких кристаллитов.

В пятом параграфе представлен анализ результатов исследования методом [сссбауэровской спектроскопии ферритина и жслезо-декстрановых комплексов. Показано, то в различных ферритинах структура "железного" ядра, его упаковка и размеры имеют екоторые отличия, что оказывает влияние на сверхгонкую структуру мессбауэровских иектров и в основном проявляется в появлении магнитного расщепления в спектре, арактеризующего эффективное магнитное поле на ядре "Ре (Нэфф). Однако, до недавнего ремени не проводилось систематизированного исследования связи микроструктурных собенностей различных железо-декстрановых комплексов и параметров мессбауэровских пектров.

В шестом параграфе проводится краткое обсуждение результатов биомедицинского рименепия мессбауэровской спектроскопии. Высокая чувствительность мессбауэровских араметров к изменениям электронной и магнитной структур железосодержащих иомолекул, а также к количественным изменениям железосодержащих систем в организме ;озволяет проводить биомедицинские исследования по целому ряду направлений. Важное 1есто здесь занимает изучение тех или иных нарушений в структуре биологических молекул, вязанных либо с развитием патологии, либо с действием внешних факторов. Основные

11

направления биомедицинского применения мессбауэровской спектроскопии обобщены и сформулированы автором и кратко могут быть представлены следующим образом:

- количественные изменения содержания железосодержащих биомолекул;

- качественное изменение структуры железосодержащих биомолекул;

- процессы метаболизма с участием молекул, содержащих мессбауэровские ядра;

- действие на железосодержащие биомолекулы факторов внешней среды;

- динамические свойства железосодержащих биообъектов;

- фармацевтические препараты и искусственные переносчики кислорода.

В заключительном параграфе первой главы формулируются цели и задачи исследования гемоглобинов и железо-декстрановых комплексов с различной молекулярной структурой методом мессбауэровской спектроскопии. В качестве основных зада' исследования поставлены следующие:

- изучение связи электронной структуры железа, стереохимии (молекулярной структуры) активного центра и особенностей мессбауэровских спектров для нормальны? гемоглобинов человека с различной молекулярной структурой;

- изучение связи электронной структуры железа, стереохимии (молекулярно! структуры) активного центра и мессбауэровских параметров для гемоглобинов людей больных злокачественными заболеваниями системы крови;

- изучение структурных изменений и нарушений в гемоглобине человека при действш внешних факторов по данным мессбауэровской спектроскопии, включая оценку электронно! и молекулярной структуры новых компонент;

-изучение связи структурных особенностей "железных" ядер и мессбауэровски: параметров для железо-декстрановых комплексов, отличающихся молекулярной структурой

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Вторая глава посвящена описанию методов исследования и подготовки образцов. Дат характеристики мессбауэровских спектрометров ЯГРС-4 и СМ-2201, на которы: проводилось измерение мессбауэровских спектров, спектрометров угловых корреляцю аннигиляционного излучения и времени жизни позитронов, описаны методы приготовлена гемоглобина в эритроцитах и в концентрированном растворе и его модификации, методь приготовления железо-декстрановых комплексов, метод теоретической оценки электронно! структуры и мессбауэровских параметров для моделей гемоглобина, способы проведени облучения и нестерильной деградации гемоглобина и метод измерения сродства гемоглобин

кислороду.

ГЛАВА 3. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕССБАУЭРОВСКИХ ПАРАМЕТРОВ, ЭЛЕКТРОННОЙ СТРУКТУРЫ Ге(И) И СТЕРЕОХИМИИ АКТИВНОГО ЦЕНТРА В НОРМАЛЬНЫХ ГЕМОГЛОБИНАХ ЧЕЛОВЕКА С РАЗЛИЧНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРОЙ.

Третья глава посвящена изучению взаимосвязи мессбауэровских параметров, лектронной структуры Ре(П) и стереохимии активного центра в нормальных фетальном и зрослом гемоглобинах человека, отличающихся составом субъединиц (2а2у-субъединицы и а2(5-субъединицы, соответственно) и функциональными свойствами, а также в лиофильно ысушенном и модифицированном пиридоксальфосфатом и глутаровым альдегидом емоглобинах взрослого человека.

В первом параграфе проведено сравнение мессбауэровских спектров и их параметров >етального и взрослого гемоглобинов человека в дезокси-, окси- и карбокси-формах (НЬР, 1ЬР02, ПЬРСО и НЬА, НЬА02, НЬАСО, соответственно). Мессбауэровские спектры трех юрм гемоглобинов А и Р показаны на Рис. 5.

Мессбауэровские параметры (изомерный сдвиг 6, квадрупольное расщепление ЛЕЧ. I ирина линии Г) определялись аппроксимацией спектров по методу наименьших квадратов использованием лоренцевой формы линии. В результате аппроксимации мессбауэровских пектров фетального и взрослого гемоглобинов одним квадрупольным дублетом (в редположении эквивалентности электронной структуры Ре(11) в неидентичных а-, (3- и у-убъединицах гемоглобинов - аппроксимация 1) обнаружено отличие величины ДЕ9 для гмоглобинов А и Р в дезокси- и окси-формах (Рис. 6), хотя для карбокси-форм гмоглобинов А и Р параметры сверхтонкой структуры оказались одинаковыми в пределах шибки. Также обнаружено, что линии мессбауэровских спектров дезокси- и окси-форм гмоглобинов оказались шире, чем для карбокси-форм, для которых ширина линии казалась сравнима с шириной линии мессбауэровского спектра стандартного поглотителя итропруссида натрия. Исследование формы линий мессбауэровских спектров показало, что пектры окси-форм гемоглобинов имеют асимметрию формы линий поглощения, в то время ак спектры других форм гемоглобинов имеют лоренцеву форму линии.

Проведенный качественный анализ отличий мессбауэровских параметров для етального и взрослого гемоглобинов позволил сделать вывод о том, что соответственно в гзокси- и окси-формах белков имеют место отличия электронной структуры Ре(И) и его

Ц 0.8

ы ©

е

m

1.6

£

ы

0.8

1.6

HbFO¡ afHbFÓ'j rtHbFO,) Bef'Fe)

-10 12 СКОРОСТЬ, мм/с HbAOj fi(¡ÍbAÓ])

afHbAOJ

Be f7Fe)

-10 12 СКОРОСТЬ, ммк

Рис. 5. Мессбауэровские спектры фетального (а) и взрослого (б) гемоглобинов человека в дезокси-форме (А), в окси-форме (S) и в карбокси-форме (В). Т=87 К. Для спектров АиБ пунктир - аппроксимация 1, сплошная линия - аппроксимация 2. Для спектров В сплошная линия - аппроксимация 1. Здесь и далее Be("Fe) - вклад в спектр от ядер 5,Fe в бериллиевом окне сцинтилляционного детектора, изомерный сдвиг приводится относительно a-Fe при 295 К, горизонтальными скобочками показаны компоненты в спектрах (квадрупольные дублеты и магнитные секстеты).

а

о <

2,260

0,910 0,930 0,950 0,970

ИЗОМ1ГНЫЙ СДВИГ, мм/с

а

о

и о

-д

§

С

2,050

0,220 0,240 0,260 0,280

ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с

Рис. 6. Области значений параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров фетального и взрослого гемоглобинов человека в дезокси- (я) и окси-форме Т=87 К. Д - гемоглобин Р; □ - гемоглобин А.

:тереохимии, обусловленные ассоциацией а- и у- субъединиц и а- и р~субъединиц в гетрамерах белков. В карбокси-форме гемоглобинов образование сильной связи Ре(Н)-СО с ючти сферической симметрией электрического поля на ядре 57Ре приводит к сглаживанию этличий в электронной структуре Ре(Н), обусловленных различиями в молекулярной лруктуре белков. Поэтому уширение линий мессбауэровских спектров дезокси- и окси-форм фетального и взрослого гемоглобинов по сравнению с карбокси-формой може! быть ;вязано с дополнительным влиянием структурных отличий активных центров в 1еидентичных субъединицах тетрамеров на электронную структуру Ре(Н).

Во втором параграфе дан критический анализ особенностей мессбауэровских спектров жсигемоглобина и их интерпретации различными авторами. Предложено наблюдаемую ¡симметрию формы линий мессбауэровских спектров оксигемоглобина, измеренных при гемпературах в области температуры жидкого азота, описывать суперпозицией двух свадрупольных дублетов, связанных с неидентичными субъединицами в тетрамере.

