СИНТЕЗ И СВОЙСТВА НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 8-АЗАПУРИНА тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 8-АЗАПУРИНА

02.00.10 — Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре органической химии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Научный руководитель кандидат химических наук О.Г. Родин

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор Г.В. Аврамснко, доктор биологических наук, профессор П.Б. Курапов

Ведущая организация - Институт физиологически активных вешеств РАН

Зашита диссертации состоится июня 2004 г в ^ часов на ¡аседании

диссертационного совета К 220 043 04 по присуждению ученой степени кандидата химических наук при Московской сечьскохозяйственной академии имени К Тимирязева по адресу 127550, Москва, Тимирязевская ут , 49

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА Автореферат разостан « 23 » мая 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета МСХА,

кандидат химических наук

Г.П. Токмаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Настоящее исследование связано с поиском и направленным синтезом новых биологически активных веществ, являющихся азааналогамн пуринов — важнейшего класса азотистых оснований. Работа посвящена химии 8-азапурина (1,2,3-триазоло[4,5-<1]пиримидинов), поскольку изоструктурные лекарственные препараты на основе пурина (ацикловир, цитовен) обладают широким спектром биологической активности.

Несмотря на то, что первые синтетические работы появились уже в 50-х годах XX века, химия 8-азапурина получила свое второе рождение лишь в конце 80-х в работах итальянских ученых с открытием принципиально нового подхода к синтезу системы 8-азапурина исходя из 1,2,3-триазолов. Такой подход позволил модифицировать положения 2 и 9, однако периферия описанных в литературе соединений не выходит за рамки тривиальных заместителей. Биологические исследования 8-азапуринов показывают, что наиболее активными являются соединения, содержащие в положении 9 заместитель бензильного типа, что связано с возможностью их ферментативного расщепления в организме с образованием структур, аналогичных по своему химическому строению аденину, гипоксантину и другим азотистым основаниям. Сообщается, однако, что такие соединения достаточно гидрофобны и имеют низкие показатели растворимости в воде (кщв,,,). Сведения о 6-функциональнозамещенных 8-азалуринах крайне отрывочны. Интерес представляет введение в положение б 8-азапурина различных фармакофорных заместителей, а также синтез 6-С-замещенных 8-азапуринов, пуриновые аналоги которых проявляют противоопухолевую и антивирусную активность. Более того, такие соединения интересны как биологические зонды для установления механизма взаимодействия с ферментами. Особый интерес представляет собой синтез аннелированных трициклических структур на основе 8-азапурина, единичные представители которых проявляют чрезвычайно высокую биологическую активность в качестве ингибиторов А| и Аг подтипов аденозиновых рецепторов и обладают противоаллергическими свойствами. Совокупность этих обстоятельств делала актуальной проблему систематического подхода к синтезу разнообразных 8-азапуринов, содержащих в положении 9 заместитель бензильного типа, в положении 2 - заместитель алкильного типа, в положении 6 - связь С(6)-элемент (С, N. О, Б), как потенциально активных соединений.

Цель работы. Целью диссертационного исследования является:

- синтез новых производных 8-азапурина, содержащих в положении 9 заместитель бензильного типа, а также имеющих разнообразные фармакофорные заместители в положениях 2 и 6, в том числе повышающие растворимость данного класса веществ,

- синтез новых трициклических систем на основе 8-азапурина

2 Установление детального строения всех новых веществ

3 Оценка биологической активности новых 8-азапуринов с помощью виртуального и реального биологического скрининга

Научная новизна и практическая ценность. Разработан удобный подход к синтезу потенциально биологически активных производных 8-азапурина, содержащих в положении 9 заместитель бензильного типа, в положении б - связь С(6) - элемент (С, N. О, S) В качестве исходных веществ испотьзованы простые и доступные бензилгалогениды, цианаиетамид и эфиры карбоновых кислот

Изучены пути распада молекут 8-азапурин-6-онов под действием этектронного удара Установлены общие закономерности распада, на основе которых предсказаны наиболее вероятные пути метаболизма соединений такого типа в живом организме

Предложен новый способ синтеза трициклических структур на основе 8-азапурина, основанный на взаимодействии арил- и гетарид- тетразолов с 6-хлор-8-азапуринами, и проведено изучение устойчивости таких систем по отношению к различным восстановителям Показано, что применение диборана в качестве восстановителя приводит к разрушению 8-азапуринового фрагмента и образованию производных 5-амино-1,2,3-триазола, ранее не описанных в литературе

Проведено всестороннее изучение структуры всех соединений с использованием современных физико-химических методов ЯМР'Н, ЯМР13С, ЯМР'Н 2D NOESY, ЯМР'Н-|5Ы HSQC, LC/MS, установлено их геометрическое строение Показано, что 6-оксо и 6-тиозамещенные 8-азапурины находятся в амидной (тиоамидной) форме, 6-карбозамещенные 8-азапурины - в илиденовой

Проведен виртуальный скрининг всех синтезированных соединений по схеме LBD (Ligand-Based Design) и TBD (Target-Based Design) с помощью лицензионной программы SYBIL 6 9, а также биологические испытания in vitro некоторых 6-аминозамещенных 8-азапуринов Выявлена потенциальная активность ряда соединений по отношению к различным подтипам аденозиновых, серотониновых и дофаминовых рецепторов, а также по отношению к тирозиновым и серин-

треониновым типам киназ и найдены вещества, обладающие сродством к дофаминовым и серотониновым рецепторам.

