Молекулярные основы специфичности аминоацилирования тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазами. Конформационная динамика продуктивного взаимодействия с тРНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

003445Э71

На правах рукописи

МООР НИНА АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ СПЕЦИФИЧНОСТИ АМИНОАЦИЛИРОВАНИЯ тРНК ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗАМИ. КОНФОРМАЦИОННАЯ ДИНАМИКА ПРОДУКТИВНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С тРНК

02 00 10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Л^

1 8 СЕН 205В

Новосибирск - 2008

003445971

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный консультант доктор химических наук, член-корреспондент РАН,

профессор Лаврик Ольга Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зенкова Марина Аркадьевна

доктор биологических наук, профессор Фаворова Ольга Олеговна

доктор химических наук, член-корреспондент РАН, профессор Габибов Александр Габибович

Ведущая организация. Московский государственный университет

имени М В Ломоносова, химический факультет

Защита состоится « 19 » сентября 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г Новосибирск, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан« 1$ » августа 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент

Коваль В В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Воспроизведение генетически заданной структуры белков определяется ДНК-зависимым синтезом мРНК, кодон-антикодоновым взаимодействием при считывании мРНК в рибосоме и синтезом аминоацил-тРНК Специфичность трансляции не зависит от природы аминокислотного остатка аминоацил-тРНК, поэтому наличие в клетке полного набора правильно аминоацилированных тРНК имеет первостепенное значение для общей точности биосинтеза белка Реакция аминоацилирования тРНК катализируется аминоацил-тРНК-синтетазами (ааН5з), самой многочисленной группой ферментов различной специфичности, разделенных на два класса в соответствии со структурными характеристиками активных центров Исключительно высокая точность реакции обеспечивается избирательным взаимодействием ферментов с тРНК и аминокислотой и наличием у некоторых из них «корректирующей» (гидролитической) активности в отношении ошибочных продуктов Познание молекулярных основ узнавания тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами дает ключ к пониманию принципов высокоспецифичного нуклеиново-белкового взаимодействия и относится к числу фундаментальных проблем молекулярной биологии Актуальность структурно-функциональных исследований этих ферментов определяется также решением прикладных задач Обнаруженные различия между ферментами (одной специфичности) бактерий и эукариот делают их перспективными мишенями для создания лекарств Дополнительные функции в клеточных процессах (регуляция роста и дифференциации клеток, транскрипции и трансляции, участие в сплайсинге РНК, апоптозе и др) устанавливают взаимосвязь между аминоацил-тРНК-синтетазами и болезнями человека, что может быть использовано для развития новых методов диагностики и терапии Быстро развивающаяся биотехнология производства белков с необычными свойствами основана на включении в целевые белки неприродных аминокислот с помощью мутантных форм синтетаз и тРНК-синтетазных пар с измененной или ослабленной специфичностью, рациональное конструирование которых базируется на знании молекулярных основ селективного взаимодействия с субстратами

Большие успехи в выявлении структурных элементов, по которым каждая ааЯЭ отличает «свою» тРНК, достигнуты за последние два десятилетия, благодаря развитию подходов, основанных на использовании мутантных и химерных тРНК Установлено, что специфичность обеспечивается индивидуальным для каждой пары набором структурных элементов тРНК - элементов узнавания (или специфичности) Молекулярные детали избирательного взаимодействия с тРНК выявлены для многих ааЯБв (в основном бактериального происхождения) с помощью рентгеноструктурного анализа Различные районы тРНК взаимодействуют с определенными структурными доменами белка, общее число которых, способы укладки и степень участия в связывании и узнавании тРНК своеобразны для каждой пары Образование комплекса сопровождается конформационными изменениями обеих макромолекул Прямое узнавание основных элементов специфичности в тРНК - общее свойство антикодонузнающих ааЯЗв, в то время как для узнавания элементов, ответственных за формирование пространственной структуры и конфигурации отдельных районов субстрата, используются преимущественно непрямые механизмы Полученные для некоторых ферментов данные о распознавании тРНК на стадии связывания и последующих этапах каталитического превращения показывают разнообразие и индивидуальность не только наборов элементов, но и выполняемых ими функций Сложной задачей при использовании традиционных подходов является идентификация непрямых элементов узнавания и их роли в обеспечении специфичности Для большинства ааЯ8э с известной трехмерной

структурой их комплексов не установлены механизмы контроля продуктивного связывания акцепторного конца тРНК Представлялось перспективным использовать для решения этих задач метод аффинной модификации химически активными аналогами субстратов, применявшийся в ранних исследованиях систем аминоацилирования

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - установление молекулярных механизмов специфичного функционирования фенилаланил-тРНК-синтетазы (PheRS), имеющей консервативную в прокариотах и цитоплазме эукариот четвертичную структуру (а(3)2-типа, самую сложную и редкую для синтетаз Основным объектом исследования является PheRS из экстремально термофильной эубактерии Thermus themophilus, трехмерная структура фермента расшифровывалась к началу выполнения работы (Reshetnikova et al, 1992) Некоторые функциональные исследования проведены параллельно с цитоплазматической PheRS человека для проверки эволюционно консервативной природы механизмов Данная работа представляет собой комплексное изучение механизмов взаимодействия PheRS с субстратами с применением структурных и функциональных методов, и в ходе ее выполнения решались следующие задачи

• идентификация структурных элементов PheRS Т thermophilics, ответственных за узнавание АТР и L-фенилаланина и каталитическую активность,

• выявление механизмов дискриминации неспецифичных аминокислот для фенилаланил-тРНК-синтетаз эубактерии и эукариот,

• идентификация структурных элементов тРНКРЬе, определяющих специфичность ее аминоацилирования фенилаланил-тРНК-синтетазой Т thermophilus,

• установление функциональной роли элементов узнавания тРНКРЬе в обеспечении эффективного распознавания на стадии связывания с ферментом,

• идентификация структурных элементов универсального ССА-конца, ответственных за продуктивное взаимодействие тРНКРЬс с PheRS,

• установление роли фенилаланина и АТР в обеспечении правильной ориентации акцепторного конца тРНКРЬе в комплексе с PheRS (в условиях функциональной активности) для эволюционно различных систем,

• выявление относительного вклада элементов узнавания тРНКРЬе в формирование комплекса с функционально активной Конформацией акцепторного конца,

• детальная локализация структурных перестроек комплекса PheRS Т thermophilus с тРНКРЬе, индуцируемых малыми субстратами

Научная новизна и практическая значимость работы. Выполнено первое систематическое исследование молекулярных механизмов высокоспецифичного аминоацилирования тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой, имеющей редкую структуру (сф)2-типа Независимые измерения равновесных констант диссоциации комплексов PheRS с разными тРНК и кинетических параметров аминоацилирования позволили идентифицировать нуклеотиды, обеспечивающие распознавание тРНК ферментом на стадии связывания и каталитического превращения, и различить непрямые элементы специфичности по их роли в создании оптимальной конформации тРНК Впервые для локализации нуклеотидов, образующих близкие контакты с синтетазой, применена 54и-индуцируемая аффинная модификация статистически замещенными аналогами тРНК-транскриптов, что позволило зафиксировать взаимодействия между PheRS и непрямыми элементами узнавания, участвующими в конформационной адаптации комплекса Результаты исследований в растворе подтверждены и дополнены данными РСА конформационно подвижные нуклеотиды, модулирующие структуру тРНК в разных функциональных состояниях комплекса, идентифицированы сравнительным изучением трехмерных структур комплексов PheRS с тРНКРЬе, закристаллизованных в

отсутствие или в присутствии устойчивого аналога фенилаланиладенилата Впервые продемонстрирована результативность метода аффинной модификации аминоацил-тРНК-синтетазы производными специфичной тРНК и ее мутантных форм для непосредственной регистрации участия различных элементов узнавания в создании комплекса с правильной ориентацией акцепторного конца В работе впервые показан другой важный аспект применения таких аффинных тРНК-реагентов - установление роли малых субстратов в продуктивном связывании акцепторного конца тРНК ферментом Фотоаффинные, s4U(s6G)-3aMeiaeHHbie в 3'-концевой последовательности, аналоги тРНК синтезированы впервые и могут оказаться полезными для структурно-функциональных исследований комплексов различных тРНК с другими компонентами аппарата трансляции Полученные результаты свидетельствуют об эффективности комплексного применения химических и биохимических методов в сочетании с РСА для решения проблемы узнавания тРНК ключевыми ферментами биосинтеза белка

Выявленные молекулярные детали взаимодействия PheRS с малыми специфичными и неспецифичными лигандами важны как для понимания механизма функционирования наиболее сложноорганизованной aaRS, так и для решения биотехнологических задач по созданию белков с необычными свойствами На их основе конструируются мутантные формы PheRS, пригодные для функционализации рекомбинантных белков (Datta et al, 2002, Kwon & Tirrel, 2007) Другая область практического применения - оптимизация структуры ингибиторов PheRSs, обладающих антибактериальным действием (Yu et al, 2004, Jarvest et al, 2005)

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 25 статьях (4 обзорах) и 32 тезисах докладов Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях "tRNA Workshop" (Франция, 1993, США, 1995, Япония, 1997, Великобритания, 2000), "3rd German-Russian Workshop Biotechnology" (Германия, 1994), "French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression", (Новосибирск, 1995), конференции, посвященной 30-летию журнала «Молекулярная биология» (Москва, 1998), "International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances" (Новосибирск, 1998), "EMBO Workshop on Structure and Function of Ammoacyl-tRNA Synthetases" (Франция, 1998), "Trends in Nucleic Acid Chemistry" (Москва, 2000), "IVth ISTC Scientific Advisoiy Committee Seminar on Basic Science in ISTC Activities" (Новосибирск, 2001), "RNA as Therapeutic and Genomics Target" (Новосибирск, 2001), "Asilomar Conference on Aminoacyl-tRNA Synthetases in Biology, Medicine and Evolution" (CIIIA, 2002), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), "Targeting RNA Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA Interference" (Новосибирск, 2003), "Chemical and Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 2004), "Structural Biology at Crossroads from Biological Molecules to Biological Systems" (Германия, 2004), "International Conference on Aminoacyl-tRNA Synthetases Ancient Molecules for Future Biology and Medicine" (Корея, 2004), "Biosphere Origin and Evolution" (Новосибирск, 2005), «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2006), 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protein Interactions" (Московская область, 2006), "International Conference on Aminoacyl-tRNA Synthetases from the Genetic Code to Human Diseases and Medicine" (CIIIA, 2006)

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 329 стр машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы (623 ссылки) и содержит 113 рисунков и 41 таблицу

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Структурные основы каталитической функции фенилаланил-тРНК-синтетазы и специфичности ее взаимодействия с низкомолекулярными субстратами

В исследовании трехмерной структуры РИеИЯ Т. ЛегторЫЫз (закристаллизованной в отсутствие функциональных лигандов) было показано, что олигомерная организация имеет молекулярную топологию (сф)2-типа (рис. 1); каждый из сф-гетеродимеров (связанных осью симметрии С2) состоит из 11-ти доменов; мотивы, характерные для синтетаз И-ого класса, входят в состав домена А1.

Рис. 1. Общий вид структуры РЬеЯБ (код РОВ: IРУБ; Моэуак ег а!.. 1995). Доменная организация а-субъединиц (А1: остатки 102-125 и 192-327; А2: 126-191; для Ы-концевого фрагмента не показаны остатки 1-84, образующие биспиральный домен СС, упорядоченный в присутствии тРНКи,с) и Р-субъединиц (В1: 1-39 и 152-183; В2: 40-151; ВЗ: 211-264 и 329396; В4; 265-328; В5; 401-473; В6; 482-514 и 564-679; В7: 515-563; В8: 692-785). Звездочкой отмечены домены симметрично расположенного гетеродимера.

В данной работе установлены молекулярные детали функционирования РИеЯЯ на стадии активации аминокислоты с помощью рентгеноструктурного анализа комплексов фермента с Ь-фенилаланином, Ь-фенилаланил-5'-аденилатом (РИе-АМР. промежуточным продуктом реакции аминоацилирования, синтезированным РЬеЯ.Ч в кристаллах) и его устойчивым аналогом Ь-фенилаланинил-З'-аденилатом (РИеОН-АМР), выполненных совместно с проф. М. Сафро (Институт Вейцмана, Израиль) и Д.Г". Васильевым (Институт передовых исследований, Япония).

1.1. Анализ структуры комплексов РЬеК8 с малыми специфичными лигандами

В организации активного центра, локализованного полностью на а-субъединице, участвуют наряду с характерным для класса II семицепочечным [3-слоем петлеобразные фрагменты (рис. 2). Петля мотива 2 универсальна для класса; спиральная петля 139-152 (содержащая короткую а-спираль) и петля 176-180 соответствуют «упорядочивающей» и "ГхЕ-петлям, характерным для ряда синтетаз 11-ого класса; РРР-петля образована фрагментом х256(У/0(Р/№(Р/У)ТЕР82(,4, консервативным в РИе!^ различного происхождения (рис. 3). Все петли хорошо структурированы в комплексах и нативном белке, несмотря на то что температурные факторы остатков петли мотива 2 и петли 139-152 в среднем на -30 А2 выше по сравнению с В-факторами конформационно устойчивых остатков. Упорядоченность активного центра, отличающая РйеКв от остальных ааЯ8я класса II (кроме ОуЯЗ; Агпег е! а!., 1999), обусловлена интенсивными

Рис. 2. Фрагмент трехмерной структуры комплекса РЬе!^ Т. ¡кеппоркИиь с фенилаланил-5'-аденилатом (РИе-АМР).

внутримолекулярными, в том числе a/ß-межеубъединичными, взаимодействиями. В формировании гидрофобного ядра с модулем В6-В7 участвуют петля мотива 2 и спиральная петля, образующая дополнительные контакты с доменами В1 и ВЗ (табл. 1). Взаимодействия самой устойчивой FPF-петли с доменами BI и В5 (с участием высоко консервативных в PheRSs про- и эукариот заряженных остатков) опосредованы ионом металла. Стабилизация структуры важных фрагментов активного центра с помощью этих взаимодействий объясняет отсутствие каталитической активности а-субъединиц PheRSs в реакции синтеза аденилата (Hanke et а/., 1975; Зыкова и др.. 1982; Bobkova eta!., 1991).

Особенность активного центра - наличие глубокого РЬе-евязывающего «кармана» в полости, одна из поверхностей которой образована консервативными остатками Gly (рис. 4): анизотропное распределение гидрофобных и гидрофильных остатков обеспечивает точную ориентацию функциональных групп субстрата. Основной вклад в узнавание вносят взаимодействия ароматических колец Phe-субстрата и двух остатков Phea258 и Phea260 из FPF-петли: каждая пара колец ориентирована под углом ~90° друг к другу. Стабилизация позиции карбонильной группы с использованием инвариантного остатка Arga204, кооперирующего в связывании a-фосфата АТР(АМР). - универсальная характеристика синтетаз класса 11. Общим свойством PheRS с другими aaRSs является связывание a-NH2-rpyrmbi с участием Т(Н/ц)Т-петли 176-180 (или эквивалентной ТхЕ-петли) и консервативных остатков (Gin. Glu/Asp) из мотива 2 (табл. 2).

Рис. 4. Особенности структурной организации активного центра PheRS: поверхность белка, комплементарная связанному Phe-AMP (А), и распределение формирующих полость остатков (Б); взаимная ориентация лиганда и остатков, образующих ароматическую триаду (В).

Взаимодействия инвариантных остатков из мотивов 2 и 3 (Arga204, Phea216 и Argu321) с Ade и a-фосфатом аденилата (см. табл. 2) универсальны для класса. Сеть водородных связей, стабилизирующих позицию остатка рибозы, своеобразна для каждого комплекса, и степень сходства между разными aaRSs значительно варьирует. Отсутствие иона двухвалентного металла, координирующего а- и (5-фосфаты АТР, характерно для комплексов PheRS, HisRS и ProRS (Arnez et al., 1997; Yaremchuk et a!., 2001). Его функцию электрофильного катализатора реакции синтеза Phe-AMP могут выполнять остатки Тгр«149 и Arga204. Связывание нуклеогидной части Phe-AMP или PheOH-AMP с PheRS индуцирует конформационный сдвиг петли мотива 2 как целого фрагмента на -0,8-1.2 А в двух комплексах (рис. 5). FPF-пегля конформационно стабильна на уровне скелета и боковых цепей. Конформации петли 139-152 наиболее близки и стабильны в нативном ферменте и комплексе с Phe-AMP; самые сильные изменения структуры и ее дестабилизация в комплексе с PheOH-AMP происходят из-за отсутствия контактов между остатком Trpal49 и синтетическим лигандом (содержащим метиленовую группу вместо карбонильной). Таким образом, спиральная петля наряду с универсальным остатком Arga204 координирует взаимодействие фермента с двумя малыми субстратами.

Hs 132 Sc 135

Tt 101 EC 107 Hs 225 Sc lib

* cc *

mleealaaiqnardleeLkalkarylGkkGlltqemkglsalpleerrkrGqelNaikaaleaalearekaleeaalkeaLerErvDvslPGaslfsGgl lvasakaaisqasdvaaLfovRveylGkkGhltlqmttlrelppeerpaaGaviNeakeqvqqalnarkaelesaalnarLaaEtlDvslPGrrienGgl

meDevqrrl----qlvrggqaeklgekerseLrKRKLlaevtlktywvsKGsaFstfliskqe---TeLspEMisegsWrDtpFKpYNFlAhGvlPdsGhl

laeltdetqsilaqiknnshldeidakilndLKRRKLiaqgkitdfnvtKGpeFstdltkle---TDLTsdMvstnaykDLkFKpYNFnsqGvqissGal

*- A1 --A2 -►

♦ - - мотив 1 " ~ " >

HPitlmereLveiFralGyqaveGPE-vEseffNFdaLNiPeh HPvtrtidnesfFgelGFtvatGPE-IEdDyhNFdaLNiPgh HPLlKVRsqFrQIFleMGFtEMPTdnfiESSFWNFDALFQPQQ HPLnKVReeFrQIFfsMGFtEMPsNqYVEtgFWNFDAIjyvPQQ 4 A2 -К-

?? p DMw

PA adh

PA DqH

PA Die

TFwltgegfrlegp Igeevegrl------------------------

TFwfdttr----------------------------------------

TFFLrdPaea-lqlPmDYvqrVKrtHsqGGYGSqGYkYri>iXldEArKN TFyikdPltadlpddktYmdniKavHeqGrfGSi.GYrYnWfcpfcEcqKl -A1 --

Tt 174 1L

Ec 165 H

He 323 1L

sc 327 vL

'HTSPtnQvRyffivah.....tpPfriwPGrVf

TqTSgVQ i RTmkaq.....qpPirilaPGrVy

THTTsaSARaLYrLAQkkpFtPvKYFSIDRVF THaTAiSARMLhdLAkdp--kPtrlFSIDRVF - A1

>ТИВ 2 ' ifeqtDaTHeav nDy-DqTHtpn NET1DATKLAE MEavDATHIAE

OlEGLvvgeg--xamahLKGaiyelaqalFgpdskvRfqPvyF 4niEGLivdt--niSf tnLKGtLhdFlrnf FeedlqiRfRPSyF yaEGwAdh--gLCLGhLsiGvlreFFtKLG--itqLRFKPAyI' Q"/EGvlAdy--nitLGdLIkfmeeFFermG--vtgLRFKPty^

FvEFg ^TEPS YTEPS YTEPS

Tt 265 Ec 255 Hs 417 Sc 419

Aq f avwpe---ggkWl

AEVDvmg----kngkWl

KEvFeYHqGLk---XWv MEIFewHeGLq---KWv

jLgGa

JvlGc

WvGNS

rjj-GNS

• мотив 3 '

MVHPkVfqavdayrerlglppayrgvtGFAF

MVHPnVLrnvGiDpev.........ysGFAF

vFRPEMLLPMGlPen..........VsViAfc

inFRPEMLesMGlPkd..........IrVlgfc

IGvE uiGmE LSLI LSLE

lAMLrYGIpDilR LtMLrYGvtDIiT PTMIKYGanNl{7 PTMIKYkvqNlJT

yFfgg--rlkFLeQfkgvl sFfeN--DIRFLkQCk eLvGbKvnlqmvydsPlCRlDaeprp LIGbKvsldfietnPaaRlDedlye

B1

B2

Tt 93

Ec 96

Hs 44

Sc 44

Tt 185 Ec 188 Hs 92 Sc 81

Tt 273 Ec 277 Hs 172 Sc 158

Tt 343 Ec 343 Hs 262 Sc 251

Tt 432 Ec 434 Hs 335 Sc 325

Tt 528 Ec 527 Hs 430 Sc 423

Tt 611 EC 619 Hs 521 Sc 519

Tt 698 Ec 711

Mrvpf---sWlkayvp-elespevleerlaglGfEtdriervfpiprgvv£arvleahpiPg-trLkrlvldaG--rtvevVsGAeNarkGigvalAlp

Mkf se---lVfLrewvn-paidsdalanqiTmaGLEVdgvepvagsfhgvvvGewecaqHPnADkLrvtkvnvGgdrlldlVCGAPNcrqGlrvavAti

MPTvsvkrdlLfqaLGr- tYTdeeFdeLCFeFGLELDeiTsEke............-.........................................

MPTvsvnkqqLfdlLGk-nYTsqeFdeLCFeFGmEmDedTtEea----------------------------------------------------

B2 * « B1

GtelPglgqkvgerviqGvrSfGMalSprElGvge---

GavlPg-dfkikaaklRGepSeGMlCSfsElGisddh-

-yggGllefPedalppgtplseawpeewldlevTPNRpDalgllGlARdlhAl-gyal

---sGIieLPadapigtdireylklddntiEisvTPNRaDClgiiGvARdvAvlnqlpl

..........llskEqgnvkaagaedwlYKrdvPANRYDLLClEGLvrgLqvFke-rl

..........lktgE...........epelKldieANRYBLliCiEGisqsLneyle-rk

B3

► B4 •

vePeaa--lkaealplp£alkved--pegaPhftlgya£glr-vapSPlWmqraLfaaGmPpiNnvVDvtNYvuilera-----QPmHAfDlr-fvgegi

vqpeiv--pvgatiddtlpitvea--peacPrylgrvvkginvkaptPlWmkekLrrcGiRsidavVDvtNYvllelG-----QProHAfDkd-rieggi

kapvYkrv-mpdgkiqkliiteeT--akiRPfavaAvLRnikftk...............drYdSFIeuQeKLHgNICRkRaLValGTHDLD-TlsGPF

erPdYkl----skpttkliidksT -eqiRPfataAvLRiuklne...............ksYaSFIaLQDKLHaNlCRnRsLVamGTHDLD-BieGPF

« B4 » * B3 -►

avrrAreGE-rlktLdGv—BrtLbpe-------------------------dlviag-wrgeeefplglAGvmGGaes-evredteaial EvAcFdPvs

wrmAkeGE-tlvlLdGt--BakLnad-------------------------tlvi----adbnkalAaigGi£GGeh3-gvndetqnvllEcAf FsPls

tYtAkrPSdIKFkPLNk-TKEytacELmnlY---ktdnblKhyLhIIeilkPlYPVj.yDSng---vVlSmPPIINGdHS-rlTvnTrNiFIECTgTDfT-

hYrAlpPkdlKFvPLNq-TqEftgdkLiefYkspeqknnigryvhlledsPvfPViinDSkd---rVcSLPPlINseHS-KIsvnTrNilldiTATDkT-

* - ■ ■■■■■■■■ E3----—— -■■■■» ■ ' B5 ■ ~ - ' ■ ' »

irktarrbGlrteaShRFErGvdplgqvpaqrRAlsllqala—Garvaealleagspkp-------peaipf rpeyanrlLGtsypeaeqiaiLkrL

ltgrarrbGlhtDaShRyErGvdpalqhkameRAtrllidic---GGeagpviditn&atl-----pkratitlrrskldrliGbbiadeqvtdiLrrL

.........................KAkiVLdiivTmFSEyCenqFtvEaaEVvfpngksbtf-PelayRkemvradliNkkvGiretpenlaklLtRN

.........................KAeiVLniltTmFSryCdepFtvEPvEivsehngqsrlaPnfndRimdvsikyiNsclGldqsadeiahcLkkM

< B5 » < B6 * « B7 —

Gcrvegegp—tyrvtpPshRltDjlrlEe Gcevtegkd—ewqavaPswRflL&reiEe yLks-evigdgnqieieiPptRapjuHaC sLhavqskedkdiLhvdiPvtRpQiLHaC < B7 ——

iLvEEvaRiqGyetiPlalpaffpapdnrgveapyrkeqrlRevlsglGfqSvytySfmdpedarrfrld HLvEEvaRvYGynniPde-pvqasllfflgthreadl-slkrvktllndkGyqSvitySfvdpk-vqqmihp jivEDaalAyGyNNiqm- - tlPktytianqfPlli-KLtelLRhdniaaaGf tEaltf aLCSqeDiadkLgv JimEDaavgyGfNNlpkgeklenanfiakplPiN-KvsdifRvassqatwvEvlpltLCShdenfkfLrq

B6

ppr----llllNPlapekaalRthLfPGLvrvlkeNldldRpe-ralLFEvGrvf........rereethlaglLfGe--gvglpwakerlsg-yf UK

gve---alllpBPisvemsaMRlsL*tGLLatvvyNqn--RqqiirvriFEsGlrfvpdtqaplgirqdlmlagTricGn--ryeehwnlaketvDFydlK

disatkAVbisNPKtaEFqvaRTtLlPGLLKTiaaNrk---©PLPlKlFEiSDivikDsntdvGAkNyRhlcAvYynknpGFEiiHGLlDRiMq.....

sdngdlAVklaNPKtlEyqvvRTtLlPGiLKTvkeNrk---bsLPiKvFEtgDVvfkDdklerkAyNeRhwaAvYvgknsGFEiiqGI.lgkiMqtfrte

< Вб * B8

Gylealfarlglafrve--aqa£pflHPGvsgrvlvegee------vGflGaLHPeiaqelelp-pvb-lFElrlplp--dkplafqdpsrhPaafRDl

GdlesvldltgklnevefraeanpalHPGqsAalylkger------iG£vGwHPelerkldlngrtl-vFElewnkladrwpqareisrFPanrRDi

-lldvppgedkgGYvik-aseg paFfPGRcAeifarGqs------vGklGvlHPd/itkFeLtaPcS-slEinigpFL

wiadygaaasgrGYwie-eddsvktyfPGRgAkvmfrskegaepkqTGhlGvlHPeVmmnFdvpfaaS-fvEvnaEvFL

avvvpaptpygevealvreaagpyLeslalFDlYqGpplpeGhkSlafhlrfrhpkrTLrDeeveeavsrvaealrar-gfgLRgldtp avwaenvpaadilseckkvgvnqvvgVnlFDVYrGkgvaeGykSlaislilqdtsrTLeeeeiaatvakcvealkerfqasLRd

Рнс 3 Сравнение последовательностей а- и р-субъединиц PheRSs из различных организмов (Tt -Т thetmophrfits, Ее - Е tali, Hs - И sapiens, Sc - S terexisiae) Остатки, консервативные в PheRSs эубактерий или эукариот, выделены синим и красным цветом (67-79% и 80-100% консервативности соответственно), структурно подобные остатки обозначены строчными, часто встречающиеся из них (более 50%) - прописными буквами (по данным анализа последовательностей 235 ферментов из эубактерий, 11 - из эукариот и 18 - из архей) Универсальные для разных PheRSs или aaRSs класса II остатки обведены в красные или черные рамки, консервативные районы выделены на сером фоне Стрелками над последовательностями изображена композиция доменов по данным РСА для PheRS Tt и Р-субъединицы PheRS Р horikashu (Sasaki et al, 2006)

Таблица 1. Внутримолекулярные а/р-межсубъединичные взаимодействия РЬеЯ8 Т (Иеппор1и1их, стабилизирующие структуру активного центра

Остаток белка" Mg"4(6 Остаток белка"" "

петля 139-152 домены Bl, ВЗ и В7

Ргоа144, MetaI48 ProB162(vdw)

Aspal47 0°', 0м ArgP344 N'", N112 (hb), ArgP348 N11', N112 (hb/es)

Thral51 О AsnP535 N"2 (hb)

Phca!52 PhcP515, Leup533, LcuB537 (vdw)

петля мотива 2 (204-214) модуль B6-B7

Phea205 AsnP535. LeuP537 (vdw)

Giua2i3o",o'2 Tvrp513 Qn (hb)

А1аа214, Vala215 Leiip537 (vdw), PhepSIS (vdw)

FPF-петля, домены В1 и В5 домен B5

Gluct262 0rl,Asnpi63 О"1 (es) Argp450 N"1', Nn2, Nr, ArgB465 N'12, N' (hb)

Asp(S452 Ом, О"2, GluP462 0г1,0'2 (es)

Aspp458 0"',GIu(546l 0rl (es)

"Остатки, консервативные (идентичные или структурно подобные) во всех РЬеЯЗэ, отмечены полужирным шрифтом, характерные для эубактериальных РЬе!^ подчеркнуты °Ион Мп2+ в комплексе РИеЯЗ-РЬе-АМР "Типы взаимодействий (в скобках) ЬЬ - водородная связь, -ван-дер-ваальсовые контакты, ее - электростатическое (ионное) взаимодействие Расстояния между взаимодействующими атомами <3,5 (ЬЬ) или <4,2 А (ус)уу, е5)_

Таблица 2 Взаимодействия PheRS с функциональными лигандами

Остаток белка" Phe/KOMiuieKC*-1' АМР/комплекс*'6

петля 139-152, петля 176-180 Meta 148 0 Trpal49Nü Hisal78 N" Thral79 O1 Sera 180 0' 0 (hb)/l, 2 O (hb)/l, 2 N (hb'Vl N (hb)/l, 2, 3 01P", 02P" (hbw2JÍ,)/l 01Pu(hb)/l

мотив 2 (199-220) Arga204 N4' Arga204 №2 Glua206 0rl,0r2 Hisa212,PAra216 кольцо Glua213 N, 0 Glna218 Nc2 Glua2200" O (hb)/l, 2 N (hb^Vl N (hb^'yi. 2*, 3* 01PÜ (hb)/l, 3, N7 (hb"2m)/l, 3* 01P" (hb)/l, 3,05' (hb)/l, 3 N6 (hb)/l, 3 Ade (vdw)/l, 3 N1,N6 (hb)/l, 3

FPF-петля 256-264 Phea258, Phea260 кольцо Vala261 кольцо (vdw)/l, 2, 3 кольцо (vdw)/!, 2, 3

Glua279 O' ', Leua280 O Glva282, Alaa283 кольцо (vdw)/1,2, 3 03,(hb4l4Vl,03,(hb)/l,3

мотив 3(312-327) Alaa314, Pheoc315, GIyo316 Glya318 Glya318 0 Argai2) N, C\ C" Arga321 N4' кольцо (vdw)/!, 2,3 СГ, C4'(vdw)/1, 3 N3,02' (hb*2U8)/l N3 (hb*'2"s)/l, Ade (vdw)/l,3 02' (hb*208)/l. 3*

Ilea332 Ade (vdw)/l, 3

"Обозначения расшифрованы в примеч табл 1, курсивом выделены остатки, характерные для синтетаз Н-ого класса сВзаимодействия в комплексах с 1 - РЬе-АМР, 2 - РЬе, 3 - РИеОН-АМР (коды РОВ ШС, 1В70, 1В7У, разрешение 2,5-2,7 А), прямые контакты в комплексах 2 и 3 отмечены звездочкой _

Другие важные различия между комплексами - неодинаковые смещения боковых цепей Н1за212 и особенно А^а321, индуцированные их взаимодействиями с аденином (Р11е-АМР или его аналога) и уходящей пирофосфатной группой (в комплексе с РЬе-АМР).

Рис. 5. Конформационные изменения в активном центре PheRS, индуцируемые взаимодействиями с лнгандами. А, Б-Сравнение конформаций петель в структурах нативного белка и комплексов; В - сравнение позиций Phe-субстрата, Phe-AMP, PheOH-AMP и некоторых взаимодействующих с ними остатков. Изображения получены совмещением пептидного скелета (показан коричневым цветом в нативной PheRS; фрагменты белка в комплексах того же цвета, что и лиганд). Остаток Тгра149 разупорядочен в комплексе PheRS-PheOH-AMP.

1.2. Механизмы обеспечения специфичности взаимодействия фенилаланил-тРНК-синтегаз с аминокислотным субстратом

Субстратные свойства L-тирозина (Тут) в катализируемых PheRS Т. thermophilic реакциях были исследованы в широком диапазоне концентраций субстратов и фермента. В условиях стационарной кинетики не обнаружено включения [,4С]Туг в тРНКРк'. Г идролиз АТР (АТР-пирофоефатазная активность) в присутствии высокоочищенного Туг свидетельствует об активации неспецифичного субстрата (рис. 6). Значения Кт в этой

Рис. 6. Кинетические кривые гидролиза АТР, катализируемого PheRS T. thermophilus в присутствии Plie или Туг. Реакция проводилась при 37° в смеси, содержащей 0,2 мкМ PheRS, 100 мкМ АТР, 300 мкМ Phe (Туг), в отсутствие или в присутствии 4 ед/мл неорган, пирофосфатазы. 1 мкМ тРНК№.