В третьем параграфе проведен анализ мессбауэровских спектров фетального и 1зрослого гемоглобинов в дезокси- и окси-форме с учетом неэквивалентности электронной :труктуры Ре(П) в а-, (3- и у- субъединицах тетрамерных белков. Спектры обрабатывались уперпозицией двух квадрупольных дублетов (аппроксимация 2). Одним из критериев такой япроксимации служило условие равенства площадей (Б) дублетов в пределах ошибки. В юзультате аппроксимации 2 удалось описать асимметрию формы линий спектров 1ксигемоглобинов при свободном варьировании параметров (см. Рис. 5, Б). Для описания

симметричных лоренцевых линий мессбауэровских спектров дезоксигемоглобинов суперпозицией двух квадрупольных дублетов приходилось фиксировать один или два параметра. Мессбауэровские параметры для дезокси-форм гемоглобинов даны в Таблице 1.

Таблица 1.

Значения мессбауэровских параметров для дезоксигемоглобинов Аир. Аппроксимация 2.

Образец Гь мм/с 81, мм/с АЕд!, мм/с г2, мм/с 52, мм/с АЕЧ2, мм/с 8!,% Бз, % х5

НЬА 0,257* 0,927 2,434 0,284* 0,928 2,154 52 48 603

НЬА 0,270* 0,942 2,434 0,299' 0,946 2,159 51 49 525

НЬР 0,282* 0,932 2,393 0,321' 0,941 2,158 49 51 646

НЬР 0,262* 0,931 2,391 0,300' 0,936 2,107 52 48 592

Индексы 1 и 2 относятся соответственно к первому и второму квадрупольным дублетам. Б -относительная площадь дублета. Знаком * отмечены фиксированные параметры. Максимальная экспериментальная ошибка для ДЕ0 и б ±0,013 мм/с. Максимальная экспериментальная ошибка для Г +0,026 мм/с. Ошибка для 8 ±(5-7) %.

Полученные оценки сверхтонких параметров проанализированы с учетом известных рентгеноструктурных данных об отличиях стереохимии Ре(Н) в а- и р-субъединица> тетрамерного дезоксигемоглобина взрослого человека. В результате первый дублет I большей величиной ДЕд соотнесен с а-субъединицами, а второй дублет с меньше! величиной АЕ0 соотнесен с (3-субъединицами в тетрамерном НЬА. Для НЬР аналогичне первый дублет соотнесен с а-субъединицами, а второй - с у-субъединицами в тетрамере.

Дополнительно для железопорфириновых комплексов Ре(Н)-порфирин-имидазог (Ре(11)Р1т), моделирующих стереоструктурные отличия а- и (3-субъединиц в тетрамернок дезоксигемоглобине взрослого человека и в дезоксимиоглобине (МЬ) (Таблица 2), проведень теоретические квантово-химические расчеты электронной структуры Рс(Н) I мессбауэровских параметров (расчеты были выполнены в Институте Биофизики Минздрав; РФ В.И. Хлесковым, Б.Н. Бурыкиным и А.Б. Смирновым по разработанным ими программа!^ при участии автора в постановке задачи и обсуждении результатов).

Результаты расчетов показали, что энергетические спектры основного и низколежагцш электронных термов для моделей а- и р-субъединиц в тетрамерном дезоксигемоглобинс взрослого человека и в дезоксимиоглобине отличаются (Рис. 7), отличаются также энерги* молекулярных орбиталей для данных комплексов и температурные зависимост!

Таблица 2.

Структурные параметры активного центра в дезоксимиоглобине и в дезоксигемоглобине 1зрослого человека, использованные для теоретических расчетов.

Расстояния, А Углы, °

Fe-Ct' Fe—Ргема2 Fe-N/ Fe-Ne (His F8) Im-N,FeN3 плоскость Im -нормаль к тему

Mb 0.42 0.47 2.03 2.22 12 3

НЬА

а 0.40 0.58 2.08 2.16 18 3

Р 0.36 0.50 2.05 2.09 24 2

Ct - центр плоскости азотов порфирина, положительное значение расстояния l'c-Ct )бозначает смещение в сторону His F8. 2Ргема - плоскость порфирина (усреднение по 32 томам). 3Np - атомы азота порфирина. По рентгеноструктурным данным: Phillips S.E.V. Structure and Refinement of Oxymyoglobin at 1.6 A Resolution. J. Mol. Biol. 1980, 142, p. 531->54, Fermi G., Perutz M.F., Shaanan В., Fourme R. The Crystal Structure of Human )eoxyhaemoglobin at 1.74 A Resolution. J. Mol. Biol. 1984,175, p. 159-174.

e, cm"'

5a2

967.3

5b2

60

5B,

72;

5a2

4.2

37.8

И2

'a2

833.9

5B2

21.4

а(НЬА)

Рис. 7. Рассчитанные энергетические высокоспиновых термов Ре(П) структурные отличия в МЬ иве

ß(HbA) Mb

спектры основного и низколежащих в комплексах Fe(II)PIm, моделирующих I- и ß-субъединицах тетрамерного НЬА.

квадруполыюго расщепления (Рис. 8). Рассчитанные изомерные сдвиги оказались одинаковыми. Полученное отличие рассчитанных значений ДЕ0 для а- и Р-субъединиц в

"I 2>7° Г

£

2,60

5

Л 2,50 -с _

о

| 2,20 -

0

1 2,10 -

| 2,00 -'-1-1-

0 50 100 150 200

Температура, К

Рис. 8. Температурные зависимости квадруполыюго расщепления, рассчитанные с учетом спин-орбитального взаимодействия для модельных комплексов Ре(И)Р1ш: Д - сх-субъединицы в НЬА, □ - р-субъединицы в НЬА, О - МЬ.

тетрамере (0,13 мм/с при 87 К) оказалось сравнимо с отличиями ДЕд, полученными при аппроксимации мессбауэровских спектров НЬА суперпозицией двух квадрупольных дублетов (Таблица 1). Отличие рассчитанных значений ДЕд при одинаковых значениях изомерного сдвига для а- и р-субъединиц в тетрамере указывает на уширенис суперпозиционных линий мессбауэровских спектров дезоксигемоглобина, что соответствует экспериментальным результатам.

Мессбауэровские параметры для спектров окси-форм фетального и взрослого гемоглобинов даны в Таблице 3. Они были проанализированы с учетом известных рентгеноструктурных данных для оксигемоглобина взрослого человека (Таблица 4). В результате первый дублет был сопоставлен с а-субъединицами в НЬА02, а второй дублет - с р-субъединицами в НЬА02. Отличие ширин линий первого и второго дублетов связывается с отличиями в связи Ре(11)-02 в неидентичных субъединицах, в частности, предположено, что одним из основных факторов уширения линии второго дублета является свободное вращение молекулы кислорода вокруг оси Ре(Н)-0 в р-субъединицах, в то время как в а-субъединицах вращение молекулы кислорода стерически ограничено ввиду образования сильной водородной связи с Н,(Я« Е7) - атомом азота дистального гистидина (Рис. 9). На основании предложенной модели учета различия электронной структуры и стереохимии

Таблица 3.

Значения мессбауэровских параметров для оксигемоглобинов А и F. Аппроксимация 2.

Образец гь мм/с si, мм/с aeq|, мм/с г2, мм/с §2, мм/с aeq2, мм/с si, % s2, % х2

ньао2 0,272 0,252 2,153 0,488 0,251 1,782 54 46 548

ньао2 0,257 0,244 2,154 0,470 0,235 1,809 51 49 568

HbFO, 0,252 0,261 2,207 0,407 0,259 1,868 54 46 545

HbF02 0,254 0,267 2,197 0,449 0,259 1,846 51 49 618

Индексы 1 и 2 относятся соответственно к первому и второму квадрупольным дублетам. 8 -относительная площадь дублета. Максимальная экспериментальная ошибка для ДЕ0 и 6 ±0,013 мм/с. Максимальная экспериментальная ошибка для Г ±0,026 мм/с. Экспериментальная ошибка для в ±(5-7) %.

Таблица 4.

Структурные параметры активного центра в оксигемоглобине взрослого человека.

