Молекулярное моделирование строения аденозиновых рецепторов и компьютерный дизайн их потенциальных лигандов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Иванов, Андрей Андреевич АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
2004 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.03 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Молекулярное моделирование строения аденозиновых рецепторов и компьютерный дизайн их потенциальных лигандов»
 
Автореферат диссертации на тему "Молекулярное моделирование строения аденозиновых рецепторов и компьютерный дизайн их потенциальных лигандов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи

УДК 541.6:547.96

ИВАНОВ АНДРЕЙ АНДРЕЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРОЕНИЯ АДЕНОЗИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ И КОМПЬЮТЕРНЫЙ ДИЗАЙН ИХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ

(02.00.03-Органическая химия 05.13.18-Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории органического синтеза кафедры органической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова и в группе Высокоэнергетических соединений Института физиологически активных веществ РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук, ведущий научный

сотрудник Палюлин Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Синицын Аркадий Пантелеймонович

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Махаева Галина Файвелевна

Ведущая организация: ГУ НИИ Биомедицинской химии

им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится "22" октября 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.102.01 в Институте физиологически активных веществ РАН по адресу: 142432 Московская обл., Ногинский р-н, г. Черноголовка, ИФАВ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологически активных веществ РАН.

Автореферат разослан "22" сентября 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 002.102.01 кандидат биологических наук

Е.Г. Киреева

0,015 1

Актуальность проблемы. Аденозиновые рецепторы широко представлены в большинстве типов тканей и клеток животных и человека и участвуют в огромном количестве различных физиологических процессов. Как агонисты, так и антагонисты аденозиновых рецепторов могут использоваться в медицине в качестве лекарственных препаратов для лечения ряда нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний. Данные о воздействии лигандов на аденозиновые рецепторы достаточно обширны, но до сих пор отсутствуют экспериментальные данные о пространственном строении этих рецепторов, что существенным образом затрудняет задачу изучения механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий и разработку новых более эффективных препаратов. Также неясньми остаются причины селективного связывания лигандов с тем или иным подтипом рецепторов. В связи с этим в настоящее время изучение структуры аденозиновых рецепторов и дизайн их новых селективных лигандов представляется весьма важной и актуальной проблемой. Аденозиновые рецепторы, как и другие рецепторы, сопряженные с G-белками, представляют собой мембранные белки, плохо поддающиеся кристаллизации и изучению методом рентгеноструктурного анализа. Поэтому на первый план выступает молекулярное моделирование пространственных структур этих белков. Однако к настоящему моменту не существует ни одной молекулярной модели аденозиновых рецепторов, в которой кроме трансмембранного домена были бы смоделированы все гидрофильные петли, влияющие на общую геометрию рецептора, участвующие в передаче сигнала от рецептора к G-белку и способные принимать участие в связывании агонистов и антагонистов. Кроме того, именно методы молекулярного моделирования дают возможность определить наиболее перспективные модификации существующих лигандов, что оказывается крайне важным при поиске новых биологически активных соединений с заданными свойствами.

Цель работы. 1) Изучение структуры каждого из четырех известных на сегодняшний день подтипов аденозиновых рецепторов человека (Л1, А2а, Л2Ь и Л3) посредством построения их полных пространственных молекулярных моделей, включающих в себя не только трансмембранные а-спирали, но и гидрофильные петли, а также концевые участки; 2) детальное изучение механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий для агонистов и антагонистов данных рецепторов на основе компьютерных молекулярных моделей, определение функциональных групп лигандов и аминокислотных остатков рецепторов, наиболее важных для эффективного связывания лигандов; 3) выявление особенностей строения лиганд-связывающих центров рецепторов и определение причин селективного связывания агонистов и антагонистов с каждым подтипом рецепторов; 4) компьютерное конструирование новых потенциальных лигандов аденозиновых рецепторов.

Научная новизна. В работе впервые построены полные молекулярные модели всех четырех подтипов аденозиновых рецепторов человека, содержащие как трансмембранные а-спирали, так и все гидрофильные петли и концевые участки. С помощью молекулярного докинга изваст^^х Антагонистов

БИМИОТЕКЛ

а

О»

аденозиновых рецепторов детально изучены лиганд-рецепторные взаимодействия и выявлены аминокислотные остатки, имеющие наибольшее значение для эффективного связывания лигандов с каждым подтипом рецепторов. Выявлен ряд важных особенностей строения лиганд-связывающих центров каждого рецептора. На основе полученных молекулярных моделей сделаны выводы о причинах селективности и эффективности различных лигандов, включая их оптические изомеры.

В работе показана возможность существования двух различных механизмов связывания антагонистов, что подтверждено результатами молекулярно-динамических расчетов лиганд-рецепторньк комплексов А2Ь аденозинового рецептора в фосфолипидном бислое.

Все известные на сегодняшний день агонисты аденозиновых рецепторов представляют собой производные аденозина. В данной работе на основе полученных моделей и предложенных механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий сконструирован ряд структур новых потенциальных агонистов аденозиновых рецепторов, не являющихся производными аденозина. Предложены пути поиска селективных агонистов А2Ь рецептора, что является одной из актуальнейших проблем в современной химии аденозиновых рецепторов.

Практическая значимость. Полученные полные молекулярные модели аденозиновых рецепторов человека позволяют не только представить их общее строение, но и выявить важные особенности, характерные для каждого подтипа. Данные модели вносят определенный вклад в понимание общей структуры G-белок сопряженных рецепторов семейства родопсина и могут использоваться при изучении структуры других рецепторов этого семейства. Построенные модели могут быть использованы при изучении механизмов функционирования аденозиновых рецепторов и передачи сигнала к G белку, что является отдельной крайне важной проблемой. Полученные данные о пространственной конфигурации лиганд-связывающих центров и установленные механизмы лиганд-рецепторных взаимодействий, а также предложенные пути поиска новых потенциальных эффективных лигандов аденозиновых рецепторов являются важными для разработки новых лекарственных препаратов для лечения сердечнососудистых и нейродегенеративных заболеваний.

Построенные пространственные модели рецепторов и лиганд-рецепторных комплексов могут использоваться в качестве иллюстративного материала и материала для практических работ при обучении студентов и аспирантов химических, биологических и медицинских ВУЗов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на IX Всероссийском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002); III Российской конференции "Молекулярное моделирование" (Москва, 2003); X Всероссийском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2003); конференции "Medicinal Chemistry and Pharmacology of Purinergic Receptors", проводимой в рамках XIV международного симпозиума "Ongoing Progress in the Receptor Chemistry" (Камерино, Италия, 2003); конференции "Polish-Austrian-

German-Hungarian-Italian Joint Meeting on Medicinal Chemistry" (Краков, Польша, 2003);

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи и 5 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы (198 работ). Общий объем диссертации составляет 163 страницы, включая 42 рисунка и 7 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Во введении формулируется цель и обосновывается актуальность темы диссертационной работы, указываются основные направления исследования.

Первая глава посвящена обзору литературных данных по теме диссертационной работы. В главе рассмотрена современная классификация и общая структура G-белок сопряженных рецепторов (GPCR), современная классификация аденозиновых рецепторов, особенности их строения и функционирования, проведен обзор как известных на сегодняшний день агонистов и антагонистов данных рецепторов, так и основных методов молекулярного моделирования G-белок сопряженных рецепторов. В главе изложены современные данные о лиганд-рецепторных взаимодействиях в аденозиновых рецепторах, полученные как с помощью экспериментальных работ по сайт-направленному мутагенезу, так инайденные с помощью молекулярного моделирования.

Вторая глава посвящена описанию построения пространственных молекулярных моделей четырех подтипов аденозиновых рецепторов человека (Al, A2a, A2b и A3), включающих трансмембранный домен, внеклеточные и внутриклеточные гидрофильные петли и концевые участки.

Аденозиновые рецепторы являются мембранными белками, плохо поддающимися кристаллизации и изучению с помощью рентгеноструктурного анализа. По этой причине, наиболее эффективным оказывается изучение их пространственной структуры с помощью молекулярного моделирования по гомологии со структурно-схожим шаблонным белком. На первом этапе работы было осуществлено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей трансмембранных ос-спиралей четырех известных подтипов аденозиновых рецепторов человека (Al, A2a, A2b и A3) и шаблонного белка -родопсина. Далее с помощью программного комплекса Sybyl 6.9 все аминокислотные остатки трансмембранного домена родопсина, нетождественные остаткам аденозиновых рецепторов, были последовательно заменены на соответствующие аминокислотные остатки каждого подтипа рецепторов. Таким образом были получены четыре трехмерные структуры, отвечающие трансмембранным доменам четырех подтипов аденозиновых рецепторов. К данным структурам были добавлены все водородные атомы, после чего была проведена оптимизация геометрии полученных моделей. Минимизация энергии

проводилась методом Пауэлла в силовом поле Tripos с использованием атомных зарядов Кольмана ("KOLLMAN-ALL"). После завершения построения моделей трансмембранных доменов аденозиновых рецепторов с помощью программы LOOP SEARCH блока BIOPOLYMER, входящего в состав комплекса Sybyl 6.9 было осуществлено моделирование внеклеточных и внутриклеточных гидрофильных петель. После вставки всех гидрофильных петель была проведена повторная оптимизация геометрии полученных моделей. Таким образом, были построены четыре пространственные молекулярные модели каждого подтипа аденозиновых рецепторов человека, включающие в себя как трансмембранные а-спирали, так и гидрофильные петли, соединяющие эти спирали. Формальная геометрия полученных моделей была проверена с помощью процедуры ProTable, входящей в состав комплекса Sybyl, и программы Procheck. Проведенный анализ полученных молекулярных моделей показал, что в целом модели обладают достаточным качеством и могут использоваться для изучения лиганд-рецепторных взаимодействий. Однако полученное пространственное расположение гидрофильных петель в данных моделях заметно отличается от их расположения в родопсине, структура которого рассматривается как эталонная для рецепторов первой подгруппы GPCRs. В большей степени это касается второй внеклеточной и третьей внутриклеточной гидрофильных петель, имеющих наибольшую длину.

Для уточнения пространственного расположения гидрофильных петель аденозиновых рецепторов было осуществлено повторное построение молекулярных моделей. При этом в качестве шаблона для моделирования были использованы как трансмембранные а-спирали родопсина, так и его гидрофильные петли и концевые участки. Для этого с помощью программы автоматического выравнивания ClustalX и с учетом выравнивания, проведенного для трансмембранных а-спиралей, было проведено множественное выравнивание полных аминокислотных последовательностей аденозиновых рецепторов и родопсина. После этого с помощью программы Modeller было осуществлено построение пространственных моделей аденозиновых рецепторов. Для тех случаев, когда во множественном выравнивании аминокислотных последовательностей исследуемых рецепторов и родопсина имелись пропуски или вставки, была использована процедура DOJLOOP, входящая в Modeller. С помощью данного подхода были получены молекулярные модели четырех подтипов аденозиновых рецепторов, содержащие все атомы основных и боковых цепей рецептора, кроме атомов водорода. Далее с помощью программного комплекса Sybyl 6.9 для каждой из полученных моделей были добавлены водородные атомы и атомные заряды из библиотеки "KOLLMAN-ALL". После этого была выполнена окончательная минимизация энергии в силовом поле Tripos. Верификация моделей была осуществлена с помощью процедуры ProTable и программы Procheck. Проведенный анализ полученных пространственных моделей аденозиновых рецепторов показал их высокое качество и возможность их дальнейшего использования в работе. Полученные модели представлены на рис. 1.

