Микробиологическая деструкция лигнина - основа технологических процессов биоделигнификации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ ИРКУТСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА Гадина Петровна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ЛИГНИНА - ОСНОВА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ БИОДЕЛИГНИФИКАЩИ 02.СЮ.03 - органическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Иркутск -1994

Работа выполнена в лаборатории биохимии лигнина Иркутского института органической химии СО РАК

Научные рукозодители: доктор химических наук, профессор

Ведущая организация: Сибирский научно-исследовательски

Защита диссертации состоится 2 6 опт. 1994 г. в час а заседании специализированного совета Д 063.32.02 по защит» диссертаций на соискание ученой степени кандидата химически наук при Иркутском государственном университете по адресу: г Иркутск, ул. Лермонтова 126, комн.430

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

университета.

Отзывы просим направлять по адресу: 664033, Иркутск, а/.'

4020, ИНУС, ученому секретарю специализированного совета.

Автореферат разослан 20 сен т. 1994 г.

Ученый секретарь специализированного

Е.А. БАБКИН

кандидат химических наук, старший научный сотрудник С.А. МЕДВЕДЕВА

Официальные оппоненты: доктор химических наук

A.A. СЕМЕНОВ

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Б.Л. ФИНКЕЛЬШГЕП

институт целлюлозы и картона

совета, кандидат химических наук

Т.Л.Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Общее ухудшение экологической ситуации повысило требования к безопасности производств, в том числе и целлюлозо-бумажной промышленности (ИБП). Технология получения целлюлозы использует серо- и хлорсодержащие продукты, которые в процессах варки и отбелки превращаются в дурнопахнуше (меркаптаны), токсичные и канцерогенные (диоксины) вещества, загрязняющие воздух и воду, а поэтому представляющие большую экологическую опасность. Существующие системы очистки не способны очистить до конца ни газообразные выбросы, ни стоки. В связи с необходимостью сохранения целлюлозно-бумажного производства и перевода его в ранг экологически безопасного, активно разрабатываются как новые способы получения целлюлозы, так и способы очистки стоков и отходящих газов.

Одно из направлений создания технологически безвредных процессов переработки древесины в целлюлозу и волокнистое сырье связано с использованием микроорганизмов.

Биотрансформация древесины микроорганизмами - естественный процесс, за счет которого происходит круговорот углерода в природе. Раз. ложение древесины осуществляется ассоциациями микроорганизмов, но наибольшей разрушающей способностью обладают базидиальные грибы, причем среди них отличают грибы белой гнили, которые могут разрушать преимущественно лигнин. Эту способность грибов белой гнили можно использовать при разработке биотехнологических процессов делигнификации в ЦБП на стадиях варки и отбелки.

Разработки технологий биоделигнификации применительно к ЦБП активно ведутся за рубежом. Но несмотря на значительное количество исследований, посвященных микробиологическому и ферментативному разложению целлюлозы, лигнина и моделирующих его соединений, биотехнология еще не стала составной частью технологий ЦБП. Это связано прежде всего с тем, что только в последние годы на основе работ по химии и физиологии биоразложения лигнина и фенолов, развиваются теоретические основы и практические подходы к этой проблеме.

Деструкция лигнина происходит в результате воздействия ферментов, продуцируемых микроорганизмами. Ключевым среди лигнинразрушающих ферментов считается лигниназа, которая способна катализировать окислительные реакции деструкции ароматического кольца и расщепления С-О-С и С-С связей алифатической цепи. Важную роль в освобождении лигнина играют гидролазы грибов, катализирующие разрушение лигноугле-

водной матрицы.

Эффективность биоделигнификации может быть обеспечена лишь в т случае, если ферментный комплекс грибов не содержит целлюлозразруша щих ферментов. Поэтому одно из направлений поиска путей интенсифик ции биоделигнификации строится на выделении новых активных культу обладающих избирательной лигниндеструктирущей способностью и испол зовании их в конкретных технологических процессах.

