Синтез и биологическая активность новых лигандов мелатониновых рецепторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Волкова, Мария Сергеевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2013
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА
Химический факультет
На правах рукописи
Волкова Мария Сергеевна
СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ЛИГАНДОВ МЕЛА-ТОНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
02.00.03 — органическая химия 02.00.16 — медицинская химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
2 Н НОЯ 2013
Москва — 2013
005541378
005541378
Работа выполнена в лаборатории органического синтеза кафедры органической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
Николай Серафимович Зефиров
академик РАН, доктор химических наук, профессор Наталья Александровна Лозинская
кандидат химических наук, ассистент
Михаил Михайлович Краюшкин
Доктор химических наук, профессор (Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН, зав. лабораторией гетероциклических соединений)
Михаил Александрович Грин
Доктор химических наук, профессор (Московский государственный университет тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова, зам. зав. кафедрой химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского)
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Российский Государственный Аграрный Университет МСХА имени К.А. Тимирязева
Защита состоится «18» декабря 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.69 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 3, ГСП-1, МГУ, Химический факультет, аудитория 446.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «16» ноября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук, профессор
Магдесиева Т.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Гормон мелатонин (5-метокси-3-(2-(ацетиламино)этил)индол) играет ключевую роль в регуляции циркадных ритмов в организме млекопитающих, в том числе и человека. Помимо того, что мелатонин регулирует цикл сна-бодрствования, он также оказывает влияние на деятельность иммунной, сердечно-сосудистой и репродуктивной систем. Мелатонин и его аналоги проявляют гипотензивные, антидепрессантные, антиоксидантные и нейропротекторные свойства; низкий уровень мелатонина напрямую связан с риском раковых заболеваний.
В настоящее время во многих странах выпускаются препараты мелатонина, которые зарегистрированы или в качестве лекарств, или как БАД. Так, например, лекарственная форма мелатонина - мелаксен является препаратом выбора для лечений нарушений сна у больных с нарушением мозгового кровообращения, применяется при комплексной противоопухолевой терапии, лечении артериальной гипертензии и нейродегенеративных заболеваний. Более широкому внедрению мелатонина в медицинскую практику препятствует его быстрый метаболизм в организме, особенно в светлое время суток, а также неселективность его действия, связанная с наличием в организме многочисленных сайтов связывания мелатонина. Так, у млекопитающих выделяют 3 подтипа мелатониновых рецепторов: трансмембранные GPCR рецепторы МТ, и МТ2, и низкоаффинный МТ3 рецептор, согласно некоторым исследованиям представляющий собой фермент — хинонредуктазу 2. Кроме того, мелатонин способен связываться с ядерными рецепторами подсемейства ROR/RZR. Несмотря на многочисленные исследования вопрос, какие именно физиологические функции мелатонин регулирует через каждый из этих рецепторов, до сих пор остается открытым.
Учитывая большой потенциал селективных лигандов мелатониновых рецепторов, разработка подхода к синтезу новых производных мелатонина, получение новых лигандов мелатониновых рецепторов различных подтипов и изучение их активности является актуальной задачей.
Цель настоящей работы заключается в: разработке общей стратегии синтеза разнообразных лигандов мелатониновых рецепторов МТ1; МТ2 и МТ3; синтезе ряда новых аналогов мелатонина, содержащих 2,3-дигидроиндольный фрагмент; изучении активности полученных соединений в качестве ингибиторов хинон-редуктазы 2 и лигандов мелатониновых MTj и МТ2 подтипов.
Научная новизна и практическая ценность работы. На основе конденсации Кневенагеля была разработана универсальная стратегия многостадийного синтеза замещенных (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов, являющихся прекурсорами новых лигандов мелатониновых рецепторов. Алкилирование полученных (2-оксоиндолин-З-ил)ацетонитрилов по положению 1 и 3, модификация их по второму положению индолильного цикла, а также введение 2-оксоиндолиден-З-илацетонитрилов в реакции циклоприсоединения с образованием спиро-структур позволили получить 49 новых соединений.
Обнаружено необычное протекание конденации Кневенагеля в случае нитро-изатинов. Разработан оригинальный one-pot метод восстановления цинком в уксусной кислоте полученных продуктов в 5-ацетамидопроизводные 2-оксоиндолин-З-илацетонитрилы, которые являются афинными лигандами МТ3-подтипа и потому могут быть использованы как потенциальные антиглаукомные препараты.
/
Предложено и оптимизировано три метода восстановления нитрильной группы с ее одновременным ацилированием для получения широкого ряда разнообразных лигандов мелатониновых рецепторов. Продемонстрирована возможность селективного восстановления нитрильной группы в многофункциональной молекуле с образованием 2-оксомелатонинов и 2-хлормелатонинов. Разработан метод одновременного восстановления нитрильной и ацетамидной групп для получения уникальных 2,3-дигидропроизводных ме-латонина. В ходе восстановления показана возможность дополнительной one-pot модификации молекулы в боковой ацетамидной цепи и в первом положении индола.
Синтезировано 22 новых производных мелатонина с хорошими выходами. Продемонстрирована универсальность метода для синтеза разнообразных мелатониноподобных структур.
Изучена афинность полученных соединений по отношению к МТЬ МТ2 и МТ3-подтипам мелатониновых рецепторов. Найдено, что 2-хлормелатонин обладает высокой активностью и селективностью по отношению к MTi-подтипу. В рамках изучения активности по отношению к МТ3 рецептору для ряда соединений определены константы инги-бирования хинон-редуктазы 2. Показано, что афинность замещенных (5-ацетамидо-2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов по отношению к МТз-подтипу превышает аффиность мелатонина. Методом рентгеноструктурного анализа исследовано связывание лигандов, содержащих амидную группу, с активным центром хинон-редуктазы 2. Получены принципиально новые результаты о соотношении структура-активность для лигандов МТ3 рецепторов.
Личный вклад соискателя. Автором были поставлены цели и задачи исследования, спланированы и проведены синтезы всех соединений, обобщены и интерпретированы полученные результаты, сформулированы выводы. Автор участвовал в проведении биологических исследований синтезированных соединений, осуществлял регистрацию спектров полученных соединений, осуществлял обработку всех полученных результатов.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены в виде устных докладов на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), Первой Российской конференции по медицинской химии (Москва, 2013), а также на Международном Симпозиуме «Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry» (Москва, 2013).
Публикации. По результатам работы опубликовано 2 статьи и 7 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 107 схем и 80 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 283 наименований. Во введении обоснована актуальность темы работы и сформулированы основные задачи исследования. В обзоре литературы проведен анализ соотношения структура-активность известных лигандов мелатониновых рецепторов и приведены данные об исследовании макро-свойств и использовании в клинической практике мелатонина и его аналогов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Существующие в настоящее время высокоаффинные лиганды мелатониновых рецепторов весьма разнообразны по структуре. Несмотря на то, что среди успешных лиган-дов известно много биоизостерических замен индольного цикла на ароматический или ге-тероароматический, потенциал мелатониноподобных модификаций индольного цикла далеко не исчерпан. Так, можно выделить следующие структурные требования и фармако-форные группы, необходимые для связывания с МТ]/МТ2 и МТ3 подтипами мелатониновых рецепторов (рис.1, А, В):
Рис. 1. Необходимые для аффинности к М^/МТг и МТ3 подтипам фармакофорные группы (1-1У)
Для агонистической активности по отношению к МТ1/МТ2 подтипам необходима группа I, представляющая собой метокси-группу или ее гомологический (циклический) аналог, в то же время для антагонистов ее присутствие не обязательно. Наличие же амидной группы II и спейсера III, строго равного двум атомам углерода, является необходимым для любого вида активности. Перспективными представляются модификации мелатонина, направленные на создание зр3-гибридного атома углерода в третьем положении молекулы индола и введение туда дополнительного заместителя Я3 (см. рис.1, С). В этом случае боковая аце-тамидная цепь оказывается выведенной из плоскости индольного ядра, что положительно влияет на активность соединения по отношению к мелатониновым рецепторам МТ1/МТ2 подтипов. Структурные требования к лигандам низкоаффинного МТ3 подтипа менее изучены. Поскольку, вероятно, МТ3 рецептор представляет собой фермент хинонредуктазу 2, можно предположить, что хороший лиганд должен содержать плоский ароматический цикл с планарным расположением заместителей. Также достоверно известно, что наличие карбамоильной группы IV значительно улучшает связывание с МТ3 подтипом. Кроме того, общим перспективным направлением при создании новых лигандов МТрМТз рецепторов является введение заместителей с различными электронными эффектами и разной степени стерической нагруженности во 2-е и 5-е положения индольного цикла (см. рис.1, С). Поскольку прямая модификация индольного ароматического цикла затруднена, мы предложили универсальную стратегию, позволяющую проводить необходимые модификации на разных стадиях сборки индольного ядра.
