Микробиологическая деструкция лигнина - основа технологическихпроцессов биоделингнификации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ



\\ 1: ГОСУДАРСТВЕННЫ!! КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАН]® ИРКУТСКИЕ ГОСУДАРСТВЕННШ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА Галина Петровна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ЛИГНИНА - ОСНОВА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ БИОДЕЛИГНИФИКА1ШИ 02.00.03 - органическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Иркутск -1994

£*" 3 С'О Т а 2ЫИОЛН6 Н 3 3 Л 3 'Зо С £ то сии Оно химии лигнина Иркутского института органической химии СО РАН

Научны v рук о sодизели ^ rr^vti^p ^ ч ^ с к из* ч^ук, псоф°ссор

В. А EASKF*"

VQU ffyrTQf^ yT/fJjTT-CU^^'^тлт WÖTiV t С^СШИЙ

каучный сотрудник С. А. МЕЛЗЕДЕЕА

О^ннизльныб оппоненты: доктор химических наук

A.A. СЕМЕНОВ

кандидат химических наук, старший

научный сотрудник 5.Л. ФИШЕДЪШТЕЙН

«

Ведущая организация: СиСирский научно-исследовательский

институт целлюлозы и картона

Заднта диссертация состоится 2£ 1994 г. в час на

ЗЗСе.ИаН1£И СПеЦИаЛИ2ИТ;ОВаНН0г'0 СОЕеТЗ Q63.32-ОЕ по защите диссертаций на соискание степени кзн-И^лзтз хи?лических

наук ™и йгзкутском государственном университете по адресу: г. Иркутск, ул. Лермонтова 12-5, комн.430

С ДНССе£ЗТаЦИе МОЧСН'"1 ,~13:"4"С>:**,~МИ'Г'ЬСЯ & FQyutJOH '"ЗиОЛИ^Теке

ti П л ТЛ-ФU гтl Р

Отзывы просим направлять со адресу: ь~4033, Иркутск, а/я 4C2G, ИНУО, ученому секретарю специализированного совета.

Автореферат разослан 20 1994 г.

Ученый секретарь специадизкооЕаккого

совета, кандидат химических наук Т.Л.Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Общее ухудшение экологической ситуации повысило требования к безопасности производств, в том числе и целлюлозо-бумажной промышленности (ЦБП). Технология получения целлюлозы использует серо- и хлорсодержащие продукты, которые в процессах варки и отбелки превращаются в дурнопахнущие (меркаптаны), токсичные и канцерогенные (диоксины) вещества, загрязняющие воздух и воду, а поэтому представляющие большую экологическую опасность. Существующие системы очистки не способны очистить до конца ни газообразные выбросы, ни стоки. В связи с необходимостью сохранения целлюлозно-бумажного производства и перевода его в ранг экологически безопасного, активно разрабатываются как новые способы получения целлюлозы, так и способы очистки стоков и отходящих газов.

Одно из направлений создания технологически безвредных процессов переработки древесины в целлюлозу и волокнистое сырье связано с использованием микроорганизмов.

Биотрансформация древесины микроорганизмами - естественный процесс, за счет которого происходит круговорот углерода в природ. Разложение древесины осуществляется ассоциациями микроорганизмов, но наибольшей разрушающей способностью обладают базидиальные грибы, причем среди них отличают грибы белой гнили, которые могут разрушать преимущественно лигнин. Эту способность грибов белой гнили можно использовать при разработке биотехнологических процессов делигнификации в ИБП на стадиях варки и отбелки.

Разработки технологий биоделигнификации применительно к ЦБП активно ведутся за рубежом. Но несмотря на значительное количество исследований, посвященных микробиологическому и ферментативному разложению целлюлозы, лигнина и моделирующих его соединений, биотехнология еще не стала составной частью технологий ЦБП. Это связано прежде всего с тем, что только в последние годы на основе работ по химии и физиологии биоразложения лигнина и фенолов, развиваются теоретические основы и практические подходы к этой проблеме.

Деструкция лигнина происходит в результате воздействия ферментов, продуцируемых микроорганизмами. Ключевым среди лигнинразрушающих ферментов считается лигниназа, которая способна катализировать окислительные реакции деструкции ароматического кольца и расщепления С-О-С и С-С связей алифатической цепи. Важную роль в освобождении лигнина играют гидролазы грибов, катализирующие разрушение лигноугле-

водкой матрицы.