Цель работы - исследование микробиологической й ферментатива деструкции лигнина и целлюлозы, и выявление возможности избиратель® деструкции лигнина с сохранением качественных показателей целлюлоз! Для достижения изложенной цели были поставлены следующие задачи:

- скрининг активных лигниндеструктирующих базидиомицетов,

- изучение ферментативной активности исследуемых грибов и химичесю реакций, сопрововдавдих деструкцию лигнина,

- оптимизация условий для проявления максимальной лигнинолитическс способности,

- разработка основных подходов к технологическим процессам варки отбелки, включающим стадии биоделигнификации древесины и целлюло; ных полуфабрикатов.

Научная новизна работы. Впервые в качестве селективного деструр тора лигнина отобран и изучен базидиомицет Тгалегез уШозиз, а тага показана избирательность деструкции остаточного лигнина в лигноцеллк лозе грибом РЬапегосЬаеЪе защипеа. Установлена взаимосвязь степев биологической деструкции лигнина и целлюлозы. Найдены оптимальные ус ловия проявления микроорганизмами избирательной лигнинразрушанце способности. Впервые установлено, что биологическое воздействие изу ченных грибов на лигнин является окислительным процессом и приводит изменению химического и структурного состава лигнина. Биодеструкция функционализация лигнина облегчают его последувдую экстракцию.

Практическое значение работы. Оценен вклад и эффективность био логических стадий, введеных в технологическую цепь производства цел люлозы. Биоделигнификация древесины перед водно-этанольной варко увеличивает ее селективность, введение ступени биоделигнификации схему пероксидной отбелки дает возможность получить целлюлозу с бели зной на уровне товарного продукта. Эти процессы защищены патентом авторским свидетельством.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсувден на 3 научном семинаре "Превращения древесины при энзиматическом :

микробиологическом воздействиях". Рига, 1988; на 6 межреспубликанской школе-семинаре "Исследования в области химии древесины", Рига, 1991; на международной конференции "PapFor 93", Ст.Петербург, 1993.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ в центральной и международной печати.

Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание методов и материалов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 194стр., включает рисунка и 25 таблиц. . Список литературы содержит 197 наименований, в том числе 136 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследовано 11 штаммов микроорганизмов, коллекционных и выделенных нами из плодовых тел грибов, собранных в районе озера Байкал. В качестве основных обьектов исследования выбрали базидиомицеты Phanerochaete sanguínea и Trametes Yillosus.

В качестве субстратов в работе использовали хвойную и лиственную сульфатную целлюлозу лабораторных и промышленных варок Братского ЛПК.

Поверхностное культивирование микроорганизмов проводили на жидкой питательной среде Кирка (с различными модификациями) в колбах Эр-ленмейера и ферментере обьемом 2л собственной конструкции, защищенной рацпредложением. Температура инкубирования 26-37°С. Показатели, характеризующие рост культур (радиальная и удельная скорости роста, продуктивность по образованию биомассы и белка) определяли по общепринятым методикам. Продолжительность роста культур варьировала от 3 до 84 сут в зависимости от целей эксперимента.

Лигнинолитическую и целлюлолитическую способность культур устанавливали по деструкции лигнина г целлюлозы. Содержание лигнина в древесине определяли по методу Комарова, содержание остаточного лигнина в лигноцеллюлозе - по перманганатному окислению ( метод числа Каппа). Содержание целлюлозы определяли методом Кюршнера.

Соотношение количества разлагаемых культурами целлюлозы и лигнина в субстрате характеризовали индексом ксилолиза I = С/(С+Ъ), где С и L - потери целлюлозы и лигнина.

Способность грибов продуцировать лигниназу устанавливали по образованию вератрового альдегида (3,4 диметоксибензальдегида) из экзо-

б

генно введенного вератрового спирта методом ВЗЖХ на "Милихром-1

Активность лигниназы оценивали спектрофотометрически на приС "СФ 20" по скорости окисления вератрового спирта до вератрового а дегида, активность лакказы - устанавливали по скорости окисления рокатехина, активность р-глюкозидазы оценивали по п-нитрофев -p-D-глюкозиду, активность ксиланазы определяли по скорости гидрол ксилана, активность внеклеточных целлюлаз оценивали по осахаривг фильтровальной бумаги. Редуцирующие вещества определяли по мет Шомоди-Нельсона. Содержание белка фиксировали по методу Брэдфорда.

