Некоторые свойства и специфичность Ca,Mg-зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. МЕТАЛЛОЗАВИСИШЕ ДНКАЗЫ ЭУКАРИОТ

ГЛАВА I. РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

МЕТАЛЛОЗАВИСИМЫХ ДНКАЗ.

1. Классификация ДНКаз.

2. Распространённость металлозависимых ДНКаз

3. Молекулярная масса и субъединичность металлозависимых ДНКаз.

4. Изоэлектрическая точка, изоформы металлозависимых ДНКаз . . .•.

5. Первичная структура и активный центр металлозависимых ДНКаз.

6. Влияние рН среды и температуры на активность металлозависимых ДНКаз.

7. Активаторы металлозависимых ДНКаз

8. Ингибиторы металлозависимых ДНКаз

ГЛАВА П. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ МЕТАЛЛОЗАВИСИМЫХ ДНКАЗ

1. Величина продуктов гидролиза

2. Механизм гидролиза ДНК металлозависимыми

ДНКаз ами.

3. Конформация ДНК (субстрата).

4. Специфичность металлозависимых ДНКаз к химической природе оснований субстрата

5. Специфичность металлозависимых ДНКаз к пространственной структуре субстрата.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ГЛАВА Ш. ВЫДЕЛЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ ДНКАЗЫ.

1. Выделение Ca,Mg -зависимой ДНКазы

2. Характеристика физико-химических свойств Ca.Mg--зависимой ДНКазы.

ГЛАВА 1У.ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ ДНКАЗЫ

К ПЕРВИЧНОЙ И ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРАМ СУБСТРАТА

ГЛАВА У. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ

ДНКАЗЫ К ЛОКАЛЬНЫМ ВАРИАЦИЯМ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ СУБСТРАТА.

1. Действие Ca,Mg -зависимой ДНКазы на двухцепо-чечные полидезоксирибонуклеотиды

2. Действие CafMg -зависимой ДНКазы на 47-членный фрагмент ДНК.

3. Действие CatMg - зависимой ДНКазы на синтетиче ские РНК*ДНК и РНК* РНК комплексы.

4. Влияние высокой ионной силы раствора на субстратную специфичность Ca,Mg -зависимой ДНКазы

Дезоксирибонуклеинат-5'-олигонуклеотидгидролазы-дезоксирибо-нуклеазы (КФЗ.1.4.5) относятся к одной из интенсивно исследуемых групп гидролитических ферментов. Согласно современным представлениям ДНКазы участвуют, как в реакциях деполимеризации нуклеиновых кислот, так и в избирательных расщеплениях связей в молекуле ДНК генома, необходимых для осуществления процессов репликации, репарации, рекомбинации и рестрикции. В последнее время получены многочисленные данные, подтверждающие чрезвычайную гетерогенность ферментов этой группы, а, следовательно, и участие в каждом из этих процессов определённых ДНКаз. Имеющиеся сведения о важной роли ДНКаз во многих генетических процессах у бактерий и фагов, определяют интерес к исследованию свойств, специфичности и механизма действия этих ферментов у эукариот. Кроме того, ДНКазы широко используются как инструменты при исследовании структуры и функции нуклеиновых кислот, организации тонкой структуры нуклеопро-теидных комплексов. В последнее время эти ферменты получили применение в практической медицине в качестве эффективных противовирусных препаратов.

Среди ДНКаз большую группу с разнообразными свойствами составляют металлоактивируемые ДНКазы эндо-типа действия, которые широко распространены в ядрах клеток различных животных. Тесная связь этих ферментов с белками хроматина и способность активировать синтез ДНК позволяют предположить важную роль этих ферментов в процессах репликации ядерной ДНК. Тем не менее вопрос о функции этих ферментов ещё далёк от окончательного выяснения.

Несмотря на значительное количество работ, посвящённых ме-таллозависимым ДНКазам, систематизация этого материала до сих пор не проводилась. Большинство исследователей до последнего времени ограничивалось констатацией некоторых свойств ДНКаз и выяснением особенностей их действия на различные субстраты.

Наиболее изученный представитель этой группы ферментов -панкреатическая ДНКаза I, широко используется для исследования структуры хроматина, вьщеления мининуклеосом и для избирательного расщепления транскрипционноактивных участков хроматина. Кроме этого ДНКаза I применяется для получения фрагментов определённой величины при сиквенировании ДНК, определения периодичности двойной спирали В-ДНК в растворе и локальных флуктуаций в структуре ДНК, зависящих от нуклеотидной последовательности. Интерес к эукариоти-ческим металлозависимым ДНКазам значительно возрос в последнее время в связи с активным поиском новых высокоспецифичных ДНКаз как инструментов для структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот.

В то же время стало очевидным, что для структурных исследований и решения задач генной инженерии необходимо использование высокоочиценных ферментов с установленными физико-химическими свойствами. Без знания специфичности и механизма действия ферментов практически невозможно исследование их роли в различных генетических процессах. Удобной моделью для выяснения функции ДНКаз в метаболизме ДНК в клетках эукариот являются дифференцирующие клетки эмбрионов морского ежа.