реакции (измеренные при ненасыщающей концентрации АТР) составляют 1,6 мкМ для Phe и 2,1 мМ для Туг. Эффективность дискриминации тирозина PheRS, рассчитанная из отношения величин kcJKm реакции активации неспецифичного и специфичного субстратов (2,6-КГ1), превышает допустимый предел ошибки (10"4) при включении природных аминокислот в белки (Edelman & Gallant, 1977). тРНКИк (обладающая акцепторной активностью) активирует Туг-стимулируемый гидролиз АТР и значительно подавляет активирующее влияние пирофосфатазы, что указывает на преимущественный расход Tyr-АМР по тРНК-зависимому маршруту (через образование комплекса с тРНКРЬс

2 - + пирофосфатаза

3 - + тРНК№

4 - + пирофосфатаза

+ тРНК'Ьс

Субстрат/ингибитор* Шт)6, мкМ

T ihemophilus H sapiens

L-Phe LÂ 12

ATP 130 110

L-PheOH-AMP (Phe) 0,089 M

L-PheOH-AMP (ATP) 0,085 1,0

L-Tyr(Phe) 3100 3400

L-Tyr-AMS" (Phe) 0,045 0,16

L-Tyr-AMS" (ATP) 0,043 0,16

L-PheOH' (Phe) 2,2 265

"В скобках указан субстрат, по отношению к которому измерена величина К„ 6величины Кт для субстратов подчеркнуты Приведены средние значения 2-3-х экспериментов, ошибки измерений не превышали 10% "5'-0-[М-(Ь-Тнрозил)сульфа-моил]аденозин 'Ь-Фенилаланинол

до освобождения пирофосфата) В параллельных экспериментах с PheRS цит человека выявлены аналогичные закономерности и установлено сходство двух ферментов во взаимодействиях с неспецифичными лигандами (табл 3) Устойчивый аналог тирозиладенилата Tyr-AMS связывается разными PheRSs более эффективно, чем аналог специфичного адеиилата PheOH-AMP, не содержащий карбонильной группы (отсутствие которой более чувствительно для PheRS человека) Субстратной активности других

Таблица 3. Ингибиторные свойства аналогов в неспецифичных гидрофобных и реакции амшюацилировшшятРНК1^, ароматических ^аминокислот (Не,

катализируемой различными PheRSs His и Тгр) в реакциях, каталн-

зируемых двумя PheRSs, не обнаружено, что указывает на их эффективную отбраковку в активном центре Результаты наших и других исследований для PheRSs дрожжей и Е coli (Lin et al, 1983, Roy et al, 2004) свидетельствуют о том, что ошибочная активация тирозина и гидролитическая активность в отношении продукта Туг-тРНК111с (препятствующая его накоплению) -универсальные характеристики PheRSs (сф)2-типа, сохранившиеся в процессе эволюции от прокариот до высших эукариот

Кристаллографические

исследования комплексов PheRS Т thermoplulus с Туг и Tyr-AMS показали связывание лигандов в основном активном центре (рис 7) Большинство характерных для Phe-субстрата и Phe-AMP взаимодействий сохраняются в комплексах с неспецифичными лигандами ОН-группа тирозина удерживается слабыми водородными связями, опосредованными молекулой воды Смещение молекулы Туг к входу в активный центр на -1,1 Â относительно позиции Phe-субстрата приводит к частичной утрате ван-дер-ваальсовых взаимодействий бензольного кольца с белком (остатками Vala261, Glyu282, Alaa283, А1аа314, Phea315 и Glya316) Молекула Tyr-AMS занимает в активном центре то же положение, что и Phe-AMP(PheOH-AMP), и индуцирует сдвиги петли мотива 2 и боковой цепи Arga321, подобные изменениям в комплексе PheRS-PheOH-AMP Конформация спиральной петли в комплексе с Tyr-AMS является промежуточной между ее конформациями в комплексах со специфичными лигандами из-за отсутствия взаимодействия остатка Trpal49 с сульфамоильной группой аналога

Второй центр связывания молекулы Туг локализован на ß-субъединице каждого aß-гетеродимера (рис 8) В его организации участвуют характерные для PheRSs эубактерий мотивы из доменов ВЗ и В4 fi>242(N/d)x(p(pD9(T/s)N(Y/0<p(p(p(E/d)xGQP(pH/.(F/y)D2M, ^i4G(p(pGGxx(S/t)x<f>xxx(T/s)xx<px(pExAxF,18 и (T/s)1M(D/e)>.(S/t)xR(F/y)E(R/k),62 (где <р -гидрофобная, X - маленькая, х - любая аминокислота) Центр сконструирован по аналогии с основным активным центром для связывания ароматической аминокислоты (бензольное кольцо тирозина и боковых цепей взаимодействующих с ним остатков Pheß360 и Proß259 ориентированы по типу «ребро-к-грани»), но содержит ответственный за узнавание ОН-группы тирозина остаток Gluß334, который находится в полностью гидрофобном окружении (Pheß213, Leuß215, Pheß263, lleß300, Alaß314, Glyß315, Alaß336 и Pheß338) Из шести прочно связанных молекул воды (занимающих стабильные

9

[Trpal44 Serai 80vp Phca260

rVal(ï26i

auaaa

<\1аа314

>1аа2&3

PheRS-Phe PhcRS-Туг

Phcot315

Arg204

петля 139-152

Thrl79

GXn218

^^Гфа149 phea260

Arga20<

,Phe«2l6

Vala261

*hea258

,S»xl60

'Петля мотива 2

Alaa283

VTArga321 /

PheRS-TyrAMS V ¡PhcRS-PheOH-AMP '-eua280

ТЫ179

■ Acg2Q4

позиции в разных комплексах PheRS) три взаимодействуют непосредственно с карбоксильной группой лиганда. Результаты экспериментов по мутагенезу PheRS Е. coli (Ling et al2007) подтверждают, что специфичный к тирозину сайт является ответственным за корректирующую функцию фермента.

л

Рис. 7. Фрагменты трехмерных структур комплексов РЬе!^ с Туг-субстратом (А) и Туг-АМЗ (Б), показывающие молекулы лигандов (вписанные в разностную электронную плотность; контурные уровни: 2,5а, А и За, Б) в окружении остатков активного центра и опосредующих взаимодействия с белком молекул воды. В, Г - Суперпозиция комплексов РЬеЯБ с неспецифичными и специфичными лигандами; пептидный скелет фрагментов и остатки белка показаны разным цветом в соответствии с обозначением комплексов. Коды РОВ: 2АМС, 2АЬУ; разрешение 2,6-2,7 А.

GlyîlS

Thr354

Val316

Glu334

Phe3É0

О Thr354

Рго259

О Phe360

HN А1а356

LGlu334

Л Н1в261

Met260

G1U323

W112

His261

HN" О. Gly319

Asn250

Thr249

Ser322 О

Н« А1а262

М«1253 м Н(

Рис. 8. Связывание тирозина РЬекЗ Т. ¡НегторкНих в области контакта доменов ВЗ и В4. А - Фрагмент трехмерной структуры, показывающий молекулу лиганда (вписанную в разностную электронную плотность на контурном уровне 2,5а) в окружении ключевых остатков и молекул воды, опосредующих взаимодействия с белком. Б - Схема взаимодействий между молекулой Туг и остатками [}-субъединицы РЬеИЗ; пунктирными линиями изображены водородные связи, стрелками - ван-дер-ваальсовые взаимодействия.

Молекула Tyr-AMS не связывается в гидролитическим центре. Структурные и биохимические данные указывают на доминирующий способ коррекции путем гидролиза Туг-тРНК1'1'1. Расстояние между Са-атомами двух молекул Туг, связанных на а- и ß-субъединицах, около 35 А. Моделирование показало, что для транслокации Туг-тРНК11"' из синтезирующего центра в гидролитический достаточно изменения конформации З'-ССА-конца тРНК (рис. 9). Наиболее вероятная каталитическая функция PheRS состоит в правильном размещении субстрата относительно активированных молекул воды в гидролитическом центре: молекула WU2 может участвовать в нуклеофильной атаке карбонильного атома С Tyr-остатка, связанного сложноэфирной связью с тРНК; молекула W99 может выступать в роли донора протона для уходящей группы (см. рис. 8). Модуль ВЗ-В4 отличается топологией от гидролитических доменов других aaRSs, и, как показал структурный анализ фрагмента ß-субъединицы PheRS Р. horikoshii (Sasaki et а!., 2006), его трехмерная укладка сохраняется в различных PheRSs (несмотря на наличие функционально важных вставок, характерных для эубактериальных или эукариотических и им подобных архебактериальных ферментов (см. рис. 3).

Рис. 9. Структура половины молекулы PheRS, показывающая ориентацию З'-конца тРНК''|1е (по данным для PheRS-TPHKptlL'-PheOH-AMP-компдекса, описываемого далее) относительно молекул Туг (фиолетового цвета), связанных в основном активном и гидролитическом центрах. Измененная конформация ССА-конца (синего цвета) необходима для переноса Tyr-остатка на ß-субъединииу.

2. Молекулярные основы специфичности взаимодействия PheRS с тРНК 2.1. Выявление элементов узнавания тРНК1'" фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus с помощью кинетических экспериментов in vitro

Для идентификации элементов узнавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus (Tt} были изучены субстратные свойства тРНК|>11е-транскриптов Е. coli и дрожжей (Ее и Sc), содержащих замены нуклеотидов в различных положениях (рис. 10).

А А

с с

с с

5' а—-G.C.U 6. а—с g • с aa—g-c —u"

с • g с • g g »сg-суо

С•G в-U

е-с а•и и 9

с е'с * ,, и - А V I,

\ - ( и А- U " А UU'A Ъ А

ц u а |а gag с с и^а „а" gacac

N: cucfe „„г им kg и cues

гд-cuugg „ и cucg g*cugug

_ 3d с .... ,

g gag с\ С" u ц 9 е gagc \ с '

^.cu u.u;g.«a- /®с.g g s „ u) г

I 1 A C.e Рис. 10. Структуры tPHR"1-

c.g.a л "o ■ ci . ua a.n C,. 1 A i с,. ,e>

g-cv UA „A'u» _ транскриптов Ее (А) и 5c (Б).

Стрелками показаны замены

30g • c« g ■ с-

а • u с*—а • u-

А.С*

и а ел нуклеотидов в мутантиых

ja и g тРНК1'1"''; замены в составе

/в f \ а \ множественных мутантов

отмечены звездочкой.

Плазмидные ДНК, содержащие гены тРНК"1' дикого типа (д т) и их мутантные формы под контролем промотора Т7 PHK-полимеразы, сконструированы в лаборатории проф О С Улекбека (Университет Колорадо, США) Для мутантов тРНК Ее. самого эффективного гетерологичного субстрата, кинетические исследования выполнены в разных условиях Основные измерения проводились при 37° и двух концентрациях MgCl2, оптимальных для тРНК№е 77 и Ее, природных и транскриптов (9 мМ), или для большинства мутантов (15 мМ) (табл 4) Посттранскрипционная модификация tPHK11"-не важна для аминоацилирования в этих условиях, конформационные особенности транскриптов даже более предпочтительны при высокой [MgCl2] Заметное влияние на кинетику аминоацилирования тРНК11"' при [MgCl2]=15 мМ (использованной в экспериментах с PheRSs Ее и Sc, Tinkle-Peterson & Uhlenbeck, 1992, Sampson et al, 1990, 1992), оказывают лишь замены вантикодоне и третичной пары нуклеотидов G19-C56,

Таблица 4. Кинетические характеристики* аминоацилирования тРНК1 '""-транскрипта Е coli и его мутантных форм фенилаланил-тРНК-синтетазой Т thermophilus при 37°

тРНК"4'" 9 мМ MgCl2 15 мМ MgCl2

к"„п мкМ KJ dJ Km, мкМ К ¿i

тРНК'111 Т theimophihis тРНКИ1С-транскрипт Ti д т тРНК|1к-транскрипт йдт 0,12 0,14 0,18 0,73 0,88 L0 М 1,1 Lü 0,12 0,16 0,19 0,50 0,85 LO 0,79 1,0 LO

G34A (0,89)" 3,4 0,10 0,0053 1,4 0,49 0,066

G34C/A35U (0,89)" 10 0,032 0,00058 8,9 0,13 0,0028

А36С 0,44 0,24 0,10 0,36 1,3 0,69

G27A/C43U, G28A/C42U (1,0)" 0,21 0,88 0,75 0,23 1,2 0,99

U16C 0,23 1,1 0,86 0,18 0,98 1,0

C17U 0,18 1,2 1,2 0,19 1,2 1,2

U20C (0,19)" 0,34 0,52 0,28 0,28 1,2 0,81

U20G (0,15)" 0,36 0,86 0,43 0,19 1Д 1,1

U20A (0,19)" 0,43 1,0 0,42 0,28 1,5 1,0

C56U (0,86)г 0,46 1,0 0,39 0,32 0,94 0,56

G19A/C56U (0,72)' 0,44 0,37 0,15 0,28 0,90 0,61

G19U/C56A (0,75)' 0,59 1,0 0,30 0,30 1,5 0,95

G19U/C56G (0,53)г 1,9 0,59 0,056 0,84 1,4 0,32

C56G (0,50)г 2,0 0,41 0,037 1,2 1,2 0,19

G19U/C56U (0,37)' 1,9 0,26 0,025 1,1 1,3 0,22

G10A/C25U (0,53)" 0,34 0,36 0,19 0,27 1,1 0,77

U45G (1,0)" 0,17 1,1 1,2 0,18 1,1 1,2

G44C (0,14)" 0,24 0,47 0,35 0,25 1,3 0,99

A26G/G44A (0,88)" 0,26 1,1 0,76 0,22 1,2 1,0

A73G 0,20 1,0 0,90 0,19 1,0 1,0

A73U 0,18 0,51 0,51 0,18 0,98 1,0

А73С 0,19 0,69 0,65 0,19 1,0 1,0

тРНК""~1111 (1,0)" 0,18 0,62 0,62 0,19 1,0 1,0

tPHK'mu"""l(0,10)' 0,32 0,060 0,034 0,28 0,25 0,17

■"Приведены (и далее в табл 5, 6 и 9) средние значения 2-4-х независимых измерений, ошибка для и К„, не превышала 10% "Мутанты тРНК№1 Ее, данные для тРНК',к 7>, природной и транскрипта, приведены для сравнения Значения ки, и &Ы,/Л"Ю нормированы на соответствующие константы для тРНК'^-транскрипта Ее д т "ГВ скобках скорости сайт-специфичного расщепления ионами свинца по данным (Ттк1е-Ре1ег5оп & иЫепЬеск, 1992) или фотопревращения тРНК (при облучении УФ-светом 1=254 нм), нормированные на соответствующее значение для тРНК -транскрипта д т тРНК |,1Г^№е и трнк1Ма~*|,,к - химерные тРНК (описаны в тексте)

мутанты С44С и 010А/С2511 с измененной трехмерной конформацией эффективно аминоацилируются Данные структурного тестирования ряда мутантов заимствованы из литературы, для оценки влияния замен 019 и С56 на трехмерную укладку тРНК нами применен метод фотосшивок нуклеотидов, сближенных в третичной структуре (ВеЫеп е< а/, 1992) Замены нуклеотидов Ш6, С17 и в антикодоновом стебле, а также мутации третичных нуклеотидов А2бО/С44А и 11450, не влияющие на формирование общей структуры тРНКРЬе, не проявляются и при [М§С12]=9 мМ или приводят к очень слабому уменьшению величины к^Кт (в 1,3 раза) В то же время в этих условиях обнаружено влияние замен 1120 и А73 на эффективность аминоацилирования тРНК'Ье Изменения в структуре тРНКРЬе, обусловленные заменами 019 и С56, гораздо более критичны, чем изменения в результате замены других третичных нуклеотидов они приводят к потере кса/Кт в 18-40 раз или 2,8-5,3 раза соответственно Зависимость эффектов от [М£С12] может быть объяснена влиянием мутаций на сродство тРНК№е к ионам металла Из анализа данных следует, что 1) эффективность аминоацилирования в исследуемой системе зависит в первую очередь от идентичности антикодона, 034 - важнейший элемент специфичности, 2) нуклеотиды, образующие третичные пары А26-044, 019-С56 и тройку С25-ОЮ-и45А, ответственны за поддержание необходимой трехмерной структуры тРНКРЬе, ведущая роль принадлежит паре 019-С56, 3) природа нуклеотидов 1120 и А73 важна для создания оптимальной локальной конформации субстрата

Для некоторых тРНКР1и кинетические параметры были измерены при более высокой температуре (табл 5), выбранной с учетом сохранения третичной структуры тРНК№е-

Phe

in

транскрипта д т (Sampson et al, 1988) Положительное влияние модификации тРНК vivo на величину kcJKm аминоацилирования при [MgCIJ=9 мМ свидетельствует о

структурной роли миноров в

Таблица 5. Кинетические характеристики аминоацилирования мутантных форм тРНКИ|е PheRS Т thermophilus при 60г

Ее

трНКРЬ(.) мкМ L. б.» *4at UKj' * [UKJ^V [kzai/Кщ ]

трНКР1ю п 0,13 (0Д2) 0,65 (0,95) 1,0 (1,7) 0,79 (0,65)

тРНК' ""-тран Ее д т 0,20 (0,21) LÜ (Lffl 10 (Lffl 0,46* (0,61)*

G34A 4,8 (14) 0,38 (0,065) 0,016 (0,00098) 4,1 (5,4)

U20C 0,61 1,0 0,33 2,4

U20A 0,52 1,3 0,50 2,0

C56U 0,54 1Д 0,41 1,4

G19U/C56A 0,53 1,0 0,38 2,5

G10A/C25U 0,70 0,91 0Д6 3,0

A26G/G44A 0,28 0,82 0,58 1,7

A73G 0,20 0,90 0,90 1,1

A73U 0,31 0,87 0,56 1,8

А73С 0,25 0,91 0,73 1,4

"Мутанты тРНК Ее, тРНКр Т1 природная "Значения в скобках получены в присутствии 9 мМ ОДСЬ, остальные при 15 мМ М§С1г 'Значения к_л и к_л/К,„ нормированы на соответствующие константы для тРНКРЬе-транскрипта д т гОтношение отн констант специфичности при 37° и 60°, для тРНКР1к-транскрипта д т приведены отношения абсолютных значений кы!Кт (отмечены *)

обеспечении оптимальной конформации тРНК в условиях функционирования термофилов Повышение температуры влияет на эффективность распознавания так же, как уменьшение [МиСЩ проявляются эффекты мутаций по положениям 20 и 73, становятся более критичными замены в антикодоне и нуклеотидов, стабилизирующих третичную структуру тРНК Одинаковый механизм действия этих факторов (дестабилизация структуры) свидетельствует о чувствительности фермента к изменениям в общей структуре тРНК и локальной конформации различных районов

Кинетические измерения аминоацилирования мутантных форм тРНКР1,е & в условиях, оптимальных для тРНКРЬе-транскрипта 8с дт (табл 6),

показали, что относительный вклад нуклеотидов из различных районов тРНКИк в величину к^м/Кт зависит по-разному от последовательности Эффекты мутации А73, С34 и А36 сохраняются или даже усиливаются, свидетельствуя о более эффективном распознавании ферментом

антикодона в составе тРНК||к с неоптимальной структурой Из обратных замен на нуклеотиды, характерные для тРНК1''"" эубактерий (С20и и ЫбА/Мбв), лишь С2(Ш-замена имеет незначительный положительный эффект Из четырех вариантов, дополняющих серию бактериальных мутантов (не считая замены А3511), только одновременная замена двух пар в антикодоновом стебле, 030-С40 и АЗ 1-1139, заметно (в 2,2 раза) снижает эффективность аминоацилирования Замены в Т-петле (1159С и С6(Ю) и акцепторном стебле (С!А/С72(_1) практически не влияют на величину Кл1Кт

Для проверки полноты набора элементов узнавания были измерены субстратные свойства химерных тРНК тРНКт

Таблица 6. Кинетические характеристики аминоацилирования тРНКИк-транскрипта Sc и его мутантных форм PheRS Т (hemophilus

тРНК11к-транскрипт Кт, МКМ км

тРНК11"" 5t д т 0,20 Lfl 10

G34A (0,93/ 14 0,30 0,0043

A35U (0,86)" 5,2 0,40 0,015

А36С 4,8 0,60 0,025

G30C/C40G, A31C/U39G (0,97)" 0,39 0,90 0,46

G20A (0,85)" 0,17 0,80 0,94

G20U (0,92)6 0,21 1,5 1,4

G26A/A44G (0,54)" 0,20 1,0 1,0

U59C (ОЛО)"1' 0,33 1,4 0,85

C60U (0,10)" 0,23 1,3 1,1

G1A/C72U 0,30 1,2 0,80

А73С (0,93)" 0,57 1,2 0,42

тРНКми"и'1" 0,14 0,83 1,2

трНК lyr-mu.) 0,36 2,0 1,1

тРНКлгг-™м.) 0,36 0,53 0,29

тРНК,ж//*дт 0,18 0,85 0,94

'Значения и kJKm нормированы на соответствующие величины для тРНК|1*"-транскрипта Si д т Реакция проводилась при 37° в присутствии 50 мМ MgCl2 (и 10 мМ АТР) В скобках отн скорости расщепления РЬ2+ по данным (Behlen et а!, 1992), "низкие скорости из-за структурных изменений в сайте связывания иона РЬ2+ 'Химерные тРНК

и тРНК|Мс'"Ик (рис

! 1) содержат ряд

элементов, специфичных для тРНК1|к эубактерий, и соответствующие структурные характеристики D-петли (a/ß=4/2, число нуклеотидов с 5'-/3'-конца от универсальных G18G19, определяющее трехмерную укладку), внесенные в тРНК г и тРНК|Ма Ее

AGAGCAUGCGACUGAAAAUCGCAGUGUCGGCGGÜTJCGAUUCCGCUCCUCGGCA AGAGCAGGGGAUUGAAAAtJCCCCGnGOCCOTGGUUCGATIDCCGAGtJCCGCGCA AGAGCAACGGACUGAAAADCCGUGUGUCGGCGGUUCGAOTJCCGUCCCGAGCCA AGAGCACACCCTOGAAAAGGGDGGÜGUCGGCAGTOCGAÜCCCTGCCüAaCAGCA AGCGCAÜCGGGCÜGAAAACCCGAGUGUCGTJCGGTJÜCAAUCCCGGCCCCCGCCA AGAGCGCCAGACUGAAGAOCmSGASGUCCOGUGOBCGAUCCACAGAATOCGCA AGAGCGUTJAGACUGAAGAUCUAAAGGUCCCUGGUUCGAUCCCGGGUUUCGGCA AGAGCGÜCAGUCUGAAAAÜCUGAAGGUCCAGAGUUCGAUCCUCDGCUGGAGCA GCGUCGGUAGCPCAGOTJ GGGiiAGAGCGCAAGACUGAÄAAtJCDTrGAGGUCGGGCGOTJCGACtJCGCCCCCGGCGCA GCGCÜCGtJSGCGÖAAUU GGG AACGCGUCUGACUGAAAAtJCAGAAGAUlTAtJGGGOTICGAÜCCCCAÜCGAGUGCA 1 10 20 30 40 50 "60 70

Рис 11 Сравнение последовательностей тРНК-транскриптов, тестируемых на аминоацилирование PheRS Tt Нуклеотиды, общие с тРНК1к Ее, показаны красным цветом, с тРНК''к Tt (и отличающиеся от tPHK''i,l Ei) - синим, общие в эукариотических тРНК с тРНК11к Sc (и отличающиеся от тРНКИх Tt и Ее) - зеленого цвета В химерных тРНК подчеркнуты изменения соответствующих неспецифичных тРНК, их важные отличия от тР1 Гк'* " показаны на сером фоне А - удаление нуклеотида З'-ССА-конец не представлен Обозначения для организмов Tt - Т thennophilin Ее - Е coli, Hs - человек, Si - дрожжи, Bs - В subtilis

тРНК(Phe) Tt GCCGAGGaAGCÜCAGTTO GGD

TPHK(phe) Eo GCGCGGAUAGCOCAGÜC GGÜ

TPHK(Phe) Bs GGCUCGGUAGCUCAGOT GGU

TPHK(Thr-Phe) GCUGAtJAUAGCUCAGUU GGU

тРНК(fMet-Phe) GGCGGGGUGGCGCAGCCÜGGU

TPHK(phe) Sc GCGGAOTJUAGCDCAGOTJ GGG

*PHK(Phe) HB GCCGAAAOAGCUCAGUU GGG

TPHK(Met-Phe) GCUUCAGTJAGCUCAGTJA GGG ФРНК (Туг - Phe) ТРНК (Arg- Phe)

тРНКТ|""|ь" - прекрасный субстрат РИсК^Я 'П (см табл 4) уменьшение в 1,6 раза при 9 мМ 1У^С12 обусловлено, скорее всего, присутствием пар С30-040 и 031-С39 (не характерных для тРНК1Чк), остальные отличия относятся к нуклеотидам, варьирующим в

одинаково эффективно аминоацилируемых тРНК1'1 Tt, Ее и Bs Величина kLJKm для

тРНК

существенно ниже и сильно зависит от [MgCli] Наиболее вероятная

причина ее отличий от тРНК к - присутствие необычных нуклеотидов в позициях 9, 12 и 23, стабилизирующих крутой излом в структуре тРНКМи-,11,\ тРНКТу' и тРНКл,е~*''к содержат структурные элементы эукариотических тРНК№\ внесенные в неспецифичные тРНК Из них только 7РНКЛ'Г*11"" аминоацилируется РЬсКЙ 7г менее эффективно (в 3,4

раза, чем тРНК11к Sc, см табл 6), как и в тРНК'"

, в ней присутствуют G9, G12 и С23

вместо характерных для тРНК А9,1112 и А23 (см рис 11)

Результаты экспериментов по выявлению элементов узнавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Те с использованием двух наборов тРНК обобщены на рис 12

© Q консервативные в канонических тРНК • Ом О консервативные в тРНК14" О О специфичные для тРШСМубак-герий . О илиэукарнот

G • Ото О

О'О©

• о • 0(t) if

А • 1)

•©

® О варьирующие в активных тРНК С (А)

© ® N N элементы узнавания © 0

©®® ©®®

Рис 12 Элементы узнавания тРНК"'1 фенилаланил-тРНК-синтетазой Т гЬенпорЫЫч Нуклеотиды, варьирующие в эффективных бактериальных (А) и эукариотических (Б) тРНК-субстратах показаны кружками серого цвета, размер кружка пропорционален числу активных вариантов, черное кольцо показывает наличие замен разного типа или неконсервативных (пурин-пиримидиновых, пар А-11 на в-С и наоборот) Универсальный ССА-конец не показан

Три нуклеотида антикодона, замены которых оказывают самое сильное негативное влияние на аминоацилирование tPHK№l - наиболее вероятные кандидаты на прямое узнавание ферментом (красного цвета) Остальные элементы отнесены на основании эффектов или их зависимости от нарушений в пространственной укладке к структурным элементам узнавания (фиолетового цвета), обеспечивающим необходимую общую или локальную конформацию U20 и пара A26-G44 ответственны за более эффективное аминоацилирование эубактериальных tPHK'1il PheRS 77 в оптимальных для гомологичного субстрата условиях Нуклеотиды, варьирующие в полностью активных тРНК (в соответствующих идентичных условиях), сосредоточены преимущественно в акцепторном и Т-стеблях и верхней части антикодонового стебля Отсутствие эффектов мутаций показано лишь для некоторых из них, хорошая корреляция данных для двух наборов и наличие нескольких активных вариантов позволяют исключить наличие в этих районах существенных элементов специфичности Пониженная активность TpHK1Ma^№t и tPHKVs свидететьствует о существовании дополнительных элеменшв узнавания среди консервативных нуклеотидов, для которых влияние мутаций не изучалось

На основании полученных и литературных данных (Sampson et al, 1989, 1990, 1992, Tinkle-Peterson & Uhlenbeck, 1992, Nazarenko et al, 1992) выполнен анализ эволюционной консервативности элементов специфичности tPHKiv Ведущая роль антикодона универсальна, G34 критически важен для узнавания тРНК эубактериальными PheRSs (Ее, Tt), а А35 - эукариотическими (Sc, Hs) А73 и U(G)20 - общие, более существенные для тРНК11"" эукариот, элементы специфичности Основной вклад третичных нуклеотидов из D- и Т-петель в создание оптимальной трехмерной укладки тРНК1'^ также консервативен Повышенная чувствительность бактериальных PheRSs к заменам третичных нуклеотидов A26-G44 и U45-G10-C25 обусловлена необходимостью более

тонкого распознавания общей архитектуры Анализ сходства тРНК11^' Ее, 77, Яс и Нь с другими тРНК тех же организмов показал, что в бактериях более многочисленны тРНК, имеющие идентичные с тРНК1'1"' элементы в антикодоне и структурные характеристики V- и Э-петель, но отличающиеся природой нуклеотидов в позициях 26-44 и 25-10-45

2.2. Изучение функциональной роли элементов узнавания тРНКр1ю 2.2.1. Идентификация нуклеотидов тРНКр|№, образующих контакты с PheRS, с помощью s U-индуцируемой аффинной модификации

4-Тиоуридин (s4U), как реакционноспособный компонент аффинных аналогов РНК, обладает необходимыми характеристиками для локализации близких контактов между взаимодействующими биополимерами в условиях, исключающих их фотодеградацию (Favre, 2001) 84и-Содержащие аналоги тРНКи'1 Ее были синтезированы транскрипцией ш vitro 1) включением s4U вместо 16 остатков U ([16s4U]-tPHK ), 2) статистическим включением s4U в условиях синтеза моно- ([1s4U]-tPHKpik) и дизамещенных тРНК Для разделения молекул тРНК по степени замещения и их анализа использовали метод аффинного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), сополимеризованном с ртуть-органическим соединением (АРМ) (Igloi, 1988) Измерения кинетических параметров аминоацилирования показали, что замена любых 1-2 остатков U на s4U в тРН!\Ик не влияет на ее взаимодействие с PheRS Tt При облучении УФ-светом (1=337 или 365 нм) наблюдалось ковалентное присоединение з4и-замещенных тРНК1>к к PheRS, удовлетворяющее критериям аффинного мечения 1) полной инактивации фермента (в условиях многооборотной реакции аминоацилирования) соответствует присоединение 1,80(±0,06) моль на моль функционального димера, 2) уровень мечения

снижался в присутствии тРНКр,к Важнейшим доказательством специфичности мечения является обнаруженная

нами способность [Is U]-tPHK с аминоацилироваться в ковалентном комплексе с PheRS Белок с присоединенной |4С-меченой [ls4U]-TPHKPhl" отделяли от свободного тРНК-аналога (рис 13) и измеряли стехиометрию мечения и включения [4H]Phe в комплекс (в стандартной смеси, не содержащей тРНКр|к) Амино-ацилирование тРНК1>1к в ковалентном комплексе катализируется присоединенной PheRS, а не примесью свободного фермента неактивный как субстрат тРНК1>^-аналог, укороченный с З'-конца, не ингибирует реакцию аминоацилирования комплекса Уровень акцепторной активности ковалентно присоединенной тРНК - -60% исходной активности [ls4U]-тРНКи"' - свидетельствует о том, что большинство комплексов, различающихся позициями сшивки, имеет функционально активную конформацию

Для идентификации позиций s4U, образующих сшивки с PheRS, была разработана процедура тонкого фракционирования f 1 s4U]-rPHKlhL в 8%-ном аффинном ПААГ

тРНК +PheRS

600 700 Объем мюента, мы

Рис. 13 А - Разделение гель-фильтрацией ковалентного комплекса РЬеИБ 7'/ с [1541Л-тРНК и неприсоединившегося тРНК-реагента Б - Аминоацилирование присоединенной к РЬеИЭ [^Щ-тРНК'1" (материал 1-ого пика) и свободной тРНКИ|с (контроль) в отсутствие или в присутствии тРНК11,е-С75 Концентрации РЬе!^ (комплекса и свободного фермента в основном эксперименте) 40 нМ, [154и)-тРНК1''"; в комплексе и тРНК"* в контроле 15 нМ, тРНК№-С75 4 мкМ

6660595554:

5|50: 4745" 3933,,:

/ 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 тРНК [ЬП^-тРНК тРНК

Т1 I 2 2' 3 4 5 67 из ■„--§ ----- •

2016-

высокого разрешения и дополнительного разделения одной из семи фракций на две (2 и 2') в 15%-ном денатурирующем геле. Для анализа фракций продукты их частичного щелочного гидролиза разделяли с помощью аффинного электрофореза (рис. 14): задержка &411-содержащих фрагментов приводит к появлению брешей в регулярном наборе полос либо уменьшению их интенсивности и появлению дополнительных полос (в неоднородных фракциях). Большинство полученных фракций представляло собой сложные смеси, что не позволило идентифицировать все возможные позиции включения в4и (см. далее табл. 7).

Рис. 14. Анализ продуктов частичного ОН-гидролиза фракций 5'--,:Р-меченой [1з411]-тРНК в 15%-ном ПААГ (в присутствии АРМ 2 мкг/мл и 7 М мочевины). В контрольных экспериментах (дорожки 2 и 12) и для анализа последовательности с помощью РНКаз использовали незамещенный тРНК11"-транскрипт. Время ОН'-гидролиза: 1 мин - дорожки 2-10, 2 мин - 12. Бреши и менее интенсивные полосы (по сравнению с контрольными) показаны белыми треугольниками, дополнительные полосы - черными; слева отмечены позиции 541!(11).

Разделение продуктов УФ-индуцируемого присоединения фракций (и4и]-тРНКИк' к РЬе!^ (рис. 15, А) и анализ их выходов показали, что фракции образуют с разной эффективностью сшивки с а- или Р-субъединицами. Природа ковалентных аддуктов установлена в отдельных экспериментах: продукты присоединения [^Щ-тРИК^' и [1б54и]-тРНК''1!е (меченных статистическим включением [а-,:Р]АМР) к РИеЯЗ после их разделения подвергали гидролизу РНКазой А или бензоназой и повторному анализу электрофорезом. Наряду с мечением отдельных а- и (3-субъединиц (аддукты 1 и II. кажущиеся мол. массы 55 и 100 кДа соответственно) обнаружено образование высокомолекулярных аддуктов (III и IV) в результате мечения минорных примесей (М| и М2, устойчивых олигомерных форм РИе!^) и одновременных сшивок тРНКРЬе с разными субъединицами (из-за наличия примесей $ и-дизамещенных тРНК и незначительного прямого фотолиза). Образование продуктов Г и 1Г обусловлено расщеплением тРНК в ковалентных аддуктах I и 11.

Эффективность образования фотосшивок*

фракции (и'и1-]РНК

3

тРНК""

Т1

-^193= - - „ - . IV

м-112= Р - - - # - пи

' 70- т —

574 -I 1- г

V —1 .

