Молекулярные инструменты на основе составных олигонуклеотидных конструкций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ПЫШНЫЙ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ НА ОСНОВЕ СОСТАВНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ 4856891

диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

1 3 ОКТ 2011

Москва-2011

4856891

Работа выполнена в лабораториях бионанотехнологии и химии нуклеиновых кислот Учреждения Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, академик РАН

Мирошников Анатолий Иванович

доктор химических наук Долинная Нина Германовна

доктор химических наук, профессор Позмогова Галина Евгеньевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 25 » октября 2011 г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан » ^/-улу2011

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ол1 ironyклеотиды - короткие синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (НК) - широко используют в качестве молекулярных инструментов для изучения различных биохимических процессов, специфических зондов в системах НК-диапюстики, а также ген-направленных биологически активных препаратов. Относительно недавно продемонстрирована возможность использования олигонуклеотидов в качестве строительных блоков при формировании наноструктур, обладающих заранее заданными геометрическими характеристиками. Столь обширные области применения обусловлены способностью олигонуклеотидов образовывать прочные двухцепочечные (дц) комплементарные комплексы. Современные возможности химии НК позволяют получать любые олигонуклеотидные последовательности и производные на их основе, что определяет необходимость разработки фундаментальных принципов выбора структуры синтетических НК-конструкций в строгом соответствии с целями и задачами исследований. Однако направленный выбор структуры олигонуклеотидов возможен лишь при наличии алгоритмов прогностического расчета физико-химических и/или субстратных свойств формируемых ими комплексов с НК. Такие алгоритмы могут быть разработаны при создании детализованных модельных описаний структурно-функциональных особенностей НК-комплексов. Известны (SantaLucia J., 2004, Owczarzy D. et at., 2008) унифицированные термодинамические параметры образования отдельных элементов <);/ДНК, как комплементарных, так и несовершенных, в различных буферных растворах. Однако изменение типа комплекса, введение модифицированных компонентов (например, «скованных» НК (LNA), пептидил-НК (PNA), морфо-лино-НК) или формирование структуры, элементы которой не параметризованы с точки зрения энергетических эффектов, сокращают спектр возможных приложений даже этих хорошо изученных классов олигонуклеотидов, в том числе в присутствии НК-зависимых ферментов.

Таким образом, разработка любых новых типов производных или аналогов НК требует детального описания физико-химических и биохимических свойств вновь создаваемых молекулярных инструментов. С другой стороны, массив данных, накопленных за десятилетия после расшифровки структуры Л/ДНК, огромен, и рациональное использование этой информации может привести к созданию новых универсальных путей использования нативных олигонуклео-тидных блоков в качестве компонентов оригинальных конструкций, сочетающих в себе функциональные характеристики природных НК. С этой точки зрения наиболее оптимальными являются составные олигонуклеотидные конструкции: тандемы, копкатемеры и мостиковые сшигонуклеотиды (МО) с ненук-леотидными вставками в углеводно-фосфатном остове. Тандемы олигомеров или их «сшитые» аналоги, МО, формируют с адресной НК-последовательностью комплексы без пробелов, составленные из нативных блоков и содержащие либо одноцепочечный (о//) разрыв, либо ненуклеотидное вы-петливание. Изменяя структуру составных олигонуклеотидов, удается регулиро-

1

вать стабильность формируемых ими дуплексов, сохранять их способность выступать в качестве субстратов для различных НК-зависимых ферментов, создавать новые инструменты для гибридизационного анализа НК (Dirks R.M. et al„ 2004), а также системы внутриклеточной доставки сиквенс-специфичных агентов (Simortova O.N. et al„ 2006) и сборки генов (Gupta N.K. et at., 1968; Shabarova Z.A. et al„ ¡991). Известен ряд описаний феноменологических моделей образования составных НК-дуплексов (Asseline U. 1985; Shabarova Z.A. et ai, 1991; Walter A. E.t et al., 1994), однако комплексной физико-химической харакгериза-ции таких молекулярных систем не проводили. Данное обстоятельство ограничивает потенциал использования составных олигонуклеотидов и сужает сферы их применений в ДНК-диагностике, разработке ген-направленных агентов, ДНК-архитектонике.

Целью данной работы являлось комплексное решение фундаментальной проблемы выявления строгой взаимосвязи структуры и физико-химических свойств с функциональной значимостью составных ДНК-комплексов на основе тандемных олигонуклеотидных конструкций, включая конкатемеры, и мостико-вых олигонуклеотидов, содержащих ненуклеотидные вставки.

В ходе работы было необходимо решить следующие основные задачи:

1) разработать комплексный подход к исследованию пространственной структуры, физико-химических свойств составных комплексов олигодезокеири-бонуклеотидов (кинетических и термодинамических параметров комплексооб-разования), образованных с участием нативных НК-компонентов и их производных, позволяющий выявлять структурные элементы, влияющие на эффективность формирования таких типов комплексов, как полностью комплементарных, так и содержащих мисматчи;

2) определить набор и величины унифицированных термодинамических параметров, обеспечивающих возможность прогностического расчета температуры плавления составных ДНК/ДНК-комплексов и термодинамических параметров (энтальпии ДН°, энтропии AS" и свободной энергии AG°T) их формирования в стандартных условиях (1 М NaCl, нейтральный рН), а также характера изменения данных величин при изменении состава буферных растворов;

3) систематически исследовать закономерности превращения составных олигонуклеотидных комплексов в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами (ДНК-лигазой фага Т4 и ДНК-полимеразой Thermits aquaticiis), и разработать на основе выявленных закономерностей алгоритмы выбора структуры инструментов для мсшекулярно-биологического анализа и высокоселективных зондов, а также новые подходы к созданию систем ДНК-диагностики.

Научная новизна и практическая ценность работы

Настоящая работа представляет собой первое систематическое исследование, направленное на изучение фундаментальных принципов формирования комплексов составных олигонуклеотидных конструкций с ДНК и их использование в качестве молекулярных инструментов в молекулярно-биологической и ДНК-диагностической практиках.

Впервые проведено системное исследование закономерностей образования составных комплексов олигодезоксирибонуклеотидов, направленное на изучение их пространственной структуры, кинетических и термодинамических параметров комплексообразования нативных НК-компонентов или их производных с ДНК. Определен характер влияния различных структурных элементов нуклео-тндной и ненуклеотндной природы (ароматические н стероидные остатки, вставки на основе фосфодиэфиров опигоэтиленглнколей и олигометилендиолов и др.), наличие которых в составных конструкциях определяет эффективность формирования комплементарных и несовершенных комплексов.

Для тандемных комплексов и дуплексов на основе мостиковых олигонукле-отидов определены величины унифицированных термодинамических параметров, обеспечивающие возможность прогностического расчета температуры плавления их ассоциатов с ДНК, и предложен новый способ количественной оценки масштаба изменения термостабильности составных комплексов при варьировании концентрации противоионов в растворе. Разработана термодинамическая схема описания распределения равновесных форм при образовании конкатемерных ДНК-комплексов - перспективных систем усиления сигнала при гибридизационном анализе НК и систем доставки олигонуклеотидных агентов внутрь эукариотическнх клеток.

Систематически исследованы закономерности превращения составных олигонуклеотидных комплексов в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами (ДНК-лигазой фага Т4 и Taq ДНК-пол имеразой). Определена зависимость эффективности превращения ДНК-субстратов от положения ненуклеотндной вставки в их составе. Показано, что, используя наборы олигонуклеотидных дуплексов на основе мостиковых олигонуклеотидов, можно определять топологию сайтов связывания фермента с ДНК-субстратом. Продемонстрировано, что комплексы на основе мостиковых и тандемных олигонуклеотидов проявляют повышенную чувствительность к нуклеотидным заменам, включая однонук-леотидные, в сайтах специфического связывания анализируемой ДНК. Предложены алгоритмы выбора структуры составных олигонуклеотидов и методы создания на их основе новых систем гибридизационного анализа ДНК в гомо- и гетерофазном вариантах. Разработан новый способ повышения эффективности гибридизационного анализа с участием ДНК-зависимых ферментов и составных олигонуклеотидов, обладающих пониженной комплексообразующей способностью, основанный на использовании в качестве анализируемых ДНК-объектов частично фрагменгированных в мягких условиях и не требующих дополнительной очистки ДНК-ампликонов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на российских конференциях («Современные направления в химии нуклеиновых кислот», Москва, 2000; «Химическая биология», Новосибирск, 2005, 2006, 2009; VI конференции по биоинформатике регуляции генома и структуры, Новосибирск, 2008; VIII международной конференции по изучению узнавания в нуклеиновых кислотах (NACON-VIII), Шеффилд, Великобритания, 2010); на Менделеевском съезде по

3

общей и прикладной химии, Санкт-Петербург, 1998, Москва, 2007; III Всероссийском биохимическом съезде, Санкт-Петербург, 2002; IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; V симпозиуме «Химия и биология нуклеиновых кислсл», Кембридж, Великобритания, 2003; российско-французских симпозиумах «Супрамолекулярные системы в химии и биологии», Москва, 2007, Страсбург, Франция, 2008; XV совещании по структуре и динамике биомолекул, Олбани, США, 2007; российско-европейском рабочем совещании «Репарация ДНК и эпигенетическая регуляция стабильности генома», Санкт-Петербург, 2008; на международных форумах по нанотехноло-гиям, Москва, 2008,2009,2010.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 53 работы, из них: 3 обзора, 6 патентов, 44 научные статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 443 страницах, содержит 163 рисунка, 32 схемы и 62 таблицы. Библиография охватывает 532 публикации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Дуплексы на основе составных олигонуклеотидных конструкций

(|объекты исследования) Впервые тандемные системы были предложены в качестве сиквенс-специфичных агентов в работах проф. Зарытовой В.Ф. (КшуспчпIV. е/а/., 1988). Независимо, используя принцип взаимной стабилизации олигомеров при их гибридизации на прилегающих сайтах общей НК-матрицы, в лаборатории акад. Мирзабекова А.Д. была развита концепция секвенирования ДНК при непрерывной стэкинг-гибридизации (КИгарко К.Я. е! а1„ ¡989). Тандемы олигонуклеоти-дов были использованы и как зонды для анализа точечных мутаций в ДНК методом ферментативного лигирования {Ьстс1е£геп V. с/ а!.. 1989). Мостиковые оли-гонуютеопшы (МО), разработанные в ИХБФМ СО РАН при участии автора данной работы, сочетают в себе некоторые преимущества разобщенных наборов коротких олигонуклеотидов, объединяя их в одномолекулярную структуру не-нуютеотидными вставками (л), которые облегчают контроль за поведением составной конструкции в исследуемой системе и позволяют направленно регулировать свойства мостиковых олигомеров. Наряду с тандемнымн системами и МО в последнее время наблюдается возрастание интереса к многокомпонентным НК-ассоциатам, например, к конкатемерным комплексам, которые формируются за счет взаимодействия «липких» концов ^-блоков НК. В работе представлены результаты первого систематического исследования закономерностей образования составных олигонуклеотидных комплексов (Схема 1): конкатемер-ных, тандемных и образованных мостиковыми олигонуклеотидами. Простые бимолекулярные дуплексы исследовали в качестве контрольных систем, позволяющих оценить влияние наличия ¿»/-разрыва и/или различных модификаций на термическую стабильность отдельных компонентов составных комплексов. На-

ряду с нативными (немодифицированными) ДНК-комплексами в работе были исследованы и дуплексы, несущие различные остатки ненуклеотидной природы.

Схема 1.

Простые дуплексы

(коптпольные)- Комплексы 1УЮСТИКОВЫХ олигонуклеотидов

м м

МММ ^I

(контрольные)

м

ь

М„

1-г Ц. Ь, ь„ Ц.

Тандемные комплексы

м м

Ч Ц Ь,

Конкатемерные комплексы

м м м

1-,

I'

ь ь

- ненуклсотндияя вставка ("мостик") - одноцепочечный разрыв

со',' , $ оба- 9 ^

СХХГ-

♦от, РЬкЯ

пио 1 V

т |

11 = -Ж(СНгЬЖ- Я'=-ЩСН.)5МН- Ви - -ЫН(СНг)зСНз Я"= "О"

| ооп

- i n

п-1-5 I

,-N1*1-

"» \ РБ | 00 /

Оь о о о—р—

"-Р- I. о ^ ^ 0=Р-

II р - II

п.« ° 0=Р- Г°

ш

У

( ^О 0~Р-)п \-1 "

'—о о— —о о—1

СО

о' >„

Остатки полициклических ароматических соединений (ароматических углеводородов, азинов, производных антрахинона и др.) вводили на 5'-концевой фосфат олигонуклеотидов путем формирования фосфамидной связи и исследовали их влияние на термостабильность простых ДНК и тандемных дуплексов (Схема 1). В случае гибридизации встык остатки локализовали в точке контакта дуплексных структур. В качестве ненуклеотидных вставок в структуре МО выступали фосфодиэфирные остатки на основе олигометилендиолов и олигоэти-ленгликолей различной длины (Схема 1). Стероидные остатки (эстрона или холестерина) присоединяли к концевым фосфатным группировкам непосредственно либо через линкер на основе Р-аланина (5'-С/го/-С(0)СН2СН;.-Ь1Н-). Строение производных подтверждали данными спектрофотометрии, МАЬЭ1 ТОЙ масс-спектрометрии и в ряде случаев при изучении пространственной структуры комплексов доказывали с помощью ЯМР-спектроскопии.

2. Термодинамическое описание эффективности образования составных олигонуклеотидных комплексов с ДНК Анализ структурных факторов, определяющих стабильность комтексов коротких олигонуклеотидов

В соответствии с целью работы, направленной на установление фундаментальных принципов, определяющих взаимосвязь структуры как составных олигонуклеотидных дуплексов, так и отдельных нативных спиральных фрагментов в их составе, с их стабильностью и другими функциональными свойствами, на первом этапе исследования было необходимо отработать комплексный подход к физико-химической характеризации ДНК/ДНК-комплексов. Точное термодинамическое описание ДНК-комплексов позволяет выявлять энергетические вклады от формирования отдельных элементов структуры ДНК-компонентов и в дальнейшем составлять алгоритмы прогностического расчета гибридизационных свойств олигонуклеотидных конструкций, необходимых для рационального дизайна молекулярных инструментов на их основе.

Термодинамический анализ эффективности образования дуплексных структур олигодезоксирибонуклеотидами и их производными

Для определения термодинамических параметров формирования всех олигонуклеотидных комплексов использовали усовершенствованный вариант метода термической денатурации, в рамках которого регистрацию кривых плавления НК-комплексов проводили на нескольких длинах волн (не менее 4-х в диапазоне 240-360 нм) при пошаговом переключении монохроматора оптического детектора уникальной установки, созданной на базе хроматографа «Милихром» (Эко-нова, Новосибирск). Это усовершенствование позволило:

1) использовать широкий диапазон суммарной концентрации олигонуклеотидных компонентов комплексов от 3 ■ 10"6 до 2-10"4 М;

2) проводить параллельную регистрацию оптического сигнала в диапазонах длин волн, характерных как для регистрации гипо(гипер)хромных эффектов, сопряженных с образованием(распадом) НК-дуплексов (от 240 до 290 нм), в том

числе А/Т- и в/С-иар оснований (вблизи 260 и 280 им, соответственно), так и дня регистрации результирующих эффектов от взаимодействия хромофорных остатков ненуклеотиднон природы с элементами дуплексов (от 300 до 360 им); 3) регистрировать для одного образца несколько кривых плавления, профили которых пригодны для независимого расчета термодинамических параметров комплексообразования, и регистрировать опорный сигнал вне спектральной области реализации НК-специфичных переходов. Использование этих усовершенствований позволило повысить информативность и надежность данных, получаемых методом термической денатурации комплексов НК.

Эффективность образования простого бимолекулярного несамокомплемен-тарного комплекса с участием олигонуклеотида или его производного при заданной ионной силе «а» характеризуется величиной равновесной константы комплексообразования (К"р) и описывается в рамках модели двух состояний с помощью уравнением (1), на основании которого температура плавления комплекса (Т,„) может быть представлена в виде уравнения (2):

* - ¡¿¿г* =ехр [=^г)' =Ан- -г •(1>

1 дя°

- (2)

г„ + к • 1п(сг /4)

А»(Г)=а-{Д;+ГВ^)+(1-а)(А..+ГВ^) (3)

1 дн°

- = ------(4)

Дя" + Я • Дп • 1п([»а*]) + Я ■ 1п(Сг /

ДС°(Г)=ДС£.(Г)+ДС°.<Г) , (5)

где ДGf.tr) = Дн° - Г • ДЯ" и Ай°(Т) = -Г • В ■ Дп ■ 1п([Ма*])

Я = 1.987 кал/(моль-К); А;(Т) - зависимость оптической плотности на выбранной длине волны (X) от температуры (кривая плавления); А\ В*1/ - не зависящие от температуры параметры, описывающие линейную зависимость оптической плотности отдельного дц-(¡=с&) и ш/- (/=.«) состоянии от температуры; Ст - суммарная концентрация взаимодействующих олигонуклеотидов, взятых в стехиометрическом соотношении. Анализ проводили в приближениях ДН°(Т), Д5п(Т}=сош/ (АС/т=0) и ДН"а([Ыа+]>=стамГ, А5°а= А5°+11-Дп7>;([№+]) (для 0.022 М £[Ыа*]<0.182 М). Символы «пе» и «с» отражают неэлектростатическую и электростатическую состаапяюшле энергии взаимодействия.

Кривая плавления любого комплекса может быть описана в приближении «двух состояний» и задается выражением (3) (РаешЬе'ип М., е! а!., 1983). Применить данное приближение для описания комплексов НК возможно, если выполняется ряд требований: а) профили кривых термической денатурации комплексов хорошо описываются расчетными зависимостями А'(Т), получаемыми с использованием уравнений (1)-(3); б) различие величин термодинамических параметров комплексообразования (ДН° и ДБ"), определяемых концентрационным методом из зависимости 1/Т,„ га 1п(Ст/4) (2) и методом оптимизации (уравнения (1) и (3)), составляет менее 10 % (А7а Т., е/ а!.. 1998)\ в) величины термодинамических параметров комплексообразования (АН" и ДБ"), определяемые методом

оптимизации кривых плавления, зарегистрированных на разных длинах волн (например, на 260 и 280 нм), близки между собой; г) взаимодействующие алиго-нуклеотидные цепи не формируют стабильных внутримолекулярных структур, регистрируемых методом термической денатурации и при анализе температурных серий спектров кругового дихроизма (КД) (Davis T. M., et al., 1998).

Исследование влияния ионной силы раствора на термостабильность ДНК-комплексов проводили при изменении концентрации ионов натрия от 0.022 до 1.022 М. Концентрация соли не оказывала существенного влияния на величину энтальпии комплексообразования, что согласуется с литературными данными для нативных олигонуклеотидных комплексов (Williams А.Р., et al, 1989), поэтому принимали приближение ДН°а = АН". Величина гипохромного эффекта в спектральном диапазоне регистрации плавления дуплекса, в том числе и на длине волны, на которой регистрируется изменение спектральных свойств хромофорных остатков ненуклеотидной природы при диссоциации комплекса, также оказывается не зависящей от ионной силы буфера. Совокупность этих данных позволяет заключить, что ионная сила раствора влияет только на равновесное распределение оц и дц форм при комплексообразования и не оказывает существенного влияния на структуру комплекса. Во всех случаях снижение ионной силы раствора приводит к падению термостабилыюсти исследуемых комплексов, а в интервале концентрации ионов Na+ 0.022 - 0.182 M наблюдается линейная зависимость Т„, комплексов от log[Na*], что позволяет использовать модель конденсации противоионов (An) для определения электро- (AG°C) и неэлектростатической (AGV) составляющих в экспериментальных величинах свободной энергии формирования дуплекса с использованием выражения (5). В этом случае представляется возможным выделить эффекты, сопряженные с реализацией неэлектростатических (стэкинг, водородное связывание и др.) и электростатических (кулоновских) взаимодействий, обуславливающих результирующий вклад элементов структуры нативных и модифицированных комплексов в наблюдаемые термодинамические параметры образования исследуемого дуплекса.

Термодинамические эффекты (AAG°T, ААН° или AAS0), сопряженные с введением в структуру исследуемого комплекса модификаций и с реализацией дополнительных, например, контактных, взаимодействий олигонуклеотида при гибридизации встык в тандемах, рассчитывали относительно величины термодинамического параметра, определенного для комплекса сравнения. В качестве комплексов сравнения выбирали нативные, в том числе и тандемные, или модифицированные дуплексы, не требующие параметризации их термодинамических эффектов: AAG°t= ДО°т(исследуемый комплекс)-АО°т(комплекс сравнения) (6).

Разработка схемы термодинамического описания равновесного формирования комплексов олигонукчеотидных тандемов на общей ДНК-матрице

Термодинамический анализ взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-матрицами при гибридизации встык с образованием комплексов матри-

iia/(o.viconynieomii(H-ojiicoiiyiaeoimtd(bi)) проводили па модельных системах трех типов (Схема 1): гибридизации олигонуклеотидов с о;/ участком матрицы, образующей минишпильку (I), комплексообразование ДНК-матрицы и тандемов олигонуклеотидов, состоящих из двух (II) или трех (III) коротких олигомеров.

Первым этапом физико-химического анализа тандемного комплексообразо-вания олигонуклеотидов (комплексы II и III типов) было построение математической модели, описывающей температурную зависимость эффективности фор-

мирования дуплексов. Схема 2.

К| Кг К» .

M + Li - MLi M+U - Mb М + 1д - Mb

K12K1 K12K2 KijKJ

MLi + Li - ML:Li MLi+U - ~ ML2L1 MLi + lj ~ ML1L.1

K1.1K1 Ki Кз

MLj + LI ~ M Li Li Mb+Li " MUU MU + ü " »ILiü

KuKiaKi K12K2 KijKJ

MLäLj + Li - " ML1L2LJ MLiU + Li:" * MLiLaL» IML1L2 + Ls MLiULj

где К; - равновесная константа «независимого» связывания ¡-го сшгонуклеотида с соответствующим сайтом мишени; К12, К|3- конста1ггы сгэкинг-взаимодействия дуплексных участков центрального (Ь|) и фланкирующих его и олигонуклеотидов.

Видно, что наряду с формированием полноразмерных тандемных комплексов протекает образование «независимых» дуплексных форм с заполнением лишь части мест в составном сайте связывания ДНК-матрицы с тандемом. В случае двух- или трехкомпонентных тандемов степень ассоциации одного из олигонуклеотидов (0|) с соответствующим ему комплементарным участком матрицы может быть представлена лишь в неявном виде через его эффективную константу связывания К,*

а,(а,„)=0.5х[2+п/(К^*Ст) -л/(2+п/(К,'ффСт))2-41 (7), где

где oj - степень связывания ¡-го олигонуклеотида с соответствуюищim сайтом мишени М (1=1 дтя центрального компонента тандема и ¡=2, 3 дтя фланкирующих олигонуклеотидов); п - число компонентов тандемиой системы матрица+олигонуклеоптды:, С, - сумммариая концентрация компонентов системы матргща+олнготклеотиды (для стсхиомстрической смеси олигомеров,в случае комплекса двухкомпонентного тандема M/fLt+L^ равновесную константу комплексообразования Кз третьего компонента Lj в уравнении (7) принимали за бесконечно малую величину.

Термодинамический анализ образования тандемных комплексов типа II и III можно провести при решении уравнения (7) только в численном виде, используя известные величины индивидуальных равновесных констант комплек-сообразования олигонуклеотидов и констант стэкинг-взаимодействия между дц участками тандемного комплекса. Аналитическое описание образования ком-

плексов даже двухкомпонентных тандемов в общем случае затруднено, однако, при стехиометрическом соотношении компонентов Li+L2 и матрицы М можно определить некоторые закономерности комплексообразования. Суммарную степень ассоциации матрицы (ам) в температурном интервале плавления тандемно-го комплекса M/LiL2 можно представить в виде суммы степеней ассоциации матрицы в тандемном комплексе M/L1L2 (а1) и «независимых комплексах» M/Li и M/L2 с отдельными компонентами тандема \\L2 (a"i и аН2 соответственно): ам = ат + aHi + ан2.

Анализ схемы равновесного распределения форм для комплексов двухкомпонентных тандемов M/(Lt+L$ (при стехиометрии компонентов) показывает, что выражение эффективности формирования «независимых» комплексов НК-матрицы и компонентов тандема при его Т„, (ат = 0.5) имеет вид:

0.5 ^__ а„ = 0.5 _

|а + к12, и 2 1 + +

Отсюда следует, что при значительно различающихся гибрндизационных свойствах олигонуклеотидов, например, при K2»Ki (а'\ = 0, аН2 = 0.5), значение суммарной степени связывания матрицы (в пределах участка связывания тандема) при температуре плавления тандемного комплекса оказывается близко к 1 (ам = ат + а"; = 1). В этом случае образование комплекса M/LiL2 будет обусловлено связыванием более слабого компонента тандема £/ с уже предформирован-ным комплексом M/L2, а уравнение (7) упрощается до (8).

1 I-г---;--. кк а1 (8),

= 1 +---±---(1 + -±-)2 - 1 К^и - -

2К,К12М0 V 2К,К12М0 (1 - а^ М0

где М0 -начальная концентрация матрицы М.

Важно отметить, что для описания тандемных комплексов 1-типа, формируемых при гибридизации олигонукпеотида встык с предформированным стеблем стабильной минишпильки, может быть использовано выражение (8).

При близких гибрндизационных свойствах олигонуклеотидов ¿/ и Ь2 (К1~К:) эффективность их связывания с матрицей при Т„, тандемного комплекса одинакова и зависит только от эффективности кооперативного контакта (К12):

0-5 , а„ = а* + 2а"

а. = а, = а = ---------- "

1 + л/1 + К12

В этом случае значения а" уменьшаются от величины -0.2 (при Кп=1) до 0 (при К):»1). Следовательно, при реализации высокоэффективного кооперативного контакта (К|2»1) «независимым» связыванием компонентов тандема при его Т,„ можно пренебречь (ан —► 0). Тогда во всем температурном интервале комплексообразование именно тандемного комплекса будет определять степень ассоциации НК-мишени, что эквивалентно использованию схемы тримолеку-лярного равновесного процесса в рамках модели двух состояний:

М + + ¿2 А/£,£г , где Кэф* = К,К2К,2 = ам/((1 -ам )3Л/02) (')•

Выявленные закономерности дают возможность на качественном и, при наличии характеристических параметров, на количественном уровне прогнозировать поведение тандемов или же проводить термодинамический анализ экспериментальных данных (например, кривых плавления), получаемых при использовании составных комплексов на основе тандемов сшигонуклеотидов.

Разработка схемы термодинамического описания равновесного формирования комтексов азигонукпеотидпых тандемов на общей ДНК матрице

Мостиковые олигонуклеогнды (МО) являются аналогами олигонуклеотид-ных тандемов, компоненты которых ковалентно связаны ненуклеотидной вставкой. Термодинамический анализ комплексообразования одигонуклеотидных производных такого типа до начала данной работы был проведен лишь для случаев, имитирующих наличие в Л(ДНК апуринового/апиримидинового сайта и для ограниченного набора ненукпеотидных линкеров (например, Уе.чпагег С. е1 а!., 1989). Разработка аналитической модели, описывающей образование дуплекса, в котором вставка соединяет примыкающие друг к другу на общей ДНК-матрице ¿¡/-фрагменты, проведено в представленной работе впервые. В составе МО, содержащего, например, два нативных ДНК-фрагмента (а/лП,а2), ненуклео-тидный линкер (л„) нарушает регулярность цепи ДНК, что может затруднять сборку полноразмерной ДНК-спирали по модели «застежка-мата» и позволяет предположить поэтапную сборку модифицированного комплекса (Схема 3):

Степень возмущения, вносимого вставкой, должна определяться длиной и конформационной подвижностью линкера, которым соединены олигонукпео-тидные фрагменты а| и аг, и находить отражение в величине константы К12, характеризующей эффективность формирования кооперативного контакта между двумя частями олигонуклеотцда в составе дуплекса. Наличие промежуточных этапов при комплексообразовании МО, в общем случае, приводит к тому, что равновесная схема такого процесса не может быть представлена в рамках приближения двух состояний (ог/ либо дц). Следовательно, необходимо определить условия, при которых возможно описание таких комплексов при термодинамическом анализе в рамках метода термической денатурации комплексов НК. Нами показано, что эффективная константа равновесного связывания (К"'х1>) олиго-мера М/а/л"'а2 может быть представлена согласно выражению (10):

Схема 3.

К**"* = К,К,(—+—+К„)

К., К.!

Тогда степень ассоциации НК-мишени в составе полноразмерного комплекса М/а/л"'а2 рассчитывается по (11):

а(Т) = 1 +

к* • сг

1 + •

(11).

