Модели динамики полиэлектролитов в процессах электрокинетического фракционирования тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

Фрумин Леонид Лазаревич

МОДЕЛИ ДИНАМИКИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ В ПРОЦЕССАХ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОГО ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

01.04.07 — «физика конденсированного состояния»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в Новосибирском государственном университете.

(

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Романовский Юрий Михайлович

Защита состоится "23" ноября 2005 года в 16:00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.002,01 в Московском государственном университете, по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, Физический факультет, аудитория ЮФА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Физического факультета

доктор физико-математических наук, профессор Халатур Павел Геннадьевич

доктор физико-математических наук Криксин Юрий Анатольевич

Ведущая организация: Институт неорганической химии СО РАН

им. А.В. Николаева

МГУ.

Автореферат разослан "18" 01

диссертационного совета Д 51

Ученый секретарь

к.ф.-м.н.

Лаптинская Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Электрокинетические методы фракционирования (сепарации) макромолекул полиэлектролитов, в особенности — гель-электрофорез [1,2] и электрофокусирование [3,4] в последние десятилетия испытали стремительный прогресс и развитие и в настоящее время признаны одними из наиболее мощных инструментов поиска и сепарации макромолекул ДНК, белков и их комплексов и других биополимеров. Всевозрастающий интерес к этой области исследований обусловлен главным образом тем, что электрокинетические процессы фракционирования полиэлектролитов составляют технологическую основу современной экспериментальной молекулярной биологии. Применение гелей для фракционирования макромолекул стало базовой инновацией в электрокинетических технологиях сепарации и позволило преодолеть главную трудность ранних методик электрофореза — конвективную неустойчивость электролита, возникающую при прохождении электрического тока.

Диссертационная работа посвящена моделям динамики полиэлектролитов в гелях в сеансах импульсного гель-электрофореза [5,6] и электрофокусирования [3,4], так как именно эти электрокинетические процессы имеют наибольшее практическое значение, как основа наиболее эффективных технологий фракционирования. Возникающий при этом широкий круг проблем и задач тесно связан с целым комплексом научных направлений физики конденсированного состояния.

Актуальность и важность исследования динамики полиэлектролитов в процессах электрокинетического фракционирования обусловлены тем, что теоретическое обоснование и интерпретация многих современных экспериментальных результатов и методик заметно отстают от потребностей практики. Среди наиболее известных проблем в этой области укажем задачу изучения импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК, которая до настоящего времени не имела адекватного ее значимости теоретического описания и интерпретации, а также инструментов надежного прогноза рабочих областей параметров и качества фракционирования. Импульсный гель-электрофорез, предложенный в работах [5,6], является основным и весьма эффективным методом сепарации длинных полимерных цепей ДНК. Он основан на необычной динамике полиэлектролитов в переменных (импульсных) полях, которая экспериментально изучалось в работах [7-10]. Несмотря

на обилие теоретических моделей и подходов (см. обзоры моделей в [2, 11]), теория импульсного гель-электрофореза до настоящего времени отсутствовала. В отличие от случая постоянного электрического поля, не позволяющего разделять длинные полимерные цепи, в импульсном поле у полиэлектролита наблюдается заметная, хотя и не монотонная, зависимость скорости дрейфа от размера полимерной цепи. Эта зависимость меняется с изменением периода электрического поля, что указывает на дисперсионный характер этого явления. Чтобы объяснить эту зависимость автор вводит понятие дисперсии электрокинетической подвижности и связывает его с таким фундаментальным свойством цепных полимеров, как их линейная память [12,13]. Дисперсия электрокинетической подвижности представляет большой интерес для современной физики полимеров и позволяет построить теорию как одномерного [6], так и двумерного [5] импульсного гель-электрофореза. Дисперсионный эффект тесно связан с нелинейным характером электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных электрических полях. Изучение дисперсионных и нелинейных свойств подвижности полиэлектролитов в процессах импульсного гель-электрофореза составляет ведущее направление исследований в диссертации.

В работе проводится анализ динамики движения полимерных цепей в импульсных полях и делается вывод о неадекватности диффузионных подходов основанных на теории рептаций [14] для описания динамики длинных полимерных цепей в умеренных и сильных полях. Предложен альтернативный — «гидродинамический» - подход, учитывающий упругие «энтропийные» силы полимерной цепи, который позволяет преодолеть трудности диффузионных моделей и открывает новое направление в теоретических исследованиях динамики полимерных цепей в геле в сильных импульсных полях. В основу «гидродинамического» подхода положено полученное методами статистической физики уравнение состояния для отрезка полимерной цепи в одной поре геля, называемого в теории скейлинга - «блобом» [12,15].

Большое внимание в работе уделено методам электрокинетического фокусирования макромолекул. Предельное разрешение методик фракционирования, достигнутое в методе изоэлектрического фокусирования [3, 4,16,17] до настоящего времени ограничено не очень большими по размерам белками и умеренным диапазоном рН среды. Метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в настоящее время является, пожалуй, наиболее мощным аналитическим методом сепарации белков. Применение метода электрофокусиро-

вания не только для сепарации белков, но и для других биополимеров остается актуальной нерешенной проблемой.

Возможность фокусирования амфотерных полиэлектролитов в диффузионных градиентах рН без применения амфолитов давно привлекает к себе внимание исследователей. Недавно в [18] были вновь получены решения стационарных уравнений для градиентов концентраций ионов в электрическом поле и предложено их использовать для изоэлектрического фокусирования белков. Вместе с тем, изучение стабильности, устойчивости таких стационарных градиентов концентраций ионов до настоящего времени вообще не проводилось, хотя еще 30 лет назад X. Рильбе [16,17] указал на неустойчивость градиентов распределений ионов. Исследование перечисленных и других важных аспектов метода электрокинетического фокусирования способствует расширению области применения метода и спектра исследуемых с его помощью макромолекул полиэлектролитов.

С самого начала работы предполагалось получение результатов прикладного, инновационного характера, в том числе — разработка новых подходов и способов фракционирования и фокусирования макромолекул. На основе разработанных моделей динамики полиэлектролитов в электрокинетических процессах сепарации в работе предложены и апробированы новые методы фракционирования — нелинейный импульсный гель-электрофорез и нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях, а также методика быстрой сепарации длинных фрагментов ДНК.

Двойной слой и его поляризация во внешнем поле играют определяющую роль во всех электрокинетических процессах и явлениях, а также и в процессах электродной кинетики, протекающих на электродах[19]. Моделирование двойного слоя и электродной кинетики, включая расчет вольтампер-ных характеристик и моделирование тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода, имеют самостоятельное значение для разработки систем контроля буфера в современных микрофлюидных системах сепарации и в капиллярном электрофорезе.

Целью работы является развитие физических основ современных электрокинетических процессов фракционирования и фокусировки полиэлектролитов для повышения эффективности и расширения возможностей существующих и разработки новых практических электрокинетических методик сепарации. .

В ходе исследования рассматривались следующие основные задачи: изучение нелинейных и дисперсионных свойств электрокинетической подвижности макромолекул на примере импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК;

разработка теоретических моделей динамики полиэлектролитов, позволяющих объяснять ключевые эксперименты по импульсному гель-электрофорезу макромолекул;

исследование процессов электрофокусирования полиэлектролитов, включая изоэлектрическое фокусирование и фокусирование в неоднородных электрических полях;

разработка новых — нелинейных методов электрофореза и фокусирования макромолекул и исследование нелинейной электрокинетической подвижности полиэлектролитов;

методические вопросы моделирования электрокинетических явлений и процессов.

Работа выполнена в Новосибирском государственном университете в соответствии с планами научных исследований НИЧ НГУ по темам С-98 и С-01,-02 «Разработка методов и устройств для фракционирования биологических макромолекул».

На защиту выносятся:

1. теоретические модели электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных полях и их приложения для описания одномерного и двумерного импульсного гель-электрофореза, включая дисперсионную модель, модель неидеального одномерного газа рептонов и теорию одномерной «гидродинамики», призванную заменить теорию рептаций для случая длинных полимерных цепей и умеренных и сильных полей;

2. результаты численного моделирования диффузионной теории рептаций и теории «одномерной гидродинамики» на кластере из 11 компьютеров;

3. модели процессов электрокинетического фокусирования макромолекул в градиенте рН и в неоднородных электрических полях, а также критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования. Комплекс программ для расчета неоднородных электрических полей и моделирования движения макромолекул полиэлектролитов в сеансах импульсного гель-электрофореза и в процессах электро фокусирования;

4. практические приложения разработанных теоретических моделей:

новый метод нелинейного импульсного гель-электрофореза для сепарации биологических макромолекул, включая фрагменты ДНК и комплексы белков;

новый метод электрокинетического фокусирования макромолекул - нелинейная фокусировка полиэлектролитов в неоднородных электрических полях;

оригинальная методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК для скоростной биомедицинской диагностики бактериальных заражений;

5. результаты экспериментов по наблюдению нелинейной подвижности полимерных цепей ДНК и комплексов белков с ионными детергентами;

6. методические результаты: асимптотическая теория двойного слоя для сферического электрода с учетом сложной кинетики электродных реакций в электролитах и основанный на этой модели алгоритм расчета вольтам-перных характеристик, а также его приложения к решению обратных задач электродной кинетики;

Научная новизна. Выполненное исследование позволило автору получить ряд новых научных, методических и прикладных результатов:

развита дисперсионная теория электрокинетической подвижности полиэлектролитов, позволившая объяснить ключевые эксперименты по импульсному гель-электрофорезу ДНК и научиться предсказывать области эффективной сепарации;

для описания движения длинных полимерных цепей в импульсных полях предложена новая теория одномерной «гидродинамики», включающая впервые полученное термодинамическое уравнение состояния отрезка цепи в поре геля, а также нелинейное уравнение динамики длины полимерной цепи в геле;

получено аналитическое описание нестационарного процесса электрокинетического фокусирования полиэлектролитов, Исследована устойчивость градиентов рН в электрических полях в многокомпонентных буферных системах и получен критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования;

на основе теоретических моделей и численных расчетов предложены и апробированы новые методы фракционирования - метод нелинейного импульсного гель-электрофореза и метод нелинейной фокусировки макромолекул в неоднородных электрических полях;

в сеансах импульсного гель-электрофореза впервые обнаружена аномальная зависимость нелинейной подвижности от размеров макромолекулы для фрагментов ДНК и комплексов белков и ионных детергентов;

впервые получена нелинейная фокусировка молекул ДНК в неоднородных электрических полях;

предложена и апробирована новая методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК, позволяющая исключить инверсию фракций, увеличить скорость сепарации в 4-5 раз, по сравнению с лучшими мировыми образцами;

На основе асимптотической модели двойного слоя, с учетом сложной электродной кинетики, развит метод оценки параметров в задачах электродной кинетики;

Практическая значимость работы. Практическому приложению рассматриваемых в работе теоретических моделей и расчетов в работе уделено особое внимание. Разработанные модели подвижности длинных цепей ДНК и комплексы программ являются необходимыми для практики инструментами прогноза эффективных областей сепарации макромолекул. На основе развитых моделей динамики полиэлектролитов в работе предложены новые практические методы электрофореза — нелинейный импульсный электрофорез ДНК и комплексов протеинов, нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях, а также прикладная методика быстрой сепарации длинных фрагментов ДНК, которая представляет большой интерес для скоростной биомедицинской диагностики.

Достоверность результатов работы основана на тщательном анализе развиваемых моделей, сопоставлении расчетных данных с аналитическими моделями и данными эксперимента, тестировании численных алгоритмов на известных аналитических решениях, а также на использовании аналитических вычислений на ЭВМ.

Апробация работы. Полученные результаты докладывались на научных семинарах Кафедры общей физики Физического факультета Новосибирского государственного университета, Кафедры физики полимеров и^ кристаллов Физического факультета МГУ, а также на научных семинарах институтов РАН, в частности, на семинарах Института цитологии и генетики СО РАН, Института химической кинетики и горения СО РАН, Института вычислительных технологий СО РАН, Института теплофизики СО РАН.

Основные результаты докладывались на отечественных и международных конференциях и симпозиумах: на III Генеральной ассамблее Ассоциации азиатских Академий наук -"The Impact of Biotechnological Advance in Asia", 2002 (Израиль), на III международном конгрессе электрофоретических обществ ICES-2001 Верона, (Италия), на VI Симпозиуме "Interface of Regulatory and Analytical Sciences for Biotech Health Products" 2002 (Япония), на международных конференциях "Хроматография высокого давления" HPLC99 (Испания) 1999, XIII международной конференции по диэлектрическим жидкостям, Нара, 1999, (Япония), на VII Португальском и III Иберийском симпозиуме по электрохимии, Фаро (Португалия), 1995, на V международной конференции «Кинетика в аналитической химии», Москва, 1995, Всесоюзной школе-семинаре: «Теория и методы решения некорректно поставленных задач», Новосибирск, 1983, III Всесоюзной школе-конференции по современным методам магнитного удержания, нагрева и диагностики плазмы, Харьков, 1982.

Публикации. Содержание диссертации отражено в 25 работах в журналах и сборниках, из них 8 статей в журналах из списка ВАК, 1 Web-публикация ([13*]) и 3 публикации в трудах конференций.

Личный вклад автора. Все теоретические результаты и результаты моделирования, вошедшие в диссертацию, получены при определяющем личном участии автора в постановке и решении задач. Программный код. дисперсионной модели выполнен автором, код одномерной гидродинамической модели подготовил В.В. Часовских, код комплекса "Laplas" — Ю.А. Целовальников. Автор участвовал в постановке, организации и анализе результатов приведенных в работе электрофоретических экспериментов, а сами эксперименты были выполнены С.Е. Пельтеком.

Структура и объем диссертационной работы. Общий объем работы включает 266 страниц, в том числе 44 рисунка и 3 таблицы. Работа состоит из введения, пяти глав с выводами, заключения, приложения и списка цитируемой литературы (236 наименований).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обосновывается актуальность рассматриваемых в диссертации задач, сформулированы цель, основные задачи работы и положения, выносимые на защиту.

В Главе 1 на основе теории рептаций П. де Жена [14] рассматривается динамика движения полимерных цепей ДНК в сеансах импульсного гель-

электрофореза. Диффузионные модели, основанные на теории рептаций, удовлетворительно описывают стационарный электрофорез относительно коротких полимерных цепей (до 30-40 тысяч пар нуклеотидов - тпн). В середине восьмидесятых годов появился импульсный гель-электрофорез, позволивший фракционировать длинные цепи ДНК, размером в сотни и тысячи тпн. При этом возникла необходимость теоретического описания таких необычных эффектов импульсного гель-электрофореза, как «антирезонанс» - глубокий минимум подвижности и инверсия фракций.