Именно эти проблемы определили задачи данной работы, которые были сформулированы следующим образом:

1. Выделить из клеток эмбрионов морского ежа S.intermedius гомогенный препарат Ca,Mg -зависимой ДНКазы.

2. Определить основные физико-химические свойства фермента.

3. Изучить влияние двухвалентных ионов металлов и различных реагентов на активность фермента.

4. Исследовать специфичность фермента к химической природе оснований субстратов.

5. Исследовать специфичность фермента к пространственной структуре субстратов.

Проведённые исследования показали, что в клетках эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedins находится несколько ДНКаз эндо-типа действия. Наиболее высокой удельной активностью обладает Са,% - зависимая ДНКаза.

На первом этапе работы впервые из морских организмов был выделен гомогенный препарат Ca,Mg - зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа и охарактеризованы его основные физико-химические свойства.

В связи с тем, что на механизм действия и специфичность металлозависимых ДНКаз существенное влияние оказывают ионы двухвалентных металлов, было изучено влияние этих катионов и их сочетаний на ферментативную активность Ca,Mg - зависимой ДНКазы. Полученные данные позволили подойти к исследованию специфичности фермента к химической природе оснований и пространственной структуре полимерного субстрата с учётом локальных флуктуаций в структуре спирали.

Показано, узнавание локальной конформации сахарофосфатного остова ДНК лежит в основе специфичности Ca,Mg - зависимой ДНКазы. На основе экспериментальных данных предположено, что фермент гидролизует В-ДНК в местах обладающих гладкой структурой классической В-конформации или тяготеющих к А-конформации.

Знание свойств и специфичности Ca,Mg - зависимой ДНКазы открывают возможности использования фермента для структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот и нуклеопротеидных комплексов. Необычное свойство ДНКазы-проявление активности в растворах с высокой ионной силой-позволяет предположить, что фермент может найти применение в практической медицине при лечении ран с использованием гипертонических растворов, а также как противовирусный препарат.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ШТАЛЛОЗАВИСИМЫЕ ЭНДОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ ЭУКАРИОТ

Литературный обзор освещает круг вопросов, исследуемых автором в представляемой экспериментальной работе. Данные о метал-лозависимых ДНКазах эукариот приведены в обзоре М.Ласковского (1967 г.) /I/ и в монографии В.С.Шалота (1968г.) /2/. Биологическая роль нуклеаз освещена в обзоре Р.И.Татарской (1976г.) /3/ и сборнике обзоров "Нуклеазы" (1982г.) /4/. В настоящем обзоре использованы литературные данные, опубликованные в отечественных и основных зарубежных изданиях до 1984 года.

вывода

1. Разработан метод выделения Ca,Mg -зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedins Препарат фермента гомогенен по данным диск-электрофореза и изо-электрофокусирования в ПАА геле, не содержит следов экзонуклеаз-ной и РНКазной активностей.

2. Фермент стабилен в диапазоне рН от 5 до 9 и при нагревании до 40°. Состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 45 кД, имеет pi 4,4, устойчив к действию еульфгидрильных реагентов.

3. Активность фермента полностью зависит от присутствия ионов двухвалентных металлов, при рН 7,5 активаторами ферментативной реакции служат ионы Са2+ , Mg2+ , Мп2+ , Со2+ , Ва2+ о, pt 2+ и Sr ; совместное присутствие ионов Са и Mg оказывает синергическое активирующее действие. рН - Оптимум зависит от природы двухвалентных катионов металлов. Фермент сохраняет активность в растворах с высокой ионной силой при соотношении двухвалентных и одновалентных катионов 1:10.

4. Установлено, что Ca,lg -зависимая ДНКаза является типичной эндонуклеазой и расщепляет ДНК по з'- фосфодиэфирным свя зям, образуя олигонуклеотиды с 5-концевым фосфатом.

5. Показано, что Ca,Mg -зависимая ДНКаза не имеет строгой специфичности к природе гетероциклических оснований, а проявляет специфичность ко вторичной структуре ДНК. Фермент не расщепляет синтетические одноцепочечные полинуклеотиды независимо от их длины и нуклеотидной последовательности и гидролизует субстраты с двухцепочечной структурой. .

6. Установлено, что устойчивость отдельных фосфодиэфир

- 126 ных связей к действию Ca,Mg -зависимой ДНКазы коррелирует с рассчитанными величинами углов спирального вращения ( Т > 36°) для этих пар оснований в природных и синтетических субстратах. На основании полученных результатов и литературных данных сделан вывод, что' специфичность фермента определяется узнаванием локальных вариаций структуры сахарофосфатного остова ДНК в растворе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённые нами исследования показали, что Ca,Mg -зависимая эндонуклеаза является одним из основных ДНК-гидролизующих ферментов в клетках эмбрионов морского ежа. Впервые из морских организмов получен гомогенный, по данным диск-электрофореза и изоэлектрофокусирования в ПАА геле, препарат фермента, не содержащий следов экзрнуклеазной и РНКазной активности. Разработанный нами метод выделения фермента включает стадии осаждения сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, оксиапатите и гель-хроматографию на сефадексе G-I00.