Ст,

Анализ выражения (10) свидетельствует, что условием применимости модели двух состояний для описания комплексообразования МО является неравен-

ствока1, К>2 >> 1/К,, • В этом случае доля промежуточных форм М-Д/ и М-а2

становится пренебрежимо мала, по сравнению с количеством полноразмерного дуплекса. Таким образом, для описания системы применимо приближение двух

г^эфф — I/ . .

состояний с величиной эффективной константы, равной «2 12, что

позволяет рассматривать формирование комплекса МО по аналогии с комплек-сообразованием несамокомплементарных олигонуклеотидов.

Описание равновесной схемы образования конкатемерной структуры на основе двух олигонуклеотидов

Формирование конкатемерной структуры на основе пары из двух олигонуклеотидов/! и В возможно, когда в каждом из них имеются два типа фрагментов I и причем нуклеотидная последовательность фрагмента ¡А комплементарна фрагменту ¡В, а/4 - фрагменту}В. Для обеспечения сборки конкатемерной системы необходимо, чтобы взаимокомплементарные фрагменты (как ¡, так и .¡) находились на одном и том же 5'- или 3'- конце в последовательностях А и В.

( А у д I! | д- АН" , у Рис. 1. Формирование

I):;'1I '■ у + гт;"' т 1, Г/' ■'? конкатемерной сгрукгу-

' А / ,Ч г \ ' , ,,,„ ры при ассоциации двух

_____1 У .! Л, ....... V • I' 'I/'

Tj.ii.iiii п -¡—У-1 1 ' ■ I - . .у различных олигонук-

5' .V .V 5'

За)

ЗЬ)

> ' (в„. леотндов (А и В). Кт-

/ /[ >. /|й"| 11. .*. л:<> , -У. ■ равновесная константа

, , " J I образования дуплексного

, формирование кооперативного кч>|ггак-?п . .

I | 1 | к , . 11 ( / элемента фрагментами 1

J I

АН" У К,К. \Atli ;

5)

(Л одигонуклеотцдов А или В. Кк- константа образования кооператив> ' > ' > 1 ного контакта между ) II { , ААРу | | к, 1 \ j парами оснований вбли-

I

1 зи о/^-разрыва в двойной

спирали ДНК.

На первом этапе комплексообразования олигонуклеотиды АнВ формируют дуплекс АЕР (или А В'') с липкими концами .ц (или и) (Рис. 1, этапы 1 и 2). Образование этого и всех последующих комплексов происходит в приближении модели двух состояний, предполагающей отсутствие в системе альтернативных состояний олигонуклеотидов, кроме ассоциированных и свободных форм. На втором шаге происходит присоединение к комплексу АВР (или А В1') еще одного

олигонуклеотида (А или В) с образованием комплекса из трех олигонукпеотидов (Рис. 1, этапы За-4) и т.д. Здесь и далее мы считаем (в качестве приближения), что эффективности формирования кооперативного контакта в местах о!/-разрывов между олигонуклеотндами А и В близки, т.е. дня обоих стыков эффективность контактных взаимодействий имеет одинаковую равновесную константу Кк. Видно, что можно выделить четыре типа конкатемерных структур: AKB,¡', A^iBj, A„B^./J - где верхний индекс обозначает тип липких концов, а нижний (п= 1,2,...со) - количество молекул данного олигонуклеотида в комплексе.

Концентрация каждого типа конкатемерной структуры любой длины может быть выражена через концентрации свободных олигонуклеотидов А и В: [АпВ'>] = К-^К^К^АУЩ"

[^„Bf] - K¡"~2 К" К"'1[А]"[В]" (12),

К., В»] = K;",K^K"J[AY-'[B]n

где А'„ Kj, Kk - равновесные константы образования дуплексной структуры ¡-типа, j-типа и константа образования кооперативного контакта на стыке дуплексных структур i и j.

Уравнение материального баланса можно записать в виде суммы вкладов всех возможных полимерных структур и олигонуклеотидов в свободном состоянии. Например, для компоненты Л оно будет выглядеть следующим образом:

аз).

n=f п-1 я=! п-\

Сходимость каждой суммы в уравнении (13) определяется условием:

К;К,К^А\[В\< 1 (14).

При равенстве начальных концентраций олигонуклеотидов ([А]0=[В]0), проводя суммирование с использованием (12) и учитывая, что [А]=[В], получаем:

= + + KJ+KkKlKJ([A] + [A](Kk -lX[A]2K;K,Kj -2))) (,5)

(lAfK'K.Kj-l)2

Уравнение (15) описывает связь между равновесной концентрацией свободных олигонуклеотидов в системе ([А]), их начальной концентрацией ([А]0) и равновесными константами комплементарного (K¡, Kj) и кооперативного (K¡) взаимодействий между олигонуклеотидамн. Видно, что в общем виде из уравнения пятой степени (15) нельзя получить аналитическую зависимость для [А], т.к. оно не имеет решения в общем виде. Однако определить равновесную концентрацию олигонуклеотида А в свободном состоянии возможно, решая (15) численным методом при фиксированном значении начальной концентрации олигонуклеотидов и равновесных констант. Следует отметить, что в частном случае, когда отсутствует кооперативное взаимодействие между олигонуклеотидамн, а стабильности комплексов i и j равны, т.е. выполняются условия Ку=1 и K¡ =Kj=K, (15) значительно упрощается. В этом случае удается найти аналитическое выра-

13

жение для концентрации олигонуклеотидов в свободном состоянии в зависимости от их начальной концентрации и равновесной константы формирования кон-катемерногокомплекса: ^_щ_ 1 + 2[Л]0К—^1+4[Л]0К (16).

2[А\аК2

Такое упрощение позволяет проводить прогаостический анализ эффективности формирования конкатемерных комплексов. Кроме того, отметим, что в этом приближении выражение для расчета Т„, в точности совпадает с таковым, применяемым для описания свойств обычного дуплекса, состоящего из двух несамокомплеменгарных олигонуклеотидов (2).

Таким образом, в работе проведен анализ схем равновесного образования всех заявленных типов составных олигонуклеотидных комплексов и определены условия применимости различных аналитических зависимостей для детального физико-химического исследования таких систем, с целью количественной ха-ракгеризации энергетических эффектов от реализации различных взаимодействий между отдельными элементами структуры исследуемых комплексов, несущих остатки ненуклеотидной природы или без них.

Базы данных термодинамических параметров образования составных комплексов на основе нативных олигонуклеотидов и их производных

Разработанные алгоритмы термодинамического анализа позволили выработать критерии выбора структуры модельных объектов, обеспечивающих возможность их детальной физико-химической харакгеризации с целью параметризации вкладов от формирования отдельных элементов структуры комплексов ДНК. В ходе работы был синтезирован широкий набор олигонуклеотидов и их производных, обеспечивающий возможность образования как всех типов изучаемых составных комплексов, так и соответствующих им контрольных дуплексов. Структуры модельных олигонуклеотидов подбирали таким образом, чтобы анализируемый набор комплексов содержал все возможные параметризуемые структурные элементы (нативные динуклеотидные шаги спирали, коаксиальные стыки, динуклеотидные шаги со вставкой, ближайшие соседи, мисматчи и т.д.), представленные неоднократно. Методом термической денатурации были определены величины энтальпии и энтропии комплексообразования созданных модельных олигонуклеотидов в стандартных буферных условиях (1 М ЫаС1, нейтральный рН) и/или в условиях с измененной ионной силой раствора. Кроме того, в базу данных включали представленные в литературе величины термодинамических параметров образования интересующих типов комплексов, определенные другими группами исследователей в результате систематических физико-химических исследований. В случае если компоненты комплексов формировали внутримолекулярные структуры (например, шпильки), их влияние на наблюдаемые энергетические параметры межмолекулярного связывания олигоме-ров учитывали с помощью специально разработанного алгоритма. Основные характеристики созданных баз данных термодинамических параметров (ДН°, ДБ", ДС^) образования различных типов комплексов представлены ниже.

База данных для тандемных и контрольных простых комплексов олигонуклеотидов и их производных включает в себя данные о формировании более чем 200 не модифицированных тандемных комплексов, главным образом 1-типа, в том числе 90 совершенных и 113 содержащих мисматч на стыке дуплексных структур. Дополнительно включено 17 наборов энергетических вкладов от формирования коаксиальных контактов между Л/ДНК, опубликованных ранее /аЬиаа У. <?/ а!., 2003). Представлены параметры для тандемных комплексов с одним или двумя коаксиальными контактами. Диапазон изменения величины ДСзу, характеризующей вклад коаксиального стэкинга в стабильность дуплекса: 0.8-4.8 ккал/моль. Кроме того, в данной базе данных представлены параметры, описывающие гибридизацию встык гептануклеотида и его производных, несущих 5'-концевые остатки лигандов, которые локализуются в тандемном комплексе вблизи о;/-разрыва в Л/ДНК. Для этого набора модельных дуплексов определены параметры их образования в стандартных условиях (1 М №С1, нейтральный рН) и при пониженной концентрации соли (до 22 мМ [№+]). Более 40 простых бимолекулярных комплексов охарактеризованы в качестве образцов сравнения, позволяющих определить энергетический эффект от реализации кооперативных контактов с различным составом взаимодействующих структурных элементов.

База данных для комплексов мостнковых олигонуклеотидов включает 375 наборов термодинамических параметров образования комплексов с участием нативных олигонуклеотидов (311) и МО (64) в стандартных условиях. Длина комплексов варьирует от 4 до 20 пар оснований (п.о.). Использованы МО, в структуре которых присутствует одна или две ненуклеотидные вставки на основе фосфодиэфира диэтнленгликоля (ОЕО, см. схему 2). Диапазон варьирования СС-состава: 0-100 % и 19-74 % для комплексов на основе нативных и мостиковых олигонуклеотидов, соответственно. Диапазон изменения свободной энергии комплексообразования ДС^: -3.6 - -24.6 ккал/моль. Средняя представленность динуклеотидных шагов спирали каждого типа: нативных - 314, модифицированных - 4.7 раза. Данная выборка дополнена представленными в литературе величинами термодинамических параметров комплексообразования нативных олигодезоксирибонуклеотндов (278 наборов) (АПат Н. Т.. еI а!., 1997; йок/ус: Ш„ с/ а!., 1995; Тапака Е, е( а!., 2004). Кроме того, в базу включены две дополнительные выборки параметров, характеризующих: 1) комплексообразование МО, в которых более 2-х модифицированных вставкой динуклеотидных шагов, и МО, несущих вставки, отличные от ОЕС1, или имеющих несколько подряд введенных вставок (< 5 шт.) одного типа; 2) зависимость стабильности комплексов нативных (1456 наборов) и мостиковых олигонуклеотидов (124 набора) от ионной силы раствора ([№+]: 0.001-1.024 М; 0.25 мМ-0.3 М) при нейтральном значении рН. Всего представлено 160 дуплексов разного состава. Диапазон изменения СС-состава - 20-87 %; Т,„ дуплексов - 12-89 "С; концентрации олиго-

нуклеотидов - 5-10"3-2-10-6М. Базу данных формировали с использованием собственных данных и данных из литературных источников (Оп'сгаггу Д., е/ а!.. 2004; Шкапо 8., <?/ а!., 1999; и др.).

Термодинамический анализ энергетических эффектов от образования ДНК-комплексов проводили тремя основными способами, анализируя: 1) величины вкладов (например, АДС'т) от введения в структуру дуплекса модифицирующих остатков согласно уравнению (6) для ограниченных выборок комплексов; 2) полные величины термодинамических эффектов от комплексообра-зования с помощью метода множественной линейной регрессии с целью определения вкладов от формирования отдельных элементов дуплексов (модель ближайших соседей) в соответствии с их представленностью в систематически подобранных наборах охарактеризованных Л/ДНК; 3) экспериментальные величины с помощью метода поиска решения с целью определения параметров модели, описывающей физико-химические закономерности образования дуплексов. Последний способ использовали, когда аналитические зависимости описываемых величин не были линейно зависимыми от варьируемого параметра (например, Т„, У5 [Ыа"]).

Определение унифицированных параметров коаксиальных взаимодействий оснований на стыке дуплексных структур проводили с помощью метода множественной линейной регрессии (МЛР), анализируя: 1) для совершенных комплексов - величины термодинамических эффектов, обуславливающих повышение термостабильности структуры при переходе от тупоконечного комплекса к тандемному (ДДС°т= ДСт{тандем) - ДС^простой дуплекс)); 2) для тандемных комплексов, содержащих мисматч вблизи ог;-разрыва, - термодинамические эффекты, обуславливающие изменение термостабильности дуплексной структуры гибридизованного встык олигонуклеотида при переходе от совершенного тандемного комплекса к несовершенному (ДДС-г^ ДС-Ктандем несов.) - ДС-^тандем сов.)). В последнем случае величины ДАС'т рассчитывали, используя величины термодинамических параметров образования тандемных комплексов с участием одной и той же ДНК-матрицы, т.е. мисматч на стыке дуплексов создавали заменой основания в составной цепи тандемного дуплекса.

В результате анализа был выявлен набор структурных элементов тандемных комплексов, чье присутствие в составном дуплексе статистически значимо влияет на наблюдаемую эффективность контактных взаимодействий при гибридизации олигонуклеотидов встык с предформированной дуплексной структурой. Методом МЛР определены величины унифицированных термодинамических параметров (27 инкрементов), которые являются линейно независимыми и хорошо описывают эффективность реализации всех возможных кооперативных контактов в совершенных тандемных комплексах ДНК (Рис. 2). В число наиболее значимых параметризованных элементов структуры комплексов входят: 16 типов возможных динуклеотидов с (¡(/-разрывом; 6 типов оснований в окружении никованного динуклеотида; 5'-фосфомоноэфирный остаток в нике; олигопу-

риновые тракты в разных позициях матричной цепи (2 шт.) и др. Полученные параметры с хорошей точностью описывают термодинамический эффект от образования всех исследованных типов коаксиальных контактов, в том числе и для тандемных систем, параметры которых не были включены в анализируемую методом МЛР выборку. Видно (Рис. 2), что характеристики контактных взаимодействий п.о. значительно отличаются от унифицированных энергетических вкладов, описывающих формирование динуклеотидных шагов нативной ДНК-спирали (АИат Н.Т., е/ а!., 1997). Это указывает, что коаксиальное стэкинг-взаимодействие принципиально отличается от комплементарного связывания оснований при формировании дц структур. В последнем случае значительный вклад вносит формирование водородных связей, в то время как при формировании контакта на стыке дуплексов основной вклад дает образование стопки оснований. Так, например, плохое перекрывание оснований одной цепи в составе -шага не обеспечивает высокого термодинамического эффекта от реализации такого типа контактов между стыкующимися фрагментами тандемного дуплекса. Эффективное перекрывание оснований в случае реализации

как и

? ЛЯ3-контактов, делает взаимодействие оснований вблизи ог/-разрыва в Л/ДНК наиболее энергетически выгодным (ДДО°з7 до - 3.5 ккал/моль).

Б

О М(. .17(Х У), ккял/нолк -3.0

-2.5

-2 -2.0

-4

-5

0.0

-Ь

Рис. 2. (А) Корреляция экспериментальных величин свободной энергии образования коаксиального контакта в тандемных дуплексах и соответствующих величин, рассчитанных с помощью унифицированных термодинамических инкрементов. (Б) Зависимость унифицированных энергетических вкладов, возникающих при образовании коаксиального стэкинга фрагментов составного дуплекса (серые столбцы) или шага нативной спирали ДНК (черные столбцы) (АНаш Н. Т., е! а!., 1997), от типа пар оснований в соответствующем динуклеотидном шаге.

Термодинамический анализ всех возможных мисматчей па стыке дуплексных структур проводили, сопоставляя изменения величин энергетических параметров образования олигонуклеотидами (совершенным и с однонуклеотид-ной заменой) тандемных комплексов 1-типа с одной и той же матрицей ДНК (Рис. 3). В результате обработки соответствующей базы данных с помощью метода МЛР определен набор из 32 унифицированных характеристик, среди кото-

17

СГ АС ГС СГ СТ XI ГТ СТ (¡А АА ТА СА м; АС тс сс \ или XV

&АС°37(жспер.), ккал/моль у - 0.972ч - 0.057 К*' - 0.976 п=9|)

ДДС°37(расчет), ккал/моль

рых по 12 инкрементов, описывающих все типы мисматчей (рУ/2, X/Z') в 3'- и 5'-позициях никованного шага Л/ДНК (5'-Х*рУ-3'/2£, где • - кооперативный контакт) (Рис. ЗБ); 4 инкремента, определяющие тип динуклеотидного шага матричной цепи (5'-ZZ'-Зl) в составе контакта шага Л/ДНК: тКН, т КР. тРР или тРЯ; 1 инкремент, описывающий изменение типа шага никованной цепи 5'-Х'рУ-З' с пурин-пиримидинового (КР) в стыке без мисматча на пиримидин-пиримидиновый (РР) в мисматч-содержащем шаге - инкремент я1Г<Р РР; 1 инкремент для исчезновения специфического совершенного контакта З'/СТ при переходе к мисматч-содержащему шагу §Х«рУ-3'/ХГ, где Х=Т, в, С, и дополнительные инкременты (2 шт.), характеризующие дестабилизирующий эффект любого мисматча на конце предформированной стабильной дуплексной структуры (например, шпильки) при контакте с ней менее стабильного с)г/ фрагмента, не содержащего мисматч, или содержащего экспонированный к стыку концевой мисматч указанного типа.

Рис. 3. (А) Корреляция экспериментальных и расчетных величин термодинамических эффектов (AAG037), характеризующих дестабилизацию тандемного комплекса при наличии мисматча на стыке дуплексных структур. (Б) Термодинамические инкременты AAG"j7(мисматч) различных типов мисматчей в 3'- (N*pY/z) и 5'-положениях (X(/z>pY) динуклеотидного шага с о!/-разрывом. pY/z и X(/z') - некомплементарные пары, z и z' - основания матричной цепи.

Из представленных данных видно, что дестабилизирующие эффекты от мисматчей, расположенных с разных сторон от ог/-разрыва ДНК, сопоставимы. Минимальную дестабилизацию вызывают мисматчи G/A и G/G. Сравнительный анализ величин термодинамических эффектов, характеризующих эффективность дискриминации мисматчей, локализованных в различных частях дуплекса (концевой или внутренний участок), показал, что в среднем мисматч вблизи оц-разрыва дестабилизирует дуплекс в большей степени, чем такой же мисматч на конце дц спирали, но в меньшей, чем внутренняя некомплементарная пара оснований. Для гибридизации встык нами не выявлено ни одного случая, когда мис-матч-содержащие комплексы были бы более стабильны относительно совер-

шенных дуплексов с близким нуклеотндным составом. В то же время, с использованием простых минидуплексов с нуклеотндным нависанием (4 п.о.), установлено, что концевые G/A-пары обеспечивают максимальную стабильность комплекса в серии: (pAGCGAb>(pCGCGAb>(pAGCTAR

Таким образом, проведенный комплексный анализ энергетических параметров образования коаксиальных стыков Л/ДНК указывает на то, что этот тип взаимодействия в тандемных системах относится к отдельному классу НК-НК-взаимодействий и без проведенной в данной работе параметризации не было возможности проводить прогностический расчет комплексообразующих свойств тандемов олигонуклеотидов.

Влияние 5'-концевых остатков азинов и других ароматических полициклических соединений на термодинамические параметры формирования простых и тандемных комплексов проводили с использованием производных гептануклеотида (Схемы 4 и 1). Было показано,

что наличие на конце дуплекса Схема 4.

(DR)// СС А А АСА /»TGTTTGGC полицию™- m„„,mm„_ „„^

~ ~ 5 pTGTTTGG----CGCG,

ческой ароматической группы (DR) во всех с А

J ACAAACCpRD GCGA

случаях вызывает значительную стабилизацию «v-™»«^—^

короткого дуплекса ДНК (7 п.о.). В зависимости от структуры ароматического остатка Тя, такого комплекса возрастает на 11-22 °С. В случае гибридизации встык эффект от введения остатков не столь однозначен. Формирование кооперативного контакта (5'-G»pC-37GC) между немодифицированными дуплексами увеличивает Т„, гептануклеотидного дуплекса на -12 "С. Введение ароматических ненуклеотидных остатков в точку контакта дц структур может как несколько понизить (FluR, PlizR, PhoR, PhnR", Ant), так и повысить (Rub, Mit, PltkR, PltitiR) стабильность тандемного комплекса (для [Na']=182 мМ). Максимальную дестабилизацию (-13 °С) тандема вызывает остаток флуоресцеина FluR, который практически предотвращает контактные взаимодействия на стыке öi/ДНК (согласуется с Vasiliskov V.A., eta!., 2001). Наиболее эффективно, из рассмотренных остатков, гибридизации встык способствовали производные анграхинона (АТ,„ до +7), а также поликатион на основе феназиния (PltkR) и аннелированные фе-назиниевые производные (PhiiiR. /=1-3).

Анализ термодинамических эффектов от введения различных группировок свидетельствует, что природа стабилизации ДНК ароматическими остатками существенно варьирует, что может быть установлено при рассмотрении относительных величин различных (ААН"( DR), AAS "(DR), неэлектростатических (не) и электростатических (е) (кулоновских)) энергетических вкладов в наблюдаемую величину AAG°t(DR) взаимодействия группировки с ДНК. Исследование зависимости термостабильности 0/?-модифицированных и контрольных (где DR -остаток n-бутиламина, имитирующий линкерную группу) комплексов от концентрации противоионов в растворе ([Na"]: 22-182 мМ) позволило разделить пе-и е-составляющие такого взаимодействия (Рис. 4).

2.5 2 1.5

i I

о

>11.5

4? 4? 4? 4f4f

Рис. 4. Величины неэлектро-сгатической (не) и кулонов-ской (е) составляющих суммарного термодинамического эффекта, сопряженного с введением В/?-остатков в точку контакта дуплексных структур ДНК ДДСзЛДД) (относительно комплекса бутиламинового производного ВирЫ7/рЫ16).

Ml4 Схема 5.

' TTGAAGG---GGACCGC

AACTTCCp pCCTGGCG N?Azh

Видно, что для подавляющего числа ароматических остатков существенный вклад в стабилизацию коаксиального стыка вносят благоприятные изменения в электростатических взаимодействиях, сопряженные с введением D/f-группы. Наибольший эффект такого типа оказывает /V/AÄ-остаток, несущий три положительных заряда (Схема I), два из которых расположены в остатках экзоцикличе-ских заместителей. Группировки, не несущие положительный заряд, интеркали-руя между парами оснований в (-«(-разрыве, по-видимому, способны экранировать электростатическое отталкивание смыкающихся при гибридизации встык дц структур. Наиболее эффективная стабилизация тандемных комплексов является результатом реализации благоприятных для комплексообразования (AGu37<0) пе- и ^-составляющих наблюдаемого термодинамического эффекта от введения интеркалирующего остатка, например, остатка Rub. Таким образом, достичь дополнительной стабилизации тандемных комплексов за счет введения на стыки дуплексов интеркалирующих остатков возможно только при условии эффективного взаимодействия остатка с каждым из контактирующих спиральных фрагментов.

Структурные исследования тандемных комплексов проводили, используя три основных метода: 2Д-ЯМР спектроскопию, спектрополяриметрию кругового дихроизма (КД) и компьютерное моделирование (AMBER). В качестве образцов изучали четыре тандемных комплекса, представленные на схеме 5.

Структурные особенности локализации остатков перилена (Per) и арилазида (Azli) и их взаимодействие с гетероциклическими

hn hn

_^-N-N

F

f f

Me

'■pTGGA-GCTG PhnRpN'i ACCToCGACp pNt

nh <jh2ch20h

CJlcbo

Me

»'pTGGA-GCTG P»'< ACCTpCGACp pH<

ACCJ t^GACp pH<Es £s£s HjC p

E SN

основаниями ДНК были изучены с помощью спектров КД. Сами по себе ненук-леотидные группировки не имеют хиральных центров и не должны проявляться в спектрах КД. Взаимодействие этих остатков с НК может приводить к появлению спектров индуцированного КД, которые являются характеристиками их ориентации относительно гетероциклических оснований (Lyng R., el al„ 1987). За поведением группировок следили, регистрируя температурные изменения в спектре КД для тандемного комплекса М u/N7A~Jt+PerN'? (Рис. 5). С ростом температуры в процессе плавления тандемного ДНК-дуплекса полностью исчезает сигнал индуцированного КД в области 300-350 нм, в то время как отрицательные полосы в видимом диапазоне длин волн (400-460 нм) лишь несколько уменьшаются по амплитуде. Такое поведение этих полос может объясняться тем, что при плавлении дуплекса остаток перилена с коротким линкером теряет контакт с матрицей, сохраняя перекрывание (следовательно и индуцированную хиральность) с ближайшим к нему гетероциклическим основанием несущего его олигонуклеотида-адреса. Остаток Azh, напротив, имеет достаточную конформа-ционную вариабельность и в процессе плавления теряет взаимодействие с ДНК. Можно предположить, что остаток Per интеркалирует в ДНК дуплекс, а лабильная арилазидная группировка контактирует с ней со стороны одной из бороздок. Методом термической денатурации с многоволновым режимом детекции показано, что остатки арилазида и перилена, как каждый отдельно, так и оба одновременно, взаимодействуют с di/ДНК и существенно ее стабилизируют. При этом, по данным спектров КД, структура двойной спирали остается близкой к В-форме. С помощью компьютерного моделирования предложена трёхмерная структура такого тандемного комплекса, которая согласуется с полученными экспериментальными результатами (совместно с Ковалем В.В., ИХБФМ СО РАН) (Рис. 5).

15.0

? Ч

1

-7.5 -15,0

г

Рис. 5. (Слева) Температурные изменения в спектре КД тандемного комплекса M,4/N7pAzh+PerpN'7. Шаг по температуре для каждого спектра составляет 10 °С. (Справа) Локализация сенсибилизирующего интеркалятора (Per) и фотоактивируемой группировки (Azh) в центральной части ДНК-тандема поданным компьютерного моделирования (вид со стороны ника).

Детально пространственную структуру тандемных комплексов изучили на примере трех модельных дуплексов, образованных парой тетрануклеотидов или их производных с общей октануклеотидной ДНК-матрицей. Исследовали изменение структуры составного комплекса при введении в место стыка дуп-

лексных участков интернирующей фуппировки (М-2-гидроксиэтил)феназиния (РИп) или пары гидрофобных остатков эстрона (£.\)) (Схема 5). Оба типа модификации приводят к стабилизации тандемных дуплексов, однако природа этого эффекта не была ранее установлена. Конструирование данных модельных комплексов выполнено автором лично, структурные исследования были осуществлены Денисовым А.Ю. (ИХБФМ СО РАН) в группе проф. 1 СИаНорас/куауа

Рис. 6. Пространственные структуры тандемных комплексов: (А) нативпого М/рЬ^+р.У^ (РОИ 10: 1ТА1М) и (Б) модифицированного остатками эстрона (РОВ Ю:

1Е88) и (В) феназиния Мя/р^+Р/тЛрН'*

Методом 2Д-ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования с экспериментальными ограничениями для нативного тандемного комплекса и его модифицированных аналогов показано, что дуплексные участки принимают структуру, близкую к В-форме ДНК-спирали. Нативный комплекс малоотличим от классической спирали ДНК. Пары оснований в точке «/(-разрыва сведены за счет стэкинг-взаимодействия. В результате конформация никованного динуклеотид-ного шага в спирали ДНК практически не отличается от нативного шага без повреждения. Наличие стероидных остатков существенно возмущает структуру тандемного комплекса. Сближаясь в пространстве, объемные гидрофобные группировки раздвигают пары оснований на стыке дуплексов на 5-9 А. Результатом сведения остатков эстрона является изгиб и частичное расплетание спирали ДНК. Непосредственного контакта стероидных каркасов зарегистрировать не удалось, они остаются удаленными друг от друга на расстояние ~ 3 А, соприкасаясь, по-видимому, своими сольватными оболочками, в которых молекулы растворителя структурированы вокруг гидрофобного неполярного ядра. Такого контакта оказывается достаточно для стабилизации тандемного комплекса за счет повышения эффективности кооперативного контакта между его модифицированными частями (Рис. 6).