В разделе 1.2 Главы 1 представлена дисперсионная модель динамики полимерной цепи в геле, основанная на фундаментальном свойстве , цепных полимеров - их линейной памяти. Дисперсионная модель опирается на известную формулу П. де Жена [14] для скорости дрейфа полимерной цепи во внешнем поле, согласно которой эта скорость пропорциональна среднему квадрату вектора Р, соединяющего начало и конец цепи. В работе показано, что благодаря линейной памяти цепных полимеров [12,13], конформация полимерной цепи в геле «запоминает» последовательность изменений импульсного электрического поля. При этом входящий в формулу де Жена вектор Р, соединяющий начало и конец полимерной цепи, представим в виде линейного фильтра, на вход которого подается внешнее импульсное поле. Постоянная времени фильтра совпадает с временем тл обновления конфигурации цепи в геле под действием поля. При этом скорость дрейфа нелинейно зависит от амплитуды поля, а реакция фильтра объясняет наблюдаемые в эксперименте дисперсионные эффекты. Дисперсионная модель вполне удовлетворительно описывает ключевые эксперименты для одномерного инверсионного и двумерного импульсного гель-электрофореза ДНК. Заметим, что в случае постоянных полей дисперсионная модель приводит к известному соотношению А.Ю. Гросберга и А.Р. Хохлова [12 (п.35)] для нелинейной скорости дрейфа макромолекул. В разделе 1.3 описана численная схема и представлены расчеты, выполненные в рамках предложенной дисперсионной модели как для одномерного инверсионного, так и для двумерного импульсного гель-электрофреза полимерных цепей ДНК. Часть результатов расчетов приведена на Рис. 1 и 2.

Сравнение дисперсионной модели и эксперимента, представленное на Рис. 2, показывает, что предложенная модель позволяет количественно интерпретировать минимум подвижности, наблюдаемый в «антирезонансе» и прогнозировать области эффективной сепарации макромолекул

10 В/см 6 В/см 4 В/см

В/см

10 100 1000 Рис. 1. Результаты расчета зависимости скорости дрейфа центра масс фрагмента ДНК от длительности Т+ положительного импульса поля для четырех разных амплитуд поля. Длина фрагмента ДНК - 670 тысяч пар нуклеотидов (тпн).

U отн. ед.

1 i I -—1

<4-

8 6 4 2 О

тпн 845

645

445

245

45

Рис. 2. Сравнение расчета по дисперсионной модели (сплошная линия) и экспериментальных данных (+) о скорости дрейфа U фрагментов маркера ДНК «DNA Lambda ladder».

В разделе 1.4 рассмотрен метод и результаты численного моделирования диффузионной теории рептаций, предпринятого с целью проверки ее применимости для описания импульсного гель-электрофореза длинных полимерных цепей. Для решения одномерного уравнения диффузии рептонов вдоль примитивного пути полимерной цепи применялась неявная центрированная разностная схема. Важным элементом расчетного алгоритма является механизм рождения и исчезновения ячеек на концах цепи. Если суммарная длина рептонов, которые «втекли» в краевую пору геля, превышала равновесную длину цепи в поре, то добавлялась новая ячейка с равновесной плот-

ностью рептонов ро- Аналогично проводится и уменьшение числа ячеек. Такой алгоритм сохраняет постоянной полную (контурную) длину цепи. Исследование диффузионной модели рептаций проведенное на основе численного моделирования одномерной диффузии рептонов, показало, что диффузионные модели имеют ограниченную область применимости и не могут описывать длинные полимерные цепи в сильных импульсных полях. Расчеты часто приводили к неподвижной и-образной конфигурации цепи. Движение цепи попавшей в такую конфигурацию было невозможно, так как средняя часть цепи практически лишена рептонов вследствие их экспоненциального больцмановского распределения вдоль ветвей и-образной конформации. В разделе 1.5 представлена модель неидеального газа рептонов в сильном внешнем поле. В сильных полях статистическую задачу о распределении флуктуаций полимерной цепи можно исследовать асимптотически точно в приближении малых углов изгиба цепи. Стационарное распределение рептонов в сильных полях заметно отличается от экспоненциального распределения Больцмана. При этом подвижность рептонов ц зависит от их плотности р по закону ¡л ~р2, что приводит к квазилинейному уравнению диффузии неидеального одномерного газа рептонов. Расчеты, выполненные с учетом отклонения газа рептонов от идеальности, заметно «оживили» динамику движения полимерных цепей, однако проблема и-образных конформаций для диффузионных моделей основанных на теории рептаций не была преодолена. Анализ результатов численного моделирования теории рептаций приводит к выводу, что важнейшим элементом при описании импульсного гель-электрофореза длинных полимерных цепей ДНК должен быть учет упругих сил натяжения, возникающих из-за теплового движения сегментов цепи.

В Главе 2 предложена новая динамическая теория движения полимерных молекул - теория одномерной «гидродинамики», призванная заменить диффузионную теорию рептаций в случае длинных полимерных цепей и умеренных и сильных внешних (импульсных) полей, когда необходимо учитывать упругие «энтропийные» силы, обусловленные тепловыми флуктуа-циями сегментов полимерной макромолекулы. «Гидродинамическое» описание динамики полиэлектролита базируется на методах статистической физики полимеров и использует элементы теории скейлинга [12,15], в частности -понятие блоба. Известно, что при описании движения сплошной среды в случае малых упругих сил давления вполне пригодно диффузионное приближение. Однако с ростом упругих сил необходимо гидродинамическое описание, включающее уравнение состояния среды, которое связывает упру-

гую силу и плотность среды. Аналогично при рассмотрении движения полимерной цепи в случае коротких цепей и сравнительно малых сил упругости, можно ограничиться диффузионным приближением и использовать диффузионную теорию рептаций. Однако в случае сильного натяжения цепи внешним полем и больших упругих сил, что характерно для импульсного гель-электрофореза длинных полимерных цепей ДНК, необходим качественно иной способ описания, корректно учитывающий «энтропийные» упругие силы, сходный с гидродинамическим описанием в физике сплошной среды.

Начало Главы (разделы 2.2 и 2.3) посвящено статистическому описанию флуктуирующей свободно-сочлененной цепи [12] представимой в виде последовательности жестких сегментов с характерным размером Ъ. В присутствии упругой силы / статистика конформаций блоба - отрезка цепи находящегося в одной поре геля, описывается статсуммой Z, которая позволяет найти среднюю относительную длину w отрезка цепи в поре - плотность длины. Эта плотность находится из уравнения, определяющего среднеквадратичный размер поры h2 = <(£k zk)2>+ > + <(Ekxk)2>. Здесь величины xk, -

декартовы координаты k-ro сегмента цепи в поре, а угловые скобки < > означают усреднение по всем статистически возможным конформациям сегментов блоба. Искомое выражение имеет вид:

Д(/?) = [(wo/w - \)/(ww0 -1)]ш (1)

Где A(ß) — функция Ланжевена, ß=fb!T, vv0 — равновесная плотность длины цепи в отсутствии внешних полей, Г — температура в энергетических единицах. Уравнение (1) неявно описывает зависимость упругой силы / от плотности длины w, и его следует называть термодинамическим уравнением состояния блоба, по аналогии с зависимостью давления от плотности газа. Использование уравнения состояния характерно для гидродинамических способов описания движения сплошной среды. Именно поэтому развиваемая модель динамики полиэлектролитов была названа гидродинамической. На краях цепи упругие силы малы, и здесь необходимо учитывать электрическое поле. В разделе 2.2.3 проведен теоретический расчет многопараметрического статистического интеграла для заряженной полимерной цепи в электрическом поле, который применяется для оценки плотности длины на краях цепи и для постановки краевых условий в численном алгоритме моделирования динамики цепи. Показано, что граничное значение плотности длины цепи совпадает с равновесной плотностью w0 длины цепи в отсутствии внешних полей.

Из условия равновесия упругих и электрических сил и сил вязкого трения, действующих на отрезок полимерной цепи, находящийся в поре геля, получено уравнение для потока] длины цепи в поре.

У = ьоь(в) + цЦ- (2)

& ■

Здесь х ' плотность заряда цепи, 9 обозначает угол между направлениями вектора поля и поры геля, параметр ц аналогичен коэффициенту подвижности, 5 - координата вдоль примитивного пути цепи. Поток длины приводит к изменению ее плотности и к движению полимерной цепи в целом. В последующем рассмотрении используется закон сохранения длины цепи в виде одномерного уравнения непрерывности

^ + ^ = 0 (3)

Э/ д5 ^

Движение полимерной цепи в геле полностью определяется совместным решением уравнений (1),(2) и (3). Подставляя выражение (2) в уравнение (3), получим нелинейное уравнение «одномерной гидродинамики»:

ды _£[>усо5(0)] а2/ А

дt Ш <75

Сходство уравнения (4) и уравнения диффузии одномерного газа реп-тонов П. де Жена объясняет сравнительно успешные попытки распространить область действия диффузионных моделей за пределы их области применимости. Важно отметить нелинейный характер уравнения (4), который предсказывает заметную нелинейную подвижность цепей ДНК. Нелинейный электрофорез полиэлектролитов рассматривается далее в Главе 4 диссертации.

Теория одномерной «гидродинамики», вслед за теорией рептаций, также приводит к формуле П. де Жена для средней скорости дрейфа центра масс полимерной цепи (раздел 2.3.1), что позволяет обосновать опирающуюся на эту формулу дисперсионную модель, рассмотренную в предыдущей главе для случая длинных полимерных цепей в умеренных и сильных электрических полях.

В завершении Главы (разделы 2.4 и 2.5) теория одномерной «гидродинамики» используется для численного моделирования на кластере из 11 компьютеров динамики движения длинных полимерных цепей под действием внешних импульсных полей. Целью моделирования была проверка работоспособности теории, а также выяснение условий, при которых возникает глубокий, почти десятикратный минимум подвижности, наблюдаемый в «анти-

резонансе». Численная модель, сходная с описанной в Главе 1, использовала дискретизацию нелинейного уравнения (4) динамики длины полимерной цепи в геле.

Ветвления цепи, возникающие при «переполнении» плотности длины в порах геля, когда плотность длины уг превышает равновесную м>0 и цепь начинает просачиваться в соседние поры, имеют большое значение в динамике цепи и приводят к заметной ориентации цепи вдоль поля даже в сравнительно слабых полях. Расчеты выявили важную роль объемных взаимодействий [12,20] в ветвлениях цепи.

Численные расчеты подтвердили глубокий минимум подвижности в «антирезонансе», что иллюстрируется Рис. 3, на котором приводятся результаты расчетов средней скорости дрейфа для фрагмента полимерной цепей ДНК размером 340 тпн (тысяч пар нуклеотидов).

Результаты расчетов динамики полимерной цепи ДНК представлены на Рис. 4, где приводится картина движения цепи за один период импульсного электрического поля.

2 4 6 8101 2 4 6

ТЛс]

Рис. 3. Результаты расчета зависимости скорости дрейфа фрагмента ДНК от длительности положительного импульса поля, в сеансе импульсного гель-электрофореза. Длина фрагмента - 340 тпн.

.—-с«- ■

Е [В/см]

! /=0с

г=1.35с

г—2.7с

/=4 .05с

г=5 .4с

г=6.75с

Г— 8 . 1 с

Г=1 0.8 с

-т—

■4

Л" [ м к м ]

—г»-

+ 4

0 10 20 30 40

Рис. 4. Последовательные стадии динамики движения цепи ДНК в переменном электрическом поле. Расчет соответствует размеру цепи 340 тпн. Напряженность поля £+= -£_=4 В/см. Длительность положительного импульса поля в 3 раза больше длительности отрицательного импульса. Период поля - 10.8 сек. Ветвления цепи выделены жирными линиями.

Глава 3 посвящена исследованию процессов электрокинетического фокусирования макромолекул. В разделе 3.2 Главы рассмотрено уравнение диффузии, которому подчиняется распределение концентрации частиц некоторой фракции макромолекул с(х) в процессе фокусирования:

дс дЩх)с =вдгс дt дх дхг

Здесь и(х) = £/0(1 - кх) скорость дрейфа частиц, линейно зависящая от координаты х, О — коэффициент диффузии частиц в среде. Показано, что уравнение (5) допускает точное аналитическое решение, которое имеет вид:

с(х Л = —ехр|— Г*-*оО-ехр(-£/0*/))]2] (6)

Здесь х0 = Л"1значение координаты точки фокусирования, с0 — начальная концентрация молекул. Для эффективной ширины распределения получено выражение

8(0 = ^о-2 ехр(~21/0к/) + ^[1- ехр(-2 С/0&)] (7)

Полученное нестационарное гауссово распределение (6)-(7) полностью определяет закон изменения концентрации движущихся амфотерных макромолекул в процессе электрокинетического фокусирования и позволяет аналитически описывать весь процесс электрофокусирования полиэлектролитов.

В разделе 3.3 исследуется устойчивость градиентов рН, применяемых в задачах изоэлектрической фокусировки [4]. Исследование устойчивости стационарного решения для случая плоской задачи проводится методом Фурье [21,22]. Сначала рассмотрена абсолютно устойчивая амбиполярная диффузия для буферной системы из двух сортов ионов. На этом примере тестируется метод исследования устойчивости. Затем исследована устойчивость более реальной буферной системы, состоящей из трех сортов (однозарядных) ионов - одного сотра анионов и двух сортов катионов. С помощью программы аналитических вычислений МаШета^са 4.0 было получено дисперсионное уравнение. Оно имеет два корня, один из которых (в отсутствии диффузии) нулевой, а другой содержит вещественную и мнимую части:

со — Е(кх + гк)Р (8)

Параметр Р определяется подвижностью ионов:

в_Ъ+ьа)ъ1+ъм-ьг)2

к > 0 задает градиент концентрации, а параметр z = сус„ есть концентрация второго катиона, отнесенная к концентрации аниона. Знак мнимой части частоты определяется направлением электрического поля Е: Im(co) = Екр. Положительная мнимая часть означает неустойчивость градиента ионов и соответствует электрическому полю, направленному в сторону роста концентрации или падения pH (один из катионов — ион водорода). Полученный критерий можно непосредственно перенести на систему из двух сортов анионов и одного сорта катионов. В большинстве экспериментов используются более сложные, чем система из трех сортов ионов, буферные системы. Нужно отметить, что в случае, когда в системе имеется не менее двух сортов анионов и не менее двух сортов катионов, при любом направлении электрического поля, наблюдается неустойчивость.

В разделе 3.4 Главы изучается электрокинетическая фокусировка макромолекул в неоднородных электрических полях. Неоднородное поле приводит к зависимости скорости дрейфа от координаты и, как показано в предыдущем разделе, к фокусированию фракций макромолекул. В начале раздела ставится задача отыскания всех возможных плоских геометрий слоя геля, для которых форма фракций остается прямолинейной. Для комплексного потенциала Ф(г) электрического поля, в котором форма фракций остается прямолинейной, получено выражение <P(z) = Az2, где А — произвольная константа. Уравнения для скалярного потенциала <р и функции тока у/ в этом случае имеют вид: <р = Ах2 — Ау2, ц/ — 2Аху. Условие постоянства функции тока у/ определяет линию границы геля в плоскости х—у: 2Аху = Const. Таким образом, искомая форма геля, при которой фракции сохраняют прямолинейную форму, представляет собой гиперболический клин. В разделе 3.5 Главы обсуждаются способы расчета электрических полей в клине геля для учета неизбежных на практике краевых эффектов. Для решения краевых задач для уравнения Лапласа, рассматривался метод граничных элементов (МГЭ) [23,24]. Для внутренней задачи Дирихле развит новый алгоритм угловых интегралов, представляющий самостоятельный интерес. В предложенном методе интегрирование по границе области заменено интегралом по углу. Этот угол фактически задает естественную параметризацию границы, что позволяет обойти проблему ее аппроксимации граничными элементами. Тестовые расчеты показали, что предложенный подход заметно, почти в 5 раз, повышает точность численного решения, по сравнению со стандартным методом МГЭ. Для расчета полей в плоском слое геля использовался алгоритм МГЭ с первым порядком аппроксимации функции и границы области. Приведен

расчет полей в гиперболическом отрезке геля, который используется в следующей Главе для нелинейной фокусировки макромолекул ДНК.