Сравнивания молекулярные модели аденозиновых рецепторов, полученные двумя различными способами, следует отметить, что основные отличия при построении моделей были связаны со способом моделирования гидрофильных петель, а не трансмембранных а-спиралей, при построении которых было

использовано одно и тоже выравнивание аминокислотных последовательностей и шаблонные а-спирали родопсина. Поэтому расположение аминокислотных остатков внутри трансмембранного домена, в частности лиганд-связывающего центра рецепторов, практически идентично в моделях, построенных разными способами. Из этого следует, что результаты изучения лиганд-рецепторных взаимодействий, полученные для двух различных моделей одного и того же рецептора, вполне сопоставимы. С другой стороны, расположение гидрофильных петель в моделях, построенных с помощью подбора гомологичных петель глобулярных белков, находится в меньшем соответствии со структурой родопсина, чем в моделях, построенных с помощью моделирования по гомологии с полной структурой шаблонного белка. Кроме того, в моделях, построенных последним способом, присутствуют внеклеточный и внутриклеточный концевые участки, что также является их важным преимуществом.

Третья глава посвящена изучению лиганд-рецепторных взаимодействий антагонистов аденозиновых рецепторов с помощью молекулярного докинга.

Процедура докинга лигандов осуществлялась вручную и заключалась в следующем. Первоначально, геометрия каждого лиганда была оптимизирована в силовом поле Tripos с использованием атомных зарядов, рассчитанных по Гастайгеру - Хюккелю. Далее каждый лиганд был помещен в лиганд-связывающий центр рецептора таким образом, чтобы функциональные группы лиганда, предположительно участвующие в связывании, находились на расстоянии от соответствующих групп рецептора, оптимальном для образования водородных связей. После этого с помощью программы dock, входящей в комплекс Sybyl 6.9, проводился поиск наиболее благоприятного расположения лигандов в лиганд-связывающем центре с фиксированным положением атомов основных и боковых цепей рецептора до достижения наиболее энергетически выгодной конформации лиганда внутри рецептора. Далее ограничения на подвижность основных и боковых цепей лиганд-связывающего центра снимались, и проводилась повторная процедура молекулярного докинга с небольшим числом итераций минимизации энергии. Это позволяло учесть не только гибкость лиганда, но и подвижность боковых цепей рецептора. После этого осуществлялась окончательная оптимизация геометрии полученных лиганд-рецепторных комплексов. Использование такого подхода, во-первых, позволяет найти наиболее выгодную конформацию лигандов внутри сайта связывания, и, во-вторых, избежать значительных изменений в структуре рецептора, возникающих на первых шагах молекулярного докинга при подвижных боковых цепях.

В главе изложены результаты изучения лиганд рецепторных взаимодействий для 38 антагонистов аденозиновых рецепторов, включая 8-незамещенные 1,3-диалкилксантины, 1,3-диалкил-8-циклопентил- и 8-фенилксантиновые производные, антагонисты с сукцинимидными, малимидными и пара-замещенными фениламидными заместителями (рис. 2). Всего для данных лигандов было построено и изучено 152 лиганд-рецепторных комплекса. На основе полученных результатов был предложен общий механизм лиганд-рецепторных взаимодействий (рис. 3-6), найдены наиболее важные для связывания аминокислотные остатки рецепторов и фармакофоряые группы лигандов, а также

выявлены важные особенности взаимодействий антагонистов с каждым подтипом рецепторов, что позволило объяснить причины различий в селективности и эффективности связывания антагонистов.

В главе также представлены результаты компьютерного исследования механизмов связывания 8-пиразол-, 8-изоксазол- и 8-аминофенилзамещенных ксантиновых производных с А2Ь аденозиновым рецептором человека (рис. 7). Всего построено и изучено 53 лиганд-рецепторных комплекса для таких лигандов. Первоначально, была предпринята попытка расположить данные антагонисты в лиганд-связывающем центре А2Ь рецептора по аналогии с 1,3-диалкил-8-фенилксантиновыми производными, то есть таким образом, чтобы оба кислородных атома ксантинового фрагмента участвовали в образовании водородных связей с гистидиновым и аспарагиновым остатками. Однако полученные результаты позволяют предположить, что такой механизм связывания лигандов маловероятен. Было найдено, что метальная группа антагонистов, находящаяся в первом положении пиразольного цикла, должна располагаться между гидроксильными группами 1Ъг89 и Seг279. Кроме того, His280, Val85, ^61 и Glul4 создают стерические затруднения для фенильного кольца лигандов. Аналогичные результаты были получены и для 8-(3-пиразольных)-производных, замещенных в положении 5.

Рассматриваемый механизм лиганд-рецепторных взаимодействий оказался невыгодным и для изоксазолильных производных. Несмотря на отсутствие в изоксазолильном цикле метальной группы, при взаимодействии данных структур с А2Ь аденозиновым рецептором сохраняются стерические препятствия, создаваемые, прежде всего, His280 и Glul4, расположенными слишком близко к фенильному циклу лигандов. Тем не менее, экспериментальные значения констант связывания рассматриваемых лигандов, показывают, что данные антагонисты обладают определенной, достаточно высокой аффинностью по отношению к А2Ь подтипу аденозиновых рецепторов. На основании полученных результатов было сделано предположение о возможности существования альтернативного механизма связывания данных антагонистов с А2Ь рецептором.

Для поиска такого механизма связывания был проведен анализ Внутренней конфигурации полученной молекулярной модели А2Ь рецептора и молекулярный докинг рассматриваемых антагонистов в различные части данного рецептора. Было найдено, что наиболее вероятное расположение ксантинового фрагмента лиганда такое, что атом кислорода в положении 6 находится на расстоянии 2.4А от гидроксильной группы Seг92 и ЗА от аминогруппы Asn282, что обуславливает возможность образования водородной связи данного кислородного атома с обоими аминокислотными остатками. При этом алкильный заместитель в первом положении ксантинового цикла располагается внутри гидрофобной полости, образованной Leu49, Ala52, Asp53 и Asn286, а алкильная группа в третьем положении находится в окружении ^93, Leul95 и Metl98. Кроме того, фенильное кольцо Phe243 оказалось расположенным параллельно плоскости ксантинового фрагмента лигандов и находится от него в непосредственной близости. Это позволяет предположить, что с большой вероятностью между данным фенилаланиновым остатком и ксантиновой частью лигандов могут возникать выгодные л - л взаимодействия (рис. 8).

Анализ полученных результатов молекулярного докинга 1-метилпиразолзамещенных производных показал, что метальная группа в положении 1 пиразольного цикла лиганда находится в окружении гидрофобных заместителей Leul95, His251 и Тгр247. При этом индольный цикл Тгр247 остатка ориентирован параллельно плоскости пиразольного цикла, что может приводить к дополнительным выгодным лиганд-рецепторным взаимодействиям. Кроме того, атом кислорода амидной группы лигандов образует водородную связь с Ш8251, a NH-группа амидной части антагонистов участвует в образовании водородной связи с ^г89.

Рис. 8. Общий механизм лиганд-рецепторных взаимодействий пиразольных производных с А2Ь аденозиновым рецептором

Согласно механизмам связывания, полученным для изоксазолзамещенных производных, NH-группа имидазольного цикла Шв251 находится на расстоянии 4А от атомов кислорода и азота изоксазолильного фрагмента лигандов. Это позволяет предположить участие гистидинового остатка в образовании водородной связи с лигандами данного типа, возникающей за счет возможности вращения имидазольного цикла вокруг С-С связи. Также было найдено, что в моделях, полученных для данных антагонистов, расстояние между атомом кислорода в положении 6 ксантинового цикла и аминогруппой Asn282 составляет 2.4А, и участие Asn282 в образовании водородной связи представляется достаточно вероятным. Рассмотрение механизмов связывания 8-амидофенилзамещенных ксантиновых производных позволяет сделать вывод, что фенильная группа в восьмом положении ксантинового фрагмента участвует в я-я взаимодействиях с Тгр247, находящимся достаточно близко от данного заместителя и расположенным параллельно плоскости фенильного цикла лигандов. Также в связывании лигандов принимает участие гидроксильная группа !Ъг89 и NH-группа имидазольного цикла His251, образующие водородные связи с амидной группировкой антагонистов. Бензильная группа лигандов или соответствующий ей анилиновый фрагмент располагаются между Phel87, Vail91, ^^58 и метиленовой группой л8п254. На расстоянии ЗА от атомов кислорода метоксигрупп лигандов (в частности, лиганда 13) оказалась расположена аминогруппа Asnl86, которая с равной вероятностью может участвовать в образовании водородной связи как с группой в пара-положении, так и в мета-положении. Кроме того, метиленовая группа данного аспарагинового остатка находится около метильного заместителя метоксигруппы в мета-положении лиганда. В гидрофобных взаимодействиях с мета-метоксигруппой принимает участие ^и258, а метильный заместитель метоксигруппы, находящейся в пара-положении фенильного цикла, участвует в гидрофобных взаимодействиях с VaП83, Cys255 и Phel87, образующих гидрофобный карман. На рис. 9 представлены молекулярные комплексы лигандов 13 и 14 с А2Ь рецептором.

Было показано, что альтернативный механизм связывания может реализоваться и для 8-незамещенных 1,3-диалкилксантинов, а также 8-фенилксантинов с небольшими функциональными группами в пара-положении фенильного цикла. Все результаты молекулярного докинга антагонистов аденозиновых рецепторов находятся в хорошем соответствии с имеющимися экспериментальными данными по сайт-направленному мутагенезу аденозиновых рецепторов.

В четвертой главе для дальнейшего изучения лиганд-рецепторных взаимодействий антагонистов с А2Ь аденозиновым рецептором и дополнительной проверки гипотезы о существовании альтернативного механизма связывания лигандов были осуществлены молекулярно-динамические расчеты комплексов А2Ь рецептора с теофиллином, 1,3-дипропил-8-сульфофенилксантином (БР8РХ) и лигандом 15.

Наиболее оптимальным для проведения молекулярно-динамических расчетов трансмембранных рецепторов представляется использование фосфолипидного бислоя, который является естественной природной средой таких

рецепторов. В данной работе была использована модель фосфолипидного бислоя 1-пальмитоил-2-олеил-8п-глицеро-3-фосфатидилхолина (рис. 10), содержащая 200 фосфолипидных молекул, сольватированных молекулами воды, что представляется достаточным для помещения внутрь бислоя структуры А2Ь аденозинового рецептора. Для проведения молекулярно-динамических расчетов А2Ь рецептора, была осуществлена вставка трех лиганд-рецепторных комплексов рецептора с указанными выше лигандами внутрь фосфолипидного бислоя. Данная процедура осуществлялась вручную с помощью программного комплекса Sybyl 6.9 и заключалась в следующем. Первоначально, молекулярная модель А2Ь рецептора с лигандом помещалась внутрь фосфолипидного бислоя, содержащего исходное количество молекул фосфолипидов и воды. При этом пространственная ориентация рецептора внутри бислоя была такой, что, во-первых, трансмембранный домен рецептора был окружен примерно одинаковым количеством фосфолипидов с каждой стороны. Во-вторых, трансмембранные а-спирали рецептора были ориентированы максимально параллельно углеводородным цепям фосфолипидных молекул (то есть, перпендикулярно плоскости водного слоя). Кроме того, внеклеточные и внутриклеточные гидрофильные петли рецептора находились в окружении молекул воды внеклеточного и внутриклеточного водных слоев. После этого все фосфолипидные молекулы и молекулы воды, перекрывающиеся со структурой рецептора и находящиеся от нее на расстоянии 2.3А, были удалены, что позволило получить необходимое пространство для структуры рецептора внутри фосфолипидного бислоя.