Выявленная по данным спектров 2Д-ЯМР сеть контактов между необмени-ваемыми протонами в Р/ш-содержащем комплексе доказывает, что азиновый остаток интеркалирует непосредственно в место «/-разрыва цепи ДНК, что дополнительно подтверждается данными КД-спектрополяриметрии. Остаток РИп

находится в непосредственном взаимодействии с нуклеотидами Т5 (к которому присоединен краситель), С4 прилегающего тетрануклеотнда и А12, находящегося в составе комплементарной последовательности ДНК-матрицы (Рис. 6). Остаток красителя располагается планарно относительно плоскости пары оснований Т5-А12 (г=3.5-4 А) дуплекса, вытесняя при этом пару С4-С13 прилегающего дуплекса. Длинная псевдоось трнциклической системы крас1ггеля находится под острым углом к псевдоосям этих пар. Ароматическая система остатка красителя перекрывается с пиримидиновымн основаниями Т5 и С4 тетрамера, в меньшей степени - с основанием А12 н практически не контактирует с ОЗ цепи октаме-ра. При этом основания Т5 и С4 оказываются «стянутыми» в вертикальную стопку с большим перекрыванием их л-систем с л-системой остатка Р/т; плоскости оснований противоположной цепи А12 и 013 смещены относительно друг друга по сравнению с их расположением в структуре немодифицированного комплекса. Очевидно, что именно такое расположение остатка красителя, обеспечивающее перекрестное взаимодействие феназиниевой группировки с парами оснований примыкающих встык дуплексов, и должно вызывать стабилизацию тандемного комплекса в целом, в большей степени влияя на стабильность РИп-содержащей тетрануклеотидной дуплексной структуры и, в несколько меньшей, на стабильность прилегающего к ней не модифицированного красителем дуплекса. Интеркаляция красителя проходит, вероятнее всего, со стороны большой бороздки спирали ДНК, вызывая излом дуплекса. Интеркаляционный характер встраивания Р!т в ДНК подтверждается и данными КД-спектрополяриметрии.

Таким образом, результаты исследования структуры тандемных комплексов доказывают, что, как в случае формирования гидрофобной скрепки на стыке дуплексов, так и при интеркаляции азинового красителя в месте ог/-разрыва, стабилизация тандемного комплекса происходит на фоне значительной реорганизации дц структуры относительно таковой для нативного тандемного комплекса. При этом полученные данные продемонстрировали способность коротких сши-гонуклеотидов формировать в составе немоднфицированных тандемных комплексов ДНК-спираль В-формы. Наличие о;/-разрыва не вызывает существенных возмущений в пространственной организации ДНК-дуплексов. Разработанный системный подход к характеризации тандемных комплексов крайне информативен и обеспечивает получение достоверных и всесторонних сведений о структурно-функциональных особенностях изучаемых молекулярных объектов.

Термодинамический анализ формирования ДНК-дуплексов с участием мостиковых олигонуюеотидов

С использованием большого набора модельных комплексов были исследованы эффекты, сопряженные с варьированием природы вводимой ненуклеотцдной вставки (длина, гидрофобность) (см. схему 2); числа модифицируемых вставкой динуклеотидных шагов в ДНК-комплексе; числа введенных подряд вставок одного типа в пределах одного дннуклеотндного шага; типа модифицируемого динуклеотидного шага; положения вставки в дуплексе. В результате была сфор-

мирована база данных термодинамических параметров образования широкого спектра комплексов МО в стандартных буферных условиях. Было доказано, что все исследованные комплексы могут быть описаны в приближении модели двух состояний, в соответствии со всеми критериями применимости данного приближения, представленными выше. Профили термической денатурации всех исследованных комплексов, характеристики которых были использованы в дальнейших анализах, имели монофазный переход из 04- в ¿{/-состояние (Рис. 7).

в

Б

3

4V¿T

ДАК/ДТ

20 40 60 80 Тамларатура, °С

Тамп«р«т)гра *С

2 -U ln(C'./J)

Рис. 7. Расчетные (жирные черные) и экспериментальные (тонкие серые) дифференциальные кривые плаатения комплексов мостиковых и нативных олигонуклеотидов: (А) 1 -CCTGGAGC/GCTCCAGG (M8/N8), 2 - CCTGGAGC/GCTC®rx;1,CAGG (M8/N4(DEG,)4); (Б) 3 -TCCTGGAGCT/AGCTCCAGGA (MI0/N10), 4 - TCCTGGAGCT/AGCTCdec"CAGGA (М10/ N5*nf:<;,,5). (В) Линейная зависимость обратной темпфатуры плавления комплексов на-тивного (M8/N8) и мостикового (M8/N4 CI|4) атигонуклеотидов от логарифма суммарной концентрации опигонуклеогидных цепей, взятых в стехиометрическом соотношении. Буфф: 1 М NaCl, 10 мМ фосфат натрия (рН 7.3), 0.1 мМ №2ЭДТА.

В случае, когда было обнаружено, что компоненты комплексов формируют внутримолекулярные структуры, их вклад в наблюдаемые термодинамические параметры образования межмолекулярного комплекса учитывали в соответствии со специально разработанным алгоритмом. В результате было установлено, что введение ненуклеотидной вставки во внутреннюю часть дуплекса во всех случаях вызывает его дестабилизацию. Увеличение длины вставки и числа модифицированных динуклеотидных шагов в комплексе вызывает дополнительную дестабилизацию комплексов МО. Несколько подряд расположенных фос-фодиэфирных остатков на основе гидрофобных диолов (например, декандиола DD¡) не описываются этой тенденцией. По-видимому, гидрофобные взаимодействия между такими остатками снижают эффективную длину вставки, что сим-батно снижает дестабилизирующий вклад от их введения. Кроме того, установлено влияние типа динуклеотидного шага, модифицированного, например, DEG|, на наблюдаемый термодинамический эффект вставки. Одновременное введение вставок в несколько разнесенных (>2 п.о.) в комплексе динуклеотидных фрагментов характеризуется аддитивным энергетическим вкладом.

Дополнительно методом «остановленной струи» было изучено влияние не-нуклеотидных вставок разной длины на кинетику формирования ДНК-дуплексов. Установлено, что введение вставки практически не влияет на кон-

стаиту скорости ассоциации комплексов. Однако диссоциация двойной спирали, сформированной с участием МО, протекает быстрее, чем это наблюдается для немодифицированного ДНК-дуплекса. Увеличение длины вставки является фактором ускорения распада дуплекса с ненуклеотидным выпетливанием. Если константа скорости диссоциации немодифицированного дуплекса M10/N10 (Рис. 7) при 25 °С составляет 3.3-104 с'1, то для дуплекса с относительно короткой вставкой M10/N5(W<'"5 становится при этой же температуре в -100 больше (3.7-10'2 с"1), а для дуплекса М10ЛЧ5,ПК"3)5 с удлиненной вставкой увеличивается более чем в 3500 раз до величины 1.2 с'1.

Исыедовапие структурных особенностей комплексов МО проводили методом спектрополяриметрии КД и с помощью анализа элеюрофоретической подвижности таких модифицированных Л/ДНК-структур в неденатурирующем геле (ПААГ 18%). По данным КД-спекгров установлено (Рис. 8), что, как и следовало ожидать, введение в д//ДНК ненуклеотидного выпетливания различной длины не приводит к глобальному изменению конформацин двойной спирали. Как и в случае контрольных комплексов, для дуплексов на основе МО профили КД-спектров соответствуют B-форме с)/(ДНК. Это указывает на то, что наблюдаемая в результате введения ненуклеотидных остатков дестабилизация спирали ДНК является результатом локального возмущения ее структуры в сайте модификации. Об этом же свидетельствуют данные метода задержки в геле дуплексов с возмущением. Был проведен анализ электрофоретических подвижностей контрольного ДНК-дуплекса (32 п.о.) и его аналогов, несущих в центральной части разной длины выпетливания на основе исследуемых ненуклеотидных вставок или моно- и пентааденилатные выпетливания, для которых влияние на дуплексную структуру описано ранее (например, Dornberger U., et а!., 1999). Нами было показано, что подвижность в геле дуплексов с выпетливанием в центральной части заметно ниже, чем у Л/ДНК с такой же модификацией на ее конце или без нее. Это является следствием изгиба двойной спирали в сайте возмущения регулярной структуры. Для серии модельных дуплексов установлены величины углов отклонения спирали от линейной формы (а). Показано, что для контрольных комплексов с аденилатными выпетливаниями определенные нами значения а хорошо согласуются с данными структурных исследований, проведенных ранее. С увеличением длины ненуклеотидной вставки возрастает угол изгиба di/ДНК. Длинные вставки на основе гидрофобных диолов изгибают спираль несколько меньше, чем гибкие олигоэтиленгликолевые выпетливания. Доказано, что степень дестабилизации дуплекса коррелирует с эффективностью его изгиба. Например, если DEGl-вставка дестабилизирует модельный дуплекс на 2.5 СС, отклоняя дуплекс от линейного на ~20°, то в случае модификации DEG5 изгиб достигает 60°, при этом Т,„ комплекса снижается уже на -6 °С. В целом для негидрофобных вставок, например на основе DEG-содержащих фосфоди-эфиров, установлено, что термодинамический эффект от удлинения вставки

имеет энтропийную природу и пропорционален логарифму числа дополнительных ковалентных связей, вносимых вставкой в углеводно-фосфатный остов МО.

Таким образом, продемонстрировано, что ненуклеотидные вставки, вызывая изгиб Л/ДНК, увеличивают скорость диссоциации двойной спирали, определяя природу снижения стабильности комплексов МО относительно нативных.

Рис. 8. Температурные серии КД-спекгров нативного ДНК-дуплекса и двух дуплексов с ненуклеотидными вставками. Концентрация каждого из компонент комплекса 5-Ю"5 М в буфере 1 М N30,10 мМ фосфат натрия (рН 7.3), 0.1 мМ Ыа-ЭДТА.

Определение унифицированных параметров для прогностического расчета стабильности комплексов МО с ДНК проводили с помощью метода множественной линейной регрессии (МЛР), используя сформированную базу данных, характеризующую свойства комплексов нативных и мости ковых олиго-нуклеотидов. Были получены унифицированные термодинамические параметры для расчета энергии формирования как нативных, так модифицированных ОЕв1 -вставкой(ами) ДНК-дуплексов. В представленной работе параметризацию нативных комплексов проводили при использовании большего набора экспериментальных термодинамических характеристик, чем было использовано ранее (например, АИат Н.Т., а а1„ ¡997). Сопоставление величин термодинамических инкрементов, полученных нами и представленных в литературе, показывает хорошую корреляцию между этими параметрами, что указывает на отсутствие систематической ошибки в величинах термодинамических параметров комплек-сообразования, определенных нами и внесенных в общую базу данных. Кроме того, определены унифицированные параметры, количественно описывающие энергетические эффекты от введения ненуклеотидной вставки в любой динукле-отидный шаг ДНК спирали. Наибольшую прогностическую способность показал набор из 29 наборов инкрементов (ДДСу, ДДН" и ДДБ") (13 для нативных и 16 дополнительных унифицированных наборов для МО). Как и в случае нативных комплексов, полученный набор параметров позволяет проводить прогностический расчет величин свободной энергии комплексообразования МО. Более того, с их использованием возможно рассчитывать и Т,„ нативных и 0Е01-содержащих дуплексов в стандартных условиях. Стандартное отклонение прогностического расчета термостабильности нативных и модифицированных комплексов составило менее 2 °С, как при рассмотрении комплексов, вошедших в

базу данных, так н независимой выборки комплексов, параметры которых не использовали при определении унифицированных характеристик.

Эффективное использование олигонуклеотидов в лабораторной практике возможно, если существуют алгоритмы прогностического расчета стабильности формируемых ими дуплексов в различных буферных условиях, главным образом, в условиях с различной ионной силой растворов. В данной работе с целью определения особенностей комплексообразования нативных и мостиковых (для вставки ОЕО) олигонуклеотидов в растворах, отличных от стандартных (1 М №С1, нейтральный рН), была предложена новая оригинальная модель, учитывающая влияние противоионов на стабильность образуемых дуплексов. Расширенная модель конденсации противоионов предполагает, что экранирование отрицательных зарядов в олигонуклеотидной цепи происходит в результате насыщающего связывания катионов с фосфатными остатками (см. (17.1 И 17.4)). Эффективность взаимодействия катионов с олигонуклеотидом, определяется состоянием, в котором находится цепь (от/ или ¿>г/); числом сайтов связывания катионов в ДНК, зависящим от числа фосфатных остатков, находящихся вблизи конца цепи и внутри ее (вблизи в/С- и А/Т-пар, вблизи ненуклеотидной вставки).

А+В< >АВ (17.1),

ЛВ + А»,,Ма\ " >АВЫаГ. (17.2),

л в лялш

Л+М^а^+^Ё^АШи, (17.3),

А'**

й + ДА , Л'а' —> Я Л'" и, (17.4).

С использованием базы данных, характеризующей зависимость термоста-билыюсти комплексов ДНК от ионной силы растворов, определены параметры предложенной модели. Эта модель позволяет с высокой точностью проводить расчет стабильности комплексов олигонуклеотидов: средняя ошибка расчета Т,„ составляет 0.7 и 1.0 °С, соответственно, а зависимость ошибки предсказания величин Т,[, от СС-состава НК-компонентов и их длины отсутствуют (Рис. 9). В отличие от представленных в литературе, приведенное нами описание учитывает взаимодействие катионов как с о</-, так и с ¿//-состоянием НК, переход между которыми и определяет эффективность комплексообразования в системе. Полученное описание имеет наглядную физическую интерпретацию и позволяет проводить прогностический расчет стабильности НК-комплексов в широком диапазоне ионных сил раствора ([№С1] = 0.01-1.024 М). Различное число катионов, связывающихся с фосфатными остатками в о//- и ¿(/-состоянии, обусловлено различием их пространственной организации, что определяет неэквивалентность величин констант ассоциации катионов одновалентных металлов с ДНК. В дц-состоянии константа ассоциации катиона с сайтом НК практически в 2 раза выше, чем в «/-состоянии, что, вероятно, связано с повышенным электростатиче-

ским потенциалом вблизи НК-дуплекеа из-за сближения в его составе двух отрицательно заряженных олигонуклеотидных цепей.

(г 20

1 0 н

= 0.997* + 0.22« R! = 0.997

0 20 40 60 S0 100 Температура плавлення (эксперимент), °С

'>=<Ш13х-<1.125 ' R1 = 0.001

о ............»0 О I......\г±з........|]

» 1......ПО.........

о 1......\........I;..................i

............tr" ............ : ° 8': :

о ; ■ ;

10

20

30

Число фпсф(),|и)фирмых ocraiKtm и пей»

Рис. 9. (А) Корреляция экспериментальных и рассчитанных с помощью предложенной модели величин Т„, комплексов нативных и мосгиковых олигонуклеотидов с ДНК. (Б) Зависимость ошибки расчета температуры плавления ДНК комплексов от длины олиго-нуклеотидов.

Данная модель позволяет описывать термостабильность ДНК-комплексов и в условиях конкурентного связывания противоионов с НК-компонентами, что продемонстрировано для случаев одновременного присутствия Na+ (от 1 мМ до 1 М) и Mg2+ (от 0.5 мМ до 0.3 М) в растворах (данные не приведены). Выявленные закономерности и параметризующие их величины легли в основу прототипа программного обеспечения, позволяющего проводить прогностический расчет термодинамических параметров образования комплексов нативных олигонукле-отидов и МО в различных буферных условиях. Алгоритм реализован в среде VB for Applications (Excel, Microsoft). Таким образом, в работе проведены комплексные исследования физико-химических закономерностей образования составных комплексов и получены данные, позволяющие проводить направленный выбор структуры зондов на основе тандемов олигонуклеотидов и МО. Кроме того, доказано, что выявленные закономерности применимы и для описания процесса образования конкатемерных структур, формирование которых проходит через этапы тандемного связывания олигомеров на общей матрице ДНК (данные не приведены). Наличие изгибающих дуплекс ненуклеотидных вставок в ДНК-блоках конкатемерных структур ограничивает их длину, что доказано с помощью данных атомно-силовой микроскопии.

3. Тандемы коротких олигодезоксирибонуклеотидов как высокосслектив-ные зонды при анализе точечных мутаций методом ферментативного ли-гироваиия

Первоначально была определена эффективность дискриминации всех возможных типов одиночных мисматчей при лигировании тандемных комплексов с

помощью ДНК-лигазы фага Т4. Для этого использовали серию тандемных комплексов, образованных парой декануклеотидов, обеспечивающих высокую степень ассоциации субстратных дуплексов в условиях оптимальной работы фермента (25-37 °С). Установленные факторы дискриминации мисматчен вблизи о!/-разрыва, как со стороны Р-компонента (донор 5'-фосфата), так и ОН-компонента (донор 3'-гидроксила) субстрата, включены в базу данных, характеризующую физико-химические свойства тандемных комплексов (например, см. Рис. 10).

В результате сравнительного анализа эффективностей лигирования 96 несовершенных комплексов установлено, что в среднем "ОН"-мисматчи дискриминируются в 23 раза лучше, чем "Р"-мисматчи. В некоторых случаях несовершенные комплексы, содержащие несоответствия со стороны "Р"-компонента, лигируются даже лучше, чем соответствующие комплементарные комплексы. Между значениями факторов дискриминации "ОН"-и "Р"-мисматчей наблюдается хорошая корреляция, которая нарушается только в случае 5 типов "ОН"-мисматчей: G/G, G/A, A/G, А/А (четыре R/R) и С/С. Наличие корреляции между факторами дискриминации неожиданно, т.к. "ОН"- и "Р"-мисматчи, скорее всего, должны влиять на разные этапы ферментативного катализа. В целом мисматчи типа R/P и гомо-Р/Р максимально дискриминируются как в случае "ОН"-, так и в случае "Р"-мисматчей. Возможным объяснением всплеска эффективности дискриминации R/R и С/С может являться тот факт, что пространственная структура дуплекса с несовершенными парами оснований такого типа наиболее сильно отклоняется от канонической структуры двойной спирали, т.е. комплементарной пары типа R/P, что и влияет на селективность ДНК-лигазы.

Таким образом, получены данные, необходимые для создания программного обеспечения, производящего выбор тандемов олигонуклеотидов, которые обеспечивают максимальную селективность при их использовании в качестве зондов для анализа полиморфных сайтов в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов. Разработан алгоритм выбора структуры тандемов олигонуклеотидов, который был реализован на VB for Application (Excel, Microsoft), исходными данными для которого являются последовательности нормальной и мугантной матрицы, их концентрации и концентрации компонентов тандема - зонда, в сайте связывания которого располагается предполагаемая замена, и олигонуклеоти-дов-эффекторов, обладающих повышенной относительно зонда гибридизацион-ной способностью. При этом необходима также информация о возможном диа-

29

С*рА С*рУ \*п\ с;-т G-T__с-т

т/с; т/т т/с с/<; с/л с./т

ЛСТААСТААСС-ТСЛТСАТЛТС ' САТТСАТТСХ рУСТАСТАТАС.

Рис. 10. Типичный пример элсктро-форстического анализа результатов лигирования комплементарных и несовершенных комплексов (20%-ный денатурирующий ПААГ). Условия лигирования: 10 мин, 0.25 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы.

пазоне температур проведения анализа и о минимально допустимых степенях ассоциации комплекса зонда и эффектора с матрицей. Программа позволяет производить расчет комплексообразующих свойств двух- и трехкомпонентного тандемов, соответствующих анализируемым вариантам ДНК, и отбирать те из них, которые обладают высокими значениями селективности гибридизации для заданных концентрационных и температурных условий. Далее для выбранных тандемов определяют величины факторов дискриминации лигирования, соответствующие отношению скоростей ферментативного лигирования комплементарных и несовершенных комплексов. В результате алгоритм выводит структуры двух- и трехкомпонентных тандемов, структуры которых, согласно расчетам, имеют максимальную селективность как гибридизации, так и лигирования при заданной температуре и для интересующего участка ДНК, имеющего анализируемый полиморфный сайт.

Оптимизация схемы анализа точечных мутаций в ДНК методом ферментативного лигирования

Величины энергетических вкладов от реализации коаксиальных взаимодействий в ДНК способны обеспечить значительное возрастание Тш только коротких дуплексов. Поэтому далее была исследована возможность минимизации размеров тандемного комплекса с целью определения его оптимального строения, обеспечивающего высокоселективное лигирование составного зонда с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Было установлено, что тандемный комплекс, в котором тетрануклеотидный зонд, фланкированный на общей ДНК-матрице парой олигомеров большей длины (например, октануклеотидов), является субстратом данного фермента (Рис. И).

3'CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp Р"' ] ^ вШС вООС ^ rCJ.XC ^ рглач

„ [3 2 Р ï GC АТС AAG рТСС AGGCA _м, fcAoTfcCAOfcCTAfcTO*

Р», Р" «

PCAGC pli, ^ ^

pXAGC pSt(tl), рИ,(л1>, pu, (g1) pN„'& — '

pCXGC рИ, (f) , pN,(c*), pNt (g*) __

pCAXC pnt(t3), Pn,(a>), рн4(с>) p»- WWW»WWWHMWa pCAGX рЫ4 <t<) , pHt (a'}, pN4 (g<)

Pue. 11. Состав модельных тандемных комплексов (слева) и радиоавтограф электрофореза в 20%-ном денатурирующем ПААГ продуктов их лигирования pNg+pN4+p.\"8 (справа). Условия лигирования: 25°С, 15 мин, 50 ед.акт. ДНК-лигазы фага Т4, олиго-нуклеотидные компоненты взяты в концентрации 10 мкМ каждого.

Определен порядок лигирования двух ог/-разрывов в таком составном комплексе: лигирование разрыва со стороны Р-компонента происходит первым. Показано, что практически любой мисматч, формируемый в дуплексной части центрального тетрануклеотида, эффективно дискриминируется ДНК-лигазой. Это достигается как за счет значительной дестабилизации минидуплекса в случае образования несовершенного комплекса, так и за счет эффективной дискриминации мисматчей на этапе лигирования. Установлено, что за счет варьирования условий лигирования (например, ионной силы растворов) или за счет укороче-

подход I

и

^''СвТАСТТСОТСОЛОвТСССТр ,

(вЬрсслтсдда рТссасоса<*£>

П-рЯ, РСАСС р«,«1о . с".

Схема 6.

ПОДХОД II

кия фланкирующих олигомеров (с окта- до гекеануклеотидов) удается дополнительно повысить селективность лигирования трехкомпонеитного тандема.

Разработка подходов к гетерофазному анализу однопуклеотидпых несоответствий в ДНК при лигироваиии тандемов коротких олигонуклеотидов

Учитывая высокую чувствительность системы анализа точечных мутации в ДНК, основанной на использовании предложенных составных зондов, мы разработали два варианта новых подходов к созданию ДНК-диагностичсских тест-систем (Схема 6). Оба подхода приводят к фиксации сигнального продукта лигирования на твердотельном носителе, облегчая удаление избытка репортерных групп из системы и визуализацию специфичного продукта лигирования. В первом подходе один из компонентов тандема, фланкирующих тетрамерный мини-зонд, иммобилизовали на поверхность полиметакрилатных микрочастиц. Репор-терную группу (например, остаток биотина) вводили в структуру второго фланкирующего олигомера. В присутствии комплементарной ДНК-матрицы и ДНК-лигазы биотиновая метка фиксируется на твердотельном носителе и легко выявляется после отмывок, например, с помощью копъюгата стрептавидин-щелочная-фосфатаза и хромогенных субстратов.

В рамках второго подхода реакцию лигирования биотин-меченого тандема на матрице анализируемого ДНК-ампликона проводили в растворе. Протяженный продукт лигирования в составе комплекса с ДНК-аналитом наносили из реакционной смеси на капроновую мембрану и иммобилизовали с помощью УФ-облучения (254 нм, ртутные лампы низкого давления). Мембрану отмывали от избытка меченого компонента тандема, который не способен удержаться на иммобилизованном ампликоне. Сигнальный продукт выявляли колориметрически.

Возможность практического использования обоих подходов к анализу од-нонуклеотидных полиморфизмов в ДНК-ампликонах была проверена с использованием различных модельных объектов. Доказано, что на основе предложенных прототипов тест-систем с высокой надежностью удается выявлять точечные

ДНК-лигаэа промывочные процедуры

сотАСТтсстсслоатссотр ,

рССАТСААО рТССА^^СА-- п-рм, рСАСС рМ,В1л Р».

' ССТАОТТСОТССАСвТСССТр (й)-рССАТСААССАОСТССАОССА^>

Д~р»„В1о

' ССТАаТТССТСЫДСТОСОТр рССАТСААССАССТССАвССА^«^ Л-рНлДЮ

I

иммобклизадоя на носитель промывочные процедуры

0 роСАТСААгсластссАСКСА-^РЗ

окрашивание полимера

^ / ВС1Г+ИВТ

(а^рССАТСЛАОСАССТССА(МСА<^^л^ где (п)-

- полимерные носители, Н1РН • биотии

ОП -КОШЮГЛ9 С9р»т»»НЯМК-ЩЯДОЧНЛЯ

ЬО фосфате»», £

ВСХРЖВТ -кромогфнмы» субстраты.

V-

мутации в ДНК, диагностически значимые при генотипировании вирусов, наличии генетических заболеваний или при проведении популяционно-генетических исследований. Адекватность предложенных подходов доказана при сопоставлении результатов анализа с данными прямого секвенирования ДНК-образцов или при проведении параллельных тестов с помощью референс-методов, таких, как аллель-специфичный ПЦР и рестрикционный анализ.

Другие варианты использования тандемов коротких олигонуклеотидов, исследованные в работе

Возможность создания составных праймеров для секвенирования ДНК давно привлекает внимание исследователей. Наличие библиотеки универсальных блоков на основе коротких олигонуклеотидов обеспечивает значительное сокращение затрат на анализ НК, когда требуется большой набор синтетических праймеров. В данной работе продемонстрировано, что составной праймер с участием тетранук-леотидов (pGTAA, pAACG, pACGG, pCCAG) и их 5'-феназиниевых производных способен заменить стандартную 16-звенную олигонуклеотидную затравку (GTAAAACGACGGCCAG) при секвенировании методом Сэнгера модельной oi/ ДНК рекомбинашного бактериофага M13HAV20 с использованием набора "Sequenase version 2.0" (Amersham). Только одна из рассмотренных комбинаций нативных и модифицированных тетрамеров - sPltnRpGTAA +PhnRpAACG+pACGG+ pCCAG - приводила к специфическому праймированию реакции секвенирования, позволяя определить последовательность фрагмента анализируемой ДНК. Полученные результаты указывают на то, что, осуществлять сборку праймеров любой сик-венс-специфичности, используя ограниченный набор уникальных блоков на основе 256-ти тетра-нуклеотидных последовательностей, по-видимому, возможно. Другое потенциальное приложение тандемов олигонуклеотидов основано на ДНК-лигаза-зависимом введении на концевые участки неизвестных последовательностей ДНК-фрагментов заданной структуры (Схема 7).

Обычно для таких целей используют дуплексы на основе протяженных оли-гомеров, содержащие оц нависание. Нависающий сч/ДНК фрагмент имеет вырожденную последовательность, которая позволяет связать выявляемую ДНК за счет гибридизации встык с предформированным дц фрагментом известной структуры. После лигирования наличие пары концевых участков известной структуры дает возможность амплифицироватъ ДНК. Однако для обеспечения качественного протекания, например, амплификации с помощью ПЦР, требуется удаление избытка

Схема 7.

ир»й«ир

у^у тччч W494W9

•

'w»w vwvw—

адапторной конструкции. Протяженные олигомеры-адапторы могут конкурировать с праймерами, снижая эффективность и специфичность ПЦР. Данное неудобство можно преодолеть, если в качестве одной из цепей адапшрного дуплекса использовать тандем коротких олигонуклеотидов. Такая конструкция при низких температурах, т.е. в условиях лигирования ее с искомой ДНК, обладает достаточной стабильностью. Однако при повышении температуры до уровня, необходимого для протекания ПЦР, та наемный комплекс денатурирует, а его компоненты не могут конкурировать с праймерами за связывание с ДНК-матрицей. Кроме того, использование З'-модифицированных компонентов предполагаемого адаптера исключает его нсспецифическое превращение ДНК-зависимыми ферментами (ДНК-липазой и ДНК-полимеразой). Следовательно, при использовании таких модифицированных адапторных структур появляется возможность ввести их на конец ог/ДНК-объекта и без разделения реакционной смеси (после реакции лигирования) перейти к этапу ПЦР. Подобная процедура существенно упрощает методику проведения аналгоа и снижает вероятность потери низкокопийных фрагментов ДНК в пуле неизвестных последовательностей, подлежащих идентификации. Работоспособность предложенной схемы доказана.

4. Составные олигонуклеотиды как инструменты для направленного воздействия на НК-мишени и зонды для анализа ДНК

Относительно недавно Схема 8.