Ключевой стадией нашего метода позволяющего выйти к разнообразным лигандам мелатониновых рецепторов, является реакция изатинов с циануксусной кислотой или ее эфирами по типу конденсации Кневенагеля (схема 1):
к2оос сы
,СО(Ж2 у^
ЫНАс
х, = н, =о
Х= На],ОН,5
Схема 1. Стратегия синтеза новых лигандов мелатониновых рецепторов
1. Синтез исходных циан(2-оксоиндолин-3-илиден)уксусных кислот
Помимо введения 5-метокси-группы, необходимой для агонистической активности по отношению к МТ]/МТ2 подтипам рецепторов было интересно осуществить синтез лигандов, содержащих иные по стерическим и электронным свойствам заместители в бензольном кольце. Для синтеза исходных изатинов 1 нами был выбран метод Зандмейера (схема 2). Выходы из соответствующего анилина представлены в таблице 1.
ЫН2ОН*НС1 , .. „ о
НС1 75°С шн 1.Н2504ко„ц
«Г II г" 70"с -
"кн2
2.Н20,0 С
О
ын
1 50-96%
И = 5-Н, 5-МеО, 6,7-<Ше, 5-Вг 1' 60 - 72 %
Схема 2. Синтез изатинов по методу Зандмейера
Таблица 1. Выходы изатинов, полученных по реакции Зандмейера (по двум стадиям)
№ 1а 1Ь 1с ы
Я 5-Н 5-ОМе 5-Вг 6,7-диМе
Выход, % 65 55 63 36
Поскольку введение небольшого заместителя к индольному атому азота положительно сказывается на аффинности мелатониновых лигандов, нами был синтезирован ряд Л'-метилзамещенных изатинов. С другой стороны, для получения А'-незамещенных лигандов на некоторых стадиях могла потребоваться защитная группа. В качестве таковой нами была выбрана стабильная в присутствии кислот и оснований, но в то же время легко удаляемая бензильная группа и также был синтезирован ряд Д'-бензилированных производных. Таким образом, в результате А'-алкилирования были получены соответствующие изатины 1е-к, ш (схема 3).
О
1а-<1
1.ЫаН, ОМИ или ТНИ Я-
2. ВпВг или МеІ
"И
85 - 97% Яі 1е-к
Я = 5-Н Я, = Ме, Вп З 5-ОМе 5-Вг
6,7-сііМе
Схема 3. Синтез Ы-замещенных изатинов
6
Также нами были синтезированы нитроизатины И-п с хорошим выходом (схема 4). Введение нитро-группы предполагает ее последующее восстановление и ацилирование с выходом к ацетамидным производным - потенциальным лигандам МТ3-подтипа мелато-ниновых рецепторов (рис. 1 В).
\
II: К]= Н, 47% К1 1т: К]= Ме, 58%
Схема 4. Синтез 5-нитроизатинов и 5,7-динитроизатина
Выходы реакций алкилирования и нитрования представлены в таблице 2: Таблица 2. Выходы изатинов, полученных по реакциям алкилирования и нитрования
№ 1е If lg Ii U lk 11 Im 1п
R 5-Н 5-Н 5-ОМе 5-ОМе 5-Вг 6,7-диМе 5-NÜ2 5-NO2 5,7-диШ2
R. Ме Вп Ме Вп Ме Ме н Ме Н
Выход, % 85 97 93 87 95 95 47 58 55
Для полученных изатинов далее нами была изучена конденсация Кнёвенагеля как с самой циануксусной кислотой, так и с ее эфирами.
Нами было показано, что конденсация изатина с эфирами циануксусной кислоты в разных условиях с последующим омылением полученного эфира протекает с низкими выходами (схема 5). Кроме того, дополнительная стадия - омыление сложного эфира - не только понижает общий выход, но и создает дополнительные затруднения: в этих условиях может происходить гидролиз не только сложноэфирной, но и нитрильной группы. Наилучшие результаты были достигнуты при проведении конденсации с циануксусной кислотой в присутствии триэтиламина по методу, описанному для изатинов 1а-с, 11. Конденсация изатинов 1е-к и 1ш-п с циануксусной кислотой была проведена нами впервые. Дальнейшая оптимизация метода (определение оптимального количества растворителя и времени проведения реакции для каждого из субстратов) позволила увеличить выходы по сравнению с литературными данными с 42-70% до 60-90%.
ноос
НООС______^CN
Et3N, диоксан '' 20 °С, 4 ч
2) НОконц 2-5 д, 25 °С
К \
Ri
RzOOO^CN
О5-
э-
растворитель А, В R'
R2OOC
сгС
2 а-П1
53-89 %
А: EtOH/PhH, R = 5-ОМе, R2 = Ме, 32% В: АсОНлех, R = 5-ОМе, R2 = Et, 26%
R=5-H, 5-ОМе, 5-В г, 6,7-сШе Rl = Н, Ме, Вп
Схема 5. Конденсация Кневенагеля изатинов с циануксусной кислотой и ее эфирами
Соединения 2а-ш были выделены в виде смеси двух стереоизомеров, выходы приведены в таблице 3.
Таблица 3. Выходы соединений, полученных конденсацией Кневенагеля изатинов с циануксусной кислотой
№ 2а 2Ь 2с 2& 2е 2{ 2g ?\ 2] 2к 21 2т
Я 5-Н 5- ОМе 5-Вг 6,7-диМе 5-Н 5-Н 5- ОМе 5- ОМе 5-Вг 6,7-диМе 5- N02 5- N02
я. Н Н Н Н Ме Вп Ме Вп Ме Ме Н Ме
Выход, % 85 53 81 54 75 82 69 68 89 59 64 68
Нами впервые было обнаружено необычное протекание конденсации Кневенагеля для соединений II и 1п, содержащих одну или две нитрогруппы в бензольном кольце.
ноос
о2к
1) 1*ГН2СООН, Е1зК 4ч.
2) НИ, 25°С, 7д
1) ЫОСН2СООН, EtзN
2) НС1, 70°С; 0,5 ч
3) ЬЬО, 0°С
о2к
1) КССН2СООН, Е13ы, 4 ч
2) НС1, 25°С, 7 д.
N02
N02
1п
2п 60%
Схема 6. Необычное протекание конденсации Кневенагеля в случае нитро-изатинов
Так, для соединения II при проведении реакции в обычных условиях образуется продукт 21, однако при изменении условий выделения нами впервые был получен 3-гидрокси-индолин-3-илацетонитрил 2о. При введении же в реакцию изатина 1п образуется исключительно 3-гидрокси-продукт 2п независимо от условий. Вероятно, присутствие акцепторных нитро-групп в изатине замедляет завершающую стадию конденсации Кневенагеля - элиминирование воды с образованием двойной связи.
1.2 Синтез 2-оксоиндолин-З-илацетонитрилов
Для выхода к разнообразным (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилам мы предложили две последовательности превращений, включающие в себя восстановление двойной связи и декарбоксилирование продуктов конденсации Кневенагеля 2а-к - подход А и подход В (на схеме 7).