Расстояния, Á Углы, °

Fe-Ct1 Fr-P 2 i ^ 1 гемл Ь'е-N/ Fe-Nc (His F8) Fe-O,4 Fe-Ог-О; Im-N,FeN3 плоскость Im-нормаль к гему

НЬАО2

a 0.12 0.16 1.99 1.94 1.66 153 11 0

Р -0.11 0.00 1.96 2.07 1.87 159 27 4

'Ct - центр плоскости азотов порфирина, положительное значение расстояния Fe-Ct обозначает смещение в сторону His F8. 2Ргема - плоскость порфирина (усреднение по 32 атомам). 3N - атомы азота порфирина. "О, - атом кислорода молекулы О,, образующий координационную связь с ионом Fe. По рентгеноструктурным данным: Shaanan В. Structure of Human Охуhaemoglobin at 2.1 Á Resolution. J. Mol. Biol. 1983,171, p. 31-59.

Fe(II) в а- и p- субъединицах оксигемоглобина проведен анализ известных данных о температурной зависимости формы линий мессбауэровских спектров и характера связи Fe(II)—02. Предполагается, что для фетального оксигемоглобина существует аналогичная :вязь первого и второго квадрупольных дублетов с а- и у-субъединицами в тетрамере.

В четвертом параграфе рассмотрены особенности мессбауэровских спектров, электронной структуры и стереохимии Fe(II) в лиофильно высушенном оксигемоглобине человека. Мессбауэровские спектры лиофильно высушенного оксигемоглобина показаны на Рис. 10. Они обработаны без учета и с учетом неэквивалентности электронной структуры Fe(II) в a- и Р-субъединицах тетрамера (аппроксимации 1 и 2, соответственно). Оказалось,

На

-На

соон

Рис. 9. Отличие структуры связи Ре(Н)-02 в а-субъединицах (а) и (3-субъединицах (б) тстрамерного оксигемоглобина.

а

и ,-,1

СКОРОСТЬ, мм/с

Рис. 10. Мессбауэровские спектры лиофильно высушенного оксигемоглобина при Т=295 К (в) и Т=87 К (б). 1 - НЬА02Ь; 2 - гемохромы; 3 -Ве(57Ре). Сплошная линия - аппроксимация 1.

что форма линий спектров близка к лоренцевой при 87 К и лоренцева при 295 К. Кроме того, обнаружено возрастание величины АЕЧ по сравнению с данными для замороженного раствора оксигемоглобина (Рис. 11). Отличия в величинах ДЕ9 для лиофильно высушенного оксигемоглобина и в замороженном растворе обнаружены также при аппроксимации 2.

0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, им/с

Рис. 11. Отличие квадруполыюго расщепления для оксигемоглобина взрослого человека в растворе (□) и в лиофильно высушенной форме (И) и для гемоглобина, модифицированного пиридоксальфосфатом и глутаровым альдегидом, в окси-форме в замороженном растворе (Л) и в лиофильно высушенной форме (А). Т=87 К.

1олученные результаты проанализированы с учетом возможных структурных изменений в >бласти активного центра лиофильно высушенного оксигемоглобина.

3 пятом параграфе рассмотрены особенности мессбауэровских спектров, электронной :труктуры и стереохимии Ре(Н) в гемоглобине, последовательно модифицированном шридоксальфосфатом (РЬР) и глутаровым альдегидом (ОА) (искусственный переносчик ;ислорода, разработанный в Гематологическом научном центре РАМН). Мессбауэровские :пектры модифицированного гемоглобина в окси-форме приведены на Рис. 12, а значения :верхтонких параметров, полученные при аппроксимации 1, показаны на Рис. 11. Интересно >тметить, что при лиофилизации возрастает величина ДЕЦ как для немодифицированного, •ак и для модифицированного оксигемоглобинов. Результаты также свидетельствуют об 'меньшении величины ДЕр для окси-формы гемоглобина в результате модификации белка. )бнаружено отличие тенденций температурных зависимостей ДЕд для лиофильно «сушенных форм немодифицированного и модифицированного оксигемоглобинов при ппроксимации без учета и с учетом неэквивалентности электронной структуры Ре(П) в а- и 1-субъединицах тетрамерных белков (Рис. 13). Проанализированы возможные структурные тличия в области активного центра в модифицированном оксигемоглобине. Для дезокси-юрмы модифицированного гемоглобина отличий в величине ДЕд не обнаружено.

СКОГОСТЬ, мм/с

Рис. 12. Мессбауэровские спектры НЬА02 в концентрированном растворе, Т=87 К (я), НЬА(РГ,Р+0А)02 в лиофильно высушенной форме, Т=87 К (б), НЪА(РЬР+0А)02 в лиофильно высушенной форме, Т=295 К (в), НЬА(РЬР-|-0А)02 в замороженном растворе, Т=87 К (г). 1 - а-субъединицы; 2 - (З-субъединицы; 3 - неизвестное соединение Ре3+; 4 - Ве(5,Ре). Сплошная линия - аппроксимация 2.

В шестом параграфе в грубом приближении проведена оценка изменения электронной структуры Ре(П) в фетальном, лиофильно высушенном взрослом и модифицированном оксигемоглобинах относительно взрослого оксигемоглобина. Получены значения изменений энергий низколежащих возбужденных термов Ре(11).

г £

ьГ 2,10 К

§ 2,00

ы

3

" 1,90 о.

-а

ч о

С 1,70 >>

и 1,60

1,50

0 100 200 300

ТЕМПЕРАТУРА, К

Рис. 13. Отличие тенденций температурных зависимостей квадрупольного расщепления для а- и Р-субъединиц в лиофильно высушенных НЬА02 и НЬА(РЬР ЮА)0_,: а-субъединицы НЬА02 (О), а-субъединицы НЬЛ(Р1,Р4 ОА)Ог (♦), р субъединицы НЬА02 (О), р-субъединицы НЬА(Р1,Р+0А)02 (в).

ГЛАВА 4. ПАРАМЕТРЫ СВЕРХТОНКОЙ СТРУКТУРЫ МЕССБАУЭРОВСКИХ СПЕКТРОВ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СИСТЕМЫ КРОВИ. АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЙ ЭЛЕКТРОННОЙ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА.

Четвертая глава посвящена исследованию электронной структуры и стереохимии Ре(П) в гемоглобине больных лейкозами и эритремией в окси- и дезокси-формах (НЬШ2, НМ,).

В первом параграфе обсуждается молекулярная природа канцерогенеза и возможное изменение структуры железосодержащих белков в процессе малигнизации.

Во втором параграфе обсуждаются особенности мессбауэровских спектров, электронной структуры и стереохимии Ре(Н) в оксигемоглобине больных лейкозами. Мессбауэровские спектры оксигемоглобина больных также имеют асимметрию формы линий поглощения. Показано, что при аппроксимации мессбауэровских спектров оксигемоглобина больных параметры сверхтонкой структуры несколько отличаются от нормального взрослого оксигемоглобина и частично совпадают с параметрами фатального оксигемоглобина (Рис. 14). Такая тенденция возрастания ДЕ^ и 5 может быть обусловлена

ослаблением а- и я-связей Ре(И) с лигандами вследствие изменения структуры активного центра в оксигемоглобине больных лейкозами людей. В грубом приближении проведен расчет изменения электронной структуры Ре(Н) и получены оценки уменьшения энергий низколежащих электронных термов Ре(Н).

ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с

Рис. 14. Отличие областей сверхтонких параметров мессбауэровских спектров нормальных оксигемоглобинов и оксигемоглобинов больных лейкозами: О - нормальный взрослый; А - нормальный фетальный; • - хронический миелолейкоз; ■ - острый миелобластный лейкоз; ▲ - хронический лимфолейкоз; ♦ - острый лимфобластный лейкоз. Т=87 К.

Далее получены оценки мессбауэровских параметров для оксигемоглобина больных лейкозами при аппроксимации спектров с учетом неэквивалентности электронной структуры Рс(П) в неидентичных субъединицах тетрамеров. Обнаружены схожие тенденции отличий сверхтонких параметров для первого и второго дублетов нормального взрослого, фетального и лейкозного оксигемоглобинов (Рис. 15).

