Металл-, металлоксидные электроды для определения глюкозы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

и и ~ ;/' ■ у ~ а ;

Казанский государственный университет

На правах рукописи

Б АКАНЙНА ЮЛИЯ НИКОЛАЕВНА

МЕТАЛЛ-, МЕТАЛЛОКСИДНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ГЛЮКОЗЫ

02.00.02 - аназшшческаж химия

Диссертация на соискание ученой степени . химических наук

Научные руководатезш: доктор} химических наук профессор Абдузвшн Й.Ф., доктор хнзшмесжих наук профессор Будииков Г.К.

Казань, 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

'-¿М-

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................5

Глава 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ (ЛШЕРАТШШЙ ОБЗОР)

1.1. Химические методы......................................................................................9

1.2. Электрохимические методы........................................................................11

1.3. Спектральные методы..................................................................................24

1.4. Термические, электрические и другие методы...........................................27

1.5. Различные типы детекторов в проточно-инжекционном анализе глюкозы.......................................................................................................30

1.6. Унифицированные лабораторные методы..................................................35

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Приборы, ячейки, установки.......................................................................41

2.2. Электроды...................................................................................................43

2.3. Методика эксперимента...............................................................................45

2.4. Растворы и реактивы....................................................................................50

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЛЬТАМШРОМЕТРИЧЕСКОГО

ПОВЕДЕНИЯ МЕТАЛЛИЧЕСКИХ И УГОЛЬНО-ПАСТОВЫХ ЭЛЕКТРОДОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОКСИДАМИ МЕТАЛЛОВ В ПРИСУТСТВИИ ГЛЮКОЗЫ............................................51

3.1. Графит и платина..........................................................................................52

3.2. Медь

3.2.1 Металлический медный электрод...............................................................53

3.2.2. Угольно-пастовые электроды на основе оксидов меди (1,11)...................63

3.3. Ртутный и медноамальгамный электроды....................................................б

3.4. Серебряный электрод...................................................................................69

.4

3.5. Золотой электрод..........................................................................................73

3.6. Никель

3.6.1. Металлический никелевый электрод.........................................................81

3.6.2. Угольно-пастовый электрод, модифицированный оксидом

НЕжеж (II)..................................................................................................86

3.7.Ко6зльт

3.7.1. Металлический кобальтовый электрод......................................................87

3.7.2. Угольно-пастовый электрод, модифицированный оксидом

кобальта (II)...............................................................................................90

3.8. Свинцовый и висмутовый электроды...........................................................92

Глава 4. ВОЛЫАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ, ВИНАХ И ВННОМАТЕРИАЛАХ И ОЦЕНКА МЕШАЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ ПРИСУТСТВИЯ МОЛОЧНОЙ, МОЧЕВОЙ, АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТ И НЕКОТОРЫХ

АМИНОКИСЛОТ

4.1. Оценка мешающего влияния молочной, мочевой, аскорбиновой кислот и некоторых аминокислот на вольтамперометрическое определение

глюкозы на металлических электродах........................................................98

4.2. Вольтамперометрическое определение глюкозы в сыворотке -

крови...........................................................................................................109

4.3. Проточно-инжекционное определение глюкозы........................................113

4.4. Вольтамперометрическое определение сахара в винах и виноматерпалах............................................................................................116

Глава 5. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ УГЛЕВОДОВ НА МЕТАЛЛИЧЕСКИХ ЭЛЕКТРОДАХ.........................................................................................121

Глава б. КУЛОНОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ

6.1. Определение глюкозы с помощью электрогекерироваиного

реактива Фелинга.......................................................................................127

6.2. Определение глюкозы с помощью элекгрогенернрованного гжюбромита..............................................................................................128

6.3. Определение глюкозы с помощью феррициашщакалня........................129

6.4. Исследование и разработка способа косвенного кулонометрического определения глюкозы по расходу кислорода...........................................131