Публикации и апробация работы. Результаты диссертационного исследования были представлены на международной конференции по комбинаторной химии: Second International Conference on Multi Component Reactions, Combinatorial and Related Chemistry (Genova, Italy, 2003).

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы I доклада.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез 2-алкил-9-бензил-8-азапурин-6-онов

Из литературы известно всего лишь два основных способа синтеза 8-аза-пуринового гетерошпела Первый, аналогичный получению пуринов из пиримидинов, достаточно трудоемок и ограничен небольшим выбором заместителей в положении 2 гетероцикла Он, в основном, применим для введения разнообразных заместителей в положение 9 Второй, менее изученный путь, основанный на конденсации 5-амино-4-кароксамидо-1,2,3-триазолов с эфирами карбоновых кислот, дает практически неограниченные возможности модификации положения 2 В литературе имеется немного примеров подобных соединений, как правило, не имеющих заместителей в положении 2, поэтому актуальной задачей являлась разработка новых подходов к синтезу структур, содержащих в этом положении различные фармакофорные заместитечи

На первом этапе работы была отработана и оптимизирована методика синтеза 8-азапурин-6-онов по схеме

X. К. выход <%)■ Н Н, 75 (8), Н, СН,, 85 (9) Н, (-СД 36 (10), Н, СТ,, 72 (И) 2 С1 Н 71 (12) 2 С), СН,, 81 (13) 2-С1, С.Н5 65 (14), 2 К СН,, 70 (15), 2 Р С„Н5, 62 (16), 2 Р 6 С1 СН3 81 (17) 4-СН,, СНЬ 80 (18), 4 ОСН,, СН, 77 (19), 4 Р, СН, 78 (20) 4-Ь, С Н5 65 (21)

Следует отметить, что соединения 8, 9, 12 и 13 уже описаны в литературе, и были получены по этой схеме итальянскими учеными с выходами 20-40% Нами были найдены условия трехкомпонентной циклизации, в которых целевые продукты были выделены с выходами 60-80% Для этого конденсацию проводили в присутствие пятикратного избытка натрия в безводном изопропаноле, компоненты брали в эквимолярном соотношении Соединения 8-21 в дальнейшем были использованы в качестве исходных веществ для модификации положения 6 8-азапурина

На наш взгляд, особенно интересным было синтезировать 2-метилтиозамещенные 8-азапурин-6-оны, поскольку фрагмент СНг-Б-СНг является распространенным линкером в биологически активных соединениях В частности, проведенный нами поиск в базе ШЯЖ выявил ряд 2-метилтиозамешенных

о

7

1 7

8 21

пуринов, являющихся агонистами аденозиновых (Аг) рецепторов, а также 2-метилтиопиримидины, обладающие противобактериальными свойствами. Нам удалось применить аналогичную схему для синтеза новых производных 8-азапурина, содержащих СН23- фрагмент в положении 2 гетероцикла:

X. И. выход (%): 4-Р, с-С3Н5, 60 (40); 4^, 1-адамантил, 54 (41); 4-Р, 4-Р-СбШ, 75 (42); 4-Р, 2,6-(СН3)2-СбН3, 82 (43); 4-^ 4-М(СН3)2-СбН4, 72 (44); 2-С1, 2-СН3-С6Ш, 29 (45); 2-С1, 4-СН3-СбН4, 26 (46); 2-С1, г^ОЬЪ-СбНз, 34 (47); 2-С1,2-ОСН3-СбШ, 30 (48); 2-С1,4-ОСН3-СбН4,48 (49)

Исходные бензилазиды 1-7 получали из соответствующих бензилгалогенидов кипячением в смеси ацетона и ацетонитрила с избытком азида натрия. Исходные 2-хлорацетамиды 22-30 получали по общей методике ацнлирования аминов хлорангидридами из соответствующих аминов и 2-хлорацетилхлорида в дихлорметане, соединения 31-39 — по общей методике алкилирования тиофункции меркалтоэтилацетата 2-хлорацетамидами 22-30 в изопропаноле в присутствие основания (ЫаОН). Выходы продуктов конденсации 40-49 были значительно ниже таковых для 8-азапурин-б-онов 8-21, что, по-видимому, связано с пространственными затруднениями при введении в реакцию массивного метшггиоацетамидного фрагмента.

Строение 8-азапурин-6-онов 8-21 и 40-49 доказано методами ЯМР'Н, 20 МОЕБУ, ЬС/Мв, масс-спектрального анализа, ИК-спектроскопии и подтверждено методом элементного анализа. Характерной чертой 8-азапурин-6-онов 40-49 является наличие в ЯМР'Н спектрах этих соединений сигналов протонов СН2-группы бензильного фрагмента в области 5,6-5,9 м.д. и протона ЫН- группы в области 12,0-12,5 м.д. Для соединений 40-49 характерно также наличие синглетов в области 3,4-3,6 и 3,7-3,9 м.д. фрагмента СНгБСНг.