В третьем параграфе обсуждаются результаты мессбауэровской спектроскопии гемоглобина больных эритремией в дезокси- и окси-формах (Рис. 16). Обнаружено, что в спектрах гемоглобина некоторых больных присутствует дополнительная компонента, которая связывается с возрастанием содержания ферритина в эритроцитах больных от 5 до 15 % для депонирования избыточного железа. Параметры сверхтонкой структуры

2,10

-Ь

2,00

1,95

ы К

а

ы Ч

3 1,90 о

ы О

я

•д §

В

,85

,80

<

сэ

а 1,75

0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, ми/с

0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, им/с

Рис. 15. Области сверхтонких параметров первого (а) и второго (б) дублетов (аппроксимация 2) мессбауэровских спектров оксигемоглобинов взрослого (О), фетального (Д) и больных лейкозами (в). т=87 к.

а

-10 12 3 СКОРОСТЬ, мм/с

Рис. 16. Мессбауэровские спектры эритроцитов (в) и гемолизата (б) из крови больного эритремией 3. 1 - НЪЬ02; 2 - НЬЬ; 3 - ферритиноподобная компонента; 4 -Ве(57Ре). Т=87 К. Аппроксимация 1. Пунктир и сплошная линии - результат аппроксимации без учета и с учетом ферритиноподобной компоненты.

мессбауэровских спектров оксигемоглобина больных эритремией также отличаются от параметров для нормального взрослого оксигемоглобина, как и в случае лейкозов, однако для дезокси-форм гемоглобннов здоровых и больных людей отличий не обнаружено.

В четвертом параграфе приводятся результаты второй серии исследования гемоглобина больных лейкозами в дезокси- и окси-формах, проводится анализ электронной структуры и стереохимии Рс([[) в активном центре белков. На Рис. 17 показаны области сверхтонких параметров для гемоглобннов здоровых и больных лейкозами и эритремией людей в окси- и дезокси-формах. Для окси-форм белков тенденция отличий сверхтонких параметров

ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с

Рис. 17. Отличие областей сверхтонких параметров мессбауэровских спектров гемоглобннов в окси-форме (а) и в дезокси-форме (б): О - нормальный взрослый; Д - нормальный фетальный; ■ - эритремия; • - острый миелобластный лейкоз; ♦ - острый миеломонобластный лейкоз; А -хронический миелолейкоз. Т=87 К.

сохраняется (ср. Рис. 14). Для дезокси-форм нормального взрослого гемоглобина и гемоглобина больных лейкозами отличий в сверхтонких параметрах не обнаруживается. Из этого факта делается вывод о том, что в гемоглобине больных лейкозами возможны структурные изменения в дистальной области гема, влияющие на связь Ре(П)-02.

В пятом параграфе обсуждаются структура и функциональные свойства гемоглобина больных злокачественными заболеваниями системы крови. Показано отличие кривых насыщения гемоглобина кислородом для здоровых и больных лейкозами и эритремией людей (Рис. 18), свидетельствующее о различии функциональных свойств гемоглобннов.

Рис. 18. Кривые насыщения гемоглобина кислородом. 1, 2 -норма (О - рН=7,14; Д - рН=6,88), 3 - хронический лимфолейкоз (• - рН=7,10), 4 - хронический миелолейкоз (▲ - рН=7,00), 5 - острый миелобластный лейкоз (В - рН=6,36), 6 - эритремия (♦ - рН=6,96).

ГЛАВА 5. ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ГЕМОГЛОБИН.

АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ НАРУШЕНИЙ И ПРОЦЕССА РАДИОЛИЗА БЕЛКА.

Пятая глава посвящена изучению структурных нарушений в гемоглобине под 1ействием ионизирующего излучения и процесса радиолиза белка методами .юссбауэровской спектроскопии и аннигиляции позитронов.

В первом параграфе обсуждается эффект облучения оксигемоглобина человека в фитроцитах у-лучами с энергией ~15,5 МэВ в дозах ~100, -300 и -600 кГр. Иессбауэровские спектры облученного оксигемоглобина в эритроцитах показаны на Рис. 19. Гпектры были обработаны по нескольким моделям, получены оценки параметров всех сомпонент, которые сопоставлены с мессбауэровскими параметрами известных производных емоглобина. В результате выявленные компоненты в спектрах облученного жсигемоглобина были сопоставлены с конкретными соединениями, которые могут >бразовываться в процессе радиолиза белка. Более того, по изменению относительных иощадей компонент в спектрах получены изменения содержания компонент в процессе облучения оксигемоглобина (Рис. 20). Предложена схема радиолиза оксигемоглобина.

СКОРОСТЬ, х

Рис. 19. Мессбауэровские спектры концентрированного раствора оксигенированных эритроцитов, облученных у-лучами с энергией ~15,5 МэВ в дозах: а - 100 кГр; б - 300 кГр; в - 600 кГр. Т=87 К. Сплошная линия - результат обработки с учетом пяти компонент: 1 - НЬА02, 2 - НЬА, 3 - гематин (Ьс(Ш)~гем-ОН) и/или ц-оксодимеры Ре(Ш)-порфирина, 4 - МеЩЬОН" и/или гемихромы, 5 - высокоспиновый комплекс негемового Ре(Ш) в ромбическом окружении, 6 - Ве(5Те).

а

в, %

100' 1

80 1

60 1 -\

40 \

20 А

0 ' 1,....

в, % 20

15

б

10

0

2

0 100 300 600 0 100 300 «00 Д О 3 А, кГр Д О 3 А, кГр

Рис. 20. Изменение относительных площадей компонент в мессбауэровских спектрах оксигемоглобина в эритроцитах, подвергнутых у-облучению (аппроксимация с использованием пяти компонент): а - НЬА02 (■), НЬА (Ж) и суммарная площадь компонент 3-5 (•), заштрихованная область соотносится с наличием низкоспинового метгемоглобина; б - компонента 3 (■), компонента 4 (•), компонента 5 (А), заштрихованная область соотносится с наличием высокоспинового метгемоглобина. Номера компонент соответствуют компонентам, приведенным на Рис. 19.

5

Во втором параграфе обсуждаются результаты сравнительного исследования оксигемоглобина человека в концентрированном растворе, подвергнутого естественной деградации в нестерильных условиях и у-облучению с энергией ~9 МэВ в дозах —16,5, ~26,5 и -33,0 кГр. Мессбауэровские спектры оксигемоглобина, подвергнутого нестерильной дирадации, и оксигемоглобина, облученного у-лучами, свидетельствуют о различных механизмах разрушения белка. Отмечено также отличие от радиолиза оксигемоглобина под действием у-лучей с энергией ~15,5 МэВ. Общим является лишь дезоксигенация IГЬЛО,, хотя этот процесс отличается при облучении оксигемоглобина у-лучами с разной энергией (Рис.21). О структурных изменениях в растворе оксигемоглобина свидетельствуют также

.» юо

О

А

к

к

с.

«

ч

о О

о

100

200 300

400

500

600

Доза облучения, кГр Рис. 21. Отличие процесса дезоксигенации оксигемоглобина под действием у-излучения: М-НЬА02 в эритроцитах, у-лучи с энергией 15,5 МэВ; ▲ - НЬА02 в растворе, у-лучи с энергией 9 МэВ.

спектры времени жизни позитронов (Рис. 22). По ашшгиляционным параметрам были оценены средний радиус ячеек свободного объема и относительный полный свободный объем в исходном и подвергнутых нестерильной деградации и облучению растворах НЬА02.

3,0 2,5

I 51 101 151 201 251 301 351 401 451 НОМЕР КАНАЛА

1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 НОМЕР КАНАЛА

Рис. 22. Отличие спектров времени жизни позитроиов растворов оксигемоглобина: А - исходный (а) и после 64 час инкубации (б); Б - исходный (а) и после облучения у-лучами с энергией 9 МэВ в дозе 16,5 кГр (б). Т=295 К.

В третьем параграфе обсуждаются результаты изучения действия электронов с энергией ~10 МэВ в дозах -1,7, -2,5 и -5,0 кГр на концентрированный раствор оксигемоглобина. Мессбауэровские спектры раствора оксигемоглобина, облученного электронами, показаны на Рис.23. В результате обработки спектров оценены параметры

СКОРОСТЬ, им/с

Рис. 23. Мессбауэровские спектры исходного концентрированного раствора оксигемоглобина (а), контрольного раствора дезоксигемоглобина (б) и растворов оксигемоглобина, облученных электронами в дозах 1,7 кГр (в), 2,5 кГр (г) и 5,0 кГр (д). 1 - НЬА02; 2 - НЬА; 3 - высокоспиновое соединение Ре3+(1); 4 - гемихромы; 5 - высокоспиновое соединение Ре3+ (II); 6 - гемохромы; 7 - Ве("Ре). Т=87 К.