Фракция ¡Ь^-тРЫК

Продукт 0' 0 1 2 2' 3 4 5 6 7

1 0.5 1.8 4.5 25.4 2.7 9.6 5.2 3.7 5.0 5.4

Г 0,34 0.70 0.51 0.29 0.37 0.35

11 0.05 0.08 0.56 0.36 5.5 0.30 0.81 0.28 0.27 0.40

1Г 0.12 0.65

*9с присоединенного аналога от общего количества (предельные по времени значения). в пробе

Рис. 15. Разделение с помощью Оз-№-ПААГ-электро-фореза продуктов аффинной модификации РЬе!^ 7>, облученной УФ-светом в присутствии 5'-<2Р-меченых: А - фракций [1э и]-тРНК (1=365 нм); 0 и 0' - тРНК1>ы-транскрипты. полученные в присутствии или в отсутствие 84иТР, не задерживающиеся в АРМ-геле; Б - природных тРНК Ее и 77 (1=337 нм). Отмечены положения белков-маркеров мол. масс (кДа), субъединиц и минорных полос РЬеИЗ (а, (3, и М2) и указаны продукты мечения фермента (справа, А и Б). Концентрации РЬеЯЗ 2 мкМ, тРНК14"' и тРНКи"'-транскриптов 0,2 мкМ; время облучения 30 мин.

Продукты мечения а- и ¡3-субъединиц после разделения подвергали гидролизу протеиназой К, затем частичному щелочному гидролизу. Разделение гидролизата в секвенируюшем геле и его анализ в сравнении с продуктами гидролиза тРНКр1и' позволяет идентифицировать позиции сшивок в тРНК: уменьшение подвижности тРНК-фрагментов с присоединенным пептидом приводит к появлению бреши в наборе полос в позиции сшивки (пример такого анализа представлен на рис. 16). Наличие слабых полос в районах сшивок обусловлено неоднородностью фракций [)54и]-тРНКр1и' и частичным разрушением аддуктов в процессе выделения и гидролиза, отсутствие четких полос после бреши - неоднородностью протеолитических фрагментов. Использование частично фракционированных ,ч4и-замещенных транскриптов позволило выявить шесть нуклеотидов тРНК11ю, взаимодействующих с а- или Р-субъединицами РЬеЯБ (табл. 7).

Таблица 7. Идентификация позиций s4U в tPHKiv, образующих сшивки с PheRS Tt

i 2 з 4 s

тРНК jPHK-a

T1U2

тРНК№с, [1S4U]-TPHK№ (фракция) Позиция s4U в тРНК Позиция s4U, образующего сшивку

a ß

тРНК™ Ес 8 8

[1S4U]-TPHK (1 ) 32" H.H." н.и."

[1S4U]-tPHK (2) 12,20 20 12

[1S4U]-tPHK (2') 39 20 39

[Is4U]-tPHK (3)" 50 45 33

[1S4U]-tPHK (4)" 16 н.и." 33

[1S4U]-TPHK (5)" 59 н.и." н.и."

[1S4U]-TPHK (6)" 51,54 47 н.и."

[1S4U]-TPHK (7) 60 н.и." н.и."

"Сложные смеси. Содержит примесь тРНК, дизамещениой в позициях 32 и 33. "Не идентифицировано.

Рис. 16. Разделение в 20%-ном денатурирующем ПААГ ковалентных аддуктов а-субъединиц с фракциями 2 и 3 5'-32Р-меченой [к4и]-тРНК после их протеолиза и частичного щелочного гидролиза (дорожки 4 и 5). В контрольном эксперименте и для анализа последовательности (дорожки 1-3) использован незамещенный тРНК'^-транскрипт. Позиции сшивок в тРНК отмечены треугольниками.

Данные независимого анализа позиций s U в продуктах аффинного мечения и в соответствующих фракциях [ls4U]-TpHKphl' совпадают лишь частично, и некоторые фракции образуют одинаковые сшивки. В этом нет противоречия, поскольку минорные компоненты сложной смеси могут образовывать основные продукты сшивок. Дополнительный контакт выявлен в экспериментах с природными тРНКр1к (рис. 15, Б), присоединяющимися с низкой эффективностью (2,6-3,5%) к а-субъединице PheRS.

Результаты идентификации нуклеотидов тРНКИк, образующих близкие контакты с PheRS Tt, полученные с помощью 84и-индуцируемого аффинного мечения и другими методами в параллельных исследованиях, представлены для сравнения на рис. 17. По данным РСА (Goldgur et а!.. 1997) в связывании каждой молекулы тРНК участвуют все субъединицы: домены А1-А2. В1, ВЗ и В6-В7, контактирующие с D-стеблем, V-петлей и акцепторной ветвью, принадлежат одному aß-гетеродимеру, антикодонузнающий домен В8* и биспираль СС*, взаимодействующая с тРНКр1к со стороны V-петли и угловой части L-формы, - второму гетеродимеру. Большинство контактов образовано с участием рибозофосфатного скелета; в специфические взаимодействия вовлечены антикодон и А76. Четыре нуклеотида (8, 12, 20 и 39) из идентифицированных нами контактов, защищаются от расщепления в экспериментах по тиофосфатному футпринтингу (Kreutzer et ai, 1995), и лишь U12 контактирует с белком в кристаллическом комплексе.

и 056

СС*

Остальные позиции сшивок (33, 45 и 47) расположены по соседству с контактами, локализованными с помощью РСА и футпринтинга. В целом результаты исследований разными методами в растворе лучше согласуются друг с другом, чем с данными РСА, свидетельствуя о формировании динамических контактов между тРНК и PheRS в условиях функциональной активности. Все сшивки с а-еубъединицей сгруппированы в районе контакта тРНК с биспиралью; основания нуклеотидов 8, 20, 45 и 47 находятся на расстояниях 8-15 Ä от ближайших остатков белка. Образованию сшивок способствует конформационная подвижность домена СС (для него характерны самые высокие значения температурных факторов), а также нуклеотидов тРНК'*|к. С труктур-ные изменения V-петли при взаимодействии с PheRS предполагаются на основании данных футпринтинга и РСА. U12. U33 и U39 расположены в районах контактов с доменом В8*. самым подвижным фрагментом ß-субъединицы; расстояния между основаниями и ближайшими остатками PheRS 6-9 Ä. Интенсивное расщепление тРНК в продуктах сшивки s4U 12 с ß-субъединицей (см. рис. 15) может быть обусловлено деформацией D-петли в комплексе тРНК с PheRS (в районе 16-ого нуклеотида по данным РСА и футпринтинга) и ее усилением в ковалентном аддукте. Фиксация динамических взаимодействий трех элементов специфичности tPHK№l' (U20. U39 и U45) с PheRS позволила предположить механизм их непрямого узнавания: структура тРНК"" в соответствующих подвижных районах может быть деформирована в процессе взаимодействия с ферментом, что обеспечивает взаимную конформационную адаптацию макромолекул.

$4и-индуцируемые сшивки с

О |- контакты с ()Ьс(;8 с участием скелета Ц ' или оснований по данным РСЛ

• I- чащита или усиление расщепления ' 1 в комплексе с по данным

тиофосфатного футпринтинга

Рис. 17. Сравнение районов контакта тРНК1,1" с РЬе!« П идентифицированных разными методами. Звездочкой отмечены домены второго ар-гетеродимера.

2.2.2. Относительный вклад структурных элементов г РНК1'1" в эффективность ее распознавания ферментом на стадии связывания

Для оценки эффективности распознавания тРНК в процессе комплексообразования с 77 и выявления элементов, ответственных за специфичность, были измерены равновесные константы диссоциации (Ккомплексов с мутантами тРНК№с Ее и другими тРНК методом задержки в геле в условиях, близких (по значениям рН и [1У^СЬ]) к условиям реакции аминоацилирования (рис. 18). Анализ данных (табл. 8) показывает, что идентичность антикодона критически важна для эффективного комплексообразования; ведущую роль играет 034, образующий наибольшее число специфических

[PheRSI 0 4 [5 25 60 0 2 5 8 12 [PheRS] 0 20 50100^00 0 1кМ) - (нМ)

м т

гРНК

в комплексе

Рис. 18. Разделение продуктов комплексообразования PheRS 77 с тРНКи""'-транскриптом Ее (А) и G.34C/A35U-MyraHTOM (Б) с помощью электрофореза в 6%-ном ПААГ в присутствии 9 мМ MgCk

Таблица 8 Сравнение эффективности связывания и аминоацшшрования различных тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазоЙ Т ¡НегторЫш

тРНК" мкМ (ад")" ад»'"" ^1.41 тРНК" ЛГа", мкМ тк^г к/ /ив

тРНК"11 Ее 0,005 10 10 1116С 0,010 (2) 1,3 0,91

тРНК™ Ее 0,015* и20С 0,025 (5) 1,9 1,9

ОМА вМА С34С/А35К 1,2 (240) 1,6* 1,6 (320) 19 56 10 31 и2(Ю 1120 А и20А 0,030 (6) 0,040 (8) 0,080* 2,0 2,4 1,2 1,0

А36С 0,15 (30) 2,4 4,2 А73и 0,005 (1) 1,0 2,0

С5би 019А/С5би С19и/С56А С!9и/С56С 019ШС56С 0,040 (8) 0,060 (12) 0,060 (12) 0,16 (32) 0,25* 2,6 2,4 3,3 11 1,0 2,7 1,0 1,7 А73С А73С А73в -А76' -А76г 0,005 (1) 0,012* 0,005 (1) 0,008 (1,6) 0,012* 1,1 1,1 1,4 1,0 над

С56С С19и/С5би 0,20 (40) 0,35 (70) 11 11 2,4 3,8 тРМК"" 'П* тРНК"1^"11 0,005 (1) 0,0075 (1,5) 0,67 1,0 1,4 1,6

11450 С10А/С2511 0,005 (1) 0,020 (4) 0,94 1,9 0,91 2,8 тРНК1М^№ тРНК№ //л 0,015 (3) 0,080 (16) 1,8 4,6 17 1,1

в44С А260/С44А 0,020 (4) 0,040 (8) 1.3 1.4 2,1 0,91 тРНКл|л Ее тРНКлч,5с* 0,57 (114) 15 (3000) 20 1,7 н а1

С27А/С43и, С28А/С42и 0,005 (1) 1,2 1,1 тРНК^'а* 12 (2400) н а '

"тРНК-транскрипты, ^отменены природные тРНК 6Средние значения 3-4-х измерений, ошибка не превышала 15%, 'отмечены величины измеренные в присутствии РЬеОН-АМР "Степень увеличения и Кт или уменьшения С» по сравнению с характеристиками тРНК''1"- й дг 1 Укороченный с З'-конца на один нуклеотнд зРШх -транскрипт Ее д т 'Не аминоацилируется

контактов с РЬеЯЭ по данным РСА (Goldgur е! а/, 1997) Значительная зависимость эффективности связывания от природы нуклеотидов третичной пары 19-56 доказывает функциональную значимость ее взаимодействий с РЬеЯЗ в кристаллическом комплексе, в которых наряду с рибозофосфатным скелетом участвуют основания, образующие ван-дер-ваальсовые контакты с гидрофобными остатками (не описанные ранее) Отсутствие строгой корреляции между эффектами замен на величины Кй и стабильность третичной структуры тРНК (см табл 4) указывают на то, что связывание зависит от изменений в общей и локальной структуре тРНК1'1'1 Из сравнения изменений величин Кл и кы1 в результате мутаций нуклеотидов, образующих третичную пару С19-С56 и тройку ОЮ-С25-1!45, (см табл 8) следует, что активность в катализе выше для более стабильных комплексов Противоположная закономерность для замен третичной пары А26-С44 и 1)20 - чем нестабильнее комплекс, тем он эффективнее в катализе -согласуется с идеей о том, что увеличение конформационной подвижности комплекса способствует формированию его функционально активной структуры Таким образом, структурная роль нуклеотидов центральных районов тРНК1'1*" неодинакова 019-С56 и С1()-С25-и45 стабилизируют необходимую для оптимального связывания и аминоацилирования трехмерную структуру тРНКи'\ идентичность Ш0 и пары А26-044 важна для конформационной подстройки тРНК в процессе взаимодействия с РЬеК5 Небольшой эффект замены 1Л6С на можно объяснить участием 1Л6 (расположенного вне зоны контактов тРНК1'1"' с РЬеИБ) в перестройке Б-петаи, предполагаемой на основе независимых исследований (как описано выше) Специфичность А73 не проявляется на стадии связывания, и этот элемент важен только для эффективного катализа Небольшое

уменьшение прочности комплекса в результате удаления А76 может быть обусловлено потерей локальных контактов с З'-концом, формирование которых не является предпосылкой для взаимодействия РЬеРЗ с другими районами тРНК1'^ Эффекты различных замен в тРНК1^ выражены отчетливее в изменениях величин /Сь чем значений Кт, и последние отражают неадекватно влияние мутаций на сродство тРНК к РЬеЯ8 Гораздо более высокие значения констант Михаэлиса по сравнению с величинами А"а не обусловлены влиянием малых субстратов на сродство тРНК"11 к РЬе!^ измеренные для ряда тРНК величины Кл в присутствии устойчивого аналога аденилата лишь в 1,3-3 раза выше соответствующих значений в отсутствие лиганда

Одинаковые значения Кл для комплексов с тРНК1'11 7 г и Ее (и близкие для комплекса с тРНКт|1Г~''1к), а также отсутствие эффектов мутаций пар А27-и43/А28-Ш2 указывают на то, что контакты между РЬе!^ и рибозофосфатным скелетом антикодонового и акцепторного стеблей стабилизируют комплекс, не обеспечивая специфичности Структурные различия между тРНК1'1"' и тРНК|Ма"Ик проявляются сильнее в величинах А.^, чем свидетельствуя о более важной роли тройки оснований А9-Ш2-А23 в поддержании правильной конформации тРНКИк на каталитической стадии, чем в процессе связывания Более низкое сродство тРНК1'111-транскрипта № к РЬеИ.? 7> по сравнению с бактериальными тРНК| |к обусловлено заменами и20 и пары А26-044 Три неспецифичные тРНК значительно уступают бактериальным тРНК11к в эффективности связывания с РЬе!^, из них только тРНКли ошибочно аминоацилируется тРНКдц и тРПКЧч> содержат 634, главный элемент специфичности тРНК11" (рис 19)

трнкгь* ть оссс^аеиАссисАяоиазо АгАЕСАТСсзАОТЗААМтссСАсизисавсоотФсоАгоссссиссиссосА трнкгь* Ее осзсонлиАссиСАСосааи АолесАВ(м<ЗАшгаААААисссссависалгазйос<ЗАоисссАзосс<зсасА тРНК*1* Ее азаОСВАСТАвСТГСАСЯКЗев АЗАЗСОСГОаСАиОЕСАивСААОАЙЗиСАССОЕПиСОАиСССССаПАОСиССА тенк"р 8с иесоиаАиызиичгААи веБС АОААисаассстосасеозагссАСА вссвзатч'СААииссссаасососса тРКК01" Ее (ЗиССССОиССиСТАСА ООСССАСОАСАССЗСССОТОСАССЮССаПАА САСОаатЧтаААОССССПАОаЗСАСа 1 10 20 30 40 50 60 70

Рис 19. Сравнение последовательностей неспецифичных тРНК с тРНК|1к Нуклеотиды, общие с тРНК1,1* £с, показаны красным цветом, с тРНК1"1 7'г (и отличающиеся от тР1 1К1Ъ~ Ее) - синим Модификации миноров в природных тРНК (подчеркнуты) не учитываются при сравнении Важные отличия неспецифичных тРНК от тРНК'1* показаны на сером фоне

тРНКА!'р и тРНК01" отличаются от тРНК1'1"' структурными характеристиками Б- и вариабельной петель, определяющими трехмерную укладку и локальную конформацию соответствующих районов тРНК Величины Кл в диапазоне 12-15 мкМ являются нижним уровнем неспецифического связывания тРНК для РЬеК8 77 100-3000-кратные различия в эффективности связывания специфичных и неспецифичных тРНК с РЬеК8 гораздо выше уровней дискриминации другими ааЯБв, характеризующимися в основном более низким сродством к специфичным тРНК (величины Кл порядка 0,1-1 мкМ)

3. Молекулярные механизмы, обеспечивающие продуктивное взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетаз с акцепторным концом тРНКр|";

3.1. Функциональные исследования взаимодействия различных РЬеГО^ с З'-ССА-концом тРНКр|!£

Модифицированные в З'-конце аналоги тРНКПк' (рис 20) синтезировали с использованием известных процедур окисления концевой рибозы, ступенчатой деградации тРНК

и достраивания тРНК в присутствии концевой СТР(АТР) тРНК-нуклеотидилтрансферазы или РНК-лигазы, целевые продукты выделяли с помощью электрофореза в аффинном или денатурирующем геле 3'-84и(860-3амещенные аналоги тРНК получены впервые

тРНК -С75-

♦тРНК^-з'Шб

1 рэ 1)р РНК-лигаза ^ 2 щ фосфатаза

1 N310,

2 анилин

3 щ фосфатаза ¿Ш£-- тРНК~-8'1П5

тРЦК~-С74-

тРНК~-2'<1А(3'<1А)76

1РНК"*-8'и75

;*ир

■лигаза 2 щ фосфагтаза

тРНК1

нуклеогидил-трансфераза

1 №10,

2 анилин

3 щ фосфатаза

"-А73

рСрСрА /рИр1ГрА/(ри)Л?С), РНК-лигаза

тРНК~-ССА/тРНК""-ииА/тРНК"*-иии/1РНК""-ССС

Рис 20 Общая схема синтеза З'-модифнцированных аналогов тРНК1111 Реакционноспособные аналоги получены на основе тРНК'1*-транскрипта Ее (модификации в рамках слева), остальные - на основе природных тРНК (модификации в рамках справа)

Результаты кинетических измерений (табл 9) показывают, чю нативная структура ССА-конца важна для эффективного связывания тРНК11к РЬеКБ 77 (в условиях реакции аминоацилирования) и каталитического превращения Отсутствие имидазольного цикла или 6-МН2-группы в акцептирующем нуклеотиде (при замене А на С или ь('С) снижает существенно величину к^я/Кт аминоацилирования, а утрата обоих элементов приводит к

Таблица 9 Влияние модификации З'-ССА-конца на субстратные (ингибиторные) свойства различных тРНК1'и

тРНКР1М.| РЬеЯ5 и тРНК1111 Т ОгеипорЫич РЬе!^ и тРНК,|к Е соП

КЖ)\ мкМ к ■ 1УС КЮ(К,)*, мкМ 1 * ГГ|

тРНК"к-ССА" 0,30 м 10 0,60 10 10

тРНК'1к-ииА" 0,98 0,40 0,12 1,3 0,25 0,12

тРНК№-ССС" 0,035 0,0070 1,6 0,015 0,0056

тРНК'^-ААА" <0,0001 <0,0001

тРнк'^-иии" н а н а

тРНК"^-А76" 0,16 1,0 1,0

тРНК"к-2'(Ш6* н а

тРНК'^-З'сШб* 0,16 0,03 0,03

тРНКИк Ее и РЬек8 77 тРНК11* и РЬеК.Я человека

тРНК'111-транскрипт тРНКи"--5вС76 0,19 1,0 10 0,014 10 0,0027 0,11 10 10

тРНК"к-$4и76 0,92 (4,8) н а 0,64 (3,8) н а

тРНК""-Ср75 1,0 (5,3) н а 0,69 (4,1) н а

тРНК' "1-54и75 1,0 (5,3) н а 0,71 (4,2) н а

тРНК'^Ш? 0,58 (3,1) н а 0,40 (2,4) и а

"Аналоги на основе природных тРНК'1"", контрольные препараты реконструированы тем же способом 6Величины Л1, для неаминоацилируемых (н а ) конкурентных ингибиторов, в скобках отношение А7", к Кт для тРНКИм-транскрипта д т величины к^ и к.х/Кт нормированы на соответствующие константы для контрольного субстрата в каждой серии Реакция проводилась при 37° с РЬеЯБ 77 и Ее или при 25° с РЬеНЯ № в оптимальных для каждого фермента условиях

потере субстратной активности Позиции 74 и 75 могут быть заняты пиримидинами, хотя остатки С предпочтительнее для эффективного аминоацилирования Для первичного присоединения Phe-остатка используется 2'-ОН-группа, но З'-ОП-группа положительно влияет на каталитический акт Существенный вклад ССА-конца в величину кы1/Кт реакции (сопоставимый с вкладом основных элементов специфичности) указывает на его активное участие в формировании продуктивного комплекса Сравнимые эффекты модификаций З'-конца на субстратные и ингибиторные свойства тРНК11*' в реакциях, катализируемых различными PheRSs, свидетельствуют об эволюционно консервативной роли ССА-конца в продуктивном взаимодействии тРНК11к с ферментом

При исследовании кинетики аминоацилирования тРНКv PheRS Tt в широком диапазоне условий обнаружено избыточное включение Phe в тРНК-субстрат, уровень которого зависит от концентраций фермента, тРНК и Phe, от типа и pH буфера PheRS Ее не обладает таким свойством С помощью отработанной хроматографической процедуры (на носителе ионно-гидрофобного типа LiChrosorb RP-18/Adogen 464) выделен продукт бис-аминоацилирования со стехиометрией включения 1,85 моль [14C]Phe на 1 моль тРНК (Phe2-TPHK1>hL), который образуется в -50 раз медленнее, чем РЬе-тРНК11к На основании данных о стабильности Phe-TPHKI>,K и Phei-тРНК'1" и хроматографического анализа их продуктов рибонуклеазного гидропиза сделано предположение об образовании 6nc-2',3'-0-Phe-TPHKl lK в результате повторного аминоацилирования обычного продукта

3.2. Исследование конформационной динамики взаимодействия различных PheRSs

с акцепторным концом тРНКи,е с помощью метода аффинной модификации 3.2.1. Роль малых субстратов в функциональном связывании акцепторного конца тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Г thermophilus

При сопоставлении трехмерных структур комплексов PheRS-rPHK11'1 и PheRS-Phe-АМР обнаружено перекрывание сайтов связывания А76 и Phe-субстрата, что указывало на необходимость перестройки З'-конца в присутствии матых лигандов Взаимодействие PheRS Tt с акцепторным концом тРНК1>ь" в различных функциональных состояниях комплекса было исследовано с помощью аффинного мечения фермента З'-замещенными аналогами tPHKi1il Структура реакционноспособного нуклеотида во всех аналогах (см рис 20) предусматривает образование близких контактов (2-4 À, Favre et al, 1998, Hountondji et al, 1990) с модифицируемыми остатками белка, что делает эти реагенты пригодными для анализа конформационной динамики взаимодействия фермента с тРНК Две группы реагентов имеют свои преимущества и недостатки s4U и s6G характеризуются широкой специфичностью присоединения к аминокислотным остаткам, но их введение вместо А76 влияет на эффективность взаимодействия TPHKphL с PheRS (см табл 9), в диальдегидных производных сохраняется природа основания З'-концевого нуклеотида, но эффективность мечения ограничивается узкой специфичностью химического действия (модификация по остаткам Lys и Arg) При облучении УФ-светом s4U(s6G)-3aMeiueHHbix rPHKlv с PheRS или инкубации тРНК11к-Аох76 и тРНК',|к-С0Х75 (в присутствии цианборгидрида натрия) наблюдалось их ковалентное присоединение к белку (рис 21) Модификация фермента, более эффективная фотоактивируемыми аналогами, сопровождается инактивацией в соответствии со стехиометрией мечения функционального димера Набор продуктов мечения PheRS с различной подвижностью в Ds-Na-ПААГ идентифицирован с помощью нуклеазного гидролиза как ковалентные аддукты тРНК с а- или ß-субъединицами (продукты I-VI в случае фотоактивируемых аналогов) и с минорной примесью (VII) Неодинаковый вклад полианиона РНК в электрофоретическую подвижность аддуктов может быть обусловлен разным влиянием

его на степень разветвления полипептидной цепи и связывания детергента в зависимости от природы и положения модифицируемого остатка. В присутствии тРНК№е защищаются в равной степени все модифицируемые остатки а- и [3-субъединиц (и минорная примесь), что доказывает аффинную природу продуктов; таким эффектом не обладает суммарная тРНК, не содержащая тРНК1'

А

(см. для примера рис. 21, В).

.гРНК'"-$'и76 / тРНК^-С„75 193т. 86- ттшт г™1 ГЧУ

7057- ■ и I

3123456789 10 Концентрация реагента, мкМ 39-1 зьп

Таблица 10. Аффинная модификация РЬеЯЗ 7> аналогами тРНК'''1С-транскрипта Ее

Кошк'итриини гРНК^-8*и75, мк'М

Рис. 21. Зависимости предельного по времени уровня аффинного мечения РЬе!^ (1 мкМ) аналогами тРНК от их концентрации (А и Б) и сопоставление с остаточной активностью фермента в реакции аминоацилирования (А). В - Разделение с помощью Рй-Ыа-ПААГ-электрофореза продуктов (1—VII) модификации РЬеК5 1:Р-мечеными аналогами. Концентрации фермента и реагентов I мкМ, тРНК11"'' и суммарной тРНК 10 мкМ; время облучения (светом лазера, >.=337 нм) указано сверху. Мол. массы белков-маркеров (кДа) показаны слева.

Относительные выходы продуктов мечения РИе!^ различными тРНК-аналогами, сгруппированных в соответствии с кажущейся мол. массой (для упрощения описания), приведены в табл. 10. Наборы продуктов для 841]-содержащих или диальдегидных аналогов с положением способного одинаковы, демонстрируют ность взаимодействия соседних

акцепторного конца тРНК/ с разными субъединицами РИе!^ в соответствии с данными РСА. Основание 75-ого нуклеотида связывается (З-субъединицей (тРНК№с-84и75 присоединяется почти избирательно к большой субъединице). В связывании 76-ого нуклеотида, независимо от

различным реакцинно-нуклеотида Результаты специфич-двух

нуклеотидов

Ию

гРНК Относительный выход продуктов, %" а/р6

а Р

56-58 70 100 110 132 155-165

-в4и75 1,5 3,2 8,0 2,0 2,3 83 0,05

-з4Ш6 12 53 4,0 2,4 3,6 25 1.9

-54Ш7 83 4,2 1,6 1,4 0,8 9,0 6,8

-86С76 14 55 6,0 10 15 2.2

-Аох76 68 27 5,0 2,1

-С,»75 59(45) 35 (49) 6,0 (6,0) 1,4 (0,82)

*% от общего уровня мечения субъединиц. Указаны каж. мол. массы (кДа), диапазон - для неразрешенного набора аддуктов. Приведены средние значения 3-х измерений; отклонения 6-8% для минорных и 2^4% для остальных продуктов. Данные для фотоактивируем ых аналогов за 15-30 мин облучения, для тРНКи,е-А„,76 и тРНК™с-С<к75 за 120 мин (в скобках 15 мин) инкубации. "Отношение уровней мечения и- и (3-субъединиц.

природы основания, участвует преимущественно а-субъединица; эффективность этого взаимодействия увеличивается благодаря образованию специфических контактов с имидазольным циклом пуринов. Множественное мечение и отсутствие строгой селективности модификации а- и (3-субъединиц (даже в случае тРНК''|11;-А0Х76, структура которой предусматривает сохранение специфических взаимодействий) свидетельствуют о подвижности ССА-конца тРНК№е в комплексе с РЬе!^. Влияние малых субстратов на ориентацию З'-конца было изучено с помощью аффинной модификации фермента

аналогами, не обладающими субстратной активностью, что позволяет «замораживать» комплекс PheRS с тРНК hl и аминоациладенилатом на стадии, предшествующей аминоацилированию. Изменение мечения а-субъединицы в присутствии Phe-субстрата и(или) АТР (рис. 22) свидетельствует о модификации остатков активного центра: влияние на мечение |3-субъединицы. не претерпевающей структурных изменений при взаимодействии PheRS с малыми субстратами, отражает изменение ориентации З'-концевого нуклеотида тРНКи'°. АТР индуцирует более существенные эффекты на [ модификацию PheRS разными реагентами по сравнению с влиянием Phe-субстрата; действие двух субстратов не является аддитивным. Наиболее выраженное влияние Phe и АТР. присутствующих в отдельности или совместно, на мечение Р-еубъединицы аналогом тРНК -s4U76 и широкий набор детектируемых продуктов делают этот реагент эффективной пробой конформационной динамики взаимодействия PheRS с З'-концом tPHKiv. В целом, результаты свидетельствуют о том, что связывание Phe-субстрата и АТР и синтез аминоациладенилата индуцируют перестройки, определяющие ориентацию акцепторного конца тРПКи,е в продуктивном комплексе с ферментом.

I

I [

-I

1 I

Для установления роли Phe и АТР в создании функциональной ориентации З'-конца тРНК№е было исследовано аффинное мечение PheRS 3'-s4U -замещенными аналогами тРНК|1к Ее и Hs. Выбор двух тРНК обусловлен их различиями в эффективности связывания и аминоацилирования PheRS TV из-за замены трех элементов узнавания этим ферментом в тРНК№с Hs (U20G, A26G и G44A). Аналоги тРНК№е Ее и Hs образуют близкие наборы продуктов (рис. 23). Анализ эффектов, производимых Phe-субстратом на t выходы продуктов мечения fS-субъединицы, показывает их зависимость в значительно

А Б В I I IL. TPHK-A..76 TPHK-s'U76 2,8 ,_0 5И»В70 01» ¿40 0132 »155-165_ Рис. 22. Влияние

малых субстратов на мечение PheRS 7/ аналогами тРНК№с Ее. А. Б - Разделение в Ds-Na-ПААГ продуктов присоединения к белку tphkphc-ao476 (4 мкМ) и tPHK,1k-s4U76

^.s*U76 -А„76 -S-U76 -А„76 -С.,75 VVW -А.,76 (0,2 мкм) В ОТСуТСТВИе атр + + + + + или в присутствии 50

мкМ Phe. 5 мМ АТР; концентрация PheRS I мкМ (А) и 2 мкМ (Б); время реакции 90 мин (А) и 30 мин (Б). В - Изменения выходов продуктов мечения а- и ji-субъедиииц (сверху указаны мол. массы, кДа); показаны средние значения 3-х измерений и их отклонения. Степень мечения определена как отношение выходов в присутствии субстратов к соответствующим значениям в их отсутствие.

u В 056-58 0 67/70 П100 Q108/110 0120/132 в 140-155/155-165

tphk"»-i'u77 Ее tPHK"»-sU76 Hs гв.- PliC. 23. СраВНИТвЛЬНЫЙ

Ph. . , HI— . - ' Г

анализ фотоаффинного мечения PheRS Tt аналогами тРНК''1*1 Ее (А) и Hs (Б) в отсутствие или в присутствии малых субстратов. Концентрации PheRS 2 мкМ, тРНК-аналогов 0,2 p,fe + + ■> мкМ (А) и 0,4 мкМ (Б),

АТР 5 мМ. Phe 50 мкМ.

В - Изменения выходов продуктов мечения а- и р-субъединиц (сверху указаны мол. массы, кДа) в присутствии субстратов; показаны средние значения 3-х измерений и их отклонения.