Эффективность биоделигнификашш мокет быть обеспечена лишь в тем случае, если ферментный комплекс грибов не содержит целлюлозразрушаю-щих ферментов. Поэтому одно из направлений поиска путей интенсификации биоделигнификашш строится на выделении ноеых активных культур, обладаниях избирательной лигнивдеструктирующей способностью и использовании их в конкретных технологических процессах.

Цель работы - исследование микробиологической и ферментативной деструкции лигнина я целлюлозы, и выявление возможности избирательной деструкции лигнина с сохранением качественных показателей целлюлозы. Для достижения излоаенной цели были поставлены следующие задачи:

- скрининг активных лигниндеструктурувдих базидиомицетоз,

- изучение ферментативной активности исследуемых грибов и химических реакций, сопровождающих деструкцию лигнина,

- оптимизация условий для проявления максимальной лигкинолитаческсЗ способности,

- разработка основных подходов к технологическим процессам варки и отбелки, включающим стадии биоделигнификашги древесины и целлюлозных полуфабрикатов.

Научная новизна работы. Впервые в качестве селективного деструктора лигнина отобран и изучен базидиомицет Тгап^ез тШозиз, а таксе показана избирательность деструкции остаточного лигнина в лигноцеллю-лозе грибом РЬапегосЬае1е защ^ипеа. Установлена ззиамоезязь степени биологической деструкции лигнина я целлюлозы. Найдены оптимальные условия проявления микроорганизмами избирательной лигнинразрушающей способности. Впервые установлено, что биологическое воздействие изученных грибов на лигнин является окислительным процессом и приводит к изменению химического и структурного состава лигнина. Биодеструкция и функпионализация лигнина облегчают его последующую экстракцию.

Практическое значение работы. Оценен вклад и эффективность биологических стадий, введеных в технологическую цепь производства целлюлозы. Биолелигкификация древесины перед водно-зтзнольной заркой увеличивает ее селективность, введение ступени биоделигкификации в схему пероксидной отбелки дает возможность получить целлюлозу с белизной на уровне товарного продукта. Эти процессы защищены патентом и авторским свидетельством.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на 3 научном семинаре "Превращения древесины при энзиматическом и

ликробислсгическом воздействиях", Рига, 1588; на 6 межреспубликанской ш-соле-семинарэ "Исследования з области химии древесины", Рига, 1991; за международной конференции "РарРог 93", Ст.Петербург, 1993.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ з вентральной и международной печати.

Структура и объем диссертации, диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей опи-:акие методов и материалов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 191стр., включает рисунка и 25 таблиц . Список литературы содержит 183 наименования, в сом числе 136 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе исследовано 11 штаммов микроорганизмов, коллекционных и зыделевных нами из плодоеых тел грибов, собранных в райоЕе озера Бай-сал. В качестве основных объектов исследования выбрали базидиомшеты Phanerochaete sanguínea и Trametes rillosus.

В качестве субстратов в работе использовали хвойную и лиственную ¡ульфатнуэ целлюлозу.лабораторных, я прсмышленных^-зарок^Братскога-.ЛПК-Поверхностное культивирование микроорганизмов проводили на хид-сой питательной среде Кирка (с различными модификациями) з колбах Эр-генмейера и ферментере объемом 2л собственной конструкции, защищенной зацпредлозением. Температура инкубирования 26-37°С. Показатели, хара-стеризунгше рост культур (радиальная и удельная скорости роста, про-щстивность по образованию биомассы и белка ^определяли -по~абЕаприня-тн?л методикам. Продолжительность роста культур варьировала от 3 до 84 :ут з зависимости от целей эксперимента.

Лигнинолитическую и целлюлолитическую способность культур устанавливали по деструкции лигнина и целлюлозы. Содерзание лигнина з греЕесине определяли по методу Комарова, содержание остаточного лиг-•пна з лигноцеллюлсзе - по перманганаткому окислению ( метод числа Сarma). Содержание целлюлозы определял;! методом Кюопгнерз.

Соотнесение количества разлагаемых культурам;! целлюлозы и лигнк-:з з субстрате характеризовали индексом ксилолиза 1,= -С/(С.+Ь), гае С i ь - потери целлюлозы и лигнина.