Для прогнозирования свойств 2-метилтиозамещенных 8-азапурин-6-онов на примере соединений 45-49 были рассмотрены процессы их распада под действием

22-30

31-39

этскгронного удара, что позволило сделать определенные выводы о путях метаболизма 8-азапуринового фрагмента в живом организме Показано, что основными направлениями распада являются отрыв 2-хлорбензильного катиона, а также расщепление связи СНг-Б (а-распад) Вопреки нашим ожиданиям, основанным на литературных аналогиях с пуринами, распад 8-азапуринового фрагмента ни для одного из рассматриваемых соединений не являлся преобладающим процессом

2. Синтез 6-замсщенных 2-алкил-9-бензил-8-азапурннов

Синтезу 6-замещенных 8-азапуринов посвяшено значительно меньшее количество работ, несмотря на то, что замещение гидроксильной группы на галоген с последующим его замещением различными нуклеофилами является распространенным способом введения заместителей в гетероциклическую систему

2.1. Синтез исходных 6-хлор-8~азапуринов

Для получения 7-хлорпроизводных 8-азапуринов мы использовали два альтернативных метода, широко применяемых для получения хлорпроизводных гетероциклов Первый способ заключался в продолжительном нагревании исходных 8-азапурин-6-онов с хлорокисью фосфора в присутствие диметиланилина _ качестве катализатора, второй — в кипячении 8-азапурин-6-онов с хлористым тионилом Таким образом, все исходные 8-азапурин-6-оны 8-21 были переведены в соответствующие хлорпроизводные 50-63

-Ы С1

X о

50-63

X. И выход (%) Н, Н, 71 (50), Н, СН3, 81 (51), Н, /-СЛЬ, 48 (52), Н, О-'), 59 (53), 2 С1, Н, 82 (54) 2-С1, СНз, 77 (55), 2-С1, С.\Н5. 72 (56), 2 Р, СН3, 66 (57), 2-Р, С2Н5, 56 (58), 2 И 6-С1, СН3, 75 (59), 4-СНь СН,, 79 (60), 4-ОСН3, СН3, 80 (61), 4-Р, СН3, 75 (62), 4-Р, СгН5, 54 (63)

Проведение реакции в хлорокиси фосфора имело ряд недостатков Во-первых, применение столь агрессивного реагента приводило к частичному осмолению продукта, и даже при небольшом перегревании выход понижался до 10-20% Во-вторых, при нейтрализации остатков хлорокиси фосфора, а именно выливании реакционной смеси на лед с последующей экстракцией

дихлорметаном, уже при низких температурах имел место гидролиз продукта. Использование хлористого тионила в качестве хлорирующего агента позволило увеличить выход продукта до 50-80% одновременно с сокращением времени синтеза. Этот способ позволил избежать контакта хлорпроизводного с водой в процессе выделения, а время реакции (4-6 часов) в большей степени зависело от природы заместителей, влияющей на растворимость исходного соединения в хлористом тиониле. Чистоту полученных соединений контролировали хроматографически, и полупродукты 50-63 сразу использовали в дальнейших превращениях.

2.2. Синтез б-аминозамещенных 8-азапуринов

Из большого набора коммерчески доступных аминов мы выбрали те, которые наиболее часто присутствуют в лекарственных препаратах в качестве фармакофорных фрагментов (например, морфолин, пиперазин, циклопропиламин и др.). В случае использования бензил- и фенетиламинов наиболее вероятным путем метаболизма замещенных 8-азапуринов является расщепление связи № бензил (фенетил) не только в положении 9, но и в положении 6, что приводит к образованию производных 6-амино-8-азапурина (8-азааденина). В результате просмотра баз данных АСБ и ВеНв1еш нами было обнаружено, что замещенные в положении 6 такими аминами 8-азапурины не описаны в литературе. Нами была создана обширная виртуальная база б-аминозамещенных 8-азапуринов и проведено нуклеофильное замещение галогена в б-хлор-8-азапуринах аминами по схеме:

50-63 64-86 *

X. И. В;'1Щг. выход {%>: Н. Н, (СН3)2М, 35 (64); Н, Н, 4-С1-СбН,СН2СН2Ш, 88 (65); Н, СН3, 2-СООСНуСбН4-МН, 85 (66); Н, (-СДЪ, НС=С-СН2Ш, 74 (67); Н, СБз, с-С3НзМН, 55 (68); Н, СР3, фурил-2-СН2КН, 82 (69); 2-С1, Н, СН3М(СН2СН2)2М, 28 (70); 2-С1, Н, фурил-2-СН2ЫН, 80 (71); 2-С1, Н, СбН5СН2СН2МН, 79 (72); 2-С1, Н, 3-С5ШЧ-СН2Ш, 51 (73); 2-С1, Н, 4-ОСН3-ОЛ,-СН2СН2Ш, 80 (74); 2-С1, СН3, г-Р-СЛМН, 64 (75); 2-С1, С2Н5, Ш2Ш, 22 (76); 4-СН3. СН3, с-С3Н5ЫН, 30 (77); 4-СН3, СН3, 0(СН2СН2)2М, 75 (78); 4-СН3> СНз, З-ОСНз-СеДОШ, 60 (79); 4-ОСН3, СНз, ЫН2, 52 (80); 4-ОСН3, СНз, с-С3Н5КН, 62 (81); 4-ОСН3, СН3, 0(СН2СН2)2Ч 75 (82); 4-ОСНз, СНз, 4-Г-СбН4ЫН, 85 (83); 4-Р, СН3, с-С3Н5-СН2КН, 75 (84); 4-Р, СН3, Ы-С2Ну пирролидин-2-ил-СН2ЫН, 31 (85); 4-Р, С2Н5, СН2=СНОСН2СН2Ш, 74 (86).