новых компонент, которые сопоставлены с известными производными гемоглобина. Полученные данные свидетельствуют, что происходит дезоксигенация НЬА02 и образуются гемихромы и гемохромы. Изменение содержания оксигемоглобина и дезоксигемоглобина в

процессе облучения электронами показано на Рис. 24. Проведенные измерения спектров времени жизни позитронов растворов оксигемоглобина, облученных электронами, свидетельствуют о структурных изменениях в облученных растворах. Оценки среднего радиуса ячеек свободного объема и относительного полного свободного объема указывают на некоторое эффективное сжатие белка по сравнению с раствором оксигемоглобина,

100 * 80

в 60 5

1 40 §

U 20

0

0,0 2,0 4,0 6,0

Доза облучения, кГр

Рис. 24. Изменение содержания НЬА02 (■) и НЬА (Ж) в растворе оксигемоглобина, облученном электронами с энергией 10 МэВ.

облученного у^лучами. Полученные результаты позволили проанализировать процесс радиолиза оксигемоглобина электронами.

В четвертом параграфе обсуждены результаты мессбауэровской спектроскопии раствора оксигемоглобина, подвергнутого микроволновому нагреву, в сравнении с действием электронов. Мессбауэровские спектры оксигемоглобина, подвергнутого микроволновому нагреву показаны на Рис. 25. В результате аппроксимации спектров выявлена лишь одна дополнительная компонента, связываемая с высокоспиновым соединением Fe3+. Обнаружено также изменение формы линий поглощения и уширение пиний спектров, свидетельствующие о структурном разупорядочении в молекулах оксигемоглобина в результате микроволнового нагрева.

ГЛАВА 6. МИКРОСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЖЕЛЕЗО-ДЕКСТРАНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ВАЖНЫХ МОДЕЛЕЙ ФЕРРИТИНА.

Шестая глава посвящена изучению микроструктурных особенностей железо-текстрановых комплексов, являющихся фармацевтически важными моделями ферритина, методами мессбауэровской спектроскопии и аннигиляции позитронов. Проведено

СКОРОСТЬ, юа/с

Рис. 25. Мессбауэровские спектры концентрированных растворов оксигемоглобина: а - исходный, б - после микроволнового нагрева в течение 5 с, в - после микроволнового нагрева в течение 15 с. 1 - НЬА03; 2 - высокоспиновое Ре3+(1); 3 - Ве(57Ре). Т=87 К.

две серии исследований зарубежных промышленных фармацевтических препаратов и комплексов, разрабатываемых в Гематологическом научном центре РАМН.

В первом параграфе обсуждаются результаты первой серии измерений, в которой были исследованы Имферон (Benger, USA), Декстрафер (СССР), Ферридскстран (Leciva, CSSR) и комплексы IDC20A, IDC3, IDC33, IDC26 и IDC81. Мессбауэровские спектры железо-декстрановых комплексов измерялись на спектрометре ЯГРС-4 в замороженном растворе при 87 К, в лиофильно высушенной форме - при 87 и 295 К. Мессбауэровские спектры замороженных растворов (Рис. 26) свидетельствуют о том, что "железные" ядра в комплексах находятся в магнитном, суперпарамагнитном и парамагнитном состояниях при 87 К. При 295 К мессбауэровские спектры всех комплексов представляют собой квадруполыю расщепленные дублеты, что указывает на парамагнитное состояние "железных" ядер. Известно, что в мессбауэровских спектрах мелкодисперсных частиц оксигидроокисей железа форма линий парамагнитного дублета отличается от лоренцевой. Поэтому спектры обрабатывались по двум моделям: в предположении структурной однородности "железных"

а

б в

г

6.0 L -1-1-1-1-1_

-8 -4 0 4 8

СКОРОСТЬ, ми/с

Рис. 26. Мессбауэровские спектры замороженных растворов железо-декстрановых комплексов: а - Декстрафер; б - Имферон (Benger, USA); в - IDC20A; г - IDC3. Т-87 К.

ядер парамагнитная компонента описывалась одним квадрупольным дублетом и в предположении структурной неоднородности "железных" ядер парамагнитная компонента описывалась суперпозицией двух и более квадрупольных дублетов. В результате аппроксимации спектров по первой модели был сделан вывод, что железо в ядре Декстрафера находится в форме a-FeOOH с некоторым разбросом по размерам ядер, в Имфероне (Benger, USA) и IDC26 - железо находится в форме ß-FeOOH, в остальных комплексах железо также находится в форме (VFeOOII, однако, с несколько меньшими размерами ядра. Кроме того, в мсссбауэровском спектре Ферридекстрана выявлена дополнительная компонента (4 %), свидетельствующая о наличии примеси двухвалентного железа. Сравнение величин AEq для парамагнитных компонент спектров железо-декстрановых комплексов показало, что есть небольшие отличия для разных комплексов, которые указывают на микроструктурные различия "железных" ядер, в частности, на большее или меньшее октаэдрическое искажение и на степень кристалличности. Результаты аппроксимации мсссбауэровских спектров железо-декстрановых комплексов по второй модели показывают, что все спектры удовлетворительно описываются суперпозицией двух дублетов. Использование суперпозиции трех и более дублетов позволяло удовлетворительно аппроксимировать лишь часть спектров. Этот факт указывает на внутреннюю

неоднородность "железных" ядер в комплексах.

Во втором параграфе обсуждаются результаты исследования микроструктурньс отличий в железо-декстрановых комплексах методами аннигиляции позитронов - измеренш спектров угловых корреляций анпигиляционного излучения и спектров времени жизш позитронов. Параметры спектров угловых корреляций аннигиляционного излучения i времени жизни позитронов позволили оценить средний радиус ячеек свободного объема i относительный полный свободный объем в комплексах, которые свидетельствуют ( микроструктурных отличиях в декстрановой оболочке, в частности, о различии плотности i ветвистости декстрана и проницаемости оболочки для ионов СГ. Особо следует отметит] отличие спектра времени жизни позитронов для Ферридекстрана (Рис. 27), параметрь которого характеризуют более высокое содержание свободных ионов Fe2+ в растворе.

3,0 2'5

н о

О « 2,0 В

в е

S 1 1,5 и 's Я S" «=-1,0 S

0,5 0,0

1 51 101 151 201 251 301 351 401 4J1 НОМЕР КАНАЛА

Рис. 27. Спектры времени жизни позитронов железо-декстрановых комплексов: а - Имферон; б - Ферридекстран. Т=295 К.

В третьем параграфе обсуждаются результаты гистологических и гистохимическю исследований железо-декстрановых комплексов, проведенных в Гематологическом научнок центре РАМН. Исследованы несколько промышленно производимых препаратов i разрабатываемых комплексов. Оценено распределение железа в тканях и клетках животные после введения неэффективного препарата Декстрафер, эффективного препарата Имфери (Benger, USA) и комплексов IDC20A, IDC3, IDC33 и IDC26. Оказалось, что после введеню комплексов IDC20A и IDC3 железо аккумулировалось также, как и после внедени: Декстрафера, не дающего требуемого эффекта. Напротив, часть железа комплексов IDC33 i IDC26 аккумулировалось в организме животных также, как после введения Имферона.

В четвертом параграфе рассматриваются результаты второй серии исследования железо-декстрановых комплексов, проведенной с использованием более чувствительного мессбауэровского спектрометра СМ-2201. Исследованы образцы Имфсрона (Fisons, UK), IDC87, IDC3I1, ШС4П, ШС6П и ШС8П в растворе и в лиофильно высушенной форме. Для сравнения были проведены повторные измерения мессбауэровских спектров Имферона (Benger, USA), Декстрафера (СССР), Ферридскстрана (Leciva, CSSR), IDC26 и IDC81. Мессбауэровские спектры замороженных растворов (Рис. 28 и 29) большинства комплексов

Рис. 28. Мессбауэровские спектры замороженных растворов железо-декстрановых комплексов: а - ГОСЗП; 6 - ГОС4П; в - ГОС6П; г - ГОС8П; д - Ферридекстран; е ~ ГОС87; ж - ШС81; з - Имферон ^¡бопэ, иК). Т=87 К. 1 и 2 - результат обработки двумя квадрупольными дублетами, 3 - примесь соединения высокоспинового Ре2'.