Таким образом были построены три. молекулярных комплекса А2Ь аденозинового рецептора с теофиллином, DPSPX и лигандом 15 в окружении фосфолипидного бислоя. В среднем, каждый комплекс содержит 130 фосфолипидных молекул и 4220 молекул воды, что с учетом атомов рецептора и лиганда составляет около 22350 атомов (рис. 10). Далее для снятия возможных неблагоприятных взаимодействий между боковыми цепями рецептора и молекулами фосфолипидного бислоя была осуществлена оптимизация геометрии полученных молекулярных комплексов. Оптимизация геометрии проводилась методом "скорейшего спуска" с помощью программного комплекса GROMACS 3.14. После этого, также с помощью программы GROMACS, для каждого лиганд-рецепторного комплекса были осуществлены молекулярно-динамические расчеты. Для молекул фосфолипидов, воды, лиганда и рецептора была использована температура ЗООК с константой сопряжения Tt = 0.1 пс и постоянное давление 1 атм с константой сопряжения тр = 1 пс. Молекулярно-динамические расчеты проводились в течение 1 не с временным шагом 0.002 не в силовом поле GROMACS, являющимся модифицированной версией силового поля GROMOS, с периодическими граничными условиями по каждой из трех координат. Как известно, для изучения глобальных изменений в структуре рецептора в течение молекулярной динамики требуются достаточно большие времена (10-20 не). Однако в данной работе основной целью проведения молекулярно-динамических расчетов явлалось уточнение пространственного расположения лигандов внутри лиганд-связывающего центра рецептора, поэтому выбор времени молекулярной динамики t = 1 не представляется оправданным.

Рис. 15. Расположение этильного заместителя NECA внутри сайга связьвания АЗ рецептора

Рис. 16 Расгюлоиени: циклогенг ильного зашггигеля CP А внутри ли-авд связьваощач) центра Al адегеяинового рецептора

Для оценки стабильности систем, полученных после проведения молекулярно-динамических расчетов, для каждой системы был осуществлен расчет общей энергии. Расчет энергии проводился по всей молекулярно-динамической траектории. Результаты показали, что каждая система перешла в стабильное состояние примерно после 400 пс молекулярной динамики. Также была осуществлена оценка изменений в общей структуре исследуемых систем, произошедших за 1 ж молекулярно-динамических расчетов (рис. 11). Для этого было рассчитано среднеквадратичное отклонение (RMSD) атомных координат систем относительно их исходных значений. Было найдено, что в каждом случае значения RMSD составляют около 4 нм. Анализ зависимостей RMSD от времени (рис. И) показал, что каждая система перешла в стабильное состояние после 400 пс, что находится в хорошем соответствии с результатами анализа полной энергии систем и указывает на возможность дальнейшего использования комплексов, полученных после 1 ж молекулярно-динамических расчетов.

Для определения аминокислотных остатков А2Ь рецептора, в пространственном расположении которых произошли наибольшие изменения, для каждого комплекса были рассчитаны среднеквадратичные флуктуации (RMSF) а-углеродных атомов рецептора. Было найдено, что наибольшие значения RMSF соответствуют аминокислотным остаткам, расположенным в гидрофильных петлях рецептора, тогда как значения RMSF, соответствующие трансмембранным а-спиралям, находятся в пределах 0.15 нм. Наибольшие значения RMSF были получены для остатков, находящихся во второй внеклеточной петле, имеющей наибольшую длину. В частности, максимальное значение RMSF = 0.4 нм соответствует Thrl55 комплекса А2Ь рецептора с лигандом 15.

Проведенный анализ полученного после молекулярно-динамического расчета комплекса А2Ь рецептора с теофиллином показал, что лиганд образует водородные связи Asn286 и Тгр247. Кроме того, расстояние между гидроксильной группой Ser92 и карбонильным атомом кислорода лиганда составляет 2.96А, что обуславливает возможность участия данного серинового остатка в образовании водородной связи. Также, согласно полученным результатам, фенильное кольцо Phe243 принимает участие в п-п взаимодействиях с теофиллином.

Анализ найденного после молекулярной динамики механизма связывания DPSPX с А2Ь рецептором показал, что существенных изменений в лиганд-рецепторных взаимодействиях данного лиганда по сравнению с результатами, полученными с помощью молекулярного докинга, не произошло (рис. 12). Было показано, что His251 участвует в образовании водородной связи с сульфогрушюй лиганда, a Asn282 образует водородную связь с карбонильным атомом кислорода в положении 2 ксантинового фрагмента. Кроме того, данный кислородный атом лиганда может участвовать в образовании водородной связи с Asn286. Фенильное кольцо Phe243 также располагается достаточно близко от лиганда и с большой вероятностью может быть вовлечено в П-П взаимодействия. Пропильные заместители в первом и третьем положении ксантинового цикла DPSPX оказались расположенными в окружении Leu49, AIa52, Asp53, IIe93, Leul95, Metl98 и Asn286, а согласно результатам молекулярного докинга именно эти аминокислотные остатки участвуют в гидрофобных взаимодействиях с пропильными группами лиганда.

Результаты молекулярно-динамических расчетов, полученные для комплекса А2Ь рецептора с лигандом 15 (рис. 12) показали, что карбонильный атом кислорода во втором положении ксантинового цикла находится достаточно близко от гидроксильной группы Sei92 и образует с ней водородную связь. Аналогичный результат был получен и с помощью молекулярного докинга. Гидроксильная группа Thr89 с большой вероятностью вовлечена в образование водородной связи с непротонированным атомом азота ксантинового фрагмента. Кроме того, анализ полученной модели показывает, что карбонильная группа Asnl86 взаимодействует с NH-группой амидной части лиганда, а аминогруппа данного аспарагинового остатка образует водородную связь с атомом кислорода бензодиаксольного фрагмента. Также около данного фрагмента лиганда оказались расположены Lys 170 и Phel87. Атом кислорода метоксигруппы в положении 3 пиразольного фрагмента лиганда 15 находится достаточно близко от His251 и может принимать участие в образовании водородной связи с NH-группой имидазольного цикла данного аминокислотного остатка.

Таким образом, проведенный анализ результатов молекулярно-динамических расчетов комплексов А2Ь аденозинового рецептора с тремя структурно различными антагонистами внутри фосфолипидного бислоя подтвердил возможность существования альтернативного механизма связывания лигандов. При этом было показано, что Ser92, Asn282, His251, Phe243 и Тгр247, расположенные в трансмембранной части рецептора, имеют наибольшее значение при связывании лигандов. Кроме того, при реализации данного механизма связывания большое значение имеют аминокислотные остатки, находящиеся во второй, пятой, шестой и седьмой трансмембранных а-спиралях, участвующие в выгодных гидрофобных взаимодействиях с 1,3-алкильными заместителями ксантинового фрагмента.

Пятая глава посвящена изучению лиганд-рецепторных взаимодействий структурно различных агонистов аденозиновых рецепторов (рис. 13). Всего в работе проведен анализ 188 молекулярных лиганд-рецепторных комплексов, полученных для 47 агонистов.

Первоначально для изучения механизмов связывания агонистов, общих для всех исследуемых подтипов аденозиновых рецепторов, и определения наиболее важных для связывания лигандов аминокислотных остатков рецепторов, был осуществлен молекулярный докинг неселективного природного агониста -аденозина. Полученные результаты показали, что механизмы взаимодействия аденозина с каждым из четырех аденозиновых рецепторов практически идентичны. Было найдено, что аминогруппа лиганда образует водородную связь с Asn623. 3'-Гидроксильная группа аденозина взаимодействует с непротонированным атомом азота His7'11, a 2'-гидроксильная группа - с Не''6. Атом кислорода рибозной части лиганда располагается на расстоянии, оптимальном для образования водородной связи с гидроксильной группой Thr311, которая также может взаимодействовать с 5'-гидроксильной группой аденозина (рис. 14). Выявленные лиганд-рецепторные взаимодействия находятся в хорошем соответствии как с известными экспериментальными данными по сайт-

направленному мутагенезу, так и с данными работ, посвященных молекулярному моделированию аденозиновых рецепторов.

Проведенное исследование лиганд-рецепторных взаимодействий 5'-N-алкилкарбоксаимидоаденозинов и 5'-^алкилгиокарбоксаимидоаденозинов (рис. 15) показало, что при связывании данных лигандов все взаимодействия, характерные для аденозина, сохраняются. Кроме того, гидроксильная группа Thr311 образует водородную связь с NH-группой амидной части лигандов, а атом кислорода данной амидной группы взаимодействует либо с Thr277 в случае А1 рецептора, либо с соответствующим сериновым остатком А2а, А2Ь и A3 рецепторов. При этом для тиопроизводных взаимодействие с Thr(Ser)7'10 не наблюдается, что, видимо, является причиной некоторого уменьшения аффинности данных агонистов. Алкильный заместитель лигандов оказался

о 3.14 А 7.13 6.16

расположенным в полости, образованной Ser , Asn и Тгр , присутствующими в каждом подтипе рецепторов. В случае А2Ь рецептора в образовании данной полости также принимает участие Cys246, присутствующий только в А2 рецепторах. Кроме того, в моделях, полученных для Al, A2b и A3 рецепторов, в непосредственной близости от данного заместителя находится Phe6.12, тогда как для А2а рецептора указанный фенилаланиновый остаток оказался расположен несколько дальше от лиганда. Также для А1 и А2 подтипов во взаимодействиях с алкильной группой лиганда принимает участие Leu310, а для A3

рецептора на месте данного лейцина находится фенилаланин. Эта особенность А3 рецептора позволяет объяснить наибольшую аффинность 5'-К метилкарбоксаимидоаденозина (МЕСА) к данному подтипу по сравнению с А1 и А2 рецепторами. В случае А3 рецептора переход от этильного заместителя (КЕСА) к метальному (МЕСА) приводит к уменьшению неблагоприятных взаимодействий между ароматическим кольцом РИе93 и алкильной группой (К,(КВСА) = 10.6 нМ, К1(МЕСА) = 6.4 нМ). Для остальных рецепторов, напротив, уменьшаются выгодные гидрофобные взаимодействия (для А2Ь К,(НВСА)" 2.4 нМ, К,(МВСА) " 45.0 нМ). Найденные пространственные ориентации лигандов внутри лиганд-связывающих центров рецепторов также показали, что в случае А2а и А2Ь подтипов объем полости, в которой находится алкильный заместитель лиганда, оказывается несколько меньше, чем в А1 и А3 рецепторах, что является возможной причиной падения аффинности циклобутилзамещенного производного по отношению к А2 рецепторам.