По данным гель-фильтрации в нативных условиях и электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия показано, что молекула фермента состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 45 кД. Изоэлектрическая точка молекулы фермента находится в области рН 4,4. Фермент стабилен в диапазоне рН от 5 до 9 и полностью сохраняет активность при нагревании до 40°, имеет температурный оптимум в диапазоне Сульфгидрильные реагенты не оказывают заметного влияния на активность фермента.

Для проявления ферментативной активности Ca,Mg- зависимой ДНКазы необходимо присутствие двухвалентных катионов металлов. Активаторами фермента являются ионы Са2+, Mg2+, Мп2+, Со2+, Ва2+ и Sr2+. Совместное присутствие ионов Mg2+ + Са2+ ,

Mg2+ + Ba2+ и Mg2+ + Sr2+ оказывает синергическое активирующее действие, что является характерным признаком этого класса ферментов. рН - Оптимум зависит от природы двухвалентных катионов металлов.

Одновалентные катионы металлов ингибируют активность фермента. Добавление 0,3 М хлористого натрия в стандартную инкубационную смесь полностью ингибирует реакцию. В то же время фермент обладает уникальным свойством, по сравнению с панкреатической ДНКазой, полностью сохранять активность в растворах с высокой ионной силой ^ — 0,7, если соотношение двухвалентных и одновалентных катионов металлов составляет не менее 1:10.

Исследование продуктов гидролиза, образующихся при инкубации фермента с различными субстратами, показало, что Ca,Mg -зависимая ДНКаза является типичной эндонуклеазой и расщепляет ДНК по з'-фосфодиэфирным связям с образованием олигонуклеотидов с фосфатом на 5-конце.

Ca,Mg -зависимая ДНКаза не проявляет строгой специфичности к природе гетероциклических оснований. Отличительной характеристикой фермента является его выраженная специфичность ко вторичной структуре субстрата. Фермент не гидролизует одноцепочечные полинуклеотиды независимо от их длины и нуклеотидной последовательности и гидролизует субстраты с двухцепочечной структурой. В отличие от панкреатической ДНКазы специфичность фермента не завир . р. сит от присутствия в инкубационной среде ионов Са , Mg или Са2+ + Mg2+.

1. Laskowski М. DNAses and their use in the studies of primary structure of nucleic acids. -Advances in enzymology, 1967, v.29, pp.165-220.

2. Hashida Т., Tanaka Y., Matsunami N., Yoshihara K., Kamiya T., Tanigawa Y., Koide S. S. Purification and properties of bull seminal plasma Ca,lg-dependent endonuclease. -J.Biol.Chem., 1982, v.257, N 21, pp.13114-13119.

3. Burgoyne L.A., Hewish. D.R. The regular substructure ofmammalian nuclei and nuclear Ca,Mg-endonuclease. -Cell Uucl,,1978, v.4, Chromatin. Part A. Hew York e.a. pp.47-74.

4. Lindberg U. Molecular weight and amino acid compositionof deoxyribonuclease I. -Biochemistry, 1967, v.6, H 1, pp.335-342.

5. Price P.A., biu T-Y., Stein W.H., Moore S. Properties of chromatographically purified bovine pancreatic deoxyribonuclease. -J.Biol,Chem., 1969, v.244, И 4, pp.917-923.

6. Love J.D., Hewitt R.R. The relationship between human serum and human pancreatic DNA-ase I. -J.Biol.Chem., 1979, v.254, К 24, pp.12588-12594.

7. Anai M., Sasaki М», Muta A., Miyagawa T, Purification andproperties of a neutral endodeoxyribonuclease from guinea pig epidermis. -Biochim.Biophys.Acta, 1981, v.656, IT 2, pp.183-188.

8. Lee C.Y., Lawrence S., Zbarsky S.H. The separation of two deoxyribonucleases from extracts of intestinal mucosa of the rat. -Can.J.Biochem., 1972, v.50, N 6, pp.697-703.

9. Nagae S., Nakayama J., Nakano X., AnaiM. Purificationand properties of a neutral endodeoxyribonuclease from rat small intestinal mucosa. -Biochemistry, 1982, v.21, И 6, pp.1339-1344.

10. Liao T-H. Isolation and characterization of multiple forms of malt deoxyribonuclease. —Phytochemistry, 1977» v. 16 • I 10, pp.1469-1474.

11. Kreuder V., Dieckhoff J., Drenchkhahn D., Mannherz H.G. Isolation, characterization and subcellular localisation of bovine and rat parotide deoxyribonuclease I. -Europ.J.Cell Biol.,1982, v.27» К 1, pp.740-746.

12. Cantor C.R. A possible explanation for the nuclease limit digestion pattern of chromatin. -Proc.Uat.Acad.Sci.USA, 1976, v.73, N 10, pp.3391-3393.

13. Lomonossoff G.P., Butler P.J.G., Klug A. Sequence-dependent variation in the conformation of DHA. -J.Mol.Biol., 1981, v.149, 14, pp.745-760.

14. Dickerson R.E., Drew H.R. Structure of а В-ША dodecamer.

15. Influence of base sequence on helix structure. -J.Mol.Biol., 1981, v.149» H 4, pp.761-786.

16. Fischman G.J., Lambert M.W., Studzinski G.P. Purification and properties of a nuclear ША endonuclease from Hela S^ cells, -Biochim.Biophys.Acta, 1979, v.567, И 2, pp.464-471.