большей степени от положения s4U в З'-концевом фрагменте тРНК"11 Ее (76 или 77), чем от структурных различий тРНКр1к Ее и lis В то же время существенно различаются эффекты, оказываемые АТР на аффинное мечение фермента аналогами тРНК11"" Ее и Hs правильной длины, что нельзя объяснить влиянием АТР на связывание только З'-концевого нуклеотида Выявленные закономерности позволили предположить, что Phe-субстрат индуцирует локальные перестройки во взаимодействии PheRS с акцептирующим нуклеотидом тРНКИк, дтр модулирует конформацию всей акцепторной ветви и играет главную роль в обеспечении функционального связывания З'-конца РНК1'1'

3.2 2 Влияние нуклеотидных замен в тРНКр1|е на ориентацию акцепторного конца в

комплексе с PheRS Т thermophilus в различных функциональных условиях

Для определения роли различных элементов узнавания тРНКр1к в обеспечении продуктивного связывания акцепторного конца выполнено сравнительное исследование фотоаффинного мечения PheRS 77 х4и76-замешеннымн аналогами тРНК11"" и ее мутантов в отсутствие и в присутствии малых субстратов Шесть выбранных мутантов тРНКр^ Ее (G34C/A35U, G34A, А36С, G44C, U20A и G19U/C56G) содержат замены в разных участках структуры и различаются эффективностью связывания с ферментом и аминоацилирования Одинаковые наборы продуктов наблюдаются для аналогов тРНКР1к дт (в контрольном эксперименте) и мутантов G34A, А36С и G44C (рис 24, табл 11) Небольшие отличия в электрофоретической подвижности трех продуктов присоединения аналогов мутантов U20A и G19U/C56G от соответствующих продуктов в контрольном образце обусловлены, скорее всего, структурными отличиями соответствующих тРНК Различные мутации тРНКп"~ оказывают неодинаковое влияние на прочность связывания и ориентацию З'-конца, от которых зависят общая эффективность и селективность мечения белка Самое существенное влияние на ориентацию реакционноспособного нуклеотида оказывает замена двух нуклеотидов антикодона G34C/A35U значительно уменьшается относительная эффективность мечения каталитической субъединицы и меняется набор продуктов мечения Р-субъединицы Заметное изменение относительных уровней мечения субъединиц наблюдается для аналога тРНК с заменой G44C в V-петле

Таблица 11. Аффинная модификация PheRS Т thermophilus

У <$• О V

54и76-замещенными аналогами тРПКИк и ее мутантов

19'_

Рис 24 Разделение в Рв-Иа-ПААГ продуктов аффинного мечения РЬе!^ 77 84и76-замещенными аналогами тРНК|1ш д т и ее мутантов Слева указаны мол массы маркеров

tPHK№i Относительный выход продуктов" а/рб %•

а В

56-58* 67*, 69**,70 100, 104* 110 120*, 128**, 132 150*, 150160**, 155-165

дикий тип 12 53 4,0 2,4 3,6 25 1,9 64

G44C/A35U 32 15 12, 14* 11 16 0,89 4

G34A 11 52 5,4 4,0 5,6 22 1,7 18

А36С 11 55 5,1 2,4 4,5 22 1,9 64

U20A 12 53** 3,3 2,5 5,2** 24** 1.9 40

G44C 9,0* 46 6,6 7,9 3,5 27 1,2 43

G19U/C56G 12* 56* 4,0 2,8 4,2* 21* 2,1 55

"% от общего уровня мечения а - и р-субъединиц Указаны каж мол массы (кДа) продуктов Концентрации фермента 2 мкМ, аналогов тРНК 0,2 мкМ Отношение уровней мечения субъединиц 'Эффективность мечения, определена как % присоединенного реагента от количества комплекса (рассчитанного с использованием величин Ал для исходных мутантов)

Влияние остальных мутаций на ориентацию акцепторного конца в комплексе обнаружено в присутствии малых субстратов (рис. 25). Наибольшие различия в эффектах, производимых Phe-субстратом, для аналога С34А-мутанта по сравнению с контрольным экспериментом свидетельствуют о ведущей роли G34 в формировании комплекса с функциональной ориентацией З'-конца. Все замены в тРИК1''1 подавляют мечение (5-субъединицы и усиливают ингибирующее влияние АТР на мечение а-субъединицы. Снижение общей эффективности модификации в присутствии АТР (или Phe и АТР) не обусловлено уменьшением прочности комплексов, как следует из анализа изменений величин Кл для соответствующих tPHK1v с нативным З'-концом в присутствии PheOH-AMP (см. табл. 8). Ингибирующее влияние АТР на выходы основных продуктов мечения и- (67-70 кДа) и (3-субъединиц (150-165 кДа) и общую эффективность мечения увеличивается в результате мутаций в том же ряду (U20A < GI9U/C56G < А36С < G34A), в котором уменьшается величина ксм аминоацилирования соответствующих тРНКИк'-транскриптов с нативным акцепторным концом (U20A > G19U/C56G > А36С > G34A). Таким образом, влияние мутаций на индуцируемые АТР изменения в ориентации З'-концевого нуклеотида и его •эффективности присоединения отражает нарушения взаимодействий в комплексе, ответственных за продуктивное связывание акцепторного конца. Для оценки влияния мутаций на функциональную ориентацию акцепторного конца показательны относительные выходы продуктов мечения в присутствии двух малых субстратов (см. рис. 25, Б). По этому критерию замена G34A оказывает максимальный, а мутация U20A - минимальный дезориентирующий эффект. Замены А36 и третичной пары G19-C56 занимают промежуточное положение, но мутация в ангикодоне более критична для селективности мечения различных остатков а-субъединицы. Таким образом, негативное влияние четырех мутаций на ориентацию З'-конца тРНК1>1к в комплексе PheRS со всеми лигандами увеличивается в ряду U20A < G19U/C56G < А36С < G34A, соответствующем уменьшению величины ксл (U20A > G19U/C56G > А36С > G34A). Такая корреляция свидетельствует о том. что каталитический процесс переноса аминоацильного остатка на тРНК1>|к, для которого необходима правильная ориентация акцепторного конца, является скоростьлимитирующей стадией аминоацилирования для мутантов, содержащих замены любых элементов узнавания. Результаты проведенного исследования представляют

□ 56-58 □ 67/69/70 □ 100 u 110 d120/128/132 u 150/150-160/155-165 cl а

§ 1.=

Plie АТР

Шшшм

Д.Т. +

g34a +

i

А36С II20A G19U/C56G д.т. С34А А36С Ш<1 A G19U/C56G

Рис. 25. Влияние малых субстратов на мечение PheRS Tt в4Ш6-замещенными аналогами тРНКИк (д.т.) и ее мутантов. А - Отношения выходов отдельных или всех продуктов мечения а- или (3-субъединиц, или общей (Total) эффективности мечения белка в присутствии Phe или АТР к соответствующим значениям в отсутствие субстратов. Сверху указаны каж. мол. массы (кДа) продуктов мечения. Б - Относительные выходы продуктов мечения в присутствии Plie и АТР.

ill 11)1

д.т. g34а a.w ш0ас1шс5№

прямое доказательство участия элементов узнавания тРНКРЬе, оптимизирующих ее первоначальное связывание с PheRS, в создании необходимой ориентации акцепторного конца в продуктивном комплексе Нарушение специфических взаимодействий с антикодоном наиболее критично для стабильности комплекса и функционального связывания З'-конца Более существенное влияние мутаций любых элементов узнавания тРНКРЬе на взаимодействие PheRS с 3'-концевым нуклеотидом в присутствии Phe и АТР, чем в их отсутствие, указывает на тонкую конформационную подстройку комплекса на этапе, предшествующем каталитическому превращению тРНК

3.2.3 Взаимодействие PheRS человека с акцепторным концом тРНКр|,е

Для выявления общих закономерностей в механизмах функционирования PheRSs различного происхождения исследовано взаимодействие PheRS человека с акцепторным концом тРНКРЬе с помощью аффинной модификации З^и-содержащими аналогами тРНКр11е-транскрипта Hs (табл 12) Общая эффективность мечения белка и относительные выходы продуктов зависят от положения s4U и наличия фосфата на З'-конце аналога Максимальные эффективность и селективность мечения наблюдаются для тРНКРЬе-s4Up77, обладающей самым высоким сродством к ферменту (как установлено в экспериментах по ингибиро-ванию мечения незамещенным тРНКРЬе-транскриптом д т) Результаты показывают, что в связывании акцепторного конца тРНКр'1е участвуют две субъединицы 76-ый нуклеотид локализован на а- (57 кДа), а 75-ый - на р-субъединице (66 кДа) фермента Различия в селективности мечения а- и р-субъединиц PheRSs Hs и Tt реагентами одного типа (см табл 10 и 12) свидетельствуют о более динамичном взаимодействии эукариотического фермента с З'-концом тРНКРпе

Взаимодействие PheRS как с АТР, так и с Phe-субстратом оказывает влияние на общую эффективность мечения и распределение продуктов (рис 26) Изменение уровня мечения р-субъединицы укороченными или полноразмерными аналогами отражает изменение ориентации З'-конца тРНКРЬе (в предположении, что связывание малых субстратов не индуцирует перестроек этой субъединицы, как и в случае PheRS Tt) Интересный факт обнаружен при сравнении относительных выходов продуктов мечения фосфорилированными аналогами в присутствии Phe и соответствующими нефосфорили-рованными реагентами в отсутствие лигандов их близкие значения указывают на конкуренцию между аминокислотным субстратом и 3'-концевым фосфатом аналогов за взаимодействие с ферментом АТР по сравнению с Phe-субстратом оказывает гораздо более существенное влияние на мечение р-субъединицы в случае З'-нефосфорили-рованных аналогов, эти эффекты сохраняются в присутствии двух субстратов и сравнимы по величине для TPHKPhe-s4U75 и TPHKPhe-s4U76 Сопоставление эффектов, производимых Phe-AMP (Phe + АТР) и его аналогом (PheOH-AMP), показывает их

Таблица 12. Аффинная модификация PheRS человека аналогами гомологичного тРНК Ье-транскрипта

тРНК Относительный выход продуктов" a/p6 Эффективность %"

a P

63 69 73 75 84

-s4U75 2,0 10 18 70 0,43 23

-s'Up75 2,0 24 31 43 1.3 22

-s"U76 61 26 5,8 18 44 1,3 23

-s4Up76 3,4 53 5,6 22 16 5,2 25

-s1U77 10 64 10 16 5,2 37

-s4Up77 1,8 93 3,2 2,0 49 62

"% от общего уровня мечения, для продуктов указаны каж мол массы (кДа) "Отношение уровней мечения а- и Р-субъединиц "% присоединенного к белку (1 мкМ) реагента (0,4 мкМ) Данные соответствуют предельным по времени значениям (30 мин облучения лампой НВО 200^У, Х=365 нм)

A S'U75 s'Up75 s'U76 s'Up76 8'U77 g<Up77

ATP' ГТ' Г71 ГТ1' Г1

— т

■ Total D63 069 □ 73 D75

° 0

-sJU75 -s4U76 -s4U77 -s4U75 -s4U76 -s4U77 Phe + + + ATP + + +

PheOH-AMP

-s4U75 -sJlI75 -s4U76 -s4U76 -s4U77 -s4U77

Рис. 26. Аффинное мечение PheRS человека s4U-замешенными аналогами тРНК11"' в отсутствие и в присутствии малых лигамдов. А - Радиоавтограф геля после разделения продуктов ковалентного присоединения нР-меченых аналогов к ферменту. Б - Изменения выходов отдельных продуктов или обшей эффективности мечения белка (шстолбцы) в присутствии лигандов; сверху указаны каж. мол. массы (кДа) продуктов мечения. Концентрации PheRS 1 мкМ, аналогов тРНК 0.4 мкМ, Phe 75 мкМ, АТР 5 мМ, PheOH-AMP 50 мкМ.

наиболее яркие различия в случае tPHKpiw-s U76. Неодинаковое влияние Phe-AMP и PheOH-AMP на мечение (3-субъединицы аналогом правильной длины позволяет предположить, что функциональная ориентация акцепторного конца тРНКр|1с в активном центре контролируется остатками, ответственными за взаимодействие с карбонильной группой Phe-AMP. Результаты свидетельствуют о конформационной перестройке З'-конца тРНКр1к в комплексе с PheRS человека в присутствии малых субстратов: связывание Phe-субстрата индуцирует локальные изменения, влияющие на ориентацию З'-концевого (акцептирующего) нуклеотида. в то время как связывание АТР модулирует взаимодействие фермента с ССА-концом в целом. Таким образом, молекулярные механизмы взаимодействия гетеротетрамерных PheRSs про- и эукариот с акцепторным концом тРНК№с и контроля его функциональной ориентации с участием малых субстратов эволюционно консервативны.

3.3, Идентификация структурных изменений комплекса феннлаланил-тРНК-синтетазы Т. ¡ЫгторкИия с тРНКРЬ|!, индуцируемых малыми субстратами 3.3.1. Влияние РЬеОН-АМР на взаимодействие РЬеЯ8 с акцепторным концом тРНКр|1|;

Для идентификации изменений во взаимодействиях фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНКр1х, индуцируемых малыми субстратами, выполнен аначиз трехмерной структуры комплекса фермента 77 с гомологичной тРНКры\ закристаллизованного в присутствии устойчивого аналога фенилаланиладенилата. Разностная карта электронной плотности (по сравнению с рентгеноструктурными данными для нативного фермента) показывает наличие лигандов в комплексе (рис. 27). Молекула тРНК в тройном комплексе

локализована ближе к белку в районе Э- и акцепторного стеблей (на 2-3 А) по сравнению с ее позицией в двойном комплексе Р1^8-тРНК№с.

Рис. 27. Общий вид трехмерной структуры комплекса РЬеК8-тРНКр"с-РИеОН-АМР (А) в сравнении со структурой комплекса Р11е1?8'тРНКи" (показанного серым цветом). Б - Фрагмент структуры, показывающий связывание РЬеОН-АМР в активном центре и З'-конца тРНК"""' на входе в активный центр; молекула тРНКИк вписана в электронную плотность, вычисленную с коэффициентами ^ь^/^л и 2/г,^-/гса|С (синего и красного цвета; контурные уровни 2,0а и 1,0а).

Конформация З'-конца тРНК№° меняется в присутствии аналога аденилата (рис. 28). Характерные для двойного комплекса контакты рибозофосфатного скелета АССА-конца с доменом В1 (остатками Меф1 и А^Р2) утрачиваются (табл. 13). Два остатка домена ВЗ (Н[.5р358 и А^(3362) взаимодействуют с разными нуклеотидами в двух комплексах (С74 или С75); дополнительный остаток этого домена (А^рЗДЗ) участвует в связывании С74 в тройном комплексе. Специфические взаимодействия ССА-конца с РЬеЯЗ характерны только для тройного комплекса: 4-МНггруппа «вывернутого» основания С75 находится в контакте с отрицательно заряженными остатками домена В1, С1и|331 и Авр^ЗЗ, консервативными в РИе!^.? бактерий и эукариот. А73 свободен от контактов с белком в тройном комплексе, но вовлечен во внутримолекулярные взаимодействия, которые дополнительно стабилизируют структуру АССА-конца: стэкинг А73 с первой парой

Рис. 28. Сравнение взаимодействий доменов В1 и ВЗ Р1ю1?5 с З'-концом тРНК"* в присутствии и в отсутствие РЬеОН-АМР. Пунктирными линиями показаны водородные связи между нуклеотидами и остатками белка и внутримолекулярные взаимодействия тРНКПк с участием А73 (в тройном комплексе). Изображения получены совмещением пептидного скелета РЬе!^ в двух комплексах.

Таблица 13. Сравнение взаимодействий с акцепторной ветвыо тРНК'"с в

присутствии и в отсутствие устойчивого аналога фенилаланиладенилата

Остаток Взаимодействующие группы тРНК""' и PheRS"

тРНК PheRS-TPHK^-PheOH-AMP'' PheRS-rPHR1'1"""

А76 Ade: Hisa212' кольцо, Ade PheOH-AMP (vdw); N7: Arga3215 N4', N'12 (hb); 03': Arga204' (hb). Metal48" O (hh). S'! (hbw67); 02': Glua206' О", O'1 (hb) Ade: Phea2582, Phea2602кольцо (vdw ); N7: Trpul496 Nd (hb); N6: Sera 180J 0\ Glua2204 0,;l (hb)

С75 N4: Gluß31BI 0'J, Aspß33BI 0"' (lib); 02P: Hisß358B'" NS1, Argß362B3 N',: (hb) OIP: Valß 160BI N (hb)

С74 OIP: Argß353B,N"", N' (hb) 02': Hisß358"-' N':J, Argß362BJ N"1 (hb); OIP: MetßlBI N (es); 02P: Argß2B' N"' (hb)

А73 OIP: Argß2BI Nn~ (es)

С69 OIP: Glna207' NT* (hbw)

U68 OIP: Gln«207' Nr~ (hb"1")

С67 02': Gluß540"7 0':' (hb""-') 02': Gluß540B7 O'1 (hb")

С66 02': Gluß540b7 O'" (hb""') 02': Gluß540B7 0" (hb")

j "Верхним индексом отмечена принадлежность остатков фрагментам активного центра (I - петля I мотива 2, 2 - FPF-петля, 3 - Т(НЛрТ-петля, 4 - мотив 2. 5 - мотив 3, 6- петля 139-152) или доменам ß-субъединицы; на сером фоне выделены остатки, взаимодействующие одновременно с А76 и АМР-| частью PheOH-AMP. Остальные обозначения расшифрованы в примеч. табл. 1 и 2. г'Код PDB: 2IY5. разрешение 3,1 А. "Данные работы (Goldgur et ai, 1997; код PDB: IE1Y).

I оснований акцепторного стебля, водородные связи между N3- и Ш-атомами А73 и J 2-ОН- и 4-NHi-rpynnaMH С74 соответственно. Немногочисленные в обоих комплексах ; взаимодействия между акцепторным стеблем тРНК1>к' и PhcRS, в которых участвуют

I рибозофосфатный скелет, петля мотива 2 и петля домена В7 (образованная остатками ; 535-541), опосредованы молекулами воды.

Акцептирующий нуклеотид связан вблизи АМР-части аналога аденилата (рис. 29).

Рис. 29. Фрагменты трехмерной структуры тройного комплекса, показывающие: А - изменение ориентации А76 по сравнению с его позицией в двойном комплексе Р|1еР5-тРНК№с (зеленого и коричневого цвета соответственно); Б - взаимное расположение З'-конца тРНК'1к и РЬеОН-АМР в окружении взаимодействующих с ними остатков активного центра и молекул воды (сфер голубого цвета).

Все взаимодействия с PheOH-AMP, характерные для комплекса PheRS-PheOH-AMP. сохраняются в присутствии тРНКР1к'. В связывании А76 участвуют консервативные остатки петли мотива 2, мотива 3 и спиральной петли 139-152; остатки из мотивов 2 и 3 кооперируют во взаимодействиях с тРНКр|к и АМР-частью аденилата (см. табл. 13). Более того, аденин AMP участвует в образовании ароматической триады с основанием А76 и кольцом Hisa212 (ориентированных относительно друг друга по типу «ребро-к-грани»). Формирование контактов между А76 и остатками Hisa212 и Arga321, «переключающихся» с уходящей пирофосфатной группы на тРНК-субстрат, обеспечивает динамику реакции аминоацилирования.

Взаимодействия PheRS с PheOH-AMP и тРНКИк индуцируют перестройки в активном центре (рис. 30). Изменения петли мотива 2 на уровне пептидного скелета (сдвиг по направлению к лигандам) обусловлены в первую очередь ее взаимодействиями с PheOH-AMP. а на уровне боковых цепей остатков -кооперативными взаимодействиями с обоими лигандами. Конформация спиральной петли 139-152 в тройном комплексе, классифицируемая нами как «закрытая», определяется ориентацией остатка Мею 148: сдвиг боковой цепи остатка, индуцируемый взаимодействием с З'-концевой рибозой тРНК№', создает барьер для сближения акцептирующего нуклеотида с активированной аминокислотой на необходимое для реакции расстояние. Переход в «открытую» конформацию, благоприятную для продуктивного взаимодействия, может быть индуцирован связыванием истинного промежуточного соединения: такая конформация петли в комплексе PheRS с Phe-AMP стабилизирована взаимодействием остатка Тгра149 с карбонильной группой субстрата и наиболее устойчива.

Данные РСА для тройного комплекса свидетельствуют о ведущей роли нуклеотидного субстрата в создании ориентации акцепторного конца тРНКр|к'. необходимой для одновременного размещения в активном центре всех участников реакции аминоацилирования, и согласуются с результатами экспериментов по аффинному мечению PheRS различными аналогами тРНК, замещенными в З'-конце. Участие специфических функциональных групп АССА-конна в меж- и(или) внутримолекулярных взаимодействиях, стабилизирующих его конформацию, коррелирует с положительным вкладом соответствующих оснований в каталитическую эффективность аминоацилирования тРНК hc. Соответствие результатов структурного анализа и независимых биохимических исследований позволяет рассматривать закристаллизованный комплекс PheRS-TPHK1>hc-PheOH-AMP как близкий к продуктивному. Дополнительная подстройка комплекса, необходимая для оптимального размещения З'-концевой акцептирующей рибозы, индуцируется взаимодействиями фермента с аминоациладенилатом.

Кооперативные взаимодействия петли мотива 2 с АТР (или AMP в составе аденилата) и тРНК, контролирующие ориентацию акцепторного конца, характерны для всех aaRSs 11-ого класса с известной трехмерной с труктурой (Cavarelli et al., 1994; Cusack et al., 1996; Eiler et al., 1999; Sauter et al., 2000; Torres-Larios et al., 2003). Участие некаталитических доменов в связывании ССА-конца тРНК - уникальное свойство PheRS, обусловленное сложной структурной организацией фермента.

Рис. 30. Конформационные изменения в активном центре РЬеЯБ, индуцируемые взаимодействиями с РЬеОН-АМР и тРНК1'1*. Суперпозиция пептидного скелета в комплексах РЬеКЗ-тРНК'^-РЬеОН-АМР и РИеКЗ-РЬеОН-АМР (серого и зеленого цвета соответственно); петля мотива 2, спиральная петля и РРР-петля показаны для сравнения в комплексе РЬеИЗ-РИе-АМР и структуре нагивного белка (розового и коричневого цвета соответственно). Остатки белка в тройном комплексе показаны стандартным набором цветов (СРК), в остальных комплексах тем же цветом, что и скелет.

3.3.2. Протяженные структурные изменения комплекса фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНК Ье, индуцируемые аналогом аденилата

При сравнительном анализе структур комплексов PheRS-тРНК h0-PheOH-AMP и PheRS-TPHK1''11 обнаружены перестройки в районах, удаленных от активного центра. На уровне тРНК|1к (рис. 31) существенно различаются конформации некоторых нуклеотидов антикодоновой (U33), D- (U16, U17 и U20) и вариабельной петель (G44 и (J 47). Структура антикодоновой петли в тройном комплексе дополнительно стабилизирована необычной парой С32-А38 и взаимодействием основания U33 (ориентированного внутрь петли) с фосфатной группой А36. Основание U16 образует нестабильную пару с U59 только в двойном комплексе (и в тРНК1'1""' дрожжей в определенных условиях; Shi & Moore, 2000); остальные третичные пары с участием нуклеотидов D-петли (G15-C48. G18-U55 и G19-C56) существуют в обоих комплексах. Третичное спаривание оснований A26-G44 и межплоскостные взаимодействия G44 с А43 и U45. наблюдаемые в комплексе PheRS-TPHKPte (и в тРНК1''10 дрожжей), отсутствуют в тройном комплексе. Взаимная ориентация вариабельной петли и D-ветви в комплексе PheRS-rPHKpk-PheOH-AMP стабилизирована третичным взаимодействием U45 с парой G10-С25.

Рис. 31. Суперпозиция антикодоновой, D- и вариабельной петель

тРНК11* в комплексах PheRS-TPHK'*"c.PheOH-AMP и PheRS-TPHKH,c (атомы С зеленого цвета в тройном комплексе и коричневого в двойном).

Степень перестроек комплекса PheRS с тРНК№е, индуцируемых связыванием PheOH-AMP в активном центре, значительно варьирует для различных районов (табл. 14). Наиболее стабильны взаимодействия домена В8* с антикодоновой петлей (рис. 32). Небольшие конформационные изменения благоприятствуют образованию в тройном комплексе ван-дер-ваальсовых контактов Alaß698 не только с А35. но и с А36, а также более прочному связыванию основания G34 остатками Argß780 и Aspß729; ориентация боковой цепи Argß780 стабилизирована дополнительной водородной связью с остатком рибозы U33. Существенные перестройки наблюдаются во взаимодействиях PheRS с D-стеблем тРНК№е, локализованным в области контакта домена В8* с модулем В6-В7 (рис. 33). Для связывания трех нуклеотидов (G10. U12 и А26) из шести, расположенных

Рис. 32. Сравнение взаимодействий домена В8* с антикодоновой петлей тРНК|>1к в тройном и двойном комплексах. Изображения получены совмещением пептидного скелета РЬеКБ в двух комплексах. Показаны все остатки фермента, участвующие в связывании антикодоновой петли, и водородные связи (пунктирными линиями), характерные для каждого комплекса.

PheRS-rPHK^-PheOH-AMP

PheRS-rPHKPl"

Таблица 14. Сравнение взаимодействий Р11еГ18 с различными районами тРНК№ в отсутствие и в присутствии устойчивого аналога фенилаланиладенилата

Остаток Взаимодействующие группы тРНК№ и PheRS

тРНК PheRS-rPH Kl№-PheOH -AM P"'6 PheRS-TPHK1'"6 '*•"

G10 ОТ: Glup664B6Or'2 (hb) 02': AspP561"7 0 (hb)

СИ 02': ArgP689lis" О (lib); rib: Prop691""" (vdw) 02': AreR689"8* 0 (hb); rib: Prop69l"8" (vdw)

U12 01P: ArgP689"s" N'>-,N'; (hb); rib: Hisp690"s" (vdw) 04': Hisp690BS" Nf'2 (hb); rib: Hkp690BS* (vdw)

G19 Gua: Leua39cc*, GIua35cc* (vdw) Gua: Leua39cc*, Glua35w* (vdw); 02': Glua35cc* Ocl (hb)

G24 02': Leu(i756"** О (hb); О IP: ArgP757,i8* N1'2 (hb) 02': Leup756BS* 0 (hb)

С25 О IP: Argp757"8* N''1 (lib)

А26 OIP: PheP694us' N (hb); OIP, 02P: Argp695B8* N'1' (hb) OIP: Phep694"8* N (hb); Q2': Argp564B6 N'^N"2 (hb)

G28 02':Glual7tL"0'J(hb) 02':Glual7c<-*0cl (hb)

U33 02': AraP780""" N"J (hb)

G34 Об: Serp742'18* O7, ArcP780B8" N1' (hb); n1. N2: AseP729B8'Os1 , O62 (hb); N7: ArgP780B8* N^.N"2 (hb); Gua: TvrB731вв* кольцо (vdw) 06: Serp742"8" Or, ArgB780""' N'12 (hb); N1.N2: AsBP729BsrOa (hb); N7: ArgP780"8' N112 (hb); Gua: Tyrp73l1"'* кольцо (vdw)

А35 Ade: ArgP780B8", Alap698B8' (vdw) Ade: ArgP780B!<*, Alap698"8" (vdw)

А36 Q2': AspP696"** O"2 (hb); Ade: LeuR697B8*, ArgP78Q"8*, Alap698® (vdw) 02': AseP696B8* Osl (hb); Ade: Leup697"8', ArgP780li8* (vdw)

А37 02': AspP696""' 0 (hb) 02': AsgP696"8* 0 (hb)

А43 rib: Leuu21tv" (vdw); ОЗ': Arga24"' N (hb) rib: Leua21LL* (vdw); 02': Alaa20cc* 0 (hb); OIP: Lysa28cc* Nc (es)

G44 OIP. 02P: Arga24lv" N', N (hb/es) OIP, 02P: Arga24(x" N1", N': (hb)

С56 02': Glna34cc* N':2 (hb); Cyd: Leua54tc*, Arga50cc* (vdw) 04': Glna34LC* Nt2, Lvsa58cc" N' (hb); Cyd: Leua54cc*, Lysa58cc" (vdw); OIP: Arga50cc* N' (hb)

"Обозначения: rib - остаток рибозы, остальные расшифрованы в примеч. табл. I и 13. 6Код PDB: 21Y5, разрешение 3,1 А. "Данные работы (Goldgur et al„ 1997;кодРОВ: 1E1Y).

Рис. 33. Локализация 0-стебля тРНКИк в комплексах с РЬе!^, Изображены нуклео-тиды и все остатки доменов В6, В7 и В8*. вовлеченные в межмолекулярные контакты в тройном или двойном комплексе (для сравнения их ориентации в комплексах, совмещенных по пептидному скелету) и характерные для каждого комплекса взаимодействия (водородные связи).

PheRS-TPHK^'-PheOH-AMP PheRS*rPHKpil

близко к ферменту в двух комплексах, используются альтернативные взаимодействия в отсутствие или в присутствии РЬеОН-АМР с участием остатков, принадлежащих одному и тому же или разным доменам (см. табл. 14). В тройном комплексе усиливаются

взаимодействия домена В8* с D-стеблем благодаря образованию водородных связей ~ между двумя остатками Arg (695 и 757) и фосфатными группами G24, С25 и А26.

Значительные информационные изменения в тройном комплексе по сравнению с | комплексом PheRS-TPHKli,c охватывают конец биспирали СС*. который взаимодействует с третичной парой G19-C56, и сегмент 17-28. находящийся в контактах с антикодоновым стеблем и вариабельной петлей (рис. 34). Остатки Lysa28, Glua35, Arga50 и Lysa58 вовлечены в более интенсивные взаимодействия с тРНК№с в двойном комплексе. 1 Некоторые альтернативные взаимодействия с А43 и С56 индуцированы небольшими j информационными изменениями. Наиболее стабильны ван-дер-ваальсовые контакты i углеводных остатков и гетероциклических ядер G19 и С56 с биспиральным доменом.

| Рис. 34. Сравнение взаимодействий домена СС* с тРНК1'1* в присутствии или в отсутствие аналога аденилата. Показаны остатки РЬе!^, участвующие в связывании вариабельной, 6- и Т-петель в I двойном или тройном комплексе и характерные для каждого комплекса взаимодействия I (водородные и ионные связи).

I

Результаты сравнительного анализа демонстрируют взаимную адаптацию РЬеИЗ и \ тРНК11к в разных функциональных состояниях комплекса: усиление взаимодействий , тРНК№с с доменом В8* в присутствии аналога аденилата сопровождается ослаблением | контактов с доменом СС*. Конформационная подвижность этих основных тРНК-] связывающих доменов (характеризующихся самыми высокими значениями ' температурных факторов) обеспечивает индуцированное структурное соответствие. I Функциональное значение большинства перестроек на уровне тРНК для структурной I адаптации РЬеРЗ-тРИК^'-комплекса подтверждается исследованиями в растворе. - Динамические взаимодействия подвижных оснований в положениях 20, 33, 45 и 47 с РйсРЭ зафиксированы с помощью 5411-индуцируемого аффинного мечения. На участие I и 16 и 044 в перестройках тРНК1>1х' в процессе взаимодействия с ферментом указывают | данные футпринтинга (см. рис. 17). Влияние мутаций и 16, 1120 и 044 на эффективность связывания или каталитического превращения (см. табл. 8) коррелирует с их непрямой ролью в узнавании тРНК1>Ке путем модуляции структуры субстрата в разных состояниях комплекса. В образование межмолекулярных динамических контактов наряду с ШЗ вовлечены две пары С30-С40 и А31-Ш9. вносящие минорный вклад в специфичность, что указывает на участие всей антикодоновой петли во взаимной конформационной I адаптации тРНКИк и фермента. Третичные взаимодействия между основаниями 019-С56 и С25-С10-1145, ответственные за поддержание оптимальной для связывания и аминоацилирования трехмерной структуры тРНК|>ю, устойчивы в двух комплексах. | Таким образом, межнуклеотидные контакты с образованием пары А26-044 и тройки I С25-ОЮ-и45 обеспечивает взаимосвязь гРНК-связывающих доменов В8*, СС* и В6-В7

и координацию их взаимодействий с определенными районами субстрата на различных этапах реакции. В пользу тонкой взаимной подстройки РЬе!^ и тРНК№с на конечном этапе, предшествующем каталитической стадии, указывают результаты экспериментов по аффинному мечению фермента 84Ш6-замещенными аналогами тРНК,1к' и ее мутантов. Основной способ передачи информации об «узнавании» элементов специфичности в активный центр - это многостадийный процесс взаимодействия фермента и тРНКрк'. сопровождаемый их конформационными изменениями. Роль связующего звена со стороны белка играет модуль В6-В7, находящийся в контактах с другими тРНК-связываюгцими доменами (В8*, В1 и ВЗ), каталитическим модулем А1-А2 и различными районами тРПК№е.

На основании данных структурно-функционального анализа предложена динамическая модель формирования каталитически активного комплекса РЬеЯЗ с тРНК1к (рис. 35). В первичной, контролируемой диффузией, ассоциации молекул участвуют домены В2 и СС, ответственные за создание электроположительного потенциала на поверхности РИсИв (Т'люго\У8кт ел а/., 2005). Формирование специфичного комплекса протекает в несколько стадий и инициируется узнаванием и связыванием антикодона, вносящего определяющий вклад в эффективность комплексообразования и аминоацилирования. Встраивание антикодоновой петли в домен В8 индуцирует формирование контактов антикодоновой ветви, вариабельной петли, Э-ветви и крайней угловой структуры тРНК с этим и другими доменами, что обеспечивает, в свою очередь, связывание акцепторной ветви доменами В1. ВЗ, В7 и каталитическим модулем. Конформационные изменения фермента и тРНК оптимизируют их взаимное соответствие, необходимое для продуктивного связывания А76 в активном центре.

Рис. 35. Динамика взаимодействия РЬе!^ 7> с тРНК11"''. А - Первичная ассоциация молекул. Б, В, Г-Стадии образования специфичного комплекса: связывание антикодона с доменом В8 (стадия 1, Б) инициирует переход первичного комплекса в специфичный; связывание центральных районов тРНК1' с доменами В8, В6-В7 и СС (стадия 2, В) способствует сближению акцепторной ветви с каталитическим модулем и прилегающими к нему фрагментами доменов В7, В1 и ВЗ; связывание акцепторной ветви (стадия 3) завершает формирование каталитически активного комплекса (структура на панели Г соответствует структуре комплекса РЬеК8-тРНК"к-РЬеОН-АМР). В тРНК11к' показаны нуклеотиды, находящиеся в контактах с РЬе!^ в тройном комплексе; красным цветом выделены элементы, определяющие эффективность и специфичность взаимодействия.