быЛО ПОКазаНО ЧТО ИС- Первая пень- доставляемый слквснс-слсиифичный одигонуклсотид

пользование сложных ' -' ■- • -1

составных комплексов Вторая цепь - олигомуклсотид-достаиишк

ДНК - конкатемерных (я^мстка (яй^г) дуплексов - В значи-

дуплексов -

тельной степени спо- ' . <

собствует проникнове- Липофильнын остаток [ С7)оА1 ] | СЬоМ ]

нию НК в клетки мле- ^—^ ^—ч .—^

.. (яи*) (Ии-я) (ки^)

копитающих. Мы исследовали возможность дополнительного ПО- Олигонуклсоп.д-стоппер^Гс^лГ)

вышения эффективно- -

ста проникновения таких мультиассоциатов в клетки млекопитающих за счет введения гидрофобных холестериновых остатков в олигонуклеотидный компонент, комплементарный антисенс-агенту (Схема 8). Такой олигомер выступает в роли доставщика, исключающего необходимость модификации снквенс-специфичного агента и удерживающего его в комплексе. Остаток холестерина в виде р-аланиновош эфира вводили по 5'-концевому фосфату олигомера-доставщика или стоппера путем формирования фосфамидной связи. Эффективное использование конкатемерных структур определяется в том числе и их стабильностью. Анализ физико-химических свойств комплексов проводили методом термической денатурации и с помощью элекгрофоретического анализа в неденатурирующих услови-

ях. Было показано, что в действительности остаток холестерина не вызывает существенной дестабилизации di/ДНК-ассоциата, хотя и снижает наблюдаемую кооперативность его плавления. Остаток стероида изменяет характер распределения модифицированного конкатемера по длине относительно нативного аналога. В случае холестерин-содержащей структуры увеличивается доля укороченных форм, однако при этом наблюдается и некоторое увеличение высокомолекулярных ассоциатов, обладающих низкой электрофоретической подвижностью.

Формируемые структуры длиной до 1000 п.о. несут множество остатков стероида, что существенно упрощает их сорбцию на поверхности клеточной мембраны и повышает вероятность проникновения внутрь клетки. Действительно по данным флуоресцентной микроскопии и FACS-анализа уже после 30 мин инкубации конкатемера, содержащего в одной цепи остатки флуоресцеина, а в другой холестерина, клетки (НЕК293) эффективно флуоресцируют. Детальное рассмотрение биологических эффектов выходит за рамки данной работы, поскольку анализ биологической активности созданных конструкций проводили в ЛБНК ИХБФМ СО РАН под руководством проф. М.А. Зенковой.

Сравнение эффективности воздействия на НК-мшиени сиквенс-специфичиых агентов на основе нативных и мостиковых тигонукиеотидов

Одним из механизмов подавления экспрессии генов, например, с помощью ангисмысловых олигшгуклеотидов, считается направленная модификация НК-мишеней с помощью реакционноспособных производных или же расщепление мРНК в составе гибридных РНК/ДНК-дуплексов рибонуклеазами Н. Это обусловило необходимость исследования МО на способность выступать в качестве адресованных антисенс-агентов. Влияние ненуклеотидной вставки (фосфодиэфира 1,6-гександиола) в составе МО на его способность взаимодействовать с ДНК было оценено по эффективности модификации ДНК-мишени алкилирующими производными МО. Если в условиях эффективного комплексообразования

модификация ДНК- Схема 9.

мишени алкилирующим 3. | Н ю! 5 i степень т™ »с

ПРОИЗВОДНЫМ нативного М CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp'W мод^иак*,

»«V-» VRC1-pCAGCTCCAGGCA RClpN,, 60% 55

олигонуклеотида и МО 5' я ci -рс ag с*г сса gg сд rcipv. 64% 38

происходит по ^ci-pCAGCTCCA RClpH, 77% 35

одинаковым сайтам ДНК, 5'яс!-рсасстсса rcip«<\ - <7

то, следовательно, оба

олигомера образуют комплексы с одинаковой пространственной структурой. Алкилирование было исследовано на модельной системе, где в качестве мишени выступал 5'-[33Р]-меченый 20-звенный олигонуклеотид М., а ЛС7-содержащие реагенты были получены на основе 12- или 8-звенных мостиковых или нативных олигонукпеотидов, комплементарных участку в составе ДНК-мишени (Схема 9). В МО ненуклеотидная вставка на основе фосфодиэфира гексаметилендиолабыла на расстоянии четырех нуклеотидов от 5'-конца сшигомеров (ph'/Nj и pN4ANg).

Алкилирование мишени Л/регистрировали гель-электрофорезом в денатурирующем 20%-ном ПААГ по появлению продуктов деструкции ДНК-мишени в местах модифицированных оснований после обработки реакционной смеси 10%-ным водным пиперидином (С9,012, в16 и й") и пиперидин-стабильных аддуктов (С13, -70% от общей степени модификации). В условиях эффективного комплек-сообразования, при 2(ГС, введение ненуклеопщной вставки практически не влияет на направленность и степень модификации мишени ал копирующим реагентом ЯОрМ^Нч (64%), несмотря на уменьшение гибриднзационных свойств МО. Для всех алкилирующих производных олигомеров модификации подвергаются одни и те же сайты мишени. Реакционноспособиые агенты на основе других составных конструкций, а именно тандемов коротких олигонуклеотидов, в том числе стаби-лшированных гидрофобными стероидными «скрепками», - также являются способными вызывать направленную модификацию ДНК.

Способность МО вызывать гидролиз РНК мишеней под действием РНКзы Н Е.соИ было исследовано на примере расщепления 20-звснного олигорибонуклео-тида (тМ - РНК-аналог олигомера М на схеме 10) в комплексах с комплементарным сшигодезоксирибонуклесгпщом (рМл) и его производными, содержащими гексаметшендиоловые и гексаэтиленпгтиколевые вставки, а также в ряде случаев дополнительный аденилатный остаток, соединенный с концом олигомера З'-З'-«инвертированной» межнуклеотидной связью. Первоначально было установлено, что все изученные производные способны формировать комплементарные комплексы. Все МО вызывали гидролиз РНК мишени, хотя и в несколько меньшей степени, чем протяженный нативный олигомер и трехкомпонентный тандем (¡лУх+рМ^+рЩ- Снижение эффективности ферментативного гидролиза РНК и числа гидролизуемых фосфодиэфирных связей вызывало и увеличение числа вставок, вводимых в олигонуклеотнд, например, в случае использования производного Л,5ллМллД'_.;лаЛ'5 (где ЛЛ - НЕС 1-вставка). Кроме того, было установлено, что МО, несущие вставку вблизи З'-конца, обладают повышенной относительно нативных олигонуклеотидов стабильностью к действию экзонуклеаз, например, фосфодиэстеразы змеиного яда (СгоЫш а1тх).

Таким образом, доказано, что составные олигонуклеотидные конструкции могут быть использованы для создания сиквенс-специфичных агентов НК-направленного действия.

Мостиковые олигонукчеотиды — молекулярные зонды для исследования фермент-субстратного взаимодействия и аллель-специфичного анализа ДНК

Ненуклеотидные вставки, введенные в углеводно-фосфатный остов олиго-нуклеотида, нарушают регулярность структуры олигомерной цепи, формируя вы-пегливание в составе комплекса мостикового олигомера. Это возмущает двойную спираль ДНК, вызывая ее изгиб. Повышенная доступность пар оснований в таком сайте для атаки молекулами воды приводит к увеличению скорости диссоциации модифицированной двойной спирали относительно нативной. Таким образом, имеющиеся физико-химические и структурные данные о комплексах ДНК, со-

держащих ненуклеотидные вставки-выпетливания, позволяют полагать, что дуплексы на основе МО могут выступать в качестве субстратов в ферментативных реакциях, и что влияние вставки должно определяться ее положением в субстрате ДНК. Однако субстратные свойства МО в реакциях ДНК-зависимых ферментов определяются не только и не столько термостабильностью их комплексов, сколько типом, размером и положением вставок. Таким образом, без систематических исследований невозможно предопределить особенности поведения комплексов МО в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами.

На примере широко используемых ферментов ДНК-лигазы фага Т4 и ДНК-полимеразы ТИегтш ациаПст (Тац ДНК-полимеразы) было изучено влияние природы и положения ненуклеотидной вставки в составе субстратных комплексов на эффективность и селективность их ферментативного превращения. Исследования проводили с использованием наборов субстратных комплексов, в структуре которых варьировали положение ненуклеотидного остатка (Рис. 12).

Ъоо

к | 80

3 60

§.40

Ь 20

! « А

а

V

С

а/ Н

О

ипо

N О О* 00 Ь Ю V, Т ^ М

<<<<<<<

У < Ю"<Г1Л«1-«000\®

2 г г £ ¡г г & г £

70

60 у

н

50

Модификация ОН-компонента

матрица М1, \lhii

сасстссассса N,¡.14,

ас/ПСААС. V*.

О С\ 00 МО т 9 П N N

< < <<<<<<-*

с ^ 1Г| « г ® » о /

^ггггггг; н.

Модификация Р-компонента матрица М2, М2т

ССАТСЛ4С

САССТССАСССА Р*1Г Р14и"

Рис. 12. Лигирование Т4 ДНК-лигазой олигонуклеогидов в составе нативных и модифицированных комплексов, отличающихся положением ненуклеотидной вставки относительно о^-разрыва, задаваемого структурой мостикового додекацуклесггида /V;/. Степень лигиро-вания олигонуклеотидов в комплексах (столбцы), несущих 0Е01 -вставку в различных положениях ОН- (А) и Р-компонента (Б) ДНК-субстратов (вставки справа). Температура плавления комплементарных комплексов, образованных соответствующим додекануклеотиаом (N,2, Л',/) и матрицей 'ТСССТООАССТС;1 (кружки).

Так, используя, например, два типа комплексов, в которых МО выступал в роли либо Р-компонента, либо ОН-компонента в ДНК-субстрате, было показано, что ДНК-лигаза является крайне чувствительной к наличию ненуклеотидных вставок в ряде положений ДНК. Находящиеся по разные стороны от ¿«¿-разрыва участки субстрата, в составе которых модификации ухудшают субстратные свойства тандемных комплексов, имеют разную протяженность. Это отражает «асимметричность» расположения зоны взаимодействия (от -5 до +7 нт.) Т4 ДНК-лигазы с ДНК-субстратом относительно сайта лигирования (Рис. 12). Аналогичные закономерности по влиянию позиции вставки в праймерной и матричной цепи субстрата Тац ДНК-полимеразы позволили проанализировать топологию сайта связывания и для этого фермента. В специфическое взаимодействие с аминокислотными остатками этой ДНК-полимеразы вовлечены 8-9 и 5-7 нт. в матричной и

праймерной цепях, соответственно. Таким образом, МО могут быть использованы в качестве доступных молекулярных инструментов для анализа белково-нуклеииовых взаимодействий, с использованием которых критичные для распознавания позиции в ДНК могут быть определены с точностью до нуклеотида.

Селективность ферментативного превращения комплексов МО

Наличие ненуклеотидной вставки в составе субстратных комплексов, образованных с участием МО, можно рассматривать как возмущение ДНК-структуры. В литературе представлены варианты повышения селективности действия некоторых ДНК-полимераз при использовании олигонуклеотидов, несущих модификацию, нарушающую регулярность спирали ДНК и располагающуюся непосредственно вблизи сайга каталитического превращения.

Ml D М1-1 □ М1-2 □ MI-3 П М1-4 □ М1-5 О MI-6

Jibftii

I

I

I

^fliLrfn

м i 2 i ^ i 00 i r i ^ у ^ V.: vD

I <1

1 rtv '

Рис. 13. Анализ эффективности превращения ДНК-субстратов, нативных и модифицированных ненуклеотидной вставкой, под действием Т4 ДНК-лигазы (А) или Тещ ДНК-полимеразы (Б) в отсутствие одиночного мисматча или при его наличии в различных положениях комплексов ДНК (1-НЗ п.о. от З'-конца праймера). Матрицы Mlm (ni: -1-Мэ) обеспечивают в комплексах с нагивным pNi: или модифицированными pN^- додекамерами наличие одиночного мисматча в позициях от первой и до шестой п.о. относительно их З'-конца.

Из представленных данных следует, что при использовании нативных олигонуклеотидов как ДНК-лигаза, так и Тац ДНК-полимераза оказываются достаточно селективными только тогда, когда несовершенная пара оснований находится вблизи лигируемого ОН-компонента или праймера соответственно, т.е. вблизи сайта ферментативного превращения (Рис. 13, см. М1-1 и М1-2). Для обоих ферментов по мере отдаления мисматча от З'-конца ингибирующий эффект снижается. Совершенно иная картина наблюдается для комплексов на основе МО (Рис. 13). Наличие ненуклеотидной вставки внутри сайта связывания фермента на ДНК-субстрате или на его границе приводит к значительному повышению селективности превращения. Например, факторы дискриминации мисматча (отношение выходов продукта реакции в совершенном и несовершенном комплексах), удаленного от сайта превращения (шесть нуклеотидов), при использовании зондов на основе мостикового олигомера /V/vVб достигают 8 при лигировании и 12 при его удлинении. В этом случае использование нативного зонда не обеспечивает надежной дискриминации однонуклеотидной замены в матричной цепи, а факторы дискри-

минации мисматча при лигировании и при полимеризации составляют 2.9 и 1.2 соответственно. Наличие ненуклеотидной вставки проявляется даже при дискриминации мисматчей, удаленных от сайта модификации в субстратном комплексе. Так, эффективность дискриминации несовершенных пар оснований вблизи 3'-конца удлиняемого олигомера резко возрастает при введении ненуклеотидного выпетливания в область связывания полимеразы. При этом вставка в пограничной позиции обеспечивает максимально высокую селективность действия фермента. Следует отметить, что такой эффект удаленной вставки является результатом сочетания ее относительно низкого ингибирующего эффекта в составе совершенного субстратного комплекса (по сравнению со случаями использования модификаций в более близких к З'-концу затравки положениях) и выраженного ингибирующего действия вставки в составе комплексов с мисматчем. Для комплексов МО, несущих вставку ближе к З'-концу затравки, также наблюдается высокая селективность ферментативного удлинения, однако это происходит на фоне снижения их субстратных свойств (Рис. 13).

Гибридишционнми анализ НК с помощью мостиковых олигонуклеотидов

Для демонстрации способности МО выступать в качестве высокоселективных зондов при гибридизационном анализе ДНК были рассмотрены на модельных системах три способа выявления специфических последовательностей в гетерофаз-ном варианте (Схема 10): сэндвич гибридизация (формирование тандемно-го комплекса (иммобилизованный зонд+меченый зонд)/анализируемая ДНК); лигирование иммобилизованного и меченого олигонуклеотида на общей ДНК-матрице; мечение иммобилизованного на твердотельном носителе зонда при его ферментативном удлинении под действием Тещ ДНК-полимеразы в комплексе с ДНК-матрицей. В серии сравнительных экспериментов было показано, что удлинение МО с помощью термостабильной Гек/ ДНК-полимеразы дает более воспроизводимые результаты анализа ДНК и обеспечивает более высокую чувствительность ее выявления. Наибольшая чувствительность выявления ДНК-ампликонов (-0.2 фмоль, 230 п.о.) была достигнута при проведении реакции минисеквенирования ДНК-матрицы, т.е. реакции матричного удлинения зонда-затравки в присутствии ограниченного набора нуклеозидтрифосфатов, например, с1АТР и модифицированного сПТР, несущего репортерный остаток биотина в С5 положении тимина. В этом случае удлинение

Схема 10.

I) Сэнлвнч-гнбрилнишнн

зонда не приводит к значительной стабилизации комплекса удлиненного продукта с ДНК-аналитом относительно комплекса исходного зонда с ДНК, что позволяет при температуре, близкой к Т,„ этих комплексов, обеспечивать мечение большого числа олигомеров-затравок в расчете на одну молекулу цепи анализируемой ДНК. Этот подход - изотермическая амплификация гибридизационного сигнала, кратко описанный ранее (Dubilev S., et al., 1999), оказался приемлем как для гомофазно-го, так и для гетерофазного вариантов выявления специфических последовательностей ДНК.

В данной работе проведена детальная оптимизация изотермического мечения олигонуклеотидных зондов с помощью Taq ДНК-полимеразы. Предложена кинетическая схема, описывающая этот процесс. Полученные результаты (в сочетании с результатами физико-химического описания комплексов МО) легли в основу алгоритмов направленного выбора сиквенс-специфичных зондов на основе МО, что было нами использовано при разработке прототипа тест-системы для геноти-пирования вируса гепатита С (ВГС). В качестве анализируемой области генома вируса использовали 5'-нетранслируемый участок (5-UTR), в составе которого выявлены генотип-специфичные области (Bukh J., étal., 1992). Выбран набор ВГС-и генотип-специфичных олигонуклеотидов, которые были синтезированы и иммобилизованы на капроновые мембраны в результате мягкого облучения УФ-светом. Условия УФ-индуцированной иммобилизации тщательно оптимизировали с целью выявления факторов процесса и структуры зондов, обеспечивающих сохранность функциональных свойств последних. В результате было установлено, что введение короткого декатимидилатного домена на 5-конец зондов-затравок через гибкий DEG-содержащий линкер значительно повышает эффективность фотоиндуцированной иммобилизации олигонуклеотидов на капроне. Доказано, что фиксированные таким образом на твердотельном носителе зонды способны связывать ДНК-аналит и превращаться под действием Taq ДНК-полимеразы. Одним из основных фактов, остававшихся без рассмотрения до этого, ограничивающих потенциал МО как зондов для гибридизационного анализа, является их пониженная способность к комплексообразованию. Это обстоятельство приводит к тому, что при наличии внутримолекулярных структур в анализируемой ДНК ком-плексообразующей способности таких зондов может оказаться недостаточно для связывания со специфическим сайтом, вовлеченным в формирование шпилечных структур. Решением этой проблемы может стать контролируемая фрагментация ДНК-аналита. Сокращение длины НК-фрагментов снижает вероятность образования ими прочных внутримолекулярных комплексов. В литературе описаны способы фрагментации ДНК, использование которых, однако, часто требует предварительной очистки аналита.

В данной части работы представлены результаты исследований по зависимости эффективности выявления специфической последовательности в составе ПЦР-фрагмента ДНК от степени его статистической фрагментации. Фрагментацию ДНК осуществляли путем образования апуриновых или апиримидиновых сайтов (АР-сайтов) с последующей термической обработкой. Подобраны простые и вос-

39

производимые процедуры кислотной и ферментативной деструкции ДНК, не требующие дополнительной очистки анализируемой пробы перед проведением гетерофазного гибридизационного анализа. В первом варианте протокол фрагментации ДНК был основан на изменении рН реакционной смеси, содержащей ПЦР-ампликон. Значение рН образца изменяли до значения 2, добавляя расчетное количество раствора соляной кислоты (0.4 М). Полученную смесь выдерживали до 30 мин при 37 °С, что приводило к образованию апуриновых сайтов в ДНК. Фрагментацию пробы осуществляли термической обработкой (10 мин, 95 °С) после нейтрализации (дорН 7.0) раствора добавлением аликвоты 1 М раствора трис-ОН.

Второй протокол основан на использовании дезоксиуридин-содержащей ДНК и урацил-ДНК-гликозилазы (ШЮ), обеспечивающей формирование апиримиди-новых сайтов в структуре биополимера. Предварительно получали ДНК-фрагмент, проводя ПЦР в присутствии определенного количества дезоксирибо-уридинтрифосфата (сШТР). Степень фрагментации такой ДНК после обработки и00 определяется содержанием в ней сЮМР-остатков и легко контролируется изменением относительного содержания с1ТТР и <ШТР при наработке ДНК-аналита.

Выявление фрагментированной ДНК-матрицы проводили с помощью отработанной схемы, основанной на ограниченном удлинении иммобилизованного зонда в комплексе с ДНК-пробой с помощью Тац ДНК-полимеразы. В качестве зондов использовали нативные олигонуклеотиды и их мостиковые аналоги в качестве высокоселективных зондов, обладающих пониженной гибридизационной способностью. Кроме того, важно отметить, что использование фрагментированной ДНК-пробы позволяет минимизировать контаминацию помещений лабораторий полноразмерным ампликоном.

Рис. 14. Шаблоны и изображения капроновых мембран, содержащих иммобилизованные зонды, после проведения генотипирования ВГС (аева). Сравнение эффекгивностей выявления ОТ-ПЦР-фрагмента ДНК 5-ЦТ11-ВГС субтип За (Р, 230 п.о.) после проведения его кислотной и ферментативной фрагментации или без них (справа).

Эффективность предложенных подходов апробировали при разработке прототипа тест-системы по генотипированию ВГС (Рис. 14). Капроновые полоски, несущие набор ВГС и генотип-специфичных зондов, вводили в реакцию минисек-венирования в присутствии Тац ДНК-полимеразы, ограниченного набора нуклео-зидтрифосфатов, включая биотин-содержащий, и продукта ОТ-ПЦР ВГС (230

п.о.), прошедшего процедуры контролируемой фрагментации или без них. Видно, что с использованием созданных систем параллельного анализа ДНК удается однозначно типировать ВГС по набору использованных маркерных последовательностей. При этом контролируются все стадии анализа: К)+ - отражает дееспособность системы генерации колориметрического сигнала; К> - функциональность меченого трифосфата и ДНК-полимеразы.

Таким образом, в результате проведенного комплексного исследования выполнены все поставленные фундаментальные задачи, касающиеся разработки молекулярных инструментов на основе составных олигонуклеотидных конструкций. Разработаны способы прогностического расчета термической стабильности ДНК/ДНК-комплексов, образованных с участием составных олигонуклеотидных зондов. Выявлены основные факторы структуры таких объектов, определяющие стабильность и субстратные свойства комплексов на их основе. Предложены оригинальные подходы к разработке ДНК-диагностических систем и биологически активных агентов, эффективность действия которых определяет использование именно составных олигонуклеотидных конструкций.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлены основные закономерности влияния нуклеотидно-го состава и модификаций различной природы в структуре олигонуклеотидов на эффективность образования ими составных олигонуклеотидных комплексов -тандемных, конкатемерных и содержащих мостиковые олигонуклеотнды (МО). Показано, что ненуклеотидные остатки (стероидные и ароматические) в сайте одноцепочечного разрыва тандемных комплексов и ненуклеотидные выпетлива-ния в составе комплексов МО/ДНК вызывают изгиб двойной спирали ДНК в сайте модификации. Для комплексов МО/ДНК установлено, что масштаб из-гнбной деформации ДНК-спирали и степень ее дестабилизации можно задавать, варьируя природу, размер и композицию ненуклеотидных вставок на основе фосфодиэфиров олигоэтнленгликолей и олигометилендиолов. Доказано, что наличие ненуклеотидной вставки в комплексах МО/ДНК приводит к увеличению скорости диссоциации дуплексной структуры. Выявлены основные элементы структуры ДНК-комплексов и модифицирующих остатков в их составе, определяющие стабильность составных олигонуклеотидных ДНК-дуплексов.

2. Разработаны методы термодинамического анализа составных олигонуклеотидных ДНК-комплексов, позволяющие определять энергетические эффекты от формирования отдельных элементов их структуры. Созданы базы данных, содержащие величины температур плавления (Тш) и термодинамические параметры образования (энтальпии ДН°, энтропии AS0 и свободной энергии AG°37) тандемных комплексов, комплексов МО/ДНК и соответствующих контрольных Л/ДНК-структур, включающие энергетические характеристики как экспериментально определенные, так и представленные в литературе. Определены унифицированные термодинамические характеристики, позволяющие проводить прогностический расчет термодинамических параметров образования

совершенных и несовершенных тандемных комплексов, содержащих любые типы мисматчей на стыке дуплексных структур, а также совершенных комплексов ДНК с МО. Созданы алгоритмы прогностического расчета Т,„ таких дуплексов для стандартных буферных условий (1 М №С1, нейтральный рН) и новый способ расчета соответствующих величин для условий с другой ионной силой растворов. Показано, что с использованием разработанных алгоритмов удается с хорошей точностью прогнозировать стабильность составных олигонуклеотцд-ных (^ДНК-конструкций, средняя ошибка расчета Т,[7 комплексов составных олигонуклеотидов в стандартных условиях не превышает 2 °С.

3. Осуществлено систематическое исследование закономерностей превращения составных олигонуклеотидных комплексов в реакциях, катализируемых ДНК-лигазой фага Т4 и ДНК-полимеразой ТЪегтт сщиайсиь. Определены основные характеристики строения тандемных комплексов и комплексов МО/ДНК, обеспечивающие сохранность субстратных свойств соответствующих дг/ДНК-структур в реакциях, катализируемых данными ДНК-зависимыми ферментами. Показано, что в диагностических подходах, основанных на ферментативном лигировании и/или минисеквенировании ДНК, эффективность дискриминации мисматчей в несовершенных комплексах с участием составных тандемных и мостиковых олигонуклеотидов выше, чем при использовании немо-дифицированных протяженных олигонуклеотидов.

4. Доказано, что составные сшигонуклеотидные конструкции могут выступать в качестве сайт-специфичных агентов для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты в рамках как комплементарно-адресованной модификации, так и РНКаза Н-опосредованного воздействия при физиологических температурах. Продемонстрирована перспективность использования составных конструкций на основе модифицированных конкатемерных структур для эффективной доставки биологически активных олигонуклеотидов внутрь клеток млекопитающих.

5. Предложены новые варианты использования составных олигонуклеотидных конструкций для анализа ДНК. Показано, что тандемы тетрануклеота-дов и их производных образуют составные праймеры для секвенирования ДНК по методу Сэнгера. С использованием тандемов коротких олигонуклеотидов и МО разработаны новые подходы к определению точечных мутаций в ДНК, создан ряд прототипов тест-систем для анализа полиморфных сайтов в ДНК, обуславливающих генотип вирусных инфекций, генетические заболевания, а также вариации генетических маркеров в популяции человека. Проведена оптимизация протоколов использования составных олигонуклеотидных зондов при проведении параллельного гибридизационного анализа ДНК в гомо и гетерофазном вариантах. Разработаны новые способы мягкой фрагментации ДНК (кислота-зависимый и урацил-ДНК-гликозилаза-зависимый варианты) для повышения эффективности выявления специфических последовательностей в её составе с использованием составных олигонуклеотидных зондов, обладающих пониженными гибридизационными свойствами.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОГпоры

1. Vlassov V.V., Pyshnyi D.V., Vorobjev Р.Е. Nucleic acids: Structures, functions, and applications in Handbook of Nucleic Acid Purification. - Ed. D. Liu. - CRC Press. - NY. - 2009. - P. 1-20.

2. Пышный Д.В., Веньяминова, А.Г. Синяков, А.Н., Зенкова М.А., Власов В.В. Нуклеиновый наноконструктор // Наука из первых рук. - 2008. - №. 5(23). - С. 4257.

3. Виноградова О.А., Пышный Д.В. Селективность ферментативного превращения сшигонуклеотидных зондов при анализе нуклеотидных полиморфизмов ДНК // Acta naturae. - 2010. - Т. 2. - № 1(4). - С. 40-58.

Патенты

4. Koulikova V.F. (Zarytova), Ivanova Е.М., Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Krivenko

A.A.,

Dymshits G.M. Procede de detection d'une sequence d'acide nucleique a analyser //

Patent FR

#9704290.

5. Куликова В.Ф. (Зарытова), Пышный Д.В., Иванова Е.М., Лохов С.Г., Кри-венко А.А., Дымшиц Г.М. Способ выявления анализируемой последовательности нуклеиновых кислот, в том числе содержащей точечные мутации // Патент на изобретение PCT/RU № 2146707 от 20.03.2000.

6. Пышный Д.В., Иванова Е.М., Пышная И.А., Зарытова В.Ф. Способ выявления анализируемой последовательности ДНК // Патент на изобретение РФ № 2259402 от 27.08.2005.

7. Скобельцына Л.М., Пышный Д.В., Иванова Е.М., Пышная И.А., Дымшиц Г.М., Зарьггова В.Ф. Способ определения однонуклеотндных замен в известных последовательностях нуклеиновых кислот// Патент на изобретение РФ № 2247781 от 10.03.2005.

8. Пышная И.А., Дмитриенко Е.В., Пышный Д.В. Способ получения ДНК-чипа // Патент на изобретение РФ № 2340677 от 10.12.2008 г.

9. Шопаева Г.А., Бейсембаева Ш.А., Пышная И.А., Дмитриенко Е.В., Зарьггова

B.Ф., Пышный Д.В. Способ диагностики вирусного гепатита С и определение генетического типа вируса // Инновационный патент Республики Казахстан на изобретение №22681 от 15.07.2010.

Статьи

10. Pyshnyi D., Pyshnaya I., Lokhov S., Ivanova E., Zarytova V. How to force the reactive derivatives of hydrophobic tetranucleotides to attack site specifically nucleic acid targets at physiological conditions?//Nucleic Acids Symp. Ser. - 1994. - №. 31. -P. 115-116.

11. Pyshnyi D., Pyshnaya I., Sergeev D., Vorobjev P., Lokhov S., Zarytova V. A new approach to potentiate site-specific hybridization: a set of hydrophobic heterofiinctional short oligodeoxyribonucleotides // Nucleosides Nucleotides. - 1995. - V. 14. - P. 10651068.

12. Кнорре Д.Г., Пышный Д.В., Иванова E.M., Бондарь А.А., Морозов И.В., Мертвецов Н.П., Зарьггова В.Ф. Тетрануклеотиды и их феназиниевые производные в качестве составных праймеров для секвенирования ДНК методом Сэнгера //Докл. Акад. Наук. -1996. -Т. 350. -С. 119-121.