На следующем этапе работы был осуществлен молекулярный докинг и анализ механизмов связывания К6-алкил-, К6-циклоалкил- и К6-фенилзамещенных производных аденозина и КЕСА. Полученные результаты докинга К6-алкил- и К6-циклоалкилзамещенных производных показали, что заместитель в Л-положении лиганда расположен внутри полости, образованной ТИг311, РИе", Тгр616 и Asn6'23, присутствующими в каждом из четырех подтипов рецепторов (рис. 16). Найденные механизмы взаимодействий аденозиновых рецепторов с агонистами, содержащими К6-фенильный заместитель, показали, что фенильное кольцо лигандов окружено теми же аминокислотными остатками, что и алкильные группы К6алкильных производных. Однако механизмы лиганд-рецепторных взаимодействий лигандов, содержащих функциональные группы, способные к образованию водородных связей, оказались различными для разных подтипов рецепторов. Полученные результаты позволили выявить причины различий в селективности и эффективности связывания ряда К6-замещенных агонистов аденозиновых рецепторов с каждым из четырех подтипов. В частности, полученные результаты позволяют объяснить более чем четырехсоткратное различие в константах связывания Я-Р1А - одного из селективных лигандов А1 рецептора - с А1 и А2а рецепторами.

Изучение механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий К6-норборнен-, К6-нор6орнил- и К6-эпоксинорборнилзамещенных производных аденозина, предложенных в качестве эффективных агонистов А1 рецептора, (рис. 17) показало, что каркасный заместитель лигандов расположен между ТИг91, Gln92, РИе185, VaU89, Тгр247, Ьеи250 и Нв251 А1 рецептора. При этом конфигурация полости, образованной этими аминокислотными остатками, такова, что никаких неблагоприятных контактов между рецептором и каркасной группой лигандов не наблюдается. Кроме того, атом кислорода эпоксинорборнильной группы располагается около Нв251 и образует с ним водородную связь.

В отличие от этого модели, полученные для А2а рецептора, позволяют сделать вывод, что пространственное расположение каркасного фрагмента в данном рецепторе значительно отличается от установленного для А1. Если в случае А1 рецептора, двойная связь норборненового фрагмента ориентирована в сторону Ьеи250 и His251, то для А2а рецептора такое расположение невозможно

из-за стерических затруднений. То есть в этом случае, двойная связь лиганда перекрывалась бы с указанными аминокислотными остатками. Поэтому каркасные группы лигандов в А2а рецепторе оказываются ориентированы в противоположную сторону, а именно в сторону 01и163 и Лsnl81. При этом, согласно полученным моделям, около атома кислорода эпоксинорборнильной группы находится аминогруппа Asnl81, но расстояние между ними составляет 3.7А и образование водородной связи между лигандом и Asnl81 неочевидно. Эти результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными и позволяют понять причины проявления большей аффинности лигандов по отношению к А1 рецептору, чем к А2а.

Проведенный анализ механизмов связывания 2-замещенных аналогов аденозина и NECA с каждым из четырех подтипов аденозиновых рецепторов показал, что заместитель в положении 2 лигандов расположен в полости, образованной рядом аминокислотных остатков рецепторов, находящихся не только в трансмембранных спиралях, но также и в первой и второй внеклеточных гидрофильных петлях. Согласно моделям, полученным для каждого подтипа рецепторов, в непосредственной близости от алкинильного заместителя лигандов оказались расположены оба цистеиновых остатка, образующих дисульфидную связь в рецепторах. При этом цистеин, находящийся во второй внеклеточной петле, может участвовать в образовании водородной связи с гидроксильной группой гидроксипропинильных производных. Анализ результатов, полученных для тиазолильного производного 29, показал, что водородных связей между рецепторами и тиазолильной группой лиганда не образуется. Наиболее выгодное расположение данной группы лиганда внутри лиганд-связывающего центра было установлено для А2Ь и Л3 подтипов. В случае А1 рецептора около двойной связи тиазолильной группы находится Asnl48, что приводит к определенным неблагоприятным взаимодействиям. Согласно модели, полученной для А2а рецептора, расположение тиазолильной группы внутри лиганд-связывающего центра данного рецептора оказывается наименее выгодным, по сравнению с другими подтипами рецепторов (рис. 18). Эти результаты находятся в хорошем соответствии с экспериментальными данными.

При изучении лиганд-рецепторных взаимодействий агонистов, содержащих гидроксипропинильный заместитель, было уделено особое внимание различиям в механизмах связывания оптических изомеров данных лигандов. Результаты молекулярного докинга PHPNECA в А1 рецептор показали, что дополнительных водородных связей между рецептором и гидроксильной группой фенилгидроксипропинильного заместителя не образуется ни с (Я)-, ни с (8)-изомером лиганда. Однако и неблагоприятных лиганд-рецепторных взаимодействий также не наблюдается. Данный механизм связывания PHPNECA с А1 рецептором позволяет объяснить практически идентичную активность двух изомеров. Механизмы связывания PHPNECA, полученные для А2 и Л3 рецепторов, показали, что гидроксильная группа (8)-

фенилгидроксипропинильного заместителя образует водородную связь с цистеиновым остатком, находящимся во второй внеклеточной петле рецепторов и образующим дисульфидную связь. В отличие от этого, при взаимодействии (Я)-PHPNECA с А2а, А2Ь и Л3 рецепторами данная гидроксильная1 группа

оказывается окруженной гидрофобными аминокислотными остатками (рис. 19), что приводит к нежелательным лиганд-рецепторным взаимодействиям и ухудшению константы связывания. Полученные результаты докинга (Я)- и изомеров 2-(4-гидрокси-1-пентинил)-замещенных производных позволяют сделать вывод, что для данных лигандов более активными являются ^)-изомеры (экспериментально определены константы связывания только для смеси изомеров).

Шестая глава посвящена компьютерному дизайну новых потенциальных агонистов аденозиновых рецепторов с. модифицированным адениновым фрагментом. К предлагаемым в работе лигандам предъявлялся ряд необходимых требований. А именно, механизм связывания потенциального лиганда должен соответствовать общему механизму связывания известных агонистов, прежде всего, лиганд должен образовывать необходимые водородные связи с рецептором. Во-вторых, модифицируемый адениновый фрагмент должен сохранять плоскую структуру, что необходимо для нахождения аминогруппы и рибозной части агонистов в строго определенном положении. На сегодняшний день высокоэффективных и селективных агонистов А2Ь подтипа не найдено и поиск таких лигандов является актуальнейшей проблемой химии аденозиновых рецепторов. По этой причине в качестве "структуры-лидера" был выбран PHPNECA, являющийся одним из наиболее эффективных и селективных агонистов А2Ь рецептора, а в качестве "начального лиганд-рецепторного комплекса" был использован молекулярный комплекс А2Ь - (S)-PHPNECA. Такой выбор является оправданным с точки зрения установленного общего механизма лиганд-рецепторных взаимодействий известных агонистов аденозиновых рецепторов с каждым из четырех подтипов, поскольку в каждом подтипе аденозиновый фрагмент лигандов располагается в лиганд-связывающем центре практически идентично. Также очевидно, что при замене 5'-Ы-этилкарбоксамидного заместителя на гидроксиметильную группу или другой известный заместитель в данном положении, а также при отсутствии 2-фенилгидроксипропинильного заместителя агонистическое действие лиганда сохранится. С другой стороны, наличие указанных заместителей увеличивает вероятность получения наиболее эффективного агониста А2Ь рецептора.

Первоначально был проведен анализ возможных модификаций аденинового цикла агонистов и выявлена возможность замены атома азота в положении 3 на СН-группу. Такая замена с одной стороны позволяет сохранить ароматичность модифицируемого фрагмента, а с другой стороны может привести к увеличению селективности связывания агонистов с А1, А2а и А3 рецепторами по сравнению с А2Ь подтипом. Было показано, что в данном положении аденинового цикла может находиться как незамещенная СН-группа, так и замещенная на атом галогена (рис. 20). Также был проведен анализ механизмов связывания лигандов, содержащих дополнительное бензольное кольцо, сопряженное с атомами в седьмом и восьмом положениях аденинового цикла (рис. 21). При этом атом азота в положении 7 был заменен на углеродный атом. Таким образом были найдены новые лиганды с потенциальной агонистической активностью, содержащие вместо пуринового цикла трициклический у-карболиновый фрагмент. Согласно полученным

молекулярным комплексам данных соединений с аденозиновыми рецепторами, карболиновый цикл является оптимальным для расположения внутри гидрофобного кармана и не вызывает неблагоприятных взаимодействий с гидрофильными группами аминокислотных остатков.

Рис. 21. Примеры структур предложенных потенциальных агонистов аденозиновых рецепторов.

Наличие небольших гидрофильных групп в восьмом положении карболинового фрагмента также представляется выгодным. Было показано, что гидроксильная группа или аминогруппа в положении 8 могут участвовать в образовании водородных связей с сериновым и треониновым аминокислотными остатками рецепторов. Также введение карбонильной группы в восьмое положение является перспективной модификацией лиганда, и карбонильный атом кислорода оказывается расположенным около гидрофильных групп рецептора. При этом для сохранения плоской структуры карболинового фрагмента СН-группа в положении 5 должна быть заменена на КЫ-группу (рис. 21).

Поиск потенциальных агонистов с сопряженным гетероциклическим фрагментом при 1-6 и 6-5 положениях пуринового цикла показал, что одной из перспективных модификаций известных агонистов может являться введение пиразольного фрагмента в пуриновый цикл. При этом атом азота в первом положении пуринового цикла был заменен на углеродный атом; полученная таким образом связь С6=С1 находится в сопряжении со связью С4=С5 пиразольного фрагмента. Несколько менее выгодным, но потенциально возможным, представляется введение неароматического пятичленного цикла, содержащего КЫ-группы в первом и третьем положениях. Также для данных лигандов была проанализирована возможность замены атома азота, соответствующего атому азота в положении 7 пуринового фрагмента, на СН-группу, и введение в данное положение небольших алкильных групп и атомов галогенов (рис. 21). Полученные результаты показали, что такие модификации возможны, хотя и не приводят к заметному улучшению связывания лигандов.

Анализ конфигурации лиганд-связывающих центров аденозиновых рецепторов также позволяет предположить, что потенциальной агонистической

активностью могут обладать структуры, содержащие дополнительный циклический фрагмент, образованный атомами углерода в пятом и шестом положениях пуринового цикла, углеродным атомом, находящимся на месте N7, атомом азота аминогруппы агонистов и дополнительной аминогруппой в седьмом положении. При этом атомы водорода обеих аминогрупп данного циклического фрагмента оказываются расположенными вблизи карбонильной группы Asn623 и могут участвовать в образовании водородных связей. Однако более выгодным представляется замещение атома водорода введенной аминогруппы на метильную группу, что приводит к возникновению дополнительных гидрофобных взаимодействий с Тгр616 и Leu / Val61'.