СКОРОСТЬ, «я*

Рис. 29. Мессбауэровские спектры замороженных растворов железо-декстрановых комплексов: а - Декстрафер (1 - парамагнитная компонента, 2-6 - магнитные компоненты); 6 - Имферон (Benger, USA); в - IDC26 (1 и 2 - парамагнитные компоненты, 3 - примесь соединения высокоспинового Fe2+, 4 и 5 - магнитные компоненты). Т=87 К.

содержат небольшое количество примеси двухвалентного железа (от 3 до 9 %): Мессбауэровские спектры комплексов аппроксимировались по двум вышеупомянутым моделям. При аппроксимации в предположении структурной однородности "железных" ядер обнаружено отличие в величинах ДЕд и Г как для одинаковых лиофильно высушенных образцов, измеренных при 295 и 87 К, так и для одинаковых образцов в лиофильно высушенной форме и в растворе, измеренных при 87 К (Рис. 30). Более того, обнаружено отличие ДЕд для различных комплексов, измеренных в одинаковой форме и при одинаковой температуре (Рис.31). Эти результаты указывают на микроструктурные отличия е "железных" ядрах комплексов, связываемые как с процессом лиофильной сушки, так и с процессом приготовления образцов, которые приводят к изменению симметрии локального окружения ионов железа и степени кристалличности.

Рис. 30.

Отличие квадрупольного расщепления (а) и ширины линии (ff) для мессбауэровских спектров железо-декстрановых комплексов в лиофильно высушенной форме и в замороженном растворе (Т=87 К). 0- ГОСЗП; ШС4П; Д- ГОСбП; О- ЮС8П; IDC87; Ферридекстран; А~ Имферон (Fisons, USA). FS - замороженный раствор, L - лиофильно высушенная форма.

Чппроксимация мессбауэровских спектров по второй модели также показала, что только :уперпозиция двух квадрупольных дублетов удовлетворительно описывает парамагнитную сомпоненту всех спектров. Параметры мессбауэровских спектров, оцененные в результате тпроксимации по второй модели, даны в Таблице 5. Полученные результаты :видетельствуюх о различии величины АЕд у различных комплексов для первого и второго (ублетов, соответственно. Кроме того, имеется отличие в соотношении площадей дублетов

0,300

0,400

0,320 0,340 0,360 0,380 ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с Рис. 31. Отличие квадрупольного расщепления для лиофильно высушенных железо-декстрановых комплексов: ЮСЗГ1; А-ГОС4П; О- ГОС6П; Д- ГОС8П; Я-IDC87; 0- Ферридекстран; □- Имферон (Fisons, USA). Т=295 К.

Таблица 5.

Параметры мессбауэровских спектров железо-декстраиовых комплексов при аппроксимации

парамагнитной компоненты суперпозицией двух дублетов.

Образец Форма* Т,К Г, мм/с 6, мм/с ДЕф мм/с Нэфф, кЭ s,%

ШСЗП L 295 0,425±0,020 0,36010,010 0,91810,010 - 58 0,19

0,297±0,020 0,36410,010 0,55410,010 - 42

L 87 0,567±0,026 0,45010,013 0,92810,013 - 60 0,28

0,38710,026 0,47810,013 0,57710,013 - 40

FS 87 0,512±0,032 0,44110,016 0,91010,016 - 52 1,26

0,37410,032 0,46410,016 0,58310,016 - 48

ГОС4П L 295 0,39110,020 0,35510,010 0,96610,010 - 42 0,57

0,352±0,020 0,35710,010 0,56810,010 - 58

L 87 0,455±0,026 0,45410,013 0,99910,013 - 42 0,21

0,409+0,026 0,46210,013 0,58010,013 - 58

FS 87 0,42310,032 0,43710,016 0,98610,016 - 32 1,41

0,389±0,032 0,45810,016 0,57910,016 _ 64

Примесь Fe2+ 0,4426 1,28810,016 2,49110,016 - 4

ГОС6П L 295 0,449±0,020 0,36310,010 0,93210,010 - 57 1,07

0,320+0,020 0,362+0,010 0,56610,010 - 43

L 87 0,476±0,026 0,45210,013 1,06510,013 - 44 0,43

0,406+0,026 0,47310,013 0,59210,013 _ 52

Примесь Fc^■ 0,396±0,026 1,32810,013 2,542+0,013 - 4

ГОС6П FS 87 0,41610,03 2 0,43610,016 1,03210,016 - 33 1,53

0,372+0,032 0,46810,016 0,60410,016 - 58

Примесь Fe^+ 0,538° 1,39010,016 2,67610,016 - 9

ГОС8П L 295 0,45 6±0,020 0,36610,010 0,921+0,010 - 60 0,44

0,306Ю,020 0,37210,010 0,54710,010 - 40

L 87 0,764+0,026 0,46110,013 0,88310,013 - 84 0,16

0,38210,026 0,47310,013 0,56210,013 - 16

FS 87 0,578+0,032 0,44610,016 0,920+0,016 - 60 1,88

Примесь Fe2+ 0,35810,032 0,47110,016 0,578+0,016 - 35

0,6036 1,45510,016 2,22310,016 - 5

IDC26 FS 87 0,47310,084 0,46010,042 1,02910,042 - 19 1,70

0,41010,084 0,49810,042 0,62310,042 - 32

0,38110,042 -0,22310,042 390,111,5 23

0,41610,042 -0,033+0,042 278,411,5 20

Примесь Fc2' 0,596® 1,48510,042 2,31310,042 - 6

IDC87 L 295 0,44710,016 0,34610,008 0,95910,008 _ 36 2,00

0,41510,016 0,35210,008 0,57010,008 - 64

L 87 0,54210,032 0,45610,016 0,91310,016 - 56 1,11

0,41110,032 0,473Ю,016 0,54310,016 - 44

FS 87 0,509+0,032 0,43610,016 0,94110,016 _ 32 1,43

0,44610,032 0,45510,016 0,55810,016 _ 59

Примесь Fe2+ 0,73010,032 1,36210,016 2,60010,016 - 9

IDC81 FS 87 0,47010,032 0,45910,016 0,90610,016 _ 55 1,25

0,34910,032 0,469+0,016 0,55410,016 - 45

aL - лиофильно высушенная форма, FS - замороженный раствор. Фиксированный параметр

аблнца 5. (Продолжение).

араметры мессбауэровских спектров железо-декстрановых комплексов при аппроксимации

фамагнитной компоненты суперпозицией двух дублетов.

Образец Форма" Т,К Г, мм/с 5, мм/с ДЕ0, мм/с Н,фф, кЭ в,0/» х2

Оерридекстран 1 295 0,424+0,016 0,349±0,008 0,965±0,008 - 39 0,92

0,40б±0,016 0,351±0,008 0,561+0,008 - 6!

Ь 87 0,452±0,026 0,455±0,013 1,069+0,013 - 34 0,15

0,501+0,026 0,458+0,013 0,565±0,013 - 66

Рв 87 0,504±0,032 0,442+0,016 0,994±0,016 - 44 1,16

0,44 б±0,032 0,454+0,016 0,532±0,016 _ 48

1римесь 0,5616 1,481±0,016 2,352±0,016 - 8

1мферон Ь 295 0,467±0,020 0,353+0,010 0,943±0,010 - 47 0,33

Р^зопв, (Ж) 0,383±0,020 0,361±0,010 0,547+0,010 - 53

ь 87 0,556±0,020 0,456+0,010 0,953±0,010 - 60 0,17

0,421 ±0,020 0,465±0,010 0,512+0,010 - 40

РБ 87 0,468+0,032 0,440±0,016 0,975±0,016 - 39 2,36

0,404+0,032 0,466+0,016 0,565+0,016 _ 57

1римесь Ре2х 0,484° 1,430+0,016 2,605±0,016 - 4

1мферои 87 0,545±0,084 0,479+0,042 0,918±0,042 - 41 2,18

Вег^ег, иЭА) 0,371±0,084 0,507±0,042 0,553±0,042 - 28

0,476±0,042 -0,283±0,042 484,9+1,5 12

0,485±0,042 -0,283+0,042 458,9± 1,5 14

1римесь Ре^+ 0,5406 1,576е 2,5366 - 5

' ' 11 ё - лиофильно высушенная форма, РЯ - замороженный раствор. Фиксированный параметр.