Нуклеофильное замещение атома хлора в молекуле 8-азапурнна в зависимости от природы амина проводили по двум методикам С различными алифатическими аминами, как первичными, так и вторичными, нуклеофильность которых значительно выше, чем у анилинов, реакция достаточно энергично проходила в этаноле в присутствие триэтиламина в качестве основания, или с избытком амина уже при комнатной температуре Использование в качестве растворителя ДМФА и ацетонитрила не повлияло ни на ход реакции, ни на выходы продуктов, которые достигали 40-80% С анилинами реакцию проводили в диметилформамиде с добавлением К2СО3 при нагревании Мы исследовали также возможность нуклеофильного замещения хлора гидразином и аммиаком В этих случаях конкурентной реакцией являлся гидролиз выделить индивидуальные соединения 76 и 80 удалось только после двух перекристаллизации из спирта, что отразилось на выходе целевых продуктов (порядка 20%)

2.3. Синтез б-оксизамещенных 8-дзапуринов

Интересным, на наш взгляд, было синтезировать 6-оксизамещенные 8-азапурины, поскольку поиск в этектронной библиотеке Beilstein выявил всего тишь два аналогичных соединения Это дало нам стимул для синтеза новых производных этого типа на основе алифатических спиртов и фенолов Получение таких производных осуществляли по схеме

С1

",Аа —— "ДА

(У вт (У т (У

^Г 87 89 ^ 61-62 х 90 91

И=А1ку| Р!=Агу|

X. И. выход (%) 4-Р, СНз, 70 (87), 4-Р, /-С^Нт, 64 (88), 4 Р, СН еССН2) 65 (89), 4-Р, 4 ОСНэ-СбШ, 82 (90), 4-ОСНз 2 СНгСЛЬ, 32 (91)

Реакшпо с алифатическими спиртами проводили непосредственно в среде этих спиртов с избытком натрия Попытки замещения атома хлора в соединениях 61-62 более объемными спиртами, такими как третбутанол, циклогексанол и бензиловый спирт, не привели к выделению соответствующих 6-оксипроизводных. Замещение хлора фенолами с высокими выходами проводили в апротонных растворителях (ацетонитрил, ДМФА) в присутствие карбоната калия В случае замещения 2-метапфенолом выход продукта 91 значительно ниже

таковых в ряду соединений 87-90, что, возможно, объясняется стерическими затруднениями.

В синтезе тиозамещенных 8-азапуринов на примере хлорпроизводного 62 мы использовали два основных подхода: получение 8-азапурин-6-тиона 92 с последующим алкилированием и непосредственное нуклеофильное замещение хлора тиолами и тиофенолами:

И. выход (%)■■ 4-ОСНз-СбН,, 72 (93); 4-Р-СбН4,35 (94); фурил-2-СН2> 74 (95); С2Н5> 85 (96); С2Н5ООССН2,58 (97)

Для получения 8-азапурин-6-тиона 92 нами были применены три метода: синтез из 8-азалурин-6-она 20 с РгБ; в толуоле, синтез из 6-хлорпроизводного 62 с избытком ЫаБН в этаноле, и из 6-хлорпроизводного 62 с (ЫНг^ в метаноле с последующей обработкой изотиурониевой соли водным раствором ИаОН. Наибольший выход обеспечил метод получения тиона 92 из хлорпроизводного 62 с №8Н (60%). Целевые продукты 93-97 также синтезировали несколькими способами. Соединения 93-95 получали нуклеофильным замещением атома хлора тиолами в изопропаноле. Несмотря на бблыпую нуклеофильность серы, в некоторых случаях идет замещение Б-функции спиртами или ОН" ионом. Так, попытка введения низкомолекулярных тиолов по этой методике, а именно этилмеркаптана и 2-меркаптоэтилацетата, не привела к продуктам 96 и 97. В первом случае было выделено соединение 20, во втором - 88. Поэтому для получения веществ 96-97 предложен другой синтетический путь, основанный на

2.4. Синтез б-тиозамещенных 8-азапуринов

т-

93-97

алкилировании 8-азапурин-6-гиона 92 алкилгалогенидами Тион 92 нагревали в ацетонитриле с избытком алкилгалогенида (С2Н51 и ВгСН2СООСгН5, соответственно) и избытком КгС03

Для подтверждения строения соединения 92 в виду возможной ЫН-БН таутомерии, его структура изучена методами спектрометрии ЯМР'Н и 20 КЮЕБУ, и четко установлено, что соединение 92 находится в форме тиона На это указывал отчетливый кросс-пик между протонами СНэ- группы в положении 2 и протоном 1ЧН, удаленными в пространстве примерно на 2,1 А Оптимизацию структуры и расчет межатомных расстояний проводили с использованием программы НурегСЬеш

В настоящее время большое внимание уделяется синтезу 6-карбозамещенных пуринов Известно, что нуклеозиды, построенные на основе 6-С-замещенных пуринов, проявляют противоопухолевую и антивирусную активность Более того, такие соединения интересны как биологические зонды для установления механизма взаимодействия с ферментами Синтез аналогичных производных 8-азалурина, а именно содержащих в положении 6 фрагменты ацетамида, апетонитрила, малонового эфира и пиразолона, не описан в литературе Нашей задачей являлся направленный синтез 6-С-замешенных 8-азапуринов путем нуклеофильного замешения хлора в молекулах 6-члор-8-азапуринов В ходе выполнения эксперимента были реализованы следующие схемы

И к', и'. И3, выход (%) 2-р (6-С1) СбН,-СН2.СН3> С;Н5ООС, СМ, 38 (98); 2-С1 С6Н4-СН2 СН3, С2Н5ООС, С2Н5ООС, 44 (99) 2 СЛ-СбШ-СНг, СНз, СН3С(0), СаН5ООС, 35 (100), 2 ЬЧб-С1)-С61{г СН2.СНЗ, С(0)МН2, СЛ, 45 (101), 2 С1 С«Н4-СН2 СН) СбШ СЫ, 65 (102), Я1, выход (%). Н 85 (103), С2Н5, 58 (104).