соон
в
52-75%
А
45-89%
5-Н, 5-ОМе, 5-Вг, 6,7-сШе = Н. Ме, Вп
Схема 7. Две стратегии синтеза (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов Подход А заключается в последовательном восстановлении двойной связи и декар-боксилировании полученной кислоты. В литературе описано гидрирование двойной связи на палладиевом катализаторе для незамещенной (2-оксоиндолин-3-илиден)циануксусной кислоты, однако данное превращение сопровождается нежелательным побочным процессом: при гидрировании также происходит частичное восстановление нитрильной группы. Поэтому для соединений 2а-2к нами было разработано и оптимизировано восстановление двойной связи системой Zn/HClpaзб. Выделенные продукты восстановления 2' без характе-ризации и дополнительной очистки были введены в реакцию декарбоксилирования. Нитрилы 3 были получены с хорошим выходом (схема 8, таблица 4).
11= 5-Н, 5-ОМе, 5-Вг, 6,7-диМе 11,= Н, Ме, Вп
Схема 8. Синтез 2-оксоиндолин-З-илацетонитрилов. Подход А
Альтернативный подход В предполагает декарбоксилирование в пиридине с последующим восстановлением двойной связи. Литературная методика для соединений 4а,Ь была оптимизирована нами для прочих субстратов. Ранее не описанные соединения 4с-к были получены по схеме 9:
0 I) Ру . 100°С,2Ч. 2) АсОН, 5д.
2а-к
\
4а-к К,
N \
Зс-к
52-91% 40-82%
Я=5-Н, 5-ОМе, 5-Вг, 6,7-диМе Яі= Н, Ме, Вп
Схема 9. Синтез (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов. Подход В
Таким образом, нами были получены соединения Зс-Зк, выходы по двум стадиям приведены в таблице.
Таблица 4. Суммарные выходы по двум стадиям (2-оксоиндолин-З-ил)ацетонитрилов 3, полученных методами А, В
№ За зь Зс Зе 3f 3g 3i 3j 3k
R 5-Н 5-ОМе 5-Вг 5-Н 5-Н 5-ОМе 5-ОМе 5-Вг 6,7-диМе
Ri Н н Н Me Вп Me Вп Me Me
Выход А, % 69 57 45 87 60 67 69 57 60
Выход В, % - - - 80 79 72 76 40 82
Восстановление двойной связи в нитро-соединениях 21,ш сопровождается одновременным восстановлением нитрогруппы, что создает дополнительные сложности при выделении продукта. Поэтому для решения этой проблемы нами был разработан оригинальный метод восстановления в присутствии уксусного ангидрида с одновременным аудированием образующейся амино-группы. Реакция сопровождается сильным разогревом, вызывающим также one-pot декарбоксилирование. В результате нами впервые были получены нитрилы 31-о, в силу структурных особенностей представляющие собой потенциальные лиганды МТз-подтипа мелатониновых рецепторов (см. рис 1; схема 10). Интересно, что в случае соединения Зп образуется продукт О-ацилирования.
ноос
31: R-H,89% 3m: R-Me, 95%
Зо: R2=H, 45% Зп: R2=NHAc, 79%
Схема 10. Синтез (5-ацетамидо-2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов Таким образом, мы показали, что подход, основанный на конденсации изатинов с производными малоновой кислоты, оказался достаточно универсальным для синтеза широкого ряда (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов. В ходе работы было впервые описано и охарактеризовано 49 новых соединений 2-4.
Полученные (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилы 3 представляют собой удобные полифункциональные субстраты для дальнейших модификаций. Преимущества соединений 3 как исходных для синтеза новых лигандов мелатониновых рецепторов в том, что они представляют собой недорогие доступные реагенты, стабильные при хранении, и могут быть легко синтезированы с хорошим суммарным выходом (14-41% по 6 стадиям).
1.3 Синтез 2-гетерозамещенных индолин-3-илацетонитрилов
Мы предположили, что введение гетероатома, содержащего неподеленные электронные пары, во второе положение мелатонина может положительно сказаться на связывании с мелатониновыми рецепторами, а также, возможно, и на селективности по отношению к МТ1/МТ2 подтипам. Мы показали, что оксоиндольная группа в соединениях 3 является достаточно реакционноспособной и может быть дополнительно модифицирована.
Так, при кипячении оксонитрила ЗЬ в оксохлориде фосфора был выделен 2-хлориндол 5Ь с хорошим выходом.
ЗЬ 5Ь 84 %
Схема 11. Хлорирование (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрила
Также мы провели серию опытов, направленных на введение в положение 2 мелатонина и других гетероатомов: брома, серы и азота. Нами была опробована реакция хлорнит-рила 5Ь с морфолином в присутствии йодида меди, однако желаемый результат не был достигнут. Использование различных лигандов (Ph3P, Р(о-толил)3 и BINAP) и палладиевых катализаторов (Pd2(dba)3, PdCl2, Pd(OAc)2 и (Ph3P)4Pd) также не привело к успеху.
Попытка получить 2-бром-производное при помощи оксотрибромида фосфора не привела к успеху, и в результате реакции было выделено только исходное соединение. Использование пентабромида фосфора в качестве галогенирующего агента приводит к введению брома во второе положение, судя по данным масс-спектрометрии, но сопровождается гидролизом метокси-группы. При проведении реакции с пентасульфидом фосфора в ацетонитриле в присутствии питьевой соды был детектирован желаемый продукт 7Ь, но, к сожалению, в неразделяемой смеси с исходным соединением в соотнощении 2:1 по данным ЯМР спектроскопии.
Схема 12. Введение брома и серы во второе положение
Кроме того, нами была показана возможность модификации полученных нами нитрилов Зg и Зі, содержащих бром в пятом положении молекулы индола. Мы предположили, что замена атома брома на нитрильную группу в дальнейшем позволит получить перспективные 5-азотсодержащие производные, интересные для изучения активности к МТ3-подтипу мелатониновых рецепторов. Сравнение активности подобных соединений с активностью Зп-о, позволило бы проследить зависимость аффинности от удаления ацета-мидной группы от бензольного кольца. С этой целью нитрилы Зg и Зі были введены в реакцию с цианидом меди (I) в ДМФА. Целевые продукты 7с,і также были детектированы нами в реакционной смеси, однако выделить их в чистом виде не удалось.
CuCN, DMF
NHAc
reflux, 2 h
, . K 7c: R=H
3C,J 14 7j: R=Me
Схема 13. Введение нитрильной группы в пятое положение
1.3 Синтез спироциклических индолин-3-ил-ацетонитрилов
Далее нами была поставлена задача синтеза 2-оксоиндолин-З-ил-ацетонитрилов, которые могут стать прекурсорами спиро-производных мелатонина. Спиро-производные интересны, во-первых, с точки зрения фиксирования определенной конформации молекулы, что является перспективным инструментом для создания селективных лигандов. С другой стороны спиро-производные индола являются объемными молекулами, следовательно могут проявлять антагонистическую активность за счет так называемого «зонтичного эффекта» - экранирования активного центра рецептора. В рамках данной работы нами была поставлена цель синтезировать спиро-производные мелатонина, содержащие трех- или ше-стичленный цикл в третьем положении молекулы индола.
С целью создания спиробицикло-гептановых аналогов мелатонина нами были изучены реакции [4+2]-циклоприсоединения диенов к соединениям 2а, 2Ь, 21. Синтезы проводились при нагревании с двумя диенами - циклопентадиеном и 2,3-диметилбутадиеном как в присутствии иодида цинка в качестве катализатора, так и без него, соон
соон
ЕЮН, 78
R=H, ОМе, N02 Схема 14. Реакция Дильса-Альдера
45-83%
Оптимизация условий проведения реакций и выделения продуктов 8 и 9 позволила получать последние с приемлемыми выходами:
Исходный диенофил Выходы продуктов реакции с диенами,%:
Циклопентадиен 8 2,3-Диметилбутадиен 9
Без кат. Znl2 Без кат. Znl2
2а, R = H 83 - 75 -
2b, R = ОМе 45 60 14 45
21, R = NO2 60,5 66,5 - 53
Соединение 8Ь, содержащее фармакофорную метокси-группу, было выбрано нами для дальнейших модификаций. Несмотря на тот факт, что аддукт 8Ь имеет высокую температуру плавления, то есть является достаточно стабильным, его декарбоксилирование не приводит к ожидаемому результату, вместо этого соединение 8Ь претерпевает ретро-реакцию Дильса-Альдера. Поэтому нами было проведено предварительное восстановление двойной связи диимидом с последующим декарбоксилированием путем кипячения в
этоксиэтаноле. Оптимизация условий реакции позволила получить соединение libe высоким выходом:
СООН
МеО.