Поиск оптимального состава питательной среды для проявления г бом Ph. sanguínea максимальной избирательной лигниндеструктирук способности проводили с использованием матрицы планирования экспе мента по планам Бокса 23 и 24 по методу крутого восхождения. Рас оптимальных параметров культивирования выполнен на ЭВМ Эльбрус-1К2 Отбелку сульфатной целлюлозы проводили по схемам: Б-Щ-П и Б-Ш Пк, где Б - биологическая обработка ; Щ - щелочная экстракция; : ступень пероксидной отбелки (2-4% HgOg при 70-90°С в течение 20-мин, рН 10,5-12,0); К - обработка комплексообразователем (0,3% Три Б, 30 мин при 70°С, рН 4,0-4,5); Пк - ступень каталитической пер сидной отбелки (добавка 0,3% о-фенантролина). Биологическую обрабо проводили как при культивировании микроорганизмов непосредственно лигноцеллюлозном субстрате, так и при использовании бесклеточ культуральных фильтратов грибов.

Спектры отражения отливок целлюлозы, приготовленных согла ГОСТ записывали на спектрофотометре "Specord М 40".

Органосольвентную варку выполняли в стальных лабораторных ав клавах в системе этанол-вода при 165°С в течение 90-210 мин с испо зованием катализатора НС1 в количестве 0,2-0,4%. Промывку проводил течение 30 мин при 70°С 0,25% NaOH.

Лигнины органосольвентных варок выделяли высаживанием в вось кратный обьем воды с последующим центрифугированием и высушиванием Гель-хроматографию щелоков и лигнинов органосольвентных ва выполняли на хроматографе "Милихром 1".

Спектры ЯМР ^Н и ^С регистрировали на спектрометре "Bruker 200-SY".

Эксперименты и анализы выполнены в 3-5 кратной повторности и работаны статистически.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Критериями отбора древоразрушающих грибов служили лигниндеструк- ' :ирующая способность и способность продуцировать лигниназу, основной зермент, катализирующий деструкцию лигнина. Среди исследованных 11 •.ультур нами выбраны базидиомицеты Т. vlllosus и Ph. sanguínea, облагающие наибольшей избирательностью деструкции лигнина.

Многочисленные исследования, касающиеся лигнинолитических фер-ентов фиксируют развитие лигниназной активности без учета изменений еллюлазной активности, хотя они взаимно регулируются. Поэтому про-есс делигнификации необходимо исследовать во взаимосвязи с Оиодест-укцией целлюлозы.

Лигниназная активность у базидиомицетов проявляется во время горичного метаболизма и регулируется содержанием в питательной среде зота и углерода. В связи с этим мы изучили влияние содержания азота глюкозы на проявление культурой гриба Ph. sanguínea лигнинолитичес-эй и целлюлолитической способности. Установлено, что при содержании зота до 1,8 ммоль/л способность гриба к деструкции лигнина увеличи-зется (рис.1). Введение вератрового спирта в качестве индуктора сти-глирует лигнинолитическую способность, причем ее увеличение проходит

Потери лигнина (Ь) и целлюлозы (С) при культивировании РЬ.зап-1пеа на лигноцеллюлозном субстрате в течение 10 сут в зависимости содержания в питательной среде микроэлементов, вератрового спирта ,2 ммоль (а), 0,3 ммоль (б), 0,4 ммоль (в) и азота 0,5 ммоль (д), I ммоль (•), 1,8 ммоль (о).

через максимальное значение (рис.2). Установлена оптимальная кондент рация глюкозы, тормозящая деструкцию целлюлозы(рис.3).