2.5. Синтез 6-карбозамещенных 8-азапуринов

м Л Л

105

Высокая подвижность атома хлора в положении б 8-азапурина обуславливает возможность его замещения даже относительно слабыми С-нуклеофилами Для генерирования карбанионов нами апробировано замещение в следующих условиях, гидрид натрия в ДМФА; этилат (изопропилат) натрия в этаноле (изопропаноле), К2СОз в ДМФА или ацетонитриле; триэтиламин в этаноле, в результате получены вещества 98-104

Опасаясь возможной переэтерификации сложноэфирных групп, замещение галогена производными малоновой кислоты и ацетоуксусным эфиром проводили в этаноле с этилатом натрия, замещение цианацетамидом проводили в изопропаноле с изопропилатом натрия Выходы соединений 98-101 при этом составили 35-45%

Интересным, на наш взгляд, было изучение протекания реакции в случае арилацетонитритов Известно, что последние представляют собой менее активные СН-кистоты, поскольку карбанион стабилизирован тишь одной электроноакцелторной группой Учитывая это, мы заведомо использовали более сильное основание - гидрид натрия в безводном ДМФА При этом введение в реакцию целого ряда арилацетонитрилов привело к смеси изомеров в самых различных соотношениях Изомеры имели очень близкую хроматографическую годвижность Такие способы очистки, как герекристаллизация и переосаждение из горячего раствора, также не позволили выделить какой-либо изомер индивидуально Лишь в с ту чае фенилацетонитрила после перекристаллизации из этанола с выходом 65% был выделен индивидуальный продукт 102, не имеющий примеси изомера по данным [.С/МБ

Реакции с фенилпиразолоном, также являющимся С-нуклеофилом, проводили в диметилформамиде в присутствие гидрида натрия Процесс протекал гладко, и соединения 103-104 были выделены без каких-либо побочных продуктов с выходами 54% и 39%, соответственно

На примере соединения 105 нами был предложен способ замещения галогена в соединении 60 карбанионом, не стабилизированным электроноакцепторными группами Синтез проводили путем взаимодействия хлорпроизводного 60 с бензилмагнийбромидом в диэтиловом эфире при охлаждении (лед-№С1) в атмосфере аргона, продукт выдетяли на колонке

Особой сложностью при работе с 6-карбозамещенными 8-азапуринами было установление структуры полученных соединений, поскольку наличие сопряженных связей в молекулах последних предполагает возможность их существования как в таутомерных формах, так и в виде структурных изомеров

Нами был проведен тщательный анализ спектральных характеристик соединений 98-104. В ЯМР'Н спектрах соединений 98-104 не было выявлено сигнала СН-протона. Вместо этого был зафиксирован пик в слабом поле (12-15 м.д.), что доказывало существование этих соединений в илиденовой форме. Сигнал протона в слабом поле обусловлен наличием прочных внутримолекулярных водородных связей (за исключением соединения 102), характерных для илиденовых структур. Наше предположение было дополнительно подтверждено методами спектрометрии ЯМР13С, Ш(5С (ЯМР'Н-15Ы) и ИОЕвУ. Более того, данные спектров позволили точно определить расположение групп (тип изомерии) относительно илиденовой двойной связи. На основании полученных данных соединениям 98-104 были присвоены следующие структуры:

2.6. Синтез аннелированных трициклических структур на основе 8-азапурина

В литературе имеются данные о синтезе аннелированных трициклических производных на основе 8-азапурина, однако многостадийностъ и низкие выходы делают синтез таких соединений малопривлекательным. В тоже время биологические испытания показывают высокую активность таких соединений в качестве ингибиторов А] и Аг аденозиновых рецепторов на уровне наномолярных концентраций. Получение подобных структур обычно проводят путем термической конденсации гетарилгидразинов с эфирами карбоновых кислот или с ортоэфирами. Другим способом синтеза является ретроконденсация гетарилгидразидов кислот в дифениловом эфире в предельно жестких условиях, однако выходы продуктов циклизации не превышают 30%.