В Главе 4 описаны прикладные, практические результаты исследования. Теоретические методы и модели динамики полиэлектролитов в процессах гель-электрофореза и электрофокусирования, представленные в предыдущих главах, позволили обосновать и апробировать новые методы электрокинетического фракционирования — метод нелинейного импульсного электрофореза (НЭФ) молекул ДНК и комплексов белков, метод нелинейного фокусирования полиэлектролитов в неоднородных электрических полях, методику быстрой сепарации больших фрагментов ДНК.

Подавляющее большинство электрофоретических методик сепарации полиэлектролитов основано на линейной зависимости скорости дрейфа макромолекулы от величины приложенного внешнего электрического поля. Линейный закон хорошо выполняется в сравнительно слабых полях, меньших некоторого порога. Для полей превышающих этот порог, наблюдаются заметные отклонения от линейности и появляется нелинейная (кубическая) составляющая зависимости скорости дрейфа от величины поля. Эффект нелинейности скорости дрейфа в электрофорезе давно привлекает внимание исследователей, как возможное средство повышения качества сепарации и расширения возможностей традиционных методик электрофореза. В монографии С.С Духина и Б.В. Дерягина [19] ему посвящена целая глава, где приводится теория для частиц глобулярной (сферической) формы.

Отклонения скорости дрейфа полимерных цепей ДНК от линейного закона неоднократно отмечалось в сеансах гель-электрофореза ДНК, хотя систематического исследования нелинейных эффектов до последнего времени не проводилось. На основе уже упоминавшейся теоретической оценки нелинейного эффекта, предложенной А.Ю. Гросбергом и А.Р. Хохловым в книге [12] можно сделать вывод, что в постоянном поле нелинейная поправка не зависит от размера цепи и приводит к ухудшению разделения длинных цепей в сильных полях. Иначе обстоит дело в случае импульсного электрофореза. Как показано в первой и во второй главах диссертации,, дисперсионный эффект, ответственный за разделение длинных полимерных цепей в импульсных полях представляет собой существенно нелинейный эффект. Именно нелинейная составляющая скорости дрейфа зависит от размера цепи, что и позволяет фракционировать макромолекулы в импульсных полях.

Для исследования нелинейной составляющей скорости дрейфа полиэлектролитов в работе предложен вариант импульсного гель-электрофореза,

с асимметричными импульсами и нулевым средним за период полем. Импульсное поле приводит к дисперсии нелинейной электрокинетической подвижности. При этом наблюдается инверсия фракций разделяемой смеси. В сеансе нелинейного электрофореза при некоторых параметрах импульсного поля наибольшая нелинейная скорость дрейфа наблюдается у больших фрагментов ДНК, что резко отличает нелинейный импульсный электрофорез от «обычного» стационарного гель-электрофореза.

Нелинейный импульсный гель-электрофорез (НЭФ) представляет собой новый инструмент электрокинетического фракционирования макромолекул. Он позволяет манипулировать, управлять движением фракций макромолекул и даже менять направление их движения, заставляя отдельные фракции ДНК двигаться в разные стороны от старта.

Замечательная особенность метода НЭФ состоит в том, что на его основе можно осуществить фокусировку молекул в неоднородном электрическом поле. В сеансе НЭФ можно подобрать параметры неоднородного импульсного поля таким образом, чтобы в некоторой точке линейная и нелинейная составляющие средней скорости дрейфа были направлены в противоположные стороны и уравновешивали друг друга, а средняя за период скорость обратилась в нуль. Возможность нелинейной фокусировки макромолекул в неоднородных полях одними из первых обсуждали Г. Слэтер и М. Чакрон в работе [25].

Представленный в Главе 3 метод фокусирования молекул в неоднородном электрическом поле в гиперболическом клине находит свое применение в методе нелинейной фокусировки. Основные принципы нелинейной фокусировки макромолекул рассматриваются в разделе 4.3 Главы 4. В разделе 4.3 описаны уникальные эксперименты по нелинейному электрофорезу и фокусировке молекул ДНК. В качестве основной модельной смеси для фракционирования был выбран набор фрагментов, полученных при гидролизе ДНК фага Lambda эндонуклеазой рестрикции Hind III. На Рис. 5 представлен результат фокусирования молекул ДНК в агарозном клиновидном геле..Параметры импульсного поля: 81 В х 5 сек и -30 В х 15 сек. Использовался трис-ацетатный буфер и окраска в УФ с помощью бромистого этидия.

Метод НЭФ и нелинейное фокусирование применяются в разделе 4.4 для разработки новой методики быстрой сепарации длинных фрагментов ДНК. Эта методика позволяет исключить инверсию фракций, увеличить скорость сепарации в 4-5 раз по сравнению с лучшими существующими методиками, и при этом, благодаря фокусированию в неоднородном поле, имеет вы-

сокое разрешение для больших фрагментов ДНК, а также монотонную зависимость координаты фракции от размеров молекулы. Методика быстрой сепарации представляет практический интерес для биомедицинской диагностики.

На Рис. 6 представлены результаты разделения хромосом S. cerevisiae, полученные в 8 часовом сеансе электрофореза. Для сравнения, отметим, что аналогичная ЭФГ этого же препарата, полученная по стандартной методике CHEF, требует 28 часов.

Рис. 5. Нелинейная фокусировка фрагментов 27.5 и 23.1 тпн рестриктов HIND III ДНК фага Lambda. Длительность сеанса 48 час.

Рис. 6. Быстрая сепарация фрагментов ДНК дрожжевых хромосом 5. сегеушае.

Завершается Глава 4 рассмотрением метода нелинейного электрофореза комплексов протеинов и ионных детергентов, имеющего первостепенное значение для фракционирования крупных белковых комплексов. Для наблюдения нелинейной скорости дрейфа комплексов белков применяется вариант импульсного гель-электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением ионного детергента додецил сульфата натрия (ДСН). В экспериментах с ком-

плексами белков, как и в случае нелинейного электрофореза ДНК, используется асимметричное периодическое электрическое поле с нулевым средним, пиковой амплитудой до 300 В/см и частотой 100 Гц. На примере белковых маркеров «SDS Rainbow recombinant protein molecular weight markers» фирмы Amersham впервые экспериментально наблюдалась нелинейность скорости дрейфа комплексов протеинов и ионных детергентов в сеансе импульсного гель-электрофореза. В проведенных экспериментах наибольшую нелинейную скорость проявляют белковые комплексы с высокой молекулярной массой. В процессе НЭФ на электроды в течение 12 часов подавалось асимметричное импульсное периодическое электрическое напряжение с параметрами 1000 В х 1.66 мс и -200 В х 8.33 мс. При таких параметрах пиковая амплитуда напряженности поля достигает 300 В/см. Двумерное распределение белковых комплексов (Рис. 7), полученное после сеанса нелинейного электрофореза путем повторного фракционирования в постоянном поле в ортогональном направлении, обнаружило немонотонное распределение фракций маркера, что указывает на возможную дисперсию электрокинетической подвижности комплексов белков и ионных детергентов, подобную той, которая имеет место для полимерных цепей ДНК. Для сравнения, в правой части рисунка представлен образец фирмы Amersham разделения фракций в 12% акрила-мидном геле в системе Лэммли. Некоторые отличия в расположении фракций обусловлены тем, что в данном случае использовался Ю-% гель и иной разделяющий буфер (трис-глицин вместо трис-НС1).

и о

ся j,

О V

<л

NEP (АС)

L»

+"5Srl

—>■

•ч

4 1

1?

[ 5 л • }' I . t

. Л:

j >

-ч * н

25»к Ым

1йк « ум I. «■ rW

IttSk is., .«■<» |цч ■Ик У»"®*

s»k . *.; »«п»'»

эа '

* &,«

25к * .•'

1Л Мк

fci.'V

Рис. 7. Двумерная карта распределения фракций для НЭФ комплексов белков и ионных детергентов^ Горизонтальное направление рисунка соответствует НЭФ, вертикальное — ДСН-электрофорезу. Справа расположен образец электрофореграммы ДСН-маркера фирмы АтегеЬат.

Глава 5 носит методический характер. В начале Главы обсуждается двойной заряженный слой, имеющий фундаментальное значение для всего круга электрокинетических процессов и явлений [19,27]. Исследование двойного слоя необходимо для совершенствования экспериментальной техники электрофореза, в частности для контроля буферных систем в микрофлюидных электрокинетических системах фракционирования. Двойной заряженный слой представляет собой электрокинетический аналог пограничного слоя Прандтля, и поэтому для его исследования применяются асимптотические методы, развитые в задачах физики сплошных сред. Используемый в работе метод сращиваемых асимптотических разложений позволяет полностью описать двойной слой, область квазинейтральности в окрестности сферического электрода и его вольтамперные характеристики, не прибегая к полуэмпирическим моделям и аппроксимациям. В этой Главе предложена макрокинети-ческая модель тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода. Исходя из аналогии между двойным слоем Гельм-гольца и полупроводниковой рт-структурой, модель дает новую трактовку тафелевской зависимости и позволяет теоретически рассчитать величину та-фелевского параметра. Вольтамперные характеристики электрода несут информацию о кинетике электродных реакций, составе и свойствах электролита и позволяют обратиться к численному моделированию обратных задач электродной кинетики. Учитывая важную методическую роль методов решения обратных задач для практических приложений, в конце Главы рассмотрены обратные задачи и методы их решения.

В разделе 5.2 подробно описан метод сращиваемых асимптотических разложений (САР) [26], применяемый для моделирования двойного заряженного слоя в электролитах. Рассматривается сферический электрод радиуса Ко, помещенный в сосуд с раствором электролита с постоянной температурой Г. Электролит содержит анионы и катионы валентности г и 2к, соответственно, невозмущенная концентрация которых в растворе равна С0 и сЛ. Двойной слой вблизи электрода описывается уравнением Пуассона для электрического потенциала Ф, и уравнениями неразрывности для ионов в диффузионном приближении. Граничные условия краевой задачи имеют вид Ф — О, и

Ск = Ск° — вдали от электрода; Ф = Ф0 — на поверхности электрода. Учет конечного размера сольватированного иона, приводит к трехточечной краевой задаче. Полная система граничных условий краевой задачи включает стационарное уравнение гетерогенной кинетики электродной реакции первого порядка. Переход к безразмерным переменным (г = Л/Яо, с — С/С?, <р = еФ/Т, ц>0

= еФо/Т и т.д.) и оценки показывают, что параметром асимптотического разложения Яо в этой задаче является квадрат отношения радиуса Дебая к размеру электрода Я0: Л0 = (/?о//?0)2. В ходе решения краевой задачи пространство вблизи электрода разбивается на две области — область внешнего разложения по малому параметру (область квазинейтральности), и область внутреннего разложения — область двойного слоя. Решение в двойном слое "сращивается" с решением в квазинейтральной области. В итоге, метод САР сводит сложную нелинейную краевую задачу к системе двух трансцендентных уравнений, описывающих вольтамперную характеристику сферического электрода.

В разделе 5.3 приводятся результаты расчетов вольтамперных характеристик, в том числе и для общего случая сложной электродной кинетики, определяемой схемой реакции: у,Аг' о УгА'-. Здесь ги г2 — валентности исходного и восстановленного продукта, подчиненные соотношению \хг\ — у22г2 + п. В качестве примера рассмотрена электродная реакция восстановления персульфата 82082~ +2е~ч~* 25042~. Результаты расчетов вольтамперных характеристик приведены на Рис. 8, для четырех значений концентрации персульфата СД отнесенной к концентрации катионов.

Рис. 8. Результаты расчета вольтамперных характеристик для случая сложной кинетики восстановления персульфата.

Представленные результаты наглядно демонстрируют возможности подхода для количественного описания сложной электродной кинетики. В

24

разделе 5.4 построена макрокинетическая модель тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода. Исходя из аналогии между двойным слоем Гельмгольца и полупроводниковой рт-струкгурой, модель дает новую трактовку тафелевской зависимости.

В разделе 5.5 обсуждаются обратные задачи электродной кинетики. Рассматриваются как методические вопросы решения линейных обратных задач, так и вопросы корректной обработки нелинейных параметрических задач обработки эксперимента. Среди методических вопросов рассмотрены методы регуляризации и нелинейные обратные задачи, приводящие к интегральным уравнениям типа Урысона первого рода с факторизованным ядром.

В Приложении описан комплекс программ «ЬарЬэ», предназначенный для моделирования неоднородных (импульсных) электрических полей и динамики полимерных макромолекул в таких полях.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ:

1. Построена дисперсионная модель динамики полимерных цепей в импульсных полях. Показано, что аномальное поведение подвижности является следствием дисперсии электрокинетической подвижности, обусловленной линейной памятью цепных полимеров, и количественно описывается реакцией линейного фильтра на внешнее импульсное поле. Дисперсия электрокинетической подвижности позволяет объяснять ключевые эксперименты как одномерного инверсионного, так и двумерного импульсного гель—электрофореза ДНК. Дисперсионная модель служит инструментом, позволяющим прогнозировать области параметров эксперимента, где отсутствует инверсия фракций. Предложена модель неидеального одномерного газа рептонов для заряженной полимерной цепи в сильном электрическом поле, расширяющая область применения диффузионной теории реп-таций. С помощью численного моделирования обнаружена ограниченность диффузионных моделей динамики макромолекул при описании импульсного гель-электрофореза длинных полимерных цепей ДНК;

2. Разработана теория одномерной «гидродинамики» для описания движения длинных полимерных цепей в геле в импульсных электрических полях, учитывающая упругие «энтропийные» силы натяжения заряженной цепи и призванная заменить диффузионную теорию рептаций в случае длинных цепей и умеренных и сильных полей. На основе последовательного статистического подхода для модели свободно-сочлененной цепи впервые полу-

чено уравнение состояния для блоба — отрезка цепи в поре геля, связывающее упругую силу натяжения цепи и плотность длины цепи в поре. Динамика движения полимерной цепи определяется равновесием электрических сил, градиента упругих сил и сил трения и описывается нелинейным уравнением диффузионного типа. На основе дискретной модели одномерной «гидродинамики» на кластере из одиннадцати компьютеров проведено численное моделирование движения длинной полимерной цепи ДНК в импульсных электрических полях. Численный эксперимент подтвердил возможности теории одномерной «гидродинамики» объяснить и интерпретировать такие дисперсионные аномалии импульсного гель-электрофореза ДНК, как «антирезонанс» — глубокий минимум подвижности в переменных полях и инверсию фракций. Выявлена особая роль ветвлений цепи и объемных взаимодействий в динамике ее движения;