Рис.2 Влияние добавок вератрового спирта на деструкцию лигнинг (L) - 1 и целлюлозы (С) - 2 грибом Ph. sanguínea. Рис.3 Влияние добавок глюкозы на деструкцию лигнина (L) - 1 и целлюлозы (С) - 2 грибом Ph.. sanguínea.

Поскольку действие всех компонентов питательной среды взаимосвязано, то для поиска оптимальных условий проявления культурой лигнин-деструктирующей способности использовали метод математического планирования эксперимента. В качестве переменных факторов были выбраны время инкубирования Х4И0-14 сут) и содержание в питательной среде азота Х2(0.6-1,8 толь), микроэлементов ^(1-7 кратное), вератрового спирта (0,2-0,4 ммоль), а также глюкозы Хд (0,02-0,3835) и перокси водорода Xg(4-12 мкмоль/л).

Из полученных экспериментальных значений рассчитали коэффициенты в уравнении регрессиии, правели статистическую проверку их значимости и составили уравнения, описывающие деструкцию лигнина Y^ и целлюлозы Ус в процессе делигнификащи:

Yl= 35.8+0,42Х1 +1 ,76X2+7,67Х4-2.15X^-3,10Xg2+1 ,85Хз2+

+2,1 ^XgXg-0,84ХдХ^. Yc= 7,67+2,15X2+1,22X3+2,99X^+1,10X^0,45X2+2,05X3+2,85X4+

+0,66X^-1,21x^4+1,79X2X3+1,1^X4 Методом крутого восхождения был найден оптимальный состав питательной србды, в условиях которой при заданном пределе деструкции целлюлозы 10% может быть достигнута степень делигнификации 45%. Эти оптимальные условия были использованы при дальнейшем изучении процесса биоотбелки.

Степень делигнификации зависит от взаимного сочетания в питательной среде глюкозы, сероксида водорода и вератрового спирта: Yl= 31 ,84-3,26Х5-1 ,41X^+2,79X^-1 ,51Х5Х6+1 ,61X6Xt

Процесс биодеструкции лигнина является окислительным. После воздействия грибов в лигнине значительно повышается массовая доля кислорода. Методом количественной спектроскопии ЯМР Ни 1 С установлено, что биотрансформация приводит к увеличению содержания в лигнине карбонильных и фенольных гвдроксильных групп -.(габл.'П за счет того, что протекают реакции Са и С^-окисления и деметоксилирования (схема). Под действием Ph. sanguínea деструкция лигнина сопровождается расщеплением арил-арильных и алкил-арильных (Сар-С) связей за счет каталитического действия Mn-зависимой пероксидазы и лигниназы. В случае Т. Tillo sus деструкция осуществляется преимущественно за счет разрыва С-С связей боковой цепи с участием лигниназы и лакказы. Одновременно с биодеструкцией происходит частичная полимеризация лигнина, которая протекает с образованием С-О-С связей. Окислительная биодеструкция лигнина и связанная с нею функщонализация способствуют увеличению растворимости лигнина и тем самым делигнификации лигноцеллюлозных субстратов.

Таблица 1. Распределение атомов углерода и водорода по структур-шм фрагментам лигнина механического размола (ЛМР) и лигнина органо-;ольвентной варки (ЛОСВ), после деструкции древесины грибами (коли-юство на 100 ароматических колец)

Исходная Деструктированная осина Ошибка, осина Ph. sanguínea T.vlllosus %

фрагмент ЛМР ЛОСВ ЛМР ЛОСВ ЛМР ЛОСВ

¡0 карбонильные 13 20 75 45 33 19 9,3

Я фенольвые 29 79 51 70 34 51 12,0

СНд метоксильные 144 147 104 144 131 148 9,5

00 сложно эфирные 40 35 147 39 56 27 10,3

ар-О-С эфирные 60 50 117 65 79 35 14,0

ар-С 118 125 81 120 143 184 10,3

боковой цепи 530 340 588 370 363 270 9,5

а степень аро-

матичности 0,46 0,54 0,46 0,53 0,52 0,57 6,4

В тоже время данные элементного анализа целлюлозы показывают, го в выбранные сроки инкубирования окислительные процессы не затра-явают целлюлозу. Деструкция целлюлозы происходит за счет действия

гидролаз и приводит к уменьшению степени полимеризации.