С целью получения потенциальных агонистов, селективных по отношению к А2Ь рецептору, были проанализированы возможности модификаций фенильного цикла (S)-PHPNECA. Было найдено что введение заместителей любой природы в положения 3, 4 и 6 является нежелательным. Напротив, введение в положение 2 фенильного цикла гидроксиметильной группы или метиламинного заместителя является эффективной модификацией, приводящей к увеличению гидрофобных взаимодействий, а также, что более существенно, к образованию дополнительной водородной связи с карбонильной группой Cys78 A2b рецептора. Молекулярный докинг таким образом модифицированных структур в А1, А2а и A3 рецепторы показал, что проведенные модификации не являются выгодными ни для одного из этих подтипов рецепторов, а наоборот заметно затрудняют связывание лиганда из-за недостаточного свободного пространства внутри лиганд-связывающего центра. Введение заместителей в положение 5 также представляется достаточно перспективным направлением для поиска агонистов А2Ь подтипа рецепторов. Анализ конфигурации аминокислотного окружения фенильного цикла лиганда в модели А2Ь рецептора показал, что около пятого положения данного цикла расположен достаточно объемный гидрофобный карман, образованный Leu81, Val85, Serl65, IIe276, Leu277 и His280. С помощью молекулярного докинга было найдено, что свободное пространство внутри гидрофобного кармана позволяет ввести в положение 5 фенильного цикла лиганда метильную, этильную, пропильную, изопропильную и циклопентильную группы (рис. 22).

Таким образом, в результате проведенных расчетов был предложен ряд новых потенциальных агонистов аденозиновых рецепторов, не содержащих адениновый фрагмент, присутствующий во всех известных на сегодняшний день агонистах. Кроме того, проведенный анализ механизма связывания и ближайшего аминокислотного окружения (S)-PHPNECA позволил предложить пути поиска новых агонистов, селективных по отношению к А2Ь аденозиновому рецептору.

Для количественной оценки активностей предложенных потенциальных агонистов для каждого полученного лиганд-рецепторного комплекса были рассчитаны значения оценочных функций CSCORE комплекса Sybyl 6.' и проведено их сопоставление со значениями, полученными для известных агонистов А2Ь аденозинового рецептора. С использованием данных оценочных функций была построена множественная линейно-регрессионная модель для значений pKi известных агонистов А2Ь рецептора. Полученная зависимость описывается уравнением: pKi = -1,12635 - 0,02210*G_Score - 0,04'73*PMF_Score + 0,00414*D_Score + 0,02853*ChemScore (R = 0.6345, s = 0.4355).

Данная регрессионная модель представляется полезной с точки зрения оценки порядка значений Kj, что в свою очередь позволяет уменьшить число заведомо неактивных соединений. Значения оценочных функций, рассчитанные для потенциальных агонистов, хорошо согласуются со значениями, полученными для известных лигандов, а значения Ki предложенных структур, рассчитанные с помощью регрессионной модели, лежат в диапазоне от 0.21 до 23.59 нМ, что вместе с установленными механизмами лиганд-рецепторных взаимодействий позволяет ожидать проявление определенной активности сконструированных агонистов аденозиновых рецепторов.

Выводы.

1. С помощью метода моделирования по гомологии впервые построены полные пространственные модели каждого из четырех известных на сегодняшний день подтипов аденозиновых рецепторов человека, содержащие как трансмембранные а-спирали, так и все внеклеточные и внутриклеточные гидрофильные петли, а также концевые участки рецепторов.

2. С использованием компьютерного молекулярного докинга исследованы лиганд-рецепторные взаимодействия для серии известных антагонистов аденозиновых рецепторов, определены аминокислотные остатки рецепторов, участвующие в связывании антагонистов и выявлены особенности взаимодействий антагонистов с каждьм из четырех подтипов рецепторов.

3. Для некоторых антагонистов аденозиновых рецепторов установлена возможность существования альтернативного механизма связывания, что подтверждено результатами молекулярно-динамических расчетов лиганд-рецепторных комплексов А2Ь рецептора в фосфолипидном бислое.

4. С помощью молекулярного докинга серии структурно различных производных аденозина детально изучены механизмы и особенности связывания агонистов с каждым подтипом аденозиновых рецепторов, найдены причины различий в селективности и эффективности связывания различных агонистов, в том числе оптических изомеров.

5. На основе результатов молекулярного моделирования аденозиновых рецепторов и докинга известных агонистов предложены пути поиска новых потенциальных агонистов аденозиновых рецепторов, не являющихся аналогами аденозина. Сконструирован ряд структур потенциальных селективных агонистов А2Ь аденозинового рецептора.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Иванов А.А., Баскин И.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Молекулярное моделирование А1 аденозинового рецептора человека и изучение механизмов связывания его селективных лигандов. // ДАН. 2002. Т. 386. № 4. С. 548-551.

2. Ivanov A.A., Baskin I.I., Palyulin V.A., Baraldi P.G., Zeflrov N.S. Molecular modelling of the human A2b adenosine receptor and an analysis of the binding modes of its selective ligands. // Mendeleev Commun. 2002. V. 6. P. 211-212.

3. Иванов А.А., Баскин И.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Молекулярное моделирование аденозиновых рецепторов. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2002. Т. 43. № 4. С. 231-236.

4. Иванов А.А., Баскин И.И., Палюлин В.А, Зефиров Н.С. Построение молекулярной модели А2а-аденозинового рецептора человека. // ДАН. 2003. Т. 389. №3. С. 404-407.

5. Ivanov AA., Baskin I.I., Palyulin V.A, Baraldi P.G., Zefirov N.S. Molecular modeling and molecular dynamics simulation ofthe human A2b adenosine receptor in the phospholipid bilayer. // Book of abstracts of Meeting "Medicinal Chemistry and Pharmacology of Purinergic Receptors". Camerino. Italy. September 11-13 2003. P. 62.

6. Ivanov AA, Baskin I.I., Palyulin V.A., Baraldi P.G., Zefirov N.S. Molecular modeling of the human A2b adenosine receptor. The investigation of the ligand-receptor interactions. // Book of abstracts of Polish-Austrian-German-Hungariain-Italian Joint Meeting on Medicinal Chemistry. Krakow. Poland. October 15-18. 2003. P. 78.

7. Иванов АА., Баскин И.И., Палюлин В.А, Зефиров Н.С. Молекулярное моделирование аденозиновых рецепторов и докинг лигандов. // Сборник тезисов докладов IX Всероссийского национального конгресса "Человек и лекарство". 8-12 апреля 2002. Москва. С. 619.

8. Иванов АА., Баскин И.И., Палюлин В.А, Зефиров Н.С. Изучение комплексов аденозиновых рецепторов с их лигандами методом молекулярной динамики. // Сборник тезисов докладов X Всероссийского национального конгресса "Человек и лекарство". 7-11 апреля 2003. Москва. С. 717.

9. Иванов АА, Баскин И.И., Палюлин В.А, Зефиров Н.С. Сравнительный анализ структуры аденозиновых рецепторов и механизмов связывания их лигандов. // Сборник тезисов докладов III Российской конференции "Молекулярное моделирование". 15-17 апреля 2003. Москва. С. 70.

Подписано в печать 15.09.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 пл. Тираж 110 экз. Заказ № 134 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

Р17366

РНБ Русский фонд

2005-4 16025

 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Иванов, Андрей Андреевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Классификация и структура G-белок сопряженных рецепторов.

1.2 Аденозиновые рецепторы.1 О

1.2.1 Классификация аденозиновых рецепторов.1 О

1.2.2 Лиганды аденозиновых рецепторов.

1.2.2.1 Селективные лиганды А1 рецепторов.

1.2.2.2 Селективные лиганды А2а рецепторов.

1.2.2.3 Лиганды А2Ь рецепторов.

1.2.2.4 Селективные лиганды A3 рецепторов.

1.3 Моделирование G-белок сопряженных рецепторов.

1.4 Лиганд-рецепторные взаимодействия аденозиновых рецепторов.

ГЛАВА 2. ПОСТРОЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МОДЕЛЕЙ АДЕНОЗИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ.

2.1 Пути компьютерного исследования лиганд-рецепторных взаимодействий.

2.2 Построение молекулярных моделей аденозиновых рецепторов.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ СВЯЗЫВАНИЯ АНТАГОНИСТОВ АДЕНОЗИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ.5 О

3.1 Выбор метода молекулярного докинга.5 О

3.2 Механизмы связывания ксантиновых производных.

3.2.1 Докинг 8-незамещенных 1,3-диалкилксантинов.

3.2.2 Докинг 1,3-диалкил-8-циклопентил- и 8-фенилксантинов.

3.2.3 Докинг антагонистов с сукцинимидными, малимидными и пара-замещенными фениламидными заместителями.

3.3 Механизмы связывания 8-пиразол-, 8-изоксазол- и

8-аминофенилзамещенных ксантиновых производных с

А2Ь аденозиновым рецептором.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО - ДИНАМИЧЕСКИЕ РАСЧЕТЫ КОМПЛЕКСОВ А2Ь АДЕНОЗИНОВОГО РЕЦЕПТОРА С АНТАГОНИСТАМИ.

4.1 Подготовка молекулярных комплексов и условия проведения молекулярно-динамических расчетов.

4.2 Анализ результатов молекулярно-динамических расчетов.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ АГОНИСТОВ АДЕНОЗИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ.

5.1 Докинг аденозина.

5.2 Докинг 5'-М-алкилкарбоксамидоаденозинов.

5.3 Докинг N -алкил-, N6 -циклоалкил- и К^-фенилзамещенных производных аденозина и NEC А.

5.4 Докинг К^-норборнен-, Г^-норборнил- и 1ч[6-эпоксинорборнилзамещенных производных аденозина.

5.5 Докинг 2-замещенных производных аденозина и NECA.

ГЛАВА 6. КОМПЬЮТЕРНЫЙ ДИЗАЙН НОВЫХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АГОНИСТОВ АДЕНОЗИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ.

6.1 Выбор метода и общие пути поиска новых потенциальных агонистов.

6.2 Анализ возможных модификаций аденинового цикла.

6.3 Карболиновые производные.

6.4 Потенциальные агонисты с сопряженным гетероциклическим фрагментом при 1-6 и 6-5 положениях пуринового цикла.

6.5 Модификации фенильного цикла 2-фенилгидроксипропинильного фрагмента (S)-PHPNECA как способ получения потенциальных агонистов, селективных по отношению к А2Ь рецептору.

6.6 Оценка активностей предложенных потенциальных агонистов.

 
Введение диссертация по химии, на тему "Молекулярное моделирование строения аденозиновых рецепторов и компьютерный дизайн их потенциальных лигандов"

Аденозиновые рецепторы широко представлены в большинстве типов тканей и клеток животных и человека и участвуют в огромном количестве различных физиологических процессов. Как агонисты, так и антагонисты аденозиновых рецепторов находят широкое применение в фармакологии и медицине в качестве лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний.

Экспериментальные данные о воздействии лигандов на аденозиновые рецепторы достаточно обширны, но до сих пор отсутствуют экспериментальные данные о пространственном строении этих рецепторов, что существенным образом затрудняет задачу изучения механизмов лиганд-рецепторного взаимодействия и разработку новых более эффективных препаратов. На сегодняшний день известно лишь, что аденозиновые рецепторы содержат трансмембранный домен, образованный семью а-спиралями, соединенными гидрофильными петлями. Сайт связывания агонистов и антагонистов локализован внутри трансмембранного домена и образован примерно одинаковым набором аминокислотных остатков. Также неясными остаются причины селективного связывания лигандов с тем или иным подтипом рецепторов.