3. Построена модель процесса электрокинетического фокусирования амфо-терных полиэлектролитов на основе аналитического решения одномерного нестационарного уравнения диффузии с переменными коэффициентами. С помощью аналитических вычислений на ЭВМ впервые теоретически исследована проблема неустойчивости стационарных ионных распределений многокомпонентных буферных систем, применяемых для электрокинетического фокусирования белков, и получен критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования. Показано, что для буферных систем, содержащих не менее двух сортов анионов и не менее двух сортов катионов, градиенты концентраций во внешнем электрическом поле всегда неустойчивы. Разработан комплекс программ «Ьар1аз» для расчета неоднородных электрических полей и моделирования движения макромолекул с учетом нелинейной зависимости их подвижности от амплитуды поля. Предложена новая геометрия геля - гиперболический клин, в которой разделяемые фракции макромолекул имеют прямолинейную форму. На основе МГЭ проведено численное моделирование неоднородных электрических полей в клиновидном геле. Предложена разновидность МГЭ — численный алгоритм угловых интегралов, не требующий аппроксимации границы области;

4. На основе развитых теоретических моделей и численных расчетов предложены и апробированы новые практические методы электрокинетического фракционирования:

метод нелинейного импульсного гель—электрофореза ДНК — способ сепарации макромолекул ДНК по их нелинейной подвижности;

- метод нелинейного электрофореза для комплексов белков и заряженных ионных детергентов. Метод позволяет расширить область применения импульсного гель—электрофореза на случай крупных гидрофобных комплексов протеинов;

- метод нелинейного фокусирования полиэлектролитов в неоднородных импульсных электрических полях;

- методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК, позволяющая исключить инверсию фракций, увеличить скорость сепарации в 4-5 раз по сравнению с другими методиками, и при этом иметь высокое разрешение для больших фрагментов ДНК и монотонную зависимость координаты фракции от размеров молекулы. Методика имеет практическое значение для диагностики бактериальных заражений;

5. В экспериментах по нелинейному импульсному гель-электрофрезу впервые обнаружены:

- аномальная дисперсионная зависимость нелинейной подвижности полимерных цепей ДНК от размера цепи;

- нелинейная фокусировка макромолекул ДНК в неоднородных импульсных электрических полях;

- нелинейная подвижность комплесков белков с ионным детергентом ДСН

- аномальная дисперсионная зависимость нелинейной подвижности комплесков белков и ионных детергентов от их размеров;

6. Для контроля буферных систем в микрофлюидных электрокинетических системах фракционирования проведено моделирование параметрических обратных задач электродной кинетики. Разработана асимптотическая модель двойного слоя и построен численный алгоритм расчета вольтам пер-ных характеристик с учетом сложной электродной кинетики в электролитах. Построена макрокинетическая модель тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: [1*] Преображенский Н.Г., Фрумин. Л.Л. К вопросу о восстановлении потенциала межмолекулярного взаимодействия по вириальным коэффициентам. // Известия Вузов, серия Физика, 1980. N 6. С. 30—33. [2*] Коткин Г.Л., Фрумин Л.Л. Практикум «Моделирование физических явлений» - Новосибирск: НГУ, 1992. - 60 стр.

[3*] Фрумин Л.Д., Зильберштейн Г.В.. Краевые задачи электродной кинетики. / Труды Института Вычислительных Технологий, - Новосибирск, ИВТ СО РАН, 1994. Т. .4. N. 13. С. 258-270. [4*] Вельтмандер П.В., Фрумин Л.Л. Моделирование в курсе электротехники и электроники. - Новосибирск: НГУ, 1995. - 63 стр. [5*] Зильберштейн Г.В., Фрумин Л.Л. О функции Тафеля. //Ж. Хим. Физики, 1995. С. 104-105. [6*] Frumin L.L., Zilberstein G.V. On the Tafel Function. // Proc. of the VII Meeting of the Portuguese Electrocheml Soc. and III Iberian Meeting of Electrochemistry. - Algarve, Portugal, 1995. P. 25—26. [7*] Frumin L.L., Zilberstein G.V.. Steady-state electrode kinetics for the spherical electrode. Proc. of the VII Meeting of the Portuguese Electrochem. Soc. and III Iberian Meeting of Electrochemistry. Algarve, Portugal, (1995) p.

143-144.

[8*] Frumin L.L., Zilberstein G.V. Asymptotic approach in steady—state electrode kinetics for the spherical electrode. // J. Electrochemical Soc., 1997. V. 144. P. 3458-3461. [9*] L.L. Frumin, G.V. Zilberstein. Asymptotic approach in steady-state electrode kinetics for the spherical electrode-II. // J. Electrochemical Soc., 1998. V. 145. P. 720-721. [10*] Frumin L.L.. Angular integral method for the Dirichlet problem. // Вычислительные Технологии, 1998. Т. 4, N. 3. С. 75—78. [11*] Frumin L.L., Zilberstein G.V. — Parametric inverse problems of electrode

kinetics. // Electrochem. Communications, 1999. V.l. P. 97-100. [12*] Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V. - "Wrong" peaks forming conditions in capillary electrophoresis. // Jap. J. of Electrophoresis, 1999. V. 43. P. 43.

[13*] Frumin L.L., Peltek S.E., Chasovskikh V.V., Bukshpan S., Zilberstein G.V. Anomalous size dependence of the nonlinear mobility of DNA: // Phys. Chem. Comm., 2000. N. 11. P. 1-3. [14*] Frumin L.L., Zilberstein G.V., Peltek S.E. The isoelectric focusing problem analytic solution: // J. Biochemical and Biophysical Methods, 2000. V. 45. P. 205-209.

[15*] Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., - Nonlinear focusing of DNA macromolecules: // Phys. Review E, 2001. V.64. P. 021902.1-5.

[16*] Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V.. The model of DNA chain motion in pulsed field gel electrophoresis: // Вычислительные Технологии, 2001. Т. 6. N l.C. 65-71.

[17*] Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V. Rapid separation of large DNA fragments. // Analytical Biochemistry, 2001. V. 293. P. 288-291.

[18*] Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., - Nonlinear electrophoresis and focusing of macromolecules. // J. Biochem. Biophys. Methods, 2001. V. 48. P. 269-282.

[19*] Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., - Nonlinear electrophoretic focusing of DNA macromolecules. // The Analyst, 2001. V. 126. N. 5. P. 559563.

[20*] Chasovskikh V.V., Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., A model of the motion of long DNA chains in a pulsed electric field. //Phys. Chem. Chem. Phys, 2002. V.4. P. 2691-2701.

[21*] Фрумин Jl.JI. Об одном подходе к решению нелинейных параметрических задач. // Вычислительные Технологии, 2002. V. 7. N .5. С. 88-95.

[22*] Peltek S.E., Frumin L.L.. Chasovskikh V.V., Zilberstein G.V. Nonlinear electrophoresis of protein-detergent complexes. // The Analyst, 2002. V. 127 (3). P. 337-341.

[23*] Frumin L.L., Chasovskikh V.V., Peltek S.E., A "hydrodynamic" model of long polymer chain motion in pulsed field. // Вычислительные Технологии, 2005. Т. 10. N3. С. 3-22.

[24*] Фрумин Л.Л. Об устойчивости стационарных распределений ионов электролитов в электрических полях. // Вычислительные Технологии, 2005. Т. 10. N4. С. 99-106.

[25*] Пельтек С.Е., Фрумин Л.Л., Часовских В.В. Быстрая сепарация больших фрагментов ДНК. // Доклады Академии Наук. 2005. Т. 403. N 2/ С. 261-264.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

[1] Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. — М.: Наука, 1981. — 288 с.

[2]Viovy J.-L. Electrophoresis of DNA and other polyelecrtolytes: Physical mechanisms. // Rev. Mod. Phys. 2000, v. 72, N 3, p. 813-872.

[3] Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. - М.: Наука, 1983.-304 с.

[4] Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. - М.: Мир, 1986. - 398 с.

[5] Schwartz D.C., Cantor C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. // Cell, 1984. V. 37. P. 67-75.

[6] Carle G.F., Frank M., Olson M.V. Electrophoretic separation of large DNA molecules by periodic inversion of the electric field. // Science, 1986. V. 232. P. 65-68.

[7] Hutson M.S., Holzwarth G., Duke T.A.J., Viovy J.L., Two-dimensional motion of DNA bands during 120° pulsed field gel electrophoresis I: Effect of molecular weight. // Biopolymers, 1995. V. 35. P. 297-306.

[8] Neitzey L.M., Holzwarth G., Duke T.A.J., Viovy J.L. Two-dimensional motion of DNA bands during pulsed field gel electrophoresis II: Effect of field angle // Biopolymers, 1995. V. 35. P. 307-317.

[9] Sabanayagam C.R., Holzwarth G. Real-time velocity of DNA bands during field-inversion gel electrophoresis. // Electrophoresis. 1996. V. 17. P. 1052— 1059.

[10] Piatt К J., Holzwarth G. Velocity in gels during field inversion. // Phys. Rev. A, 1989. V. 40. N 12. P. 7292-7300.

[11] Slater G.W., Guillouzic S., Gauthier M.G., Mercier J.-F., Kenward M., McCormick M.C., Tessier F. Theory of DNA electrophoresis ~(1999-2002,/2). // Electrophoresis, 2002. V. 23. P. 3791-3816.

[12] Хохлов A.P. Кучанов С.И. Лекции по физической химии полимеров. М.: Мир, 2000.-192 с.

[13] Гросберг А.Ю., Хохлов А.Р. Статистическая физика макромолекул. — М: Наука, 1989.-344 с.

[14] de Gennes P.G., Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles.//J. Chem. Phys. 1971, v. 55, p. 572-579.

[15] Жен де П. Идеи скейлинга в физике полимеров. — М.: Мир,1982. —368 с.

[16] Rilbe Н. Historical and theoretical aspects of isoelectric focusing. Isoelectric focusing. A. Theory and methodology. //Annals New York Academy of Sciences, 1973. V. 209. P. 11-22.

[17] Rilbe H. Theoretical aspects of steady-state focusing. / In: Isdelectric Focusing, ed. Gastimpulos N., - NY: Academic Press, 1976. P. 13-52.

[18] Межевикин B.B., Почекутов А.А., Рузанова Л.Н. Электродиффузионные градиенты pH для изоэлектрического фокусирования белков. // Доклады РАН, 2001. Т. 77. № 3. С. 406-407.

[19] Духин С.С, Дерягин Б.В. Электрофорез, - М.: Наука, 1976. - 338 с.

[20] Флори П. Статистическая механика цепных молекул. - М.: Мир. 1971. — 440 с. i

[21] Слезкин Н.А. Динамика вязкой несжимаемой жидкости. - Гостехиздат, 1955, с. 385-432. ;

[22] Кочин Н.Е., Кибель И.А., Розе Н.В. Теоретическая гидромеханика, ч. II, изд. 4-е, - Физматгиз, 1963, с.658-686.

[23] Риццо. Ф. Метод граничных интегральных уравнений — современный вычислительный метод прикладной механики. / В сб.: Механика, Новое в зарубежной науке. Метод граничных интегральных уравнений. Ред.: Иш-линский А.Ю., Черный Г.Г., - М.:Мир, 1976. с. 11-17.

[24] Мендельсон А., Алберс Л. Применение метода граничных интегральных уравнений для решения упругопластических задач. // Там же, с. 69110. ,

!

[25] Chacron M.J., Slater G.W. Particle trapping and self-focusing in temporally asymmetric ratchets with strong field gradients. // Physical Review E, 1997. V. 56. P. 3446-3450.

[26] Найфэ А. Введение в методы возмущений. -М.: Мир. 1984. - 536 с.

[27] Левич В.Г. Физико-химическая гидродинамика. - М.: ГИФМЛ, 1959, -700 с.

Подписано к печати "19" сентября 2005 г. Формат бумаги: 60x84 1/16. Объем 2 печ. л. Тираж: 100 экз. Заказ N 450

Редакционно-издательский центр НГУ 630090, Новосибирск-90, ул. Пирогова, 2.

Список сокращений.

Введение.:.

1 Дисперсия электрокинетической подвижности и импульсный гель-электрофорез полиэлектролитов.

1.1 Введение.

1.2 Дисперсия электрокинетической подвижности полиэлектролитов.

1.2.1 Диффузионная теория рептаций.

1.2.2 Дисперсионная модель динамики полиэлектролита в импульсном поле.

1.3 Расчеты импульсного гель-электрофореза ДНК.

1.3.1 Одномерный инверсионный гель-электрофорез.

1.3.2 Двумерный импульсный гель-электрофорез.

1.4 Численное моделирование динамики полиэлектролитов на основе диффузионной теории рептаций.

1.5 Неидеальный одномерный газ рептонов.

1.6 Выводы.

2 «Гидродинамическая» теория движения полимерной цепи в сильном внешнем поле.

2.1 Введение.

2.2 Статистическая механика отрезка полимерной цепи в геле.

2.2.1 Свободно-сочлененная полимерная цепь.

2.2.2 Уравнение состояния блоба - отрезка полимерной цепи в поре геля

2.2.3 Статистическая механика концов полимерной цепи во внешнем поле.

2.3 Уравнения одномерной «гидродинамики» полимерной цепи.

2.3.1 Одномерная «гидродинамика» полимерной цепи.

2.3.2 Формула де Жена.

2.4 Численное моделирование «гидродинамики» полимерной цепи в импульсном поле.

2.4.1 Дискретная модель «одномерной гидродинамики».

2.4.2 Ветвления полимерной цепи в геле.

2.5 Результаты расчетов динамики полимерной цепи в импульсных полях

2.6 Выводы.

3 Модели процессов электрокинетического фокусирования полиэлектролитов

3.1 Введение.

3.2 Точное решение нестационарной задачи электрокинетического фокусирования полиэлектролитов.

3.3 Устойчивость стационарных распределений ионов в электрических полях

3.3.1 Уравнения Нернста-Планка и аналогия с гидродинамикой.

3.3.2 Буферная система из двух сортов ионов - амбиполярная диффузия

3.3.3 Устойчивость буферной системы с тремя сортами ионов.

3.3.4 Неустойчивость стационарных распределений ионов в многокомпонентных буферных системах.

3.4 Фокусирование макромолекул в неоднородных электрических полях

3.5 Моделирование неоднородных электрических полей методом граничных элементов.

3.5.1 Метод угловых интегралов.

3.5.2 Расчет неоднородных электрических полей методом граничных элементов

3.6 Выводы.

4 Нелинейные процессы фракционирования и фокусирования.

4.1 Введение.

4.2 Нелинейный импульсный гель-электрофорез фрагментов ДНК.

4.3 Нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях.

4.4 Методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК.

4.5 Нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов

4.5.1 Одномерный нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов.

4.5.2 Двумерный гель-электрофорез комплексов белков.

4.5.3 Нелинейный гель-электрофорез нативных белков.

4.6 Выводы.

5 Двойной заряженный слой и электродная кинетика.

5.1 Введение.

5.2 Асимптотическая модель двойного заряженного слоя.

5.2.1 Двойной заряженный слой.

5.2.2 Квазинейтральная область.

5.2.3 Вольтамперная характеристика.

5.3 Численное моделирование сложной электродной кинетики.

5.3.1 Результаты расчетов вольтамперных характеристик.

5.3.2 Учет ионов буферного электролита.

5.3.3 Сложная электродная кинетика.