ВЫВОДЫ..........................................................................................................142

ЛИТЕРАТУРА....................................................................................................144

ПРИЛОЖЕНИЕ.................................................................................................164

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; Е - потенциал электрода, В; Еш - потенциал полуволны, В; Ел - потенциал пика, В; Ест - стационарный потенциал, в; АЕ - разность потенциалов на индикаторных электрода; I - сила тока, мА или мкА; С - концентрация М или мг/л; ПрОб - предел обнаружения; ПИА - проточно-инжекциооный анализ; УПЭ - угольно-пастоЕый электрод; КТТ - конечная точка титрования; Р - доверительная вероятность; 8г - относительное стандартное отклонение,

Пе - число электронов, принимающих участие в электрохимическом процессе;

п- количество определений;

1р - коэффициент Стъюдента;

Е-критерий Фишера;

х.с.э. - хлорндсеребряный электрод;

всп. э. - вспомогательный электрод;

г - коэффициент корреляции;

Т - температура, °С;

I - время, с или мин.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Глюкоза является одним из наиболее распространенных компонентов живых систем. Содержание ее, например, б крови и других биологических средах отражает состояние углеводного обмена организма. Определение сахара в крови имеет важное диагностическое значение не только при распознавании сахарного диабета, но и при установлении диагноза и лечении некоторых эндокринных, нервно-психических и других заболеваний. Глюкоза является также главным компонентом питательных сред микроорганизмов и культивирования клеток теплокровных. И, наконец, глюкоза народу с другими сахарами является составным компонентом пищевых продуктов.

Применяемые в настоящее время в практике отечественных клинических лабораторий методы определения глюкозы в крови (орто-толунднновый метод) имеют существенные недостатки, среди которых основными являются неспецифичностъ и относительная трудоемкость. В шестидесятых годах в связи с развитием энзнмологни появились работы по определению глюкозы с помощью ферментов. Основным преимуществом ферментативных методов является высокая специфичность определения, обусловленная особенностями ферментативного катализа. Но несмотря на очевидные достоинства ферментных электродов они не лишены недостатков, основным из которых является нестабильность в работе как самих устройств, так и стоимость иммобилизованных ферментов.

Интенсивные исследования, проводимые в последние годы по созданию и совершенствованию различных датчиков, устанавливающих присутствие глюкозы, свидетельствуют о том, что проблема разработки новых

экспрессных, точных н специфичных методов и устройств для определения глюкозы в различных объектах остается нерешенной. Поэтому поиск других альтернативных методов определения Сахаров, в том числе и глюкозы, б растворах представляет актуальную задачу.

Целью настоящего исследования явилось изучение и разработка электрохимических методов, основанных на зтринципах использования металл-, металлоксидных электродов, для определения глюкозы в различных объектах.

Б связи с этим были поставлены следующие задачи : •изучить вольтамперометрическое поведение различных металлических и металлоксидных электродов в щелочных растворах в присутствии глюкозы и некоторых других угяеводоЕ. Выявить природ}? амперометрического и потенцнометрнческого отклика электродов на содержание глюкозы и некоторых Сахаров.

•найти рабочие условия и разработать способ Больтамперометрнческого определения глюкозы в стационарном и проточно-ннжекцнонном режимах, и оценить влияние ряда сопутствующих соединений и Сахаров на результаты определения.

•исследовать прямые и косвенные способы кулонометрического определения глюкозы.

Научная новизна На основании вольтамперометрического исследования поведения металлических электродов на основе меди, медной амальгамы, серебра, золота, никеля, кобальта, свинца и некоторых металлоксидных элекгродоЕ в растворах гндроксида натрия в присутствии глюкозы и ряда других углеводов установлено, что эти электроды дают амперометрический отклик на глюкозу и некоторые другие углеводы, линейно

зависящий от их концентрадии. Вольтамперометрнческий сигнал обусловлен каталитическим окислением глюкозы и других углеводов оксидами металлов в соответствующих степенях окисления в щелочных растворах. Предложены возможные схемы электродных и химических реакций; катализирующих электрохимическое окисление.

Обнаружен потенциометрическнй отклик медного, серебряного, никелевого и кобальтового электродов, предварительно покрытых оксидными пленками, на глюкозу и другие сахара.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований разработаны вольтамперометрические способы определения содержания глюкозы в сыворотке крови (в стационарном и проточно-ннжекционном режимах) и сахара в винах и Енноматерналах. Разработанные методики кроме хорошей воспроизводимости (Зг не более 0,04) обеспечивают высокую производительность, что позволяет существенно сократить время анализа, отличаются простотой и не требуют больших экономических затрат.