Способность грибов продуцировать лигзгназу устанавливали по об-гззеззнпю зеозтоовеге зльдешда (3,4 диметоксибензальдегида) из экзо-

б

генно введенного Еерзтрового спирта методом ВЭЖХ на "Милихром-1".

Активность лигншазы оценивали спектрсфотометрически на приборе "OS 20" по скорости окисления вератрового спирта до зератравого альдегида. активность лакказы - устанавливали по скорости окисления пирокатехина, активность £-глюкозидазы оценивали по п-нитрофенил--(З-Б-глшозиду, актиЕЕОсть ксиланазы определяли по скорости гидролиза ксилана, активность внеклеточных целлюлаз оценивали по осахариванию фильтровальной бумаги. Редуцирующие вещества определяли по методу Шомода-Нельсона. Содержание белка фиксировали по методу Брэдфорда.

Поиск оптимального состава питательной среды для проявления грибом Ph. sanguínea максимальной избирательной лигниндеструктирующей способности проводили с использованием матрицы планирования эксперимента по планам Бокса 2^ и 24 по методу крутого восхождения. Расчет оптимальных параметров культивирования выполнен на ЭВМ Эльбрус-1К2.

Отбелку сульфатной целлюлозы проводили по схемам: Б-Щ-П и Б-Щ-К-Пк, где Б - биологическая обработка ; Щ - щелочная экстракция; И -ступень пэроксидной отбелки (2-4% Hg02 при 70-90°С в течение 20-120 мин, рН 10,5-12,0); К - обработка комплексообразователем (О, 3% Трилон Б, 30 мин при 70°С, рН 4,0-4,5); Пк - ступень каталитической перок-сщщой отбелки (добавка 0,32 о-фенантролина). Биологическую обработку проводили как при культивировании микроорганизмов непосредственно на лигноцеллюлозном субстрате, так и при использовании бесклеточных культуральных фильтратов грибов.

Спектры отражения отливок целлюлозы, приготовленных согласно ГОСТ записывали на спектрофотометре "Specord М 4-0".

Органосольвентную варку выполняли з стальных лабораторных автоклавах в системе этанол-вода при 165°С в течение 90-210 мин с использованием катализатора НС1 в количестве 0,2-0,4%. Промывку проводили в течение 30 мин при 70°С 0.25Ж NaOH.

Лигнины оргаиосольвентных зарок выделяли высаживанием в восьмикратный обьем воды с последующим центрифугированием и высушиванием.

Гель-хроматографию щелоков и литников оргзЕосользентных варок выполняли на хроматографе "Милигсом 1".

I " п

Спектры ЯМР К и С регистрировали на спектрометре "Bruzar w?-200-SY".

Эксперименты а анализы выполнены з 3-5 краткой повторности и обработаны статистически.

РЕЗУЛЬТАТЫ М ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Критериями отбора древоразрунающих грибов служили лигниндеструк-:ирушая способность и способность продуцировать лигниназу, основной ¡ермент, катализирующий деструкцию лигнина. Среда исследованных 11 ультур на ми выбраны базидисмицеты Т. тШобцз и зап£м1пеа, обла-ающие наибольшей избирательностью деструкции лигнина.

Многочисленны^ исследования, касающиеся лкгниноли^и^еских фес-ентов фиксируют развитие лигниназкой активности без учета изменений зллхшазной активности, хотя они ззаимно( регулируются. Поэтому про-зсс делигнификации необходимо исследовать во взаимосвязи с биодест-гкцией целлюлозы.

Лигниназная активность у базидиомицетов проявляется во зремя юричного метаболизма и регулируется содержанием з питательной среде юта и углерода. В связи с этим мы изучили влияние содержания азота глюкозы на проявление культурой гриба 3angu.l_n.ea лигнинолитиче" • й и целлюлслитической способности. Установлено, что при содержании ота ло 1,3 мчсль/л способность гриба к деструкции лигнина увеличи-°;рис.1). Введение вератроЕого спирта з качестве индуктора сти-гнинолитическуи способность, причем ее увеличение проходит

яирует

1,% с,:

30

го

ю ■

30

го

А

зо

га

ю

I 4 Г I 4 7 I 4 7

1 Потери лигнина (Ь) и целлюлозы (С) при культивировании ?Ь..зап-.еа на лигноцеллюлозном субстрате з течение 10 сут з зависимости одержания з питательной среде микроэлементов, вератрсвого спирта же ль (а;, 0,3 ммоль (в), 0,4 ммоль (з) и азота 0,6 ммоль (д), ммоль (•), 1,3 ммоль (о) .