5.4 Макрокинетическая модель тафелевской зависимости.

5.5 Обратные задачи электродной кинетики.

5.5.1 Постановки обратных задач.

5.5.2 Методы решения обратных задач.

5.5.3 Нелинейные обратные задачи.

5.5.4 Параметрические обратные задачи.

5.5.5 Обратные задачи электродной кинетики.

5.6 Выводы.

Электрокинетические методы фракционирования (сепарации) макромолекул полиэлектролитов, в особенности - гель-электрофорез и электрофокусирование, в последние десятилетия испытали стремительный прогресс и развитие и нашли широкое применение в самых современных разделах науки и технологии. В настоящее время и гель-электрофорез, и электрофокусирование, наряду с хроматографией и ценрифугированием, занимают центральное место среди способов фракционирования полиэлектролитов и признаны одними из наиболее мощных инструментов поиска и сепарации макромолекул ДНК, белков и их комплексов, РНК и других биополимеров [1-4]. Высокая разрешающая способность и сравнительная простота исполнения гель-электрофореза и электрофокусирования сделали их незаменимым средством исследования и выделения биологических макромолекул. Всевозрастающий интерес к этой области исследований обусловлен главным образом тем, что электрокинетические процессы фракционирования составляют технологическую базу, основу современной экспериментальной молекулярной биологии. Непрерывный рост числа новых научных журналов и публикаций является показателем активного развития этой области. По данным информационно-поисковой системы "PubMed" [5], к началу 2005 года количество публикаций, содержащих ключевые слова "gel" и "electrophoresis", превысило 9000.

Применение гелей для фракционирования макромолекул стало базовой инновацией в электрокинетических технологиях сепарации и позволило преодолеть основную трудность ранних методик электрофореза - конвективную неустойчивость слоя электролита, возникающую при прохождении электрического тока. Именно отсутствие конвективных движений приводит к высокому качеству электрофоретического фракционирования, во многом определяя успех современных электрокинетических методик.

Методики фракционирования полиэлектролитов, основанные на гель-электрофорезе, позволили секвенировать (установить последовательность нуклеотидов ДНК) и «прочесть» генетический текст генома человека и ряда других организмов, и, наряду с методами электрофокусирования, служат главным поставщиком новых биологических макромолекул.

Вместе с тем, несмотря на неоспоримые достижения приложений электрокинетического фракционирования, теоретическое обоснование и интерпретация многих современных экспериментальных результатов и практических методик заметно отстают от потребностей практики и делают проблему их изучения особенно важной и актуальной.

В данной работе рассматриваются почти исключительно (импульсный) гель-электрофорез и электрофокусирование в гелях, так как именно эти электрокинетические процессы имеют наибольшее практическое значение, как основа наиболее эффективных технологий фракционирования биополимеров и других полиэлектролитов.

Основная задача, возникающая при исследовании физических основ гель-электрофореза и электрофокусирования - это изучение динамики движения заряженной полимерной макромолекулы в геле, под действием внешних электрических полей. Возникающий при этом широкий круг проблем и задач тесно связан с целым комплексом научных направлений физики конденсированного состояния.

Теоретические основы современного гель-электрофореза и электрофокусирования полиэлектролитов включают два основных раздела - теорию электрокинетических процессов и явлений, и статистическую физику полимерных макромолекул. Теоретические основы электрокинетических процессов и двойного заряженного слоя были заложены Х.Л.Ф. Гельмгольцем, Н. Смолуховским, Ф. Кольраушем, а затем продолжены в работах Б.В. Деря-гина и С.С. Духина, В.Г. Левича, X. Рильбе (Свенссона), и других. Современная теоретическая физика полимеров разрабатывалась в работах П. Флори, И.М. Лифшица, С.Ф. Эдвардса, М.В. Волькенштейна, П.Ж. де Жена, А.Р. Хохлова, успешно применивших в этой области методы теоретической физики. Теоретические основы динамики полимерных макромолекул под действием внешних полей были заложены в работах В.А. Каргина и Г.Л. Слонимского, П.Е. Рауса, Б. Зимма, П.Ж. Де Жена.

Среди рассматриваемых в работе полиэлектролитов основное внимание уделяется биополимерам - макромолекулам ДНК, РНК и белков, представляющим основной интерес для молекулярной биологии и биотехнологии. Двойная спираль ДНК представляет собой едва ли не идеальный объект исследования для физики полимеров. Большая длина макромолекулы ДНК, по сравнению с поперечным размером, позволяет рассматривать ее как своеобразную физически одномерную систему. Интерес к физически одномерным системам непрерывно возрастает, начиная со времени появления термодинамической теоремы Ландау-Лифшица о невозможности равновесного существования разных фаз в одномерных системах.

Почти каждый сорт макромолекул полиэлектролитов требует разработки и применения своего собственного типа электрофореза или своей методики. В литературе продолжают появляться все новые и новые методики и устройства для электрофореза, непрерывно повышается его качество и разрешающие способности. В последние годы интенсивно развивается процесс миниатюризации и автоматизации электрофоретических устройств. Появились так называемые микрофлюидные системы, капиллярный электрофорез и биочипы, позволяющие ускорить и автоматизировать процессы фракционирования. Все более популярными становятся гибридные системы, сочетающие гель-электрофорез и другие физические методы, например, хроматографию или масспектрометрию. При этом практические приложения зачастую намного опережают существующие теоретические модели и подходы. В исследовании электрокинетических явлений, несомненно, уже давно назрела необходимость широкого применения теоретических, в том числе - численных методов и моделей, обобщения и систематизации накопленного экспериментального материала.

Задачи исследования динамики полиэлектролитов в электрокинетических процессах фракционирования многочисленны и разнообразны. Среди наиболее важных для практики научных проблем в этой области укажем задачу изучения импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК, которая до настоящего времени не имела адекватного ее значимости теоретического описания и интерпретации, а также инструментов надежного прогноза рабочих областей параметров и качества фракционирования. В настоящее время импульсный гель-электрофорез, предложенный в работах [6,7] является основным и весьма эффективным методом сепарации длинных полимерных цепей ДНК. Он находит все более широкое применение в биологических и медицинских приложениях. Особенность импульсного гель-электрофреза, как метода фракционирования, состоит в том, что он позволяет разделять фрагменты ДНК размером в сотни тысяч и даже миллионы пар нуклеотидов, когда «обычный» стационарный гель-электрофорез вообще не дает никакого разделения.

В отличие от случая постоянного электрического поля, в импульсном поле у полиэлектролита наблюдается заметная, хотя и не монотонная, зависимость скорости дрейфа от размера полимерной цепи. Эта зависимость меняется с изменением периода электрического поля, что, по мнению автора, указывает на дисперсионный характер этого явления. Автор впервые вводит понятие дисперсии электрокинетической подвижности и связывает его с таким фундаментальным свойством цепных полимеров, как их линейная память [8]. Дисперсия электрокинетической подвижности представляет несомненный интерес для современной физики полимеров и позволяет построить теорию как одномерного, так и двумерного импульсного гель-электрофореза. Вместе с тем, дисперсионный эффект оказывается тесно связан с нелинейным характером электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных электрических полях. Изучение дисперсионных и нелинейных свойств подвижности полиэлектролитов в процессах импульсного гель-электрофореза составляет главное направление исследований в настоящей работе.

В работе проводится анализ динамики движения полимерных цепей в импульсных полях и делается вывод о неадекватности диффузионных подходов, основанных на теории рептаций, для описания динамики длинных полимерных цепей в умеренных и сильных полях. Автор развивает альтернативный - «гидродинамический» - подход, учитывающий упругие «энтропийные» силы полимерной цепи, который позволяет преодолеть трудности диффузионного подхода, и открывает новое направление в теоретических исследованиях динамики полимерных цепей. В основу гидродинамического подхода положено полученное методами статистической физики уравнение состояния для отрезка полимерной цепи в одной поре геля, называемого в теории скейлинга - «блобом» [8].

Большое внимание в работе уделено методам электрокинетического фокусирования макромолекул. Методы электрофокусирования имеют наивысшее разрешение среди методов гель-электрофореза, позволяя разделять до тысячи и более фракций в одном сеансе [2, 4]. Предельное разрешение методик фракционирования, достигнутое в методе изоэлектрического фокусирования, до настоящего времени ограничено не очень большими по размерам белками и умеренным диапазоном рН среды. Применение метода фокусирования не только для сепарации белков, но и для других биополимеров остается актуальной нерешенной проблемой. До настоящего времени не была в достаточной степени изучена и проблема устойчивости неоднородных распределений ионов в электрических полях в отсутствии амфолитов. Исследование перечисленных и других важных аспектов метода электрокинетического фокусирования способствует расширению области применения метода и спектра исследуемых с его помощью макромолекул полиэлектролитов.

Еще одно направление данной работы, несмотря на явное преобладание в ней теоретических подходов и методов, связано с прикладным характером исследования. С самого начала работы предполагалось получение результатов прикладного, инновационного характера, в том числе - разработка новых подходов и способов фракционирования и фокусировки макромолекул. На и основе разработанных моделей электрокинетических процессов сепарации в работе предложены и апробированы новые методы сепарации - нелинейный импульсный гель-электрофорез и нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях, а также методика быстрой сепарации длинных фрагментов ДНК, перспективная для биомедицинских приложений.

Электрокинетические процессы тесно связаны с явлением двойного заряженного слоя, всегда возникающего на границе твердой фазы и электролита. Двойной слой и его поляризация во внешнем поле играют определяющую роль во всех электрокинетических процессах и явлениях, а также и в процессах электродной кинетики, протекающих на электродах. Моделирование двойного слоя и электродной кинетики, включая расчет вольтамперных характеристик и моделирование тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода, имеют самостоятельное значение для разработки систем контроля буфера в современных микрофлюидных системах и в капиллярном электрофорезе.

Поведение макромолекул в растворах электролитов, даже в отсутствии внешних полей, представляет собой довольно сложный феномен. В силу этого современную конформационную статистику полимерных цепей, включающую, например, поворотно-изомерную модель [9], учитывающую реальные физические свойства макромолекулы, далеко не всегда удается применить при исследовании динамики движения полимерной молекулы во внешнем поле. Действительно, теория рептаций П. де Жена [10] - первая динамическая теория движения полимеров в геле опирается на один из самых простых подходов - модель идеальной гауссовой цепи, недостатки и ограничения которой хорошо известны [8]. При описании динамики движения полиэлектролитов в геле приходится ограничиваться и сравнительно простыми физическими моделями поддерживающей среды - геля, например, - моделью «трубки» М. Доя и С.Ф. Эдвардса [11]. При этом вне поля зрения исследователя остаются самые современные направления, связанные с физикой восприимчивости и коллапса гелей [12]. Аналогично, классическая теория электрокинетических явлений частиц простой формы [13] остается мало востребованной при рассмотрении современных методик гель-электрофореза биологических макромолекул, поскольку реальные биополимеры не походят на идеальные сферические или цилиндрические частицы, помещенные в электролит и окруженные двойным заряженным слоем.

Сложность и междисциплинарный характер рассматриваемых в работе задач обусловливает выбор подходов и методов их исследования. Широкий круг затрагиваемых разнородных физико-химических проблем и вопросов заставляет обратиться к численному моделированию ряда частных, но важных для практических приложений, задач. В работе широко используются методы численного моделирования. При этом физика полимеров, статистическая физика макромолекул и классические разделы физической химии электролитов составляют основную методическую и теоретическую базу исследования. Вместе с тем, теоретические модели и подходы в работе поддержаны необходимыми электрофоретическими экспериментами.

Целью данной работы является развитие физических основ современных электрокинетических процессов фракционирования и фокусировки полиэлектролитов для повышения эффективности и расширения возможностей существующих и разработки новых практических электрокинетических методик сепарации.

В ходе исследования рассматривались следующие основные задачи: изучение нелинейных и дисперсионных свойств электрокинетической подвижности макромолекул на примере импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК; разработка теоретических моделей динамики полиэлектролитов, позволяющих объяснять ключевые эксперименты по импульсному гель-электрофорезу; исследование процессов электрофокусирования полиэлектролитов, включая изоэлектрическое фокусирование и фокусирование в неоднородных электрических полях; разработка новых - нелинейных методов электрофореза и фокусирования макромолекул и исследование нелинейной электрокинетической подвижности полиэлектролитов; методические вопросы моделирования электрокинетических явлений и процессов.

Работа выполнена в Новосибирском государственном университете в соответствии с планами научных исследований НИЧ НГУ по темам С-98 и С-01,-02 «Разработка методов и устройств для фракционирования биологических макромолекул». На защиту выносятся:

1. теоретические модели электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных полях и их приложения для описания одномерного и двумерного импульсного гель-электрофореза, включая дисперсионную модель, модель неидеального одномерного газа рептонов и теорию «одномерной гидродинамики», призванную заменить диффузионную теорию рептаций длинных полимерных цепей для случая умеренных и сильных полей;

2. результаты численного моделирования диффузионной теории рептаций и теории «одномерной гидродинамики» на кластере из 11 компьютеров;

3. модели процессов электрокинетического фокусирования макромолекул в градиенте рН и в неоднородных электрических полях, а также критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования. Комплекс программ и алгоритмов для расчета неоднородных электрических полей и моделирования движения макромолекул полиэлектролитов в сеансах импульсного гель-электрофореза и в процессах электрокинетического фокусирования;

4. практические приложения разработанных теоретических моделей: новый метод нелинейного импульсного гель-электрофореза для сепарации биологических макромолекул, включая фрагменты ДНК и комплексы белков; новый метод электрокинетического фокусирования макромолекул -нелинейная фокусировка полиэлектролитов в неоднородных электрических полях4 оригинальная методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК для скоростной биомедицинской диагностики бактериальных заражений;

5. результаты экспериментов по наблюдению нелинейной подвижности полимерных цепей ДНК и комплексов белков с ионными детергентами;

6. методические результаты: асимптотическая теория двойного слоя для сферического электрода с учетом сложной кинетики электродных реакций в электролитах и основанный на этой модели алгоритм расчета вольтам-перных характеристик, а также его приложения к решению обратных задач электродной кинетики;

Выполненное исследование позволило автору получить ряд новых научных, прикладных и методических результатов: развита дисперсионная теория электрокинетической подвижности полиэлектролитов, позволившая объяснить ключевые эксперименты по импульсному гель-электрофорезу ДНК и научиться предсказывать области эффективной сепарации; для описания движения длинных полимерных цепей в импульсных полях предложена новая теория одномерной «гидродинамики», включающая впервые полученное термодинамическое уравнение состояния отрезка цепи в поре геля, а также нелинейное уравнение динамики длины полимерной цепи в геле; получено аналитическое описание нестационарного процесса электрокинетического фокусирования полиэлектролитов, Исследована устойчивость градиентов рН в электрических полях, в многокомпонентных буферных системах, и получен критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования; на основе теоретических моделей и численных расчетов предложены и апробированы новые методы фракционирования - метод нелинейного импульсного гель-электрофореза и метод нелинейной фокусировки макромолекул в неоднородных электрических полях; в сеансах импульсного гель-электрофореза впервые обнаружена аномальная зависимость нелинейной подвижности от размеров макромолекулы для фрагментов ДНК и комплексов белков и ионных детергентов; впервые получена нелинейная фокусировка молекул ДНК в неоднородных электрических полях; предложена и апробирована новая методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК, позволяющая исключить инверсию фракций, увеличить скорость сепарации в 4-5 раз, по сравнению с лучшими мировыми образцами;

На основе асимптотической модели двойного слоя, с учетом сложной электродной кинетики, развит метод оценки параметров в задачах электродной кинетики;

Практическому приложению рассматриваемых в работе теоретических моделей и расчетов в работе уделено особое внимание. Разработанные модели подвижности длинных цепей ДНК и комплексы программ являются необходимыми для практики инструментами прогноза эффективных областей сепарации макромолекул. Нелинейный импульсный электрофорез фрагментов ДНК и комплексов протеинов, нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях обещают решить многие практические проблемы, возникающие в самых современных технологических приложениях электрокинетических процессов. Методика быстрой сепарации ДНК представляет большой интерес для скоростной биомедицинской диагностики бактериальных заражений.