Нами был разработан другой способ получения трициклических структур, основанный на реакции 5-арил и 5-гетарил 1-Я-тетразолов с 6-хлор-8-азапуринами. Такой способ получения аннелированных производных на основе 8-азапурина не описан в литературе. Мы поставили задачу исследовать данный

подход систематически в ряду 2-алкил-6-хлор-8-азапуринов 50-63. Ниже приведена схема синтеза и выходы целевых продуктов :

NaN, N~M R'CN -— II N

R N 115"136 * 137 139 x

50-63

x

X. R, R1. выход f%) 4-F, CH, 4 F С6Ш. 42 (115), 4-F, CH,. 4 OCH,-CsH4 56 (116), 4 F. CH, 5-CHj-2 фурил 48 (117) 4 F, CH,, 3 C,H4N, 33 (118), 4-F, C;HS. 4C1-C6H4, 71 (119), 2 F, CH, 4-OCH, um 48 (120) 2 F, CH,, 4 OC.H5 C„Hj 52 (121) 2 Cl, H 4-ОСНз-СбШ 72 (122), 2 CI, CH, 4-F-CcHi 66 (123) 2 Cl, H, 3 4-(OCH,)rC(,H,, 80 (124), 2 Cl, C2HS, 4-OCH,-C6H,. 54 (125) 2 Cl, C.H« 4 F C„H4 48 (126), H, CF,, 4-OCH, CÄ, 33 (127) H CF,, 4-CI CÜH4, 31 (128), 4-OCH,, CH, 4-OCH, СЙШ 73 (129) 4-OCH,, CH,, 4-OCH,-C„H4 66 (130), 4-OCH,, CH,, 4 NO.-UH4 58 (131) 4-CH, CH,, 5-СН,-2-фурил, 55 (132) 4-CH,, CH,, 2 тиенил 62 (133), 4-CH,, CH,, 3-C5H4N, 68 (134) 4-OCH,, CH, S-CH,-2 фvpил> 53 (135), 4 OCH,, CH,, 2 тиенил, 75 (136), 2 F. CH, 4 OC.Hs-C5H4,25 (137) OCH,, CH,, 5-СНз 2-фурил 15 (138), 2 Cl C.H5.4-F-CeH,, 21 (139)

Исходные тетразолы были синтезированы из соответствующих нитрилов кипячением в толуоле с азидом натрия и гидрохлоридом диметиламина в течение 4 часов или в диметилформамиде с двукратным избытком азида натрия в течение 24 часов Соединения 115-139 мы синтезировали из тетразолов 106-114 и 6-хлор-8-азапуринов 50-63 в ацетонитриле или диметилформамиде с добавлением каталитических количеств пиридина Все полученные целевые продукты очищали при помощи препаративной колоночной хроматографии Контроль за прохождением реакции осуществляли при помощи ТСХ Выделение азота из реакционной смеси наблюдалось уже при слабом нагревании Сначала появлялось яркое флуоресцирующее пятно, при дальнейшем нагревании (80-120°С) оно исчезало, и появлялось другое, слабо флуоресцирующее пятно вещества с меньшей подвижностью, которое, как было установлено впоследствии, относится к 3#-[1,2,3]триазоло[4,5-е][1,2,4]-триазоло[3,4-с]пиримидинам 115-136 Анализ LC/MS спектров реакционной смеси указывал на наличие изомеров, соотношение которых изменялось в процессе реакции Проведение реакции в более мягких

* Нумерация сопасно номенклатуре IUPAC

температурных условиях (50°С, ДМФА) позволило выделить индивидуальные продукты 137-139, содержащие в основе новый гетероцшсл - 3#-[1,2,3]-триазоло[5,4-е][1,2,4]триазоло[1,5-с]пиримидин. Нами было предложено объяснение факта взаимного превращения изомеров в рамках механизма перегруппировки Димрота, являющейся классической для пиримидиновых систем:

А ЙТ

—- „ ¿К^—

" В *

В результате изучения устойчивости соединений 115-136 к нагреванию, и было замечено, что взаимные превращения изомеров происходят только в растворе (по-видимому, в присутствие следов воды).

На примере соединений 121, 126, 135, 137-139 мы провели сравнение спектрального поведения изомеров. В целом, анализ ЯМР'Н спектров этих соединений показал, что хим. сдвиги протонов изомеров в целом идентичны, за исключением протонов СН3- группы в положении 5. При сравнении ЯМР'Н спектров изомерных соединений 121 и 137 наблюдалось смещение сигнала СНэ-гругшы в слабое поле (с 2,1 до 3,0 м.д.). При этом изменение химического окружения этой группы не повлияло на хим. сдвиги других протонов. Для изомерных соединений 136 и 138 также наблюдался сдвиг сигнала СН3- группы в слабое поле (с 2,5 до 2,9 м.д.). Опираясь на данные спектрометрии ЯМР'Н 20 ЫОЕБУ, нами достоверно установлены структуры соединений 115-139.

2.7. Восстановление производных 8-азапурина

Известно, что система 8-азапурина устойчива к действию различных восстановителей. Данных о восстановлении трициклических соединений на основе 8-азапурина не найдено в литературе. Таким образом, было интересно изучить устойчивость трициклической системы 3#-[1,2,3]триазоло[4,5-е][1,2,4]-триазоло[3,4-с] пиримидинов в различных условиях восстановления.