выводы

Впервые с использованием реитгеноструктурного анализа, аффинной модификации и кинетических методов выполнено комплексное исследование молекулярных механизмов специфичного аминоацилирования тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой (PheRS), ферментом с редкой (оф)гструктурой

1 Изучены молекулярные основы избирательного взаимодействия фенилаланил-тРНК-синтетазы с низкомолекулярными субстратами и механизм активации аминокислоты

• Установлено, что специфичность к L-фенилаланину обеспечивается связыванием боковой цепи субстрата в гидрофобном кармане PheRS Т thermophilus и взаимодействиями с ароматическими остатками (Phea258 и Phea260) FPF-петли, которая характерна для фенилаланил-тРНК-синтетаз Инвариантные остатки (Arga204, Phea216 и Arga321) мотивов 2 и 3, общих для II-ого класса аминоацил-тРНК-синтетаз, выполняют универсальные функции в связывании АТР и катализе Активный центр каждого up-i етеродимсра сформирован полностью a-субъединицей Структура его функционально важных фрагментов, петли мотива 2, спиральной петли и FPF-петли, стабилизирована взаимодействиями с Р-субъединицей, что объясняет необходимость олигомерной организации PheRS для синтеза аминоациладенилата

• Показано, что активация L-тирозина и гидролиз ошибочного продукта аминоацилирования Туг-тРНК1к - эволюционно консервативные свойства фенилаланил-тРНК-синтетаз прокариот и высших эукариот Доказано связывание неспецифичного субстрата в активном центре PheRS Т thermophilus с сохранением ориентации, необходимой для активации и последующего переноса на тРНК Локализован дополнительный активный центр, ответственный за гидролитическую функцию фермента, его уникальная структурная топология сформирована консервативными мотивами двух доменов р-субъединицы Специфичность этого центра к тирозину обеспечивается наличием в гидрофобном участке связывания боковой цепи лиганда гидрофильного остатка (GIup334), узнающего ОН-группу

2 Изучен механизм узнавания тРНКр1к фенилаланил-тРНК-синтетазой Т thermophilus

• Путем независимых измерений кинетических характеристик аминоацилирования тРНК , мутантных тРИКн'\ химерных и неспецифичных iPHK и равновесных констант диссоциации их комплексов с ферментом выявлены нуклеотиды тРНК"'\ ответственные за эффективное аминоацилирование и связывание Установлено, что антикодон вносит определяющий вклад в специфичность взаимодействия на разных стадиях Общая архитектура и структурные особенности отдельных районов субстрата узнаются с участием нуклсотидов, характерных для iPI 1KI1|L и универсальных для канонических тРНК Небольшой вклад в эффективность взаимодействия в процессе либо связывания, либо аминоацилирования обнаружен для U16 и А73 соответственно

• Установлена разная молекулярная природа непрямых механизмов узнавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Нуклеотиды, образующие третичную пару G19-C56 и тройку U45-G10-C25, вносят основной вклад в стабилизацию оптимальной для связывания и аминоацилирования трехмерной структуры тРНК11к, другие элементы -Ш6, U20, A31-U39, A26-G44 и А73 - обеспечивают конформационную подстройку субстрата в разных функциональных комплексах Впервые для фиксации динамических взаимодействий между непрямыми элементами узнавания тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазой использована 54и-индуцируемая аффинная модификация

• Методом аффинной модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы s4U76-замещенными аналогами тРНК№е и ее мутантов впервые продемонстрировано участие элементов специфичности в создании комплекса с правильной ориентацией акцепторного конца Влияние замен любых элементов узнавания на ориентацию 3'-концевого нуклеотида обнаружено в присутствии малых субстратов Нарушение специфических взаимодействий фермента с антикодоном наиболее критично для функциональной ориентации акцепторного конца Дополнительным подтверждением тонкой взаимной подстройки PheRS и тРНКРЬе на этапе, предшествующем каталитической стадии, служат индуцируемые аналогом аденилата (PheOH-AMP) конформационные изменения в удаленных от активного центра районах, выявленные при структурном анализе комплекса PheRS-TPHKphe-PheOH-AMP

3 Установлены механизмы контроля продуктивного взаимодействия фенилаланил-тРНК-синтетаз с акцепторным концом тРНКРЬе

• Показано активное участие универсальной З'-концевой ССА-последовательности в каталитическом превращении тРНКРЬе различного происхождения соответствующими ферментами Пиримидины в положениях 75 и 74 необходимы для проявления акцепторной активности тРНКРЬе Функциональные группы акцептирующего нуклеотида А76 (имидазольное кольцо, З'-ОН- и 6-NH2-rpynnbi) вносят основной вклад в каталитическую эффективность реакции

• Впервые с использованием аффинной модификации изучена конформационная динамика взаимодействия фенилаланил-тРНК-синтетаз Т thermophilus и человека с акцепторным концом тРНКр|,е, индуцируемая малыми субстратами Обнаружена эволюционная консервативность механизмов контроля продуктивного связывания акцепторного конца ориентация акцептирующего нуклеотида определяется взаимодействиями фермента с АТР и фенилаланином, АТР принадлежит ведущая роль в создании активной конформации акцепторной ветви

• Выявлена молекулярная природа взаимосвязи между тРНКРЬе и малыми субстратами Ключевую роль в правильном размещении субстратов для аминоацилирования тРНКРКе и динамике реакции играют 1) кооперативные взаимодействия четырех остатков PheRS (Arga204, Glua206, Hisa212 и Arga321) с AMP-частью аденилата и А76, 2) стабилизация конформации подвижной спиральной петли за счет ее взаимодействия с карбонильной группой Phe-субстрата Ориентация акцепторного конца в тройном комплексе PheRS-TPHKphe-PheOH-AMP обеспечивается меж- и внутримолекулярными взаимодействиями с участием специфических функциональных групп, ответственных за положительный вклад ССА-конца и дискриминаторного основания А73 в каталитическую эффективность аминоацилирования тРНКРЬе

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Обзоры

1 Lavrik О I, Moor N А. Reshetmkova L S , Ankilova V N, Khodyreva S N , Stepanov V G Phenylalanyl-tRNA synthetase from an extreme thermophile structure-function analysis of enzyme and its interaction with tRNA?he // Evolutionary biochemistry and related areas of physicochemical biology / Poglazov В F, Kurganov В I, Kritsky M S and Gladilin К L Eds Moscow Bach Institute of Biochemistry and ANKO 1995 P 327-340

2 Иванов К А , Моор Н А . Лаврик О И Неканонические функции аминоацил-тРНК-синтетаз// Биохимия 2000 Т 65 С 1047-1057

3 Safro М, Moor N. Lavrik О Phenylalanyl-tRNA synthetase // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M, Francklyn С and Cusack S Eds Georgetown, TX Landes Bioscience 2005 P 250-265

4 Васильева И A, Моор H А Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК общие закономерности и особенности узнавания высокомолекулярного субстрата // Биохимия 2007 Т 72 С 306-324

Статьи в научных журналах

5 Moor N . Nazarenko 1, Ankilova V , Khodyreva S , Lavrik О Determination of tRNAphe recognition nucleotides for phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus themophilus II Biochimie 1992 V 74 P 353-356

6 Stepanov V G, Moor N A . Ankilova V N , Lavrik О I Phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus themophilus can attach two molecules of phenylalanine to tRNAphe // FEBS Lett 1992 V 311 P 192-194

7 Моор H A . Степанов В Г , Репкова М Н , Веньяминова А Г , Врацких Л В , Ямковой В И, Моторин Ю А, Лаврик О И Роль З'-ССА-последователыгости во взаимодействии тРНКРЬе из Е coll и Thermus themophilus с гомологичными фенилаланил-тРНК-синтетазами//Биохимия 1994 Т 59 С 1299-1303

8 Moor N А . Repkova М N , Yamkovoy V I, Lavrik О I Alterations at the З'-ССА end of Escherichia coli and Thermus themophilus tRNAphe do not abolish their acceptor activity // FEBS Lett 1994 V 351 P 241-242

9 Степанов В Г, Моор Н А . Анкилова В Н, Васильева И А , Лаврик О И Механизм образования бис-2',3'-0-фенилаланил-тРНКРЬе в реакции аминоацилирования тРНК, катализируемой фенилаланил-тРНК-синтетазой из Thermus themophilus // Молекуляр биология 1995 Т 29 С 671-678

10 Moor N А, Ankilova VN, Lavrik OI Recognition of tRNAphe by phenylalanyl-tRNA synthetase of Thermus thermophilus // Eur J Biochem 1995 V 234 P 897-902

11 Moor N A . Favre A , Lavrik О I Covalent complex of phenylalanyl-tRNA synthetase with 4-thiouridine-substituted tRNAphe gene transcript retains aminoacylation activity // FEBS Lett 1998 V 427 P 1-4

12 Stepanov V G, Moor N A, Ankilova V N, Vasil'eva IA, Sukhanova M V, Lavrik ОI A peculiarity of the reaction of tRNA aminoacylation catalyzed by phenylalanyl-tRNA synthetase from an extreme thermophile Thermus thermophilus II Biochim Biophys Acta 1998 V 1386 P 1-15

13 Моор H A. Степанов ВГ, Анкилова BH, Фавр А, Лаврик О И Аффинная модификация фенилаланил-тРНК-синтетазы аналогами тРНК, содержащими 4-тиоуридин//Биохимия 1998 Т 63 С 1222-1230

14 Моор Н А . Анкилова В Н, Фавр А , Лаврик О И Локализация участка связывания З'-концевой последовательности тРНКРЬе на субъединицах фенилаланил-тРНК-синтетазы Т thermophilus И Биохимия 1998 Т 63 С 1231-1237

15 Reshetnikova L , Moor N, Lavrik О , Vassylyev D G Crystal structures of phenylalanyl-tRNA synthetase complexed with phenylalanine and a phenylalanyl-adenylate analogue // J Mol Biol 1999 V 287 P 555-568

16 Васильева И А, Анкилова ВН, Лаврик О И, Моор Н А Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы Thermits thermophilus с З'-концевым нуклеотидом тРНК№е //Биохимия 2000 Т 65 С 1368-1379

17 Moor N А . Ankilova V N, Lavrik О I, Favre A Determination of tRNAPhe nucleotides contacting the subumts of Thermus thermophilus phenylalanyl-tRNA synthetase by photoaffinity crosslinking//Biochim Biophys Acta 2001 V 1518 P 226-236

18 Fishman R, Ankilova V, Moor N. Safro M Crystal structure at 2 6 A resolution of phenylalanyl-tRNA synthetase complexed with phenylalanyl-adenylate m the presence of manganese//ActaCrytallogr 2001 V D57 P 1534-1544

19 Moor N. Lmshiz G, Safro M Cloning and expression of human phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia colt comparative study of purified recombinant enzymes // Protein Expr Purif 2002 V 24 P 260-267

20 Vasil'eva IA, Ankilova V N, Lavrik ОI, Moor N A tRNA discrimination by T thermophilus phenylalanyl-tRNA synthetase at the binding step // J Mol Recognit 2002

V 15 P 188-196

21 Moor N. Lavrik О, Favre A, Safro M Prokaryotic and eukaryotic tetramenc phenylalanyl-tRNA synthetases display conservation of the binding mode of the tKNAphe CCA end//Biochemistry 2003 V 42 P 10697-10708

22 Васильева И A, Богачев В С , Фавр А, Лаврик О И, Моор Н А Роль низкомолекулярных субстратов в функциональном связывании акцепторного конца тРНКРЬе фенилаланил-тРНК-синтетазой // Биохимия 2004 Т 69 С 179-191

23 Васильева И А, Фавр А , Лаврик О И , Моор Н А Влияние нуклеотидных замен в тРНКРЬе на ориентацию акцепторного конца в комплексе с фенилаланил-тРНК-синтетазой//Биохимия 2004 Т 69 С 192-203

24 Kotik-Kogan О, Moor N. Tworowski D , Safro M Structural basis for discrimination of L-phenylalanine from L-tyrosme by phenylalanyl-tRNA synthetase // Structure 2005 V 13 P 1799-1807

25 Moor N . Kotik-Kogan О, Tworowski D, Sukhanova M, Safro M The crystal structure of the ternary complex of phenylalanyl-tRNA synthetase with tRNAPhe and a phenylalanyl-adenylate analogue reveals a conformational switch of the CCA end // Biochemistry 2006

V 45 P 10572-10583

Подписано к печати «11» августа 2008 г

Тираж 150 экз Заказ № 779 Отпечатано «Документ-Сервис», 630090 Новосибирск, ул Институтская 4/1, тел 339-66-00

Список сокращений

Введение

Глава 1. Общие закономерности и отличительные особенности узнавания тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами (Обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Два класса аминоацил-тРНК-синтетаз: структурные признаки и общие характеристики взаимодействия с низкомолекулярными субстратами

1.3. Структура тРНК

1.4. Идентификация элементов узнавания в тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазах и их функциональной роли в обеспечении специфичности

1.4.1. Методы определения элементов специфичности в тРНК

1.4.2. Распределение элементов узнавания в тРНК и их относительный вклад в специфичность

1.4.3. Аминоацилирование мини-тРНК-субстратов. Значение общей структуры

1.4.4. Функциональная роль элементов узнавания тРНК в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия

1.4.5. Элементы узнавания тРНК в аминоацил-тРНК-синтетазах

1.5. Анализ структурных принципов обеспечения специфичности

1.5.1. Общие структурные характеристики тРНК-синтетазных комплексов и их уникальные особенности

1.5.2. Структурные основы эволюционных различий в механизмах узнавания тРНК

1.5.3. Динамика взаимодействия с тРНК

1.6. Механизмы контроля продуктивного взаимодействия аминоацил-тРНК-синтетаз с акцепторным концом тРНК

1.6.1. Роль универсального ССА-конца в обеспечении эффективного катализа

1.6.2. Модуляция структуры активного центра и ориентации акцепторного конца тРНК в присутствии низкомолекулярных субстратов

Воспроизведение генетически заданной структуры белков определяется по существу тремя процессами: ДНК-зависимым синтезом мРНК, кодон-антикодоновым взаимодействием при считывании мРНК в рибосоме и синтезом аминоацил-тРНК. Специфичность трансляции не зависит от природы аминокислотного остатка аминоацил-тРНК [1], поэтому наличие в клетке полного набора правильно аминоацилированных тРНК имеет первостепенное значение для общей точности биосинтеза белка. Реакция аминоацилирования тРНК катализируется аминоацил-тРНК-синтетазами (аа!^), самой многочисленной группой ферментов различной специфичности, разделенных на два класса в соответствии со структурными характеристиками активных центров [2, 3]. Исключительно высокая точность реакции обеспечивается избирательным взаимодействием ферментов с аминокислотой и тРНК [4-7], а также наличием у некоторых из них дополнительной «корректирующей» (гидролитической) активности в отношении ошибочных продуктов [8-10]. Познание молекулярных основ узнавания тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами дает ключ к пониманию принципов высокоспецифичного нуклеиново-белкового взаимодействия и относится к числу фундаментальных проблем молекулярной биологии. Актуальность структурно-функциональных исследований этих ферментов и их взаимодействий с субстратами определяется также решением прикладных задач. Обнаруженные различия между ферментами (одной специфичности) бактерий и эукариот делают их перспективными мишенями для создания лекарств [3, 7, 11, 12]. Дополнительные функции в клеточных процессах (регуляция роста и дифференциации клеток, транскрипции и трансляции, участие в сплайсинге РНК, апоптозе и др.) устанавливают взаимосвязь между аминоацил-тРНК-синтетазами и болезнями человека, что может быть использовано для развития новых методов диагностики и терапии. Быстро развивающаяся биотехнология производства белков с необычными биохимическими и биофизическими свойствами основана на включении в целевые белки неприродных аминокислот с помощью мутантных форм аминоацил-тРНК-синтетаз и тРНК-синтетазных пар с измененной или ослабленной специфичностью [13-15], рациональное конструирование которых базируется на знании молекулярных основ селективного взаимодействия с субстратами [16].

Большие успехи в выявлении структурных элементов, по которым каждая ааЯБ отличает «свою» тРНК, достигнуты за последние два десятилетия, благодаря развитию подходов, основанных на использовании мутантных и химерных тРНК [7, 17]. Установлено, что специфичность обеспечивается индивидуальным для каждой пары набором структурных элементов тРНК - элементов узнавания (или специфичности).

Молекулярные детали избирательного взаимодействия с тРНК выявлены для многих aaRSs (в основном бактериального происхождения) с помощью рентгеноструктурного анализа [7, 17-19]. Различные районы тРНК взаимодействуют с определенными структурными доменами белка, общее число которых, способы укладки и степень участия в связывании и узнавании тРНК своеобразны для каждой пары. Образование комплекса сопровождается конформационными изменениями обеих макромолекул. Прямое узнавание основных элементов специфичности в тРНК - общее свойство антикодонузнающих aaRSs, в то время как для узнавания элементов, ответственных за формирование пространственной структуры и конфигурации отдельных районов субстрата, используются преимущественно непрямые механизмы. Полученные с помощью различных методов для некоторых ферментов данные о распознавании тРНК на стадии связывания и последующих этапах каталитического превращения показывают разнообразие и индивидуальность не только наборов элементов, но и выполняемых ими функций [20-29]. Сложной задачей при использовании традиционных подходов является идентификация непрямых элементов узнавания и их роли в обеспечении специфичности. Для ее решения может быть использован метод аффинной модификации химически активными аналогами субстратов, применявшийся в ранних исследованиях систем аминоацилирования [2, 30-32]. Данный метод представляется также перспективным для изучения конформационной динамики тРНК-синтетазных комплексов в разных функциональных состояниях и установления механизмов контроля продуктивного связывания акцепторного конца тРНК. Эта проблема не решена для большинства аминоацил-тРНК-синтетаз с известной трехмерной структурой их комплексов [33-41].

Целью настоящей работы было установление молекулярных механизмов специфичного функционирования фенилаланил-тРНК-синтетазы (PheRS), имеющей консервативную в прокариотах и цитоплазме эукариот четвертичную структуру (оф)2-типа, самую сложную и редкую для аминоацил-тРНК-синтетаз [2]. Основной объект исследования - PheRS из экстремально термофильной эубактерии Thermus thermophilics. Некоторые функциональные исследования проведены параллельно с цитоплазматической PheRS человека для проверки эволюционно консервативной природы механизмов. К началу выполнения работы расшифровывалась трехмерная структура PheRS Т. thermophilus [42]; были идентифицированы элементы узнавания в тРНКРЬе фенилаланил-тРНК-синтетазами Е. coli и дрожжей с использованием генетических методов in vivo и кинетических экспериментов in vitro соответственно [43-45]. Данная работа представляет собой комплексное изучение механизмов взаимодействия PheRS с субстратами с применением структурных и функциональных методов, и в ходе ее выполнения решались следующие задачи:

• идентификация структурных элементов PheRS Т. thermophilus, ответственных за узнавание АТР и L-фенилаланина и каталитическую активность;

• выявление механизмов дискриминации неспецифичных аминокислот для фенилаланил-тРНК-синтетаз эубактерий и эукариот;

• идентификация структурных элементов тРНКРЬе, определяющих специфичность ее аминоацилирования фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus-,

• установление функциональной роли элементов узнавания тРНКР11е в обеспечении эффективного распознавания на стадии связывания с ферментом;

• идентификация структурных элементов универсального ССА-конца, ответственных за продуктивное взаимодеиствие тРНКРЬе с PheRS;

• установление роли фенилаланина и АТР в обеспечении правильной ориентации акцепторного конца тРНКРНе в комплексе с PheRS (в условиях функциональной активности) для эволюционно различных систем;

• выявление относительного вклада элементов узнавания тРНКРЬе в формирование комплекса с функционально активной конформацией акцепторного конца;

• детальная локализация структурных перестроек комплекса PheRS Т. thermophilus с тРНКРЬе, индуцируемых малыми субстратами.

выводы

Впервые с использованием рентгеноструктурного анализа, аффинной модификации и кинетических методов выполнено комплексное исследование молекулярных механизмов специфичного аминоацилирования тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой (PheRS), ферментом с редкой (ар)г-структурой.

1. Изучены молекулярные основы избирательного взаимодействия фенилаланил-тРНК-синтетазы с низкомолекулярными субстратами и механизм активации аминокислоты.

• Установлено, что специфичность к L-фенилаланину обеспечивается связыванием боковой цепи субстрата в гидрофобном кармане PheRS Т. thermophilus и взаимодействиями с ароматическими остатками (Phea258 и Phea260) FPF-петли, которая характерна для фенилаланил-тРНК-синтетаз. Инвариантные остатки (Arga204, Phea216 и Arga321) мотивов 2 и 3, общих для П-ого класса аминоацил-тРНК-синтетаз, выполняют универсальные функции в связывании АТР и катализе. Активный центр каждого ap-гетеродимера сформирован полностью a-субъединицей. Структура его трех функционально важных фрагментов, петли мотива 2, спиральной петли и FPF-петли, стабилизирована взаимодействиями с Р-субъединицей, что объясняет необходимость олигомерной организации PheRS для синтеза аминоациладенилата.

• Показано, что активация L-тирозина и гидролиз ошибочного продукта аминоацилирования Tyr-TPHKPhe - эволюционно консервативные свойства фенилаланил-тРНК-синтетаз прокариот и высших эукариот. Доказано связывание неспецифичного субстрата в активном центре PheRS Т. thermophilus с сохранением ориентации, необходимой для активации и последующего переноса на тРНК. Локализован дополнительный активный центр, ответственный за гидролитическую функцию фермента; его уникальная структурная топология сформирована консервативными мотивами двух доменов Р-субъединицы. Специфичность этого центра к тирозину обеспечивается наличием в гидрофобном участке связывания боковой цепи лиганда гидрофильного остатка (Glup334), узнающего ОН-группу.

2. Изучен механизм узнавания тРНКРНе фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus.

• Путем независимых измерений кинетических характеристик аминоацилирования тРНКРЬе, мутантных тРНКРЬе, химерных и неспецифичных тРНК и равновесных констант диссоциации их комплексов с ферментом выявлены нуклеотиды тРНКРЬе, ответственные за эффективное аминоацилирование и связывание. Установлено, что антикодон вносит определяющий вклад в специфичность взаимодействия на разных стадиях. Общая архитектура и структурные особенности отдельных районов субстрата узнаются с участием нуклеотидов, характерных для тРНКРЬе и универсальных для канонических тРНК. Небольшой вклад в эффективность взаимодействия в процессе либо связывания, либо аминоацилирования обнаружен для Ш6 и А73 соответственно.

• Установлена разная молекулярная природа непрямых механизмов узнавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой. Нуклеотиды, образующие третичную пару 019-С56 и тройку и45-ОЮ-С25, вносят основной вклад в стабилизацию оптимальной для связывания и аминоацилирования трехмерной структуры тРНКРИе; другие элементы - 1116,1120, А31-Ш9, А26-044 и А73 - обеспечивают конформационную подстройку субстрата в разных функциональных комплексах. Впервые для фиксации динамических взаимодействий между непрямыми элементами узнавания тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазой использована з4и-индуцируемая аффинная модификация.

• Методом аффинной модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы з4и76-замещенными аналогами тРНКРЬе и ее мутантов впервые продемонстрировано участие элементов специфичности в создании комплекса с правильной ориентацией акцепторного конца. Влияние замен любых элементов узнавания на ориентацию 3'-концевого нуклеотида обнаружено в присутствии малых субстратов. Нарушение специфических взаимодействий фермента с антикодоном наиболее критично для функциональной ориентации акцепторного конца. Дополнительным подтверждением тонкой взаимной подстройки РЬеКБ и тРНКРЬе на этапе, предшествующем каталитической стадии, служат индуцируемые аналогом аденилата (РЬеОН-АМР) конформационные изменения в удаленных от активного центра районах, выявленные при рентгеноструктурном анализе комплекса Р11е118-тРНКРЬе-РЬеОН-АМР.

3. Установлены механизмы контроля продуктивного взаимодействия фенилаланил-тРНК-синтетаз с акцепторным концом тРНКРЬе.

• Показано активное участие универсальной 3'-концевой ССА-последовательности в каталитическом превращении тРНКРЬе различного происхождения соответствующими ферментами. Пиримидины в положениях 75 и 74 необходимы для проявления акцепторной активности тРНКРЬе. Функциональные группы акцептирующего нуклеотида А76 (имидазольное кольцо, З'-ОН- и б-ЫНг-группы) вносят основной вклад в каталитическую эффективность реакции.

• Впервые с использованием аффинной модификации изучена конформационная динамика взаимодействия фенилаланил-тРНК-синтетаз Т. [кегторкИш и человека с акцепторным концом тРНКР11е, индуцируемая малыми субстратами. Обнаружена эволюционная консервативность механизмов контроля продуктивного связывания акцепторного конца: ориентация акцептирующего нуклеотида определяется взаимодействиями фермента с АТР и фенилаланином; АТР принадлежит ведущая роль в создании активной конформации акцепторной ветви.

• Выявлена молекулярная природа взаимосвязи между тРНКр1,е и малыми субстратами. Ключевую роль в правильном размещении субстратов для аминоацилирования тРНКРЬе и динамике реакции играют: 1) кооперативные взаимодействия четырех остатков PheRS (Arga204, Glua206, Hisa212 и Arga321) с АМР-частью аденилата и А76; 2) стабилизация конформации подвижной спиральной петли за счет ее взаимодействия с карбонильной группой Phe-субстрата. Ориентация акцепторного конца в тройном комплексе PheRS'TPHKPhe«PheOH-AMP обеспечивается меж- и внутримолекулярными взаимодействиями с участием специфических функциональных групп, ответственных за положительный вклад ССА-конца и дискриминаторного основания А73 в каталитическую эффективность аминоацилирования тРНКРЬе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования показывают эффективность комплексного применения химических и биохимических методов в сочетании с РСА для решения проблемы узнавания тРНК ключевыми ферментами биосинтеза белка. Основным и незаменимым подходом к выявлению нуклеотидов, определяющих специфичность и эффективность взаимодействия тРНК с соответствующей aaRS, является наиболее широко используемый метод - измерение кинетических характеристик аминоацилирования in vitro специфичной тРНК и ее мутантных форм, химерных и неспецифичных тРНК. Как показано в нашей работе, проведение таких измерений в варьируемых экспериментальных условиях (модулирующих структурную стабильность тРНК) позволяет идентифицировать элементы с относительно небольшим вкладом в общую каталитическую эффективность. Так, для ряда нуклеотидов, ответственных за создание правильной конформации (общей или локальной) тРНКРНе в комплексе с PheRS, отрицательное влияние замен обнаружено лишь в оптимальных условиях реакции аминоацилирования. Большинство из них (U20, A26-G44 и U45) консервативны в тРНКРЬе эубактерий или эукариот и ответственны за более тонкое распознавание общей архитектуры тРНК эубактериальными PheRS s, обусловленное высоким уровнем структурного сходства неспецифичных тРНК с тРНКРЬе в соответствующих организмах. Поэтому выбор базовых структур тРНК для введения мутаций - немаловажный фактор для выявления полного набора элементов узнавания и адекватной количественной оценки их относительного вклада в специфичность. Измерения равновесных констант диссоциации комплексов (К^) с различными тРНК параллельно с кинетическими параметрами дают самую надежную информацию для идентификации элементов, обеспечивающих распознавание на стадии связывания и(или) каталитического превращения, и абсолютно необходимы, если значения К^ и констант Михаэлиса для тРНК существенно различаются, как в изучаемой нами системе. С помощью таких экспериментов показано, что природа некоторых минорных элементов узнавания тРНКРЬе важна только для эффективного связывания субстрата (U16) или его аминоацилирования (А73). Кроме того, сравнение эффектов разных типов мутаций отдельных нуклеотидов или элементов третичной структуры на прочность комплекса и скорость каталитического превращения позволило различить непрямые элементы специфичности по их роли в создании оптимальной конформации тРНК: путем стабилизации с помощью внутримолекулярных взаимодействий (G19-C56, G10-C25-U45) или участия в подстройке, индуцируемой взаимодействием с ферментом (U20, A26-G44). Окончательная идентификация таких элементов и механизмов их узнавания требует, безусловно, структурных исследований независимыми методами. з4Ц-Индуцируемая аффинная модификация статистически замещенными аналогами тРНК-транскриптов, примененная нами впервые для локализации нуклеотидов тРНК, образующих близкие контакты с аминоацил-тРНК-синтетазой, позволила зафиксировать взаимодействия непрямых элементов узнавания тРНКРЬе с РЬеКБ, обусловленные макромолекулярной динамикой комплекса. Этот метод удачно сочетается с другим химическим подходом -тиофосфатным футпринтингом: 1) оба подхода предусматривают выявление близких контактов, но разной природы (с участием оснований или фосфатных групп); 2) метод аффинной модификации позволяет идентифицировать взаимодействующие структурные элементы со стороны тРНК и белка; 3) с помощью футпринтинга можно выявить в одном эксперименте районы контакта и структурных перестроек тРНК в комплексе с ферментом. Информация о взаимодействиях между тРНКРЬе и РЬеЯ8 в растворе, полученная двумя методами, существенно дополняет данные РСА для кристаллической (статической) структуры.

Сравнительное изучение трехмерной структуры комплексов РИе!^ с тРНК№е, закристаллизованных в отсутствие или в присутствии устойчивого аналога аденилата, позволило идентифицировать конформационно подвижные нуклеотиды, модулирующие структуру тРНК в разных функциональных состояниях комплекса. Эти данные дополняют, в свою очередь, результаты исследований в растворе и доказывают участие непрямых элементов узнавания в конформационной адаптации тРНК. Кроме того, они служат прямым указанием на существование протяженных структурных перестроек первого и второго порядков, оптимизирующих взаимное соответствие тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы для эффективного связывания субстрата и каталитического превращения соответственно. Применение РСА для выявления конформационных изменений, обеспечивающих комплементарность между тРНК и синтетазой на разных стадиях взаимодействия, может быть ограничено глубиной перестроек при формировании комплекса в отсутствие или в присутствии малых лигандов (которая индивидуальна для каждой пары) и наложением кристаллографических эффектов, как видно из анализа имеющихся данных для других пар. Для изучения механизмов функционирования таких систем незаменимы химические подходы, в первую очередь, аффинная модификация аналогами тРНК, содержащими реакционноспособные нуклеотиды различной природы в определенных позициях, позволяющая фиксировать взаимодействия разной силы и, в том числе, динамического характера. Результативность этого метода продемонстрирована его применением для непосредственной регистрации участия различных элементов узнавания тРНКРЬе в создании комплекса с правильной ориентацией акцепторного конца. Данные по аффинной модификации РЬеЯ8 з4и-замещенными в 3'-концевой позиции производными мутантных тРНК показывают корреляцию между степенью нарушений в ориентации акцепторного конца и снижением эффективности (значения &са0 аминоацилирования, индуцируемых нуклеотидными заменами. Полученные результаты служат веским указанием на перспективность систематического изучения структуры тРНК-синтетазных комплексов с использованием мутантных форм тРНК (или фермента) для установления конкретной роли каждого элемента в обеспечении эффективности и специфичности взаимодействия. Такие исследования с применением РСА и методов быстрой кинетики рассматриваются как самая эффективная стратегия для детального описания механизма узнавания на структурном и кинетическом уровнях [623]. Предварительный отбор мутантных тРНК (или синтетаз) может быть выполнен с помощью более простого и экономичного метода - аффинной модификации фермента 3'-з4и-замещенными тРНК. Другим важным аспектом применения таких аффинных реагентов является установление взаимосвязи между тремя субстратами и роли низкомолекулярных субстратов в обеспечении ориентации акцепторного конца тРНК, необходимой для продуктивного взаимодействия. Параллельные исследования гетеротетрамерных фенилаланил-тРНК-синтетаз эубактериального и эукариотического происхождения показали консервативную природу молекулярных механизмов, ответственных за координацию взаимодействий двух ферментов с субстратами, несмотря на предполагаемые значительные различия в их структурной организации.

1. Chapeville F., Lipman F., Ehrenstein G.V., Weisblum В., Ray W.H., Benzer S. On the role of solubleribonucleic acid in coding for amino acids // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1962. V. 48. P. 1086-1092.

2. Meinnel Т., Mechulam Y., Blanquet S. Aminoacyl-tRNA synthetases: occurrence, structure, andfunction // tRNA: structure, biosynthesis and function / Söll D. and RajBhandary U. Eds. Washington: Amer. Soc. Microbiol. 1995. P. 251-292.

3. Ibba M., Söll D. Aminoacyl-tRNA synthesis // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 617-650.

4. Schimmel P.R., Söll D. Aminoacyl-tRNA synthetases: general features and recognition of transfer

5. RNAs. Review // Annu. Rev. Biochem. 1979. V. 48. P. 601-648.

6. Киселев Л.Л., Фаворова О.О., Лаврик О.И. Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз и тРНК.

7. Проблема узнавания // Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК / Под ред. Кнорре Д.Г. Москва: Наука. 1984. С. 312-390.

8. Giege R., Puglisi J.D., Florentz С. tRNA structure and aminoacylation efficiency // Progr. Nucleic

9. Acids Res. 1993. V. 45. P. 129-206.

10. Beuning P.J., Musier-Forsyth K. Transfer RNA recognition by aminoacyl-tRNA synthetases // Biopolymers. 1999. V. 52. P. 1-28.

11. Киселев Л.Л., Фаворова O.O., Лаврик О.И. Сверхспецифичность аминоацил-тРНК-синтетаз //

12. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК / Под ред. Кнорре Д.Г. Москва: Наука. 1984. С.145-209.

13. Sankaranarayanan R., Moras D. The fidelity of the translation of the genetic code. Review // Acta

14. Biochim. Pol. 2001. V. 48. P. 323-335.

15. Jakubowski H. Accuracy of aminoacyl-tRNA synthetases: proofreading of amino acids // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 384-393.

16. Francklyn C., Perona J.J., Puetz J., Hou Y.-M. Aminoacyl-tRNA synthetases: versatile players in the changing theater of translation // RNA. 2002. V. 8. P. 1363-1372.

17. Ochsner U.A., Sun X., Jarvis Т., Critchley I., Janjic N. Aminoacyl-tRNA synthetases: essential and still promising targets for new anti-infective agents // Expert Opin. Investig. Drugs. 2007. V. 16. P. 573-593.

18. Budisa N., Minks G., Alefelder S., Wenger W., Dong F., Moroder L., Huber R. Toward the experimental codon reassignment in vivo: protein building with an expanded amino acid repertoire // FASEB J. 1999. V. 13. P. 41-51.

19. Dougherty D.A. Unnatural amino acids as probes of protein structure and function // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V. 4. P. 645-652.

20. Köhrer С., RajBhandary U.L. Proteins with one or more unnatural amino acids // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 353-363.

21. Dahiyat B.I., Mayo S.L. De novo protein design: fully automated sequence selection // Science. 1997. V. 278. P. 82-87.

22. Giege R., Sissler M., Florentz C. Universal rules and idiosyncratic features in tRNA identity // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5017-5035.

23. Giege R., Frugier M. Transfer RNA structure and identity // Translation mechanisms / Lapointe J. and Brakier-Gingras L. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2003. P. 3-26.

24. First E.A. Catalysis of the tRNA aminoacylation reaction // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 328-352.

25. Liu J., Ibba M., Hong K.-W., Söll D. The terminal adenosine of tRNAG,n mediates tRNA-dependent amino acid recognition by glutaminyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 9836-9842.

26. Bovee M.L., Yan W., Sproat B.S., Francklyn C.S. tRNA discrimination at the binding step by a class II aminoacyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 13725-13735.

27. Ibba M., Sever S., Praetorius-Ibba M., Söll D. Transfer RNA identity contributes to transition state stabilization during aminoacyl-tRNA synthesis //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 3631-3637.

28. Khvorova A., Motorin Y., Wolfson A. Pyrophosphate mediates the effect of certain tRNA mutations on aminoacylation of yeast tRNAPhe //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4451-4456.

29. Gruic-Sovulj I., Landeka I., Söll D., Weygand-Durasevic I. tRNA-dependent amino acid discrimination by yeast seiyl-tRNA synthetase // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 5271-5279.

30. Banerjee R., Dubois D.Y., Gauthier J., Lin S.X., Roy S., Lapointe J. The zinc-binding site of a class I aminoacyl-tRNA synthetase is a SWIM domain that modulates amino acid binding via the tRNA acceptor arm // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 724-733.

31. Uter N.T., Perona J.J. Long-range intramolecular signaling in a tRNA synthetase complex revealed by pre-steady-state kinetics //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. V. 101. P. 14396-14401.

32. Shitivelband S., Hou Y.-M. Breaking the stereo barrier of amino acid attachment to tRNA by a single nucleotide // J. Mol. Biol. 2005. V. 348. P. 513-521.

33. Лаврик О.И., Невинский Г.А. Афинная модификация многосубстратных ферментов // Власов

34. B.В., Грачев М.А., Лаврик О.И. и др. Афинная модификация биополимеров / Под ред. Кнорре Д.Г. Новосибирск: Наука. 1983. С. 86-109.

35. Киселев Л.Л., Фаворова О.О., Лаврик О.И. Химическая модификация аминоацил-тРНК-синтетаз // Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК / Под ред. Кнорре Д.Г. Москва: Наука. 1984. С. 62-103.

36. Yaremchuk A., Cusack S., Tukalo M. Crystal structure of a eukaryote/archaeon-like prolyl-tRNA synthetase and its complex with tRNAPro(CGG) // EMBO J. 2000. V. 19. P. 4745-4758.

37. Silvian L.F., Wang J., Steitz T.A. Insights into editing from an Ile-tRNA synthetase structure with tRNAIle and mupirocin // Science. 1999. V. 285. P. 1074-1077.