В соответствии с основными задачами исследования материал диссертации разделен на пять глав. Каждая из них снабжена необходимым введением, в котором дается обзор литературы и постановка задач, рассматриваемых в главе. По завершении каждой главы даются краткие выводы, а в конце работы - заключение, приложение и список цитируемой литературы.

Работа прошла широкую научную апробацию. Полученные результаты докладывались на научных семинарах Кафедры общей физики Физического факультета Новосибирского государственного университета, а также на научных семинарах институтов РАН, в частности, на семинарах Института цитологии и генетики СО РАН, Института химической кинетики и горения СО РАН, Института вычислительных технологий СО РАН, Института теплофизики СО РАН, Института электрохимии РАН (Москва).

Основные результаты докладывались на отечественных и международных конференциях и симпозиумах: на III Генеральной ассамблее Ассоциации азиатских Академий наук -"The Impact of Biotechnological Advance in Asia", 2002 (Израиль), на III международном конгрессе электрофоретических обществ ICES-2001 Верона, (Италия), на VI Симпозиуме "Interface of Regulatory and Analytical Sciences for Biotech Health Products" 2002 (Япония), на международных конференциях "Хроматография высокого давления" HPLC'99 (Испания) 1999, XIII международной конференции по диэлектрическим жидкостям, Нара, 1999, (Япония), на VII Португальском и III Иберийском симпозиуме по электрохимии, Фаро (Португалия), 1995, на V международной конференции «Кинетика в аналитической химии», Москва, 1995, Всесоюзной школе-семинаре: «Теория и методы решения некорректно поставленных задач», Новосибирск, 1983, III Всесоюзной школе-конференции по современным методам магнитного удержания, нагрева и диагностики плазмы, Харьков, 1982.

Основные научные результаты исследований опубликованы в ведущих отечественных и мировых научных журналах, а также в материалах научных конференций, симпозиумов и в сборниках научных статей.

Все теоретические результаты и результаты моделирования, вошедшие в диссертацию, получены при определяющем личном участии автора в постановке и решении задач. Программный код дисперсионной модели выполнен автором, код одномерной гидродинамической модели подготовил В.В. Ча-совских, код комплекса "Laplas" - Ю.А. Целовальников. Автор участвовал в постановке, организации и анализе результатов приведенных в работе элек-трофоретических экспериментов, а сами эксперименты были выполнены С.Е. Пельтеком.

Автор благодарит за сотрудничество своих соавторов, и в особенности -С.Е Пельтека и В.В. Часовских, внесших весомый вклад в совместную работу. Заслугой С.Е. Пельтека - профессионального молекулярного биолога из Института цитологии и генетики СО РАН - является проведение экспериментов по нелинейному гель-электрофорезу биополимеров. На всех этапах работы С.Е. Пельтек щедро делился своими обширными познаниями в области методов сепарации биологических макромолекул.

Необходимые для экспериментов научные приборы и аппаратура, зачастую превосходящие лучшие мировые образцы не только по замыслу, но и по исполнению, а также часть программного обеспечения, были разработаны В.В. Часовских - сотрудником Кафедры радиофизики Новосибирского государственного университета.

Автор также благодарит за постоянную поддержку руководство Новосибирского государственного университета, в лице ректора - члена-корреспондента РАН Н.С. Диканского, и своих уважаемых коллег -Г.Л. Коткина, А.А. Кочеева, JI.B. Куйбиду, В.В. и З.П. Пай, И.В. Хмелинско-го, Ю.А. Целовальникова, Д.А. Шапиро.

5.6 Выводы.

Для разработки систем контроля буферного электролита в микрофлюидных системах и в капиллярном электрофорезе рассмотрены задачи оценки параметров электродной кинетики по вольтамперным характеристикам электродов.

На основе метода сращиваемых асимптотических разложений построена модель двойного заряженного слоя и развит алгоритм расчета вольтамперных характеристик, с учетом кинетики электродных процессов. Получены асимптотически точные выражения для вольтамперных характеристик для случая сложной электродной кинетики и, более детально, для простых реакций нейтрализации анионов применительно к случаю "чистого" и разбавленного буферным раствором электролита. В уравнении для y/i-потенциала получена поправка, учитывающая влияние тока и диффузионных ограничений на ул-потенциал и влияние электродного тока на потенциал нулевого заряда.

Проведены расчеты вольтамперных характеристик для случая кинетики первого порядка с учетом индифферентного буферного электролита, а также для случая сложной кинетики электродных реакций, на примере восстановления анионов персульфата.

Развитый метод расчета вольтамперных характеристик использован для численного моделирования параметрических обратных задач электродной кинетики.

В конце главы дан краткий обзор постановок и методов и алгоритмов решения функциональных и параметрических обратных задач, а также приведены некоторые методические результаты, имеющие самостоятельное значение.

Заключение

1. Построена дисперсионная модель динамики полимерных цепей в импульсных полях. Показано, что аномальное поведение подвижности является следствием дисперсии электрокинетической подвижности, обусловленной линейной памятью цепных полимеров, и количественно описывается реакцией линейного фильтра на внешнее импульсное поле. Дисперсия электрокинетической подвижности позволяет объяснять ключевые эксперименты как одномерного, так и двумерного импульсного гель-электрофореза ДНК. Дисперсионная модель служит инструментом, позволяющим прогнозировать области параметров эксперимента, где отсутствует инверсия фракций. Предложена модель неидеального одномерного газа рептонов для заряженной полимерной цепи в сильном электрическом поле, расширяющая область применения диффузионной теории рептаций. С помощью численного моделирования обнаружена ограниченность диффузионных моделей динамики макромолекул при описании импульсного гель-электрофореза длинных полимерных цепей ДНК;

2. Разработана теория одномерной «гидродинамики» для описания движения длинных полимерных цепей в геле в импульсных электрических полях, учитывающая упругие «энтропийные» силы натяжения заряженной цепи и призванная заменить диффузионную теорию рептаций в случае длинных цепей и умеренных и сильных полей. На основе последовательного статистического подхода для модели свободно-сочлененной цепи впервые получено уравнение состояния для блоба - отрезка цепи в поре геля, связывающее упругую силу натяжения цепи и плотность длины цепи в поре. Динамика движения полимерной цепи определяется равновесием электрических сил, градиента упругих сил и сил трения и описывается нелинейным уравнением диффузионного типа. На основе дискретной модели одномерной «гидродинамики» на кластере из одиннадцати компьютеров проведено численное моделирование движения длинной полимерной цепи ДНК в импульсных электрических полях. Численный эксперимент подтвердил возможности теории одномерной «гидродинамики» объяснить и интерпретировать такие дисперсионные аномалии импульсного гель-электрофреза ДНК, как «антирезонанс» - глубокий минимум подвижности в переменных полях и инверсию фракций. Выявлена особая роль ветвлений цепи и объемных взаимодействий в динамике ее движения;

3. Построена модель процесса электрокинетического фокусирования амфо-терных полиэлектролитов на основе аналитического решения одномерного нестационарного уравнения диффузии с переменными коэффициентами. С помощью аналитических вычислений на ЭВМ впервые теоретически исследована проблема неустойчивости стационарных ионных распределений многокомпонентных буферных систем, применяемых для электрокинетического фокусирования белков, и получен критерий устойчивости градиентов рН в задачах изоэлектрического фокусирования. Показано, что для буферных систем, содержащих не менее двух сортов анионов и не менее двух сортов катионов, градиенты концентраций во внешнем электрическом поле всегда неустойчивы. Разработан комплекс программ «Laplas» для расчета неоднородных электрических полей и моделирования движения макромолекул с учетом нелинейной зависимости их подвижности от амплитуды поля. Предложена новая геометрия геля - гиперболический клин, в которой разделяемые фракции макромолекул имеют прямолинейную форму. На основе МГЭ проведено численное моделирование неоднородных электрических полей в клиновидном геле. Предложена разновидность МГЭ - численный алгоритм угловых интегралов, не требующий аппроксимации границы области;

4. На основе развитых теоретических моделей и численных расчетов предложены и апробированы новые практические методы электрокинетического фракционирования: метод нелинейного импульсного гель-электрофореза ДНК — способ сепарации макромолекул ДНК по их нелинейной подвижности; метод нелинейного электрофореза для комплексов белков и заряженных ионных детергентов. Метод позволяет расширить область применения импульсного гель-электрофореза на случай крупных гидрофобных комплексов протеинов; метод нелинейного фокусирования полиэлектролитов в неоднородных импульсных электрических полях; методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК, позволяющая исключить инверсию фракций, увеличить скорость сепарации в 4-5 раз по сравнению с другими методиками, и при этом иметь высокое разрешение для больших фрагментов ДИСК и монотонную зависимость координаты фракции от размеров молекулы. Методика имеет практическое значение для диагностики бактериальных заражений;

5. В экспериментах по нелинейному импульсному гель-электрофрезу впервые обнаружены: аномальная дисперсионная зависимость нелинейной подвижности полимерных цепей ДНК от размера цепи; нелинейная фокусировка макромолекул ДНК в неоднородных импульсных электрических полях; нелинейная подвижность комплесков белков с ионным детергентом ДСН аномальная дисперсионная зависимость нелинейной подвижности комплесков белков и ионных детергентов от их размеров;

6. Для контроля буферных систем в микрофлюидных электрокинетических системах фракционирования проведено моделирование параметрических обратных задач электродной кинетики. Разработана асимптотическая модель двойного слоя для сферического электрода и построен численный алгоритм расчета вольтамперных характеристик с учетом сложной электродной кинетики в электролитах. Построена макрокинетическая модель тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода.

1. Остерман J1.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. - М.: Наука, 1981. - 288 с.

2. Остерман J1.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983.-304 с.

3. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи J1. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. — 448 с.

4. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. -М.: Мир, 1986.-398 с.5. http://www.pubmedcentral.nih.gov

5. Schwartz D.C., Cantor C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. // Cell, 1984. V. 37. P. 67-75.

6. Carle G.F., Frank M., Olson M.V. Electrophoretic separation of large DNA molecules by periodic inversion of the electric field. // Science, 1986. V. 232. P. 65-68.

7. Гросберг А.Ю., Хохлов A.P. Статистическая физика макромолекул. М: Наука, 1989.-344 с.

8. Волькенштейн М.В. Конфигурационная статистика полимерных цепей. -М.-Л.: Изд. АН СССР, 1959.

9. Gennes de P.G., Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. // J. Chem. Phys., 1971. V. 55. P. 572-579.

10. Doi, M., and Edwards S. F., The Theory of Polymer Dynamics. Oxford: Oxford University Press, 1986. - 391 p.

11. Хохлов A.P. Восприимчивые гели. // Соросовский образовательный журнал, 1998. №2. С. 138-142.

12. Духин С.С, Дерягин Б.В. Электрофорез, М.: Наука, 1976. - 338 с.

13. Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V. The model of DNA chain motion in pulsed field gel electrophoresis: // Вычислительные Технологии, 2001. Т. 6. N l.C. 65-71.

14. Пельтек С.Е., Фрумин Л.Л., Часовских В.В. Нелинейный импульсный электрофорез полимерных цепей ДНК. // Доклады Академии Наук. 2005. Т. 404, N6.

15. Frumin L.L., Peltek S.E., Chasovskikh V.V., Bukshpan S., Zilberstein G.V., -Anomalous size dependence of the nonlinear mobility of DNA: // Phys. Chem. Comm., 2000. N 11. P. 1-3.

16. Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., Rapid separation of large DNA fragments. // Analytical Biochemistry, 2001. V. 293. P. 288-291.

17. Коткин Г.Л., Фрумин Л.Л. Практикум «Моделирование физических явлений» Новосибирск: НГУ, 1992. - 60 с.

18. Вельтмандер П.В., Фрумин Л.Л. Моделирование в курсе электротехники и электроники. Новосибирск: НГУ, 1995. - 63 с.

19. Левич В.Г. Физико-химическая гидродинамика. М.: ГИФМЛ, 1959. -700 с.

20. Reuss, F.F. von. Sur un nouvel effet de l'electricite galvanique. // Memoires de la Societe Imperiale des Naturalistes de Moscou, 1809. V. 2. P. 327-337.

21. Helmholtz, H.L.F. von. Studies of Electric Boundary Layers. // Wied. Ann., 1879. V. 7. P. 337-382.

22. Kohlrausch F. Uber Concentrations-Verschiebungen durch Elektrolyse im In-neren von Losungen und Losungsgemischen, // Ann. Phys. Chem. (Leipzig). 1897. V. 62. P. 209-239.

23. Smoluchowski, N. von, Handbuch der Electrizitat und des Magnetismus, Barth, J.A. ed., Leipzig. 1921. V. 2. P. 366-428.

24. Tiselius A. The moving boundary method of studying the electrophoresis of proteins. // Nova Acta Regia Societatis Scientiarum Upsaliensis. 1930, Ser IV. V. 7, No. 4. P. 1-107.

25. Троицкий Г.В. Электрофорез белков. Изд. Харьковского университета, Харьков, 1962.

26. Хохлов А.Р., Дормидонтова Е.Е. Самоорганизация в ион-содержащих полимерных системах.//УФН, 1997. Т. 167. №2. С. 113-128.

27. Флори П. Статистическая механика цепных молекул. М.: Мир. 1971. -440 с.

28. Бирштейн Т.М., Птицын О.Б. Конформации макромолекул. М.: Наука, 1964.- 392 с.

29. Хохлов А.Р. Статистическая физика макромолекул. М.: Изд.-во МГУ, 1985.-192 с.

30. Хохлов А.Р. Кучанов С.И. Лекции по физической химии полимеров. М.: Мир, 2000.-192 с.

31. Rouse Р Е. A theory of the linear viscoelastic properties of dilute solutions of coiling polymers. J. Chem. Phys. V. 21:1272-1280, 1953.

32. Zimm В H. Dynamics of polymer molecules in dilute solution: viscoelasticity, flow birefringence and dielectric loss. // J. Chem. Phys., 1956. V. 24. P. 269278.

33. Жен де П. Идеи скейлинга в физике полимеров. М.: Мир,1982. -368 с.

34. Anand, R., and Southern, Е. М. Pulsed field gel electrophoresis. // In Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach. , D. Rickwood and B.D. Hames, eds. IRL Press at Oxford University Press, New York. 1990. P. 101— 123.