Имея в распоряжении достаточно широкий выбор восстановителей, для проведения эксперимента на примере веществ 116, 124 мы ограничились

использованием следующих восстановителей ЫаВНЦ/МеОН; Нг/Рс!/С; Иг/М^Яе), ВгНб/ТОР Соединения 116,124 нагревали в метаноле с большим избытком ЫаВН* (50°С, 6 часов), однако в спектре Е-С/МБ не было замечено даже следов восстановленного продукта Каталитическое восстановление (Н^/РсУС, Нг/Ы^Яе)) этих же соединений в более жестких условиях (50°С, 6 часов, 3 атм ) также не привело к каким-либо изменениям исходных соединений Примечательно, что бензильный фрагмент не был затронут, несмотря на то, что восстановление водородом на палладиевом катализаторе является универсальным способом снятия бензильной защиты Совершенно иначе протекала реакция с дибораном в ТГФ При добавлении избытка 1М раствора диборана в ТГФ к суспензии соединений 115-124 в ТГФ уже при комнатной температуре в течение непродолжительного времени (0,5-1 час) наблюдали полное растворение веществ и изменение характера хроматографического поведения реакционной смеси В результате были выдетены продукты 140-146'

VI-

,=/ П2

В,Н.ГТСР

Я1

115 116 119 120 121 122 124

140 146

И. Я'. К2, выход Г"о) 2-С1 С„Н4-СН. Н, 3,4ЧОСН3)2 О.Н,. 55 (140), 2-С1-С„Н4 СН2, Н 4-ОСН, СбН„ 58 (141), 4 Г С«,Ш-СН: СН, 4-Р-С6Ш 76 (142), 4 Р С^Ш-СНз С Л К, 4 С1 СЛ., 75 (143), 4-Р С«Н4 СИ,, С.Н5, 4-ОСН,-С«Н4 65 (144) 2 Р СбШ-СН: СН,, 4-ОСЛЬ-С„Нд 30 (145) 2-Р-СеИ* СНг, СН, 4-ОСН3 С^Н, 38 (146)

Так как мы имели дело с достаточно сложной гетероциклической системой, предсказать продукты восстановления дибораном оказалось трудной задачей Вопреки нашим ожиданиям, реакция не ограничивалась восстановлением двойной связи пиримидина, и происходило дальнейшее восстановление по схеме, приведенной выше Причем, независимо от кратности избытка диборана, проходило восстановление двух связей (пик "М+4" по [.С/МБ) Пик "М-КГ в ЬС/Мв спектрах также присутствовал, но его интенсивность составляла не более 10% Мы предположили, что при расщеплении связи между атомами С-5 - N 6 возможно образование трех изомерных структур (на примере соединения 145), отличающихся положением протона в 1,2,4-триазольном цикле

./Ч

' 145 A ^ 145В ^

^ 145В ^^ H5C

Для установления структур соединений 140-146 методом спектрометрии ЯМР'Н 2D NOESY мы изучили соединение 145. Был зафиксирован кросс-пик между протоном NH-группы 1,2,4-триазола и орто- протонами арильного заместителя, а также кросс-пик между NH- протоном и протонами СН2 группы этильного заместителя. На основании этого для всех соединений 140-146 мы предположили структуры типа А. Следует иметь в виду, что синтез подобных 5-алкиламино-4#-1,2,4-триазолил-1#-1,2,3-триазолов 140-146 другими способами не описан в литературе.

3. Биологические свойства 8-азапуринов

3.1. Виртуальный биологический скрининг

Важным этапом нашей работы являлся виртуальный скрининг замещенных 8-азапуринов с целью выявления потенциально активных соединений и постановки синтетической задачи. Известные данные биологических испытаний указывают на широкий спектр активности пуринов и 8-азапуринов по отношению к киназам, NO-синтетазам, а также к семейству рецепторов, ассоциированных с G-белком.

В нашей работе было реализовано два подхода к поиску так называемых Drug-like molecules*. Первый метод (Structure-Based Method) основан на моделировании структурного и пространственного соответствия виртуальных соединений активным центрам белка, при этом структура биологической мишени (молекулы белка) была достоверно известна. Второй подход (Ligand-Based Method), основанный на структурном сходстве виртуальных соединений с уже известными лекарствами или их фармакофорными фрагментами, использовали для предсказания связывания с рецепторами GPCR (рецепторами, ассоциированными с G-белком), структура которых неизвестна.

Было обнаружено, что практически все представленные к рассмотрению соединения гипотетически активны в отношении киназ, а также рецепторов семейства GPCR. Результаты виртуального биологического скрининга некоторых наиболее перспективных соединений приведены в табл.1.

Совместно с лабораторией компьютерного моделирования компании Asinex

Таблица 1. Гипотетическая способность некоторых 6-аминозамешенных S-азапуринов к связыванию рецепторов GPCR

NN 1 Сродство к дофаминовым J рецепторам Сродство к серотониновым рецепторам Сродство к аденозиновым рецепторам Сродство к другим типам рецепторов

1 D, 1 D2 1 1 D, D4 5-НТ, 5-НТг Ai Аг Ai Опиоид-ные Эндо-фечин

64 1 + +

65 i + i + + + + + 4-

66 1 + 1 + ! + + +

67 1 1 i 1 i + +

68 ' I 1 i + +

69 i - i 1 + i 1 + 4- 4- 1 +

70 1 1 + ' ~ 1 4- +

71 1 ' + ! ¡4-1 + -i- +

72 1 1 - + : - , 4- + -t-

73 j - 1 * !" 1 + 1 +

74 , * i - - ! J- 1 + 1 +

75 > + ' * 1 1

76 1 1 1 i 1 + +

77 1 +- 1 т +

78 1 1- + ^ 1 ^ i + 1 1 +

79 , i i t - 1 1 * +

3.2. Биологические испытания in vitro

Следующим этапом биологических исстедований явились тесты некоторых 6-амичозамещенных 8-азапуринов на активность по отношению к киназам, а также к дофаминовым и серотониновым рецепторам на клеточном уровне in vitro проводимые в научной лаборатории AsinexBioLabs Для этих целей использовали коммерчески доступный материал, представляющий собой лиофилизированную мембрану клеток с определенным типом рецептора В качестве стандарта сравнения использовали радиолиганд с тритиевой меткой [3H]-8-OH-DPAT (8-гидрокси-2-(ди-к-пропиламино)тетралин)