через максимальное значение (рис.2). Установлена оптимальная концентрация глюкозы, тормозящая деструкцию целлюлозы(рис.3).

веротроьый спирт глюкоза

Рис.2 Влияние добавок вератроваго спирта на деструкцию лигнина (Ь) - 1 и целлюлозы (С) - 2 грибом Р1г. зап^иХпеа. Рис.3 Влияние добавок глюкозы на деструкцию лигнина (I) - 1 и целлюлозы (С) - 2 грибом РЬ. зап£и1пеа.

Поскольку действие всех компонентов питательной среды взаимосвязано, то для поиска оптимальных условий проявления культурой лигнин-деструктирующей способности использовали метод математического планирования эксперимента. В качестве переменных факторов были выбраны время инкубирования 0-14 сут) и содержание в питательной среде азота (0,6-1,8 ммоль), микроэлементов —7 кратное), вератрового спирта £3(0,2-0,4 ммоль), а также глюкозы Х5(0,02-0,38%) и пероксида водорода 2ц (4-12 мкмоль/'л).

Из полученных экспериментальных значений рассчитали коэффициенты в уравнении регрессиии, проЕели статистическую проверку их значимости и составили уравнения, списывающие деструкцию лигнина и целлюлозы Тп в процессе делигнификации:

35,3+0,42X^1 ,Т61с,+7,б7Х4-2.15Х12-3,10Х22+1,85Хз2+ +2,14X2X3-0,84X32^.

Ус= 7,67+2,15X2+1,22X3+2,99Х4+1,10X^0,45]!2+2,05Х3+2,85Х4+ +0,ббХ1Х3-1,21Х1Х4+1,797^X3+1,11ХоХ4

Методом крутого восхождения был найден оптимальный состав питательной среды, в условиях которой при заданном пределе деструкции целлюлозы 10% может быть достигнута степень делигкификации 45%. Эти оптимальные условия были использованы при дальнейшем изучении процесса биоотбелки.

Степень делигнификации зависит от взаимного сочетания в питательной среде глюкозы, пероксида водорода и вератроЕого спирта:

Ут= 31,34-3,26X^-1,41 Хс+2,79X^-1,51ХЛ.-+1,51л%Х,

и 3 О О ОО о^

Процесс биодеструкцяи лигнина является окислительным. После зоз-хействия гтабов в лигнине значительно повышается массовая доля кисло-

~ « < о

юда. Методом количественной спектроскопии ЯМ? К и С установлено, [то биотрансформация приводит к узеличению содержания з лигнине као-;онильных и £енолькых гидроксяльных групп ;(тэбл.!) за счет того, что ротекзют реакции Сд и С -окисления и деметоксщированяя (схема). Под :ейстзием РЬ.. запдШпеа деструкция лигнина сопровождается расцеплени-м арил-зрильнкх и алкил-арильных (Сар-С) связей за счет каталитичес-ого действия Мп-зазисимой пероксидазы и лигниназы. В случае Т. 711-озиз деструкция осуществляется преимущественно за счет разрыва С-С вязей боковой цени с участием лигниназы и лакказы. Одновременно с ¡гадеструкцией происходит частичная полимеризация лигнина, которая ротекает с образованием С-О-С связей. Окислительная биодеструкция агнина и связанная с нею функционализация способствуют увеличению зстворимости лигнина и тем самым делигнификации лигноцеллззлозных Гбстратов.