35. Bin-en, B.W., Lai, E., Clark, S.M., Hood, L., and Simon, M.I. Optimized conditions for pulsed field gel electrophoretic separations of DNA. // Nucleic Acids Research. 1988. V 16. P. 7563-7582.

36. Chu, G., Vollrath, D., and Davis, R.W. Separation of large DNA molecules by contour-clamped homogeneous electric fields. // Science. 1986. V. 234. P. 1582-1585.

37. Clark, S.M., Lai, E., Birren, B.W., and Hood, L.A novel instrument for separating large DNA molecules with pulsed homogenous electric fields. // Science 1988. V. 241. P. 1203-1205.

38. Gardiner, K., Laas, W., and Patterson, D.S. Fractionation of large mammalian DNA restriction fragments using vertical pulsed-field gradient gel electrophoresis. // Somatic Cell Molec. Genet. 1986. V. 12. P. 185-195.

39. Sabanayagam C.R., Holzwarth G. Real-time velocity of DNA bands during field-inversion gel electrophoresis. // Electrophoresis. 1996. V. 17. P. 10521059.

40. Heller C., Pohl F M. A systematic study of field inversion gel electrophoresis. // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 5989 -5998.

41. Piatt K.J., Holzwarth G. Velocity in gels during field inversion. // Phys. Rev. A, 1989. V. 40. N 12. P. 7292-7300.

42. Heller C., Duke Т., Viovy J.L., Electrophoretic mobility of DNA in gels II: Systematic experimental study in agarose gels. // Biopolymers, 1994. V. 34. P. 249-259.

43. Viovy J.-L. Electrophoresis of DNA and other polyelecrtolytes: Physical mechanisms. // Rev. Mod. Phys. 2000. V. 72, N 3. P. 813-872.

44. Viovy J.L., Duke Т., Caron F., The physics of DNA electrophoresis. // Con-temp. Phys., 1992. V. 33. P. 1-40.48.01vera de la Cruz, M., J. M. Deutsch, and S. F. Edwards, Electrophoresis in strong fields// Phys. Rev. A, 1986. V. 33. P. 2047-2055.

45. Deutsch J. M., Dynamics of pulsed-field electrophoresis. // Phys. Rev. Lett., 1987. V. 59. P. 1255-1258.

46. Deutsch, J. M. Theoretical studies of DNA during gel electrophoresis. // Science, 1988. V. 240. P. 922-924.

47. Deutsch, J. M., T. L. Madden, Theoretical studies of DNA during gel electro1 phoresis. // J. Chem. Phys., 1989. V. 90. P 2476-2485.

48. Lumpkin O.J., DeJardin J., Zimm B.H., Theory of gel electrophoresis of DNA. //Biopolymers, 1985. V. 24. P. 1573-.

49. Slater G.W., Noolandi J. On the reptation theory of gel electrophoresis. // Bio-polymers, 1986. V. 25. P. 431-434.

50. Barkema G.T., Marko J.F., Widom B. Electrophoresis of charged polymer: Simulation and scaling in a lattice model of reptation. // Phys. Rev. E, 1994. V. 49. N6. P. 5303-5309.

51. Duke T.A.J. Tube model of field-inversion electrophoresis. // Phys. Rev. Lett., 1989. V. 62, 2877-2880.

52. Duke T.A.J., Monte Carlo reptation model of gel electrophoresis: Steady state behavior. // J. Chem. Phys., 1990. V. 93. P. 9049-9054.

53. Duke T.A.J., Monte Carlo reptation model of gel electrophoresis: Response to field pulses. //J. Chem. Phys., 1990. V. 93. P. 9055-9061.

54. Duke T.A.J., Viovy J.L. Simulation of megabase DNA undergoing gel electrophoresis. //Phys. Rev. Lett., 1992. V.68. P. 542-545.

55. Duke T.A.J., Viovy J.L. Motion of megabase DNA during field-inversion gel electrophoresis: investigation by non-local Monte Carlo. // J. Chem. Phys. 1992. V. 96, 8552-8563.

56. Ф 60.Duke, T. A. J., A. N. Semenov, and J. L. Viovy. Mobility of a reptating polymer// Phys.Rev. Lett., 1992. V. 69. P. 3260-3263.

57. Duke Т., Viovy J.-L., Semenov N. Electrophoretoc mobility of DNA in gels. I. New biased reptation theory including fluctuation. // Biopolymers, 1994. V. 34. P. 239-247.

58. Semenov A.N., Duke T.A.J., Viovy J.L. Gel electrophoresis of DNA in moderate fields: The effect of fluctuations. //Phys. Rev. E, 1995. V. 51, 1520-1537.

59. Zimm, B.H. Size flucuations can explain anomalous mobility in field-inversion electrophoresis of DNA. //Phys. Rev. Lett., 1988. V. 61. P. 2965-2968.

60. Zimm B.H., «Lakes and Strates» model of field-inversion gel electrophoresis of DNA. //J. Chem. Phys. 1991. V. 94 N3. P. 2187-2206.

61. Lim, H. A., Slater G. W., Noolandi J. A model of the DNA transient orientation overshoot during gel electrophoresis. // J. Chem. Phys., 1990. V. 92. P. 709721.

62. Bustamante, С., Gurrieri, S. and Smith, S.B. Observations of Single DNA Molecules during Pulsed-Field Gel Electrophoresis by Fluorescence Microscopy. METHODS: a Companion to Methods in Enzymology, 1990. V. 1. P. 151-159.

63. Gurrieri S., Smith S. and Bustamante C. Trapping of Megabase-Sized DNA Molecules during Agarose Gel Electrophoresis. // Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 1999. V. 96. P. 453-458.

64. Хемминг Р.В. Цифровые фильтры. М.: Недра, 1987. - 221 с.

65. Рихтмайер Р., Мортон К. Разностные методы решения краевых задач. М.: Мир, 1972. С. 188-219.

66. Марчук Г.И. Методы вычислительной математики. М.: Наука, 1977. С. 367-373.

67. Рябенький B.C. Введение в вычислительную математику. М.: Физмат-лит. 2000. С. 219-221.

68. Ермаков С.М., Михайлов Г.А. Статистическое моделирование. М.: Наука, 1982,-296 с.

69. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Т. 5, Статистическая физика, Изд. 2, М.: Наука, 1964, с.560-564.

70. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Т.З, Квантовая механика. Нерелятивистская теория. Изд. 3-е, М.: Наука, 1974. С. 736-738.

71. Найфэ А. Введение в методы возмущений. М.: Мир. 1984. - 536 с.

72. Chasovskikh V.V., Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., A model of the motion of long DNA chains in a pulsed electric field. // Phys. Chem. Chem. Phys, 2002. V.4. P. 2691-2701.

73. Frumin L.L., Chasovskikh V.V., Peltek S.E., A "hydrodynamic" model of long polymer chain motion in pulsed field. // Вычислительные Технологии, 2005. Т. 10. N3. С. 3-22.

74. Sudor J., Novotny M.V. Separation of large DNA fragments by capillary electrophoresis under pulsed-field conditions. // Analitical Chemistry. 1994. V. 66 (15). P. 2446-2450.

75. Лифшиц И.М., Гросберг А.Ю., Хохлов А.Р. Полимерная цепь с исключенным объемом во внешнем поле. // Биофизика, 1975. Т. 21. № 5. С. 780787.

76. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Т. 10, Физическая кинетика.-М.: Наука, 1979. § 101. С. 516-518.

77. Исихара А. Статистическая физика. М.: Мир, 1973. Глава 9. С. 258-278.

78. Фрумин Л.Л. Об устойчивости стационарных распределений ионов электролитов в электрических полях. // Вычислительные Технологии, 2005. Т. 10. N4. С. 99-106.

79. Frumin L.L., Zilberstein G.V., Peltek S.E. The isoelectric focusing problem analytic solution: // J. Biochemical and Biophysical Methods, 2000. V. 45. P. 205-209.

80. Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., Nonlinear focusing of DNA mac-romolecules: // Phys. Review E, 2001. V.64. P. 021902.1-5.

81. Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., Nonlinear electrophoresis and focusing of macromolecules. // J. Biochem. Biophys. Methods, 2001. V. 48. P. 269-282.

82. Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V., Nonlinear electrophoretic focusing of DNA macromolecules. // The Analyst, 2001. V. 126. N. 5. P. 559-563.

83. Frumin L.L. Angular integral method for the Dirichlet problem. // Вычислительные Технологии, 1998. Т. 4, N. 3. С. 75-78.

84. Klose J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutation in mammals. // Humangenetik. 1975. V. 26. P. 231-243.

85. Ames G.F.L., Nikaido K. Two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins. //Biochemistry, 1976. V. 15. P. 616-623.

86. Dunn M.J., Corbett J.M. 2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. // Methods Enzymology, 1996. V. 271. P. 177-203.

87. Halloway P., Arundel P. High-resolution two-dimensional electrophoresis of plant proteins. //Analytical Biochemistry, 1988. V. 172. P. 8-15.

88. Pasquali C., Fialka I., Huber L.A. Preparative two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins. //Electrophoresis, 1997. V. 18, 2573-2581.

89. Hanash S.M., Strahler J.R., Neel J.V., Hailat N., Melham R., Keim D., Zhu C., Wagner D., Gage D.A., Watson J.T. Highly resolving two-dimensional gels for protein sequencing. // Proceeding National Academy of Sciences USA, 1991. V. 88. P. 5709-5713.

90. Gorg A., Postel W., Gunther S. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. // Electrophoresis, 1988. V. 9. P. 531-546.

91. Bjellqvist В., Ek K., Righetti P.G., Gianazza E., Gorg A., Westermeier R., Postel W. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology, and some applications. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1982. V. 6. P. 317-339.

92. Kolin A. / Methods of Biochemical Analysis. D. Glick, Ed. Interscience. New York, 1958. V. 6. P. 259.

93. Pettersson E. Isoelectric fractionation. Analysis and characterization of am-• pholytes in natural pH gradients. // Acta Chem. Scand., 1969. V. 23. P. 26332635.

94. Chrambach P., Doerr G.R. , Finlayson L.E.M. , Milers F., Sherins R., Rod-bard D. Instability of pH gradients Formed by Isoelectric Focusing in Poly-acrylamide Gel. // Annals New York Acad. Sc., 1973. V. 209. P. 44-60.

95. Rilbe H. Isoelectric fractionation. Analysis and characterization of ampholytes in natural pH gradients II. // Acta Chem. Scand., 1971. V. 25, N 7. P. 2768-2769.

96. Rilbe H. Historical and theoretical aspects of isoelectric focusing. Isoelectric focusing. A. Theory and methodology. //Annals New York Academy of Sciences, 1973. V. 209. P. 11-22.

97. Ш 110. Rilbe H. Theoretical aspects of steady-state focusing. / In: Isoelectric Focusing, ed. Gastimpulos N., NY: Academic Press, 1976. P. 13-52.

98. Межевикин B.B., Почекутов А.А., Рузанова JI.H. Электродиффузионные градиенты рН для изоэлектрического фокусирования белков. // Доклады РАН, 2001. Т. 77. № 3. С. 406-407.

99. Почекутов А.А., Межевикин В.В. Электродиффузионные градиенты рН для изоэлектрического фокусирования / Материалы VI Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем» Красноярск, ИВМ СО РАН, 2003. С. 154-155.

100. Почекутов А.А., Межевикин В.В. Электродиффузионные градиенты концентраций ионов, приближенное решение / Материалы VI Всероссийского семинара «Моделирование неравновесных систем» Красноярск, ИВМ СО РАН, 2003. С. 135-136.

101. Чандрасекар С. Перенос лучистой энергии / Пер. с англ. под ред. Е.С. Кузнецова. М.: ИИЛ, 1953. - 431 с.

102. Nguyen N.Y., Chrambach A. Stabilisation of рН Gadients in Buffer Electrophocosing on polyacrylamide Gel. // Analytical Biochemisty, 1977. V. 82. P. 54-62.

103. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Теоретическая физика. Т. 6. Гидродинамика. 4-е изд. М.: Наука, 1988.-736 с.

104. Лойцянский Л.Г. Механика жидкости и газа. М.: Наука, 1973. -848 с.

105. Мелвин-Хьюз Э.А. Физическая химия, Книга 2, Гл. XVII. М.: ИИЛ, 1962. С. 763-764.

106. Слезкин Н.А. Динамика вязкой несжимаемой жидкости. М: Гостехиз-дат, 1955. С. 385-432.

107. Кочин Н.Е., Кибель И.А., Розе Н.В. Теоретическая гидромеханика, ч. II, изд. 4-е, Физматгиз, 1963. С. 658-686.

108. Монин А.С., Яглом A.M. Статистическая гидромеханика. 4.1, М.: Наука, 1965. С. 77-161.

109. Шлихтинг Г. Теория пограничного слоя. М.: Наука, 1969. Гл. XVI и XVII. С. 425-508.

110. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика, т. 10. Физическая кинетика, М. Наука, Изд. 4-е. 1988. Гл. 2. С. 135-137.

111. Rolchigo P.M., Graves D.J. Analytical and preparative electrophoresis in nonuniform electric field. // AJChE Journal, V. 34, N 3. P. 483-492.

112. Boncinelly E., Simeone A., de Falco A., Fidanza V., La Volpe A., An agarose gel resolving a wide range of DNA fragment lengths. // Analytical Biochemistry, 1983. V.134 (1). P. 40-43.

113. Ansorge W, Labeit S. Field gradient improve resolution on DNA sequencing gels. // J Biochem. Biophys. Methods, 1984. V. 10 (3-4). P. 237-243.

114. Slater G.W., Noolandi J. Electric field gradients and band shapening in DNA gel electrophoresis. //Electrophoresis, 1988. V. 10. P. 643-646.

115. Olsson A., Moks Т., Uhlen M., Gaal A.B. Uniformly spaced banding pattern in DNA sequencing gels by use of field-stregth gradient. // J Biochem. Biophys. Methods, 1984. V. 10. P. 83-90.

116. Риццо Ф. Метод граничных интегральных уравнений современный вычислительный метод прикладной механики. / В сб.: Механика. Новое в зарубежной науке. Метод граничных интегральных уравнений. Ред.: Иш-линский А.Ю., Черный Г.Г, -М.: Мир, 1976. С. 11-17.

117. Бреббиа К, Уокер С. Применение метода граничных элементов в технике. М, Мир, 1982. - 248 с.

118. Бенерджи П, Баттерфилд Р. Методы граничных элементов в прикладных науках. М, Мир, 1984. - 494 стр.

119. Рябенький B.C. Введение в вычислительную математику. М. Физмат-лит. 2000. Гл. 12. С. 256-261.

120. Громадка Т. II, Лей Ч, Комплексный метод граничных элементов. М.: Мир, 1990.-304 с.

121. Тихонов А.Н., Самарский А.А., Уравнения математической физики. Изд. 4-е. М.: Наука, 1972. Глава IV. С. 329-368.

122. Гахов Ф.Д. Краевые задачи, М.: ГИФМЛ, 1963. Глава I. С. 92-94.

123. Верижский Ю.В. Численные методы потенциала в некоторых задачах прикладной механики. Киев: Вища школа, 1978. - 183 с.