13. Денисов А.Ю., Пышный Д.В., Пышная И.А., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф. Пространственная структура 5'- и З'-эстроновых эфиров тетрануклеотида CAGC по данным 2М-ЯМР и ограниченного молекулярного моделирования // Биоорган. химия. - 1996. - Т.22. - С. 117 -125.

14. Denisov A.Yu., Sandstrom A., Maltseva T.V., Pyshnyi D.V., Ivanova E.M., Zarytova V.F., Chattopadhyaya J. The NMR structure of estrone (Es)-tethered tandem DNA duplex: (d^'pCAGCS'^EsKEs-d^'pTCCAJ)) :d(5'pTGGAGCTG3') // J. Biomol. Struct. Dyn. - 1997. - V. 15. - P. 499-516.

15. Lokhov S.G., Pyshnyi D.V. Thermodynamic and spectral properties of DNA miniduplexes with the terminal G-A mispair and 3' or 5' dangling bases// FEBS Lett. -1997.-V.420.-P. 134- 138.

16. Balbi A., Sottofattori E., Grandi Т., Mazzei M„ Pyshnyi D., Lokhov S., Lebedev A. Synthesis and hybridization properties of the conjugates of oligonucleotides and stabilization agents - II // Bioorg. Med. Chem. - 1997. - V. 5. - P. 1903 -1910.

17. Пышный Д.В., Кривенко A.A., Лохов С.Г., Иванова Е.М., Дымшиц Г.М., Зарытова В.Ф. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотцдов с нуклеиновыми кислотами. V. Лигирование коротких олигонуклеотцдов в тандеме на комплементарной матрице ДНК // Биоорган, химия. - 1998. - Т. 24. - С. 25 - 31.

18. Пышный Д.В., Кривенко А.А., Лохов С.Г., Иванова Е.М., Дымшиц Г.М., Зарытова В.Ф. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотцдов с нуклеиновыми кислотами VI. Дискриминация комплексов с мисматчем при лигиро-вании тандема коротких олигонуклеоггидов // Биоорган, химия. - 1998. - Т. 24. -С. 32-37.

19. Zarytova V.F., Pyshnyi D.V., Krivenko А.А., Dymshitz G.M., Ivanova E.M. The accurate detection of one point mutations by ligation of short oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides. - 1998. - V. 17. - P. 2149-2152.

20. Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V., Ivanova E.M., Zarytova V.F., Bonora G.M., Scalfi Happ C., Seliger К Oligonucleotide conjugates with non-nucleotidic spacers designed for discriminative hybridization at physiological temperature // Nucleosides Nucleotides. - 1998. - V. 17. - P. 1289 - 1297.

21. Пышный Д.В., Лохов С.Г., Сильников B.H., Шишкин Г.В., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф. Влияние структуры азинов, присоединенных к 5'-концевому фосфату олигонуклеотцда, на термодинамику образования комплементарных комплексов // Биоорган, химия. -1999. - Т. 25. - С. 40 - 56.

22. Денисов А.Ю., Пышный Д.В., Иванова Е.М. Природа стабилизации тандем-ного дуплекса pTGGAGCTG4pCAGC+Phn-NH-(CH2)3-NH-pTCCA) по данным УФ-, КД- и двумерной ЯМР-спектроскопии // Биоорган, химия. - 2000. - Т.26. -С. 373 - 386.

23. Bonora G.M., De Franco A.M., Rossin R„ Veronese F.M., Ferruti P., Plyasunova O., Vorobjev P.E., Pyshnyi D.V., Komarova N.I., Zarytova V.F. PAcM-AN: poly (N-acryloylmorpholine)-conjugated antiscnse oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2000. - V. 19. - P. 1281 - 1288.

24. Скобельцына Л.М., Пышный Д.В., Шишкина И.Г., Табатадзе Д.Р., Дымшиц Г.М., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Разработка калориметрической тест-системы для выявления точечных мутаций путем лигирования тандема коротких сшиго-нуклеотидов на твердофазном носителе// Молекулярн. биология. - 2000. - Т.34. -

C. 378-385.

25. Пышный Д.В., Скобельцына Л.М., Гущина Е.Н., Пышная И.А., Шишкина И.Г., Дымшиц Г.М., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Выявление однобуквенных замен в амплифицированных фрагментах ДНК путем лигирования тандемов коротких олигонуклеотидов в растворе и на твердофазном носителе // Молекулярн. биология. - 2000. - Т.34. - С. 984 - 997.

26. Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Podyminogin М.А., Ivanova E.M., Zarytova V.F. A new strategy of discrimination of a point mutation by tandem of short oligonucleotides //Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.-2000.-V. 19.-P. 1931 -1941.

27. Vorobjev P.E., Pyshnaya LA., Pyshnyi D.V., Venyaminova A.G., Ivanova E.M., Zarytova V.F., Bonora G.M., Scalfi-Happ C., Seliger H. Nuclease resistance and RNase H sensitivity of oligonucleotides bridged by oligomethylenediol and oligoethyl-ene glycol linkers// AntisenseNucleic Acid Drug Dev. -2001. -V. 11.- P. 77 -85.

28. Денисов А.Ю., Рябинин B.A., Пышный Д.В., Абрамова Т.В., Синяков А.Н. Пространственная структура ДНК-дуплекса d(CG 111 ATT)p-Net : d(AATAAACG) с необычной локализацией ковалентно присоединенного аналога нетропсина (Net) по данным двумерной ЯМР спектроскопии // Журнал структурной химии. - 2001. - Т. 42. - С. 111-119.

29. Ryabinin V.A. Boutorine A.S., Hélène С., Denisov A.Yu., Pyshnyi D.V., Sinya-kov A.N. Oligonucleotide—minor groove binder 1:2 conjugates: side by side parallel minor groove binder motif in stabilization of DNA duplex // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2004. - V. 23. - P. 953 - 968.

30. Pyshnyi D.V., Pyshnaya I.A., Levina A.S., Goldberg E.L., Zarytova V.F., Knorre

D.G., Ivanova E.M. Thermodynamic analysis of stacking hybridization of oligonucleotides with DNA template // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2001. - V. 19. - P. 555-570.

31. Кабилов M.P., Пышный Д.В., Дымшиц Г.М., Гашникова Н.М., Покровский А.Г., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Новый подход к выявлению анализируемой последовательности ДНК путем УФ-иммобилизации ее гибриднзационного комплекса с высокоспецифичным зондом, образующимся при лигировании тандема коротких олигонуклеотидов в растворе // Молекулярн. биология. - 2002. -Т. 36. - С. 424-431.

32. Пышный Д.В., Иванова Е.М. Термодинамические параметры коаксиального стэкинга при гибридизации олигодезоксирибонуклеотидов встык // Изв. Акад. Наук. Сер. Хим. - 2002. - С. 1057 -1066.

33. Пышный Д.В., Скобельцына Л.М., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф.. Тест-системы для выявления точечных мутаций в структуре ДНК // Наука - производству. - 2003. - Т. 3. - С. 35 - 41.

34. Pyshnyi D.V., Goldberg E.L., Ivanova Е.М. Efficiency of coaxial stacking depends on (he DNA duplex structure // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2003. - V. 21. - P. 459468.

35. Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M. The influence of the non-nucleotide insert on the hybridization properties of oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2004. - V. 23. - P. 1065 - 1071.

36. Кабилов M.P., Пышный Д.В., Дымшиц Г.М., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Выявление тринуклеотидной делеции AF508 в гене CFTR человека УФ-иммобшшзацией на капроне комплекса ПЦР-фрагмента с высокоспецифичным зондом II Молекулярн. биология. - 2003. - V. 37. - Р. 793 - 800.

37. Kabilov М., Pyshnyi D., Dymshits G., Zarytova V., Ivanova E. A new approach to revealing point mutations in DNA analyzed by colorimetric detection // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2004. - V. 23. - P. 1023 - 1030.

38. Pyshnyi D.V., Ivanova E.M. The influence of nearest neighbours on the efficiency of coaxial stacking at contiguous stacking hybridization of oligodeoxyribonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2004. - V. 23. - P. 1057 -1064.

39. Ломзов A.A., Пышная И.А., Иванова E.M., Пышный Д.В. Термодинамические параметры для расчета стабильности комплексов мостиковых олигонуклео-тидов // Докл. Акад. Наук. - 2006. - Т. 409. - № 2. - С. 266 - 270.

40. Pyshnyi D.V., Lomzov А.А., Pyshnaya I. A., Ivanova E.M. Hybridization of the bridged oligonucleotides with DNA: thermodynamic and kinetic studies // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2006. - V. 23. - P. 567 - 580.

41. Виноградова O.A., Пышная И.А., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Пышный Д.В. Повышение эффективности гибрндизационного анализа путем ограниченной фрагментации ДНК пробы // Молекулярн. биология. - 2007. - Т. 41. - С. 163 -172.

42. Gusachenko(Simonova) O.N., Pishnyi D.V., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Modified concatemeric oligonucleotide complexes: new system for efficient oligonucleotide transfer into mammalian cells // Hum. Gene Ther. - 2008. - V. 19. - P. 532 - 546.

43. Mal'shakova V.S., Pyshnyi D.V., Bondar A.A., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Isolation and sequencing of short cell-surface-bound DNA // Ann. N.Y. Acad. Sci. -2008. - V. 1137. - P. 47 - 50.

44. Дмитриенко E.B., Пышная И.А., Зарытова В.Ф., Пышный Д.В. Разработка новых подходов к параллельному анализу ДНК // Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. Павлова. - 2008. - Т. XV. - С. 73-74.

45. Ломзов A.A., Пышным Д.В. Расчет температуры плавления нативных и модифицированных комплексов ДНК при различных концентрациях катионов металлов с помощью расширенной модели конденсации противоионов И Вестник НГУ. Сер. Физика. - 2008. - Т. 3. - С. 61 - 75.

46. Виноградова O.A., Еремеева Е.В., Ломзов A.A., Пышная И.А., Пышный Д.В. Конструирование изогнутых дцДНК с заданными геометрическими характеристиками на основе комплексов мостиковых олигонуклеотндов // Биоорган, химия. - 2009. - Т. 35. - С. 384 - 396.

47. Филиппов Н.С., Ломзов A.A., Пышный Д.В. Термодинамическое описание самоассоциации олигонуклеотндов в конкатемерные структуры // Биофизика. -

2009.-Т. 54.-С. 402-417.

48. Пышная И.А., Виноградова O.A., Кабилов М.Р., Иванова Е.М., Пышный Д.В. Мостиковые олигонуклеотиды - молекулярные зонды для исследования фермент-субстратного взаимодействия и аллель-специфичного анализа ДНК // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - С. 123 - 1251.

49. Дм1приенко Е.В., Пышная И.А., Пышный Д.В. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с помощью олигонукпеотидных производных. I. Ковалент-ная иммобилизация олигонуклеотидных зондов на капроне // Биоорган, химия. -

2010.-Т. 36.-С. 700 - 713.

50. Дмитриенко Е.В, Хомякова Е.А, Пышная И.А., Брапш А.Г., Ведерников В.Е., Пышный Д.В. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидных производных. II. Изотермическая амплификация сигнала при анализе ДНК методом минисеквенирования // Биоорган, химия. - 2010. - Т. 36.-С. 700-713.

51. Skobeltsyna L.M., Pyshnyi D.V., Ivanova Е.М., Stepanov V.A., Puzyrev V.P., Dymshits G.M., Kharkov V.N., Zarytova V.F. Short oligonucleotide tandem ligation assay for genotyping of single-nucleotide polymorphisms in Y chromosome // Mol. Bio-technol. - 2010. - V. 45. - P. 1-8.

52. Закабунин А.И., Камынина Т.П., Ходырева С.Н., Пышная И.А., Пышный Д.В., Храпов Е.А., Филипенко М.Л. Клонирование генов, выделение и исследование свойств рекомбинантных ДНК-лигаз термофильных археев Pyrococcus abyssi и Methanobacteriiim ihermoaiitotrophicum II Молекулярн. биология. - 2011. -T. 45.-С. 258-266.

53. Виноградова О. А., Щеглов Д. В., Латышев А. В., Пышный Д. В. Изучение структурной организации конкатемерных комплексов на основе нативных и модифицированных дцЦНК-блоков // Вестник НГУ. Сер. Биология, клиническая медицина.-2011.-Т. 9.-С. 109-117.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор приносит благодарность и выражает глубокую признательность директорам Института академику Кнорре Д.Г. и академику Власову В.В. за проявленный ими интерес к данной работе и позитивное стимулирование её завершения.

Автор выражает искреннюю признательность заведующему лабораторией химии нуклеиновых кислот Зарытовой В.Ф. и всему коллективу данной лаборатории за поддержку при становлении каркаса данной работы и содействие её плодотворной реализации.

Автор благодарит всех своих коллег и соавторов за постоянное внимание и поддержку, советы и творческий подход к планированию экспериментальной работы и обсуждению полученных результатов.

Автор глубоко признателен всем сотрудникам ИХБФМ СО РАН и коллегам из других организаций, способствовавшим реализации представленного ниже исследования.

Автор благодарит весь коллектив Лаборатории бионанотехнологии, студентов и аспирантов, работавших в ее составе, за неоценимую помощь в работе и проявленный к ней научный интерес.

Отдельные благодарности приношу Пышной И. А., Веньяминовой А.Г. и Бушуевой Т.Ю. за всестороннюю и неоценимую поддержку и помощь на каждом этапе реализации представленной работы.

Автор посвящает данную работу своим родным и близким, к числу которых относит своего научного наставника Иванову Евгению Михайловну.

Подписано в печать 18.07.2011 г. Формат 60x90/16. О&ьём 4 пл.

Тираж 160 экз. Заказ № 1707/10 от 17.07.2011 г.

Отпечатано в типографии "Срочная полиграфия" ИП Малыгин А.М 630055 г. Новосибирск ул. Мусы Джалиля 11, оф. 132 тел.: 383 217-43-46

Список сокращений

1. Введение

2. Взаимосвязь структуры и функциональной значимости ДНК- 14 комплексов в контексте гибридизационного анализа НК (обзор литературы)

2.1. Термодинамический анализ комплексообразования ДНК

2.1.1. Модельные представления для прогностического расчета стабильности 21 олигонуклеотидных комплексов

2.1.2. Термодинамическое описание формирования ДНК/ДНК комплексов 21 олигонуклеотидов

2.1.2.1. Зависимость термодинамических параметров формирования комплексов 24 олигонуклеотидов (ДЯ° и Д£") от температуры

2.1.2.2. Компенсационный эффект энтальпии и энтропии

2.1.3. Модели расчета стабильности комплексов олигонуклеотидов 28 2.1.3.1. Физическая модель. 28' 2.1.3.21 Модель ближайших соседей (БС)

Приближение нулевых соседей

Приближение первых (ближайших) соседей

2.1.3.3. Составление баз данных,и параметризация.комплексов в приближении 36 модели ближайших соседей,

2.1.3.4. Термодинамические параметры формирования1 комплексов1 с 39 нарушениями

2.1.4. • Влияние условий среды на комплексообразующие свойства олигонуклеотидов

2.1.5. Влияние ионной силы раствора на. комплексообразующие свойства 47 нуклеиновых кислот

Актуальность проблемы. Олигонуклеотиды - короткие, синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (НК) - в настоящее время широко используют в качестве молекулярных инструментов для изучения различных биохимических процессов, протекающих с участием НК, специфических зондов в системах НК-диагностики, ген-направленных биологически активных препаратов [1-4]. Относительно недавно продемонстрирована возможность использования олигонуклеотидов в качестве строительных блоков при формировании разнообразных наноструктур, обладающих заранее заданными геометрическими характеристиками [5]. Столь обширные области применения обусловлены, в первую очередь, способностью олигонуклеотидов образовывать прочные двухцепочечные комплексы при реализации комплементарного взаимодействия с НК. Современные возможности химии нуклеиновых кислот позволяют синтезировать любые олигонуклеотидные последовательности и производные на их основе, что определяет необходимость разработки фундаментальных основ и принципов выбора структуры синтетических НК-конструкций в строгом соответствии с целями и задачами исследований, сопряженных с их использованием. Данная задача оказывается актуальной еще и потому, что высокоэффективное связывание протяженного олигонук-леотида может оказаться неселективным, поскольку наряду с образованием прочного совершенного комплекса не исключена возможность! формирования частично комплементарных комплексов с мишенями, содержащими нуклеотидные несоответствия [б]. Наиболее остро проблема обеспечения селективности комплексообразования встает для вС-богатых олигонуклеотидных конструкций, когда стабильность ОС-богатых комплексов, содержащих мисматчи, оказывается близка или даже выше стабильности совершенных АТ-богатых комплексов одной и той же длины. Зависимость стабильности НК-комплексов от длины и нуклеотидного состава делает проблематичным использование наборов природных олигонуклеотидов, например, для систем параллельной НК-диагностики, в том числе и с использованием биочиповой технологии [4].

Эффективное использование олигонуклеотидов возможно лишь при наличии алгоритмов, позволяющих проводить направленный выбор их структуры, обеспечивающей формирование НК/НК-комплексов с заранее заданными физико-химическими и/или субстратными свойствами. Это может быть реализовано только при условии создания детализованных модельных описаний структурно-функциональных особенностей тех или иных типов комплексов НК. К настоящему времени наиболее детально описаны свойства комплексов нативных НК в различных буферных условиях [7-10]. Определены-унифицированные термодинамические параметры формирования отдель

Впадение ных элементов двойной спирали НК, образованных как комплементарными парами оснований, так и для случаев несовершенного спаривания оснований. Такой исчерпывающий набор характеристик дает возможность точного прогнозирования поведения олигонуклеотидных конструкций при образовании простых комплексов олигомер/НК-матрица. Однако изменение типа комплекса или формирование дуплексной структуры, элементы которой непараметризованы с точки зрения энергетических эффектов, в значительной степени сокращают спектр возможных приложений даже хорошо изученных классов олигонуклеотидов. Достаточно часто для изменения свойств олигонуклеотидных конструкций, в том числе гнбридизационных, создают их различные производные или аналоги, содержащие модифицированные компоненты [11-14]. Примером таких структур являются «скованные» НК (1ЛМА) [12], пептвдил-НК (РКА) [13], морфолино-НК [14]. Обладая рядом преимуществ относительно типичных олигонуклеотидов,- зонды на основе модифицированных блоков могут вести себя менее предсказуемо, и, кроме того, такие зонды могут быть лишены целого ряда других свойств, присущих именно нативным фрагментам НК и комплексам с их участием. Так, например, аналоги и целый ряд производных НК утрачивают возможность их превращения в системах, работающих с участием НК-зависимых ферментов [15].

Разработка любых новых типов производных или аналогов НК до уровня, обеспечивающего возможность их широкого применения в молекулярно-биологической и диагностической практике, требует детального описания физико-химических и биохимических свойств вновь создаваемых молекулярных инструментов. Эта задача в каждом конкретном случае является чрезвычайно объемной, но ее решение открывает перспективы использования лишь данного, отдельно взятого типа НК-специфичных конструкций. С другой стороны, разработка нового инструментария на основе нативных НК-фрагментов более перспективна, поскольку может основываться на богатых фундаментальных знаниях о структурной организации, биохимических и физико-химических свойствах отдельных компонентов природных НК. Массив таких данных, накопленных за десятилетия после расшифровки структуры двухцепочечной (дц) ДНК [16], огромен, и рациональное использование этой информации может привести к созданию новых универсальных путей использования нативных олигонуклеотидных блоков в качестве компонентов оригинальных конструкций, сочетающих в себе функциональные характеристики природных НК. Более того, новые данные, полученные при использовании именно конструкций на основе нативных олигомеров или их производных, позволят расширить имеющиеся представления об особенностях молекулярного распознавания с участием НК и структурной организации комплексов с возмущениями, чей характер строго задается.

Введите

С этой точки зрения наиболее оптимальными НК-конструкциями являются тандемы олигонуклеотидов или мостиковые олигонуклеотиды, содержащие ненуклеотидные вставки в углеводно-фосфатном остове. Такие наборы отдельных или сшитых вставками нативных олигонуклеотидов формируют с адресной НК-последовательностью комплексы, составленные из немодифицированных блоков и содержащие либо одноцепо-чечный (oif) разрыв, встречающийся в природе, либо ненуклеотидное выпетливание. В этих случаях, изменяя структуру составных олигонуклеотидов, появляется возможность регулировать стабильность формируемых ими дуплексных структур, которые, имея немодифицированные фрагменты, сохраняют способность выступать в качестве субстратов для различных НК-зависимых ферментов [17-19].

Формирование составных комплексов коротких олигонуклеотидов на общей НК-матрице давно привлекает внимание исследователей. Еще в конце 1960-х годов было доказано, что нуклеозиды и короткие олигонуклеотиды способны связываться с поли-пиримидиновыми матрицами за счет реализации кооперативных взаимодействий между азотистыми основаниями в одной цепи [20-21]. Практически сразу это позволило найти важное применение обнаруженного феномена для синтеза фрагментов искусственных генов при ферментативном лигировании специфичных наборов олигонуклеотидов [18].

Впервые тандемные системы были предложены в качестве сиквенс-специфичных агентов в работах проф. Зарытовой В.Ф. (НИБХ СО РАН) [22, 23]. Независимо принцип взаимной стабилизации олигомеров при их гибридизации на прилегающих сайтах общей НК-мишени был развит и в других лабораториях, например, акад. Мирзабекова А. Д. - в концепции Sequensing by Contiguous Stacking Hybridization [24] или Hélène С. — при использовании олигонуклеотидных систем, несущих остатки интеркаляторов в качестве стабилизаторов комплексов производного олигомера с НК-мишенью [25]. Мостиковые олигонуклеотиды, разработанные в ИХБФМ СО РАН, сочетают в себе некоторые преимущества разобщенных наборов коротких олигонуклеотидов, объединяя этот тандем в одномолекулярную структуру, что облегчает контроль за поведением составной конструкции в исследуемой системе. К тому же ненуклеотидные вставки, вводимые в углеводно-фосфатный остов таких олигонуклеотидов, позволяют направлено регулировать свойства мостиковых олигомеров, что дает дополнительные возможности оптимизации структуры молекулярных зондов для решения практических задач. Наряду с тандемными системами и мостиковыми олигонуклеотидами в последнее время наблюдается возрастание интереса к многокомпонентным НК-ассоциатам, например, к конкатемерным комплексам. Данные составные структуры формируются за счет взаимодействия блоков НК с липкими концами и рассматриваются как перспективные объ

11

Вчсдччис екты для создания новых диагностических приемов [26], новых систем внутриклеточной доставки сиквенс-специфичных агентов [27, 28], а также сборки генов исходя из наборов синтетических олигонуклеотидов [18, 29]. В литературе представлено достаточно подробное описание феноменологических моделей образования составных НК-дуплексов [30-35], однако комплексной физико-химической характеризации таких молекулярных систем до начала представленного ниже исследования не проводили. Данное обстоятельство в значительной степени ограничивает потенциал практического использования составных олигонуклеотидных систем и сужает сферы их потенциальных применений в ДНК-диагностике и при создании ген-направленных агентов.

Целью;данной* работы, являлось комплексное решение фундаментальной1 проблемы выявления строгой взаимосвязи структуры и физико-химических свойств с функциональной значимостью составных ДНК-комплексов на основе тандемных олигонуклеотидных конструкций, включая конкатемеры, и мостиковых олигонуклеотидов, содержащих ненук-леотидные вставки.

В ходе работы было необходимо решить следующие основные задачи:

1) разработать комплексный подход к исследованию пространственной структуры, физико-химических свойств составных комплексов олигодезоксирибонуклеотидов (кинетических и термодинамических параметров комплексообразования), образованных с участием нативных НК-компонентов и их производных, позволяющий выявлять структурные элементы, влияющие на эффективность формирования таких типов комплексов, как полностью комплементарных, так и содержащих мисматчи;

2) определить набор и величины унифицированных термодинамических параметров, обеспечивающих возможность прогностического расчета температуры плавлениям составных ДНК/ДНК-комплексов и термодинамических параметров (энтальпии ДН°, энтропии ДБ" и свободной энергии АС0 г) их формирования в стандартных условиях (1 М ЫаС1, нейтральный рН), а также характера изменения данных величин при изменении состава буферных растворов;

3) систематически исследовать закономерности превращения составных олигонуклеотидных комплексов в реакциях, катализируемых ДНК-зависимыми ферментами (ДНК-лигазой и ДНК-полимеразой), и разработать на основе выявленных закономерностей алгоритмы выбора структуры молекулярных инструментов для молекулярно-биологического анализа и высокосеяективных зондов, а также новые подходы к созданию систем ДНК-диагностики.

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт химической биологии и фундаментальной .медицины Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск (бывший Новосибирский Институт биоорганической химии СО РАН).

Благодарности

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор приносит благодарность и выражает глубокую признательность директорам Института академику Кнорре Д.Г. и академику Власову В.В. за проявленный ими интерес к данной работе и позитивное стимулирование её завершения.

Автор выражает искреннюю признательность заведующему лабораторией химии нуклеиновых кислот Зарытовой В.Ф. и всему коллективу данной лаборатории за поддержку при становлении каркаса данной работы и содействие её плодотворной реализации.

Автор благодарит всех своих коллег и соавторов за постоянное внимание и поддержку, советы и творческий подход к планированию экспериментальной работы и обсуждению полученных результатов.

Автор глубоко признателен всем сотрудникам ИХБФМ СО РАН и коллегам из других организаций, способствовавшим реализации представленного ниже исследования.

Автор благодарит весь коллектив Лаборатории бионанотехнологии, студентов и аспирантов, работавших в ее составе, за неоценимую помощь в работе и проявленный к ней научный интерес.

Отдельные благодарности приношу Пышной И.А., Веньяминовой А.Г. и Бушуевой Т.Ю. за всестороннюю и неоценимую поддержку и помощь на каждом этапе реализации представленной работы.

Автор посвящает данную работу своим родным и близким, к числу которых относит своего научного наставника Иванову Евгению Михайловну.

Общ).аппаратуры

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые установлены основные закономерности влияния нуклеотидного состава и модификаций различной природы в структуре олигонуклеотидов на эффективность образования ими составных олигонуклеотидных комплексов — тандемных, конкатемерных и содержащих мостиковые олигонуклеотиды (МО). Показано, что ненуклеотидные: остатки (стероидные и ароматические) в сайте одноцепочечного разрыва тандемных комплексови ненуклеотидные выпетливания в составе комплексов МО/ДНК вызывают изгиб двойной? спирали ДНК в сайте, модификации;. Для: комплексов« МО/ДНК установлено, что масштаб) изгибной деформации ДНК-спирали и степень ее. дестабилизации« можно • задавать,, варьируя? природу, размер и композицию,1 ненуклеотидных вставок на основе фосфодиэфиров олигоэтиленгликолей и олигометилендиолов. Доказано, что наличие ненуклеотидной вставки. в- комплексах МО/ДНК приводит к увеличению скорости диссоциации; дуплексной- структуры: Выявлены основные элементы структуры ДНК-комплексов и модифицирующих остатков в их составе," определяющие стабильност составных олигонуклеотидныхДНК-дуплексов:

2. Разработаны методы термодипамического анализа; составных олигонуклеотидных ДНК-комплексов, позволяющие определять энергетические эффекты от формирования; отдельных элементов их структуры. Созданы базы данных, содержащие величины температур плавления (Тш) и .термодинамические параметры: образования (энтальпии АН°, энтропии АБ0 и свобод1ЮЙ энергии АО°з7) тандемных комплексов, комплексов МО/ДНК и соответствующих контрольных (Зг/ДНК-структур, • включающие энергетические характеристики как экспериментально определенные, так и представленные в; литературе. Определены унифицированные термодинамические характеристики, позволяющие проводить, прогностический расчет термодинамических параметров образования совершенных и несовершенных тандемных комплексов^ содержащих любые типы мисматчей на стыке дуплексных структур, а также совершенных комплексов ДНК с МО: Созданы , алгоритмы прогностического расчета Тй, таких дуплексові для стандартных буферных условий (1 М КаС1, нейтральный рН) и новый способ расчета соответствующих величин для условий с другой ионной силой растворов; Показано, что с использованием разработанных алгоритмов удается с хорошей точностью прогнозировать стабильность составных олигонуклеотидных дг/ДНК-конструкций, средняя ошибка расчета Т,17 комплексов составных олигонуклеотидов в стандартных условиях не превышает 2 °С.

3. Осуществлено систематическое исследование закономерностей превращения составных олигонуклеотидных комплексов в реакциях, катализируемых ДНК-лигазой фага Т4 и ДНК-полимеразой Ткегтш ациШгсш. Определены основные характеристики строения тандемных комплексов и комплексов МО/ДНК, обеспечивающие сохранность субстратных свойств соответствующих дг/ДНК-структур в реакциях, катализируемых данными ДНК-зависимыми ферментами. Показано, что в диагностических подходах, основанных на ферментативном лигировании и/или минисеквенировании ДНК, эффективность дискриминации мисматчей в несовершенных комплексах с участием составных тандемных и мостиковых олигонуклеотидов выше, чем при использовании немодифицированных протяженных олигонуклеотидов.