Таблица 1. Распределение атомов углерода и водорода по структур-гм фрагментам лигнина механического размола (ЛМР) и лигнина органо-)львентнсй зарки (ЛОСВ), после деструкции древесины грибами (коли-¡ство на 1 СО ароматических колец)

Исходная Деструктированная осина Ошибка, осина РЬ.. sangцlnea Т.тШозиэ %

Фрагмент ЛМР ЛОСВ ЛМР ЛОСВ ЛМР ЛОСВ

карбонильные 13 20 75 45 33 19 9,3

фенольные 29 79 51 70 34 51 12,0

Е3 метсксильные 144 147 104 144 131 148 9,5

0 сложнозфирные 40 35 147 39 56 27 10,3

р-С-С эфирные оО 50 117 65 79 35 14,0

? ° 118 1 с0 31 120 143 184 10,3

боковой цэпи 530 340 588 О ! Ч«/ 353 270 9,5

степень аро-

матичности 0,46 0,54 О ' 0,53 0.52 0,57 о ,4

Э тоже зсемя данные элементного анализа целлюлозы показывают, : з выбранные сроет инкубирования окислительные процессы не затра-¡акт целлюлозу. Лестоукцпя целлюлозы происходит за счет действия

гядродзз я приводит к уменьшению степени полимеризации.

Использование в качестве дедигнифзцируядей стздии микробиологической деструкции з схеме пероксидЕой отбелки позволяет повысить белизну сульфатной целлюлозы. Проведя биологическую обработку в условиях оптимального состава питательней среды, при которых происходит избирательная делигняфпкация лигноцеллюлезы, мы изучили влияние различных режимов отбелки этих образцов пероксидсм зодорода на содержание остэточеого лигнина и качество получаемой целлюлозы. С использованием 2% перокедда при различных температурах было установлено, что биообработка в сочетании с пероксидной отбелкой приводит к более глубокой делигнификашш, чем пероксидная отбелка без обработки грибом (рис.4).

Рис.4 Снижение содержание лигнина (L) -1 и целлюлозы (С)-2 в образце в зависимости от условий пероксидной отбелки (23 Р1п02. 90°С (а), 80°С (б), 70°С (а); 1,2- после биообработки грибом; t',2'- без биообработки

В выбранном режиме (70°С, 60 мин) сравнили эффективность дейст-зия грибов Ph. sanguínea и Ph.chrysosporíum. Оказалось, что помощью ?ñ.sanguínea можно добиться более высокой белизны 54,2%, при этом :тепень полимеризации образца остается достаточно высокой (1190), чем гри использовании гриба Ph. chrysosporlun (Селизна 48,0), который бо-:ее значительна деструк.тпрует целлюлозу (СП 340).

При отбелке по схеме Б-;П-П, в зависимости от вида древесины, по-:учэн2 хвойная целлвлеза с белизной 52-54% и лиственная - 57,55 при ниженпп содержания лигнина на 44 ;г 623 соответственно.

Использование метода предварительной биологической деструкции

ГЯЗОТЕТИЧЕСКАЯ СХЕМА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ ЛИТНИКА

деметилирование

Кг,-С-ОН ~ I

-о-сн

I

-о-сн

C=Q

¿Г

лигнина в Солее сложных схемах пероксидной отбелки с применением ксм-плексообразователя а катализатора, позволяющих достичь' белизны 7477%, дает возмозессть повысить белизну есе на о%. Предлагаемый зари-ант бесхлорнсй отбелки по схеме Б-Щ-К-Пк позволил получить листзеннув целлюлозу с белизной S0-S2S пси сохранении достаточного уровня средней1 степени полимеризации.

Эффективность воздействия реагентов, используемых в процессе ступенчатой отбелки, наглядно просматривается при исследовании спектров отражения целлюлозы в видимой и УФ- области. Последовательные обработки по схеме БЧП-П приводят к снижению относительного поглощения во зсем диапазоне спектра, обусловленному процессами делигнификации, и к его деформации, вызванной изменениями хромофорного состава (рис. 5). Воздействшз гриба Ph..sanguínea и пероксида водорода подвергаются хромофоры в широком диапазоне 4CCG0-28CGQ см-1 - этосопряженше ароматические структуры с a-карбонильной грушей, хинонметидные, стиль-беновые фрагменты. Вклад биологической стадии в процесс отбелки составляет для березовой целлюлозы 5 эд белизны, для сосновой 3,5.

Рис.5 Спектры относительного пеглецзния л/з-у ;aj, разностные ¿R-v и разностные нормированные ¿íl-v ,'3; сульфатной сосновой целлглезк, исходной обработанной грибом >2;, гриСс.м с последуксей зелечной экстракцией ;2;, грибом с псследунией пероксидной стбялхсй (4), после перокендней отбелки без биологической обработки ,'5 i.