8Ь
МеО. 1)N2H4«H;0, Н2О2
0-5°С, 4 h 2) 25°С, 12 h
CN МеО.
О EtOCH;CH;OH
2 h Д
Схема 15. Восстановление и декарбоксилирование продуктов Дильса-Альдера
Для определения конфигурации получаемых соединений были использованы данные 'Н-ЯМР-спектроскопии. В спектре "Н-ЯМР соединения lib при 2.82 м.д. был зарегистрирован сигнал протона H-C-CN с J = 4 Гц, что подтверждает эндо-конфигурацию нит-рильной группы. Для определения положения индолинового фрагмента относительно нор-борнанового был проведен эксперимент с использованием ядерного эффекта Оверхаузера (NOE).
Первоначально создание спироциклопропанового оксиндола планировалось проводить по реакции Кори-Чайковского: сложные эфиры 2 были введены в реакцию с триметил-сульфоксоний йодидом в присутствии гидрида натрия по стандартным методикам для циклопропанирования двойной связи с двумя электроноакцепторными заместителями. Однако, как оказалось, реакция метилового эфира 2-оксоиндолин-З-илиден-циануксусной кислоты с илидом серы приводит к получению сложной смеси веществ, выделить из которой продукт циклопропанирования не удалось. Тогда нами был опробован метод, базирующийся на [3+2]-циклоприсоединении диазометана к соединениям 4. Синтез проводился в присутствии 20-тикратного избытка диазометана без катализатора. Образующиеся при этом пиразолины без дополнительной очистки были сразу подвергнуты термическому разложению, спироциклопропановые производные 12a-g были получены с высокими выходами.
R = 5-Н, 5-ОМе, 5-Br, 6,7-diMe Ri = Н, Me
Схема 16. Циклопропанирование с использованием диазометана
Таблица 6. Выходы соединений, полученных по реакции циклопропанирования
№ 12а 12Ь 12с 12d 12е 12g 12j 12k
R 5-Н 5-ОМе 5-Вг 6,7-Ме 5-Н 5-ОМе 5-Br 6,7-Me
R. Н Н Н Н Me Me Me Me
Выход, 90 83 48 34 58 68 36 93
% 93* 74* 62*
(*) - выходы соединений, полученные метилированием спиро-индолин-3-илацетонитрилов.
13
В ходе работы нами, однако, было отмечено, что при введении в реакцию нитрилов 4Ь,с,<1 выходы несколько ниже, чем в случае замещенных по первому положению нитрилов. Это связано с протеканием побочных процессов, в частности расходования диазоме-тана на метилирование азота в первом положении.
Нами также было показано, что алкилирование полученных спиро-аддуктов позволяет получить нитрилы 12g и 12} с хорошим выходом.
Ме
12 b-d 12 g,j,k
Схема 17. Метилирование полученных спиропроизводных
Таким образом, нами была получена серия 2,3-дигидроспиро[индол-3,Г-циклопропан]-3'-карбонитрилов, выходы представлены в таблице.
1.4 Синтез различных 3-алкил замещенных 2-оксоиндолин-З-илацетонитрилов
Исходя из анализа литературных данных, мы предположили, что 2,3-дигидромелатонины, содержащие алкильный заместитель в третьем положении молекулы индола, потенциально являются одними из самых перспективных лигандов мелатониновых рецепторов, и причиной этого является конформационная особенность получившихся соединений: боковая ацетамидная цепь окажется выведенной и зафиксированной вне плоскости индольного ядра. Поэтому следующим этапом нашей работы была модификация нитрилов 3 по 3-му положению путем алкилирования нитрилов различными алкил-галогенидами. Нами было впервые показано, что нитрилы За и ЗЬ легко могут быть алки-лированы одновременно в 1 и 3 положение под действием метилиодида в присутствии гидрида натрия. При использовании небольшого избытка алкилирующего агента была получена смесь продуктов моно- и диалкилирования, которые были разделены методом колоночной хроматографии.
ЗЬ: Л=ОМе 13с: 1*=Н «а: К=Н
И=ОМе, 17% 13Ь:1*=ОМе, 24%
Схема 18. Неселективное алкилирование 2-оксоиндолин-Зил-ацетонитрилов
Несмотря на этот удачный эксперимент, очевидно, что селективное алкилирование по 3 положению разнообразными алкилирующими реагентами требует предварительной защиты индольного азота в первом положении.
Из ряда разнообразных защитных групп для индольного азота нами была выбрана трет-бутоксикарбонильная-защитная группа (Вос-группа). Нами впервые было показано, что в зависимости от условий проведения реакции образуется как продукт Ы-Вос-ацилирования, так и 1,3-Вос-производное.
За: R=H, 3b: R=OMe
Зр: R=H, 30% 3q: R=OMe, 49%
14p: R=H, 55%
14q: R=OMe, 10%
Схема 19. Ацилирование 2-оксоиндолин-Зил-ацетонитрилов Вос20
Разработка метода получения iV-Вос-защищенного нитрила позволила нам впервые провести селективное алкилирование 3-го положения в присутствии гидрида натрия под действием разнообразных алкилирующих агентов (схема 20).
Помимо соединений Зр и 3q, которые были получены введением защитной Вос-группы в нитрилы За и ЗЬ, в реакции алкилирования по третьему положению молекулы индола были введены нитрилы Зе-k, уже имеющие заместитель при индольном азоте. Помимо метилйодида и этилбромида в качестве алкилирующих агентов нами был также использован 2-хлорацетонитрил, что позволило получить соединения 16e,g.
2. R2Hal, 25°С --N
\
Ri
13 e-k, p-q, 15e, g, p-q, 16e, g, q
Схема 20. Алкилирование 2-оксоиндолин-Зил-ацетонитрилов
Таблица 7. Выходы соединений, полученных алкилированием 2-оксоиндолин-З-ил-
№ 13е 13f 15е 16е 13g ІЗІ 15g 16g 13j 13k 13р 15р 13q 15q 16q
R 5-Н 5-Н 5-Н 5-Н 5- ОМе 5- ОМе 5- ОМе 5- ОМе 5-Вг 6,7-Ме 5-Н 5-Н 5- ОМе 5- ОМе 5- ОМе
Ri Ме Вп Ме Ме Ме Вп Ме Ме Ме Ме Вое Вое Вое Вое Вое
R2 Ме Ме Et СН2 CN Ме Ме Et СН2 CN Ме Ме Ме Et Ме Et СН2 CN
% 56 57 15 90 40 45 62 20 68 38 50 20 27 16 19
Таким образом, предложенный метод является удобным и достаточно универсальным для синтеза индолин-3-илацетонитрилов 3, замещенных по разным положениям молекулы индола. Используя данный метод, можно вводить различные заместители как в бензольное кольцо молекулы индола, так и в первое положение на стадии синтеза изатина. В результате дальнейших превращений по схеме могут быть получены непредельные индо-лин-3-илацетонитрилы 4, которые открывают путь к синтезу спироциклических производных. На стадии индолин-3-илацетонитрила могут быть введены различные алкильные заместители в третье положение молекулы индола, а также произведена замена кислорода во
втором положении на галогены и серу. Кроме того, данный метод позволяет по мере необходимости вводить защитные группы к атому азота в первом положении на разных стадиях синтеза. В результате нами был получен ряд разнообразных 2-оксоиндолин-З-илацетонитрилов, которые могут быть превращены в новые перспективные лиганды мела-тониновых рецепторов.
2. Синтез новых производных мелатонина
Боковая цепь в третьем положении молекулы индола, содержащая ацетамидную группу, является фармакофорной и крайне важна для аффинности соединения к МТ1 и МТ2-подтипам мелатониновых рецепторов. Поэтому важной частью данной работы стала разработка различных методов восстановления нитрильной группы и ацилирование получившегося амина.