4. Доказано, что составные олигонуклеотидные конструкции могут выступать в качестве сайт-специфичных агентов для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты в рамках как комплементарно-адресованной модификации, так и РНКаза Н-опосредованного воздействия при* физиологических температурах. Продемонстрирована перспективность использования составных конструкций 1 на' основе модифицированных конкатемерных структур' для« эффективной доставки биологически активных олигонуклеотидов внутрь клеток млекопитающих.

5. Предложены новые варианты, использования составных олигонуклеотидных конструкций для» анализа ДНК. Показано, что тандемы тетрануклеотидов > и их производных образуют составные праймеры для секвенирования ДНК по методу Сэнгера. С использованием тандемов коротких олигонуклеотидов и МО разработаны новые подходы к определению точечных мутаций в ДНК, создан ряд прототипов тест-систем для анализа полиморфных сайтов в ДНК, обуславливающих генотип вирусных инфекций, генетические заболевания, а также вариации генетических маркеров в популяции человека. Проведена оптимизация протоколов использования составных олигонуклеотидных зондов при проведении параллельного гибридизационного анализа ДНК в гомо- и гетерофазном вариантах. Разработаны новые способы мягкой фрагментации ДНК (кислота-зависимый и урацил-ДНК-гликозилаза-зависимый варианты) для повышения эффективности выявления-специфических последовательностей в её составе с использованием' составных олигонуклеотидных зондов, обладающих пониженными гибридизационными свойствами.

1. Knorre G.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives // New York. CRC Press - 1994. pp 384.

2. Oligonucleotides as therapeutic agents // Ed. Chadwick D., Cardew G. Willey. -1997. pp 250.

3. Molecular diagnostics // Ed. Patrinos G., Ansorge W. Academic Press Inc. - 2009. -pp 589.

4. DNA arrays: methods and protocols in methods in molecular biology // Ed. Rampal J.B. Humana Press. - 2001. - V. 170. - pp 264.

5. Seeman N.C. DNA in a material world // Nature. 2003. - V. 42. - P. 427-431.

6. Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions // Trends Biochem. Sci. 2004. - V. 29. - P. 62-71.

7. SantaLucia J.Jr, Hicks D. The Thermodynamics of DNA structural motifs // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. - V. 33. - P: 415-440.

8. Mathews D.H., Sabina J., Zuker M., Turner D.H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure // J. Mol. Biol. 1999. - V. 288. - P. 911-940.

9. Sugimoto N., Nakano S., Katoh M., Matsumura A., Nakamuta H., Ohmichi Т., Yone-yama M., Sasaki M. Thermodynamic parameters to predict stability of RNA/DNA hybrid duplexes // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 11211-11216.

10. Owczarzy R., Moreira B.G., You Y., Behlke M.A., Walder J.A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations // Biochemistry. 2008. - V. 47. - P. 5336-5353.

11. Freier S.M., Altmann K.H. The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA:RNA duplexes // Nucleic Acids Res. -1997. -V. 25. P. 4429-4443.

12. Vester В., Wengel J. LNA (locked nucleic acid): high-affinity targeting of complementary RNA and DNA // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 13233-13241.

13. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide // Science. — 1991. — V. 254.-P. 1497-1500.

14. Summerton J., Weller D. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties // Antisense Nucleic Acid Drug. Dev. 1997. - V. 7. - P. 187-195.

15. Uhlmann E. Peptide nucleic acids (PNA) and PNA-DNA chimeras: from high binding affinity towards biological function // Biol. Chem. 1998. - V. 379. - P. 1045-1052.

16. Watson J.D., Crick F.H.C. Molecular structure of nucleic acids: a structure of deoxyri-bose nucleic acid // Nature. 1953. - V. 248. - P. 737-738.

17. Gupta N.K., Khorana H.G. Studies on polynucleotides, XC. DNA polytnerase-catalyzed repair of short DNA duplexes with single-stranded ends // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1968. - V. 61. - P. 215-222.

18. Huang W.M., T'so P.O. Physicochemical basis of the recognition process in nucleic acid interactions. I. Interactions of polyuridylic acid and nucleosides // J. Mol. Biol. -1966.-V. 16. P. 523-543.

19. Michelson A.M., Monny C. Polynucleotides. X. Oligonucleotides and their association with polynucleotides // Biochim. Biophys. Acta. 1967. - V. 149. - P. 107-126.

20. Khrapko K.R., Lysov Yu.P., Khorlyn A.A., Shick V.V., Florentiev V.L., Mirzabekov A.D. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Lett. 1989. -V.256.-P. 118-122:

21. Asseline U., Thuong N.T., Helene C. Oligonucleotides covalently linked to intercalating agents. Influence of positively charged substituents on biding to complementary sequences // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 8936-8941.

22. Dirks R.M., Pierce N.A. Triggered amplification by hybridization chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-2004. V. 101.-P. 15275-15278.

23. Simonova O.N., Vladimirova A.V., Zenkova M.A., Vlassov V.V. Enhanced cellular binding of concatemeric oligonucleotide complexes // Biochim. Biophys. Acta. — 2006. — V. 1758.-P. 413-418.

24. Sarkar Т., Comvell C.C., Harvey L.C., Santai C.T., Hud N.V. Condensation of oligonucleotides assembled into nicked and gapped duplexes: potential structures for oligonucleotide delivery //Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - P. 143-151.

25. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Turkin S.I., Gromova E.S. DNA-like duplexes with repetitions. I. Properties of concatemer duplexes formed by d(T-G-C-A-C-A-T-G) // Nucleic Acids Res. 1980. - V. 8. - P: 2413-2429.

26. Walter A.E., Turner D.H. Sequence dependence of stability for coaxial stacking of RNA helixes with Watson-Crick base paired interfaces // Biochemistry. 1994. — V. 33. — P. 12715-12719.

27. Gelfand C.A., Plum G.E., Grollman A.P., Johnson F., Breslauer K.J. Thermodynamic consequences of an abasic lesion in duplex DNA are strongly dependent on base sequence // Biochemistry. 1998. -V. 37. - P. 7321-7327.

28. Shchepinov M.S., Udalova I.A., Bridgman A.J., Southern E.M.Oligonucleotide den-drimers: synthesis and use as polylabelled DNA probes // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4447-4454.

29. Protozanova E., Yakovchuk P., Frank-Kamenetskii M.D. Stacked-unstacked equilibrium at the nick site of DNA // J. Мої. Biol. 2004. - V. 342. - P. 775-785.

30. Горбунов B.H., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотера-пию наследственных заболеваний // Санкт-Петербург: "Специальная литература" — 1997. -287 с.

31. Friedman K.J., Highsmith W.E., Prior T.W., Perry T.R., Silverman L.M. Cystic fibrosis deletion mutation detected by PCR-mediated site-directed mutagenesis // Clin. Chem. -1990. V. 36. - P. 695-696.

32. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989. - V. 86. - P. 2766-2770.

33. Rossetti S., Englisch S., Bresin E., Pignatti P.F., Turco A.E. Detection of mutations in human genes by a new rapid method: cleavage fragment length polymorphism analysis (CFLPA) // Мої. Cell Probes. 1997. - V. 11. - P. 155-160.

34. White M.B., Carvalho M., Derse D., O'Brien S.J., Dean M. Detecting single base substitutions as heteroduplex polymorphisms // Genomics. 1992. - V. 12. - P. 301-306.

35. Myers R.M., Maniatis Т., Lerman L.S. Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis // Methods Enzymol. 1987. - V. 155. -P. 501-527.

36. Ke S.H., Wartell R.M. Influence of nearest neighbor sequence on the stability of base pair mismatches in long DNA; determination by temperature-gradient gel electrophoresis // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 5137-5143.

37. Guldberg P., Guttler F. A simple method for identification of point mutations using denaturing gradient gel electrophoresis // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 22612262.

38. Liu W., Smith D.I., Rechtzigel K.J., Thibodeau S.N., James C.D. Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) used in the detection of germline and somatic mutations //Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 1396-1400.iiiicok .iiiincpainypbi

39. Hecker K.H., Taylor P.D., Gjerde D.T. Mutation detection by denaturing DNA chromatography using fluorescently labeled polymerase chain reaction products // Anal. Bio-chem. 1999. - V. 272. - P. 156-164.

40. Novack D.F., Casna N.J., Fischer S.G., Ford J.P. Detection of single base-pair mismatches in DNA by chemical modification followed by electrophoresis in 15% poly-acrylamide gel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. - Y. 83. - P. 586-590.

41. Verpy E., Biasotto M., Meo T., Tosi M. Efficient detection of point mutations on color-coded strands of target DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. - V. 91. - P. 1873-1877.

42. Ren J., Ulvik A., Refsum H., Ueland P.M. Chemical mismatch cleavage combined with capillary electrophoresis: detection of mutations exon 8 of the cystathionine beta-synthase gene 11 Clin. Chem. 1998. - V. 44. - P: 2108-2114'.

43. Lambrinakos A., Humphrey K.E., Babon J.J., Ellis T.P., Cotton R.G. Reactivity of potassium permanganate and tetraethylammonium chloride with mismatched bases and a simple mutation detection protocol // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 1866-1874.

44. Lishanski A., Ostrander E. A., Rine J. Mutation detection by mismatch binding protein, MutS, in amplified DNA: application to the cystic fibrosis gene // Proc. Natl. Acad. Sci: U. S. A. 1994. - Y. 91. - P. 2674-2678.

45. Wagner R., Debbie P., Radman M. Mutation detection using immobilized mismatch binding protein (MutS) //Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 3944-3948.

46. Ellis L.A., Taylor G.R., Banks R'., Baumberg S. MutS binding protects heteroduplex DNA from exonuclease digestion in vitro: a simple method for detecting mutations // Nucleic Acids Res. 1994. - V. 22. - P. 2710-2711.

47. Smith J., Modrich P. Mutation detection with MutH, MutL, and MutS mismatch repair proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. - V. 93. - P. 4374-4379.

48. Beaulieu ML, Larson G.P., Geller L., Flanagan S.D., Krontiris T.G. PCR candidate region mismatch scanning: adaptation to quantitative, high-throughput genotyping // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 1114-1124.

49. Xu J.F., Yang Q.P., Chen J.Y., van Baalen M.R., Hsu I.C. Determining the site and nature of DNA mutations with the cloned MutY mismatch repair enzyme // Carcinogenesis. 1996.-V. 17.-P. 321-326.

50. Maulik G., Botchway S., Chakrabarti S., Tetradis S., Price B., Makrigiorgos G.M. Novel nonisotopic detection of MutY enzyme-recognized mismatches in DNA via ultrasensitive detection of aldehydes //Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 1316-1322.

51. Chakrabarti S., Price B.D., Tetradis S., Fox E.A., Zhang Y., Maulik G., Makrigiorgos G.M. Highly selective isolation of unknown mutations in diverse DNA fragments: toward new multiplex screening in cancer // Cancer Res. 2000. - V. 60. - P. 3732-3737.

52. Myers R.M., Larin Z., Maniatis T. Detection of single base substitutions by ribonucle-ase cleavage at mismatches in RNA:DNA duplexes // Science. 1985. - V. 230. - P. 12421246.

53. Шабарова 3.A., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов // Москва: "Химия". 1978. - 582 с.

54. Youil R., Kemper B.W., Cotton R.G. Screening for mutations by enzyme mismatch cleavage with T4 endonuclease VII // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. - V. 92. - P. 87-91.

55. Del T.B., Poff H.E., Novotny M.A., Cartledge D.M., Walker R.I., Earl C.D., Bailey A.L. Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic mutation detection // Clin. Chem. 1998. - V. 44. - P. 731-739.

56. Mashal R.D., Koontz J., Sklar J. Detection of mutations by cleavage of DNA hetero-duplexes with bacteriophage resolvases // Nat. Genet. 1995. - V. 9. - P. 177-183.

57. Howard.J.T., Ward J., Watson J.N., Roux K.H. Heteroduplex cleavage analysis using SI nuclease // Biotechniques. 1999. -V. 27. - P. 18-19.

58. Oleykowski C.A., Bronson Mullins C.R., Godwin A.K., Yeung A.T. Mutation detection using a novel plant endonuclease // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 45974602.

59. Conner B.J., Reyes A.A., Morin C., Itakura K., Teplitz R.L., Wallace R.B. Detection of sickle cell beta S-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1983. - V. 80. - P. 278-282.

60. Lilley D.M., Wilson T.J. Fluorescence resonance energy transfer as a structural tool for nucleic acids // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. - V. 4. - P. 507-517.

61. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., Wolf D.E. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. - V. 85. - P. 8790-8794.

62. Bonnet G., Tyagi S., Libchaber A., Kramer F.R. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. - V. 96. - P. 6171-6176.

63. Nelson N.C., Hammond P.W., Matsuda E., Goud A.A., Becker M.M. Detection of all single-base mismatches in solution by chemiluminescence // Nucleic Acids Res. 1996. -V. 24. - P. 4998-5003.

64. Ellington A.D., Szostak J.W. Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures //Nature. 1992. - V. 355. - P. 850-852.

65. Cairns M.J., King A., Sun L.Q. Nucleic acid mutation analysis using catalytic DNA // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. e9.

66. Долинная Н.Г., Грязнова О .И., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах II. Введение точечных модификаций в сахаро-фосфатный остав ДНК // Биорган. химия. 2006. - V. 12. - Р. 921-928.

67. Lyamichev V., Mast A.L., Hall J.G., Prudent J.R., Kaiser M.W., Takova Т., Kwiatkowski R.W., Sander TJ., de A.M., Arco D.A., Neri B.P., Brow M.A.

68. Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes //Nat. Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 292-296.

69. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique// Science. 1988. - V. 241. - P. 1077-1080.

70. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)-amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 560-569.

71. Pastinen Т., Kurg A., Metspalu A., Peltonen L., Syvanen А.С. Minisequencing: а specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays // Genome Res. — 1997. V. 7. - N. 6. - P. 606-614.

72. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. - V. 74. - P. 5463-5467.

73. Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dodd C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B., Hood L.E. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis // Nature. 1986. - V. 321. - P. 674-679.

74. Yamakawa H., Ohara O. A DNA cycle sequencing reaction that minimizes compressions on automated fluorescent sequencers // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 13111312.

75. Mitra R.D., Shendure J., Olejnik J., Edyta K.O., Church G.M. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies // Anal. Biochem. 2003. - V. 320. - P. 55-65.

76. Seo T.S., Bai X., Kim D.H., Meng Q., Shi S., Ruparel H., Li Z., Turro N.J., Ju J. Four-color DNA sequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescent nucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. - V. 102. - P. 5926-5931.

77. Ansorge W.J. Next-generation DNA sequencing techniques // New Biotechnology. -2009. -V. 25. N. 4. - P. 195-203.

78. Pandey V., Nutter R.C, Prediger E. Applied biosystems SOLiD™ System: ligation-based sequencing // In Next generation genome sequencing: towards personalized medicine, ed. by Janitz M. 2008. - Wiley-VCH. - pp. 282.

79. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. - V. 74. - P. 560-564.

80. Ohara R., Tanaka A., Ohara O. Automated fluorescent DNA sequencing by a simplified solid-phase chemical sequencing method // Biotechniques. 1997. - V. 22. - P. 653656.

81. Isola N.R., Allman S.L., Golovlov V.V., Chen C.H. Chemical cleavage sequencing of DNA using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Anal. Chem. 1999. - V. 71. - P. 2266-2269.

82. Eigen M., Rigler R. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. - V. 91. - P. 5740-5747.

83. Nie S., Emory S.R. Probing Single Molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering // Science. 1997. - V. 275. - P. 1102-110.

84. Landegren U., Nilsson M., Kwok P.Y. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis // Genome Res. 1998. - V. 8. - P. 769-776.

85. Lipson D., Raz T., Kieu A., Jones D.R., Giladi E., Thayer E., Thompson J.F., Le-tovsky S., Milos P., Causey M. Quantification of the yeast transcriptome by single-molecule sequencing // Nat. Biotechnol. 2009. - V. 27. - P. 652-658.

86. Heidenreich O., Sczakiel G. Oligonucleotides. In: Encyclopedia of molecular cell biology and molecular medicine, 2nd edition // Ed. By Meyers R.A. Wiley-VCH. - 2005. -V. 9.-P. 413-433.

87. Brucale M., Zuccheri G., Samori B. Mastering the complexity of DNA nanostmctures // Trends Biotechnol. 2006. - V. 24. -N. 5. - P. 235-243.

88. Rothemund P.W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns // Nature. -2006. V. 440. - N. 7082. - P. 297-302.

89. Gray D:M., Tinoco I. Jr. A new approach to the study of sequence-dependent properties of polynucleotides // Biopolymers. 1970. - V. 9. - P. 223-244.

90. Breslauer K.J., Frank R., Dlocker H., Marky L.A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. - V. 83. - P. 3746-3750.

91. Ponnuswamy P.K., Gromiha M.M. On the conformational stability of oligonucleotide duplexes and tRNA molecules // J. Tlieor. Biol. 1994. - V. 169. - P. 419-432.

92. Sundaralingam M., Ponnuswamy P.K. Stability of DNA duplexes with Watson-Crick base pairs: a predicted model // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 16467-16476.

93. Owczarzy R., You Y., Moreira B.G., Manthey J.A., Huang L., Behlke M.A., Walder J.A. Effects of sodium ions on DNA duplex oligomers: improved predictions of melting temperatures // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 3537-3554.

94. Tan Z.J., Chen S.J. Nucleic acid helix stability: effects of salt concentration, cation valence and size, and chain length // Biophys. J. 2006. - V. 90. - P. 1175-1190.

95. SantaLucia J. Jr. A unified view of polymer, dumbbell and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. - V. 95. - P. 14601465.

96. McTigue P.M., Peterson R.J., Kahn J.D. Sequence-dependent thermodynamic parameters for locked nucleic acid (LNA)-DNA duplex formation // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 5388-405.

97. Shabih. S., Sajjad К., Arif A. Peptide nucleic acid (PNA) a review // J. Chem. Tech. & Biotech. - 2008. - V. 81. - P. 892-899.

98. Ahlborn C., Siegmund K., Richert C. Isostable DNA // J. Am. Chem. Soc. 2007. - V. 129.-P. 15218-15232.

99. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот // М.: Мир. -1987.

100. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия // М.: Мир. 1984. - Т. I, 2, 3.

101. Luo R., Gilson H.S., Potter M.J., Gilson M.K. The physical basis of nucleic acid base stacking in water// Biophys. J. 2001. - V. 80- P. 140-148.

102. Crothers D.M., Zimm B.H. Theory of the melting transition of synthetic polynucleotides: evaluation of the stacking free energy // J. Мої. Biol. 1964. - V. 9. - P. 1-9.

103. Calladine C.R. Mechanics of sequence-dependent stacking of bases in B-DNA. // J. Мої. Biol. 1982.-V. 161.-P. 343-352.

104. Manyanga F., Home M.T., Brewood G.P., Fish D.J., Dickman R., Benight A.S. Origins of the "nucleation" free energy in the hybridization thermodynamics of short duplex DNA // J. Phys. Chem. 2009. - V. 113. - P. 2556-2563.

105. Breslauer K.J. Metods for obtaining thermodynamic data on oligonucleotide transition // In: Thermodynamic data for biochemistry and biotechnology. Chapter 15. Ed. Hinz H.-J. 1986:-P. 402-427.

106. Privalov P.L., Ptitsyn O.B., and Birshtein T.M. Determination of stability of the DNA double helix in an aqueous medium // Biopolymers. 1969. - V. 8,- - P. 559 -571.

107. Rouzina I., Bloomfield Y.A. Heat capacity effects on the melting of DNA. 1. General aspects // Biophys. J. 1999. - V. 77. - P. 3242-3251.

108. Jelesarov I, Bosshard HR. Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition // J. Мої. Recognit. 1999. - V. 12. - P. 3-18.

109. Owczarzy R. Melting temperatures of nucleic acids: discrepancies in analysis // Biophys. Chem. 2005: - V. 117. - P. 207-215.

110. Tikhomirova A., Taulier N., Chalikian T.V. Energetics of nucleic acid stability: the effect of DeltaCP. //J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126. - P. 16387-16394.

111. Rouzina I., Bloomfield V.A. Heat capacity effects on the melting of DNA. 2. Analysis of nearest-neighbor base pair effects // Biophys J. 1999. - V. 77. - P. 3252-3255.

112. Wu P., Nakano S., Sugimoto N. Temperature dependence of thermodynamic properties for DNA/DNA and RNA/DNA duplex formation // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. -P. 2821-2830.

113. Petersheim M , Turner D.H. Base-stacking and base-pairing contributions to helix stability: thermodynamics of double-helix formation with CCGG, CCGGp, CCGGAp, ACCGGp, CCGGUp, and ACCGGUp // Biochemistry. 1983. - V. 22. - P. 256-263.

114. Patel D.J., Hilbers C.W. Proton nuclear magnetic resonance investigations of fraying in double-stranded d-ApTpGpCpApT in H20 solution // Biochemistry. 1975. - V. 14. - P. 2651-2656.

115. Petruska J., Goodman M.F., Boosalis M.S., Sowers L.C., Cheong C., Tinoco I. Jr. Comparison between DNA melting thermodynamics and DNA polymerase fidelity // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. - V. 85. - P. 6252-6256.

116. Liu L., Guo Q.X. Isokinetic relationship, isoequilibrium relationship, and enthalpy-entropy compensation // Chem. Rev. 2001. - V. 101. - P. 673-695.

117. Lumry R. Uses of enthalpy-entropy compensation in protein research // Biophys. Chem. 2003. - V. 105. - P. 545-557.

118. Breslauer K.J., Remeta D.P., Chou W.Y., Ferrante R., Curry J., Zaunczkowski D., Snyder J.G., Marky L.A. Enthalpy-entropy compensations in drug-DNA binding studies // Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A. 1987. - V. 84. - P. 8922-8926.

119. Cornish-Bowden A. Enthalpy-entropy compensation: a phantom phenomenon // J. Biosci. 2002. - V. 27. - P. 121-126.

120. Petruska J., Goodman M.F. Enthalpy-entropy compensation in DNA melting thermodynamics // J. Biol Chem. 1995. - V. 270. - P. 746-750.

121. Sharp K. Entropy-enthalpy compensation: fact or artifact? // Protein Sci. 2001. - V. 10.-P. 661-667.

122. Starikov E.B., Norden B. Enthalpy-entropy compensation: a phantom or something useful? // Phys. Chem. B. 2007. - V. 111. - P. 14431-14435.

123. Гамет JI. Основы физической органической химии. Скорости, равновесия и механизмы реакций // Москва: «Мир» 1972. - 534 с.

124. Gromiha М.М. Structure based sequence dependent stiffness scale for trinucleotides: a direct method // J. Biol. Phys. 2000. - V. 26. - P. 43-50.

125. Gray D.M. Derivation of nearest-neighbor properties from data on nucleic acid oligomers. I. Simple sets of independent sequences and the influence of absent nearest neighbors // Biopolymers. 1997. - V. 42. - P. 783-793.

126. Gray D.M. Derivation of nearest-neighbor properties from data on nucleic acid oligomers. II. Thermodynamic parameters of DNA:RNA hybrids and DNA duplexes // Biopolymers. 1997. - V. 42. - P. 795-810.

127. Vologodskii A.V., Amirikyan B.R., Lyubchenko Y.L., Frank-Kamenetskii M.D. Allowance for heterogeneous stacking in the DNA helix-coil transition theory // J. Biomol. Struct. Dyn. — 1984.-V. 2.-P. 131-148.

128. Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Thermodynamics and NMR of internal GT mismatches in DNA//Biochemistry. 1997.-V 36.-P. 10581-10594.

129. Freier S.M., Kierzek R., Jaeger J.A., Sugimoto N., Caruthers M.H., Neilson Т., Turner D.H. Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. - V. 83. - P. 9373-9377.

130. Sugimoto N., Nakano S., Yoneyama M., Honda K. Improved thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of DNA duplexes. // Nucleic Acids Res. -1996. -V. 24.-P. 4501-4505.

131. Gray D.M., Hamilton F.D., Vaughan M.R. The analysis of circular dichroism spectra of natural DNAs using spectral components from synthetic DNAs //Biopolymers. 1978. -V. 17.-P. 85-106.

132. Goldstein R.F., Benight A.S. How many numbers are required to specify sequence-dependent properties of polynucleotides // Biopolymers. 1992. - V. 32. - P. 1679-1693.

133. Owczarzy R., Vallone P.M., Gallo F.J., Paner T.M., Lane M.J., Benight A.S. Predicting sequence-dependent melting stability of short duplex DNA oligomers // Biopolymers. -1997. -V. 44.-P. 217-239.

134. Nakano S., Kanzaki Т., Sugimoto N. Influences of ribonucleotide on a duplex conformation and its thermal stability: study with the chimeric RNA-DNA strands // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126. - P. 1088-1095.

135. Doktycz M.J., Morris M.D., Dormady S.J., Beattie K.L., Jacobson K.B. Optical melting of 128 octamer DNA duplexes. Effects of base pair location and nearest neighbors on thermal stability. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 8439-8445.

136. Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Thermodynamics of internal CT mismatches in DNA // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 2694-2701.

137. Peyret N., Seneviratne P.A., Allawi H.T., SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal AA, CC, GG, and TT mismatches // Biochemistry. 1999. - V. 38. - P. 3468-3477.

138. Santa-Lucia J. Jr., Peyret N. Method and system for predicting nucleic acid hybridization thermodynamics ans computer-readeble storage medium for use therein // US Patent application publication. № US 2003/0224357 Al. Pub. Date: Dec. 4. 2003.

139. Bommarito S., Peyret N., SantaLucia J. Jr. Thermodynamic parameters for DNA sequences with dangling ends // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 1929-1934.

140. Tanaka F., Kameda A., Yamamoto M., Ohuchi A. Thermodynamic parameters based on a nearest-neighbor model for DNA sequences with a single-bulge loop // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 7143-7150.

141. Peyret N. Prediction of nucleic acid hybridization: parameters and algorithms // Ph.D. Thesis. Wayne State University. Detroit. - MI. 2000.

142. Watkins N.E. Jr, SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of deoxyinosine pairs in DNA duplexes // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - P. 6258-6267.

143. Martin F.H., Castro M.M., Aboul-ela F., Tinoco I. Jr. Base pairing involving deoxyinosine: implications for probe design // Nucleic Acids Res. 1985. - V. 13. - P. 89278938.

144. Kozerski L., Mazurek A.P., Kawecki R., Bocian W., Krajewski P., Bednarek E., Sit-kowski J., Williamson M.P., Moir A.J., Hansen P.E. A nicked duplex decamer DNA with a PEG(6) tether //Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 1132-1143.

145. Kalnik M.W., Chang C.N., Grollman A.P., Patel D.J. NMR studies of abasic site* £ DNA duplexes: deoxyadenosine stacks into the helix opposite the cyclic analogue ot deoxyribose // Biochemistry. 1988. - V. 27. - P. 24-31.

146. Ke S.H., Wartell R.M. Influence of neighboring base pairs on the stabilityofbase bulges and base pairs in a DNA fragment // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P- 459 " 4600.f-tig

147. Wang Y.H., Griffith J. Effects of bulge composition and flanking sequence o5J kinking of DNA by bulged bases // Biochemistry. 1991. - V. 30. - P. 1358-1363.

148. Feig M., Zacharias M., Pettitt B.M. Conformations of an adenine bulge in a DX^^ tamer and its influence on DNA structure from molecular dynamics simulations // Bi°P ^ J.-2001,-V. 81.-P. 352-370.

149. Bourde'lat-Parks B.N., Wartell R.M. Thermodynamic stability of DNA tandei** mlS" matches // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 9918-9925.

150. Ke S.-H., Wartell R.M. The thermal stability of DNA fragments with tandem я*1®" matches at a d(CXYG>d(CY4X4G) site // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P- 7° 712.

151. Chou S.-H., Chin K.-H., Wang A. H.-J. Unusual DNA duplex and hairpin motifs // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 2461-2474.

152. Rumney S. IV, Kool E.T. Structural optimization of non-nucleotide loop replace!*161118 for duplex and triplex DNAs //J. Am. Chem. Soc. 1995. - V. 117. - P. 5635-5646.

153. Gao H., Chidambaram N„ Chen B.C., Pelham D.E., Patel R., Yang M., Zhou L., A., Cohen J.S. Double-stranded cyclic oligonucleotides with non-nucleotide Bioconjug. Chem. 1994. - V. 5. - P. 445-453.