Использование в качестве делигнифицирующей стадии микробиологической деструкции в схеме пероксядной отбелки позволяет повысить белизну сульфатной целлюлозы. Проведя биологическую обработку в условиях оптимального состава питательной среды, при которых происходит избирательная делигнификация лигноцеллюлозы, мы изучили влияние различных режимов отбелки этих образцов пероксидом водорода на содержание остаточного лигнина и качество получаемой целлюлозы. С использованием 2% пероксида при различных температурах было установлено, что биообработка в сочетании с пероксидкой отбелкой приводит к более глубокой делигнификации, чем пероксидная отбелка без обработки грибом (рис.4).

Рис.4 Снижение содержание лигнина (I) -1 и целлюлозы (С)-2 в образце в зависимости от условий пероксидной отбелки (2% HgOg. 90°С (а), 80°С (б), 70°С (в); 1,2- после биообработки грибом; 1',2'- без биообработки В выбранном режиме (70°С. 60 мин) сравнили эффективность действия грибов Ph. sanguínea и Ph.chrysosporlum. Оказалось, чтоспомощью Ph.sanguínea можно добиться более высокой белизны 54,2%, при этом степень полимеризации образца остается достаточно высокой (1190), чем при использовании гриба Ph. chrysoeporlum (белизна 48,0), который более значительно деструктирует целлюлозу (СП 840).

При отбелке по схеме Б-Щ-П, в зависимости от вида древесины, получена хвойная целлюлоза с белизной 52-54% и лиственная - 57,5% при снижении содержания лигнина на 44 и 62% соответственно.

Использование метода предварительной биологической деструкции

ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ СХЕМА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ ЛИГНИНА

Hg-Ç-OK

с=о

Лиг

HO-CÍ^-CH-CHO

лигнина в более сложных схемах пероксидной отбелки с применением ком плексообразователя и катализатора, позволяющих достичь белизны 74 77%, дает возможность повысить белизну еще на 6%. Предлагаемый вари ант бесхлорной отбелки по схеме Б-Щ-К-Пк позволил получить лиственну целлюлозу с белизной 80-82% при сохранении достаточного уровня средней степени полимеризации.

Эффективность воздействия реагентов, используемых в процессе ступенчатой отбелки, наглядно просматривается при исследовании спектров отражения целлюлозы в видимой и УФ- области. Последовательные обработки по схеме Б-Щ-П приводят к снижению относительного поглощена во всем диапазоне спектра, обусловленному процессами делигнификации и к его деформации, вызванной изменениями хромофорного состава (рис. 5). Воздействию гриба Ph.sanguínea и пероксида водорода подвергаются хромофоры в широком диапазоне 40000-28000 см-1 - это£опряжвнные ароматические структуры с a-карбонильной группой, хинонметидные, стиль-беновые фрагменты. Вклад биологической стадии в процесс отбелки составляет для березовой целлюлозы 5 ед белизны, для сосновой 3,5.

K/s-io

500 400 300 200

а

100

Ü.R.%

-з

У-Ю см

АО 36 32 23 24 20 16 V4°см

Рис.5 Спектры относительного поглощения к/з-у (а), разностные ДЙ-у е разностные нормированные ДГМ> (б) сульфатной сосновой целлюлозы, исходной (1), обработанной грибом (2), грибом с последующей щелочноЕ экстракцией (3), грибом с последующей пероксидной отбелкой (4), после пероксидной отбелки без биологической обработки (5).