Аденозиновые рецепторы, как и другие рецепторы, сопряженные с G-белками, представляют собой мембранные белки, плохо поддающиеся кристаллизации и изучению методом рентгеноструктурного анализа. Поэтому на первый план выступает молекулярное моделирование пространственных структур этих белков. Кроме того, именно методы молекулярного моделирования дают возможность определить наиболее перспективные модификации существующих лигандов, что оказывается крайне важным при поиске и синтезе новых биологически активных соединений с заданными свойствами.

Работы по молекулярному моделированию аденозиновых рецепторов проводятся относительно недавно (около десяти лет) и к настоящему моменту не существует ни одной молекулярной модели данных рецепторов, в которой кроме трансмембранного домена были бы смоделированы все гидрофильные петли, влияющие на общую геометрию рецептора, участвующие в передаче сигнала от рецептора к G-белку и способные принимать участие в связывании агонистов и антагонистов аденозиновых рецепторов.

Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что изучение аденозиновых рецепторов в настоящее время представляется весьма важной и актуальной проблемой.

Данная работа посвящена построению пространственных молекулярных моделей каждого из четырех известных на сегодняшний день подтипов аденозиновых рецепторов человека, включающих в себя не только а-спирали, но и гидрофильные петли, изучению механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий агонистов и антагонистов данных рецепторов, определению причин селективного связывания лигандов, а также компьютерному конструированию новых потенциальных лигандов аденозиновых рецепторов.

 
Заключение диссертации по теме "Органическая химия"

выводы

1. С помощью метода моделирования по гомологии впервые построены полные пространственные модели каждого из четырех известных на сегодняшний день подтипов аденозиновых рецепторов человека, содержащие как трансмембранные а-спирали, так и все внеклеточные и внутриклеточные гидрофильные петли, а также концевые участки рецепторов.

2. С использованием компьютерного молекулярного докинга исследованы лиганд-рецепторные взаимодействия для серии известных антагонистов аденозиновых рецепторов, определены аминокислотные остатки рецепторов, участвующие в связывании антагонистов и выявлены особенности взаимодействий антагонистов с каждым из четырех подтипов рецепторов.

3. Для некоторых антагонистов аденозиновых рецепторов установлена возможность существования альтернативного механизма связывания, что подтверждено результатами молекулярно-динамических расчетов лиганд-рецепторных комплексов А2Ь рецептора в фосфолипидном бислое.

4. С помощью молекулярного докинга серии структурно различных производных аденозина детально изучены механизмы и особенности связывания агонистов с каждым подтипом аденозиновых рецепторов, найдены причины различий в селективности и эффективности связывания различных агонистов, в том числе оптических изомеров.

5. На основе результатов молекулярного моделирования аденозиновых рецепторов и докинга известных агонистов предложены пути поиска новых потенциальных агонистов аденозиновых рецепторов, не являющихся аналогами аденозина. Сконструирован ряд структур потенциальных селективных агонистов А2Ь аденозинового рецептора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате выполненной работы с помощью методов молекулярного моделирования впервые построены полные молекулярные модели всех четырех подтипов аденозиновых рецепторов человека, содержащие как трансмембранные а-спирали, так и все гидрофильные петли и концевые части. Полученные молекулярные модели позволяют не только представить общее строение аденозиновых рецепторов, но и выявить важные особенности, характерные для каждого подтипа. С помощью молекулярного докинга известных антагонистов аденозиновых рецепторов были изучены лиганд-рецепторные взаимодействия и выявлены аминокислотные остатки, имеющие наибольшее значение для эффективного связывания антагонистов с каждым подтипом рецепторов. Кроме того, была показана возможность существования альтернативного механизма связывания антагонистов, что было подтверждено результатами молекулярно-динамических расчетов лиганд-рецепторных комплексов А2Ь рецептора в фосфолипидном бислое. Отметим, что ранее таких расчетов для аденозиновых рецепторов не проводилось. Осуществленный молекулярный докинг известных агонистов аденозиновых рецепторов — аналогов аденозина с различными заместителями в адениновом и рибозном фрагменте - позволил детально описать механизмы связывания и особенности лиганд-рецепторных взаимодействий для каждого подтипа рецепторов. На основании полученных молекулярных моделей впервые были сделаны выводы о причинах селективности и эффективности различных агонистов, в том числе оптических изомеров. Используя полученные модели и предложенные механизмы лиганд-рецепторных взаимодействий был сконструирован ряд новых потенциальных агонистов аденозиновых рецепторов, не являющихся аденозиновыми производными, и предложены пути поиска селективных агонистов А2Ь рецептора, что является одной из актуальнейших проблем современной химии аденозиновых рецепторов.

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Иванов, Андрей Андреевич, Москва

1. Gether U. Uncovering molecular mechanism involved in activation of G protein-coupled receptors. // Endocrine. Rev. 2000. - V. 21. - P. 90-113.

2. Hamm H.E. How activated receptors couple to G proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. - V. 98. - P. 4819-4821.

3. Lefkowitz R.J. G protein coupled receptors. Ill New roles for receptor kinases and P-arrestins in receptor signaling and desensitization. // J. Biol. Chem. 1998. -V. 273.-P. 18677-18680.

4. Hamm H.E. The many faces of G protein signaling. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273.-P. 669-672.

5. Flower D.R. Modelling G-protein-coupled receptors for drug design. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. -V. 1422. - P. 207-234.

6. Mark M.D., Herlitze S. G-protein mediated gating of inward-rectifier K+ channels. // Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267. - P. 5830-5836.

7. Dascal N. Ion-channel regulation by G proteins. // Trends Endocrinol. Metabol. -2001.-V. 12.- P. 391-398.

8. Bockaert J., Pin J.P. Moulecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolutionary success. // EMBO J. 1999. - V. 18. - P. 1723-1729.

9. Sakmar T.P. Structure of rhodopsin and the superfamily of seven-helical receptors: the same and not the same. // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. — V. 14. -P. 189-195.

10. Stiles G.L. Adenosine receptors. // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 64516454.

11. Pin J.P., Bockaert J. Get receptive to metabotropic glutamate receptors. // Curr. Opin. Neurobiol. 1995. - V. 5. - P. 342-349.

12. Unger V.M., Hargrave P.A., Baldwin J.M., Schertler G.F. Arrangement of rhodopsin transmembrane alpha-helices. // Nature. 1997. — V. 389. — P. 203-206.

13. Mizobe Т., Maze M., Lam V., Suryanarayana S., Kobilka B.K. Arrangement of transmembrane domains in adrenergic receptors. Similarity to bacteriorhodopsin. //J. Biol. Chem. 1995.-V. 271.-P. 2387-2389.

14. Scholl D.J., Wells J.N. Serine and alanine mutagenesis of the nine native cysteine residues of the human A1 adenosine receptor. // Biochem. Pharmacol. — 2000. -V. 60.-P. 1647-1654.

15. Liu J., Schoneberg Т., van Rhee M., Wess J. Mutational analysis of the relative orientation of transmembrane helices I and VII in G protein-coupled receptors. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 19532-19539.

16. Probst W.C., Snyder L.A., Schuster D.I., Brosius J., Sealfon S.C. Sequence alignment of the G-protein coupled receptor superfamily. // DNA Cell Biol. -1992.-V. 11.-P. 1-20.

17. Fredholm B.B., IJzerman A.P., Jacobson K.A., Klotz K.N., Linden J. International union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of adenosine receptors. // Pharmacol. Rev. 2001. - V. 53. - P. 527-552.

18. Fredholm B.B., Abbracchio M.P., Burnstock G., Dubyak G.R., Harden Т.К., Jacobson K.A., Schwabe U., Williams M. Towards a revised nomenclature for PI and P2 receptors. // TiPS. 1997. - V. 18. - P. 79-82.

19. Ralevic V., Burnstock G. Receptors for purines and pyrimidines. // Pharmacol. Rev. 1998. - V. 50. - P. 413-492.

20. De Gubareff Т., Sleator W.J. Effects of caffeine on mammalian atrial muscle, and its interaction with adenosine and calcium. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1965. -V. 148.-P. 202-214.

21. Sattin A., Rail T.W. The effect of adenosine and adenine nucleotides on the cyclic adenosine 3', 5'-phosphate content of guinea pig cerebral cortex slices. // Mol. Pharmacol. 1970. - V. 6. - P. 13-23.

22. Dubyak G.R. Signal transduction by P2-purinergic receptors for extracellular ATP. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991. - V. 4. - P. 295-300.

23. Benham C.D., Tsien R.W. A novel receptor-operated Ca2+-permeable channel activated by ATP in smooth muscle. // Nature. 1987. - V. 238. - P. 275-278.

24. Jiang Q., Guo D., Lee B.X., van Rhee M., Kim Y.C., Nicholas R.A., Schachter J.B., Harden Т.К., Jacobson K.A. A mutational analysis of residues essential for ligand recognition at the human P2Y1 receptor. // Mol. Pharmacol. 1997. - V. 52.-P. 499-507.

25. Jockers R., binder M.E., Hoehnegger M., Nanoff C., Bertin В., Strosberg A.D., Marullo S., Freissmuth M. Species difference in the G protein selectivity of the human and bovine A1-adenosine receptor. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 32077-32084.

26. Palmer T.M., Gettys T.W., Stiles G.L. Differential interaction with and regulation of multiple G-proteins by the rat A3 adenosine receptor. // J. Biol. Chem. 1995. -V.270.-P. 16895-16902.

27. Kull В., Svenningsson P., Fredholm B.B. Adenosine A(2A) receptors are colocalized with and activate G0if in rat striatum. // Mol. Pharmacol. 2000. - V. 58.-P. 771-777.

28. Bruns R.F., Lu G.H., Pugsley T.A. Characterization of the A2 adenosine receptor labeled by 3H.NECA in rat striatal membranes. // Mol. Pharmacol. 1986. - V. 29.-P. 331-346.

29. Випетапп M., Pott L. Down-regulation of A1 adenosine receptors coupled to muscarinic K+ current in cultured guinea-pig atrial myocytes. // J. Physiol. 1995. -V. 482.-P. 81-92.

30. Franco R., Ferre S., Agnati L., Torvinen M., Gines S., Hillion J., Casado V., Lledo P.M., Zoli M., Lluis C., Fuxe K. Evidence for adenosine/dopamine receptor interactions for heteromerization. // Neuropsychoparmacol. 2000. — V. 23. — P. S50-S59.

31. Lasley R.D., Narayan P., Jahania M.S., Partin E.L., Kraft K.R., Mentzer R.M. Species-dependent hemodynamic effects of adenosine A3-receptor agonists IB-MECA and Cl-IB-MECA. //Am. J. Physiol. 1999. - V. 276. - P. H2076-H2084.

32. Cunha R.A. Adenosine as a neuromodulator and as a homeostatic regulator in the nervous system: different roles, different sources and different receptors. // Neurochem. International. 2001. - V. 38. - P. 107-125.

33. Smits G.J., McVey M., Cox B.F., Perron M.H., Clark K.L. Cardioprotective effects of the novel adenosine A1/A2 receptor agonist AMP 579 in a porcine model of myocardial infarction. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998. - V. 286. - P. 611-618.

34. Monopoli A., Casati C., Lozza G., Forlani A., Ongini E. Cardiovascular pharmacology of the A2a adenosine receptor antagonist, SCH 58261, in the rat. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998. - V. 285. - P. 9-15.