Использование грибного мицелия з технологическом процессе сопряжено со значительными трудностями (создание специальных ферментеров, сохранение стерильности, длительность биообра':тки). В связи с этим была рассмотрена возможность использования для биоотбелки ферментных препаратов или культуральных фильтратов грибов. Изучение внеклеточных ферментных комплексов грибов рода Trametes показало, что з их состав входят лигниназа, лакказа, ß-глюкозидаза, ксиланаза и целлюлаза. Продукцию лигниназы можно увеличить зведением в питательную среду в начальный период инкубирования зератрового спирта Сопоставление динамики развития лигнинолитической и целлюлолитиче ской активности грибов показывает, что можно получить ферментные комплексы, различного состава, обладавших преимущественно либо лигниназной, либо ксиланазной активностью.« Ферментная обработка целлюлозы однозначно приводит к увеличению белизны. Наибольший эффект биотрансформации образца достигается при действии препарата, обогащенного лнгниназой из Т. villo-3us. Гидролитическое воздействие ксиланаз из Т. 7егз1со1ог с неболь-юй лигниназной активностью обнаруживается псслз делочной экстракции шгноуглеводных фрагментов. Таким образом, ферментная обработка поз-юляет повысить белизну сульфатной лиственной целлюлозы на 4-7%, т.е. гостичь такого же увеличения белизны, как и с культурой гриба.

С целью снижения стоимости процесса при культивировании грибоз з ¡роцессе биоотбелки можно использовать прздгядрслззат, имеющий з сос-'аве низкомолекулярные сахара и фенолы в качестве косубстрата и ин-■уктора лигнинолитической активности вместо глюкозы и вератрового пирта, и заменить аспарагин мочевиной.

Введение биологической стадии обеспечивает более легкую и полную елигнифякацию древесины при последующей зоднс-зтзнольной зарке. Поучение целлюлозы методом варки з органических растворителях может беспечить лучшую экологическую приспособленность и меньший обьем ентабельного предприятия, дает возможность исгсльзовать з качестве ырья древесину и хвойных, и лиственных пород. В условиях водно-гзеольной варки для того, чтобы достичь достаточно высокой степени элигкификзции (например 10 ед. Каппа), требуюдейся для лучшей бели-эстя, необходимо либо использовать высокие концентрации катализато-з, либо увеличивать продолжительность варки. Зто приводит к большой вдролитической деструкции целлюлозы, то есть :-: потере выхода и сни-;нию почти з 2 раза средней степени полимеризации. При концентрации зтализатора 0,2Z НС1) получается целлюлоза с выходом 52-53S и жест-

костью 19-20 ед.Каппа. Предварительная биологическая обработка древесины грибами позволяет уменьшить жесткость получаемой целлюлозы на 8-9 ед.Каппа при сохранении выхода на уровне контрольного опыта (табл.2). Наиболее приемлемыми оказываются относительно короткие сроки биообработки. Лучшие результаты получаются при использовании гриба Т.тШозиз, поскольку целлюлоза получается менее деструктированная.

Таблица 2. Влияние биообработки древесины на свойства целлюлозы, получаемой при органосольвентной варке (0,2% НС1)

Микроорганизм Время биооб- Потеря Выход цел- Жесткость, СП

работки, сут массы, % люлозы, % ед. Каша

Тгатейез 0 0 52,7 19,7 780

тШоэиз 15 4,8 52,8 15,1 770

30 5,2 52,1 14,8 780

60 13,2 50,0 10,4 770

Рйапегосйаеге 0 0 52,3 19,3 760

зап^Шпеа 15 1,7 52,4 14,9 670

30 6,4 49,7 10,5 530

60 10,9 46,8 10,5 480

РЬапегосйае^ 0 0 52,5 19,8 770

сйгувозрог1ш 15 8,5 50,7 12,9 480

30 16,4 47,4 15,6 440

60 27,3 44,5 15,9 400

0,4% НС1' - - 46,5 10,5 390

В связи с этим была изучена возможность бисделигнификации щепы перед варкой секреторным комплексом ферментов Т. тШоаиз вместо прямого культивирования микроорганизмов.