[я мессбауэровских спектров различных комплексов. Это свидетельствуег о наличии 1 кроструктурнг,гх отличий у "железных" ядер. Возможно наличие, по меньшей мере, двух ¡ластей с несколько различающимися структурными характеристиками у каждого ядра или ух неэквивалентных позиций ионов железа, например, в поверхностном слое «рочастицы и во внутреннем, либо с иными неоднородностями в структуре "железного" ра, обусловленными наличием областей с большим или меньшим октаэдрическим кажением или с разной степенью кристалличности.

ЗАКЛЮ ЧЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Цель настоящей работы состоит в изучении связи молекулярной структуры, состояния на железа и мессбауэровских параметров железосодержащих биомолекул и их моделей именительно к биофизическим и биомедицинским задачам на примере исследования моглобина и железо-декстрановых комплексов с различной молекулярной структурой, шовной метод исследования - мессбауэровская спектроскопия - дополнен теоретическими антово-химическими оценками электронной структуры и мессбауэровских параметров,

измерением сродства гемоглобина к кислороду и измерением спектров угловых корреляций аннигиляционного излучения и времени жизни позитронов. В рамках поставленной задачи был проведен следующий комплекс исследований по изучению связи микроструктурных особенностей гемоглобинов и железо-декстрановых комплексов, физических параметров и биологических функций данных биомолекул.

Изучены нормальные фетальный и взрослый гемоглобины человека, отличающиеся молекулярной структурой и функциями, и нормальный гемоглобин, модифицированный путем лиофильной сушки и молекулярными эффекторами. Проанализированы особенности мессбауэровских спектров гемоглобинов и их параметров. Проведены квантово-химические расчеты для моделей субъединиц в тетрамере гемоглобина. Показана взаимосвязь мессбауэровских параметров, электронной структуры железа и стереохимии активного центра в нормальных гемоглобинах человека с различной молекулярной структурой и в модифицированных гемоглобинах, связь особенностей мессбауэровских спектров гемоглобинов и их микроструктурных отличий.

Исследованы гемоглобины больных злокачественными заболеваниями системы крови (лейкозами и эритремией). Получены оценки мессбауэровских параметров, характеризующие трансформацию электронной структуры железа в оксигемоглобинах больных и небольшие структурные отличия в области активного центра, которые должны оказывать влияние на функциональные свойства бежа. Измерение сродства к кислороду показало его отличие для гемоглобинов больных злокачественными заболеваниями системы крови.

Исследованы процессы структурных нарушений в гемоглобине в процессе естественной деградации, действия ионизирующего излучения и микроволнового нагрева По данным мессбауэровской спектроскопии определены продукты разрушения гемоглобина предложены схемы радиолиза белка, показано различие действия на гемоглобин ионизирующего излучения разной энергии и типа (гамма-лучи и электроны) ? микроволнового нагрева. Получены параметры времени жизни позитронов для данных процессов, выявлена их корреляция с конформационным состоянием гемоглобина, показана связь изменений параметров с изменением структуры всей молекулы под действиеы ионизирующего излучения.

Изучены микроструктурные особенности ряда железо-декстрановых комплексов являющихся фармацевтически важными моделями белка ферритина. Получены данные характеризующие отличия в структуре "железного" ядра различных комплексов проанализирована структурная неоднородность ядер как в различных комплексах, так и I различных формах (в лиофильно высушенной и в замороженном растворе), показанс

озможное влияние на структуру эффектов старения, выявлена железосодержащая примесь о многих образцах. Проведен анализ мессбауэровских параметров с учетом известных редставлений о мелкодисперсных частицах оксигидроксидов железа. Получены оценки араметров электрон-позитрояной аннигиляции, позволившие выявить структурные тличия в декстрановой оболочке, а именно, ее проницаемости для ионов хлора, плотности и етвистости декстрана.

На основании проведенных исследований можно сделать следующие основные ыводы.

1. Впервые методом мессбауэровской спектроскопии исследованы нормальные етальный и взрослый гемоглобины человека с известными различиями в молекулярной груктурс и функциях, гемоглобин человека, модифицированный пиридоксальфосфатом и гутаровым альдегидом (искусственный переносчик кислорода), и лиофильно высушенный ксигемоглобин человека.

2. Исследована форма линий мессбауэровских спектров гемоглобина. Обнаружена ;имметрия формы линий поглощения в спектрах различных оксигемоглобинов в растворе ри температуре 87 К и близкая к лоренцевой форма линий поглощения для лиофильно осушенного оксигемоглобина при 87 и 295 К.

3. Проведена аппроксимация мессбауэровских спектров нормальных гемоглобинов, опочая модифицированные, в рамках двух моделей: без учета и с учетом ¡эквивалентности электронной структуры Ре(П) в а-, р- и у-субъединицах тетрамерных гмоглобинов. Для каждой модели получены соответствующие отличия в параметрах кгрхтоккой структуры мессбауэровских спектров для различных гемоглобинов.

4. Впервые проведена теоретическая оценка неэквивалентности электронной структуры :(П) и мессбауэровских параметров для моделей а- и р-субъединиц в гетрамерном ¡зоксигемоглобине и для модели дезоксимиоглобина. Получены отличия электронной руктуры и рассчитанных величин квадрупольного расщепления для моделей, имеющих 1нкие отличия стереохимии железа в активных центрах.

5. Предложена интерпретация особенностей мессбауэровских спектров геигемоглобина как следствия различия молекулярной и электронной структур активных :нтров в неидентичных субъединицах белка.

6. Впервые исследованы гемоглобины больных злокачественными заболеваниями ¡стемы крови (лейкозами и эритремией). Обнаружены отличия параметров сверхтонкой руктуры мессбауэровских спектров оксигемоглобина здоровых и больных людей, .швлено изменение функциональных свойств гемоглобинов больных лейкозами и

эритремией. В эритроцитах некоторых больных эритремией обнаружена дополнительна; ферритиноподобная компонента.

7. Предложена интерпретация изменения параметров сверхтонкой структур! мессбауэровских спектров оксигемоглобина при лейкозах и эритремии как следств® трансформации электронной структуры железа и структурных изменений в дистально: области гема.

8. Впервые проведено исследование действия у-излучения и электронов н оксигемоглобин в сравнении с естественной деградацией оксигемоглобина и микроволновьп нагревом белка методами мессбауэровской спектроскопии и спектроскопии времени жизн! позитронов.

9. Получены новые данные о структурных изменениях оксигемоглобина пр облучении, по мессбауэровским параметрам оценены вероятные продукты деструкции белк. образующиеся в результате действия внешних факторов на оксигемоглобин. Предложен] схемы процессов радиолиза оксигемоглобина.

10. Впервые проведено комплексное исследование различных железо-декстрановы комплексов (фармацевтически важных моделей белка ферритина) методами мессбауэровско спектроскопии и аннигиляции позитронов. Исследованы промышленно производимы фармацевтические препараты и разрабатываемые комплексы.

11. Обнаружены отличия параметров мессбауэровских спектров как для различны железо-декстрановых комплексов, так и для одинаковых комплексов в лиофильн высушенной форме и в замороженном растворе. Выявленные отличия в сверхтонки параметрах мессбауэровских спектров железо-декстрановых комплексов позволил проанализировать микроструктурные отличия "железных" ядер в разных комплексах бе учета и с учетом структурной неоднородности ядер.

12. Обнаружены некоторые отличия параметров спектров угловых корреляци аннигиляционного излучения и спектров времени жизни позитронов различных железо декстрановых комплексов, характеризующие отличия в молекулярной массе декстрана, ег ветвистости, плотности декстрановой оболочки и ее проницаемости для ионов хлора.

В целом полученные результаты характеризуют чувствительность параметре мессбауэровских спектров к небольшим структурным отличиям в железосодержащи биомолекулах и их моделях, свидетельствуют о важности учета взаимосвязи изменени локальной молекулярной структуры и электронной структуры ионов железа в биологически молекулах для более глубокого понимания молекулярных основ их функционирования норме и при развитии патологии и определяют широкую перспективу дальнейшего развити

:ледований связи молекулярной структуры, состояния иона железа и мессбауэровских >аметров железосодержащих биомолекул и их моделей применительно к биофизическим и медицинским задачам.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих статьях: Оштрах М.И., Семёнкин В.А. Исследование формы линий у-резонансного поглощения в дезокси- и оксигемоглобине. Биофизика. 1983,28, № 1, с. 128-129. Минц Р.И., Оштрах М.И., Семёнкин В.А. Исследование формы линий у-резонансного поглощения оксигемоглобина крови при лейкозе. Биофизика 1984,29, № 2, с. 310-312. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. Mossbauer Spectra Parameters and Molecular Structure of Normal Hemoglobins. In: Application of the Mossbauer Effect. Eds. Kagan Yu.M., Lyubutin I.S. -New York: Gordon and Breach Science Publishers, 1985, v. 5. - P. 1633-1638. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. The Use of Mossbauer Spectroscopy in Investigating FeJ+ Electron Structure Transformation in Oxyhemoglobin. In: Applications of the Mossbauer Effect. Proc. Int. Conf. Appl. M6ssbauer Effect 1983. Eds. Kagan Yu. M., Lyubutin I.S. -Gordon and Breach Science Publishers, 1985, v. 5. - P. 1639-1642.