Использование грибного мицелия в технологическом процессе сопряжено со значительными трудностями (создание специальных ферментеров, сохранение стерильности, длительность биообработки). В связи с этим была рассмотрена возможность использования для биоотбелки ферментных препаратов или культуральных фильтратов грибов.Дзучензе внеклеточных ферментных комплексов грибов рода Trametes показало, что в их состав входят лигниназа, лакказа, ß-глюкозидаза, ксиланаза и целлюлаза. Продукцию лигниназы можно увеличить введением в питательную среду в начальный период инкубирования вератрового спирта Сопоставление динамики развития лигнинолитической и целлюлолитической активности грибов показывает, что можно получить ферментные комплексы, различного состава, обладающее преимущественно либо лигниназной, либо ксиланазной активностью. Ферментная обработка целлюлозы однозначно приводит к увеличению белизны. Наибольший эффект биотрансформации образца достигается при действии препарата, обогащенного лигниназой из Т. villo-sus. Гидролитическое воздействие ксиланаз из Т. verslcolor с небольшой лигниназной активностью обнаруживается после щелочной экстракции лигноуглеводных фрагментов. Таким образом, ферментная обработка позволяет повысить белизну сульфатной лиственной целлюлозы на 4-756, т.е. достичь такого же увеличения белизны, как и с культурой гриба.

С целью снижения стоимости процесса при культивировании грибов в процессе биоатбелки можно использовать предгидролизат, имеющий в составе низкомолекулярные сахара и фенолы, в качестве косубстрата и индуктора лигнинолитической активности вместо глюкозы и вератрового спирта, и заменить аспарагин мочевиной.

Введение биологической стадии обеспечивает более легкую и полную делигнификацию древесины при последующей водно-этанольной варке. Получение целлюлозы методом варки в органических растворителях может обеспечить лучшую экологическую приспособленность и меньший обьем рентабельного предприятия, дает возможность использовать в качестве сырья древесину и хвойных, и лиственных пород. В условиях водно-этанольной варки для того, чтобы достичь достаточно высокой степени делигнификации (например 10 ед. Каппа), требующейся для лучшей бели-мости, необходимо либо использовать высокие концентрации катализатора, либо увеличивать продолжительность варки. Это приводит к большой гидролитической деструкции целлюлозы, то есть к потере выхода и снижению почти в 2 раза средней степени полимеризации. При концентрации катализатора 0,2% НС1 получается целлюлоза с выходом 52-53% и жест-

костью 19-20 ед.Каппа. Предварительная биологическая обработка древе сины грибами позволяет уменьшить жесткость получаемой целлюлозы на 8-ед.Каппа при сохранении выхода на уровне контрольного'опыта (табл.2) Наиболее приемлемыми оказываются относительно короткие сроки биообработки. Лучше результаты получаются при использовании гриб* T.vlllosus, поскольку целлюлоза получается менее деструктированная.

Таблица 2. Влияние биообработки древесины на свойства целлюлозы, получаемой при органосольвентной варке (0,2% HCl)

Микроорганизм Время ОиооС- Потеря Выход цел- Жесткость, СП работки, сут массы, % люлозы, % ед. Каппа

Trametes 0 0 52,7 19,7 780

vlllosus 15 4,8 52,8 15,1 770

30 5,2 52,1 14,8 780

60 13,2 50,0 10,4 770

Phanerochaete 0 0' 52,3 19,3 760

sanguinea 15 1,7 52,4 14,9 670

30 6,4 49,7 10,5 530

60 10,9 46,8 10,5 480

Phanerochaete 0 0 52,5 19,8 770

chrysoaporlum 15 8,5 50,7 12,9 480

30 16,4 47,4 15,6 440

60 27,3 44,5 15,9 400

0,4% HCl' - - 46,5 10,5 390

В связи с этим была изучена возможность биоделигнификации щепы перед варкой секреторным комплексом ферментов Т. уШозиа вместо прямого культивирования микроорганизмов.

В ходе исследования было выявлено, что выход целлюлозы и степень ее делигнификации зависят от активности использованного культурально-го фильтрата и продолжительности обработки. Определяющим фактором при ферментативной обработке щепы является время, необходимое для диффузии фермента вглубь образца. При длительности обработки 6 сут была подобрана оптимальная активность культурального фильтрата (соотношение лигниназаглакказажсяланаза составило 20:10,5:3,5 единиц активности на 1 г древесины). В этих условиях получена целшзлоза с выходом 50% и жесткостью 12 ед.Каппа.