38. Yaremchuk A., Kriklivyi I., Tukalo M., Cusack S. Class I tyrosyl-tRNA synthetase has a class II mode of cognate tRNA recognition // EMBO J. 2002. V. 21. P. 3829-3840.

39. Fukai S., Nureki O., Sekine S., Shimada A., Vassylyev D.G., Yokoyama S. Mechanism of molecular interactions for tRNAVal recognition by valyl-tRNA synthetase // RNA. 2003. V. 9. P. 100-111.

40. Kobayashi T., Nureki O., Ishitani R., Yaremchuk A., Tukalo M., Cusack S., Sakamoto K., Yokoyama S. Structural basis for orthogonal tRNA specificities of tyrosyl-tRNA synthetases for genetic code expansion//Nat. Struct. Biol. 2003. V. 10. P. 425-432.

41. Tukalo M., Yaremchuk A., Fukunaga R., Yokoyama S., Cusack S. The crystal structure of leucyl-tRNA synthetase complexed with tRNALeu in the post-transfer-editing conformation // Nat. Struct. Biol. 2005. V. 12. P. 923-930.

42. Fukunaga R., Yokoyama S. Aminoacylation complex structures of leucyl-tRNA synthetase and tRNALeu reveal two modes of discriminator-base recognition // Nat. Struct. Biol. 2005. V. 12. P.915-922.

43. Nakanishi K., Ogiso Y., Fukai S., Nureki O. Structural basis for anticodon recognition by methionyl-tRNA synthetase // Nat. Struct. Biol. 2005. V. 12. P. 931-932.

44. McClain W.H., Foss K. Nucleotides that contribute to the identity of Escherichia coli tRNAphe // J. Mol. Biol. 1988. V. 202. P. 697-709.

45. Sampson J.R., DiRenzo A.B., Behlen L.S., Uhlenbeck O.C. Nucleotides in yeast tRNAphe required for the specific recognition by its cognate synthetase // Science. 1989. V. 243. P. 1363-1366.

46. Sampson J.R., DiRenzo A.B., Behlen L.S., Uhlenbeck O.C. Role of the tertiary nucleotides in the interaction of yeast phenylalanine tRNA with its cognate synthetase // Biochemistry. 1990. V. 29. P.2523-2532.

47. Salazar J.C., Ahel I., Orellana O., Tumbula-Hansen D., Krieger R., Daniels L., Söll D. Coevolution of an aminoacyl-tRNA synthetase with its tRNA substrates // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. V. 100. P.13863-13868.

48. Praetorius-Ibba M., Ibba M. Aminoacyl-tRNA synthesis in archaea: different but not unique. Microreview // Mol. Microbiol. 2003. V. 48. P. 631-637.

49. Sauerwald A., Zhu W., Major T.A., Roy H., Palioura S., Jahn D., Whitman W.B., Yates J.R., Ibba M„ Söll D. RNA-dependent cysteine biosynthesis in archaea // Science. 2005. V. 307. P. 1969-1972.

50. Böck A., Thanbichler M., Rother M., Resch A. Selenocysteine // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 320-327.

51. Srinivasan G., James C.M., Krzycki J.A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA // Science. 2002. V. 296. P. 1459-1462.

52. Blight S.K., Larue R.C., Mahapatra A., Longstaff D.G., Chang E., Zhao G., Kang P.T., Green-Church K.B., Chan M.K., Krzycki J.A. Direct charging of tRNACUA with pyrrolysine in vitro and in vivo II Nature. 2004. V. 431. P. 333-335.

53. Polycarpo C., Ambrogelly A., Berube A., Winbush S.M., McCloskey J.A., Crain P.F., Wood J.L., Söll D. An aminoacyl-tRNA synthetase that specifically activates pyrrolysine // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. V. 101. P. 12450-12454.

54. Yarus M. Recognition of nucleotide sequences. Review // Annu. Rev. Biochem. 1969. V. 18. P. 841-880.

55. Kisselev L. The role of the anticodon in recognition of tRNA by aminoacyl-tRNA synthetases. Review // Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1985. V. 32. P. 237-266.

56. McClain W.H. Rules that govern tRNA identity in protein synthesis // J. Mol. Biol. 1993. V. 234. P. 257-280.

57. Cusack S. Eleven down and nine to go // Nat. Struct. Biol. 1995. V. 2. P. 824-831.

58. Eriani G., Delarue M., Poch O., Gangloff J., Moras D. Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs // Nature. 1990. V. 347. P. 203-206.

59. Cusack S., Berthet-Colominas C., Hartlein M., Nassar N., Leberman R. A second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia coli seryl-transfer tRNA synthetase at 2.5 A // Nature. 1990. V. 347. P. 249-255.

60. Gouda M., Yokogawa T., Nishikawa K. The 3 subunit of Aquifex aeolicus leucyl-tRNA synthetase is responsible for cognate tRNA recognition // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 297. P. 950-955.

61. Ibba M., Morgan S., Curnow A.W., Pridmore D.R., Vothknecht U.C., Gardner W., Lin W., Woese C.R., Soil D. A euryarchaeal lysyl-tRNA synthetase: resemblance to class I synthetases // Science. 1997. V. 278. P. 1119-1122.

62. Delarue M., Moras D. The aminoacyl-tRNA synthetase family: modules at work. Review // Bioessays. 1993. V. 15. P. 675-687.

63. Ibba M., Becker H.D., Stathopoulos C., Tumbula D.L., Soil D. The adaptor hypothesis revisited. Review // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 311-316.

64. Cavarelli J., Delagoutte B., Eriani G., Gangloff J., Moras D. L-Arginine recognition by yeast arginyl-tRNA synthetase // EMBO J. 1998. V. 17. P. 5438-5448.

65. Delagoutte B., Moras D., Cavarelli J. tRNA aminoacylation by arginyl-tRNA synthetase: induced conformations during substrates binding // EMBO J. 2000. V. 19. P. 5599-5610.

66. Newberry K.J., Hou Y.-M., Perona J.J. Structural origins of amino acid selection without editing by cysteinyl-tRNA synthetase // EMBO J. 2002. V. 21. P. 2778-2787.

67. Hauenstein S., Zhang C.-M., Hou Y.-M., Perona J.J. Shape-selective RNA recognition by cysteinyl-tRNA synthetase // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. V. 11. P. 1134-1141.

68. Nureki O., Vassylyev D.G., Tateno M., Shimada A., Nakama T., Fukai S., Konno M., Hendrickson T.L., Schimmel P., Yokoyama S. Enzyme structure with two catalytic sites for double-sieve selection of substrate // Science. 1998. V. 280. P. 578-582.

69. Nakama T., Nureki O., Yokoyama S. Structural basis for the recognition of isoleucyl-adenylate and an antibiotic, mupirocin, by isoleucyl-tRNA synthetase//!. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 47387-47393.

70. Cusack S., Yaremchuk A., Tukalo M. The 2 A crystal structure of leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-adenylate analogue // EMBO J. 2000. V. 19. P. 2351-2361.

71. Brunie S., Zelwer C., Risler J.L. Crystallographic study at 2.5 A resolution of the interaction of methionyl-tRNA synthetase from Escherichia coli with ATP // J. Mol. Biol. 1990. V. 216. P. 411-424.

72. Serre L., Verdon G., Choinowski T., Hervouet N., Risler J.-L., Zelwer C. How methionyl-tRNA synthetase creates its amino acid recognition pocket upon L-methionine binding // J. Mol. Biol. 2001. V.306. P. 863-876.

73. Terada T., Nureki O., Ishitani R., Ambrogelly A., Ibba M., Soli D., Yokoyama S. Functional convergence of two lysyl-tRNA synthetases with unrelated topologies // Nat. Struct. Biol. 2002. V. 9. P. 257-262.

74. Rould M.A., Perona J.J., Soil D., Steitz T.A. Structure of E. coli glutaminyl-tRNA synthetase complexed with tRNAGln and ATP at 2.8 A resolution // Science. 1989. V. 246. P. 1135-1142.

75. Rould M.A., Perona J.J., Steitz T.A. Structural basis of anticodon loop recognition by glutaminyl-tRNA synthetase//Nature. 1991. V. 352. P. 213-218.

76. Perona J.J., Rould M.A., Steitz T.A. Structural basis for transfer RNA aminoacylation by Escherichia coli glutaminyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 8758-8771.

77. Arnez J.G., Steitz T.A. Crystal structures of three misacylating mutants of Escherichia coli glutaminyl-tRNA synthetase complexed with tRNAGln and ATP // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 14725-14733.

78. Rath V.L., Silvian L.F., Beijer B., Sproat B.S., Steitz T.A. How glutaminyl-tRNA synthetase selects glutamine // Structure. 1998. V. 6. P. 439-449.

79. Bullock T.L., Uter N., Nissan T.A., Perona J.J. Amino acid discrimination by a class I aminoacyl-tRNA synthetase specified by negative determinants // J. Mol. Biol. 2003. V. 328. P. 395-408.

80. Sekine S., Nureki O., Dubois D.Y., Bernier S., Chenevert R., Lapointe J., Vassylyev D.G., Yokoyama S. ATP binding by glutamyl-tRNA synthetase is switched to the productive mode by tRNA binding // EMBO J. 2003. V. 22. P. 676-688.

81. Sekine S., Shichiri M., Bernier S., Chenevert R., Lapointe J., Yokoyama S. Structural basis of transfer RNA-dependent amino acid recognition and activation by glutamyl-tRNA synthetase // Structure. 2006. V. 14. P. 1791-1799.

82. Sekine S., Nureki O., Shimada A., Vassylyev D.G., Yokoyama S. Structural basis for anticodon recognition by discriminating glutamyl-tRNA synthetase // Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. P. 203-206.

83. Doublie S., Bricogne G., Gilmore C.J., Carter C.W.Jr. Tryptophanyl-tRNA synthetase crystal structure reveals an unexpected homology to tyrosyl-tRNA synthetase // Structure. 1995. V. 3. P. 17-31.

84. Buddha M.R., Crane B.R. Structures of tryptophanyl-tRNA synthetase II from Deinococcus radiodurans bound to ATP and tryptophan. Insight into subunit cooperativity and domain motions linked to catalysis//J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 31965-31973.

85. Buddha M.R., Crane B.R. Structure and activity of an aminoacyl-tRNA synthetase that charges tRNA with nitro-tryptophan //Nat. Struct. Biol. 2005. V. 12. P. 274-275.

86. Shen N., Guo L., Yang B., Jin Y., Ding J. Structure of human tryptophanyl-tRNA synthetase in complex with tRNATrp reveals the molecular basis of tRNA recognition and specificity // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 3246-3258.

87. Monteilhet C., Blow D.M., Brick P. Interaction of crystalline tyrosyl-tRNA synthetase with adenosine, adenosine monophosphate, adenosine triphosphate and pyrophosphate in the presence of tyrosinol // J. Mol. Biol. 1984. V. 173. P. 477-485.

88. Brick P., Bhat T.N., Blow D.M. Structure of tyrosyl-tRNA synthetase refined at 2.3 A resolution. Interaction of the enzyme with the tyrosyl adenylate intermediate // J. Mol. Biol. 1989. V. 208. P. 83-98.

89. Arnez J.G., Dock-Bregeon A.-C., Moras D. Glycyl-tRNA synthetase uses a negatively charged pit for specific recognition and activation of glycine // J. Mol. Biol. 1999. V. 286. P. 1449-1459.

90. Arnez J.G., Harris D.C., Mitschler A., Rees B., Francklyn C.S., Moras D. Crystal structure of histidyl-tRNA synthetase from Escherichia coli complexed with histidyl-adenylate // EMBO J. 1995. V. 14. P. 4143^4155.

91. Arnez J.G., Augustine J.G., Moras D., Francklyn C.S. The first step of aminoacylation at the atomic level in histidyl-tRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 7144-7149.

92. Aberg A., Yaremchuk A., Tukalo M., Rasmussen B., Cusack S. Crystal structure analysis of the activation of histidine by Thermus thermophilus histidyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 3084-3094.

93. Cusack S., Yaremchuk A., Kriklivyi I., Tukalo M. tRNAPro anticodon recognition by Thermus thermophilus prolyl-tRNA synthetase// Structure. 1998. V. 6. P. 101-108.

94. Kamtekar S., Kennedy W.D., Wang J., Stathopoulos C., Soil D., Steitz T.A. The structural basis of cysteine aminoacylation of tRNAPr0 by prolyl-tRNA synthetases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. P. 1673-1678.

95. Crepin T., Yaremchuk A., Tukalo M., Cusack S. Structures of two bacterial prolyl-tRNA synthetases with and without a cis-editing domain // Structure. 2006. V. 14. P. 1511-1525.

96. Sankaranarayanan R., Dock-Bregeon A.C., Rees B., Bovee M., Caillet J., Romby P., Francklyn C.S., Moras D. Zinc ion mediated amino acid discrimination by threonyl-tRNA synthetase // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 461-465.

97. Torres-Larios A., Sankaranarayanan R., Rees B., Dock-Bregeon A.-C., Moras D. Conformational movements and cooperativity upon amino acid, ATP and tRNA binding in threonyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 2003. V. 331. P. 201-211.

98. Belrhali H., Yaremchuk A., Tukalo M., Berthet-Colominas C., Rasmussen B., Bosecke P., Diat O., Cusack S. The structural basis for seryl-adenylate and Ap4A synthesis by seryl-tRNA synthetase // Structure. 1995. V. 3. P. 341-352.

99. Biou V., Yaremchuk A., Tukalo M., Cusack S. The 2.9 A crystal structure of T. thermophilics seryl-tRNA synthetase complexed with tRNASer// Science. 1994. V. 263. P. 1404-1410.

100. Bilokapic S., Maier T., Ahel D., Gruic-Sovulj I., Soli D., Weygand-Durasevic I., Ban N. Structure of the unusual seryl-tRNA synthetase reveals a distinct zinc-dependent mode of substrate recognition // EMBO J. 2006. V. 26. P. 2498-2509.

101. Iwasaki W., Sekine S., Kuroishi C., Kuramitsu S., Shirouzu M., Yokoyama S. Structural basis of the water-assisted asparagine recognition by asparaginyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 2006. V. 360. P. 329-342.

102. Cavarelli J., Rees B., Ruff M., Thierry J.-C., Moras D. Yeast tRNAAsp recognition by its cognate class II aminoacyl-tRNA synthetase //Nature. 1993. V. 362. P. 181-184.

103. Rees B., Cavarelli J., Moras D. Conformational flexibility of tRNA: structural changes in yeast tRNAAsp upon binding to aspartyl-tRNA synthetase // Biochimie. 1996. V. 78. P. 624-631.

104. Poterszman A., Delarue M., Thierry J.-C., Moras D. Synthesis and recognition of aspartyl-adenylate by Thermus thermophilus aspartyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 1994. V. 244. P. 158-167.

105. Briand C., Poterszman A., Eiler S., Webster G., Thierry J.-C., Moras D. An intermediate step in the recognition of tRNAAsp by aspartyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 2000. V. 299. P. 1051-1060.

106. Eiler S., Dock-Bregeon A.-C., Moulinier L., Thierry J.-C., Moras D. Synthesis of aspartyl-tRNAAsp in Escherichia coli a snapshot of the second step // EMBO J. 1999. V. 18. P. 6532-6541.

107. Rees B., Webster G., Delarue M., Boeglin M., Moras D. Aspartyl tRNA-synthetase from Escherichia coli: flexibility and adaptability to the substrates // J. Mol. Biol. 2000. V. 299. P. 1157-1164.

108. Moulinier L„ Eiler S., Eriani G„ Gangloff J., Thierry J.-C., Gabriel K„ McClain W.H., Moras D. The structure of an AspRS-tRNAAsp complex reveals a tRNA-dependent control mechanism // EMBO J. 2001. V. 20. P. 5290-5301.

109. Desogus G., Todone F., Brick P., Onesti S. Active site of lysyl-tRNA synthetase: structural studies of the adenylation reaction // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 8418-8425.

110. Swairjo M.A., Schimmel P.R. Breaking sieve for steric exclusion of a noncognate amino acid from active site of atRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 25. P. 988-993.

111. Fukunaga R., Yokoyama S. Structural insights into the first step of RNA-dependent cysteine biosynthesis in archaea //Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. P. 272-279.

112. Goldgur Y., Mosyak L., Reshetnikova L., Ankilova V., Khodyreva S., Lavrik O., Safro M. The crystal structure of phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus complexed with cognate tRNAPhe // Structure. 1997. V. 5. P. 59-68.

113. Arnez J.G., Moras D. Structural and functional considerations of the aminoacylation reaction // Trends Biochem. Sci. 1997. V. 22. P. 211-216.

114. Ataide S.F., Ibba M. Discrimination of cognate and noncognate substrates at the active site of class II lysyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 11836-11841.

115. Wang S., Praetorius-Ibba M., Ataide S.F., Roy H., Ibba M. Discrimination of cognate and noncognate substrates at the active site of class I lysyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 2006. V. 45. P.3646-3652.

116. Hendrickson T.L., Schimmel P. Transfer RNA-dependent amino acid discrimination by aminoacyl-tRNA synthetases // Translation mechanisms / Lapointe J. and Brakier-Gingras L. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2003. P. 34-64.

117. Fukunaga R., Fukai S., Ishitani R., Nureki O., Yokoyama S. Crystal structures of the CP1 domain from Thermus thermophilus isoleucyl-tRNA synthetase and its complex with L-valine // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 8396-8402.

118. Fukunaga R., Yokoyama S. Crystal structures of leucyl-tRNA synthetase from the archaeon Pyrococcus horikoshii reveals a novel editing domain orientation // J. Mol. Biol. 2005. V. 346. P. 57-71.

119. Fukunaga R., Yokoyama S. Structural basis for non-cognate amino acid discrimination by the valyl-tRNA synthetase editing domain // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 29937-29945.

120. Dock-Bregeon A.-C., Rees В., Torres-Larios A., Bey G., Caillet J., Moras D. Achieving error-free translation: the mechanism of proofreading of threonyl-tRNA synthetase at atomic resolution // Mol. Cell. 2004. V. 16. P. 375-386.

121. Dwivedi S., Kruparani S.P., Sankaranarayanan R. A D-amino acid editing module coupled to the translational apparatus in archaea//Nat. Struct. Biol. 2005. V. 12. P. 556-557.

122. Sokabe M., Okada A., Yao M., Nakashima Т., Tanaka I. Molecular basis of alanine discrimination in editing site // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 11669-11674.

123. SternJohn J., Hati S., Siliciano P.G., Musier-Forsyth K. Restoring species-specific posttransfer editing activity to a synthetase with a defunct editing domain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V.104. P.2127-2132.

124. Lee J.W., Beebe K., Nangle L.A., Jang J., Longo-Guess C.M., Cook S.A., Davisson M.T., Sundberg J.P., Schimmel P., Acherman S.L. Editing-defective tRNA synthetase causes misfolding and neurodegeneration//Nature. 2006. V. 443. P. 50-55.

125. Sprinzl M., Vassilenko K.S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33 (Database issue). P. D139-140.

126. Masquida В., Westhof W. On the wobble G-U and related pairs // RNA. 2000. V. 6. P. 9-15.

127. Varani G., McClain W.H. The G-U wobble base pair. A fundamental building block of RNA structure crucial to RNA function in diverse biological systems // EMBO Reports. 2000. V. 1. P. 18-23.

128. Rosenski J., Crain P.F., McCloskey J.A. The tRNA modification database: 1999 update // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 196-197.

129. Wang C., Sobral B.W., Williams K.P. Loss of a universal tRNA feature // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 1954-1962.

130. Sissler M., Pütz J., Fasiolo F., Florentz C. Mitochondrial aminoacyl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 271-284.

131. Kim S.H., Suddath F.L., Quigley G.J., McPherson A., Sussan J.L., Wang A.H.J., Seeman N.C., Rich A. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA // Science. 1974. V. 185. P. 435-440.

132. Robertos J.D., Ladner J.E., Finch J.T., Rhodes D., Brown R.S., Clark B.F.C., Klug A. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Á resolution // Nature. 1974. V. 250. P. 546-551.

133. Stout C.D., Mizuno H., Rubin J., Brennan Т., Rao S.T., Sundaralingam M. Atomic coordinates and molecular conformation of yeast phenylalanyl tRNA: an independent investigation // Nucleic Acids Res. 1976. V. 3. P. 1111-1123.

134. Jovine L., Djordjevic S., Rhodes D. The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 2.0 A resolution: cleavage by Mg2+ in 15-year old crystals // J. Mol. Biol. 2000. V. 301. P. 401-414.

135. Shi H., Moore P. The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 1.93 Á resolution: a classic structure revisited // RNA. 2000. V. 6. P. 1091-1105.

136. Киселев Jl.JI., Фаворова O.O., Лаврик О.И. Пространственная структура тРНК // Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК / Под ред. Кнорре Д.Г. Москва: Наука. 1984. С. 248-311.

137. Giegé R., Helm М., Florentz С. Chemical and enzymatic probing of RNA structure // Prebiotic chemistry, molecular fossils, nucleosides and RNA / Söll D., Nishimura S. and Moore P. Eds. Oxford: Pergamon. 1999. P. 63-80.

138. Durant P.C., Davis D.R. Stabilization of the anticodon stem-loop of tRNALys'3 by an A+-C base-pair and by pseudouridine // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 115-131.

139. Sundaram M., Durant P.C., Davis D.R. Hypermodified nucleosides in the anticodon of tRNALys stabilize a canonical U-turn structure // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 12575-12584.

140. Koshlap K.M., Guenther R., Sochacka E., Malkiewicz A., Agris P.F. A distinctive RNA fold: the solution structure of an analogue of the yeast tRNAPhe TyC domain // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 8647-8656.

141. Cabello-Villegas J., Winkler M.E., Nikonowicz E.P. Solution conformations of unmodified and A37 N6-dimethylallyl modified anticodon stem-loops of Escherichia coli tRNAPhe // J. Mol. Biol. 2002. V. 319. P. 1015-1034.

142. Stuart J.W., Koshlap K.M., Guenther R., Agris P.F. Naturally-occurring modification restricts the anticodon conformational space of tRNAphe // J. Mol. Biol. 2003. V. 334. P. 901-918.

143. Auffinger P., Westhof E. An extended structural signature for the tRNA anticodon loop // RNA. 2001. V. 7. P. 334-341.

144. Ashraf S.S., Guenther R.H., Ansari G., Malkiewicz A., Sochacka E., Agris P.F. Role of modified nucleosides of yeast tRNAPhe in ribosomal binding // Cell Biochem. Biophys. 2000. V. 33. P. 241-252.

145. Horie N., Yamaizumi Z., Kuchino Y., Takai K., Goldman E., Miyazawa Т., Nishimura S., Yokoyama S. Modified nucleosides in the first positions of the anticodons of tRNALeu4 and tRNALeu5 from Escherichia coli II Biochemistry. 1999. V. 38. P. 207-217.

146. Takai K., Yokoyama S. Role of 5-substituents of tRNA wobble uridines in the recognition of purine-ending codons // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 6383-6391.

147. Perreau V.M., Keith G., Holmes W.M., Przykorska A., Santos M.A.S., Tuite M.F. The Candida albicans CUG-decoding ser-tRNA has an atypical anticodon stem-loop structure // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. P. 1039-1053.

148. Limmer S., Hofmann H.-P., Ott G., Sprinzl M. The 3'-terminal end (NCCA) of tRNA determines the structure and stability of the aminoacyl acceptor stem // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 6199-6202.

149. Puglisi E.V., Puglisi J.D., Williamson J.R., RajBhandary U.L. NMR analysis of tRNA acceptor stem microhelixes: discriminator base change affects tRNA conformation at the 3' end // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 11467-11471.

150. Holland J.A., Hou Y.-M., Davis D.R. NMR structural studies of the tRNACys amino acceptor stem of Mycoplasma pneumonia I I Nucleic Acids Sym. Series. 1999. V. 4. P. 101-103.

151. Sampson J.R., Uhlenbeck O.C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P.1033-1037.

152. Hall K.B., Sampson J.R., Uhlenbeck O.C., Redfield A.G. Structure of an unmodified tRNA molecule // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 5794-5801.

153. Friederich M.W., Hagerman P.J. The angle between the anticodon and aminoacyl acceptor stems of yeast tRNAPhe is strongly modulated by magnesium ions // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 6090-6099.

154. Maglott E.J., Deo S.S., Przykorska A., Glick G.D. Conformational transitions of an unmodified tRNA: implications for RNA folding // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 16349-16359.

155. Serebrov V., Vassilenko K., Kholod N., Gross H.J., Kisselev L. Mg2+ binding and structural stability of mature and in vitro synthesized unmodified Escherichia coli tRNAphe // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2723-2728.

156. Vermeulen A., McCallum S.A., Pardi A. Comparison of the global structure and dynamics of native and unmodified tRNAVal // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 6024-6033.

157. Vives M., Tauler R., Gargallo R. Study of the influence of metal ions on tRNAPhe thermal unfolding equilibria by UV spectroscopy and multivariate curve resolution // J. Inorg. Chem. 2002. V. 89. P. 115-122.

158. Madore E., Florentz C., Giege R., Lapointe J. Magnesium-dependent alternative foldings of active and inactive Escherichia coli tRNAGIu revealed by chemical probing 11 Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 3583-3588.

159. Jia Y., Sytnik A., Li L., Vladimirov S., Cooperman B.S., Hochstrasser R.M. Nonexponentional kinetics of a single yeast tRNAphe molecule under physiological conditions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 7932-7936.

160. Friederich M.W., Vacano E., Hagerman P.J. Global flexibility of tertiary structure in RNA: yeast tRNAphe as a model system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 3572-3577.

161. Auffinger P., Louise-May S., Westhof E. Molecular dynamics simulations of solvated yeast tRNAAsp // Biophys. J. 1999. V. 76. P. 50-64.

162. Auffinger P., Westhof E. RNA hydration: three nanoseconds of multiple molecular dynamics simulations of the solvated tRNAAsp anticodon hairpin // J. Mol. Biol. 1997. V. 269. P. 326-341.

163. Giel-Pietraszuk M., Barciszewski J. A nature of conformational changes of yeast tRNAphe. High hydrostatic pressure effects // Int. J. Biol. Macromol. 2005. V. 37. P. 109-114.

164. Pallanck L., Schulman L.H. tRNA discrimination in aminoacylation // Transfer ribonucleic acid in protein synthesis / Hatfield D.L., Lee B.J. and Pirtle R.M. Eds. London: CRC Press. 1992. P. 279-318.

165. Hou Y.-M., Schimmel P. A simple structural feature is a major determinant of the identity of a transfer RNA//Nature. 1988. V. 333. P. 140-145.

166. McClain W.H., Foss K. Changing the identity of a tRNA by introducing a G-U wobble pair near the 3' acceptor end // Science. 1988. V. 240. P. 793-796.

167. McClain W.H., Foss K. Changing the acceptor identity of a transfer RNA by altering nucleotides in a «variable pocket» // Science. 1988. V. 241. P. 1804-1807.

168. McClain W.H. Identity of Escherichia coli tRNACys determined by nucleotides in three regions of tRNA tertiary structure // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 19398-19402.

169. Komatsoulis G.A., Abelson J. Recognition of tRNACys by Escherichia coli cysteinyl-tRNA synthetase//Biochemistry. 1993. V. 32. P. 7435-7444.

170. McClain W.H., Gabriel K. Construction of an Escherichia coli knockout strain for functional analysis oftRNAAsp // J. Mol. Biol. 2001. V. 310. P. 537-542.

171. Milligan J.R., Groebe D.R., Witherell G.W., Uhlenbeck O.C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates //Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 8783-8798.

172. Milligan J.R., Uhlenbeck O.C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase // Methods Enzymol. 1989. V. 180. P. 51-62.

173. Gasparutto D., Livache Т., Bazin H., Duplaa A.-M., Guy A., Khorlin A., Molko D., Roget A., Teoule R. Chemical synthesis of a biologically active natural tRNA with its minor bases // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5159-5166.

174. Schreier A.A., Schimmel P.R. Transfer ribonucleic acid synthetase catalyzed deacylation of aminoacyl transfer ribonucleic acid in the absence of adenosine monophosphate and pyrophosphate // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 1582-1589.

175. Wolfson A.D., Pleiss J.A., Uhlenbeck O.C. A new assay for tRNA aminoacylation kinetics // RNA. 1998. V. 4. P. 1019-1023.

176. Hartman M.C., Josephson K., Szostak J.W. Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 4356-4361.

177. Schulman L.H., Pelka H. The anticodon contains a major element of the identity of arginine transfer RNAs // Science. 1989. V. 246. P. 1595-1597.

178. Tamura K., Himeno H., Asahara H., Hasegawa Т., Shimizu M. In vitro study of E. coli tRNA^8 and tRNALys identity elements // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 2335-2339.

179. Eriani G., Cavarelli J. Arginyl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 3-11.

180. Sissler M., Giege R., Florentz C. Arginine aminoacylation identity is context-dependent and ensured by alternate recognition sets in the anticodon loop of accepting tRNA transcripts // EMBO J. 1996. V. 15. P. 5069-5076.

181. Geslain R., Martin F., Camasses A., Eriani G. A yeast knockout strain to discriminate between active and inactive tRNA molecules // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 4729-4737.

182. Guigou L., Mirande M. Determination in tRNA for activation of arginyl-tRNA synthetase: evidence that tRNA flexibility is required for the induced-fit mechanism // Biochemistiy. 2005. V. 44. P. 16540-16548.

183. Pallanck L., Schulman L.H. Anticodon-dependent aminoacylation of a noncognate tRNA with isoleucine, valine, and phenylalanine in vivo II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3872-3876.

184. Chu W.-C., Horowitz J. Recognition of Escherichia coli valine transfer RNA by its cognate synthetase: a fluorine-19 NMR study // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 1655-1663.

185. Tamura K., Himeno H., Asahara H., Hasegawa T., Shimizu M. Identity determinants of E. coli tRNAVal // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 177. P. 619-623.

186. Horowitz J., Chu W.C., Derrick W.B., Liu J.C., Liu M., Yue D. Synthetase recognition determinants of £ coli valine transfer RNA // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 7737-7746.

187. Nureki O., Yokoyama S. Valyl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 59-67.

188. Muramatsu T., Nishikawa K., Nemoto F., Kuchino Y., Nishimura S., Miyazawa T., Yokoyama S. Codon and amino-acid specificities of a transfer RNA are both converted by a single post-transcriptional modification//Nature. 1988. V. 336. P. 179-181.

189. Nureki O., Niimi T., Muramatsu T., Kanno H., Kohno T., Florentz C., Giege R., Yokoyama S. Molecular recognition of the identity-determinant set of isoleucine transfer RNA from Escherichia coli Hi. Mol. Biol. 1994. V. 236. P. 710-724.

190. Senger B., Auxilien S., Englisch U., Cramer F., Fasiolo F. The modified wobble base inosine in yeast tRNAlle is a positive determinant for aminoacylation by isoleucyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 8269-8275.

191. Normanly J., Ollick T., Abelson J. Eight base changes are sufficient to convert a leucine-inserting tRNA into a serine-inserting tRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 5680-5684.

192. Asahara H., Himeno H., Tamura K., Hasegawa T., Watanabe K., Shimizu M. Recognition nucleotides of Escherichia coli tRNALeu and its elements facilitating discrimination from tRNASer and tRNATyr // J. Mol. Biol. 1993. V. 231. P. 219-229.

193. Asahara H., Nameki N., Hasegawa T. In vitro selection of RNAs aminoacylated by Escherichia coli leucyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 1998. V. 283. P. 605-618.

194. Tocchini-Valentini G., Saks M.E., Abelson J. tRNA leucine identity and recognition sets // J. Mol. Biol. 2000. V. 298. P. 779-793.

195. Du X., Wang E.-D. Tertiary structure base pairs between D- and T\|/C-loops of Escherichia coli tRNAUu play important roles in both aminoacylation and editing // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 2865-2872.

196. Lincecum T.L.Jr., Martinis S.A. Leucyl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 36-46.

197. Soma A., Kumagai R., Nishikawa K., Himeno H. The anticodon loop is a major identity determinant of Saccharomyces cerevisiae tRNALeu // J. Mol. Biol. 1996. V. 263. P. 707-714.

198. Breitschopf K., Gross H.J. The discriminator bases G73 in human tRNASer and A73 in tRNALeu have significantly different roles in the recognition of aminoacyl-tRNA synthetases // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 405-410.

199. Breitschopf K., Achsel T., Busch K., Gross H.J. Identity elements of human tRNALeu: structural requirements for converting human tRNASer into a leucine acceptor in vitro II Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3633-3637.

200. Soma A., Uchiyama K., Sakamoto T., Maeda M., Himeno H. Unique recognition style of tRNALeu by Haloferax volcanii leucyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. P. 1029-1038.

201. Schulman L.H., Pelka H. Anticodon switching changes the identity of methionine and valine transfer RNAs // Science. 1988. V. 242. P. 765-768.

202. Meinnel T., Mechulam Y., Lazennec C., Blanquet S., Fayat G. Critical role of the acceptor stem of tRNAs in their aminoacylation by Escherichia coli methionyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 1993. V. 229. P. 26-36.

203. Senger B., Despons L., Walter P., Fasiolo F. The anticodon triplet is not sufficient to confer methionine acceptance to a transfer RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10768-10771.

204. Senger B., Aphasizhev R., Walter P., Fasiolo F. The presence of a D-stem but not a T-stem is essential for triggering aminoacylation upon anticodon binding in yeast methionine tRNA // J. Mol. Biol. 1995. V. 249. P. 45-58.

205. Aphasizhev R., Senger B., Fasiolo F. Importance of structural features for tRNAMet identity // RNA. 1997. V. 3. P. 489-497.

206. Ramesh V., RajBhandary U.L. Importance of the anticodon sequence in the aminoacylation of tRNAs by methionyl-tRNA synthetase and by valyl-tRNA synthetase in an archaebacterium // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 3660-3665.

207. Pallanck L., Li S., Schulman L.H. The anticodon and discriminator base are major determinants of cysteine tRNA identity in vivo II J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 7221-7223.

208. Hamann C.S., Hou Y.-M. An RNA structural determinant for tRNA recognition // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 7967-7972.

209. Lipman R.S., Hou Y.-M. Aminoacylation of tRNA in the evolution of an aminoacyl-tRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 13495-13500.