Оштрах М.И., Семёнкин В.А. Исследование нормальных фетального и взрослого гемоглобинов человека методом мессбауэровской спектроскопии. Молекулярн. биология. 1985,19, №5, с. 1310-1320.

Oshtrakh M.I., Senionkin V.A. Mossbauer Spectroscopy of Haemoglobins. Study of the Relationship of Fe2+ Electronic and Molecular Structure of the Active Site. FEBS Letters. 1986, 208, p. 331-336.

Минц Р.И., Оштрах М.И. Изучение патологических состояний организма методом ядерной гамма-резонансной (мессбауэровской) спектроскопии. Арх. патологии. 1986, 48, № 11, с. 82-87.

Оштрах М.И., Семёнкин В.А. Изменение параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров оксигемоглобина при лейкозах. Биофизика. 1987, 32, № 2, с. 197-202.

Бурыкин Б.Н., Хлесков В.И., Оштрах М.И., Семёнкин В.А. Отличие мессбауэровских параметров и электронной структуры активных центров неэквивалентных субъединиц тетрамерного дезоксигемоглобина и дезоксимиоглобина. Молекуляр. биология. 1987, 21, №6, с. 1677-1685.

Оштрах М.И., Семёнкин В.А. Возможности мессбауэровской спектроскопии гемоглобина в контроле системы "окружающая среда - человек". В кн.: Ядерно-

физические методы анализа в контроле окружающей среды. - Д.: Гидрометеоиздат 1987.-С. 76-84.

11. Минц Р.И., Ошпрах М.И. Изменение биосинтеза гемоглобина и ферритина при лейкозах по данным мессбауэровской спектроскопии. Эксперим. онкология. 1987, 9, № 1,с. 53-57.

12. Khleskov V.l., Burykin B.N., Smirnov A.B., Oshtrakh M.I. Comparative Quantum-Chemica Analysis of the Electronic Structure and Mössbauer Parameters of the Active Site Models fo Deoxymyoglobin and a- and ß-Subunits of Tetrameric Deoxyhemoglobin. Biochem Biophys. Res. Communs. 1988,155, p. 1255-1260.

13. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. Mössbauer Study of Red Blood Cells from Patients witl Erythremia. FEBS Letters. 1989,257, p. 41-44.

14. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A., Burykin B.H., Khleskov V.l. Interpretation of Mössbaue Spectra of Deoxyhemoglobin Taking into Account the Non-Equivalence of the Fe2 Electronic Structure in Different Submits. Molecular Phys. 1989,66, p. 531-535.

15. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. Study of Malignant Blood System Diseases by Mössbaue Spectroscopy. Stud Biophys. 1990,139, p. 157-164.

16. Oshtrakh M.I. Biomedical Applications of the Mössbauer Effect. Hyperfine Interact. 1991 66, p. 127-139.

17. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. Mössbauer Effect Study of Gamma Irradiated Humaj Oxyhemoglobin. Radiat. Environ. Biophys. 1991, 30, p. 33-44.

18. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. Oxyhemoglobin Radiolysis Studied by Mössbaue Spectroscopy. In: Nuclear Medicine: Nuclear Medicine in Research and Practice. Eds Schmidt H.A.E., Höfer R. - Stuttgart-New York: Schttauer, 1992. - P. 285-288.

19. Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A., Livshits A.B., Krylova V.E., Kozlov A.A Positron Annihilation and Mössbauer Effect Studies of Iron-Dextran Complexes. Mater. Sei Forum 1992,105-110, p. 1679-1682.

20. Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A. Oxyhemoglobin Degradation and Radiolysi: Analysed by Mössbauer and Positron Annihilation Techniques. Anal. Chim. Acta 1993, 279 p. 179-183.

21. Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A., Livshits A.B., Krylova V.E., Kozlov A.A Mössbauer and Positron Annihilation Studies of Pharmaceutical^ Important Irorv-Dextrai Complexes. Nucl. Instr. Meth. in Phys. Res. 1993, B76, p. 405-407.

22. Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A., Livshits A.B., Krylova V.E., Prostakov;

T.M., Kozlov A.A. An Analysis of Iron-Dextran Complexes by Mössbauer Spectroscopy and Positron Annihilation Technique. J. Inorg. Biochem. 1994,54, p. 285-295. Oshtrakh M.I. Comparison of Human Oxyhemoglobin in Lyophilized Form, Red Blood Cells, and Concentrated Solution: the Features of Mössbauer Spectra and Heme Iron Stereochemistry. J. Inorg. Biochem. 1994,56, p. 221-231.

Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A., Livshits A.B., Kozlov A.A. Mössbauer and Positron Annihilation Studies of Microstructural Peculiarities of Iron-Dextran Complexes. J. Radioan. Nucl. Chem. 1995,190, p. 449-455.

Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A. Mössbauer and Positron Annihilation Studies of Structural Modifications of Hemoglobin in Solution. J. Radioanal. Nucl. Chem. 1995,190, p. 243-249.

Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A. Mössbauer and Positron Annihilation Study of Oxyhemoglobin Exposed to y-Rays and Electrons. Radiat. Phys. Chem. 1996, 47, p. 399403.

Oshtrakh M.I., Kopelyan E.A., Semionkin V.A. Mössbauer and Positron Life-Time Spectroscopy ofy- and Electron Irradiated Oxyhemoglobin Solution. Nucl. Instrum. Meth. in Phys. Res. 1997, B131, p. 226-231.

Oshtrakh M.I. The Features of Mössbauer Spectra of Hemoglobin in Relation to the Quadrupole Splitting and Heme Iron Stereochemistry. Z. Naturforsch. 1998, 53a, p. 608-614. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A., Kopelyan E.A., Milder O.B. Mössbauer and Positron LifeTime Study of Oxyhemoglobin Solution Irradiated by Electrons. Rad. Phys. Chem. 1999, 55, p. 549-554.

Oshtrakh M.I., Semionkin V.A., Milder O.B. Mössbauer Study of Oxyhemoglobin Solution Exposed to Electrons and Microwave Heating. Nucl. Instrum. Meth. in Phys. Res. 1999, B151, p. 227-231.

Oshtrakh M.I. Mössbauer Spectroscopy of Iron Containing Biomolecules and Model Compounds in Biomedical Research. J. Mol. Struct. 1999,480-481,109-120. Oshtrakh M.I. Mössbauer Spectroscopy in Biomedical Research. Medical. & Biol. Engin. & Compt. 1999,37, Suppl. 2, Pt. 1,610-611.

Oshtrakh M.I., Milder O.B., Semionkin V.A., Berkovsky A.L., Azhigirova M.A., Vyazova E.P. Mössbauer Effect Study of Modified Human Hemoglobin. In: Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions. Eds. Greve J., Puppeis G.J., Otto C. - Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1999. - P. 137-138.

34. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A., Milder O.B., Livshits A.B., Kozlov A.A. Comparative Study of the Iron in Pharmaceutical^ Important Iron-Dextran Complexes by Mössbauer Effect. In: Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions. Eds. Greve J., Puppeis G.J., Otto C. -Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1999. - P. 547-548.

35. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A., Milder O.B., Livshits A.B., Kozlov A.A. Quadrupole Splitting and Paramagnetic Iron Core Structure in Iron-Dextran Complexes: A Mössbauer Effect Study. Z. Naturforsch. 2000, 55a, p. 186-192.

36. Oshtrakh M.I., Milder O.B., Semionkin V.A., Berkovsky A.L., Azhigirova M.A., Vyazova E.P. Variation of Quadrupole Splitting in Modified Oxyhemoglobin: A Mössbauer Effect Study. Z. Naturforsch. 2000,55a, p. 193-198.