Установлено, что электроды на основе меди, серебра, никеля и кобальта, предварительно покрытые оксидными пленками, могут быть использованы как потенциометрические детекторы на глюкозу и некоторые другие углеводы.

Разработаны кулонометрнческий способ определенна кислорода в водах и полярных органических соединениях, а также косвенный кулонометрнческий метод определения глюкозы по кислород}?.

На защиту выносятся:

•Интерпретация волмамперометрического поведения различных металлических и металлоксидных электродов в щелочных растворах в присутствии глюкозы и некоторых других углеводов.

•Совокупность результатов, харжтеризующих природу амперометрнческого и потенциометрического отклика электродов на глюкозу.

•Установленные рабочие условна вольтамперометрического, потенциометрического и кулонометрического определения глюкозы и некоторых Сахаров.

•Разработанные методики определения глюкозы в сыворотке крови и сахара в винах и виномагериалах, кислорода в водах и полярных органических соединениях.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийских конференциях по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика (Краснодар, 1996 и 1998г.), Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 1997г.), Международной конференции "1п1ета£юпз1 согшгезз оп апаЫка! скепизйт" (Москва, 1997г.), на 3 республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1997г.), на научной

Т /^Хг/К (^пРТГГТТТТ.Т Т< 'З'ЗОТГЛХ-ЛГП ТЛГ-17ТТПГ,Г^-Г-0 ^ТГЕТ ЛТр ТГПХГОА-Г^Г-ТГТ^Т-П I 1 007 Т I

Рез}шьтаты опубликованы в 5 статьях н 4 тезисах.

ГЛАВА 1

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ (жггературкый обзор).

11, ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Глюкозу в крови и моче можно определять титрованием раствором KííCuCIOejo] до появления зеленоватой окраски, которая сохраняется 30 секунд в крови и 60 секунд в моче или хлорамином Т, который количественно окисляет глюкозу в щелочной среде до муравьиной и уксусной кислот [1]:

Т? СПЛчТЛ\ЬЧГЧ о- W-П = Р Qn.,TsJR.-i -4- ТчЬГ'1 -и П /11 ч

rJ ит Г\ , ,1 /"> _ /-^xjf pí'.au i AT3r*r\r\LS /1

Для определения глюкозы в крови, моче и сахарных растворах наиболее удобными титрантами являются стандартные растворы меди (И). Глюкозу титруют раствором C11SO4 в присутствии NaOH, а также добавляют тартрагы, цитраты, ферроцианнды, глицерин, тноцианат [2].

Глюкозу можно определить с помощью стандартных растворов ванадия (II). Определение состоит в следующем : глюкозу переводят в

ГГ\Г\ ТГ» ¿STV-TTM ПрЛТГТрА ТЗТХТ-КЪ Г\ г- Гь & ТТТ.ТХТрТТТГр г ТТЛ* ЛУ\ГГТТ.ТЛ xi _ ТП-ГрТТТ"^ Ж ¿5ТТТ.Г III ü ТтЮТГЕГТ

in.M.iMvrwHa.t. *' * j/* 't 1 ' 1 ' v A i * /w I ПП i \ / | ^ulTiti > My» "гмН ' * ! *r 1 ' *..

полученные при этом 2,4-дишгтрофенижндразоны восстанавливают раствором VSO4, взятом в избытке и неизрасходованный VSO4 оттитровывают раствором KjCijCb.

КЖ>2 + + 6БГ = KNHj + 6V3+ + 2Н20 (1.3).

Периодаг калия (или натрия) является аналитическим реагентом, наиболее часто применяемым при количественном анализе углеводов [3]. Тате, для окисления глюкозы необходимо пять эквивалентов периодата:

-i- ЯП Г = wrnrvq ñto-- /1 а\

Для использования периодатного окисления при определении углеводной

функции было предложено несколько методов. В одном из них к образцу добавляют известное количество пернодата. Когда окисление завершено, избыток периодат-ионов определяют арсенитом натрия. В другом методе проводят спектрофотометрический анализ реакционной смеси до и после окисления.