210. Hou Y.-M., Perona J.J. Cysteinyl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 12-23.

211. Hou Y.-M., Sterner T., Bhalla R. Evidence for a conserved relationship between an acceptor stem and a tRNA for aminoacylation // RNA. 1995. V. 7. P. 707-713.

212. Hou Y.-M., Motegi H., Lipman R.S.A., Hamann C.S., Shiba K. Conservation of a tRNA core for aminoacylation // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4743-4750.

213. Evilia C., Ming X., Dassarma S., Hou Y.-M. Aminoacylation of an unusual tRNACys from an extreme halophile // RNA. 2003. V. 9. P. 794-801.

214. Normanly J., Kleina L.G., Masson J.M., Abelson J., Miller J.H. Construction of Escherichia coli amber suppressor tRNA genes. III. Determination of tRNA specificity // J. Mol. Biol. 1990. V. 213. P. 719-726.

215. Sylvers L.A., Rogers K.C., Shimizu M., Ohtsuka E., Soli D. A 2-thiouridine derivative in tRNAGlu is a positive determinant for aminoacylation by Escherichia coli glutamyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 3836-3841.

216. Gregory S.T., Dahlberg A.E. Effects of mutations at position 36 of tRNAGlu on missense and nonsense suppression in Escherichia coli // FEBS Lett. 1995. V. 361. P. 25-28.

217. Sekine S., Nureki O., Sakamoto K., Niimi T., Tateno M., Go M., Kohno T., Brisson A., Lapointe J., Yokoyama S. Major identity determinants in the «augmented D helix» of tRNAGlu from Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1996. V. 256. P. 685-700.

218. Kruger M.K., Sorensen M.A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo II J. Mol. Biol. 1998. V. 284. P. 609-620.

219. Rogers M.J., Soil D. Discrimination between glutaminyl-tRNA synthetase and seryl-tRNA synthetase involves nucleotides in the acceptor helix of tRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6627-6631.

220. Hayase Y., Jahn M., Rogers M.J., Sylvers L.A., Koizumi M., Inoue H., Ohtsuka E., Soli D. Recognition of bases in Escherichia coli tRNAGln by glutaminyl-tRNA synthetase: a complete identity set//EMBO J. 1992. V. 11. P. 4159-4165.

221. McClain W.H., Schneider J., Bhattacharya S., Gabriel K. The importance of tRNA backbone-mediated interactions with synthetase for aminoacylation // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1998. V. 95. P. 460-465.

222. Nissan T.A., Oliphant B., Perona J.J. An engineered class I transfer RNA with a class II tertiary fold // RNA. 1999. V. 5. P. 434-445.

223. Nissan T.A., Perona J.J. Alternative designs for construction of the class II transfer RNA tertiary core // RNA. 2000. V. 6. P. 1585-1596.

224. Hou Y.-M., Schimmel P. Modeling with in vitro kinetic parameters for the elaboration of transfer RNA identity in vivo II Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4942-4947.

225. Bedouelle H. Recognition of tRNATyr by tyrosyl-tRNA synthetase // Biochimie. 1990. V. 72. P. 589-598.

226. Himeno H., Hasegawa T., Ueda T., Watanabe K., Shimizu M. Conversion of aminoacylation specificity from tRNATyr to tRNASer in vitro //Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 6815-6819.

227. Bonnefond L., Giege R., Rudinger-Thirion J. Evolution of the tRNATyr/TyrRS aminoacylation system // Biochimie. 2005. V. 87. P. 873-883.

228. Bare L.A., Uhlenbeck O.C. Specific substitution into the anticodon loop of yeast tyrosine transfer RNA // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 5825-5830.

229. Fechter P., Rudinger-Thirion J., Theobald-Dietrich A., Giege R. Identity of tRNA for yeast tyrosyl-tRNA synthetase: Tyrosylation is more sensitive to identity nucleotides than structural features // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 1725-1733.

230. Fechter P., Rudinger-Thirion J., Tukalo M., Giege R. Major tyrosine identity determinants in Methanococcus jannaschii and Saccharomyces cerevisiae tRNATyr are conserved but expressed differently // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 761-767.

231. Wakasugi K., Quinn C.L., Tao N., Schimmel P. Genetic code in evolution: switching species-specific aminoacylation with a peptide transplantant // EMBO J. 1998. V. 17. P. 297-305.

232. Himeno H., Hasegawa T., Asahara H., Tamura K., Shimizu M. Identity determinants of E. coli tryptophan tRNA //Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 6379-6382.

233. Pak M., Willis I.M., Schulman L.H. Analysis of acceptor stem base pairing on tRNATrp aminoacylation and function in vivo II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 2277-2282.

234. Xue H., Shen W., Giege R., Wong J.T. Identity elements of tRNATrp. Identification and evolutionary conservation // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 9316-9322.

235. Xu F., Jiang G., Li W., He X., Jin Y., Wang D. Three G-C base pairs required for the efficient aminoacylation of tRNATrp by tryptophanyl-tRNA synthetase from Bacillus subtilis II Biochemistry. 2002. V. 41. P. 8087-8792.

236. Yesland K.D., Johnson J.D. Anticodon bases C34 and C35 are major, positive, identity elements in Saccharomyces cerevisiae tRNATrp // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 5079-5084.

237. Ulmasov B., Topin A., Chen Z., He S.H., Folk W.R. Identity elements and aminoacylation of plant tRNATrp// Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5139-5141.

238. Ibba M., Losey H.C., Kawarabayasi Y., Kikuchi H., Bunjun S. Substrate recognition by class I lysyl-tRNA synthetases: a molecular basis for gene displacement // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1999. V. 96. P. 418-423.

239. Soli D., Becker H.D., Plateau P., Blanquet S., Ibba M. Context-dependent anticodon recognition by class I lysyl-tRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 2000. V. 97. P. 14224-14228.

240. Ambrogelly A., Korencic D., Ibba M. Functional annotation of class I lysyl-tRNA synthetase phylogeny indicates a limited role of gene transfer // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 4594-4600.

241. Ambrogelly A., Frugier M., Ibba M., Soli D., Giege R. Transfer RNA recognition by class I lysyl-tRNA synthetase from Lyme disease pathogen Borrelia burgdoferi II FEBS Lett. 2005. V. 579. P. 2629-2634.

242. Shimizu M., Asahara H., Tamura K., Hasegawa T., Himeno H. The role of anticodon bases and the discriminator nucleotide in the recognition of some E. coli tRNAs by their aminoacyl-tRNA synthetases // J. Mol. Evol. 1992. V. 35. P. 436^143.

243. Sampson J.R., Saks M.E. Contributions of discrete tRNASer domains to aminoacylation by E. coli seryl-tRNA synthetase: a kinetic analysis using model RNA substrates // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 4467^1475.

244. Asahara H., Himeno H., Tamura K., Nameki N., Hasegawa T., Shimizu M. Escherichia coli seryl-tRNA synthetase recognizes tRNASer by its characteristic tertiary structure // J. Mol. Biol. 1994. V. 236. P. 738-748.

245. Saks M.E., Sampson J.R. Variant minihelix RNAs reveal sequence-specific recognition of the helical tRNASer acceptor stem by E. coli seryl-tRNA synthetase // EMBO J. 1996. V. 15. P. 2843-2849.

246. Himeno H., Yoshida S., Soma A., Nishikawa K. Only one nucleotide insertion to the long variable arm confers an efficient serine acceptor activity upon Saccharomyces cerevisiae tRNALeu in vitro II J. Mol. Biol. 1997. V. 268. P. 704-711.

247. Lenhard B., Orellana O., Ibba M., Weygand-Durasevic I. Survey and summary. tRNA recognition and evolution of determinants in seryl-tRNA synthesis // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 721-729.

248. Weygand-Durasevic I., Cusack S. Seryl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 177-192.

249. Gruic-Sovulj I., Jaric J., Dulic M., Cindric M., Weygand-Durasevic I. Shuttling of discrete tRNASer regions reveals differently utilized identity elements in yeast and methanogenic archaea // J. Mol. Biol. 2006. V. 361. P. 128-139.

250. Achsel T., Gross H.J. Identity determinants of human tRNASer: sequence elements necessary for serylation and maturation of a tRNA with a long extra arm // EMBO J. 1993. V. 12. P. 3333-3338.

251. Heckl M., Busch K., Gross H.J. Minimal tRNASer and tRNASec substrates for human seryl-tRNA synthetase: contribution of tRNA domains to serylation and tertiary structure // FEBS Lett. 1998. V. 427. P. 315-319.

252. Korencic D., Polycarpo C., Weygand-Durasevic I., Soil D. Differential modes of transfer tRNASer recognition in Methanosarcina barkeri II J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 48780-48786.

253. Hasegawa T., Miyano M., Himeno H., Sano Y., Kimura K., Shimizu M. Identity determinants of E. coli threonine tRNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 184. P. 478^184.

254. Nameki N., Asahara H., Hasegawa T. Identity elements of Thermus thermophilics tRNAThr // FEBS Lett. 1996. V. 396. P. 201-207.

255. Nameki N. Identity elements of tRNAThr towards Saccharomyces cerevisiae threonyl-tRNA synthetase // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 2831-2836.

256. Ishikura H., Nagaoka Y., Yokozawa J., Umehara T., Kuno A., Hasegawa T. Threonyl-tRNA synthetase of archaea: importance of the discriminator base in the aminoacylation of threonine tRNA //Nucleic Acids Symp. Ser. 2000. V. 44. P. 83-84.

257. McClain W.H., Schneider J., Gabriel K. Distinctive acceptor-end structure and other determinants of Escherichia coli tRNAPro identity // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 522-529.

258. Liu H., Peterson R., Kessler J., Musier-Forsyth K. Molecular recognition of tRNAPro by Escherichia coli proline tRNA synthetase in vitro //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 165-169.

259. Burke B., Yang F., Chen F., Stehlin C., Chan B., Musier-Forsyth K. Evolutionary coadaptation of the motif 2-acceptor stem interaction in the class II prolyl-tRNA synthetase system // Biochemistry. 2000. V.39.P.15540-15547.

260. Hasegawa T., Yokogawa T. Escherichia coli proline tRNA: structure and recognition sites for prolyl-tRNA synthetase //Nucleic Acids Symp. Ser. 2000. V. 44. P. 7-8.

261. Stehlin C., Burke B., Yang F., Liu H., Shiba K., Musier-Forsyth K. Species-specific differences in the operational RNA code for aminoacylation of tRNAPro // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 8605-8613.

262. Lipman R.S., Wang J., Sowers K.R., Hou Y.-M. Prevention of mis-aminoacylation of a dual-specificity aminoacyl-tRNA synthetase //J. Mol. Biol. 2002. V. 315. P. 943-949.

263. Yokozawa J., Okamoto K., Kawarabayasi Y., Kuno A., Hasegawa T. Molecular recognition of proline tRNA by prolyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix K1 // Nucleic Acids Res. Suppl. 2003. V. 3. P. 247-248.

264. McClain W.H., Foss K., Jenkins R.A., Schneider J. Rapid determination of nucleotides that define tRNAoly acceptor identity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 6147-6151.

265. Francklyn C., Shi J.P., Schimmel P. Overlapping nucleotide determinants for specific aminoacylation of RNA microhelices // Science. 1992. V. 255. P. 1121-1125.

266. Nameki N., Tamura K., Asahara H., Hasegawa T. Recognition of tRNAGly by widely diverged glycyl-tRNA synthetases //J. Mol. Biol. 1997. V. 268. P. 640-647.

267. Mazauric M.-H., Roy H., Kern D. tRNA glycylation system from Thermus thermophilus. tRNAGly identity and functional interrelation with the glycylation systems from other phylae // Biochemistiy. 1999. V.38.P. 13094-13105.

268. Hipps D., Shiba K., Henderson B., Schimmel P. Operational RNA code for amino acids: species-specific aminoacylation of minihelices switched by a single nucleotide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92.P.5550-5552.

269. Himeno H., Hasegawa T., Ueda T., Watanabe K., Miura K., Shimizu M. Role of the extra G-C pair at the end of the acceptor stem of tRNAH,s in aminoacylation // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 7855-7863.

270. Francklyn C., Schimmel P. Enzymatic aminoacylation of an eight-base-pair microhelix with histidine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 8655-8659.

271. Yan W., Francklyn C. Cytosine 73 is a discriminator nucleotide in vivo for histidyl-tRNA in Escherichia coli Hi. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 10022-10027.

272. Yan W., Augustine J., Francklyn C. A tRNA identity switch mediated by the binding interaction between a tRNA anticodon and the accessory domain of a class II aminoacyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 6559-6568.

273. Hawko S.A., Francklyn C.S. Covariation of a specificity-determining structural motif in an aminoacyl-tRNA synthetase and a tRNA identity element // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 1930-1936.

274. Connolly S.A., Rosen A.E., Musier-Forsyth K., Francklyn C.S. G-1:C73 recognition by an arginine cluster in the active site of Escherichia coli histidyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 962-969.

275. Rosen A.E., Musier-Forsyth K. Recognition of G-1:C73 atomic groups by Escherichia coli histidyl-tRNA synthetase // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 64-65.

276. Rudinger J., Florentz C., Giege R. Histidylation by yeast HisRS of tRNA or tRNA-like structure relies on residues -1 and 73 but is dependent on the RNA context // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 5031-5037.

277. Nameki N., Asahara H., Shimizu M., Okada N., Himeno H. Identity elements of Saccharomyces cerevisiae tRNAHis //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 389-394.

278. Rosen A.E., Brooks B.S., Guth E., Francklyn C.S., Musier-Forsyth K. Evolutionary conservation of a functionally important backbone phosphate group critical for aminoacylation of histidine tRNAs. // RNA. 2006. V. 12. P. 1315-1322.

279. Hasegawa T., Himeno H., Ishikura H., Shimizu M. Discriminator base of tRNAAsp is involved in amino acid acceptor activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 163. P. 1534-1538.

280. Nameki N., Tamura K., Himeno H., Asahara H., Hasegawa T., Shimizu M. Escherichia coli tRNAAsp recognition mechanism differing from that of the yeast system // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 189. P. 856-862.

281. Giege R., Florentz C., Kern D., Gangloff J., Eriani G., Moras D. Aspartate identity of transfer RNAs // Biochimie. 1996. V. 78. P. 605-623.

282. Choi H., Gabriel K., Schneider J., Otten S., McClain W.H. Recognition of acceptor-stem structure of tRNAAsp by Escherichia coli aspartyl-tRNA synthetase // RNA. 2003. V. 9. P. 386-393.

283. Giege R., Rees B. Aspartyl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 210-226.

284. Becker H.D., Giege R., Kern D. Identity of prokaryotic and eukaryotic tRNAAsp for aminoacylation by aspartyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilics II Biochemistry. 1996. V. 35. p. 7447-7458.

285. Piitz J., Puglisi J.D., Florentz C., Giege R. Identity elements for specific aminoacylation of yeast tRNAAsp by cognate aspartyl-tRNA synthetase // Science. 1991. V. 252. P. 1696-1699.

286. Frugier M., Soli D., Giege R., Florentz C. Identity switches between tRNAs aminoacylated by class I glutaminyl- and class II aspartyl-tRNA synthetases // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 9912-9921.

287. Fender A., Geslain R., Eriani G., Giege R., Sissler M., Florentz C. A yeast arginine specific tRNA is a remnant aspartate acceptor // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 5076-5086.

288. Shiba K., Stello T., Motegi H., Noda T., Musier-Forsyth K., Schimmel P. Human lysyl-tRNA synthetase accepts nucleotide 73 variants and rescues Escherichia coli double-defective mutant // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 22809-22816.

289. Stello T., Hong M., Musier-Forsyth K. Efficient aminoacylation of tRNALys'3 by human lysyl-tRNA synthetase is dependent on covalent continuity between the acceptor and the anticodon domain // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4823-4829.

290. Li S., Pelka H., Schulman L.H. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNAAsn // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 18335-18339.

291. Tinkle Peterson E., Uhlenbeck O.C. Determination of recognition nucleotides for Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 10380-10389.

292. Sampson J.R., Behlen L.S., DiRenzo A.B., Uhlenbeck O.C. Recognition of yeast tRNAPhe by its cognate yeast phenylalanyl-tRNA synthetase: an analysis of specificity // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 4161-4167.

293. Nazarenko I.A., Tinkle Peterson E., Zakharova O.D., Lavrik O.I., Uhlenbeck O.C. Recognition nucleotides for human phenylalanyl-tRNA synthetase //Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 475-478.

294. Hou Y.-M., Schimmel P. Evidence that a major determinant for the identity of a transfer RNA is conserved in evolution // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 6800-6804.

295. Tamura K., Asahara H., Himeno H., Hasegawa Т., Shimizu M. Identity elements of Escherichia coli tRNAAla//J. Mol. Recognit. 1991. V. 4. P. 129-132.

296. McClain W.H., Gabriel K., Schneider J. Specific function of a G-U wobble pair from an adjacent helical site in tRNAAla during recognition by alanyl-tRNA synthetase // RNA. 1996. V. 2. P. 105-109.

297. Gabriel K., Schneider J., McClain W.H. Functional evidence for indirect recognition of G-U in tRNAAla by alanyl-tRNA synthetase // Science. 1996. V. 271. P. 195-197.

298. Beuning P.J., Yang F., Schimmel P., Musier-Forsyth K. Specific atomic groups and RNA helix geometry in acceptor stem recognition by a tRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P.10150-10154.

299. Mueller U., Schiibel H., Sprinzl M., Heinemann U. Crystal structure of acceptor stem of tRNAAla from Escherichia coli shows unique G*U wobble base pair at 1.16 A resolution // RNA. 1999. V. 5. P. 670-677.

300. McClain W.H., Gabriel K., Bhattacharya S., Jou Y.-Y., Schneider J. Functional compensation by particular nucleotide substitutions of a critical G-U wobble base-pair during aminoacylation of transfer RNA // J. Mol. Biol. 1999. V. 286. P. 1025-1032.

301. Choi H., Otten S., Schneider J., McClain W.H. Genetic perturbations of RNA reveal structure-based recognition in protein-RNA interaction // J. Mol. Biol. 2002. V. 324. P. 573-576.

302. Beuning P.J., Nagan M.C., Cramer C.J., Musier-Forsyth K., Gelpi J.L., Bashford D.P. Efficient aminoacylation of the tRNAAla acceptor stem: dependence on the 2:71 base pair // RNA. 2002. V. 8. P. 659-670.

303. Ripmaster T.L., Shiba K., Schimmel P. Wide cross-species aminoacyl-tRNA synthetase replacement in vivo: yeast cytoplasmic alanine enzyme replaced by human polymyositis serum antigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 4932-4936.

304. Carneiro V.T., Dietrich A., Marechal-Drouard L., Cosset A., Pelletier G., Small I. Characterization of some major identity elements in plant alanine and phenylalanine transfer RNAs // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 1843-1853.

305. Киселев JI.JI., Фролова Л.Ю. «Контактные участки» транспортных РНК при специфическом взаимодействии с аминоацил-тРНК-синтетазами // Биохимия. 1964. Т. 29. С. 1177-1189.

306. Jilyaeva T.I., Kisselev L.L. Exposed cytosine residues in the tRNAVal (1) from yeast // FEBS Lett. 1970. V. 10.P.229-232.

307. Pelka H., Schulman L.H. Study of the interaction of Escherichia coli methionyl-tRNA synthetase with tRNA^6' using chemical and enzymatic probes // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 4450-4456.

308. Theobald A, Springer M, Grunberg-Manago M, Ebel J.-P., Giege R. Tertiary structure of Escherichia coli tRNAThr3 in solution and interaction of this tRNA with the cognate threonyl-tRNA synthetase // Eur. J. Biochem. 1988. V. 175. P. 511-524.

309. Ming X., Smith К., Suga H., Hou Y.-M. Recognition of tRNA backbone for aminoacylation with cysteine: evolution from Escherichia coli to human // J. Mol. Biol. 2002. V. 318. P. 1207-1220.

310. Rudinger J., Puglisi J.D., Piitz J., Schatz D., Eckstein F., Florentz C., Giege R. Determinant nucleotides of yeast tRNAAsp interact directly with aspartyl-tRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 5882-5886.

311. Garcia A., Giege R. Footprinting evidence for close contacts of the yeast tRNAAsp anticodon region with aspartyl-tRNA synthetase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 186. P. 956-962.

312. Sissler M., Eriani G., Martin F., Giege R., Florentz C. Mirror image alternative interaction patterns of the same tRNA with either class I arginyl-tRNA synthetase or class II aspartyl-tRNA synthetase // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4899-4906.

313. Vlassov V.V., Kern D., Romby P., Giege R., Ebel J.-P. Interaction of tRNAphe and tRNAVal with aminoacyl-tRNA synthetases. A chemical modification study // Eur. J. Biochem. 1983. V. 132. P.537-544.

314. Kreutzer R., Kern D., Giege R., Rudinger J. Footprinting of tRNAphe transcripts from Thermus thermophilus HB8 with the homologous phenylalanyl-tRNA synthetase reveals a novel mode of interaction //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4598-4602.

315. Dock-Bregeon А.С., Garcia A., Giege R., Moras D. The contacts of yeast tRNASer with seryl-tRNA synthetase studied by footprinting experiments // Eur. J. Biochem. 1990. V. 188. P. 283-290.

316. Xu M.-G., Zhao M.-W., Wang E.-D. Leucyl-tRNA synthetase from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus recognizes minihelices //J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 32151-32158.

317. Chihade J.W., Hayashibara K., Shiba K., Schimmel P. Strong selective pressure to use G:U to mark an RNA acceptor stem for alanine // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 9193-9202.

318. Crothers D.M., Seno Т., Soli G. Is there a discriminator site in transfer RNA? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 3063-3067.

319. Herring S., Ambrogelly A., Polycarpo C.R., Soil D. Recognition of pyrrolysine tRNA by the Desulfltobacterium hafriiense pyrrolysyl-tRNA synthetase // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P.1270-1278.

320. Perret V., Garcia A., Grosjean H., Ebel J.-P., Florentz C., Giegë R. Relaxation of a transfer RNA specificity by removal of modified nucleotides //Nature. 1990. V. 344. P. 787-789.

321. Piitz J., Florentz C., Benseler F., Giege R. A single methyl group prevents the mischarging of a tRNA//Nat. Struct. Biol. 1994. V. 1. P. 580-582.

322. Fender A., Sissler M., Florentz C., Giege R. Functional idiosyncrasies of tRNA isoacceptors in cognate and noncognate aminoacylation systems // Biochimie. 2004. V. 86. P. 21-29.

323. Carnicelli D., Brigotti M., Rizzi S., Keith G., Montanaro L., Sperti S. Nucleotides U28-A42 and A37 in unmodified yeast tRNATrp as negative identity elements for bovine tryptophanyl-tRNA synthetase //FEBS Lett. 2001. V. 492. P. 238-241.

324. Perret V., Florentz C., Puglisi J.D., Giege R. Effect of conformational features on the aminoacylation of tRNAs and consequences on the permutation of tRNA specificities // J. Mol. Biol. 1992. V. 226. P.323-333.

325. Pütz J., Puglisi J.D., Florentz C., Giege R. Additive, cooperative and anti-cooperative effects between identity nucleotides of atRNA // EMBO J. 1993. V. 12. P. 2949-2957.

326. Francklyn C., Schimmel P. Aminoacylation of RNA minihelices with alanine // Nature. 1989. V. 337. P. 478-481.

327. Musier-Forsyth K., Usman N., Scaringe S., Doudna J., Green R., Schimmel P. Specificity for aminoacylation of an RNA helix: an unpaired, exocyclic amino group in the minor groove // Science. 1991. V. 253. P. 784-786.

328. Musier-Forsyth K., Schimmel P. Functional contacts of a transfer RNA synthetase with 2'-hydroxyl groups in the RNA minor groove // Nature. 1992. V. 357. P. 513-515.

329. Schimmel P., Giege R., Moras D., Yokoyama S. An operational RNA code for amino acids and possible relationship to genetic code // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V. 90. P. 8763-8768.

330. Augustine J., Francklyn C. Design of an active fragment of a class II aminoacyl-tRNA synthetase and its significance for synthetase evolution // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 3473-3782.

331. Frugier M., Florentz C., Giege R. Anticodon-independent aminoacylation of an RNA minihelix with valine // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. V. 89. P. 3990-3994.

332. Nordin B.E., Schimmel P. Isoleucyl-tRNA synthetases // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 24-35.

333. Frugier M., Florentz C., Giege R. Efficient aminoacylation of resected RNA helices by class II aspartyl-tRNA synthetase dependent on a single nucleotide // EMBO J. 1994. V. 13. P. 2218-2226.

334. Hamann C.S., Hou Y.-M. Enzymatic aminoacylation of tRNA acceptor stem helices with cysteine is dependent on a single nucleotide // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 6527-6532.

335. Frugier M., Florentz C., Schimmel P., Giege R. Triple aminoacylation specificity of a chimerized transfer RNA // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 14053-14061.

336. Pleiss J.A., Wolfson A.D., Uhlenbeck O.C. Mapping contacts between Escherichia coli alanyl-tRNA synthetase and 2' hydroxyls using a complete tRNA molecule // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 8250-8258.

337. Vörtler S., Pütz J., Giege R. Manipulation of tRNA properties by structure-based and combinatorial in vitro approaches // Progr. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 2001. V. 70. P. 291-334.

338. Tinkle Peterson E., Blank J., Sprinzl M., Uhlenbeck O.C. Selection for active E. coli tRNAphe variants from a randomized library using two proteins // EMBO J. 1993. V. 12. P. 2959-2967.

339. Tinkle Peterson E., Pan T., Coleman J., Uhlenbeck O.C. In vitro selection of small RNAs that bind to Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 1994. V. 242. P. 186-192.

340. Baron C., Böck A. The length of the aminoacyl-acceptor stem of the selenocysteine-specific tRNASec of Escherichia coli is the determinant for binding to elongation factors SELB or Tu // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 20375-20379.

341. Puglisi J.D., Pütz J., Florentz C., Giege R. Influence of tRNA tertiary structure and stability on aminoacylation by yeast aspartyl-tRNA synthetase // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 41-49.

342. Wolfson A.D., Khvorova A.M., Sauter C., Florentz C., Giege R. Mimics of yeast tRNAAsp and their recognition by aspartyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 11926-11932.

343. Hou Y.-M., Sterner T., Jansen M. Permutation of a pair of tertiary nucleotides in a transfer RNA // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 2978-2984.

344. Ryckelynck M., Giege R., Frugier M. tRNAs and tRNA mimics as cornerstones of aminoacyl-tRNA synthetase regulations // Biochimie. 2005. V. 87. P. 835-845.

345. Sissler M., Giege R., Florentz C. The RNA sequence context defines the mechanistic routes by which yeast arginyl-tRNA synthetase charges tRNA // RNA. 1998. V. 4. P. 647-657.

346. Yamasaki S., Nakamura S., Terada T., Shimizu K. Mechanism of the difference in the binding affinity of E. coli tRNA01" to glutaminyl-tRNA synthetase caused by noninterface nucleotides in variable loop // Biophys. J. 2007. V. 92. P. 192-200.

347. Asahara H., Uhlenbeck O.C. The tRNA specificity of Thermus thermophilics EF-Tu // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 3499-3504.

348. Krauss G., Riesner D., Maass G. Mechanism of discrimination between cognate and non-cognate tRNAs by phenylalanyl-tRNA synthetase from yeast // Eur. J. Biochem. 1976. V. 68. P. 81-93.

349. Bonnet J., Ebel J.-P. Influence of various factors on the recognition specificity of tRNAs by yeast valyl-tRNA synthetase//Eur. J. Biochem. 1975. V. 58. P. 193-201.

350. Krauss G., Peters F., Maass G. Effect of excision of the Y-base on the interaction of tRNAphe (yeast) with phenylalanyl-tRNA synthetase (yeast) //Nucleic Acids Res. 1976. V. 3. P. 631-639.

351. Tworowski D., Safro M. The long-range electrostatic interactions control tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase complex formation//Protein Sci. 2003. V. 12. P. 1247-1251.

352. Tworowski D., Feldman A.V., Safro M.G. Electrostatic potential of aminoacyl-tRNA synthetase navigates tRNA on its pathway to the binding site // J. Mol. Biol. 2005. V. 350. P. 866-882.

353. Lam S., Schimmel P. Equilibrium measurements of cognate and noncognate interactions between aminoacyl transfer RNA synthetases and transfer RNA // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 2775-2780.

354. Krauss G., Pingoud A., Boehme D., Riesner D., Peters F., Maas G. Equivalent and non-equivalent binding sites for tRNA on aminoacyl-tRNA synthetases // Eur. J. Biochem. 1975. V. 55. P. 517-529.

355. Fasiolo F., Remy P., Pouyet J., Ebel J.-P. Yeast phenylalanyl-tRNA synthetase. Molecular weight and interaction with tRNAPhe and phenylalanine // Eur. J. Biochem. 1974. V. 50. P. 227-236.

356. Krauss G., Riesner D., Maass G. Mechanism of tRNA-synthetase recognition: role of terminal A // Nucleic Acids Res. 1977. V. 4. P. 2253-2262.

357. Holler E., Wang C.C., Ford N.C. Detection of ligand-induced conformational changes in phenylalanyl-tRNA synthetase of Escherichia coli K10 by laser light scattering // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 861-867.

358. Bartmann P., Hanke T., Holler E. Active site stoichiometry of L-phenylalnine:tRNA ligase from Escherichia coli K-10 // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 7668-7674.

359. Maelicke A., Engel G., Cramer F., Staehelin M. ATP-induced specificity of binding of serine tRNAs from rat liver to seryl-tRNA synthetase from yeast // Eur. J. Biochem. 1974. V. 42. P. 311-314.

360. Kaminska M., Shalak V., Mirande M. The appended C-domain of human methionyl-tRNA synthetase has a tRNA-sequestering function II Biochemistry. 2001. V. 40. P. 14309-14316.

361. Francin M., Kaminska M., Kerjan P., Mirande M. The N-terminal domain of mammalian lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 1762-1769.

362. Francin M., Mirande M. Functional dissection of the eukaryotic-specific tRNA-interacting factor of lysyl-tRNA synthetase // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 1472-1479.

363. Ryckelynck M., Giege R., Frugier M. Yeast tRNAAsp charging accuracy is threatened by the N-terminal extension of aspartyl-tRNA synthetase // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 9683-9690.

364. Francin M., Mirande M. Identity elements for specific aminoacylation of a tRNA by mammalian lysyl-tRNA synthetase bearing a nonspecific tRNA-interacting factor // Biochemistry. 2006. V. 45. P.10153-10160.

365. Banerjee R., Mandal A.K., Saha R., Guha S., Samaddar S., Bhattacharyya A., Roy S. Solvation change and ion release during aminoacylation by aminoacyl-tRNA synthetases // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 6035-6042.

366. Bedouelle H., Nageotte R. Macromolecular recognition through electrostatic repulsion // EMBO J. 1995. V. 14. P. 2945-2950.

367. Schmitt E., Meinnel T., Panvert M., Mechulam Y., Blanquet S. Two acidic residues of Escherichia coli methionyl-tRNA synthetase act as negative discriminants towards the binding of non-cognate tRNA anticodons // J. Mol. Biol. 1993. V. 233. P. 615-628.

368. Commans S., Lazard M., Delort F., Blanquet S., Plateau P. tRNA anticodon recognition and specification within subclass lib aminoacyl-tRNA synthetases // J. Mol. Biol. 1998. V. 278. P. 801-813.

369. Jia J., Chen X.-L., Guo L.-T., Yu Y.-D., Ding J.-P., Jin Y.-X. Residues Lys-149 and Glu-153 switch the aminoacylation of tRNATrp in Bacillus subtilis II J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 41960-41965.

370. Krauss G., von der Haar F., Maass G. Conformation transitions of a tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase complex induced by tRNAs bearing different modifications in the 3' terminus // Biochemistry. 1979. V. 18. P. 4755-4761.

371. Krauss G., Coutts S.M., Riesner D., Maass G. Mechanism of tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase recognition: influence of aminoalkyladenylates // Biochemistry. 1978. V. 17. P. 2443-2449.

372. Guth E.C., Francklyn C.S. Kinetic discrimination of tRNA identity by the conserved motif 2 loop of a class II aminoacyl-tRNA synthetase // Mol. Cell. 2007. V. 25. P. 531-542.

373. Uter N.T., Gruic-Sovulj I., Perona J.J. Amino acid-dependent transfer RNA affinity in a class I aminoacyl-tRNA synthetase Hi. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 23966-23977.

374. Geslain R., Bey G., Cavarelli J., Eriani G. Limited set of amino acid residues in a class la aminoacyl-tRNA synthetase is crucial for tRNA binding// Biochemistry. 2003. V. 42. P. 15092-15101.

375. Yao Y.-N., Zhang Q.-S., Yan X.-Z., Zhu G, Wang E.-D. Escherichia coli tRNA4Arg(UCU) induces a constrained conformation of the crucial Q-loop of arginyl-tRNA synthetase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 313. P. 129-134.

376. Auld D.S., Schimmel P. Switching recognition of two tRNA synthetases with an amino acid swap in a designed peptide // Science. 1995. V. 267. P. 1994-1996.

377. Sherman J.M., Thomann H.U., Soli D. Functional connectivity between tRNA binding domains in glutaminyl-tRNA synthetase Hi. Mol. Biol. 1996. V. 256. P. 818-828.

378. Lee J., Hendrickson T.L. Divergent anticodon recognition in contrasting glutamyl-tRNA synthetases // J. Mol. Biol. 2004. V. 344. P. 1167-1174.

379. Wang C.-C., Schimmel P. Species barrier to RNA recognition overcome with nonspecific RNA binding domains // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 16508-16512.

380. Liu C., Gamper H., Shtivelband S., Hauenstein S., Perona J.J., Hou Y.-M. Kinetic quality control of anticodon recognition by a eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 2007. V. 367. P. 1063-1078.

381. Steer B.A., Schimmel P. Different adaptations of the same peptide motif for tRNA functional contacts by closely homologous tRNA synthetases // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 4965-4971.

382. Lovato M.A., Swairjo M.A., Schimmel P. Positional recognition of a tRNA determinant dependent on a peptide insertion//Mol. Cell. 2004. V. 13: P. 843-851.

383. Buechter D.D., Schimmel P. Minor groove recognition of the critical acceptor helix base pair by an appended module of a class II tRNA synthetase // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 6014-6019.

384. Frugier M., Schimmel P. Subtle atomic group discrimination in the RNA minor groove // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 11291-11294.