В рамках данной работы нами было разработано три различных метода восстановления индолин-3-илацетонитрилов. Метод А и Метод В позволяют получать различные 2-оксо-производные, метод С - 2,3-дигидро-производные.
А/В
Схема 21. Две стратегии восстановления нитрильной и оксоиндолиновой групп
2.1 Синтез 2-замещенных производных мелатонина методом селективного восстановления нитрильной группы
Для селективного восстановления нитрильной группы нами было разработано два метода: гидрирование в мягких условиях водородом на катализаторе Адамса с одновременным ацилированием получающегося амина (метод А) и восстановление боргидридом натрия в присутствии безводного хлорида никеля (метод В).
Первый метод был опробован нами для восстановления нитрилов ЗЬ и содержащих ацетамидную группу 31 и Зо. В описанных условиях были получены 2-оксомелатонин 17Ь и потенциальные лиганды МТ3-подтипа мелатониновых рецепторов: соединения 171, 17о.
ЗЬ: И=ОМе, Н,=Н 17Ь: Я-ОМе, Н,-Н, 86%
31:1*=М1Ас, Я,=11 171: К=М1Ас, 11,«Н, 33%
Зо: 1»=№1Ас, Н,=ОН 17о: И-.-ШАе, II,»ОН, 80%
Схема 22. Селективное восстановление нитрильной группы под действием водорода на катализаторе Адамса
Преимуществами данной схемы являются довольно высокие выходы и отсутствие побочных продуктов, недостатками - невозможность варьирования ацилирующих агентов, сложности технического характера, возникающие при работе с водородом, а также ограни-
ченность применения. Так, например, невозможно получить 2-хлормелатонин в этих условиях - происходит дегалогенирование и образование сложной смеси продуктов.
В случае 2-галогензамещенных производных успешным оказался метод восстановления нитрилов, в котором восстанавливающим агентом является боргидрид натрия в присутствии безводного хлорида никеля (метод В).
ШС( 0)Л
-СИ
МеО^ Л Ме°>
ИаВНд. N¡012^, > (КС0)20, МеОН, 25°, 72Ь.
5Ь 18Ь: К=Ме, 67%
20Ь: И=Е1,15%
Схема 23. Синтез 2-хлормелатонина
К достоинствам данного метода следует отнести возможность варьирования ацили-рующего агента. Из анализа литературы следует, что варьирование остатка карбоновой кислоты в боковой цепи производных мелатонина позволяет увеличить связывание с активным центром рецептора, поэтому нами было проведено восстановление нитрильной группы с использованием боргидрида натрия в присутствии пропионового ангидрида в качестве ацилирующего агента.
Метод восстановления нитрильной группы боргидридом натрия был нами также опробован и для соединений ЗЬ и Целевые 2-оксомелатонины были также получены в данных условиях, хотя и с меньшим выходом, чем при гидрировании на катализаторе Адамса (38% против 86%):
ЫНАс
МеО.
СЫ
МеО.
№ВНа, МеОЦ №С12, АС20, 72Ь.
22-38%
ЗЬ: І*=К!=Н 17Ь: І^І^Н
13»: Я=Ві=Ме 17Й: К=Иі=Ме
Схема 24. Селективное восстановление нитрильной группы под действием боргидрида натрия в присутствии хлорида никеля
По-видимому, низкие выходы связаны с возможной координацией борида никеля по атому кислорода амидной группы. Это предположение подтверждает тот факт, что восстановление 5-ацетамидонитрилов Зо, Зп, Зт, содержащих несколько амидных групп, даже в присутствии больших избытков боргидрида натрия и хлорида никеля не происходит.
-СИ
Ас
ЫаВН4, МеОН / №С12, АС20, 72Ь. /
Я-НОН
Схема 25. Попытка селективного восстановление нитрильной группы боридом никеля в присутствии ацетамидных групп
АсШ
2.2 Синтез 2,3-дигидропроизводных мелатонина методом одновременного восстановления нитрильной и амидной групп
С целью синтеза 2,3-дигидро-производных мелатонина вначале нами было опробовано восстановление нитрилов 3 под действием алюмогидрида лития в среде тетрагидро-фурана, однако в результате реакции была выделена сложная смесь продуктов.
Альтернативой данному методу стало восстановление нитрила 3 избытком боргид-рида натрия в присутствии йода в сухом тетрагидрофуране. Реакция протекает за несколько часов, однако, помимо 2,3-дигидромелатонина (21) в данных условиях идет ароматизация индольного цикла (21'), что затрудняет выделение продукта реакции и понижает выход. Нами также было опробовано восстановление в данных условиях нитрилов 4, содержащих двойную связь, и было обнаружено, что данная система восстанавливает все функциональные группы в молекуле, однако снова получаются оба продукта восстановления (21 и 21').
Схема 26. Одновременное восстановление амидной и нитрильной групп
Однако, возможность спонтанной ароматизации отсутствует в случае восстановления (индолин-З-ил)ацетонитрилов, содержащие заместитель (в том числе цикл) в третьем положении молекулы индола и защищенный атом азота в первом положении. Восстановление подобных нитрилов приведет к перспективным лигандам МТ| и МТ2 подтипов мела-тониновых рецепторов.
1. ЫаВН4/12/ тнг, 2 Ь
2. геЯих, 10-20 Ь
3. АС20, СН2С12, 12 Ь
ЫНАс
11|=Ме, Вп
Я - 5-Н, 5-ОМе, 5-Вг, 6,7-Ме Яг» Ме, ГЦ
СМ
N \
Мс
1- ЫаВН4/12/ ТНИ, 2 Ь
2. геЯих, 10-20 Ь
3. АсгО, СН2С12, 12 Ь
ЫНАс
Я - 5-Н, 5-ОМе, 5-Вг, 6,7-Ме
Схема 27. Одновременное восстановление амидной и нитрильной групп в 3-замещенных производных
Так, в результате восстановления 3-замещенных (2-оксоиндолин-З-ил)ацетонитрилов 12, 13 и 15 были выделены новые перспективные 2,3-дигидропроизводные мелатонина.
Таблица 8. Выходы 2,3-дигидроиндольных производных мелатонина
№ 22е 24е 22f 22g 23 g 22i 22j 22k 25e 25g 25j 25k
R= 5-Н 5-Н 5-Н 5-OMe 5-OMe 5-OMe 5-Br 6,7-Me 5-H 5-OMe 5-Br 6,7-Me
ri= Me Me Bn Me Me Bn Me Me Me Me Me Me
r2= Me NHAc Me Me Et Me Me Me c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr
Выход, % 39 67 51 72 - 77 - 56 76 77 - 35
В рамках изучения этой реакции нами было обнаружено интересное превращение защитной N-Boc-группы. В данных условиях происходит ее восстановление, и в результате введения в реакцию нитрила 13р нами было выделено соединение 22е.
CN
1.NaBHt/ty THF, 2 h
2. reflux, 10-20 h
3. Ac20, CH2C12, 12 h
NHAc
22e
R = 5-Н
Схема 28. Восстановление Вос-группы под действием боргидрида натрия и йода
Метод одновременного восстановления оказался непригодным в случае нитрилов Зп,ш, содержащих ацетамидную группу в пятом положении, а также 2-хлорнитрила 5Ь. Во всех этих случаях в результате реакции нами были выделены исходные соединения.
3 Изучение биологической активности новых производных мелатонина
Заключительным этапом нашей работы стало исследование аффинности синтезированных нами производных мелатонина по отношению к мть мт2 и мт3 подтипам мела-тониновых рецепторов, а также изучение антиглаукомной активности in vivo.
Исследования аффинности по отношению к МТ( и МТ2-подтипам мелатониновых рецепторов проводились методом конкурентного ингибирования с использованием 2-[125]-йод-мелатонина в качестве радиолиганда на СНО-К1 клетках, содержащих рекомби-нантные MTi и МТ2 мелатониновые рецепторы человека. Было изучено связывание 2-
оксомелатонина (17Ь) и 2-хлормелатонина (18Ь) в сравнении с мелатонином (МЬТ) и известным антагонистом МТ2-подтипа 4-фенил-2-пропионамидотетралином (4-Р-РООТ). Данные связывания представлены в таблице 9:
Таблица 9. Изучение связывания с МТ1/МТ2 подтипами мелатониновых рецепторов
КНАс ШАс МНАс
»«Ч^Ч^Т Мео.