154. Geci I., Filichev V.V., Pedersen E.B. Synthesis of twisted intercalating nucleic possessing acridine derivatives. Thermal stability studies // Bioconjug.Chem. 200f5-17.-P. 950-957.of

155. Boczkowska M., Guga P., Stec W.J. Stereodefined phosphorothioate analogu-^®^ . DNA: relative thermodynamic stability of the model PS-DNA/DNA and PS-DNA/^^ complexes // Biochemistry. 2002. - V. 41. - РГ 12483-12487.

156. Xu Y., Kino K., Sugiyama H. The conformational study of two carbocyclic sides: why carbocyclic nucleic acids (CarNAs) form more stable duplexes with RNA-DNA does // J. Biomol. Struct. Dyn. 2002. - V. 20. - P. 437-446.

157. Schlegel M.K., Peritz A.E., Kittigowittana K., Zhang L., Meggers E. Duplex foX^*3*^ tion of the simplified nucleic acid GNA // Chembiochem. 2007. - V. 8. - P. 927-932.

158. Arghavani M.B., SantaLucia J. Jr., Romano L.J. Effect of mismatched complemer^^-^^. strands and 5-change in sequence context on the thermodynamics and structur^^ benzoa.pyrene-modified oligonucleotides // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. ' 8583.

159. Takiya T., Seto Y., Yasuda H., Suzuki T., Kawai K. An empirical approach for thermal stability (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). -2004. V. 48. - P. 131-132.

160. Giesen U., Kleider W., Berding C., Geiger A., Oram H., Nielsen P.E. A formula for thermal stability (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 5004-5006.

161. Almarsson O., Bruice T.C. Peptide nucleic acid (PNA) conformation and polymorphism in PNA-DNA and PNA-RNA hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. - V. 90. - P. 9542-9546.

162. Amrane S., Mergny J.L. Length and pH-dependent energetics of (CCG)n and (CGG)n trinucleotide repeats // Biochimie. 2006. - V. 88. - P. 1125-1134.

163. Williams M.C., Wenner J.R., Rouzina I., Bloomfield V.A. Effect of pH on the overstretching transition of double-stranded DNA: evidence of force-induced DNA melting // Biophys. J. 2001. - V. 80. - P. 874-881.

164. Brown T., Leonard G.A., Booth E.D. Influence of pH on .the conformation andiStabil-ity of mismatch base-pairs in DNA // J. Мої: Biol. 1990. - V. 212. - P. 437-440.

165. Piskur J., Rupprecht A. Aggregated DNA in ethanol solution // FEBS Lett. 1995. - V. 375.-P. 174-178.

166. Spink C.H., Chaires J.B. Effects of hydration, ion release, and excluded volume on the melting of triplex and duplex DNA // Biochemistry. 1999. - V. 38: - P. 496-508. •

167. Tarahovsky Y.S., Rakhmanova V.A., Epand R.M., MacDonald R.C. High temperature stabilization of DNA in complexes with cationic lipids // Biophys. J. 2002. - V. 82. - P. 264-273.

168. Evstigneev M.P., Mykhina Y.V., Davies D.B. Complexation of daunomycin* with a DNA oligomer in the presence of an aromatic vitamin (B2) determined'by NMR spectroscopy // Biophys. Chem. 2005. - V. 118. - P. 118-127.

169. Nakano S., Karimata H., Ohmichi T., Kawakami J., Sugimoto N. The effect of molecular crowding with nucleotide length and cosolute structure on DNA duplex stability // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126. - P. 14330-14331.

170. Gu X.B., Nakano S., Sugimoto N. The effect of the structure of cosolutes on the DNA duplex formation//Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2006. - V. 50. - P. 205-206.

171. De Xammar Oro J.R., Grigera J.R. On the thermal stability of DNA in solution of mixed solvents // J. Biol. Phys. 1995. - V. 21. - P. 151-154.

172. Hutton J.R. Renaturation kinetics and thermal stability of DNA in aqueous solutions of formamide and urea // Nucleic Acids Res. 1977. - V. 4. - P. 3537-3555.

173. Blake R.D., Delcourt S.G. Thermodynamic effects of formamide on DNA stability // Nucleic Acids Research. 1996. - V. 24. - P. 2095-2103.

174. Anastassopoulou J. Metal-DNA interactions // J. Mol. Structure. 2003. - V. 651. - P. 19-26.

175. Nakano S., Fujimoto M., Нага H., Sugimoto N. Nucleic acid duplex stability: influence of base composition on cation effects // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 29572965.

176. Korolev N., Lyubartsev A.P., Nordenskiold L. Application of polyelectrolyte theories for analysis of DNA melting in the presence ofNa+ and Mg2+ ions // Biophys. J. 1998. -V. 75.-P. 3041-3056.

177. Doktycz M.J. Nucleic Acids: thermal stability and denaturation. Encyclopedia of life // Sciences. 2002. - Oak Ridge.

178. Франк-Каменецкий М.Д. Рассмотрение перехода спираль-клубок в гомополиме-рах методом наиболее вероятного распределения // Молекулярн. биол. 1968. - Т. 2. -С. 408-419.

179. Ландо Д.Ю., Иванова М.А., Ахрем А.А. Влияние изменения стехиометрии комплекса ДНК-лиганд при тепловой денатурации ДНК на параметры перехода спираль-клубок // Молекулярн. биол. 1980. - Т. 14. - С. 1281-1288.

180. Сорокин В.А., Гладченко Г.О., Галкин В.Л., Волчок И.В., Благой Ю.П. Теории «конденсации» и «скрепок» при описании перехода спираль-клубок ДНК: сравнительный анализ // Биофизика. 1996. - Т. 41. - С. 1214-1220.

181. Ахрем А.А., Ландо Д.Ю., Крот В.И. Исследование плавления нуклеопротеидов 1. Теория перехода спираль-клубок ДНК в присутствии белков с кооперативным характером взаимодействия при обратимом связывании // Молекулярн. биол. 1976. -Т. 10.-С. 1332-1340.

182. Ахрем А.А., Ландо Д.Ю. Влияние лигандов с избирательным характером взаимодействия на переход спираль-клубок ДНК // Молекулярн. биол. 1979. - Т. 13. - С. 1098-1108.

183. Owczarzy R., Dunietz I., Behlke M.A., Klotz I.M., Walder J.A. Thermodynamic treatment of oligonucleotide duplex-simplex equilibria // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2003.-V. 100.-P. 14840-14845.

184. Frank-Kamenetskii M.D., Lukashin A.V., Anshelevich V.V. Application of polyelectrolyte theory to the study of the B-Z transition in DNA // J. Biomol. Struct. Dyn. 1985. -V. 3. - P. 35- 42.

185. Korolev N., Lyubartsev A.P., Rupprecht A., Nordenskiold L. Competitive binding of Mg(2+), Ca(2+), Na(+), and K(+) ions to DNA in oriented DNA fibers: experimental and Monte Carlo-simulation results // Biophys. J. 1999. - V. 77. - P. 2736-2749.

186. Feig M., Pettitt B.M. Sodium and chlorine ions as part of the DNA solvation shell // Biophys. J. 1999. - V. 77. - P. 1769-1781.

187. Korolev N., Lyubartsev A.P., Laaksonen A., Nordenskiold L. A molecular dynamics simulation study of polyamine- and sodium-DNA. Interplay between polyamine binding and DNA structure // Eur. Biophys J. 2004. - V. 33. - P. 671-682.

188. Manning G.S. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic properties of polynucleotides // Q. Rev. Biophys. 1978. - V. 11. — P. 179246.т¡сок литературы

189. Франк-Каменецкий М.Д., Аншелевич В.В., Лукашин A.B. Полиэлектролитная модель ДНК // УФН. 1987. - Т. 151. - С. 595-618.

190. Wilson R.W., Rau D.C., Bloomfield V.A. Comparison of polyelectrolyte theories of the binding of cations to DNA // Biophys. J. 1980. - V. 30. - P. 317-325.

191. Stigter D. Evaluation,of the counterion condensation theory of polyelectrolytes // Biophys. J. 1995. - V. 69. - P. 380-388.

192. Rouzina I., Bloomfield V.A. Competitive electrostatic binding of charged ligands to polyelectrolytes: practical approach using the non-linear Poisson-Boltzmann equation // Biophys. Chem. 1997. - V. 64. - P. 139-155.

193. Kankia B.I., Buckin V., Bloomfield V.A. Hexamminecobalt(III)-induced condensation of calf thymus DNA: circular dichroism and hydration measurements // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 2795-2801.

194. Schildkraut С., Lifson S. Dependence of the melting temperature of DNA on salt concentration // Biopolymers. 1965. - V. 3. - P. 195-208.

195. Wetmur J.G. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization // Crit. ReV. Biochem. Mol. Biol. 1991. - V. 26. - P. 227-259.

196. Frank-Kamenetskii M.D. Simplification of the empirical relationship between melting temperature of DNA, its GC content and concentration of sodium ions in solution // Biopolymers. 1971. - V.10. - P. 2623-2624.

197. Marmur J., Doty P.' Determination of the base composition-of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature // J. Mol. Biol. 1962. - V. 5. - P. 109-118.

198. SantaLucia J. Jr., Allawi H.T., Seneviratne P.A. Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability. // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 3555-3562.

199. Mitsuhashi M. Technical Report: Part 1. Basic requirements for designing-optimal oligonucleotide probe sequences // J. Clin. Lab. Anal. 1996. - V. 10. - P. 277-284.

200. Tan Z.J., Chen S.J. RNA helix stability in mixed Na7Mg2f solution // Biophys. J. -2007.-V. 92.-P. 3615-3632.

201. Stein V.M., Bond J.P., Capp M.W., Anderson C.F., Record M.T. Jr. Importance of coulombic end effects on cation accumulation near oligoelectrolyte B-DNA: a demonstration using 23Na NMR // Biophys. J. 1995. - V. 68. - P. 1063-1072.

202. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J. C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) // Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 2503-2516.

203. Huang M.M., Arnheim N., Goodman M.F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR // Nucleic Acids Res. 1992. - V. 20. - P. 4567—4573.

204. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991. -V. 88.-P. 189-193.

205. Liu Q., Thorland E.C., Heit J.A., Sommer S.S. Overlapping PCR for bidirectional PCR amplification of specific alleles: a rapid one-tube method for simultaneously differentiating homozygotes and heterozygotes // Genome Res. 1997. - V. 7. - P. 389-398.

206. Chen X., Zehnbauer В., Gnirke A., Kwok P.Y. Fluorescence energy transfer detection-as a homogeneous DNA'diagnostic method // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. - V. 94.-P. 10756-10761.

207. Deng J.Y., Zhang XE„ Mang Y., Zhang Z.P., Zhou Y.F., Liu.Q., Lu H.B., Fu Z.J. Oligonucleotide ligation assay-based DNA chip for multiplex detection of single nucleotide polymorphism// Biosens. Bioelectron. 2004. - V. 19. - P. 1277-1283.

208. Girigoswami A., Jung C., Mun H.Y., Park H.G. PCR-free mutation detection of BRCA1 on a zip-code microarray using ligase chain reaction // J. Biochem. Biophys. Methods. 2008. - V. 70. - P. 897-902.

209. Abravaya K., Carrino J.J., Muldoon S., Lee H-.H. Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR) // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 675682.

210. Ayyadevara S., Thaden A.A., Reis R.J.S. Discrimination of primer З'-nucleotide mismatch by Taq DNA polymerase during polymerase chain reaction // Anal. Biochem. -2000.-V. 284.-P. 11-18.

211. Thweatt R., Goldstein S., Reis R.J.S. A universal primer mixture for sequence determination at the 3' ends of cDNAs // Anal. Biochem. 1990. - V. 190: - P. 314-316.

212. Suss В., Flekna G., Wagner M., Hein I. Studying the effect of single mismatches in primer and probe binding regions on amplification curves and quantification in real-time PCR//J. Microbiol. Methods. 2009. - V. 76. - P. 316-319.

213. Liang P., Pardee B.A. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction // Science. 1992. - V. 257. — P. 967-971.

214. Christopherson C., Sninsky J., Kwok S. The effects of internal primer-template mismatches on RT-PCR: HIV-1 model studies // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 654658.1. C'mivoK jiimepciinypi'1

215. Bra D., Martin-Laurent F., Philippot L. Quantification of the detrimental effect of a single primer-template mismatch by real-time PCR using the 16S rRNA gene as an example // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - V. 74. - P. 1660-1663.

216. Day J.P., Bergstrom D., Hammer R.P., Barany F. Nucleotide analogs facilitate base conversion with 3' mismatch primers // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 1810-1818.

217. Mendelman L.V., Petruska J., Goodman M.F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase alpha and reverse transcriptase // J. Biol. Chem. 1990. - V-265. - P. 2338-2346.

218. Tong J., Cao W., Barany F. Biochemical properties of a high fidelity DNA ligase from Thermus species AK16D // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 788-794.

219. Pritchard C.E., Southern E.M. Effects of base mismatches on joining of short oligode-oxynucleotides by DNA ligases //Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3403-3407.

220. Housby J.N., Southern E.M. Fidelity of DNA ligation: a novel experimental approach based on the polymerisation of libraries of oligonucleotides //Nucleic Acids Res. 1998. -V. 26. - P. 4259-4266.

221. James K.D., Boles A.R., Henckel D., Ellington A.D. The fidelity of template-directed oligonucleotide ligation and its relevance to DNA computation // Nucleic Acids Res. -1998.-V. 26.-P. 5203-5211.

222. Sriskanda V., Shuman S. Specificity and fidelity of strand joining by Chlorella virus DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 3536-3541.

223. Luo J., Bergstrom D.E., Barany F. Improving the fidelity of Thermus thermophihts DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 3071-3078.

224. Nakatani M., Ezaki S., Atomi H., Imanaka T. Substrate recognition and fidelity of strand joining by an archaeal DNA ligase // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - P. 650— 656:

225. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. - V. 76. - P. 245-254.

226. Bhagwat A.S., Sanderson R.J., Lindahl T.S. Delayed DNA joining at 3'-mismatches by human DNA ligases // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 4028^033.

227. Shuman S. Vaccinia vims DNA ligase: specificity, fidelity, and inhibition // Biochemistry. 1995. -V. 34.-P. 16138-16147.

228. Alexander R.C., Johnson A.K., Thorpe J.A., Gevedon T., Testa S.M. Canonical nucleosides can be utilized by T4 DNA ligase as universal template bases at ligation junctions // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 3208-3216.

229. Aoi Y., Yoshinobu T., Tanizawa K., Kinoshita K., Iwasaki H. Ligation errors in DNA computing // BioSystems. 1999. - V. 52. - P. 181-187.

230. Steitz T.A. Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA- // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. - V. 3. - P. 31-38.

231. Delarue M., Poch O., Tordo N., Moras D., Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases // Protein Eng. 1990. - V. 3. - P. 461-467.

232. Loh E., Loeb L.A. Mutability of DNA polymerase I: implications for the creation of mutant DNA polymerases // DNA Repair. 2005. - V. 4. - P. 1390-1398.

233. Strerath M., Gloeckner C., Liu D., Schnur A., Marx A. Directed DNA polymerase evolution: effects of mutations in motif C on the mismatch-extension selectivity of therm.u-S aquaticus DNA polymerase // Chembiochem. 2007. - V. 8. - P. 395-401.4.2*5

234. Kim Y, Eom SH, Wang J, Lee D, Suh SW, Steitz ТА. Crystal Structure of Thermus aquaticus DNA polymerase //Nature. V. 376. - P. 612-616.

235. Subramanya H.S., Doherty A.J., Ashford S.R., Wigley D.B. Crystal structure of an ATP-dependent DNA ligase from bacteriophage T7 // Cell. 1996. - V. 85. - P. 607-615.

236. Doherty A.J., Suh S.W. Structural and mechanistic conservation in DNA ligases // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 4051-4058.

237. Shuman S. Closing the gap on DNA ligase // Structure. 1996. - V. 4. - P. 653-656.

238. Martin I.A., MacNeill S.A. ATP-dependent DNA ligases // Genome Biol. 2002. - V. 3.-P. 1-7.

239. Pascal J.M., O'Brien P.J., Tomkinson A.E., Ellenberger T. Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA // Nature. 2004. - V. 4321 - P. 473478.

240. Cherepanov A.V., de Vries S. Dynamic mechanism of nick recognition by DNA ligase // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. -N. 24. - P. 5993-5999.

241. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellenberger T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution // Nature. 1998. - V. 391.-P. 251-258.

242. Franklin M.C., Wang J., Steitz T.A. Structure of the replicating complex of a pol alpha family DNA polymerase // Cell. 2001. - V. 105. - P. 657-667.

243. Kiefer J.R., Mao C., Braman J.C., Beese L.S. Visualizing DNA replication in a cata-lytically active Bacillus DNA polymerase crystal // Nature. 1998. - V. 391. - P. 304-307.

244. Drew H.R., Wing R.M., Takano T., Broka C., Tanaka S., Itakura K., Dickerson R.E. Structure of a B-DNA dodecamer: conformation and dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. - V. 78. - P. 2179-2183.

245. Odell M., Sriskanda V., Shuman S., Nikolov D.B. Crystal structure of eukaryotic DNA ligase-adenylate illuminates the mechanism of nick sensing and strand joining // Мої. Cell. 2000. - V. 6. - P. 1183-1193.

246. Johnson A., O'Donnell M. DNA ligase: getting a grip to seal the deal // Curr. Biol. -2005. V. 15. - P. R90-R92.

247. Nandakumar J., Nair P.A., Shuman S. Last stop on the road to repair: structure of E. coli DNA ligase bound to nicked DNA-adenylate // Мої. Cell. 2007. - V. 26. - P. 257271.

248. Nair P.A., Nandakumar J., Smith P., Odell M., Lima C.D., Shuman S. Structural basis for nick recognition by a minimal.pluripotent DNA ligase // Nat. Struct. Мої. Biol. 2007. - V. 14. - P. 770-778.

249. Lu X.J., Shakked Z., Olson W.K. A-form conformational motifs in ligand-bound DNA structures // J. Мої. Biol. 2000. - V. 300. - P. 819-840.

250. Seeman N.C., Rosenberg J.M., Rich A. Sequence-specific recognition of double helical nucleic acids by proteins // Proc. Natl. Acad .Sci. U. S. A. 1976. - V. 73. - P. 804808.

251. Kirnkel T.A., Bebenek K. DNA replication fidelity // Annu. Rev. Biochem. 2000. -V. 69. - P. 497-529.1. С 'писок.штературь/

252. Eom S.H., Wang J., Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site // Nature. 1996. - V. 382. - P. 278-281.

253. Hendrickson C.L., Devine K.G., Benner S.A. Probing minor groove recognition contacts by DNA polymerases and reverse transcriptases using 3-deaza-2'-deoxyadenosine // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - N. 7. - P. 2241-2250.

254. Polesky A.H., Steitz T.A., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Identification of residues critical for the polymerase activity of the Klenow fragment of DNA polymerase I from Escherichia coli//J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. -N. 24. - P. 14579-14591.

255. Polesky A.H., Dahlberg M.E., Benkovic S.J., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Side chains involved in catalysis of the polymerase reaction of DNA polymerase I from Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - N. 12. - P. 8417-8428.

256. Braithwaite D.K., Ito J. Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymerases // Nucleic Acids Res. 1993: - V. 21. - N. 4. - P. 787-802.

257. Doherty A.J., Dafforn T.R. Nick recognition-by DNA ligases // J. Mol Biol. 2000. -V. 296. - P. 43-56.

258. Odell M., Shuman S. Footprinting of Chlorella vims DNA ligase bound at a nick in duplex DNA. // J. Biol. Chem: 1999. - V. 274. - P. 14032-14039.

259. Ng P., Bergstrom D.E. Protein-DNA footprinting by endcapped duplex oligodeoxyri-bonucleotides // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P! el07.

260. Wang L.K., Nair P.A., Shuman S. Stnicture-guided mutational analysis of the OB, HhH, and BRCT domains of Escherichia coli DNA ligase // J. Biol. Chem. 2008. - V. 283.-P. 23343-23352.

261. Wang L.K., Zhu H., Shuman S. Structure-guided Mutational Analysis of the Nucleotidyltransferase Domain of Escherichia coli DNA Ligase (LigA) // J. Biol. Chem. 2009. -V. 284. - P. 8486-8494.

262. Doherty A.J., Serpell L.C., Ponting C.P. The helix-hairpin-helix DNA-binding motif: a structural basis for non-sequence-specific recognition of DNA // Nucleic Acids Res. -1996. V. 24. - P. 2488-2497.

263. Shao X., Grishin N.V. Common fold in helix-hairpin-helix proteins // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 2643-2650.

264. Liu P., Burdzy A., Sowers L.C. DNA ligases ensure fidelity by interrogating minor groove contacts // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 4503-4511.

265. Morales J.C., Kool E.T. Functional hydrogen-bonding map of the minor groove binding tracks of six DNA polymerases // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 12979-12988.1. Список :штс}нчпуры

266. Thompson Е.Н., Bailey M.F., van der Schans E.J., Joyce C.M., Millar D.P. Determinants of DNA mismatch recognition within the polymerase domain of the KlenoW fra8" ment//Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 713-722.

267. Summerer D., Rudinger N.Z., Detmer I., Marx A. Enhanced fidelity in mismatch extension by DNA polymerase through directed combinatorial enzyme design // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2005. - V. 44. - P. 4712-4715.

268. Feng H. Mutational analysis of bacterial NAD+-dependent DNA ligase: role of motif1. in ligation catalysis // Acta Biochim. Biophys. Sin. 2007. - V. 39. - P. 608-616.

269. Feng H., Parker J.M., Lu J., Cao W. Effects of deletion and site-directed mutations on ligation steps of NAD+-dependent DNA ligase: a biochemical analysis of BRCAl C-terminal domain // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P; 12648-12659.

270. Cha R.S., Zarbl H., Keohavong P., Thilly W.G. Mismatch amplification mutation-assay (MAMA): application to the c-H-ras gene // PGR Methods Appl. 1992. - V. 2- -14-20.

271. Rust S., Funke H., Assmann G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a liighly specific one step procedure for easy mutation detection // Nucleic Acids Res. 1993. - v • 21. - P. 3623-3629.

272. Зыкова E.C., Патрушев Л.И., Каюшин, А.Л., Коростелева, М.Д., МирошНиКОВ' А.И., Бокарев, И.Н., Леонтьев, С.Г., Кошкин, В.М., Северин, Е.С. Новые аллель-сиецифические ираймеры для обнаружения мутации Leiden в экзоне 10 гена фактора

273. V при тромбофилиях // Биоорган, химия. 1997. - Т. 23. - С. 205-210.

274. Nielsen P.E. Peptide nucleic acid: a versatile tool in genetic diagnostics andmolecularbiology // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. - V. 12. - P. 16-20.

275. Oram H., Jakobsen M.H., Koch Т., Vuust J., Borre M.B. Detection of the faotor V Leiden mutation by direct allele-specific hybridization of PCR amplicons to photoirttr*10'31-lized locked nucleic acids // Clin. Chem. 1999. - V. 45. - P. 1898-1905.

276. Nguyen H.K., Fournier O., Asseline U., Dupret D., Thuong N.T. Smoothing the thermal stability of DNA duplexes by using modified nucleosides and chaotropic ag^nts Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 1492-1498.

277. Hacia J.G., Woski S.A., Fidanza J., Edgemon K., Hunt N., McGall G., Fodor

278. Collins F.S. Enhanced high density oligonucleotide array-based sequence analysis "usu^s modified nucleoside triphosphates //Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 4975-4S>^2

279. Guo Z., Liu Q., Smith L.M. Enhanced discrimination of single nucleotide pophisms by artificial mismatch hybridization // Nat. Biotechnol. 1997. - V. 15. - F*^ 331335.4.29

280. Zirvi M., Bergstrom D.E., Saurage A.S., Hammer R.P., Barany F. Improved fidelity of thermostable ligases for detection of microsatellite repeat sequences using nucleoside analogs //Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. e41.

281. Latorra D., Campbell K., Wolter A., Hurley J.M. Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) primers // Hum. Mutat. -2003.-V. 22.-P. 79-85.

282. Giusto D.A.D., King G.C. Strong positional preference in the interaction of LNA oligonucleotides with DNA polymerase and-proofreading exonuclease activities: implications for genotyping assays // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. e32.

283. Kennedy B, Arar K., Reja V, Henry R.J. Locked nucleic acids for optimizing displacement probes for quantitative real-time PCR // Anal. Biochem. 2006. - V. 348. - P. 294-299.

284. Ballantyne K.N., van Oorschot R.A.H., Mitchell R.J. Locked nucleic acids in PCR primers increase sensitivity and performance // Genomics. 2008. - V. 91. - P. 301-305.

285. Strand H., Ingebretsen O.C., Nilssen O. Real-time detection and quantification of mitochondrial mutations with oligonucleotide primers containing locked nucleic acid // Clin. Chim. Acta. 2008. - V. 390. - P. 126-133.

286. Koizumi M., Morita K., Takagi M., Yasumo H., Kasuya A. Improvement of single nucleotide polymorphism genotyping by allele-specific PCR using primers modified with an ENA residue // Anal. Biochem. 2005. - V. 340. - P. 287-294.

287. Summerer D., Marx A. Differential minor groove interactions between DNA polymerase and sugar backbone of primer and template strands // J. Am. Chem. Soc. 2002. -V. 124.-P. 910-911.

288. Strerath M., Gaster J., Marx A. Recognition of remote mismatches by DNA polymerases // Chembiochem. 2004. - V. 5. - P. 1585-1588.

289. Strerath M., Gaster J., Summerer D., Marx A. Increased single-nucleotide discrimination of PCR by primer probes bearing hydrophobic 4'C modifications // Chembiochem. -2004. -V. 5. P. 333-339.

290. Kranaster R., Marx A. Increased single-nucleotide discrimination in allele-specific polymerase chain reactions through' primer probes bearing nucleobase and 2'-deoxyribose modifications // Chemistry. 2007. - V. 13. - P. 6115-6122.

291. Zhang J., Li K. Single-base discrimination mediated by proofreading 31-phosphorothioate-modified primers // Mol. Biotechnol. 2003. - V. 25. - P. 223-227.

292. Hu Y.J., Li Z.F., Diamond A.M. Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphism in genotyping by phosphorothioate proofreading allele-specific amplification // Anal. Biochem. 2007. - V. 369. - P. 54-59.

293. Wilson W.D., Ratmeyer L., Zhao M., Strekovski L., Boykin D. The search for structure-specific nucleic acid-interactive drugs: effects of compound structure on RNA versus DNA interaction strength // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 4098-4104.

294. Puri N., Chattopadhyaya J. The physico-chemical properties of 5'-Polyarene tethered. DNA Conjugates and their duplexes with complementary RNA // Nucleosides and-Nucleo-tides. 1999. - V. 18. - P. 2785-2818.

295. Годовикова T.C., Зарытова В.Ф., Халимская Л.М. Реакционноспособные фосфа-миды моно- и динуклеотидов // Биоорган, химия. 1986. - Т. 12. - С. 475-781.

296. Williams A.P., Longfellow C.E., Freier S.M., Kierzek R., Turner D.H. Laser temperature-jump, spectroscopic, and thermodynamic study of salt effects on duplex formation by dGCATGC // Biochemistry. 1989. - V. 28. - 4283-4291.

297. Гурьянова E.H., Гольдштейн И.П., Ромм И.П. Физикохимические свойства ЭДА-комплексов // В кн.: Донорно-акцепторная связь. М. "Химия". — 1973. - С. 94-310.

298. Пожарский А.Ф. Теоретические основы химии гетероциклов / М. "Химия". — 1985. С. 53-102.пт ок .аппаратуры

299. Saraiya A.A., Lamichhane T.N., Chow C.S., SantaLucia J.Jr., Cunningham P.R. Identification and role of functionally important motifs in the 970 loop of Escherichia coli 16S ribosomal RNA // J. Mol. Biol. 2008. - V. 376. - P. 645-657.

300. Komatsu Y., Kanzaki I., Ohtsuka E. Enhanced folding of hairpin ribozymes with replaced domains // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 9815-9820.

301. Lane A., Ebel S., Brown T. Properties of multiple G.A mismatches in stable oligonucleotide duplexes // Eur. J. Biochem. 1994. - V. 220. -P. 717-727.

302. Li Y., Zon G., Wilson W.D: NMR and molecular modeling evidence for a G-A mismatch base pair in a purine-rich DNA duplex // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991. - V. 88. P. 26-30

303. Lane A., Martin S.R., Ebel S., Brown T. Solution conformation of a deoxynucleotide containing tandem G*A mismatched base pairs and 3'-overhanging ends in d(GTGAACTT)2 //Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 12087-12095.

304. Varani G. Exceptionally stable,nucleic acid hairpins // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995;- V. 24. P. 379-404.

305. Goodchild J. Enhancement of ribozyme catalytic activity by a contiguous oligode-oxynucleotide (facilitator) and by 2'-0-methylation // Nucleic Acids Res. 1992. - V. 20. -P. 4607-4612.