Ферментатизная обработка позволяет сократить продолжительность водно-этанольнсй варки в 1,5 раза (до 120 мин) для получения полуфабрикатов той же степени делигнификации. Применение биологической обра--, ботки также позволяет без использования катализатора достичь большей глубины провара, причем избирательность делигнификации при ОСВ биологически обработанной древесины несколько выше.

Важную информацию для оценки вклада биологической стадии в процесс делигнификации могут дать сведения о свойствах лигнинов органо-сольвентной варки. Нормированные гель-хрсматограммы щелоков ОСВ биологически обработанной древесины (рис.6) отличаются от гель-хроматограмм щелока ОСВ исходной древесины и нативного лигнина осины тем, что имеют бимодальный характер. Появление низкомолекулярных фракций в щелоках от варки биологически обработанной древесины свидетельствует о процессах деструкции лигнина, происходящих под действием грибов. Причем с увеличением периода биопредобработки до 10 сут доля низкомолекулярных фракций увеличивается до 24%. Однако в процессе ОСВ лигнин не только извлекается из древесины и разрушается, но и претерпевает полимеризационные превращения.

Рис.6 Нормированные гель-хроматограммы щелоков ОСВ, полученных после биодеструкции осины грибами Т. у111овиз (А) и Р1г. защрИлеа (В) и исходной осины (В).

1 13

Методом количественной спектроскопии ЯМР Ни С выявлено, что в результате водно-этанольной варки за счет реакций разрыва простых эфирных связей я С-С связей алифатической цепи происходит деструкция

лигнина. Биологическая обработка древесины вносит свой вклад в этот процесс (табл.1). В зависимости от комплекса продуцируемых грибом ферментов она осуществляется разными путями, как отмечено выше, и обеспечивая частичную деструкцию лигнина, приводит к более легкому его извлечению в процессе органосольвентной варки.

Таким образом, показана эффективность биологических стадий, введенных в технологическую цепь получения целлюлозы: биоделигнификация древесины перед органосольвентной варкой позвсляе^величить селективность варки, а введение ступени биоделигнифихации в схему пероксидной отбелки дает возможность получить целлюлозу с белизной на уровне товарного продукта.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг древоразрушавдих грибов по лигниндеструк-тирувдей способности и способности продуцировать лигниназу. Среди исследованных грибов выбраны ранее мало изученные штаммы базидиомицетов Ph.. sanguínea и Т. vlllosus, которые обладают наибольшей избирательностью деструкции лигнина.

2. Показано, что лигяинолитическая и целлюлолитическая способности гриба Ph. sanguínea зависят от взаимного сочетания содержания в питательной среде азота, глюкозы, микроэлементов и пероксида водорода. Выявлено стимулирущее влияние вератрового спирта на лигнинолитичес-кую способность гриба. Построена математическая модель процесса био-делигнификации небеленых целлюлоз и найден оптимальный состав питательной среда, в условиях которой при заданном пределе деструкции

целлюлозы 10Ж может быть достигнута степень делигнификацш 45%.

1 1 ч

3. Методом количественной спектроскопии ЯМР Н и С и эксклюзионной жидкостной хроматографии исследованы пути биодеструкции лигнина, направление которых зависит от комплекса продуцируемых грибом ферментов. Показано, что Ph. sanguínea осуществляет окислительную деструкцию за счет реакций разрыва преимущественно по алкил-фенильным связям, а Т. vlllosus - по углерод-углеродным связям алифатической цепи.

4. Установлено, что введение предварительной стадии биологической деструкции лигнина в схему пероксидной отбелки наряду с комплексооб-разователем и катализатором дает возможность без использования хлор-потгвржягттт'гт соептгкйштй' ттолучт^тъ лиот'ярннуто пймлуитояу. которяя тто сояя—

жанига остаточного лигнина и белизне (82%) близка к товарной беленой еллязлозе, полученной по традиционной схеме отбелки. Оценен вклад би-логической стадии в увеличение белизны: для лиственной целлюлозы -,0%; для хвойной - 3,5%. Выявлены химические изменения, происходящие хромофорном составе остаточного лигнина в процессе отбелки на био-эгической и пероксидной ступенях.