В ходе исследования было выявлено, что выход целлюлозы и степень ее делигннфикгции зависят от активности использованного культурально-го фильтрата и продолжительности обработки. Определяющим фактором при ферментативной обработке щепы является время, необходимое для диффузии фермента вглубь образца. При длительности сбработки 5 сут была подобрана оптимальная активность культуральиогс фильтрата (соотношение лкгниназа:лакхаза:ксиланаза составило 20:10,5:3,5 единиц активности на 1 г древесины;. В этих условиях получена целлюлоза с выходом 503 и жесткостью 12 ед.Каппа.

Ферментативная обработка позволяет сократить продолжительность водно-этанольнсй варки в 1,5 раза (до 12Q мин) для получения полуфабрикатов той же степени делигнификации. Применение биологической обработки также позволяет без использования катализатора достичь большей глубины провара, причем избирательность делигнификации при ОСВ биологически обработанной древесины несколько зыке.

Важную информацию для оценки вклада биологической стадии в процесс делигнификации могут дать сведения о свойствах литников органо-сольвентной варки. Нормированные гель-хрсматограммы щелоков ССВ биологически обработанной древесины (рис.6) отличаются от гель-хроматограмм щелока ОСВ исходной древесины и нативного лигнина осины тем, что имеют бимодальный характер. Появление низкомолекулярных фракций в щелоках от варки биологически обработанной, древесины свидетельствует о процессах деструкции лигнина, происходящих под действием грибов. Причем с увеличением периода биопредобработки до 10 сут доля низкомолекулярных фракций увеличивается до 2455. Однако з процессе ОСВ лигнин яе только извлекается из древесины и разрушается, но и претерпевает полимеризационные превращения.

Рис.6 Нормированные гель-хрсматограммы щелоков ОСВ, полученных после биодеструклии осины грибами Т. тШозиз (А) и запяи!пеа (Б) и исходной осины (В).

1 1 т

Методом количественной спектроскопии ЯМР Н я С выявлено, что з результате зодно-этансльнсй варки за счет реакций разрыва простых эфирных сзязей и С-С сзязей алифатической цепи происходит деструкция

лигнина. Биологическая обработка древесины знссит свсй зклад з этот процесс (табл.1 ). В зависимости от комплекса продуцируема грибом ферментов она осуществляется разными путями, как отмечено зыпе, и обеспечивая частичную деструкцию лигнина, приводит к более легкому его извлечению з процессе осганссояьзентной заски.

обоазсм, эз^^'в сффеу'ттчн"с/''гпь бнол/^т^тт'£=1с*"ги7' с^лий з~а— денных з технологическую цепь получения целлюлсзы: биоделигнификация древесины перед органосользентной варкой позволявувеличить селективность варки, а введение ступени биоделигнификацин в схему пероксидной отбелки дает возможность получить целлюлозу с белизной на уровне товарного продукта.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг древоразрушаших грибов по лигниндеструк-тируэдей способности и способности продуцировать лигниназу. Среди исследованных грибов выбраны ранее мало изученные штаммы базидиомицетов Ph. sanguínea и Т. Tlllosus, которые обладают наибольшей избирательностью деструкции лигнина.

2. Показано, что _лигнинолитическая и.-, целлюлолитическая способности гриба Ph. sanguínea зависят от взаимного сочетания содержания в питательной среде азота, глюкозы, микроэлементов и ■ пероксида водорода. Выявлено стимулирующее влияние вератрового спирта на лигнинолитичес-кую способность гриба. Построена математическая модель процесса био. делигнкфикации небеленых целлюлоз и найден - оптимальный состав питательной среды, _ в .условиях..которой - при заданном пределе деструкции целлюлозы 10% может быть достигнута степень делигнкфикации 45%.

3. Методом количественной спектроскопии ЯМР'Н и С и эксклюзионной жидкостной хроматографии исследованы пути биодеструкции лигнина, направление которых зависит ст комплекса продуцируемых грибом ферментов. Показано, что PH. sanguínea осуеестзляет окислительную деструкцию за счет реакций разрыва преимущественно по алкил-фенильнкм связям, з Г. 7lilcsus - по угдесод-углеоодным связям алифатической цепи.