124. Понтер Н.М. Теория потенциала и ее применение к основным задачам математической физики. М., ГИТТЛ, 1953. -420 с.

125. Пельтек С.Е., Фрумин Л.Л., Часовских В.В. Быстрая сепарация больших фрагментов ДНК. // Доклады Академии Наук. 2005. Т. 403. N 2/ С. 261-264.

126. Peltek S.E., Frumin L.L., Chasovskikh V.V., Zilberstein G.V. Nonlinear electrophoresis of protein-detergent complexes. // The Analyst, 2002. V. 127 (3).P. 337-341.

127. McDonnel M. W., Simon M. N., Studier F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. // J. Molecular Biology, 1977. V. 110. P. 119-146.

128. Chacron M.J., Slater G.W. Particle trapping and self-focusing in temporally asymmetric ratchets with strong field gradients. // Physical Review E, 1997. V. 56. P. 3446-3450.

129. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984.-480 с.

130. Slater G.W., Guillouzic S., Gauthier M.G., Mercier J.-F., Kenward M., McCormick M.C., Tessier F. Theory of DNA electrophoresis ~(1999-20021/2). //Electrophoresis, 2002. V. 23. P. 3791-3816.

131. Bourke В., Sherman P.M., Woodward D., Lior H., Chan V.L., Pulsed field gel electrophoresis indicates genotypic heterogeneity among Campilobacter up-salensis strains. //FEMS Microbiol. Lett., 1996. V.143 (1). P. 57-61.

132. Martin J.M., Wald E.R., Green M. Field inversion gel electrophoresis as a typing system for group A Streptococcus. // J. Infec. Diseases, 1998. V. 177 (2). P. 504-507.

133. Prevost G., Jaulac В., Piemont Y. DNA fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis is more effective than ribotyping in distinguishing among me-thicillin- resistant Staphylococcus aureus isolates. // J Clin Microbiol. 1992. V. 30. P. 967-973.

134. Каталог фирмы BioRad: Life Science Research Products. 1998/1999. -Hercules (CA): BioRad Laboratories, 1999. -492 p.

135. Guo X.H., Chen S.-H. The structure and thermodynamic of protein-SDS complexes in solution and the mechanism of their transport in gel electrophoresis process. // Chemical Physics, 1990. V. 148. P. 125-139.

136. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. //Nature, 1970. V. 227. P. 680-685.

137. Ornstein L. Disc electrophoresis-I: Background and theory. // Annalen N.Y. Academy Sciences, 1964. V. 121. P. 321-349.

138. Davis B. J. Disc electrophoresis-II: Method and application to human serum proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1964. V. 121. P. 404-427.

139. Фрумин JI.JI. Об одном подходе к решению нелинейных параметрических задач. // Вычислительные Технологии, 2002. V. 7. N .5. С. 88-95.

140. Frumin L.L., Zilberstein G.V. Parametric inverse problems of electrode kinetics. //Electrochem. Communications, 1999. V.l. P. 97-100.

141. Преображенский Н.Г., Фрумин. JI.JI. О некоторых схемах решения неустойчивых задач. / В кн.: Всесоюзная школа-семинар: Теория и методы решения некорректно поставленных задач, Новосибирск: ВЦ СО АН СССР. 1983. С. 173-174.

142. Преображенский Н.Г., Фрумин. Л.Л. Вопросы локальной оптической диагностики полупрозрачной плазмы. / Препринт ИТПМ N 26-83. Новосибирск: ИТПМ СО АН СССР. 1983. - 37 с.

143. Зильберштейн Г.В., Фрумин Л.Л. О функции Тафеля. //Ж. Хим. Физики, 1995. С. 104-105.

144. Frumin L.L., Zilberstein G.V. On the Tafel Function. // Proc. of the VII Meeting of the Portuguese Electrocheml Soc. and III Iberian Meeting of Electrochemistry. Algarve, Portugal, 1995. P. 25-26.

145. Пикалов B.B., Преображенский Н.Г., Фрумин. Л.Л. К вопросу о корректной обработке результатов зондовых измерений в плазме. / В кн.: Физическая газодинамика. Новосибирск: Наука, 1976. С. 181-183.

146. Преображенский Н.Г., Фрумин Л.Л. К вопросу интерпретации зондовых измерений в плазме. / Материалы 3-й Всесоюзной школы-конференции по современным методам магнитного удержания, нагрева и диагностики плазмы. Харьков, 1982. С. 141-149.

147. Ишуткин B.C., Кузьмин Г.Е., Пай В.В., Фрумин Л.Л. Об измерении поля температуры при плоском установившемся течении металла.// ПМТФ, 1992. №2. С. 157-165.

148. Китаева В.Ф., Осипов Ю.И., Пикалов В.В., Соболев Н.Н., Преображенский Н.Г., Фрумин. Л.Л. Локальные зондовые измерения плазмы аргонового лазера. ЖТФ, 1977. Т. 48(8). С.1663-1671.

149. Frumin L.L., Zilberstein G.V. Steady-state electrode kinetics for the spherical electrode. / Proc. of the VII Meeting of the Portuguese Electrochem. Soc.and III Iberian Meeting of Electrochemistry. Algarve, Portugal, 1995. P. 143— 144.

150. Frumin L.L., Zilberstein G.V. Asymptotic approach in steady-state electrode kinetics for the spherical electrode. // J. Electrochemical Soc., 1997. V. 144. P. 3458-3461.

151. Frumin L.L., Zilberstein G.V. Asymptotic approach in steady-state electrode kinetics for the spherical electrode-II. // J. Electrochemical Soc., 1998. V. 145. P. 720-721.

152. Фрумин JI.JI., Зильберштейн Г.В. Краевые задачи электродной кинетики. / Труды Института Вычислительных Технологий, Новосибирск, ИВТ СО РАН, 1994. Т. .4. N. 13. С. 258-270.

153. Frumin L.L., Peltek S.E., Zilberstein G.V. "Wrong" peaks forming conditions in capillary electrophoresis. // Jap. J. Electrophoresis, 1999. V. 43. P. 43.

154. Преображенский Н.Г., Фрумин. Л.Л. К вопросу о восстановлении потенциала межмолекулярного взаимодействия по вириальным коэффициентам. // Известия Вузов, серия Физика, 1980. N 6. С. 30-33.

155. Neuhoff V. Microelectrophoresis and auxiliary micromethods. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 3-11.

156. Proudnikov D., Timofeev E., Mirzabekov A. Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips. // Analitical Biochemistry, 1998. V. 259. P. 34-41.

157. Chen Y.H., Chen S.H. Analysis of DNA fragments by microchip electrophoresis fabricated on poly(methylmethacrylate) substrates using a wire-imprinting method. //Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 165-170.

158. Mueller O., Hahnenberger K., Dittmann M., Dubrow R., Nagle R., Ilsley D. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantization. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 128-134.

159. Backhouse C., Caamano M., Oaks F., Carillo A., Johnson B. Bay S. DNA sequencing in a monolithic microchannel device. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 150-156.

160. Heller M.J., Forster A.H., Tu E. Active microelectronic chip devices which utilize controlled electrophoretic fields for multiplex DNA hybridization and other genomic applications. //Electrophoresis, 2000. V. 21. P.157-164.

161. Rodriguez I., Jin L.J., Li S.F. High speed chiral separations on microchip electrophoresis devices. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P.211-219.

162. Dolnik V., Liu S., Jovanovich S. Capillary electrophoresis on microchip. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 41-54.

163. Duke T.A.J., Austin R.H. Micro fabricated sieve for the continuous sorting of macromolecules. //Phys. Rev. Lett., 1998. V. 80, 1552-1555.

164. Chou C-F., Austin R.H., Bakajin O., Tegenfeld J.O, Castelino J.A., Chan S.S., Сох E.C., Craighead H., Darnton N., Duke Т., Han J., Turner S. Sorting biomolecules with microdevices. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 81-90.

165. Wen J, Lin Y, Xiang F., Matson D.W., Udseth H.R., Smith R.D. Microfab-ricated isoelectric focusing device for direct electrospray ionization-mass spectrometry. //Electrophoresis, 2000. V. 21. P.191-197.

166. Duke Т., Austin R.H., Сох E.C., Chan S.S., Pulsed-field electrophoresis in microlithographic arrays. //Electrophoresis, 1996. V. 17. P. 1075-1079.

167. Ocvirk G., Munroe M., Tang Т., Oleschuk R., Westra K., Jed Harrison D. Electrokinetic control of fluid flow in native poly(dimethilsiloxane) capillary electrophoresis. //Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 107-115

168. Woolley A.T, Lao K, Glazer A.N, Mathies R.A. Capillary electrophoresis chips with integrated electrochemical detection. // Analitical Chemistry, 1998. V. 70. P. 684-688.

169. Ueda M, Kiba Y, Arai A, Nakanishi H, Baba Y. Fast separation of oligonucleotide and triplet repeat DNA on a microfabricated capillary electrophoresis device and capillary electrophoresis. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 176-180.

170. Colyer C.L, Mangru S.D, Harrison D.J. Microchip-based capillary electrophoresis of human serum proteins. // J. Chromatography A, 1997. V. 781. P. 271-276.

171. Carillho E. DNA sequencing by capillary array electrophoresis and micro-fabricated array systems. // Electrophoresis, 2000. V. 21. P. 55-65.

172. Демидов В.И, Колоколов Н.Б, Кудрявцев А.А. Зоидовые методы исследования низкотемпературной плазмы. М.: Энергоатомиздат. 1996, -240 с.

173. Догонадзе P.P., Кузнецов A.M. Итоги науки. Электрохимия. М.:.1969.

174. Фрумкин А.Н, Багоцкий B.C., Иофа З.А, Кабанов Б.Н. Кинетика электродных процессов. М.: Изд.: МГУ. 1952. - 278 с.

175. Гейровский Я, КутаЯ. Основы полярографии. -М.: Мир. 1965. 560 с.

176. Дамаскин Б.Б, Петрий О.А, Основы теоретической электрохимии. -М.: Высшая школа, 1978; 2-ое издание — Электрохимия, 1987, 400 с.

177. Крюкова Т.А, Синякова С.И, Арефьева Т.В. Полярографический анализ. М.: Госхимиздат, 1956. - 772с.

178. Майрановский С.Г, Страдынь Я.П, Безуглый В.Д. Полярография в органической химии. JL: Химия. 1975. - 352 с.

179. Измайлов Н.А. Электрохимия растворов.3-е изд. -М.: Химия. 1976. -488 с.

180. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа. М.: Мир. 1974,-552 с.

181. Багоцкий B.C. Основы электрохимии. М.: Химия. 1987. - 400 с.

182. Cohen I. Asymptotic Theory of Spherical Electrostatic probes in slightly ionized, collision-dominated gas. // Phys.of Fluids. 1963. V.6, N 10. P. 14921499.

183. Малявин JI.А., Москаленко A.M. Структура возмущенной зоны в окрестности сильно заряженного тела в слабоионизованной плазме. // ЖТФ, 1974, Т. XLIV. В. 2. С. 325-332.

184. Чан П., Тэлбот Л., Турян К. Электрические зонды в неподвижной и движущейся плазме. М.: Мир, 1978, -202 с.

185. Каган Ю.М., Перель В.И. Зондовые методы исследования плазмы. // Успехи физ. Наук, 1973. Т. 81 (3). С. 409-452.

186. Козлов О.В. Электрический зонд в плазме. М.: Атомиздат, 1969. -291 с.

187. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Т.6. Гидродинамика. 4-е изд. М:Наука, 1988. С. 327.

188. Елинсон М.И., Васильев Г.Ф. Автоэлектронная эмиссия. Под ред. Д.В. Зернова. М.: ГИФМЛ. 1958.-272 с.

189. V 214. Brodie I., Spindt С.A. Vacuum Microelectronics / Advances in Electronics and Electron Physics. N.Y.: Acad. Press, 1992. V. 83. P. 1-106.

190. Фишер P., Нойман X. Автоэлектронная эмиссия полупроводников: / Новое в исследовании автоэлектронной эмиссии полупроводников: Пер. с нем.; С доп. обзором Фурсея Г.Н. и Львова О.И. / Под общ. ред. И.Л. Сокольской. М.: Наука, 1971. - 215 с.

191. Модинос А. Авто-, термо- и вторично-электронная эмиссионная спектроскопия: Пер. с англ. под ред. Фурсея Г.Н. М.: Наука, 1990. - 320 с.

192. Пикус Г.Е., Полупроводники в науке и технике. Ред. Иоффе А.Ф. -М.Д: Наука. 1957. С. 148-260.

193. Ван-Дайк М. Методы возмущений в механике жидкости. М.: Мир, Щ 1967.-310 с.

194. Шлихтинг Г. Теория пограничного слоя. М.: Наука, 1969, - 744 е.

195. Черненко А.А. К теории прохождения постоянного тока через раствор электролита. // ДАН СССР, 1963. Т. 153. С. 1129-1131.

196. Черненко А.А. К теории прохождения постоянного тока через раствор электролита.// Электрохимия, 1971. Т. 7. С. 1739-1741.

197. Gouy G. Sur la constitutionde la charge electrique a la surface d'un electrolyte. // Journal de PhysiqueTheorique et Appliquee, 1910. Ser. 4. V. 9. P. 457468.

198. Chapman L. A contribution to the theory of electrocapillarity. // Philosophical Magazine. 1913. Ser. 6. V. 25, N 148. P. 475-481.

199. Флорианович Г.М., Фрумкин A.H., О механизме электровосстановления анионов на ртутном электроде. // Ж. Физ. Химии, 1955. Т. 29. С. 18271836.

200. Фрумкин А.Н. Потенциалы нулевого заряда, М.: Наука, 1982, - 228 с.

201. Тихонов А.Н., Арсенин В.Я. Методы решения некорректных обратных задач. 2-е изд. -М.: Наука. 1979,-286 с.

202. Лаврентьев М.М. О некоторых некорректных задачах математической физики. Новосибирск: изд. СО АН СССР, 1962. -68 с.

203. Турчин В.Ф., Козлов В.П., Малкевич М.С. Использование методов математической статистики для решения некорректных задач. // Успехи физ. Наук, 1970. Т. 102. (3). С. 345-386.

204. Преображенский Н.Г., Пикалов В.В. Неустойчивые задачи диагностики плазмы. Новосибирск: Наука, 1982. - 238 с.

205. Крянев А.В. Решение некорректных задач методами последовательных приближений. //Докл. АН СССР, 1973. Т. 210. С. 20-22.

206. Крянев А.В. Итерационный метод решения некорректных задач методами последовательных приближений. // ЖВММФ, 1974. Т. 14. С. 25-35.

207. Тихонов А.Н. О решении нелинейных интегральных уравнений первого рода.//Доклады АН СССР, 1964. Т.156. С. 1296-1299.

208. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Т.1. Механика. М.: Наука, 4-е изд. 1988. С. 40-41.

209. Линник Ю.В. Метод наименьших квадратов и основы теории обработки наблюдений. М.: Физматгиз, 1958. - 333 с.

210. Бард И. Нелинейное оценивание параметров. М.: Статистика, 1979. -350 с.

211. Булышев А.Е., Преображенский Н.Г. К вопросу об информационной обеспеченности метода магнитного сканирования. // Оптика и спектроскопия, 1978. Т. 44. С. 823-824.