35. Dunwiddie T.V., Diao L. Regulation of extracellular adenosine in rat hippocampal slices is temperature dependent: role of adenosine transporters. // Neuroscience. -2000. V. 95. -P. 81-88.

36. Rimondini R., Ferre S., Ogren S.O., Fuxe K. Adenosine A2A agonists: a potential new type of atypical antipsychotic. // Neuropsychopharmacology. 1997. — V. 17. -P. 82-91.

37. Schulte G., Fredholm B.B., Human adenosine Al, A2a, A2b and A3 receptors expressed in Chinese hamster ovary cells all mediate the phosphorylation of extracellular-regulated kinase 1/2. // Mol. Pharmacol. 2000. - V. 58. - P. 477482.

38. Ramkumar V., Stiles G.K., Beaven M.A., АН H. The A3 adenosine receptor is the unique adenosine receptor which facilitates release of allergic mediators in mast cells. // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 16887-16890.

39. Stehle J.H., Rivkees S.A., Lee J.J., Weaver D.R., Deeds J.D., Reppert S.M. Molecular cloning and expression of the cDNA for a novel A2-adenosine receptor subtype. // Mol. Endocriol. 1992. - V. 6. - P. 384-390.

40. Koltz K.N. Adenosine receptors and their ligands. // Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 2000. - V. 362. - P. 382-391.

41. Williams M. Adenosine antagonists. // Med. Res. Rev. 1989. - V. 9. - P. 219243.

42. Poulsen S.A., Quinn R.J. Adenosine receptors: new opportunites for future drugs. // Bioorg. Med. Chem. 1998. -V. 6. - P. 619-641.

43. Martin P.L. Relative agonist potencies of C2-substituted analogues of adenosine: evidence for adenosine A2B receptors in the guinea pig aorta. // Eur. J. Pharmacol. 1992. - V, 216. - P. 235-242.

44. Prentice D.J., Hourani S.M.O. Activation of multiple sites by adenosine analogues in the rat isolated aorta. // Br. J. Pharmacol. 1996. - V. 118. - P. 1509-1517.

45. Prentice D.J., Shankley N.P., Black J.W. Pharmacological analysis of the interaction between purinoceptor agonists and antagonists in the guinea-pig taenia caecum. // Br. J. Pharmacol. 1995. - V. 115. - P. 549-556.

46. Biagi G., Giorgi I., Leonardi M., Livi O., Pacchini F., Scartoni V., Costa В., Lucacchini A. New N6- or N(9)-hydroxyalkyl substituted 8-azaadenines oradenines as effective A1 adenosine receptor ligands. // Eur. J. Med. Chem. — 2003. -V.38.-P. 801-810.

47. Fhid O., Pawlowski M., Jurczyk S., Mtiller C.E., Schumacher B. Pyrimidin-8-on2,l-f.theophylline-9-alkylcarboxylic acids amides as A1 and A2A adenosine receptor ligands. // Farmaco. 2003. - V. 58. - P. 439-444.

48. Francis J.E., Cash W.D., Psychoyos S., Ghai G., Wenk P., Friedmann R.C., Atkins C., Warren V., Furness P., Hyun J.L., Stone G.A., Desai M., Williams M.

49. Structure-activity profile of a series of novel triazoloquinazoline adenosine antagonists. // J. Med. Chem. 1988. - V. 31. - P. 1014-1020.

50. Trivedi B.K., Bruns R.F. l,2,4.Triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-amines: a new class of A1 receptor selective adenosine antagonists. // J. Med. Chem. 1988. - V. 31. -P. 1011-1014.

51. Van Galen P.J.M., Nissen P., Van Wijngaarden I., IJzerman A.P., Soudin W. 'H-imidazo4,5-c.quinolin-4-amines: novel non-xanthine adenosine antagonists. // J. Med. Chem. 1991. - V. 34. - P. 1202-1206.

52. Jacobson K.A., van Galen P.J.M., Williams M. Adenosine receptors: pharmacology, structure-activity relationships, and therapeutic potential. // J. Med. Chem. 1992. - V. 35. - P. 407-422.

53. Dionisotti S., Ongini E., Zocchi C., Kull В., Arslan G., Fredholm B.B. Characterization of human A2A adenosine receptors with the antagonist radioligand 3H.-SCH 58261. // Br. J. Pharmacol. 1997. - V. 121. - P. 353-360.

54. Ramkumar V., Olah M.E., Jacobson K.A., Stiles G.L. Distinct pathways of desensitization of Al- and A2-adenosine receptors in DDT1 MF-2 cells. // Mol. Pharmacol. 1991. -V. 40. - P. 639-647.

55. Jacobson K.A., Stiles G.L., Ji X.D. Chemical modification and irreversible inhibition of striatal A2a adenosine receptors. // Mol. Pharmacol. 1992. - V. 42. -P. 123-133.

56. Alexander S.P., Losinski A., Kendall D.A., Hill S.J. A comparison of A2 adenosine receptor-induced cyclic AMP generation in cerebral cortex and relaxation of pre-contracted aorta. // Br. J. Pharmacol. 1994. - V. 111. - P. 185190.

57. Shimada J., Suzuki, F., Nonaka H., Ishii A., Ichikawa S. (E)-l,3-dialkyl-7-methyl -8-(3,4,5-trimethoxystyryl)xanthines: potent and selective adenosine A2a antagonists. // J. Med. Chem. 1992. - V. 35. - P. 2342-2345.

58. Kim Y.C., Ji X., Jacobson K.A. Derivatives of the triazolquinozaline adenosine antagonist (CGS 15943) are selective for the human A3 receptor subtype. // J. Med. Chem. 1996. - V. 39. - P. 4142-4148.

59. Baraldi P.G., Cacciari В., Spalluto G., Pineda M.J., Zocchi C., Dionisotti S., Ongini E. Pyrazolo4,3-e.-l,2,4-triazolo[l,5-c]pyrimidine derivatives: potent and selective A2a adenosine antagonists. // J. Med. Chem. 1996. - V. 39. - P. 11641171.

60. Chebib M., McKeveney D., Quinn R.J. l-Phenylpyrazolo3,4-d. pyrimidines; structure-activity relationships for C6 substituents at A1 and A2a adenosine receptors. // Bioorg. Med. Chem. 2000. - V. 8. - P. 2581-2590.

61. Feoktistov I., Biaggioni I. Adenosine A2b receptors. // Pharmacol. Rev. 1997. -V. 49.-P. 381-401.

62. Cristalli G., Camaioni E., Costanzi S., Vittori S., Volpini R., Klotz K.-N. Caracterization of potent ligands at human recombinant adenosine receptors. // Drug. Dev. Res. 1998. - V. 45. - P. 176-181.

63. Volpini R., Camaioni E., Costanzi S., Vittori S., Klotz K.-N., Cristalli G. Synthesis of di- and tri-substituted adenosine derivatives and their affinity at human adenosine receptor subtypes. // Nucleosides Nucleotides. 1999. - V. 18.-P. 2511-2520.

64. Muller C.E. Adenosine receptor ligands recent developments part I. Agonists. // Curr. Med. Chem. - 2000. - V. 7. - P. 1269-1288.

65. Kim Y.C., Ji X., Melman N., Linden J., Jacobson K.A. Anilide derivatives of an 8-phenylxanthine carboxylic congener are highly potent and selective antagonists at human A2b adenosine receptors. // J. Med. Chem. 2000. - V. 43. -P. 1165-1172.

66. Robeva A.S., Woodard R.L., Jin X., Gao Z., Bhattacharya S., Taylor H.E., Rosin D.L., Linden J. Molecular characterization of recombinant human adenosine receptors. // Drug. Dev. Res. 1996. - V. 39. - P. 243-252.

67. Jacobson K.A., IJzerman A.P., Linden J. 1,3-Dialkylxanthine derivatives having high potency as antagonists at human A2b adenosine receptors. // Drug. Dev. Res. 1999. - V. 47. - P. 45-53.

68. Feoktistov I., Biaggioni I. Characterization of adenosine receptors in human erythroleukemia-cells and platelets further evidence for heterogeneity of adenosine-A2 receptor subtypes. // Mol. Pharmacol. - 1993. - V. 43. - P. 909-914.

69. Kim H.O., Ji X.D., Siddiqi S.M., Olah M.E., Stiles G.L., Jacobson K.A. 2-Substitution of N^benzyladenosine-S'-uronamides enhances selectivity for A3 adenosine receptors. // J. Med. Chem. 1994. - V. 37. - P. 3614-3621.

70. Okamura Т., Kurogi Y., Nishikawa H., Hashimoto K., Fujiwara H., Nagao Y. l,2,4-Triazolo5,l-i.purine derivatives as highly potent and selective human adenosine A(3) receptor ligands. // J. Med. Chem. 2002. - V. 45. - P. 37033708.

71. Jacobson K.A., Park K.S., Jiang J.L., Kim Y.C., Olah M.E., Stiles G.L., Ji X.D. Pharmacological characterization of novel A3 adenosine receptor-selective antagonists. // Neuropharmacol. 1997. - V. 36. - P. 1157-1165.

72. Palczewski K., Kumasaka Т., Hori Т., Behnke C.A., Motoshima H., Fox B.A., Trong I.L., Teller D.C., Okada Т., Stenkamp R.E., Yamamoto M., Miyano M. Crystal structure of rhodopsin: a G protein-coupled receptor. // Science. 2000. -V. 289.-P. 739-745.

73. Gershengorn M.C., Osman R. Minireview: Insights into G protein-coupled receptor function using molecular models. // Endocrinology. 2001. — V. 142. — P. 2-10.

74. Shi L., Javitch J.A. The binding site of aminergic G protein-coupled receptors: the transmembrane segments and second extracellular loop. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. - V. 42. - P. 437-467.

75. Hibert M.F., Trumpp-Kallmeyer S., Bruinvels A., Hoflack J. Three-dimensional models of neurotransmitter G-binding protein-coupled receptors. // Mol. Pharmacol. 1991. - V. 40. - P. 8-15.

76. Findlay J., Eliopoulos E. Three-dimensional modelling of G protein-linked receptors. // Trends Pharmacol. Sci. 1990. - V. 12. - P. 492-499.

77. Schertler G.F.X., Hargrave P.A. Projection structure of frog rhodopsin in two crystal forms. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - V. 92. - P. 11578-11582.

78. Schertler G.F.X., Villa C., Henderson R. Projection structure of rhodopsin. // Nature. 1993. - V. 362. - P. 770-772.

79. Davies A., Schertler G.F.X., Gowen B.E., Saibil H.R. Projection structure of an invertebrate rhodopsin. // J. Struct. Biol. 1996. - V. 117. - P. 36-44.

80. Baldwin J.M. The probable arrangement of the helices in G protein-coupled receptors. //EMBOJ.- 1993. -V. 12.-P. 1693-1703.

81. Donnelly D., Overington J.P., Ruffle S.V., Nugent J.H.A., Blundell T. L. Modeling alpha-helical transmembrane domains: the calculation and use of substitution tables for lipid-facing residues. // Protein Sci. 1993. - V. 2. - P. 5570.

82. Alkorta I., Du P. Sequence divergence analysis for the prediction of seven-helix membrane protein structures: И. A 3-D model of human rhodopsin. // Protein Eng. 1994. - V. 7. - P. 1231-1238.

83. Taylor W.R., Jones D.T., Green N.M. A method for alpha-helical integral membrane protein fold prediction. // Proteins. 1994. - V.3. - P. 281-294.