Установлено, что ззедение предварительной стадии биологической деструкции лигнина з схему пероксидной отбелю! наряду с комплексосб-разователем и катализатором дает зозмс:хнссть без использования хлср-

TQ^vg.'ij v í^oa — тцаъгггЪ rrr* тт tftryv» ^."пру уг^лпаа г-л лппд-

энию остаточного лигнина и белизне (82%) близка к товарной беленой ялшозе, полученной по традиционной схеме отбелки. Оценен вклад би-эгическсй стадии в увеличение белизны: для лиственной целлюлозы -1%; для хвойной - 3,5%. Выявлены химические изменения, происходящие сромсфорнсм составе остаточного лигнина в процессе отбелки на бионической и персксидной ступенях.

Установлено, что грибы рода Trametes способны продуцировать лигни-5у, лакказу, (З-гдюкозидазу, ксиланазу и целлюлазу. Состав внекле-сных ферментов зависит от возраста культуры. Доказана делигнифипи-:цая способность днгниназных и лакказных препаратов, и гидролкти-:кая способность ксиланазных. Ферментная обработка позволяет псзы-'ь белизну лиственной целлюлозы на 4-7%.

Достигнуто поведение избирательности процесса водно-зтансльной ки за счет предварительной микробиологической делигнификации. По-!ано, что с использованием как микроорганизмов, так и их ферментных длексов можно добиться увеличения выхода целлюлозы на 2% по сравню с контрольным образцом при одинаковой жесткости или сократить должительность зсдно-этанолъяой заски з 1,5 раза для получения люлозы с той же степенью делигнификации.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Медведева С.А., Езбкин В.А., Волчатова И.В., Соловьев В.А., Малы-э О.Н., Спиридонова Л.Н., Александрова Г.Л. Изучение лигниназной шности базидиомицета Phanerochaete sanguínea. Химия древесины. 5. N6. с.75-76.

иександроза Г.1., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.A., Masa О.Н., Иванова 0.3. Влияние состава питательной среды на лигни-гую активность бзгидиомицета Phanerochaete sanguínea. Химия дрезе-:. 1989. N6. с. -80.

лексаядрова Т.П., Медведева С.А., Балахчи Г.К., Бабкин В.А., Со-ез В.А., Малышева О.Н. Оптимизация процесса биоделигнификации ли-еллюлозных материалов грибом Phanerochaete sanguínea. Химия дрены. 1985. N6. о.8'-83.

абкин В.А., Соловьев В.А., Александрова Г.П., Медведева С.A., Masa О.Н., Способ отбелки сульфатной целлюлозы. А.с. 1650835. Б.И. с.121 ст 23.0с.* 991

эдведева С.А., Александрова Т.П., Бабкин З.А. Перспективы и труд-í использования .-¿икрооргзнизмоЕ з целлюлозо-бумажной промкшленно-

сти. Химия древесины.1991. N1. с.3-16.

6. Александрова Г.П., Медведева С.А.. Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Исследование некоторых факторов, влияющих на ферментативную активность гриба Phanerochaete sanguínea. Химия древесины. 1993. N4. с.55-60.

7. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Изучение условий трансформации лигноцеллюлозного субстрата базидиомицетом Phanerochaete sanguínea в присутствии предгидроли-зата. Химия древесины. 1993. N4. с.37-40.

8. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Совершенствование биологической отбелки сульфатной целлюлозы. Химия древесины. 1993. N4. с-14-17.

9. Александрова Г.П., Медведева С.А., Заказов А.Н., Бабкин В.А., Бу-ряченков М.И., Волчатова И.В. Способ получения целлюлозного полуфабриката. Патент РЗ 93019492/12. 1993.

10. Медведева С.А.. Александрова Г.П., Бабкин В.А. Използуването на микроорганизма в целулозно- хартиената промшленост. Целулоза и хартия. 1991. 21,N6. с.3-9.

11. Aleksandrova G.P., Buryaciienkov M.I., Medvedeva S.A., Zakazov A.N., Babkln Y.A. Microbiological dellgnincatlon - the basls for ecologically sound pulplng technology. 7th. Int. Symp. Wood and Pulp. Ctiem. Beljjlng. China. 1993.

12. Babkin V.A., Zakazov A.N., Medvedeva E.N., Yerremova G.G., Aleksandrova G.P., Medredeva S.A. A process for chlorlne- free bleacñlng о Г kraft hardwood cellulose. 1994 Int. Pulp BleachJLng Coní. Toronto. Cañada.