1 Т >=о Т ТУ-а
ХО Орг™Г
Соединение МТ, мт2
1С50 К" 1С50 К;
18Ь 0.138 пМ 0.0716 пМ 0.338 пМ 0.176 пМ
17Ь >1 цМ >1 цМ 0.268 цМ 0.139 цМ
МЬТ 0.527 пМ 0.274 пМ - -
4-Р-РПОТ - - 0.497 пМ 0.258 пМ
ингибирования, или концентрация конкурентного лиганда, при которой он связывается с половиной мест связывания, имеющихся на реакционном субстрате.
Данные результаты подтвердили гипотезу о ведущей роли заместителя во 2-ом положении молекулы мелатонина в связывании с мелатониновыми рецепторами. Так, оксо-индолин 17Ь является низкоаффинным лигандом рецепторов МТ2 подтипа, в то время как связывание с МТ, подтипом отсутствует. В то же время 2-хлормелатонин (18Ь) обладает большим сродством к МТ, рецептору, чем сам мелатонин. Кроме того, его связывание с МТ2-подтипом примерно в 3 раза хуже, чем с МТгподтипом рецептора, что говорит о некоторой селективности его действия. В настоящее время связывание с МТ! и МТ2 подтипами исследуется радиолигандным методом и для других синтезированных нами соединений.
Поскольку в ряде современных работ постулируется тождественность мелатонино-вого рецептора МТ3 подтипа и фермента хинон-редуктазы 2, нами была изучена ингиби-рующая способность по отношению к МТз-подтипу мелатониновых рецепторов на хинон-редуктазе 2. Исследования проводились спектрофотометрическим МТТ методом, результаты для веществ, показавших наибольшую активность в сравнении с мелатонином, представлены в таблице 10.
Таблица 10. Изучение ингибирования хинон-редуктазы 2
ННАс /НАС КНАс
31: Я=Н Зш: Я-Мг
I
Ме
Соединение Зш 18Ь 31 171 21'Ь МЬТ
1С50 (ЦМ) 7 13 13 20 5,7 72
Условия измерения: [МТТ] = 200цМ, [хинон-редуктаза] = 0,.015цМ. рН=8, длина волны -*1С50 -концентрация вещества, необходимая для 50% ингибирования активности энзима
612пш.
Таким образом, нами впервые показано, что наличие ацетамидной группы в пятом положении молекулы индолина положительно сказывается на связывании с хинон-редуктазой 2 (мелатониновым рецептором МТ3 подтипа). Соединение Зш, обладающее ин-гибирующей активностью, более чем в 10 раз превышающей активность мелатонина, не содержит ацетамидоэтильную группу, таким образом можно предположить, что ее присутствие в лиганде не является обязательным для аффинности к МТ3 подтипу рецепторов. В то же время проведенное нами рентгеноструктурное исследование комплексов Зш, 171 и 18Ь с хинон-редуктазой 2 (см. рис 3.) показало, что 2-оксоиндолиновая группа обеспечивает дополнительное связывание с активным сайтом фермента.
А) разрешение 2.30-2.34 А
С) разрешение 2.30 - 2.34 А
Щрж
§<36 і
Рис. 2 Комплексы соединения А) Зт, В) 171 и С) 18Ь с хинон-редуктазой 2.
Достоверно известно, что активация мелатониновых рецепторов глаза дает начало сигнальному каскаду, вызывающему снижение внутриглазного давления, что очень важно
для профилактики и терапии глаукомы. Однако, принцип гипотензивного действия самого мелатонина и роль мелатониновых рецепторов в регуляции офтальмотонуса и в физиологии глаза до конца не изучены. Поэтому нами было проведено изучение действия полученных нами соединений и на другую молекулярную мишень, ответственную за гипотензивный эффект. Так, исследования ингибирующей способности самого мелатонина и полученных нами соединений 3l,m,n,j; 17b,I,о; 2а,е, 18Ь по отношению к ангиотензинпре-вращающему ферменту, вызывающему сужение сосудов, показали, что все они не активны при концентрациях вплоть до 1 мкМ. В настоящее время совместно с НИИ им. Гельмголь-ца проводится изучение влияния полученных нами соединений на офтальмотонус in vivo.
Выводы
1. Разработана общая стратегия синтеза замещенных по различным положениям (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов, ключевой стадией которой является конденсация изатинов с циануксусной кислотой: (а) разработана методология модификации по второму положению, (б) создан эффективный синтетический протокол алкилирова-ния по 3-му положению, (в) найдены новые реакции циклоприсоединения в ряду (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов.
2. Найден новый тип конденсации Кневенагеля для случая нитроизатинов.
3. Разработан оригинальный метод восстановления нитроизатинов в 2-ацетамидные производные, потенциальные лиганды МТ3 подтипа мелатониновых рецепторов.
4. На основе разработанной стратегии осуществлен структурный дизайн потенциальных физиологически активных (2-оксоиндолин-3-ил)ацетонитрилов , создана библиотека из новых 50 соединений.
5. Разработано три метода восстановления нитрильной группы с ее одновременным ацилированием, определены субстратные ограничения для каждого из методов.
6. Разработан универсальный препаративный метод синтеза самых разнообразных производных мелатонина, создана серия из 22 соединений.
7. Изучена активность новых производных мелатонина по отношению к MTi/MT2 и МТз-подтипам мелатониновых рецепторов. Получены принципиально новые результаты о соотношении структура-активность для лигандов МТ3 рецепторов
Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:
1. Volkova Maria S., Jensen Katherine С., Lozinskaya Natalia A., Sosonyuk Sergey E., Proskurnina Marina V., Mesecar Andrew D., Zefirov Nikolay S. Synthesis of novel MT3 receptor ligands via an unusual Knoevenagel condensation. // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22, 24, 7578-7581.
2. Lozinskaya Natalia A., Sosonyuk Sergey E., Volkova Maria S., Seliverstov Michael Yu, Proskurnina Marina V., Bachurin Sergey E., Zefirov Nikolay S. Simple Synthesis of Some 2-Substituted Melatonin Derivatives. И Synthesis, 2011, 2, 273-276.
3. Volkova M.S., Lozinskaya N.A., Sosonyuk S.E., Proskurnina M.V., Zefirov N.S Synthetic approach to novel melatonin derivatives. Сборник тезисов Первая Российская конференция по медицинской химии (MedChem Russia - 2013), Москва, 2013, С. 212.
4. Volkova Maria, Lozinskaya Natalia, Sosonyuk Sergey, Proskurnina Marina, Zefirov Niko-lay.Synthetic approach to novel melatonin receptor ligands. International symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry (ASMC), Moscow, 2013, p.73.
5. Volkova M.S., Lozinskaya N.A., Sosonyuk S.E., Proskurnina M.V., Zefirov N.S Simple approach to synthesis of 2,3 -substituted melatonin analogs. 15th RSC-SCI Medicinal Chemistry Symposium, 2009, p. 123.
6. Волкова M.C. Простой путь синтеза производных мелатонина. Сборник тезисов XVI Международной конференции «Ломоносов-2009», Москва, 2009, с. 25.
7. Lozinskaya N.A., Sizan О.Е., Volkova M.S., Proskurnina M.V., Zefirov N.S. Simple approach to synthesis of 2-substituted melatonin analogs. XX International Medicinal Chemistry Symposium, Vienna, Austria, 2008, p 297.
8. Волкова M.C. Подход к синтезу 2-замещенных производных мелатонина. Сборник тезисов «XVIII Менделеевский конкурс студентов-химиков 2007-2008 гг.», Белгород, 2008, с.60-61
9. Lozinskaya N.A., Sizan О.Е., Volkova M.S., Proskurnina M.V., Zefirov N.S. Simple way to synthesis of 2-substituted melatonin analogs. International conference on organic chemistry, Erzurum, Turkey, ICOC-2007, p 97.