17. Pedrini A.M., Ranzani G., Pedrali G., Spadari S., Falas-chi A. A novel endonuclease of human cells specific for single-stranded DM. -Europ. J.Biochem., 1976, v.70, N 1, pp. 275-283.

18. Tsuruo Т., Arens M., Padmanabhan R., Green M. An endode-oxyribonuclease of human KB cells. -J.Biol.Chem., 1978, v.253» Ж 10, pp.3400-3407.

19. Wang E.-C., Furth J.J., Rose J.A. Deoxyribonucleic acid single-strand-specific endonucleases in human cells: purification and characterization. -Biochemistry, 1978, v.17, К 3,1. PP.544-549.

20. Wang E.-C., Rose J.A. Deoxyribonucleic acid single-strand-specific endonucleases in human cells: partial purification of a salt-resistant endonuclease with an acidic isoelectric point. -Biochemistry, 1981, v.20, N 4, pp.755-758.

21. Brown F.L., I&isich P.R., Maio J.J, Cae I: endonuclease isolated from the african green monkey with properties, indicating site-specific cleavage of homologous and heterologous mammalian DHA. -Nucl.Acids Res., 1978, v.5, N 4, pp.1093-1107.

22. McKenna W.G., Maio J.J., Brown F.L. Purification and properties of a mammalian endonuclease showing site-specific cleavage of DHA. -J.Biol.Chem., 1981, v.256, N 12, pp.6435-6443.

23. McKenna W.G,, Brown F.L., Musich P.R., Maio J.J. Cleavage of mammalian repetitive deoxyribonucleic acids by mammaliansite-specific endodeoixyribonuclease. -J.Mol.Biol., 1982, v. 154, U 2, pp.379-384.

24. Wang E.-C., Furth J.J. Mammalian endonuclease, DHase V. Purification and properties of enzyme of calf thymus. -J.Biol. Chem., 1977, v.252, H 1, pp.116-124.

25. Lambert M.W., Studzinski G.P. ША endonuclease activities associated with melanoma cell chromatin. -Biochem.Biophys.Res. Commun., 1979, v.91, N 4, pp.1481-1487.

26. Antonoglou 0., Georgatsos J.G. Bond cleaving specificity and other properties of a deoxyribonuclease of kidney. -Arch. Biochem.Biophys., 1969, v.135, H 1, pp.36-44.

27. Antonoglou 0., Georgatsos J.G. Multiplicity of alkaline deoxyribonucleases in mouse liver. -Arch Biochem.Biophys., 1971, v.142, N 1, pp.268-273.

28. O'Connor P.J. The partial purification and some properties of a deoxyribonuclease from regenerating rat liver. -Bio-chim.Biophys.Acta, 1969, v.185, U 1, pp.153-162.

29. Винтер В.Г., Беляева М.И., Зоткина НД. Свойства дезок-сирибонуклеазы ядер печени крыс и изменение её активности при индуцированном синтезе нуклеиновых кислот. -Биохимия, 1974, т.39, № 5, с.923-928,

30. Kalinski A., Takamatsu H., Laskowski M; An endonuclease activity of chicken erythrocyte nuclei and mononucleosomes. -J.Biol.Chem., 1980, v.255, H 21, pp.10542-10545.

31. Hori K., Baba M., Arai Y., Moriya T. Deoxyribonuclease A of chick embryo. Partial purification and characterization of the enzyme. -J.Biol.Chem., 1983, v.258, H 2, pp.960-966.

32. Mattoccia E., Grandini A.D., Tocchini-Valentini G.P. DUA-relaxing activity and endonuclease activity in Xenopus laevis oocytes. -Proc.Nat.Acad,Sci.USA, 1976, v.73, N 12, pp.4551-4554.

33. Ashe H., Seaman E., Vinakis H.V., Levine L. Characterization of a deoxyribonuclease of Mystelus canis liver. -Biochim. Biophys.Acta, 1965, v.99, IT 2, pp.298-306.

34. Бердышев Г.Д., Рассказов В,А., Анисимов M.M. О специфичности ДНКазы из печени камбалы. -Докл. АН СССР, 1968, т.183,4, с.966-969.

35. Бронштейн И.Б., Шахбазян Г.К., Кафиани К.А. Термостабильная ДНКаза мз яиц рыб, производящая специфические разрывыв суперспиральной ДНК. -Докл. АН СССР, 1982, т.264, № 6, с.1500--1502.

36. Бронштейн И.Б., Шахбазян Г.К., Кафиани К.А. Выделение и свойства эндодезоксирибонуклеазы из яиц вьюна. -Биохимия, 1983, т.48, В I, с.92-103.

37. Boyd J,В. Characterization of an alkaline active deoxyri-bonuclease from the prepupal salivary gland of Drosophila hydei. -Biochim.Biophys.Acta, 1970, v.209, If 2, pp.339-348.

38. Georgatsos J.G., Antonoglou 0. Purification and specificity of a deoxyribonuclease of the hepatopancreas of Octopus vulgaris. -J.Biol.Chem., 1966, v.241, Л 9, pp.2151-2156.

39. Sabeur G., Bernardi A., Aubel-Sadron G., Bernardi G. The specificity of a neutral deoxyribonuclease from Cancer pagurus. -Europ.J.Biochem., 1975, v.52, N 3, pp.445-449.

40. Clough W. An endonuclease isolated from Epstein-Barr virus-producing human lymphoblastoid cells. -Proc.Nat.Acad,Sci. USA, 1980, v.77, К 10, pp.6194-6198.

41. Grandgenett D.P., Vora A.C., Schiff R.D. A 32000-dalton nucleic acid-binding protein from avian retravirus^ cores possesses DUA endonuclease activity, -Virology, 1978, v,89, Ж 1,pp.119-132.

42. Hoffmann P.J. Mechanism of degradation of duplex ША by DNase induced by Herpes simplex virus. -J,Virology, 1981, v.38, N 3, pp.1005-1014.

43. Nissen-Heyer J., Nes I.P. Purification and properties of ША endonuclease associated with Friend leukemia virus, -Hucl.Acid Res., 1980, v.8, К 21, pp.5043-5055.

44. Burton W.G., Roberts R.J., Myers P.A., Sager R. A site-specific single-strand endonuclease from the eukaryote Chlamy-domonas. -Proc.flat.Acad.Sci.USA, 1977, v.74, H 7, pp.2687-2691.

45. Kato M., Ikeda У, On the deoxyribonucleases K1 and K2 isolated from mycelia of Aspergillus oryzae.-J.Biochem., 1968, v.64, N 2, pp.321-324.

46. Kato M., Ikeda Y. On the two deoxyribonucleases K1 and K2 isolated from mycelia of Aspergillus oryzae. III. Degradation of heat denatured ША by DUAases K1 and K2. -J.Biochem.1969, v. 65, К 1, PP.43-48.

47. Suzuki M., Sakaguchi К. Purification and specificity of Aspergillus sojae DNase. -Eur.J.Biochem., 1974, v.49, И 3,pp.619-625.

48. Rushizky G.W., Whitlock J.P. Preparation and properties of a new DHAse from Aspergillus oryzae. -Biochemistry, 1977, v.16, N 14, pp.3256-3261.

49. Watabe H., Shibata Т., Ando T. Site-specific endodeoxy-ribonucleases in eukaryotes. Endonucleases of yeasts Saccharo-myces and Pichia. -J.Biochem., 1981, v.90, H 6, pp.1623-1632.

50. Rosamond J. Purification and properties of an endonuclease from the mitochondrion of Saccharomyces cerevisiae. -Ear.J. Biochem., 1981, v.120, N 3, PP.541-546.

51. Jacquemin-Sablon H., Jacquemin-Sablon A, Effect of proteolysis on the yeast mitochondrial deoxyribonucleases. -Biochim. Biophys.Acta, 1984, v.786, N 3, pp.252-261.

52. Liao T-H. Multiple forms of deoxyribonuclease I. -Mol. Cell.Biochem., 1981, v.34, IT 1, pp. 15-22.

53. Kim H.S., Liao T-H. Isoelectric focusing of multiple forms of DNase in thin layers of polyacrilamide gel and detection of enzymatic activity with zymogram method following separation. -Anal.Biochem., 1982, v.119, К 1, pp.96-101.

54. Price P., Stein I.H., Moore S. Effect of divalent cations on the reduction and re-formation of the disulfide bonds of de-oxyribonuclease. -J.Biol.Chem., 1969, v.244, N 4, pp.929-932.

55. Suck D. Crystallization and preliminary crystallographic data of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. -J.Mol.Biol., 1982, v.162, N 2, pp.511-513.

56. Sakabe Ж., Sakabe К., Sasaki К., Kondo H., Ша Т., Kamiya N., Matsushima М. Crystallographic studies of the chicken gizzardо

57. G-actin-DNAse I complex at 5A resolution. -J.Biochem., 1983» v.93, К 1, pp.299-302.

58. Price P.A. Moore S., Stein W.H. Alkylation of a histidi-ne residue at the active site of bovine pancreatic deoxyribo-nuclease. -J.Biol.Chem., 1969, v.244, N 4» pp.924-928.

59. Poulos T.L., Price P.A. The involvement of serine and carboxyl groups in the activity of bovine pancreatic deoxyribo-nuclease A. -J.Biol.Chem., 1974, v.249, N 5, pp.1453-1457.

60. Junowicz E., Spencer J.H. Studies of bovine pancreatic DHAse A. I. General properties and activation with different bivalent metals. -Biochim.Biophys.Acta, 1973, v.312, N 1, pp.72--84.2+

61. Price P. The essential role of Ca in the activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. -J.Biol.Chem., 1975, v.250, N 6, pp.1981-1986.

62. Эйхгорн H. Неорганическая биохимия, т.I. -M.: Мир, 1978, 711 с.

63. Tullis R., Price P.A. The effect of calcium and magnesium on the ultraviolet spectrum of bovine pancreatic deoxyribonucle-ase A. -J.Biol.Chem., 1974» v.249, N 16, pp.5033-5037.

64. Wallach J., Fonlupt P. Effect of Mg2+ and Mn2+ on hydrolysis of calf thymus ША by pancreatic deoxyribonuclease I.-J.Inorg.Biochem., 1980, v.13, И 3, pp.233-245.

65. Сурвиладзе З.Г., Дудкин С.М. Стационарная кинетика расщепления ДНК панкреатической дезоксирибонуклеазой А в присутствии Mg2+. -Сообщ. АН ГССР, 1980, т.ЮО, № 2, с.445-449.

66. Сурвиладзе З.Г., Дудкин С.М. Стационарная кинетика расщепления ДНК панкреатической дезоксирибонуклеазой А в присутствии ионов са2+ и м§2+. -Сообщ. АН ГССР, 1980, т.ЮО, 685-689,

67. Suck D., Kabsch W., Mannherz H.G. Three-dimensional structure of the complex of skeletal muscle actin and bovineОpancreatic DNAse I at 6A' resolution. -Proc.Bat.Acad.Sci.USA, 1981, v.78, IT 7, pp.4319-4323.'

68. Lizarraga В., Bustamante C., Gill A., Melgar E. Multipleconformations of deoxyribonuclease A. Their separation at alkap.line pH and low ionic strength in the presence of Ca . -Biochim. Biophys.Acta, 1979, v.579, Ж 2, pp.298-302.

69. Mannherz H.G., Kreuder V., Koch J., Dieckhoff J., Dren-ckhahni D, The inhibition of bovine and rat parotid deoxyribonuclease I by skeletal muscle actin. -Biochem.J., 1982, v.207, N 2, pp.305-313.

70. Liao T-H., McKenzie L.J. Inactivation of bovine pancreatic DUase by 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid. I. A novel inhibitor for DHase I. -J. Biol. Chem., 1979, v.254, H 19, pp.95989601.

71. Liao T-H., Wadano A. Inactivation of DNase by 2-nitro--5-thiocyanobenzoic acid. II. Serine and threonine are the sites of reaction on the DKase molecule. -J.Biol.Chem., 1979, v.254, H 19, pp.9602-9607.

72. Junowicz E,, Spencer J.H. Studies on bovine pancreatic DNase A. II. The effect of different bivalent metals on the specificity of degradation of DNA. -Biochim.Biophys.Acta, 1973, v.312, Ш 1, pp.85-102.

73. Watanabe H., lino Т., Kaneko Т., Shibata Т., Ando T.

74. A new class offhite-specific endodeoxyribonucleases. Endo.Sce.I isolated from a eukaryote Saccharomyces cerevisiae. -J.Biol.Chem.,1983, v.258, U 8, pp.4663-4665.

75. Поляковский ОД., Нооиков В.В. Рестрикционные эндонуклеазы в генетической инженерии. -Биологическая химия (Итоги науки и техники), 1978, т.14, с.1-30.

76. Melgar E., Goldthwait D.A. Deoxyribonucleic acid nuclease. 2. Effects of metals on mechanism of action of deoxyribonuclease I. -J.Biol.Chem., 1968, v.243, H 17, pp.4409-4416.

77. Campbell V.W., Jackson D.A. The effect of divalent cations on the mode of action of DUase I. The initial reaction products produced from covalently closed circular ША, -J.Biol, Chem,, 1980, v.255, H 8, pp.3726-3735.

78. Щелкина A.K., Минченкова Л.Е., Иванов В.И. Влияние температуры на параметры двойной спирали ДНК в растворах. -Молекул, биол., 1977, т.II, № 6, с.466-472.

79. Куприянова Ф.Г., Решетникова О.А., Сойфер В.Н., Винтер В.Г. Влияние панкреатической ДНКазы на синтез ДНК Bacillus subtiiis. -Биохимия, 1979, т.44, № 2, с.332-337.

80. Arnott S., Seising Е. Conformation of С-ША. -J.Mol. Biol., 1975, v.98, N 1, pp.265-269.

81. Мокульский М.А., Капитонова К.А., Мокульская Т.Д. Вторичная структура ДНК фага Т2. -Молекул, биол., 1972, т.6, № 6,с.883-901,

82. Arnott S., Hukins D.W.L. Optimized parameters for А-ША and B-DHA. -Biochem.Biophys.Res.Commun., 1972, v.47, N 6,pp.1504-1509.

83. Zimmerman S.B., Pheiffer B.H. A RNA-DHA hybrid, that can adopt 2 conformations. An X-ray difraction study of poly(rA)* poly(dT) in concentrated solution or in fibers. -Proc.Uat. Acad.Sci.USA, 1981, v.78, H 1, pp.78-82.

84. Wang A.H.J., Quigley G.J., Kolpak P.J., Crawford J.L., Boom J.H., Marel G., Rich A. Molecular structure of a left-handed double helical ША fragment at atomic resolution. -Nature, 1979, v.282, N 5740, pp.680-686.

85. Pohl P.M. Polymorphysm of synthetic DM in solution, -nature, 1976, v.260, 3J 5549, pp.365-366.

86. Patel D.J., Canuel b.L., Pohl F.M. "Alternating В-ША» conformation for the oligo(dG-dC) duplex in high-salt solution.-Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 1979,v.76, N 8, pp.2508-2511.

87. Behe M., Feeselfeld G. Effects of methylation 011 a synthetic polynucleotide: the B-Z transition in poly(dG-m^dC)«poly(dG-nr'dC). -Proc.Nat.Acad.Sci.USA. Biol.Sci., 1981, v.78, N 3, pp.1619-1623.

88. Klug A., Jack A., Viswamitra M.A., Kennard 0., Shakked Z., Steitz T.A. A hypothesis on a specific sequence-dependent conformation of DNA and its relation to the binding of the lac-repres-sor protein. -J.Mol.Bioi., 1979, v.131, N 2, pp.669-680.

89. Cohen J.S., Wooten J.B., Chatterjee C.L. Characterization of alternating deoxyribonucleic acid conformations in solutionby P-31 nuclear magnetic resonance. -Biochemistry, 1981, v.20, U 11, pp.3049-3055.

90. Leslie A.G#t Arnott S., Chandrasekaran R., Ratliff R.L. Polymorphism of DHA double helices. -J.Mol.Bioi., 1980, v.143, N 1, pp.49-72.

91. Флорентьев В.Л, Конформационные возможности ДНК. -Биоор-ганич. химия, 1982, т.8, Jfc 7, с.885-899.

92. Zavriev S.K., Minchenkova L.E., Fraak-Kamenetskii M.D., Ivanov V.I. OEfbhe flexibility of the boundaries between the A-form and B-form sections in DNA molecule. -Nucl. Acids Res., 1978, v. 5, N 7, pp.2657-2663.

93. Ivanov V.I., Minchenkova L.E., Prank-Kamenetskii M.D., Schyolkina A.K. The Б to 1 transition of DNA in solution. J.Mol.Bioi., 1974, v.87, N 2, pp.817-833.

94. Ehrlich S.D., Bertazzoni U., Bernardi G. The specificity of pancreatic deoxyribonuclease. -Eur,J.Biochem., 1973» v. 40, N 3, pp.143-147.

95. Bernardi A., Gaillard C., Bernardi G. The specificity of five DNAses as studied by the analysis of 5'-terminal doublets. -Eur.J.Biochem., 1975, v.52, U 3, pp.451-457.

96. Anderson S. Shotgun MA sequencing using cloned DNase I-generated fragments. -Uucl.Acids Res., 1981, v,9, N 13,pp.3015-3027.

97. Panayotatos N., Wells R.D. Cruciform structures in su-percoiled ША. -Nature, 1981, v.289, И 5797» pp.466-470.

98. Zasloff M., Camerini-Otero D.R. Limited DNase I nicking as a probe of gene conformation. -Proc,Nat,Acad.Sci.USA, Biol, Sci., 1980, v.77, N 4, pp.1907-1911.

99. Levinger L., Varshavsky A, Selective arrangement of ubiquitinated and D1 protein-containing nucleosomes within the Drosophyla genome. -Cell, 1982, v,28, Ж 2, pp.375-385.

100. Kohwi-Shigematsu T,, Gelinas R., Weintraub H. Detection of an altered DUA conformation at specific sites in chromatin and supercoiled DNA. -Proc.Nat,Acad.Sci.USA. Biol.Sci., 1983, v.80, N 14, pp.4389-4393.

101. Мюльберг A.A., Тищенко Л.И. Малая нуклеосома как возможный структурный элемент хроматина, выявляемый Са^-эндонукле-азой. -Докл. АН СССР, 1981, т.259, В 2, с.492-495.

102. Hanlon D.P., Watt D.S., Westhead E.ti. Interaction of divalent metal ions with tris buffer in dilute solution. -Anal. Biochem., 1966, v.16, N 2, pp.225-233.

103. Scheffler I.E., Elson E.L., Baldwin R.L. Helix formation by dAT oligomers. I. Hairpin and straight-chain helices. -J.Mol.Biol., 1968, v.36, И 2, pp.291-304.

104. Василенко С.К. Выделение фосфодиэстеразы и фосфомоноэсте-разы из яда гюрзы vipera lebetina методом хроматографии на суль-фоэтилцеллюлозе. -Биохимия, 1963, т.28, № 5, о.602-608.

105. Douvas A., Price P. Some effects of calcium and magnesium ions on the activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A. -Biochim.Biophys.Acta, 1975, v.395, U 1, pp.201-212. , ,

106. Wezenbeek P.M.G.F., Hulsebos T.J.M., Schoenmakers J.G.G. Nucleotide sequence of the filamentous bacteriophage М13.ША genome: comparison with phage fd. -Gene, 1980, v.11, N 1-2,pp.129-148.

107. Wilson D.A., Thomas C.A. Palindromes in chromosomes. -J.Mol.Biol., 1974, v.84, Я 1, pp.115-144.

108. Alves J., Pingoud A., Haupt W., Langowski J., Peters P., Maass G., Wolff C. The influence of sequences adjacent to the recognition site on the cleavage of oligodeoxynucleotides by the EcoR1 endonuclease. -Eur.J.Biochem., 1984, v.140, N 1,рр,83-92,

109. Thomas М., Davis R.W, Studies on cleavage of bacterio-phage-lambda DM with EcoR1 restriction endonuclease. -J.Mol.

110. Biol., 1975, v.91, Ж 3, pp.315-324.

111. Kabsch W., Sander C., Trifonov E,U, The ten twist angles of B-DHA, -Hucl.Acids Res,, 1982, v.10, К 3, pp.1097-1104,

112. Calladine C.R. Mechanics of sequence-dependent stacking of bases in B-DM, -J.Mol.Biol., 1982, v.161, И 2, pp.343-352,

113. Dickerson R.E, Base sequence and helix structure variation in B- and A-DBA. -J.Mol.Biol., 1983, v.166, Ж 3, pp.419--441.

114. Tung C-S,, Harvey S.C, A molecular mechanical model to predict the • helix twist angles of B-DM. -Nucl.Acids Res,, 1984, v.12, IT 7, pp,3343-3356.

115. Ульянов Н.Б., Журкин В.Б. Изучение гибкости комплементарных динуклеозидфосфатов методом Монте-Карло.-Молекул. биол., 1982, т.16, № 5, с,1075-1085,

116. Record М,Т,, Mazur S,J,, Melancon Р,, Roe J-H,, Shaner S,L,, Unger L, Double helical DM: conformations, physical properties and interactions with ligands, -Ann,Rev,Biochem,, 1981, v. 50, pp.997-1024,

117. Tilton R.F., Weiner P.K., Kollman P.A. An analysis of sequence dependence of the structure and energy of A- and B-DM models using molecular mechanics. -Biopolymers, 1983» v.22, N 3, pp.969-1002,

118. Arnott S,, Seising E, Structures for the polynucleotide , .< complexes poly(dA)*poly(dT) and poly(dT)» poly(dA)»poly(dT), -J.Mol.Biol., 1974, v.88, К 3, РР.509-521.

119. Klug A., butter L.C., Rhodes D. Helical periodicity of DNA on and off the nucleosome as probed by nucleases. -Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1983, v.47, Pt. 1, pp.285-292, Cold Spring Harbor, N.Y., 1983.

120. PS ФизХим Биол. Биотехнол., 1984, ЗА 397.

121. Olson W.K., Srinivasan A.R., Marky N.L., Balaji V.N. Theoretical probes of DNA conformation examining of the B-Z con-formational transition. -Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1983, v.47, Pt.1, pp.229-241, Cold Spring Harbor, N.Y., 1983.

122. PS ФизХим Биол. Биотехнол., 1984, ЗА 341.

123. РоЫ F.M. Salt-induced transition between two double-helical forms of oligo(dC-dG). -Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol., 1983, v.47, Pt.1, pp.113-117, Cold Spring Harbor, N.Y., 1983. FS ФизХим Биол. Биотехнол., 1984, ЗА 339.

124. Ivanov V.I., Minyat E.E. The transition between left-and right-handed forms of poly(dG-dC). -Hue1.Acids Res., 1981, v.9, N 18, pp.4783-4798.

125. KLenov H., Henningsen I. Selective elimination of endonuclease activity of deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli В by limited proteolysis. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1968, v.65, N 1, pp.169-175.

126. Clewell D.B. Nature of ColE1 plasmid replication in Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. -J.Bacteriol,, 1972, v.110, N 2, pp.667-676.

127. Studer F.W, Sedimentation studies of the size and shape of DNA. -J.Mol.Biol,, 1965, v,11, IT 3, pp.373-390.

128. Wirtz A., HofSchneider P.H. Replication of the single stranded DHA bacteriophage M13. -Eur,J.Biochem,, 1970, v.17, N 1, pp.141-150.

129. Lowry O.H., Rosenbrough IT.J., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin-phenol reagent, -J,Biol,Chem,, 1951, v.193, N 1, PP.265-275,

130. Razzell W.B. The precipitation of polyribonucleotides with magnesium salts and ethanol. -J,Biol,Chem,, 1963, v.238, H 9, pp.3053-3057.

131. Chen P.S., Toribara T,Y,, Warher H, -Microdetermination of phosphorus, -Analyt,Chem., 1956, v.28, pp.1756-1758.

132. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, 1958, т.23, $ 5,с.656-662,

133. Sander С., Ts'o P.O. Interaction of nucleic acids. VIII, Binding of magnesium ions by nucleic acids, -J,Mol,Biol,, 1971, v.55, H 1, pp.1-21.

134. Riley M., Maling В., Chamberlin M,J, Physical and chemical characterisation of two- and three-stranded adenin-thymine and adenine-uracil homopolymer complexes, -J.Mol.Biol,, 1966, v. 20, N 2, pp.359-389.

135. Pish W,W,, Mann K,G,, Tanford C, The estimation of polypeptide chain molecular weights by gel filtration in 6 M guani-dine hydrochloride. -J.Biol.Chem,, 1969, v.244, pp.4989-4994.

136. Стронгин А.Я., Левин Е.Д., Степанов В.М. Изоэлектрофо-кусирование белков в гелях. -Химия прир.соед., 1973, № 5, с.581 -588.

137. Maxam А.М., Gilbert W. Hew method ;to sequencing ША, -Proc,Nat,Acad.Sci,USA, 1977, v.74, N 2, pp.560-564.

138. Коробко В.Г., Грачев С,А. Определение нуклеотидной последовательности в ДЩК модифицированным химическим методом. -Биоорганич. химия, 1977, т.З, с.1420-1422.