Первоначально количественно определяли связывание стандартного лиганда с рецептором, а затем смеси исследуемого вещества и стандартного лиганда Происходило конкурентное ингибнрованне активного центра рецептора, степень

ингябирования определяли по остаточному содержанию несвязанного [эН]-8-ОН-DPAT. Таким образом, был вычислен параметр 1С30, отражающий концентрацию вещества, обеспечивающую 50%-е связывание исследуемого вещества с субстратом. Данные биологических испытаний in vitro, проведенных для ряда 6-аминозамещенных 8-азапуринов, сведены в таблицу 2.

Таблица 2» Результаты биологических испытаний некоторых соединений

NN Формула Сродство к дофаминовым рецепторам, ICso (мкМ) Сродство к серогониновым рецепторам, ICso (мкМ)

D, D2 Ds о* 5-НТ, 5-НТг

65 jXr м 2,70

70 70,00 19,00

72 » qJ^J а 2,76

74 22,41 ■ 1

75 о ■ >200

79 150,00

Полученные нами результаты показали возможность связывания некоторых 8-азапурииов, содержащих в положении б фенетиламино группу, с серотониновыми рецепторами на уровне концентраций 2-20 мкМ. Низкие

показатели активности по отношению к серотониновым рецепторам определены для 6-анилинозамешенных 8-азапуринов 75 (1С» > 200мкМ) и 79 (1С<0 150мкМ) В настоящее время на стадии биотестирования находятся все полученные соединения

Таким образом, синтезированные нами новые 8-азапурины являются перспективными объектами для биологических исследований, в том числе по отношению к аденозиновым, дофаминовым и серотониновым рецепторам

Выводы

1 Разработана методика получения 8-азапурин-6-онов, содержащих в положении 9 заместитечь бензильного типа Предложен метод синтеза новых производных 8-азапурина, содержащих в положении 2 метилтиоацетамидный фрагмент, а также изучены пути их распада под действием электронного удара

2 Разработан удобный препаративный метод синтеза новых 6-амино, 6-тио, 6-окси и 6-карбозамещенных 8-азапуринов, основанный на нуклеофильном замещении галогена в 6-хлор-8-азапуринах Проведено детальное изучение структуры полученных соединений методами ЯМР'Н, ЯМРПС, 2D NOESY и HSQC

3 Впервые предложен способ синтеза новых трициклических систем - ЗН-[1,2,3]триазоло[4,5-й}[1,2,4]-триазото[3,4-с]пиримидинов и ЗЯ-[1,2,3]-триа-зочо[5,4-е][ 1,2,4]триазоло[ 1,5-с]пиримидинов, основанный на взаимодействии арил- и гетарнл- тетразолов с б-хлор-8-азапуринами, изучена их устойчивость к действию восстановителей Показано, что реакция с дибораном приводит к разрушению пиримидинового фрагмента и образованию не известных ранее производных Л-алкил-5-амино- 1,2,3-триазола

4 Впервые синтезирован обширный ряд новых замещенных 8-азапуринов, содержащих в положениях 2, 6 и 9 различные фармакофорные заместители С помощью компьютерных расчетов показано, что большинство соединений удовлетворяют правилам Липински, являющихся критерием отбора лекарственноподобных веществ

5 Проведен виртуальный скрининг всех синтезированных соединений по схеме LBD (Ligand-Based Design) и TBD (Target-Based Design) Выявлена потенциальная активность ряда соединений по отношению к различным

подтипам аденозиновых, серотониновых и дофаминовых рецепторов, а также по отношению к тирозиновым и серин-треониновым типам киназ.

6. Проведено первичное биологическое тестирование in vitro некоторых 6-аминозамещенных 8-азапуринов и найдены вещества, обладающие сродством к дофаминовым и серотониновым рецепторам.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. К.В. Кулешов, A.B. Адамов, О.Г. Родин, В.П. Перевалов, А.Р. Эльман, Синтез новых 2-замещенных 6-гидрокси-8-азапуринов (8-азагипо-ксантинов),Хим.-фарм. журнал, 2002, 36, 44-46.

2. К.В. Кулешов, A.B. Адамов, О.Г. Родин, В.П. Переемов, Синтез комбинаторных библиотек меркаптометилзамещенных 8-азапуринонов как антиметаболитов пуринов, Second International Conference on Multi Component Reactions, Combinatorial and Related Chemistry, Book of abstracts. Genova, Italy, 2003, 139.

3. К.В. Кулешов, A.B. Адамов, А.И. Белоконь, О.Г. Родин, В.П. Перевалов, А.Р. Эльман, Масс-спектры и закономерности распада некоторых 2-замещенных 9-(о-хлорбензил)-8-азагипоксантинов, Биоорганическая химия, 2004,30,1,105-109.

4. A.B. Адамов, Н.Л. Нам, О.Г. Родин, Синтез новых производных 8-азапурина, Известия ТСХА, 2004, 1, 138-140.

Уст печл л I 16

Зак 2*6

Тир 100 чкз

\НО «Издательство МСХА» 1275М) Москва, уч Тимирязевская 44