84. Herzyk P., Hubbard R.E. Automated method for modeling seven-helix transmembrane receptors from experimental data. // Biophys. J. 1995. - V. 69. -P. 2419-2442.

85. Herzyk P., Hubbard R.E. Combined biophysical and biochemical information confirms arrangement of transmembrane helices visible from the three-dimensional map of frog rhodopsin. // J. Mol. Biol. 1998. - V. 281. - P. 741754.

86. Pogozheva I.D., Lomize A.L., Mosberg H.I. The transmembrane 7-alpha-bundle of rhodopsin: distance geometry calculations with hydrogen bonding constraints. // Biophys. J. 1997. - V. 72. - P. 1963-1985.

87. Lomize A.L., Pogozheva I.D., Mosberg H.I. Structural organization og G protein-coupled receptors. // J. Comp.-Aided Mol. Des. 1999. - V. 13. - P. 325353.

88. Teeter M.M., Froimowitz M., Stec В., DuRand C.J. Homology modeling of the dopamine D2 receptor and its testing by docking of agonists and tricyclic antagonists. // J. Med. Chem. 1994. - V. 37. - P. 2874-2888.

89. Bourdon H., Trumpp-Kallmeyer S., Schreuder H., Hoflack J., Hibert M., Wermuth C.G. Modelling of the binding site of the human ml muscarinicreceptor: experimental validation and refinement. // J. Comp.-Aided Mol. Des. -1997.-V. 11.-P. 317-332.

90. Orry A.J., Wallace B.A. Modeling and docking the endothelin G-protein-coupled receptor. // Biophys. J. 2000. - V. 79. - P. 3083-3094.

91. Olah M.E. Identification of A2a adenosine receptor domains involved in selective coupling to Gs. Analysis of chimeric Al/A2a adenosine receptors. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 337-344.

92. Olah M.E., Jacobson K.A., Stiles G.L. Role of the second extracellular loop of adenosine receptors in agonist and antagonist binding. // J. Biol. Chem. 1994. -V. 269.-P. 24692-24698.

93. Kim J., Jiang Q., Glashofer M., Yehle S., Wess J., Jacobson K.A. Glutamate residues in the second extracellular loop of the human A2a adenosine receptor required for ligand recognition. // Mol. Pharmacol. 1996. - V. 49. - P. 683-691.

94. Pikkemaat M.G., Linssen A.B.M., Berendsen H.J.C., Janssen D.B. Molecular dynamics simulations as a tool for improving protein stability. // Protein Eng. -2002. V. 15. -P. 185-192.

95. Hansson Т., Oostenbrink C., van Gunsteren W.F. Molecular dynamics simulations. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. - V. 12. - P. 190-196.

96. Pasenkiewicz-Gierula M., Murzyn K., Rog Т., Czaplewski C. Molecular dynamics simulation studies of lipid bilayer systems. // Acta Biochim. Polonica. -2000.-V. 47.-P. 601-611.

97. Dahl S.G., Edvardsen 0., Sylte I. Molecular dynamics of dopamine at the D2 receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. - V. 88. - P. 8111-8115.

98. Zhang D., Weinstein H. Signal transduction by a 5-HT2 receptor: a mechanistic hypothesis from molecular dynamics simulations of the receptor complexed to ligands. // J. Med. Chem. 1993. - V. 36. - P. 934-938.

99. Almaula N., Ebersole B.J., Zhang D., Weinstein H., Sealfon S.C. Mapping the binding site pocket of the serotonin 5-hydroxytryptamine 2a receptor. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 14672-14675.

100. Sylte I., Andrianjara C.R., Calvet A., Pascal Y., Dahl S.G. Molecular dynamics of NPY Y1 receptor activation. // Bioorg. Med. Chem. 1999. - V. 7. - P. 27372748.

101. Booth P.J., Curran A.R. Membrane protein folding. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. - V. 9.-P. 115-121.

102. Forrest L.R., Sansom M.S.P. Membrane simulations: bigger and better? // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. - V. 10. - P. 174-181.

103. Zhong Q., Jiang Q., Moore P.B., Newns D.M., Klein M.L. Molecular dynamics simulation of a synthetic ion channel. // Biophys. J. 1998. - V. 74. - P. 3-10.

104. Tieleman D.P., Berendsen H.J.C., Sansom M.S.P. An alamethicin channel in a lipid bilayer: molecular dynamics simulations. // Biophys. J. 1999. - V. 76. - P. 1757-1769.

105. IJzerman A.P., van Galen P.J.M., Jacobson K.A. Molecular modeling of adenosine receptors. I. The ligand binding site on the A1 receptor. // Drug Des. Discov. 1992. - V. 9. - P. 49-67.

106. Olah M.E., Ren H., Ostrowski J., Jacobson K.A., Stiles G.L. Cloning, expression, and characterization of the unique bovine A1 adenosine receptor. // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 10764-10770.

107. IJzerman A.P., van der Wenden E.M., van Galen P.J.M., Jacobson K.A. Molecular modeling of adenosine receptors. The ligand binding site on the rat adenosine A2a receptor. // Eur. J. Pharmacol. 1994. - V. 268. - P. 95-104.

108. Tucker A.L., Robeva A.S., Taylor H.E., Holeton D., Bockner M., Lynch K.R., Linden J. A1 adenosine receptors. Two amino acids are responsible for species differences in ligand recognition. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 2790027906.

109. Townsend-Nicholson A., Schofield P.R. A threonine residue in the seventh transmembrane domain of the human A1 adenosine receptor mediates specific agonist binding. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 2373-2376.

110. Bianucci A.M., Bigi M.U., Biagi G., Giorgi I., Livi O., Scartoni V. A 3D model of the human A1 adenosine receptor. An evaluation of the binding free-energy with ligands. // Drug Des. Discov. 1998. - V. 15. - P. 149-156.

111. Kim J., Wess J., van Rhee A.M., Schoneberg Т., Jacobson K.A. Site-directed mutagenesis identifies residues involved in ligand recognition in the human A2a adenosine receptor. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 13987-13997.

112. Dawson E.S., Wells J.N. Determination of amino acid residues that are accessible from the ligand binding crevice in the seventh transmembrane-spanning region of the human A1 adenosine receptor. // Mol. Pharmacol. 2001. - V. 59. -P. 1187-1195.

113. Kim S.K., Gao Z.G., Van Rompaey P., Gross A.S., Van Calenbergh A.C.S., Jacobson K.A. Modeling the adenosine receptors: comparison of the binding domains of A2a agonists and antagonists. // J. Med. Chem. 2003. - V. 46. - P. 4847-4859.

114. Rivkees S.A., Barbhaiya H., IJzerman A.P. Identification of the adenine binding site of the human A1 adenosine receptor. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274.-P. 3617-3621.

115. Gao Z.G., Jiang Q., Jacobson K.A., IJzerman A.P. Site-directed mutagenesis studies of human A2a adenosine receptors. Involvement of Glul3 and His278 in ligand binding and sodium modulation. // Biochem. Pharmacol. 2000. - V. 60. -P. 661-668.

116. Gao Z.G., Chen A., Barak D., Kim S.K., Muller C.E., Jacobson K.A. Identification by site-directed mutagenesis of residues involved in ligand recognition and activation of the human A3 adenosine receptor. // J. Biol. Chem.2002.-V. 277.-P. 19056-19063.

117. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000 // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 45-48.

118. Sybyl 6.9 Tripos, Inc., 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144.

119. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. PROCHECK: A program to check the stereochemical quality of protein structures. // J. Appl. Crystallogr. 1993. - V. 26. - P. 283-291.

120. Rullmann J.A.C. AQUA; Utrecht University: The Netherlands, 1996.

121. Thompson J.D., Gibson Т.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Res. 1997. — V. 25. -P. 4876-4882.

122. Sali A., Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. // J. Mol. Biol. 1993. - V. 234. - P. 779-815.

123. Fiser A., Do R.K., Sali A. Modeling of loops in protein structures. // Protein Sci. -2000. V. 9. - P. 1753-1773.

124. Sali A., Overington J. Derivation of rules for comparative protein modeling from a database of protein structure alignments. // Protein Sci. 1994. — V. 3. - P. 1582-1596.

125. Ewing T.J.A., Kuntz I.D. Critical evaluation of search algorithms used in automated molecular docking. // J. Comput. Chem. 1997. - V. 18. — P. 11751189.

126. Morris G.M., Goodsell D.S., Halliday R.S., Huey R., Hart W.E., Belew R.K., Olson A.J. Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and and Empirical Binding Free Energy Function. // J. Comput. Chem. 1998. - V. 19. -P. 1639-1662.

127. Camaioni E., Costanzi S., Vittori S., Volpini R., Klotz K.-N., Cristalli G. New substituted 9-alkylpurines as adenosine receptor ligands. // Bioorg. Med. Chem. -1998.-V. 6.-P. 523-533.

128. Kim Y.-C., Karton Y., Ji X.-D., Linden J., Jacobson K.A. Acyl-hydrazide derivatives of a xanthine carboxilic congener (XCC) as selective antagonists at human A2b adenosine receptors. // Drug Dev. Res. 1999. - V. 47. - P. 178-188.

129. Jiang Z., Lee B.X., Glashofer M. van Rhee A.M., Jacobson K.A. Mutagenesis reveals structure-function parallels between human A2A-adenosine receptors and the biogenic amine family. // J. Med. Chem. 1997. - V. 40. - P. 2588-2595.

130. Heller H., Schaefer M., Schulten K. Molecular dynamics simulation of a bilayer of 200 lipids in the gel and in the liquid crystal phase. // J. Phys. Chem. -1993. V. 97. - P. 8343-8360.

131. Lindahl E., Hess В., Van der Spoel D. GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. // J. Mol. Mod. 2001. - V. 7. - P. 306-317.

132. Berendsen H.J.C., Van der Spoel D., Van Drunen R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. // Сотр. Phys. Comm. -1995.-V. 91.-P. 43-56.

133. De Zwart M., Kourounakis A., Kooijman H., Spek A.L., Link R., Von Frijtag Drabbe Kiinzel J.K., IJzerman A.P. 5'-N-carboxamidoadenosines as agonists fro adenosine receptors. // J. Med. Chem. 1999. - V. 42. - P. 1384-1392.

134. Ji X.-D., Jacobson K.A. Use of the triazolotriazine 3H.ZM 241385 as a radioligand at recombinant human A2b adenosine receptors. // Drug Des. Discov. 1999. - V. 16.-P. 217-226.

135. Vittori S., Camaioni E., Costanzi S., Volpini R., Klotz K.-N., Cristalli G. Synthesis and receptor affinity of polysubstituted adenosines. // Nucleosides Nucleotides. 1999. - V. 18. - P. 739-740.

136. Jones G., Willett P., Glen R.C., Leach A.R., Taylor R. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking. // J. Mol. Biol. 1997. -V. 267.-P. 727-748.

137. Muegge 1., Martin Y.C. A general and fast scoring function for protein-ligand interactions: a simplified potential approach. // J. Med. Chem. 1999. - V. 42. -P. 791-804.

138. Kuntz I.D., Blaney J.M., Oatley S.J., Langridge R., Ferrin Т.Е. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. // J. Mol. Biol. 1982. - V. 161. -P. 269-288.