А Г Л

Авторами [4] изучена стехиометрия реакции периодашого окисления альдогексоз (глюкозы, маннозы, галактозы) при комнатной и повышенной температуре с использованием метода, основанного на определении иодата в виде трниоднда и разработаны методики их тнтрнметрнческого определения. Метод удобен для применения в исследовательских и заводских лабораториях.

Используются также методы, основанные на окисление альдогексоз ионами серебра [3, 5]. Существуют два основных варианта окисления серебром. В одном из них в качестве реагента используется реактив Толленса (раствор оксида серебра в аммиаке или аминах). По окончании реакции определяют непрореагировавшие ионы серебра аргентометрнческнм методом. В другом, реакцию проводят с твердым оксидом серебра н титруют образовавшуюся карбоновую кислоту:

КСНО + А&О = КСООН + 2А§. (1.5).

Метод с использованием реактива Толленса достаточно быстрый, так как все реагенты находятся в растворе.

Реакция окисления альдегидов ионами двухвалентной ртути в принципе не отличается от окисления ионами серебра Ртутный окислительный реактив применяют в форме реактива Несслера или его модификаций :

ясно+к2нё14 + зкон=лсоок++да+н2о (1.6).

Метод включает иодометрнческое определение металлической ртути, выделяющейся при реакции.

Однако, прн определении глюкозы б биосубстрахах редко прибегают к химическим методам, так как они имеют ряд недостатков, главным из которых является неспецифичностъ. Кроме того, иногда окисление глюкозы протекает очень медленно, возникают трудности в установлении конечной точки титрования, вследствие чего получаются неточные результаты. В некоторых случаях реакцию окисления проводят при температуре кипения раствора или используют методы обратного титрования. Все это создает определенные неудобства и в последнее время клинические лаборатории стараются не использовать химические методы при определении глюкозы.

1.2. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И

ДРУГИХ УГЛЕВОДОВ.

Электрохимические биосенсоры для определения глюкозы, использующие фермент глюкозооксндазу, откосятся к числу наиболее исследованных и выпускаются в промышленном масштабе [б]. Как правило, это сенсоры амперометрнческого типа, в которых в качестве индикаторного электрода используют платину н измеряют ток окисления перокснда водорода - продукта ферментативной реакции. Однако интерес к биосенсорам для определения глюкозы постоянно остается е центре внимания широкого круга исследователей, что обусловлено необходимостью создания биосенсоров, позволяющих проводить определение глюкозы в различных условиях. Так, дня клинических исследований необходимо создание сенсоров, вживляемых в ткани для непрерывного контроля содержания глюкозы в организме человека, и одноразовых биосенсоров, которые могут быть применены пациентом в

домашних условиях. В последнем случае сенсор должен удовлетворять ряду требований таких, как возможность использования малого объема пробы крови, обеспечения стабильных и воспроизводимых показаний и невысокая стоимость.

ФЕРМЕНТНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ С АМПЕРОМЕТРИЧЕОСИМ

ДЕТЕК:ТИРОВАШ'ШМ.

Такие электроды содержат иммобилизованную на платине оксидазу. При катализе этим ферментом субстрат окисляется кислородом по схеме : Субстрат + Оо = Продукт + НзОз (1.7)

За ходом такой реакции можно следить по потреблению кислорода, так и по перекиси водорода Поэтому ферментные электроды изготобляют на основе кислородных и перекнсных электрохимических датчиков [7-9].

Ферментные электроды с амперометрическзш детектированием

перешей водорода.

В работе [10] описан биосенсор для определения глюкозы, представляющий собой углеродно-пастовый электрод, в котором диспергирован рутений, с последующей иммобилизацией на его поверхности глюкозооксидазы. Бносенсор используется как амперометрнческий датчик, позволяющий определять при катодном восстановлении Н2О2, который образуется в результате ферментативной реакции. Присутствие рутения на поверхности бносенсора существенно снижает перенапряжение водорода что приводит к значительному повышению чувствительности электрода по сравнению с сенсорами, сделанными только из углеродной пасты.

Предложена [11] конструшщя ашгерометркческого биосенсора для оп