385. Frugier M., Giege R., Schimmel P. RNA recognition by designed peptide fusion creates «artificial» tRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 7471-7475.

386. Murzin A.G. OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences // EMBO J. 1993. V. 12. P. 861-867.

387. Brevet A., Chen J., Commans S., Lazennec C., Blanquet S., Plateau P. Anticodon recognition in evolution: switching tRNA specificity of an aminoacyl-tRNA synthetase by site-directed peptide transplantation //J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 30927-30935.

388. Ador L., Camasses A., Erbs P., Cavarelli J., Moras D., Gangloff J., Eriani G. Active site mapping of yeast aspartyl-tRNA synthetase by in vivo selection of enzyme mutations lethal for cell growth // J. Mol. Biol. 1999. V. 288. P. 231-242.

389. Pastmak M., Magliery T.J., Schultz P.G. A new orthogonal supressor tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair for evolving an organism with expanded genetic code // Helv. Chim. Acta. 2000. V. 83. P. 2277-2286.

390. Martin F., Barends S., Eriani G. Single amino acid changes in AspRS reveal alternative routes for expanding its tRNA repertoire in vivo II Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 4081-4089.

391. Charron C., Roy H., Blaise M., Giege R., Kern D. Non-discriminating and discriminating aspartyl-tRNA synthetases differ in the anticodon-binding domain // EMBO J. 2003. V. 22. P. 1632-1643.

392. Feng L., Tumbula-Hansen D., Toogood H., Soil D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 5676-5681.

393. Feng L., Yuan J., Toogood H., Tumbula-Hansen D., Soli D. Aspartyl-tRNA synthetase requires a conserved proline in the anticodon-binding loop for tRNAAsn recognition in vivo II J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 20638-20641.

394. Chuawong P., Hendrickson T.L. The nondiscriminating aspartyl-tRNA synthetase from Helicobacter pylori: anticodon-binding domain mutations that impact tRNA specificity and heterologous toxicity // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 8079-8087.

395. Burbaum J.J., Schimmel P. Assembly of a class I tRNA synthetase from products of an artificially split gene // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 319-324.

396. Shiba K., Schimmel P. Tripartite functional assembly of a large class I aminoacyl tRNA synthetase // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 22703-22706.

397. Shiba K., Schimmel P. Functional assembly of a randomly cleaved protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1880-1884.

398. Zhang C.-M., Hou Y.-M. Domain-domain communication for tRNA aminoacylation: the importance of covalent connectivity // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 7240-7249.

399. Li T., Guo N., Xia X., Wang E., Wang Y. The peptide bond between E292-A293 of Escherichia coli leucyl-tRNA synthetase is essential for its activity // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 13063-13069.

400. Nureki O., Vassylyev D.G., Katayanagi K., Shimizu T., Sekine S., Kigawa T., Miyazawa T., Yokoyama S., Morikawa K. Architectures of class-defining and specific domains of glutamyl-tRNA synthetase // Science. 1995. V. 267. P. 1958-1965.

401. Delarue M., Poterszman A., Nikonov S., Garber M., Moras D., Thierry J.-C. Crystal structure of a prokaryotic aspartyl-tRNA synthetase // EMBO J. 1994. V. 13. P. 3219-3229.

402. Mosyak L., Reshetnikova L., Goldgur Y., Delarue M., Safro M. Structure of phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilic //Nat. Struct. Biol. 1995. V. 2. P. 537-547.

403. Nissen P., Thirup S., Kjelgaard M., Nyborg J. The crystal structure of Cys-tRNACys-EF-Tu-GDPNP reveals general and specific features in the ternary complex and in tRNA // Structure. 1999. V. 15. P.143-156.

404. Cusack S. Aminoacyl-tRNA synthetases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. V. 7. P. 881-889.

405. Martin F., Eriani G., Eiler S., Moras D., Dirheimer G., Gangloff J. Overproduction and purification of native and queuine-lacking Escherichia coli tRNAAsp. Role of the wobble base in tRNAAsp acylation // J. Mol. Biol. 1993. V. 234. P. 965-974.

406. Quinn C.L., Tao N., Schimmel P. Species-specific microhelix aminoacylation by a eukaryotic pathogen tRNA synthetase dependent on a single base pair // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 12489-12495.

407. Yang X.L., Skene R.J., McRee D.E., Schimmel P. Crystal structure of a human aminoacyl-tRNA synthetase cytokine //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 15369-15374.

408. Doolittle R.F., Handy J. Evolutionary anomalies among the aminoacyl-tRNA synthetases // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. V. 8. P. 630-636.

409. Giege R. Genetic code expansion // Nat. Struct. Biol. 2003. V. 10. P. 414-416.

410. Wang L., Zhang Z., Brock A., Schultz P.G. Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 56-61.

411. Fukunaga J., Yokogawa T., Ohno S., Nishikawa K. Misacylation of yeast amber suppressor tRNATyr by E. coli lysyl-tRNA synthetase and its effective repression by genetic engineering of the tRNA sequence //J. Biochem. (Tokyo). 2006. V. 139. P. 689-696.

412. Ryu Y., Schultz P.G. Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli II Nat. Methods. 2006. V. 3. P. 263-265.

413. Liu W., Brock A., Chen S., Chen S., Schultz P.G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells // Nat. Methods. 2007. V. 4. P. 239-244.

414. Sprinzl M., Cramer F. The CCA end of tRNA and its role in protein biosynthesis // Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1979. V. 22. P. 1-69.

415. Paulsen H., Wintermeyer W. Incorporation of 1 ,N6-ethenoadenosine into the 3' terminus of tRNA using T4 RNA ligase. 1. Preparation of yeast tRNAphe derivatives // Eur. J. Biochem. 1984. V. 138. P. 117-123.

416. Tamura K., Nameki N., Hasegawa T., Shimizu M., Himeno H. Role of the CCA terminal sequence of tRNAVal in aminoacylation with valyl-tRNA synthetase // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 22173-22177.

417. Liu M., Horowitz J. Functional transfer RNAs with modifications in the 3'-CCA end: differential effects on aminoacylation and polypeptide synthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 10389-10393.

418. Tardif K.D., Horowitz J. Functional group recognition at the aminoacylation and editing sites of E. coli valyl-tRNA synthetase II RNA. 2004. V. 10. P. 493-503.

419. Malygin E.G., Zinoviev V.V., Fasiolo F., Kisselev L.L., Kochkina L.L., Achverdyan V.Z. Interaction of aminoacyl-tRNA synthetases and tRNA: positive and negative cooperativity of their active centers // Mol. Biol. Rep. 1976. V. 2. P. 445-454.

420. Jacques Y., Blanquet S. Interrelation between transfer RNA and amino-acid-activating sites of methionyl transfer RNA synthetase from Escherichia coli II Eur. J. Biochem. 1977. V. 79. p. 433-441.

421. Fasiolo F., Remy P., Holler E. Phenylalanyl-tRNA synthetase of baker's yeast. Modulation of adenosine triphosphate-pyrophosphate exchange by transfer ribonucleic acid // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 3851-3856.

422. Yarus M., Berg P. Recognition of tRNA by isoleucyl-tRNA synthetase. Effect of substrates on the dynamics of tRNA-enzyme interaction //J. Mol. Biol. 1969. V. 42. P. 171-189.

423. Mitra S.K., Chakraburtty K., Mehler A.H. Binding of transfer RNA and arginine to the arginine transfer RNA synthetase of Escherichia coli // J. Mol. Biol. 1970. V. 49. P. 139-156.

424. Hustedt H., Flossdorf J., Kula M.R. Interacting binding sites of isoleucyl-tRNA synthetase from Escherichia coli studied by equilibrium partition // Eur. J. Biochem. 1977. V. 74. P. 199-202.

425. Мое J.G., Piszkiewicz D. Isoleucyl transfer ribonucleic acid synthetase. Competitive inhibition with respect to transfer ribonucleic acid by blue dextran // Biochemistry. 1979. V. 18. P. 2810-2814.

426. Butorin A.S., Remy P., Vassilenko S.K., Ebel J.-P. Comparison of the hydrolysis patterns of several tRNAs by cobra venom ribonuclease in different steps of the aminoacylation reaction // Eur. J. Biochem. 1982. V. 121. P. 587-595.

427. Horz W., Zachau H.G. Complexes of aminoacyl-tRNA synthetases with tRNAs as studies by partial nuclease digestion // Eur. J. Biochem. 1973. V. 32. P. 1-14.

428. Hong K.-W., Ibba M., Weygand-Durasevic I., Rogers M.J., Thomann H.-U., Soli D. Transfer RNA-dependent cognate amino acid recognition by an aminoacyl-tRNA synthetase // EMBO J. 1996. V. 15. P. 1983-1991.

429. Yoshikawa M., Kato Т., Takenishi T. A novel method for phosphorylation of nucleosides to 5'-nucleotides // Bull. Soc. Chem. Jap. 1969. V. 42. P. 3505-3508.

430. Uhlenbeck O.C., Gumport R.I. T4 RNA ligase // The Enzymes / Boyer P. D. Ed. New York: Academic Press. 1982. V. 15. P. 31-58.

431. Лаврик О.И., Moop H.A., Невинский Г.А. Синтез аналогов (Ь-фенилаланинил)аденилата и исследование их взаимодействия с фенилаланил-тРНК-синтетазой из Е. coli II Биоорган, химия. 1978. Т. 4. С. 1480-1488.

432. Наякшин A.M. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК // Методы молекулярной генетики и генной инженерии / Под ред. Салганика Р.И. Новосибирск: Наука. 1990. С. 39-44.

433. Watanabe К., Oshima Т., Iijima К., Yamaizumi Z., Nishimura S. Purification and thermal stability of several amino acid-specific tRNAs from an extreme thermophile, Thermus thermophilics HB8 // J. Biochem. (Tokyo). 1980. V. 87. P. 1-13.

434. Bischoff R., McLaughlin L.W. Isolation of specific tRNAs using an ionic-hydrophobic mixed-mode chromatographic matrix // Anal. Biochem. 1985. V. 51. P. 526-533.

435. Ankilova V.N., Reshetnikova L.S., Chernaya M.M., Lavrik O.I. Phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus HB8. Purification and properties of the crystallizing enzyme // FEBS Lett. 1988. V. 227. P. 9-13.

436. Анкилова B.H., Лаврик О.И., Ходырева C.H. Фенилаланил-тРНК-синтетаза из Е. coli MRE-600: выделение и характеризация фермента // Прикл. биохимия и микробиология. 1984. Т. 20. С. 208-216.

437. Alford B.L., Chinault А.С., Jolly S.O., Hecht S.M. Preparation of tRNAs terminating in 2'- and 3'-deoxyadenosine // Methods Enzymol. 1979. V. 59. P. 121-134.

438. Ehresmann В., Imbault P., Weil J.H. Spectrophotometric determination of protein concentration in cell extracts containing tRNA's and rRNA's // Anal. Biochem. 1973. V. 54. P. 454-463.

439. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

440. Igloi G.L. Interaction of tRNAs and of phosphorothioate-substituted nucleic acids with an organomercurial. Probing the chemical environment of thiolated residues by affinity electrophoresis // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3842-3849.

441. Lemaigre Dubreuil Y., Expert-Bezanfon A., Favre A. Conformation and structural fluctuations of a 218 nucleotides long rRNA fragment: 4-thiouridine as an intrinsic photolabelling probe // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 3653-3660.

442. Silberklang M., Gillum A.M., RajBhandary U.L. Use of in vitro 32P labeling in the sequence analysis of nonradioactive tRNAs // Methods Enzymol. 1979. V. 59. P. 58-109.

443. Fayat G., Hountondji C., Blanquet S. Methionyl-tRNA synthetase from Escherichia coli. Inactivation and labeling by periodate-treated initiator tRNA // Eur. J. Biochem. 1979. V. 96. P. 87-92.

444. England Т.Е., Uhlenbeck O.C. З'-Terminal labelling of RNA with T4 RNA ligase // Nature. 1978. V. 275. P. 560-561.

445. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики / Пер. с англ. Курганова Б.И. Москва: Мир. 1979. (Cornish-Bowden A. Principles of enzyme kinetics. Butterworths, London-Boston. 1976).

446. Bartmann P., Hanke Т., Hammer-Raber В., Holler E. Selective labelling of the P-subunit of L-phenylalanyl-tRNA synthetase from E. coli with N-bromoacetyl-L-phenylalanyl-tRNAphe // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. V. 60. P. 743-747.

447. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

448. Hountondji C., Schmitter J.-M., Beauvallet C., Blanquet S. Affinity labeling of Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase at the binding site for tRNAPhe // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 5433-5439.

449. Carey J. Gel retardation // Methods Enzymol. 1991. V. 208. P. 103-117.

450. Weeks K.M., Crothers D.M. RNA binding assays for Tat-derived peptides: implications for specificity//Biochemistry. 1992. V. 31. P. 10281-10287.

451. Otwinowski Z., Minor W. Processing of X-ray diffraction data collected processing in oscillation mode // Methods Enzymol. 1997. V. 276. P. 307-326.

452. Jones Т., Zou J., Cowtan S., Kjeldgaard M. Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models // Acta Crystallogr. A. 1991. V. 47. P. 110-119.

453. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures // J. Appl. Cryst. 1993. V. 26. P. 283-291.

454. DeLano W.L. The PyMOL molecular graphics system / San Carlos, CA: DeLano Scientific LLC. 2002.

455. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 2714-2723.

456. Lin J., Huang J.-F. Evolution of phenylalanyl-tRNA synthetase by domain losing // Acta Biochim. Biophys. Sinica. 2003. V. 35. P. 1061-1065.

457. Szymanski M., Barciszewski J. Aminoacyl-tRNA synthetase database Y2K // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 326-328.

458. Burley S.K., Petsko G.A. Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein stabilization // Science. 1985. V. 229. P. 23-28.

459. Betts L., Xiang S„ Short S.A., Wolfenden R., Carter C.W. Cytidine deaminase. The 2.3 A crystal structure of an enzyme: transition state analog complex // J. Mol. Biol. 1994. V. 235. P. 635-656.

460. Hanke Т., Bartmann P., Holler E. Quaternary structure and catalytic functioning of L-phenylalanine:tRNA ligase of Escherichia coli K10 // Eur. J. Biochem. 1975. V. 56. P. 605-615.

461. Зыкова H.A., Невинский Г.А., Лаврик О.И. Разделение субъединиц фенилаланил-тРНК-синтетазы из Escherichia coli MRE-600 с помощью метода аффинной хроматографии в диссоциирующих условиях // Молекуляр. биология. 1982. Т. 16. С. 1165-1172.

462. Ducruix A., Hounwanou N., Reinbolt J., Boulanger Y., Blanquet S. Purification and reversible subunit dissociation of overproduced Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase II Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 741. P. 244-250.

463. Bobkova E.V., Mashanov-Golikov A.V., Wolfson A., Ankilova V.N., Lavrik O.I. Comparative study of subunits of phenylalanyl-tRNA synthetase from Escherichia coli and Thermus thermophilus IIFEBS Lett. 1991. V. 290. P. 95-98.

464. Baltzinger M., Fasiolo F., Remy P. Yeast phenylalanyl-tRNA synthetase. Affinity and photoaffinity labelling of the stereospecific binding sites // Eur. J. Biochem. 1979. V. 97. P. 481-494.

465. Gabius H.J., von der Haar F., Cramer F. Purification by salting-out chromatography and properties of phenylalanyl-tRNA synthetase from turkey liver // Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1983. V. 364. P. 71-81.

466. Ходырева C.H., Невинский Г.А., Анкилова B.H., Лаврик О.И. Модификация фенилаланил-тРНК-синтетазы из Е. coli MRE-600 аденозин-5'-триметафосфатом // Молекуляр. биология. 1983. Т. 17. С. 1196-1203.

467. Lavrik O.I., Moor N.A., Khodyreva S.N. Phenylalanyl-tRNA synthetase from E. coli MRE-600: localization of the phenylalanine binding sites on the subunits by affinity reagents // Mol. Biol. Rep. 1982. V. 8. P. 123-126.

468. Moop H.A., Невинский Г.А., Анкилова B.H., Лаврик О.И. Синтез реакционноспособных аналогов фенилаланиниладенилата и исследование их взаимодействия с фенилаланил-тРНК-синтетазой из Е. coli MRE-600 // Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 648-657.

469. Santi D.V., Dannenberg P.V., Satterly P. Phenylalanyl transfer ribonucleic acid synthetase from Escherichia coli. Reaction parameters and order of substrate addition // Biochemistry. 1971. V. 10. P. 4804-4812.

470. Berther J.M., Mayer P., Dutler H. Phenylalanyl-tRNA synthetase from yeast. Steady-state kinetic investigation of the reaction mechanism // Eur. J. Biochem. 1974. V. 47. P. 151-163.

471. Kisselev L.L., Fasiolo F., Malygin E.G., Zinoviev V.V. Kinetic mechanism of the 32P.ATP-PPj exchange catalyzed by yeast phenylalanyl-tRNA synthetase // FEBS Lett. 1975. V. 59. P. 254-257.

472. Hossain A. Purification and properties of phenylalanyl-tRNA synthetase from backer's yeast // Canad. J. Biochem. 1975. V. 53. P. 1316-1322.

473. Thiebe R. Analysis of the steady-state mechanism of the aminoacylation of tRNAphe by phenylalanyl-tRNA synthetase from yeast //Nucleic Acids Res. 1978. V. 5. P. 2055-2071.

474. Lin S., Baltzinger M., Remy P. Fast kinetic study of yeast phenylalanyl-tRNA synthetase: an efficient discrimination between tyrosine and phenylalanine at the level of the aminoacyladenylate-enzyme complex//Biochemistry. 1983. V. 22. P. 681-689.

475. Lin S., Baltzinger M., Remy P. Fast kinetic study of yeast phenylalanyl-tRNA synthetase: role of tRNAphe in the discrimination between tyrosine and phenylalanine // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 4109-4116.

476. Freist W., Sternbach H., Cramer F. Phenylalanyl-tRNA synthetase from yeast and its discrimination of 19 amino acids in aminoacylation of tRNAPhe-CCA and tRNAPhe-CCA(3 fNH2) // Eur. J. Biochem. 1996. V. 240. P. 526-531.

477. Santi D.V., Danenberg P.V. Phenylalanyl transfer ribonucleic acid synthetase from Escherichia coli. Analysis of the phenylalanine binding site // Biochemistry. 1971. V. 10. P. 4813-4820.

478. Ibba M., Kast P., Hennecke H. Substrate specificity is determined by amino acid binding pocket size in Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 7107-7112.

479. Roy H., Ling J., Irnov M., Ibba M. Post-transfer editing in vitro and in vivo by the p subunit of phenylalanyl-tRNA synthetase // EMBO J. 2004. V. 23. P. 4639-4648.

480. Igloi G.L., von der Haar F., Cramer F. Aminoacyl-tRNA synthetases from yeast: generality of chemical proofreading in the prevention of misaminoacylation of tRNA // Biochemistry. 1978. V. 17. P. 3459-3468.

481. Edelman P., Gallant J. On the translational error theory of aging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 3396-3398.

482. Loftfield R.S., Vanderjagt D. The frequency of errors in protein biosynthesis // Biochem. J. 1972. V.128. P.1353-1356.

483. Datta D., Wang P., Carrico I.S., Mayo S.L., Tirrell D.A. A designed phenylalanyl-tRNA synthetase variant allows efficient in vivo incorporation of aryl ketone functionality into proteins // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 5652-5653.

484. Furter R. Expansion of the genetic code: site-directed p-fluoro-phenylalanine incorporation in Escherichia coli // Protein Sci. 1998. V. 7. P. 419-426.

485. Ibba M., Hennecke H. Relaxing the substrate specificity of an aminoacyl-tRNA synthetase allows in vitro and in vivo synthesis of proteins containing unnatural amino acids // FEBS Lett. 1995. V. 364. P. 272-275.

486. Kirshenbaum K., Carrico I., Tirrell D. Biosynthesis of proteins incorporating a versatile set of phenylalanine analogs // ChemBioChem. 2002. V. 3. P. 235-237.

487. Ling J., Roy H., Ibba M. Mechanism of tRNA-dependent editing in translational quality control // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 72-77.

488. Fersht A.R. Editing mechanisms in protein synthesis. Rejection of valine by the isoleucyl-tRNA synthetase//Biochemistry. 1977. V. 16. P. 1025-1030.

489. Hendrickson T.L., Nomanbhoy T.K., de Crecy-Lagard V., Fukai S., Nureki O., Yokoyama S., Schimmel P. Mutational separation of two pathways for editing by a class I tRNA synthetase // Mol. Cell. 2002. V. 9. P. 353-362.

490. Fukunaga R., Yokoyama S. Structural basis for substrate recognition by the editing domain of isoleucyl-tRNA synthetase // J. Mol. Biol. 2006. V. 359. P. 901-912.

491. Moodie S.L., Mitchell J.B., Thornton J.M. Protein recognition of adenylate: an example of a fuzzy recognition template 11 J. Mol. Biol. 1996. V. 263. P. 486-500.

492. Beebe K., Ribas de Pouplana L., Schimmel P. Elucidation of tRNA-dependent editing by a class II tRNA synthetase and significance for cell viability // EMBO J. 2003. V. 22. P. 668-675.

493. Turner J.M., Larsen N.A., Basran A., Barbas C.F.III, Bruce N.C., Wilson I.A., Lerner R.A. Biochemical characterization and structural analysis of a highly proficient cocaine esterase // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 12297-12307.

494. Schmitt E., Mechulam Y., Fromant M., Plateau P., Blanquet S. Crystal structure at 1.2 A resolution and active site mapping of Escherichia coli peptidyl-tRNA hydrolase // EMBO J. 1997. V. 16. P.4760-4769.

495. Fromant M., Ferri-Fioni M.L., Plateau P., Blanquet S. Peptidyl-tRNA hydrolase from Sulfolobus solfataricus //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 3227-3235.

496. Ferri-Fioni M.L., Schmitt E., Soutourina J., Plateau P., Mechulam Y., Blanquet S. Structure of crystalline D-Tyr-tRNATyr deacylase. A representative of a new class of tRNA-dependent hydrolases III Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 47285-47290.

497. Ferri-Fioni M.L., Fromant M., Bouin A.P., Aubard C., Lazennec C., Plateau P., Blanquet S. Identification in archaea of a novel D-Tyr-tRNATyr deacylase II J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 27575-27585.

498. Roy H., Ling J., Alfonzo J., Ibba M. Loss of editing activity during the evolution of mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 38186-38192.

499. Bullard M.J., Cai Y.-C., Demeler В., Spremulli L.L. Expression and characterization of a human mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase II J. Biol. Chem. 1999. V. 288. P. 567-577.

500. Lue S.W., Kelley S.O. An aminoacyl-tRNA synthetase with a defunct editing site // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 3010-3016.

501. Sharma N., Furter R., Kast P., Tirrell D.A. Efficient introduction of aryl bromide functionality into proteins in vivo IIFEBS Lett. 2000. V. 467. P. 37-40.

502. Bentin Т., Hamzavi R., Salomonsson J., Roy H., Ibba M., Nielsen P.F. Photoreactive bicyclic amino acids as substrates for mutant Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 19839-19845.

503. Kwon I., Kirshenbaum K., Tirrel D.A. Breaking the degeneracy of the genetic code // J. Amer. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 7512-7513.

504. Kwon I., Wang P., Tirrel D.A. Design of a bacterial host for site-specific incorporation of ^-bromophenylalanine into recombinant proteins // J. Amer. Chem. Soc. 2006. V. 128. P.11778-11783.

505. Kwon I., Tirrel D.A. Site-specific incorporation of tryptophan analogues into recombinant proteins in bacterial cells // J. Amer. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 10431-10437.

506. Yu X.Y., Finn J., Hill J.M., Wang Z.G., Keith D., Silverman J., Oliver N. A series of heterocyclic inhibitors of phenylalanyl-tRNA synthetases with antibacterial activity // Bioorg. Med, Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 1343-1346.

507. Yu X.Y., Finn J., Hill J.M., Wang Z.G., Keith D., Silverman J., Oliver N. A series of spirocyclic inhibitors of phenylalanyl-tRNA synthetases // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 1339-1342.

508. Finn J., Tao J. Aminoacyl-tRNA synthetases as anti-infective drug targets // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 405-413.

509. Ladner J.E., Jack A., Robertus J.D., Brown R.S., Rhodes D., Clark B.F.C., Klug A. Structure of yeast phenylalanine transfer RNA at 2.5 A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 69. P. 3063-3067.

510. Bobkova E.V., Stepanov V.G., Lavrik O.I. A comparative study of the relationship between thermostability and function of phenylalanyl-tRNA synthetases from Escherichia coli and Thermus thermophilus // FEBS Letters. 1992. V. 302. P. 54-56.

511. Behlen L.S., Sampson J.R., DiRenzo A.B., Uhlenbeck O.C. Lead-catalyzed cleavage of yeast tRNAphe mutants // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 2515-2523.

512. Behlen L.S., Sampson J.R., Uhlenbeck O.C. An ultraviolet light-induced crosslink in yeast tRNAphe //Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 4055-4059.

513. Atmadja J., Brimacombe R., Blocker H., Frank R. Investigation of the tertiary folding of Escherichia coli 16S RNA by in situ intra-RNA cross-linking within 30S ribosomal subunits //Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 6919-6936.

514. Bergstrom D.E., Leonard N.J. Photoreaction of 4-thiouracil with cytosine. Relation to photoreactions in Escherichia coli transfer ribonucleic acids // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 1-9.

515. Branch A.D., Benenfeld B.J., Robertson H.D. Ultraviolet light-induced crosslinking reveals a unique region of local tertiary structure in potato spindle tuber viroid and HeLa 5S RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 6590-6594.

516. Downs W.D., Cech T.R. An ultraviolet-inducible adenosine-adenosine cross-link reflects the catalytic structure of the Tetrahymena ribozyme // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 5605-5613.

517. Favre A., Yaniv M., Michelson A.M. The photochemistry of 4-thiouridine in Escherichia coli tRNAVali // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. V. 37. P. 266-271.

518. Yaniv M., Favre A., Barrell B.G. Structure of transfer RNA. Evidence for interaction between two non-adjacent nucleotide residues in tRNA from Escherichia coli II Nature. 1969. V. 223. P.1331-1333.

519. Davis D.R., Poulter C.D. 1H-15N NMR studies of Escherichia coli tRNAPhe from hisT mutants: a structural role for pseudouridine // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 4223-4231.

520. Davanloo P., Sprinzl M., Watanabe K., Albani M., Kersten H. Role of ribothymidine in the thermal stability of transfer RNA as monitored by proton magnetic resonance // Nucleic Acids Res. 1979. V. 6. P. 1571-1581.

521. Frausto da Silva J.J.R., Williams R.J.P. The spatial distribution of magnesium // The biological chemistry of the elements. The inorganic chemistry of life / Oxford: Oxford University Press. 2001. P. 251-252.

522. Vieille C., Zeikus G.J. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. V. 65. P. 1-43.

523. Hou Y.-M., Schimmel P. Functional compensation of a recognition-defective transfer RNA by a distal base-pair substitution // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 10310-10314.

524. Bruce G.A., Uhlenbeck O.C. Specific interaction of anticodon loop residues with yeast phenylalanyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 3921-3926.

525. Wittenberg W.L., Uhlenbeck O.C. Specific replacement of functional groups of uridine-33 in yeast phenylalanine transfer ribonucleic acid // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 2705-2712.

526. Sprinzl M., Steegborn C., Hiibel F., Steinberg S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 68-72.

527. Kholod N., Pan'kova N., Ksenzenko V., Kisselev L. Aminoacylation of tRNA gene transcripts is strongly affected by 3'-extended and dimeric substrate RNAs // FEBS Lett. 1998. V. 426. P. 135-139.

528. Kholod N., Vassilenko K., Shlyapnikov M., Ksenzenko V., Kisselev L. Preparation of active tRNA gene transcripts devoid of 3'-extended products and dimers // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2500-2501.

529. Favre A. 4-Thiouridine as an intrinsic photoaffinity probe of nucleic acid structure and interactions // Bioorganic Photochemistry: Photochemistry and Nucleic Acids / Morrison H. Ed. New York: Inc. Wiley & Sons. 1990. P. 379-425.

530. Favre A., Saintome C., Fourrey J.-L., Clivio P., Laugaa P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1998. V. 42. P. 109-124.

531. Wower J., Rosen K.V., Hixson S.S., Zimmermann R.A. Recombinant photoreactive tRNA molecules as probes for cross-linking studies // Biochimie. 1994. V. 76. P. 1235-1246.

532. Сергиев П.В., Донцова О.А., Богданов А.А. Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: судный день (обзор) // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 559-583.

533. Tanner N.K., Hanna M.M., Abelson J. Binding interactions between yeast tRNA ligase and a precursor transfer ribonucleic acid containing two photoreactive uridine analogues // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 8852-8861.

534. Favre A., Ballini J.P., Holler E. Phenylalanyl-tRNA synthetase induced conformational change of Escherichia coli tRNAPhe // Biochemistry. 1979. V. 13. P. 2887-2895.

535. Chang K.-Y., Varani G., Bhattacharya S., Choi H., McClain W.H. Correlation of deformability at a tRNA recognition site and aminoacylation specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 11764-11769.

536. Dessen P., Ducruix A., Hountondji C., May R.P., Blanquet S. Neutron scattering study of the binding of tRNAPhe to Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1983. V. 22. P.281-284.

537. Lechler A., Kreutzer R. Domains of phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus required for aminoacylation // FEBS Lett. 1997. V. 420. P. 139-142.

538. Park S.J., Hou Y.-M., Schimmel P. A single base pair affects binding and catalytic parameters in the molecular recognition of a transfer RNA // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 2740-2746.

539. Glasfeld E., Landro J.A., Schimmel P. C-Terminal zinc-containing peptide required for RNA recognition by a class I tRNA synthetase // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 4139-4145.

540. Ohannesian D.W., Hou Y.-M. Mutational analysis of a leucine heptad repeat motif in a class I aminoacyl-tRNA synthetase //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 14405-14412.

541. Bullock T.L., Sherlin L.D., Perona J.J. Tertiary core rearrangements in a tight binding transfer RNA aptamer//Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 497-504.

542. Gale A.J., Shi J.-P., Schimmel P. Evidence that specificity of microhelix charging by a class I tRNA synthetase occurs in the transition state of catalysis // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 608-615.

543. Xin Y., Li W., First E.A. The 'KMSKS' motif in tyrosyl-tRNA synthetase participates in the initial binding oftRNATyr// Biochemistry. 2000. V. 39. P. 340-347.

544. Zhang C.-M., Perona J.J., Ryu K., Francklyn C., Hou Y.-M. Distinct kinetic mechanisms of the two classes of aminoacyl-tRNA synthetases // J. Mol. Biol. 2006. V. 361. P. 300-311.

545. Fraser Т.Н., Rich A. Amino acids are not all initially attached to the same position on transfer RNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3044-3048.

546. Sprinzl M., Cramer F. Site of aminoacylation of tRNAs from E. coli with respect to the 2'- or 3'-hydroxyl group of the terminal adenosine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3049-3053.

547. Chinault A.C., Tan K.H., Hassur S.M., Hecht S.M. Initial position of aminoacylation of individual Escherichia coli, yeast, and calf liver transfer RNAs // Biochemistry. 1977. V. 16. P. 766-776.

548. Knorre D.G. Stepwise tRNA recognition mechanism and its kinetic consequences // FEBS Lett. 1975. V. 58. P. 50-52.

549. Fraser Т.Н., Rich A. The preparation of tRNA terminating in 3'-amino-3'-deoxyadenosine and 2'-amino-2'-deoxyadenosine // Methods Enzymol. 1979. V. 59. P. 134-145.

550. Овчинников Ю.А. Нуклеиновые кислоты. Ферменты, расщепляющие РНК // Биоорганическая химия / Москва: Просвещение. 1987. С. 312-314.

551. Кнорре Д.Г., Сенженко Л.П., Теплова Н.М. N-Ацетилфенилаланил-тРНК из Escherichia coli: гидролитическая устойчивость и модификация 2',3'-0-4[(Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламино)-бензилиден.-уридин-5'-метилфосфатом // Молекуляр. биология. 1970. Т. 4. С. 749-753.

552. Grawunder U., Schon A., Sprinzl М. Sequence and base modifications of two phenylalanine tRNAs from Thermus thermophilics HB8 // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 137.

553. Gorshkova I.I., Lavrik O.I. The influence of the ATP, amino acids and their analogs on the kinetics of the affinity labelling of the phenylalanyl-tRNA synthetase // FEBS Lett. 1975. V. 52. P. 135-138.

554. Gorshkova I.I., Knorre D.G, Lavrik O.I., Nevinsky G.A. Affinity labelling of phenylalanyl-tRNA synthetase from E. coli MRE-600 by E. coli tRNAphe containing photoreactive group // Nucleic Acids Res. 1976. V.3.P. 1577-1589.

555. Akhverdyan V.Z., Kisselev L.L., Knorre D.G, Lavrik O.I., Nevinsky G.A. Affinity labelling of tryptophanyl-transfer-RNA synthetase // J. Mol. Biol. 1977. V. 113. P. 475-501.

556. Madore E., Lipman R.S., Hou Y.-M., Lapointe J. Evidence for unfolding of the single-stranded GCCA З'-end of a tRNA on its aminoacyl-tRNA synthetase from a stacked helical to a foldback conformation // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 6791-6798.

557. Noel D., Nikaido K., Ames G.F. A single amino acid substitution in a histidine-transport protein drastically alters its mobility in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis // Biochemistry. 1979. V. 18. P. 4159-4165.

558. Lee C.P., Mandal N., Dyson M.R., RajBhandary U.L. The discriminator base influences tRNA structure at the end of the acceptor stem and possibly its interaction with proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 7149-7152.

559. Wang В., Zhou J., Lodder M., Anderson R.D., Hecht S.M. Tandemly activated tRNAs as participants in protein synthesis // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 13865-13868.

560. Liu W., Huang Y.-W., Eriani G., Gangloff J., Wang E.-D., Wang Y.-L. A single base substitution in the variable pocket of yeast tRNAArg eliminates species-specific aminoacylation // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1473. P. 356-362.

561. Perona J.J., Hou Y.-M. Indirect readout of tRNA for aminoacylation // Biochemistry. 2007. V. 46. P. 10419-10432.