ДЛЯ ЗАМЕТОК
Формат 60x90/16. Заказ 1736. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА
Химический факультет
04201450371
Волкова Мария Сергеевна
СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ЛИГАНДОВ МЕЛАТОНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
02.00.03 — органическая химия 02.00.16— медицинская химия
На правах рукописи
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научные руководители: Академик РАН, профессор, д.х.н. Зефиров Николай Серафимович ассистент, к.х.н. Лозинская Наталья Александровна
?
Москва — 2013
Содержание
ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................3
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..................................................................................................................4
2.1 Медицинские аспекты химии мелатонина и его аналогов............................................................................4
2.2 Модификация различных положений индольного фрагмента.....................................................................9
2.3 Биоизостерическая замена индольного фрагмента.....................................................................................31
2.4 Структура и активность разнообразных лигандов МТ3-подтипа мелатониновых рецепторов..................61
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.....................................................................................................76
3.1 Синтез исходных циан(2-оксоиндолин-3-илиден)уксусных кислот............................................................78
3.2 Синтез различных замещенных индолин-3-илацетонитрилов....................................................................82
3.3 Синтез новых производных мелатонина....................................................................................................100
3.4 Изучение биологической активности новых лигандов мелатониновых рецепторов...............................111
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..............................................................................................122
Синтез исходных изатинов (1)...........................................................................................................................122
Синтез циан(2-оксоиндолин-3-илиден)уксусной кислоты (2)..........................................................................128
Синтез (2-оксо-ЗН-индол-3-илиден)ацетонитрилов (4)....................................................................................133
Синтез (2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индолин-3-ил)ацетонитрила (3).....................................................................137
Синтез 2-гетерозамещенных индолин-3-илацетонитрилов............................................................................142
Синтез 3-алкил замещенных ацетонитрилов (13-16).......................................................................................144
Синтез 5-ацетамидо-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-3-ил-производных (l,m,n,o)...........................................155
Синтез спироциклических производных индолин-3-илацетонитрилов (8-12)...............................................158
Синтез новых производных мелатонина..........................................................................................................169
Спектрофотометрическое изучение ингибирования хинон-редуктазы 2.......................................................181
5. ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................183
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................184
Введение
Гормон мелатонин (5-метокси-3-(2-(ацетиламино)этил)индол) играет ключевую роль в регуляции циркадных ритмов в организме млекопитающих, в том числе и человека [1, 2]. Помимо того, что мелатонин регулирует цикл сна-бодрствования, он также оказывает влияние на деятельность иммунной, сердечнососудистой и репродуктивной систем [3]. Мелатонин и его аналоги проявляют гипотензивные [4], антидепрессантные [5], антиоксидантные [6, 7] и нейропротекторные свойства [8]; низкий уровень мелатонина напрямую связан с риском раковых заболеваний [9].
В настоящее время во многих странах выпускаются препараты мелатонина, которые зарегистрированы или в качестве лекарств, или как БАД [10]. Так, например, лекарственная форма мелатонина - мелаксен является препаратом выбора для лечений нарушений сна у больных с нарушением мозгового кровообращения, применяется при комплексной противоопухолевой терапии, лечении артериальной гипертензии и нейродегенеративных заболеваний. Более широкому внедрению мелатонина в медицинскую практику препятствует его быстрый метаболизм в организме, особенно в светлое время суток, а также неселективность его действия, связанная с наличием в организме многочисленных сайтов связывания мелатонина. Так, у млекопитающих выделяют 3 подтипа мелатониновых рецепторов: трансмембранные СРСЯ рецепторы МТ1 и МТ2, и низкоаффинный МТ3 рецептор, согласно некоторым исследованиям представляющий собой фермент -хинонредуктазу 2 [11]. Кроме того, мелатонин способен связываться с ядерными рецепторами подсемейства ЯОКЛ^Я. Несмотря на многочисленные исследования вопрос, какие именно физиологические функции мелатонин регулирует через каждый из этих рецепторов, до сих пор остается открытым.
Учитывая большой потенциал селективных лигандов мелатониновых рецепторов, разработка подхода к синтезу новых производных мелатонина, получение новых лигандов мелатониновых рецепторов различных подтипов и изучение их активности является актуальной задачей.
Целью нашей работы являлась разработка общей стратегии синтеза разнообразных лигандов мелатониновых рецепторов МТЬ МТ2 и МТ3; синтезе ряда новых аналогов мелатонина, содержащих 2,3-дигидроиндольный фрагмент; изучение активности полученных соединений в качестве ингибиторов хинон-
редуктазы 2 и лигандов мелатониновых рецепторов МТ1 и МТ2 подтипов.
3
2. Литературный обзор
2.1 Медицинские аспекты химии мелатонина и его аналогов
Мелатонин синтезируется в эпифизе человека в темное время суток и
участвует в регуляции большого числа физиологических процессов [12, 13]. Основная функция мелатонина - регуляция цикла сна-бодрствования [14, 15]. Помимо этого, в частности, доказано, что мелатонин проявляет выраженные нейропротекторные свойства: его способность ингибировать образование амилоидных фибрилов позволяет рассматривать его как перспективное средство борьбы с болезнью Альцгеймера [16, 17, 18, 19]. Кроме того гибриды мелатонина с другими нейропротекторами, например, с такрином, являются эффективными ингибиторами ацетилхолинэстеразы, с пикомолярной концентрацией полумаксимального ингибирования (1С5о) [20]. Сам такрин известен как один из стандартов ингибирования ацетилхолинэстеразы и нейропротекторный препарат [21].
Хотя основной механизм действия мелатонина связан с его взаимодействием с соответствующими рецепторами, мелатонин также играет важную роль как антиоксидант [22, 23, 24]. В организме он окисляется необратимо, что не позволяет другим антиоксидантам (таким, как витамин С) действовать в качестве про-оксиданта, генерируя свободные радикалы. Как антиоксидант мелатонин также способен облегчать состояние при паркинсонизме [25], препятствовать возникновению сердечной аритмии [26, 27]. Противораковая активность мелатонина связана с его способностью интеркалировать в ДНК и тем самым ингибировать деление раковых клеток [28]. Уровень мелатонина, таким образом, оказывается напрямую связаным с риском раковых заболеваний.
Новейшие исследования показали, что депрессивные состояния тесно связано с циркадными ритмами [29] и интенсивное изучение антидепрессантной активности мелатонина и его аналогов [30, 31] показало перспективность этого направления. Мелатонин, кроме того, играет роль стресспротектора [32, 33], поскольку стимулирует синтез соответствующих энзимов (супероксид дисмутазы, глюкотион пероксидазы и глюкотион редуктазы). Последнее обстоятельство позволяет рассматривать его как перспективное лекарственное средство для борьбы с ишемией
[34]. Кроме того, аналоги мелатонина могут являться регуляторами артериального давления [4]. Также известно, что мелатонин играет важную роль в регуляции метаболизма холестерина [36] и может улучшать иммунный статус человека [37]. Есть данные о противовоспалительном и обезболивающем действии мелатонина [7, 38]. Интересен также тот факт, что с возрастом уровень мелатонина в организме снижается, поэтому мелатонин может также использоваться как маркер старения [39, 40].
Однако разнообразный спектр действия и, как следствие, наличие побочных процессов препятствуют широкому использованию мелатонина в клинической практике. Вероятно, низкая селективность действия в случае мелатонина вызвана его способностью связываться сразу с несколькими типами рецепторов.
В 1990-х годах открыто, что существует два подтипа мелатониновых рецепторов млекопитающих: выделенный и описанный в 1994 году МТ] (прежнее название - Mella), описанный в 1995 году - МТ2 (прежде - Mellb) [41]. Оба подтипа относятся к трансмембранным рецепторам. Кроме того, позже был найден третий подтип мелатониновых рецепторов МТз, позже идентифицированный как мелатонин-чувствительная форма энзима хинон-редуктаза 2 [42].