306. Parinov S., Barsky V., Yershov G., Kirillov E., Timofeev E., Belgovskiy A., Mirzabe-kov A. DNA sequencing by hybridization to microchip octa- and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 2998-3004.

307. Maldonado-Rodriguez R., Espinosa-Lara M., Loyola-Abitia P., Beattie W.G., Beattie K.L. Mutation detection by stacking hybridization on genosensor arrays // Molecular Biotechnology. 1999. - V. 11. - P. 13-25.

308. Добриков М.И., Гайдамаков C.A., Кошкин A.A., Власов В.В. Фотомодификация ДНК каталитической двухкомпонентной системой олпгонулеотидов, несущих остатки бензантрацена и перфторарилазида //Докл. РАН. 1996. - Т. 351. - С. 687-691.

309. Kieleczawa J., Dunn J.J., Studier F.W. DNA sequencing by primer walking with strings of contiguous hexamers // Science. 1992. - V. 258. - P. 1787-1791.

310. Azhikina T.L., Potapov V.K., Veselovskaia S.V., Miasnikov V.A., Sverdlov E.D. Combinations of short oligonucleotides with increase duplex formation stability as combined primers for sequencing // Dokl. Akad. Nauk. 1993. - V. 6. - P. 751-753.

311. Engler M.J., Richardson C.C. DNA ligases // In: The Enzymes. Ed. Boyer, P. D. -New York: Academic Press. 1982. - V. 15. - P. 3-29.

312. Brams J., Michelson A.M., van Hold K.E. Adenylate oligomers in single- and doublestrand conformation // J. Mol. Biol. 1966. - V. 15. - P. 467-488.

313. Kandimalla E.R., Manning A., Lathan C., Byrn R.A., Agrawal S. Design, biochemical, biophysical and biological properties of cooperative antisense oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 3578-3584.

314. Lane M.J., Paner Т., Kashin I., Faldasz B.D., Li В., Gallo F J., Benight A.S. The thermodynamic advantage of DNA oligonucleotide 'stacking hybridization' reactions: energetics of a DNA nick//Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 611-616.

315. Marky L.A., Breslauer K.J. Calculating thermodynamic data for transitions of any molecularity from equilibrium melting curves // Biopolymers. 1987. - V.26. - P. 16011620.

316. Zhong M., Kallenbach N.R. formation and thermodynamics of DNA "necks". Models for three-arm branch formation in a duplex // J. Mol. Biol. 1993. - V. 230. - P. 766-778.

317. Koval V.V., Lokteva N.A., Karnaukhova S.L., Fedorova O.S. perative binding of oligonucleotides to adjacent sites of single-stranded DNA: sequence composition dependence at the junction // J. Biomol. Struct. Dyn.- 1999. V. 17. - P. 259-265.

318. Walter A.E., Turner D.H., Kim J., Lyttle M.H., Muller P., Mathews D.H., Zuker M. Coaxial stacking of helixes enhances binding of oligoribonucleotides and' improves predictions of RNA folding // Proc. Natl. Acad. U. S. A. 1994. - V. 91. - P. 9218-9222.

319. Norberg J., Nilsson L. Potential of mean force calculations of the stacking-unstacking process in single-stranded deoxyribodinucleoside monophosphates // Biophysical J. — 1995. V. 69. - P. 2277-2285.

320. Guckian K.M., Schweitzer B.A., Ren R.X., Sheils C.J., Tahmassebi D.C., Kool E.T. Factors contributing to aromatic stacking in water: evaluation in the context of DNA // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 2213-2222.

321. Aymami A., Coll M., van der Marel G.A., van Boom J.H., Wang A.H.-J., Rich A. Molecular structure of nicked DNA: a substrate for DNA repair enzymes // Proc. Natl. Sei. U. S. A. 1990. - V. 87. P. 2526-2530.

322. Roll С., Ketterle С., Faibis V., Fazakerley G.V., Boulard Y. Conformations of nicked and gapped DNA structures by NMR and molecular dynamic simulations in water // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 4059-4070.

323. Vasiliskov V.A., Prokopenko D.V., Mirzabekov A.D. Parallel multiplex thermodynamic analysis of coaxial base stacking in DNA duplexes by oligodeoxyribonucleotide microchips // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 2303-2312.

324. Fotin A.V., Drobyshev A.L., Proudnikov D.Y., Perov A.N., Mirzabekov A.D. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips // Nucleic Acids Res. 1998.- V. 26.-P. 1515-1521.

325. Yakovchuk P., Protozanova Е., Frank-Kamenetskii M.D. Base-stacking and base-pairing contributions into thermal stability of the DNA double helix // Nucleic Acids Res. 2006: - V. 34. - P. 564—574.

326. Lyng R., Hard T., Norden В. Induced CD of DNA intercalators: electric dipole allowed transitions // Biopolymers. 1987. - V. 26. - P. 1327-1345.

327. Lyng R., Rodger A., Norden В. The CD of ligand-DNA systems. 2. Poly(dA-dT) B-DNA// Biopolymers. 1992. - V. 32. - P. 1201-1214.

328. Cantor C.R., Warshaw M.M., Shapiro H. Oligonucleotide interactions. III. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligonucleotides // Biopolymers. 1970. -V. 9.-P. 1059-1077.

329. Warshaw M.M., Cantor C.R. Oligonucleotide interactions. IV. Conformational differences between deoxy- and ribonucleoside phosphates // Biopolymers. 1970. - V. 9. - P. 1079-1103.

330. Powers R., Gorenstein D.G. Two-dimensional 1H and 31P NMR spectra and restrained molecular dynamics structure of a covalent CPI-CDPI2-oligodeoxyribonucleotide decamer complex // Biochemistry. 1990. - V. 29. - P. 9994-10008.

331. Иванов В.И. Круговой дихроизм и структура комплементарных нуклеиновых кислот // Молекулярн. биол. 1973. - Т. 7. - С. 104-140.

332. Johnson W.C. Jr. Circular dichroism and its empirical application to biopolymers // Methods Biochem. Anal. 1985. - V. 31. - P. 61-163.

333. Bhattacharryya A., Lilley D.MJ. The contrasting structures of mismatched DNA sequences containing looped-out bases (bulges) and multiple mismatches (bubbles) // Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 6821-6840.

334. Joshua-Tor L., Frolow F., Appella E., Hope H., Rabinovich D., Sussman J.L. Three-dimensional structures of bulge-containing DNA fragments // J. Мої. Biol. 1992. - V. 225. - P. 397-431.

335. Rice J.A., Crothers D.M. DNA bending by the bulge defect // Biochemistry. 1989. -V. 28.-P. 4512-4516.

336. Kalnik M.W., Chang C.-N., Johnson F., Grollman A.P., Patel D.J. NMR studies of abasic sites in DNA duplexes: deoxyadenosine stacks into the helix opposite acyclic lesions //Biochemistry. 1988. - V. 28. - P. 3373-3383.

337. Koo H.S., Wu H.M., Crothers D.M. DNA bending at adenine thymine tracts // Nature. 1986. - V. 320. - P. 501-506.

338. Haran Т.Е., Kahn L.D., Crothers D.M. Sequence elements responsible for DNA curvature // J. Мої. Biol. 1994. - V. 244. - P. 135-143.

339. Liu-Johnson H.N., Gartenberg M.R., Crothers D.M. The DNA binding domain and bending angle of E. coli CAP protein // Cell. 1986. - У. 47. - P. 995-1005.

340. Thompson J.F., Landy A. Empirical estimation of protein-induced DNA bending angles: applications to lambda site-specific recombination complexes // Nucleic Acids Res.1988.-V. 16.-P. 9687-9705.

341. Lumpkin O.J., Zimm B.H. Mobility of DNA in gel electrophoresis // Biopolymers. -1982.-V. 21.-P. 2315-2316.

342. Lilley D.M.J. Kinking of DNA and RNA by base bulges // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. - V. 92. - P. 7140-7142.

343. Dornberger U., Hillisch A., Gollmick F.A., Fritzsche H., Diekmann S. Solution structure of a five-adenine bulge loop within a DNA duplex // Biochemistry. 1999. - V. 38. -P. 12860-12868.

344. Luebke K.J., Tinoco I. Sequence effects on RNA bulge-induced helix bending and a conserved five-nucleotide bulge from the group I introns // Biochemistry. 1996. - V. 35. -P. 11677-11684.

345. Rosen M.A., Live D., Patel D.J. Comparative NMR study of A(n)-bulge loops in DNA duplexes: intrahelical stacking of A, A-A, and A-A-A bulge loops // Biochemistry. 1992. -V. 31. - P. 4004-4014.

346. Gryaznov S.M., Lloyd D.H. Separation of nucleic acid components on polyacrylamide gel columns // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 5909-5915.

347. You Y., Tataurov A.V., Owczarzy R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence // Biopolymers. 2011. - V. 95. - P. 472-486:

348. Vesnaver G., Breslauer K.J. The contribution of DNA single-stranded order to the thermodynamics of duplex formation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991. - V. 88. - P. 3569-3573.

349. Wu Pr, Sugimoto N. Transition characteristics and thermodynamic analysis of DNA duplex formation: a quantitative consideration- for the extent of duplex association // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 4762-4768.

350. Пышная И.А. «Мостиковые» олигонуклеотиды как перспективные инструменты в антпсенс технологии и ДНК-диагностике // Дисс. канд. хим. наук: 02.00.10. Защищена 03.02.06. Утв. 12.05.06. Новосибирск. 2006. 150 с.

351. Goobes R., Minsky A. Contextual equilibrium effects in DNA molecules // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 16155-16160.

352. Letsinger R.L., Chaturvedi S.K., Farooqui F., Salunkhe M. Use of hydrophobic sub-stituents in controlling self-assembly of oligonucleotides // J. Am. Chem. Soc. 1993. - V. 115.-P. 7535-7536.

353. Ying L., Wallace Mil., Klenerman D. Two-state model of conformational fuctuational a DNA hairpin-loop // Chem. Phys. Let: 2001. - V. 334. - P. 145-150.

354. Ohmichi Т., Nakamuta H., Yasuda K., Sugimoto N. Kinetic property of bulged helix formation: analysis of kinetic behavior using nearest-neighbor parameters // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 11286-11294.

355. Reuben J., Shporer M., Gabbay E.J. The alkali ion-DNA interaction as reflected in the nuclear relaxation rates of Na+ and Rb+ // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1975. - V. 72. -P. 245-247.

356. Williams A.P., Longfellow C.E., Freier S.M., Kierzek R., Turner D.H. Laser temperature-jump, spectroscopic, and thermodynamic study of salt effects on duplex formation by dGCATGCt // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 4283-4291.

357. Mathupala S.P., Sloan A.E. "In-gel" purified ditags direct synthesis of highly efficient SAGE Libraries // BMC Genomics. 2002. - V. 3. - P. 20.

358. Долинная Н.Г., Шабарова З.А. Химическое лигирование как метод сборки дву-тяжевых нуклеиновых кислот; модификация, исследование локальной структуры // Изв. Акад. Наук. Серия хим. 1996. - № 8. - С. 1889-1911.

359. Miyoshi D., Wang Z.-M., Karimata H., Sugimoto N. DNA nanowire sensitive to the surrounding condition // Nucleic Acid Symp. Ser. 2005. - V. 49. - P. 43-44.

360. Kushon S.A., Jordan J P., Seifert J.L. Nielsen H., Nielsen P.E., Armitage B.A. Effect of secondary structure on the thermodynamics and kinetics of PNA hybridization to DNA hairpins// J. Am. Chem. Soc. 2001. - V. 123.-P. 10805-10813.

361. Breslauer K.J. Extracting thermodynamic data from equilibrium melting curves for oligonucleotide order-disorder transitions // Methods Mol. Biol. 1994. V. 26. - P. 347372.

362. Gupta N.K., Ohtsuka E., Weber H., Chang S.H., Khorana H.G. Studies on polynucleotides. LXXXVII. The joining of short deoxyribopolynucleotides by DNA-joining enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1968. - V. 60. - P. 285-292.

363. Olivera B.M., Lehman I.R. Enzymic joining of polynucleotides. 3. The polydeoxyade-nylate-polydeoxythymidylate homopolymer pair // J. Mol. Biol. 1968. - V. 36 - P. 261274.

364. Королева O.H., Друца'В.Л. Контролируемое соединение олигодезоксирибонук-леотидов ДНК-лигазой фага Т4 // Молекулярн.биол. 1988. - Т. 22. — С. 1632-1641.

365. Shilov I.A., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Features of connecting short oligonucleotides with phage T4 DNA ligase // Mol. Biol. (Mosk). 1993. - V. 27. - P. 647-654.

366. Cai L., Ни C., Shen S., Wang W., Huang W. Characterization of bacteriophage T3 DNA ligase // J. Biochein. (Tokyo). 2004. - V. 135. - P. 397-403.

367. Lehman I.R. DNA ligase: structure, mechanism, and function // Science. 1974. - V. 186. - P. 790-797.

368. Nilsson S.V., Magnusson G. Sealing of gaps in duplex DNA by T4 DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1982. - V. 10. - P. 1425-1437.

369. Rossi R., Montecucco A., Ciarrocchi G., Biamonti G. Functional characterization of the T4 DNA ligase: a new insight into the mechanism of action // Nucleic Acids Res. -1997.-V. 25. P. 2106-2113.

370. Raae A.J., Kleppe R.K., Kleppe K. Kinetics and effect of salts and polyamines on T4 polynucleotide ligase // Eur. J. Biochem. 1975. - V. 60. - P.'437-443.

371. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс // М.: Фаир-Пресс. 1999.

372. Cherepanov A.V., de V.S. Kinetics and thermodynamics of nick sealing by T4 DNA ligase // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. - P. 4315-4325.

373. Harada K., Orgel L.E. Unexpected substrate specificity of T4 DNA ligase revealed by in vitro selection // Nucl. Acids Res. 1993. - V.21. - P. 2287-2291.

374. Bonora G.M., Ivanova E., Zarytova V., Burcovich В., Veronese F.M. Synthesis and characterization of high-molecular mass polyethylene glycol-conjugated oligonucleotides // Bioconjugate Chem. 1997. - V. 8. - P. 793-797.

375. Southern E., Mir K., Shchepilov M. Molecular interactionson microarrays// Nature Genetics. 1999. - V.21. - P. 5-9.

376. Калачиков C.M., Адаричев B.A., Дымшиц Г.М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембрана с помощью УФ-облучения // Биоорган, химия. 1992. - V. 18. -Р. 52-62.

377. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989. - V. 86. - P. 6230-6234.

378. Kerem В., Rommens J.M., Buchanan J.A., Markiewicz D., Cox Т.К., Chakravarti A., Buchwald M., Tsui L.C. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis // Science. 1989. - V. 245.- P. 1073-1080.

379. Jobling, M. A., & Tyler-Smith, C. The human Y chromosome: an evolutionary marker comes of age // Nature. 2003. - V. 4. - P. 598-612.

380. Лактионов П.П., Мальшакова B.C., Морозкин E.C., Пышный Д.В., Власов В.В. Способ анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных нуклеиновых кислот // Патент РФ № 2322508 от 20.04.2008.

381. Каргинов В.А, Зеленин С.М., Бондарь А.А., Николаева Е.С., НаумовВ.А. Конструирование зондов для детекции РНК вируса гепатита А на основе бактериофага М13 // Мол. генетика микробиология вирусология. 1988. — С. 39-42.

382. Wei Z., Tung С.-Н., Zhu Т., Dickerhof W.A., Breslauer К.J., Georgopoulos D.E., Lei-bowitz M.J., Stein S. Hybridization properties of oligonucleotide pairs bridged by polyar-ginine peptides // Nucleic Acids Res. 1996. -V. 24. - P. 655-661.

383. Maxam, A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled-DNA with base-specific chemical cleavage // Methods Enzymol. 1980. - V. 65. - P. 499-560.

384. Durand М., Peloille S., Thuong N.T., Maurizot J.С. Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethyl-ene glycol chains // Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 9197-9204.

385. Ma M.Y.-X., Reid L.S., Climie S.C., Lin W.C., Kuperman R„ Sumner-Smith M., Barnett R.W. Design and synthesis of RNA miniduplexes via a synthetic linker approach // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 1751-1758.

386. Wei Z., Tung C.-H., Zhu Т., Stein S. Synthesis of oligoarginine-oligonucleotide conjugates and oligoarginine-bridged oligonucleotide pairs // Bioconjugate Chem. 1994. - V. 5. - P. 468-474.

387. Home D.A., Dervan Р.В. Recognition of mixed-sequence duplex DNA by alternatestrand triple-helix formation // J. Amer. Chem. Soc. 1990. - V. 112. - P. 2435-2437.

388. Федорова О.A , Готтих М.Б., Романова E.A., Орецкая Т.С., Долинная М.Г., Ша-барова З.А. Циклические олигонуклеотиды. Гибридизационные свойства и способность вызывать расщепление РНК РНКазой Н // Молекулярн. биол. 1995. Т. 29. С. 1161-1167.

389. Lewis F.D., Wu Т., Burch E.L., Bassani D.N., Yang J.-S., Schneider S., Jager W., Letsinger R.L. Hybrid oligonucleotides containing stilbene units. Excimer fluorescence and photodimerization // J. Am. Chem. Soc. 1995. - V. 117. - P. 8785-8792.

390. Toulme, J.-J. Artificial regulation of gene expression by complementary oligonucleotides // An overview. In: Antisense RNA and DNA. J.A.H. Murray. Ed. Wiley-Liss. New York.-P. 175-194.

391. Назаркина Ж.К., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Использование модифицированных флэп-структур для исследования белков системы эксцизионной репарации оснований //Биохимия. 2005. - Т. 70. - С. 1613-1622.

392. Clark J.M. Novel non-template nucleotide addition reactions catalyzed by prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases //Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16. - P. 9677-9686.

393. Друца В.Л., Беднарек П.З., Королева, O.H. Особенности репликации синтетических олигонуклеотидов с неприродными звеньями // Биоорган, химия. 1994. - Т. 20,-С. 1206-1217.

394. Choi J.Y., Lim S., Kim E.J., Jo A., Guengerich F.P. Translesion synthesis across abasic lesions by human B-family and Y-family DNA polymerases a, 5, x\, i, к, and REV1 // J. Mol. Biol. 2010. - V. 404. - P. 34-44.

395. Prakash S., Johnson R.E., Prakash L. Eukaryotic translesion synthesis DNA polymerases: specificity of structure and function // Annu. Rev. Biochem. 2005. - V. 74. — P. 317-353.

396. Obeid S., Baccaro A., Welte W., Diederichs K., Marx A. Structural basis for the synthesis of nucleobase modified DNA by Thermus aquaticus DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-2010.-V. 107. P. 21327-21331.

397. Li Y., Waksman G. Crystal structures of a ddATP-, ddTTP-, ddCTP, and ddGTP-trapped ternary complex of Klentaql: insights into nucleotide incorporation and selectivity //Protein Sci.-2001.-V. 10.-P. 1225-1233.

398. Wlassoff W.A., Dymshits G.M., Lavrik O.I. A model for DNA polymerase translocation: worm-like movement of DNA within the binding cleft // FEBS Lett. 1996. - V. 390. - P. 6-9.

399. Proudnikov D., Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling // Nucleic Acids Res. 1996 - V. 24. P. 4535-4542.

400. Meijler M.M., Zelenko O:, Sigman D.S. Chemical mechanism of DNA scission by (1,10-phenanthroline)copper. Carbonyl oxygen of 5-methylenefuranone is derived from water// J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 1135-1136.

401. Smylie K.J., Cantor C.R., Denissenko M.F. Analysis of sequence variations in several human genes using phosphoramidite bond DNA fragmentation and chip-based MALDI-TOF//Genome Res. 2004. - V. 14. - P! 134-141.

402. Bjourson A.J., Stone C.E., Cooper J.E. Combined subtraction hybridization and polymerase chain reaction amplification procedure for isolation of strain-specific Rhizobium DNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 2296-2301.

403. Muller K.M., Stebel S.C., Knall S., Zipf G., Bernauer H.S:, Arndt K.M. Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling: a robust method for DNA fragmentation and directed evolution // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. P. el 17.

404. Timofeev E., Mirzabekov A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4096-hexanucleotide microarray // Nucleic Acids Res. — 2001. -V. 29. P. 2626-2634.

405. Sigman D.S. Chemical nucleases //Biochemistry. 1990. - V. 29. P. 9097-9105.

406. Zhang Y., Price B.D., Tetradis S., Chakrabarti S., Maulik G., Makrigiorgos G.M Reproducible and inexpensive probe preparation for oligonucleotide arrays // Nucleic Acids Res.-2001.-V. 29. P. ебб.

407. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis С virus // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992. - V. 89. - P. 4942-4946.

408. Ильина E.H., Артемов E.K., Говорун B.M., Иванова JI.M., Иваников И.О. Гено-типирование РНК вируса гепатита С аллельспецифичной амплификацией // Кремлевская медицина. Клинический вестник. -2002. — Т. 1. — С. 38-41.

409. Гущин А.Е., Носкова О.М., Шипулин Г.А. Разработка набора реагентов "Ампли-сенс HCV-генотип" для определения субтипов la, lb, 2а, За вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. — Т. 3. С. 45-48.

410. Mathews D.H., Burkard М.Е., Freier S.M., Wyatt J.R., Turner D.H. Predicting oligonucleotide affinity to nucleic acid targets // RNA. 1999. - V. 5. - P. 1458-1469.

411. Nguyen' H.K., Southern E.M. Minimising the secondary structure of DNA targets by incorporation of a modified deoxynucleoside: implications for nucleic acid analysis by hybridization // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. P. 3904-3909.

412. Stevenson R., Ingram, A. Leung H., McMillan D.C., Graham D. Quantitative SERRS immunoassay for the detection of human PSA // Analyst. 2009. - V. 134. - P. 842-844.

413. Котова Е.Ю., Крейдлин Э.Я., Барский B.E., Мирзабеков А.Д. Изучение оптических свойств флуорохромов, перспективных для использования в биологических микрочипах // Молекулярн. биол. 2000. - Т. 34. - С. 237-245.

414. Peng Н., Soeller С., Cannell М.В., Bowmaker G.A., Cooney R.P., Travas-Sejdic J. Electrochemical detection of DNA hybridization amplified by nanoparticles // Biosens. Bioelectron. 2006. - V. 21. - P. 1727-1732.

415. Langer P.R. Waldrop A.A., Ward D.C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. - V. 78. - P. 6633-6637.

416. Benters R., Niemeyer C.M., Drutschmann D., Blohm D., Wohrle D. DNA microarrays with РАМАМ dendritic linker systems // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. elO.

417. Urdea M.S. Branched DNA signal amplification // Nature biotechnology. 1994. -V.12. - P. 926-928.

418. Wang J., Liu G., Merkoci A. Electrochemical coding technology for simultaneous detection of multiple DNA targets // Anal. Chim. Acta. 2003. - V. 482. - P. 149-153.

419. He L., Musick M.D., Nicewarner S.R., Salinas F.G., Benkovic S.J., Natan M.J., Keating C.D. Colloidal Au-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of DNA Hybridization // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 9071-9077.

420. Tobe V.O., Taylor S.L., Nickerson D.A. Single-well genotyping of diallelic sequence variations by a two-color ELISA-based oligonucleotide ligation assay // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 3728-3732.

421. Schuler Т., Nykytenko A., Csaki A., Moller R„ Fritzsche W., Popp J. UV cross-linking of unmodified DNA on glass surfaces // Anal. Bioanal. Chem. 2009. - V. 395. - P. 1097-1105.

422. Dubiley S., Kirillov E., Mirzabekov A. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers // Nucleic Acids Res. — 1999. V. 27.-P.el9.

423. Bassler H.A., Flood S.J.A., Litvak K.J., Marmaro J., Knorr R., Batt C.A. Use of a fluorogenic probe in a PCR-based assay for the detection of Listeria monocytogenes // Appl Environ Microbiol. 1995. - P. 3724-3728.

424. Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., Myambo K., Drummond R., Gelfand D.H. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus// J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 6427-6437.

425. Котова E., Крейндлин Э., Барский В. и Мирзабеков А. Изучение оптических свойств флуорохромов, перспективных для использования в биологических микрочипах // Молекулярн. биол. 2000. - Т. 34. - С. 304-309.

426. Liu W., Wu J., Li E., Selamat E. Emission characteristics of fluorescent labels with respect to temperature changes and subsequent effects on DNA microchip studies // Appl Environ Microbiol. 2005. - V. 71. - P. 6453-6457.

427. Moreira B.G., You Y., Behlke M.A., Owczarzy R. Effects of fluorescent dyes, quenchers, and dangling ends on DNA duplex stability // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. - V. 327. - P. 473-484.

428. Борисова B:B., Пышная.И.А., Пышный Д.В., Франк JI.A. Высокочувствительный и быстрый метод выявления ДНК-фрагментов с использованием фотопротеина обе-лина как репортёра // Биоорган, химия. 2008. - Т. 34. - С.792-798.

429. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization // Nat. Biotech. 1996. - V. 14. - P. 303-308.

430. Drutsa V.L., Zarytova V.F., Knorre D.G., Lebedev A.V., Sokolova N.I., Shabarova Z.A. Investigation of activation of phosphate groups in mono- and oligonucleotides with mesitoyl chloride //Nucleic Acids Res. 1978. - V. 5. - P. 185-193.

431. Шишкина, И.Г., Левина, A.C., Зарытова, В.Ф. Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их сорбенты // Успехи химии. 2001. - Т. 70. - С. 581-607.

432. Liu X., Wang H., Herron J.N., Prestwich G.D. Photopatterning of antibodies on biosensors // Bioconjugate Chem. 2000. - V. 11. - P. 755-761.

433. Reichmuth P., Sigrist H., Badertscher M., Morf W.E., de Rooij N.F., Pretsch E. Immobilization of biomolecules on polyurethane membrane surfaces // Bioconjugate Chem. 2002.-V. 13.-P. 90-96.

434. Kosh Т., Jacobsen N., Fensholdt J., Boas U , Fenger M., Jakobsen M.H. Photochemical immobilization of anthraquinone conjugated oligonucleotides and PCR amplicons on solid surfaces // Bioconjugate Chem. 2000. - V. 11. - P. 474-483.

435. Church G.M., Gilbert W. Genomic sequencing. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1984.-V. 81.-P. 1991-1995.

436. К 1/fuJ YW Mr(/- C^p. j-OL. луиу (м^мл-^а^ссел^mic ok литературы

437. Gudnason H., Dufva M., Bang D., Wolff A. An inexpensive and simple method for thermally stable immobilization of DNA on an unmodified glass surface: UV linking of poly(T) 10-poly(C) 10-tagged DNA probes // BioTechniques. 2008. - V. 45. - P. 261-271.

438. Beaucage S.L. Strategies in the preparation of DNA oligonucleotide arrays for diagnostic applications // Curr. Med. Chem. 2001. - V. 8. - P. 1213-1244.

439. Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Романенко В.П. Синтез олигонуклеотидов в хлороформе триэфирным методом // Биоорг. химия. 1983. - Т. 9. - С. 516-521.

440. Веньяминова А. Г., Горн В. В., Зенкова М. А*., Комарова Н. И., Репкова Ml Н. Автоматический Н-фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов с использованием 2'-0-тетрагидропиранильной защитной группы // Биоорган, химия. 1990. - Т. 16. — С. 941-950.

441. Berkner K.L., Folk W.R. Polynucleotide kinase exchange reaction: quantitave assay for restriction endonuclease-generated 5'-phosphoroyl termini in DNA // J. Biol. Chem. -1977.-V. 252.-P. 3176-84.

442. Барам Г.И., Бунева B.H., Добрикова Е.Ю., Петров В.Н. Множественность аффи-ной модификации РНКазы при алкилировании ее реакционноспособным аналогом 5'-дезоксирибонуклеотида// Биоорган. Химия. 1986. - Т. 12. - С. 613-620.

443. Handbook of Biochemistry, and Molecular Biology: Nucleic Acids // Fasman, G.D., Ed., Cleveland: CRC Press. 1975. -V. 1. - pp. 589.

444. Дегтярев C.X., Белавин П.А, Шишкина И.Г., Зарытова В.Ф., Гаврюченкова Л.П., Морозов С.Н. Иммобилизованные олигонуклеотиды как афинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции // Биоорган, химия. 1989. - Т. 15. - С. 358-362.

445. Горожанкин А.В., Иванова Е.М., Кобец Н.Д. Синтез олигодезоксириботимиди-лата, содержащего алкилирующую группу и остаток биотина, для направленной модификации хроматина// Биоорган, химия. 1993. - Т. 19. - С. 81-85.

446. Коробко ВГ, Грачев СА. Определение нуклеотидной последовательно-сти в ДНК модифицированным химическим методом // Биоорган, химия. -1977. -Т. 3. С. 1420-1422.

447. Xu Y., Kool Е.Т. Chemical and enzymatic properties of bridging 5'-S-phosphorothioester linkages in DNA // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 3159-3164.