. Установлено, что грибы рода Trametes способны продуцировать лигни-азу, лакказу, (З-глшозидазу, ксиланазу и целлюлазу. Состав внекле-эчных ферментов зависит от возраста культуры. Доказана делигнифици-щцая способность лигниназных и лакказных препаратов, и гидролити-зская способность ксиланазных. Ферментная обработка позволяет повы-1тъ белизну лиственной целлюлозы на 4-7Ж.

. Достигнуто повышение избирательности процесса водно-этанольной зрки за счет предварительной микробиологической делигнификации. По-ззано, что с использованием как микроорганизмов, так и их ферментных змплексов можно добиться увеличения выхода целлюлозы на 2% по срав-)нию с контрольным образцом при одинаковой жесткости или сократить юдолжительность водно-этанольной варки в 1,5 раза для получения ¡ллшозы с той же степенью делигнификации.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Медведева С.А., Бабкин В.А., Волчатова И.В.. Соловьев В.А., Малыша О.Н., Спиридонова Л.Н., Александрова Г.Л. Изучение лигниназной :тивности базидиомицета Phanerochaete sanguínea. Химия древесины. 69. N6. с.75-76.

Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Ма-шева О.Н., Иванова С.З. Влияние состава питательной среды на лигни-зную активность базидиомицета Phanerochaete sanguínea. Химия древе-ны. 1989. N6. С.77-80.

Александрова Г.П., Медведева С.А., Балахчи Г.К., Бабкин В.А., Со-вьев В.А., Малышева О.Н. Оптимизация процесса биоделигнификации ли-оцеллшозных материалов грибом Phanerochaete sanguínea. Химия дре-сины. 1989. N6. с.81-83.

Бабкин В.А., Соловьев В.А., Александрова Г.П., Медведева С.А., Ма-пева О.Н., Способ отбелки сульфатной целлюлозы. А.с. 1650835. Б.И. 9. С.121 ОТ 23.05.1991

Медведева С.А., Александрова Г.П., Бабкин В.А. Перспективы и труд-сти использования микроорганизмов в целлюлоза-бумажной промышленно-

ста. Химия древесины.1991. N1. с.3-16.

6. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Исследование некоторых факторов, влияющих на ферментативную активность гриба Pfianerochaete sanguínea. Химия древесины. 1993. N4. с.55-60.

7. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Изучение условий трансформации лигноцеллюлозного субстрата базидиомицетом Phanerochaete sanguínea в присутствии предгидроли-зата. Химия древесины. 1993. К4-. с.37-40.

8. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Совершенствование биологической отбелки сульфатной целлюлозы. Химия древесины. 1993. N4. с.14-17.

9. Александрова Г.П., Медведева С.А., Заказов А.Н., Бабкин В.А., Бу-ряченков М.И., Волчатова И.В. Способ получения целлюлозного полуфабриката. Патент РФ 93019492/12. 1993.

10. Медведева С.А., Александрова Г.П., Бабкин В.А. Използуването на микроорганизма в целулозно- хартиената промишленост. Целулоза и хартия. 1991. 21.N6. с.3-9.

11. Aleksandrova G.P., Buryachenkov M.I., Medvedeva S.A., Zakazov A.N.. Babkin V.A. Mlcroblologlcal delignlílcation - the basls Гог ecologically sound pulplng technology. 7th. Int. Symp. Wood and Pulp. Chem. Beljlng. China. 1993.

12. Babkin V.A., Zakazov A.N., Medvedeva E.N., Yefremova G.G., Aleksandrova G.P., Medvedeva S.A. A procesa íor chlorine- íree bleachlng of kraít hardwood cellulose. 1994 Int. Pulp Bleachlng Conf. Toronto. Cañada.