2.1.1 Строение и функции МТ¡/МТ2-подтипов мелатониновых рецепторов
Известно, что физиологическое действие мелатонина связано с активацией мелатониновых рецепторов в соответствующей ткани организма [43]. Мелатониновые рецепторы принадлежат к A-семейству (родопсин-семейству) G-протеин-связующих рецепторов (GPCRs) и являются внутримембранными рецепторами [11, 44]. На данный момент известно, что активация MTt подтипа, преимущественно локализованого в головном мозге, регулирует циркадные ритмы [45, 46], кроме того, известно, что селективные агонисты данного подтипа облегчают состояние пожилых людей, перенесших инсульт [47]. При этом МТ2 подтип также отвечает за регуляцию циркадных ритмов [48], а кроме того влияет на выброс допамина в глазной сетчатке [49, 50]. Однако до конца роль каждого из этих рецепторов не выяснена [51, 52]. Поэтому необходим поиск аналогов мелатонина, обладающих селективным направленным действием, при этом важен не только поиск агонистов, но и антагонистов мелатонина. Антагонисты, блокируя
5
мелатониновые рецепторы, сокращают ночной период, что особенно важно в случае сезонозависимых сельскохозяйственно значимых животных, для которых таким образом происходит имитация летней ночи с соответствующими сезонными изменениями [53]. Кроме того, ряд антагонистов MTi/MT2 подтипов проявляет выраженные антидепрессантные свойства [54, 55].
Выделение рецепторов, локализованных в мембранах, в чистом виде и изучение их трехмерной структуры методом рентгеноструктурного анализа представляет собой весьма сложную задачу, которая в случае мелатониновых рецепторов до сих пор не была решена. В связи с этим поиск новых селективных лигандов для этих рецепторов обычно осуществляется одним из следующих способов: а) вариативный синтез различных модифицированных аналогов мелатонина и изучение их связывания с рецептором (опубликовано несколько обзоров афинных лигандов, например [56, 57]) и б) компьютерное молекулярное моделирование центров связывания рецептора на основании набранных статистических данных [63].
Начиная с 90-х гг XX в. начинают бурно развиваться исследования, направленные на синтез и поиск перспективных лигандов мелатониновых рецепторов. К сожалению, на начальном этапе этих исследований еще не существовало какой-либо строгой системы стандартов. Изучение связывания с мелатониновыми рецепторами проводилось на самых разнообразных тканях: срезах куриного мозга и сетчатки, клетках Xenopus melanophores [58], на кроличьей сетчатке, срезах pars tuberalis мозга овец и пр. С открытием двух подтипов мелатониновых рецепторов (МТ, и МТ2) интерпретировать более ранние данные по афинности стало еще сложнее. С изобретением возможности клонирования каждого из подтипов рецепторов в СНО или НЕК293 клетках, Дубокович с коллегами разработала универсальный тест на селективное связывание с каждым из подтипов, основанный на радиолигандном методе с использованием меченного по атому йода 2-йодмелатонина [59]. В настоящее время именно этот тест используется в качестве основного стандарта. Кроме того, существует тест для определения профиля активности (агонистическая-антагонистическая), также относящийся к
35
радиолигандным методам, с использованием гуанозин-5'[у- SJ-трифосфата [60].
Тем не менее, ранние исследования также важны, т.к. данные об агонистической и антагонистической активности соединений имеют самостоятельную ценность, поэтому в данном обзоре мы приведем все данные о модификациях, представляющих интерес с точки зрения афинности к мелатониновым рецепторам.
На настоящий момент имеется ряд достоверных моделей МТ1/МТ2 подтипов мелатониновых рецепторов [61, 62, 63]. В этих моделях определены аминокислоты, образующие каждую из семи трансмембранных а-спиралей, и получена конфигурация внеклеточных гидрофильных петель. Таким образом, в настоящее время в литературе имеется оптимизированная трехмерная модель мелатониновых рецепторов и определены основные сайты связывания данных рецепторов, а именно Н1з195, 8ег110 и 8ег114 (номера аминокислот в белковой последователности рецептора). Это позволило авторам работ [61, 62, 64, 65] определить основные пути, по которым можно будет проводить синтетический дизайн молекулы мелатонина и осуществить докинг лигандов в основные сайты рецептора:
• Введение фенильной группы к атому азота индольного фрагмента невыгодно из-за отталкивания от А1а252(265), Ьеи254(267), Тгр251(264). Последнее было подтверждено экспериментально [64].
• Метокси-группа является необходимой для связывания с рецептором, что подтверждено также и экспериментально. Так, даже замена метокси-группы на этокси-группу приводит к резкому снижению аффинности.
• Введение заместителей во второе положение индольного фрагмента повышает аффинность по отношению ко второму подтипу мелатониновых рецепторов (МТ2). В связи с этим соединения с лабильными группами в а-положении к атому азота индольного фрагмента открывает путь к новым перспективным модификациям [65].
Рис 2.1. Лиганды мелатониновых рецепторов, использующиеся в клинической практике
ЫНАс
>4НАс
ЫНАс
МеО.
МеО.
МеО.
ЫНАс
мелатонин 2,3-ДИГидромелатонн
(1) (2) И (МТ,)= 0,0823 - 0,45пМ К1(МТ2)= 0.31-0,53 пМ
ЕЮОШ
агомелатонин
(3)
И (МТ^ОЛпМ К1(МТ2)=0,12ПМ
лузиндол (4)
тасимелтеон (5)
Ю (МТ,)=0,35пМ И(МТ2)=0,17ПМ
Анализ структур известных эффективных лигандов мелатониновых рецепторов (рис. 2.1) также позволяет выдвинуть следующие предположения:
• Модификация ацетамидоэтильного фрагмента может привести как к увеличению афинности, так и к ее снижению в зависимости от размеров введенного заместителя. Так, замена ацетильной группы на пропионильную или циклопропильную приводит к увеличению афинности, но при дальнейшем увеличении длины цепи связывание с рецептором резко ухудшается [66, 67, 68].
• Введение небольшого заместителя в первое положение молекулы индола (например, метальной группы) может увеличить константу связывания преимущественно с МТ2-подтипом за счет гидрофобных взаимодействий [69]. Однако объемные заместители, такие как замещенный фенильный, существенно снижают аффинность [70].
• Индольный атом азота непосредственно не участвует в связывании с активным центром рецептора, что дает возможность проводить биоизостерическую замену индольного фрагмента на нафталин и бензофуран с сохранением высокой аффинности (см. рис 2.1) [66].
Несмотря на то, что известны удачные с точки зрения афинности модификации молекулы мелатонина по бензольному кольцу индольной системы,
можно предположить, что именно модификация по 5-членному циклу молекулы индола является наиболее перспективным путем для синтеза селективных аналогов мелатонина. Одна из простейших подобных модификаций - 2,3-дигидромелатонин 2 (см. рис. 2.1) - является хорошим антиоксидантом и клинически применяемым нейропротектором [71, 72]. Другие подобные модификации далее будут рассмотрены более подробно.
2.2 Модификация различных положений индольного фрагмента
Хотя индольный цикл не является необходимым для обеспечения связывания с активным центром мелатониновых рецепторов, наиболее широко изученными и перспективными были и остаются модификации, связанные с индольным циклом мелатонина.
Очевидно, что при изучении соотношения структура-активность для различно-замещенных аналогов мелатонина встает задача введения заместителей в различные положения молекулы индола. Общая тенденция сводится к синтезу разнообразных индолов с последующим введением в молекулу индола ацетамидной группы путем восстановления производных 3-(2-нитроэтил)индола или 3-цианометилиндола.
Производные с нитрогруппой получают либо по реакции соответствующего индола с 2-(диметиламино)нитроэтиленом [73, 74], либо по реакции Анри формилиндола с нитрометаном [75] (схема 2.1). Нитрильные прекурсоры образуются при алкилировании индола галогенацетонитрилом [76], палладий-катализируемым замыканием цианоамидинов [77] или по реакции Кнёвенагеля 3-оксоиндолов с циануксусной кислотой [78] (схема 2.2).
сно
Схема 2.2
я
\ 1*1
2.2.1 Модификация индольного фрагмента по положению 1 Одной из широко применяемых модификаций молекулы мелатонина является введение заместителя к индольному атому азота; некоторые из соединений подобного рода проявляют антидепрессантную активно�
