Новые селективные пептидные субстраты цистеиновых пептидаз семейства папаина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Семашко, Татьяна Александровна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2011
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА
На правах рукописи
СЕМАШКО Татьяна Александровна
НОВЫЕ СЕЛЕКТИВНЫЕ ПЕПТИДНЫЕ СУБСТРАТЫ ЦИСТЕИНОВЫХ ПЕПТИДАЗ
СЕМЕЙСТВА ПАПАИНА
02.00.10 - биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
2 6 МАЙ 2011
Москва 2011
4847968
Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в отделе белков растений Института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор химических наук, профессор
Филиппова Ирина Юрьевна
кандидат биологических наук Элпиднна Елена Николаевна
Официальные оппоненты: доктор химических наук
Ротанова Татьяна Васильевна
доктор биологических наук, профессор Валуева Татьяна Александровна
Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский
институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН
Защита состоится 14 июня 2011 года в 16.00 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при московском университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.
Автореферат разослан {iмая 2011 года.
Учёный секретарь Совета, / /?
Г' ./'
кандидат химических наук - . ' Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Пептидгидролазы семейства С1 (папаина) относятся к клану цистеиновых пептидаз, содержащих в активном центре остаток цистеина. Они выявлены в различных группах организмов. Родоначальником этого семейства является растительная пептидаза папаин. Этот фермент, а также близкие к нему цистеиновые пептидазы из тропических фруктов бромелаин и фицин имеют важное практическое значение и используются в пищевой промышленности, фармакологии, научных исследованиях. Большую группу цистеиновых пептидаз семейства С1 составляют цистеиновые лизосомальные катепсины млекопитающих и человека. Цистеиновые катепсины не только осуществляют неселективную лизосомальную деградацию белков, но и принимают участие в более специфических процессах как в нормальных физиологических условиях (активации проферментов, созревании гормонов, презентации антигенов и т.д.), так и при развитии различных патологий (остеопорозе, ревматоидном артрите, атеросклерозе, метастазировании и инвазии раковых опухолей и т.д.). Большой интерес представляют также цистеиновые пептидазы некоторых групп насекомых, у которых катепсин-подобные ферменты выполняют пищеварительную функцию. Сведения об организации и эволюции пищеварительной системы насекомых важны как с фундаментальной точки зрения, так и для разработки экологически безопасных методов борьбы с насекомыми-вредителями.
Идентификация и характеристика цистеиновых пептидаз семейства С1 (папаина) в природном материале требует их селективной детекции. Однако синтетические субстраты, обычно используемые для определения активности этой группы ферментов, больше удовлетворяют специфичности сериновых трипсиноподобных пептидаз. Это снижает как селективность, так и чувствительность корректного определения активности пептидаз семейства папаина. В связи с этим весьма актуальной задачей является разработка селективных и эффективных субстратов для тестирования активности ферментов этого семейства, как в гомогенном состоянии, так и в составе сложных ферментных смесей. Примером таких многокомпонентных систем служит комплекс пищеварительных пептидаз ряда насекомых-вредителей зерновых запасов. Наиболее изученным представителем этой группы насекомых является большой мучной хрущак ТепеЬпо тоНюг, пищеварительный комплекс которого содержит цистеиновые и сериновые пептидазы. Ключевую роль в протеолизе пищевых белков играют цистеиновые пептидазы. Основными пищевыми белками Т. тоШог являются главные запасные белки семян пшеницы - глиадины, которые в значительных количествах присутствуют и в пищевом рационе человека. Однако употребление в пищу глиадинсодержащих продуктов может вызывать тяжелое аутоиммунное заболевание ЖКТ целиакию (диагносцируемое у 2% населения). Отдельные пептиды глиадинов, вызывающие
3
аутоиммунный ответ у больных целиакией, устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека и большинства известных пептидаз. Мы предположили, что способностью гидролизовать токсические пептиды глиадинов могут обладать главные пищеварительные цистеиновые пептидазы этого насекомого-вредителя. На сегодняшний день лекарств от целиакии нет. В связи с этим, одной из целей данной работы являлась идентификация и исследование субстратных свойств цистеиновых пептидаз из Т. то1Иог, которые могут иметь весьма важное значение как потенциальные лекарственные средства в лечении целиакии.
Цели и задачи исследования. Основной целью работы являлся дизайн, синтез и применение новых селективных пептидных субстратов для идентификации и характеристики субстратной специфичности цистеиновых пептидаз семейства С1.
В работе решались следующие задачи: (1) дизайн и химико-энзнматический синтез селективных пептидных субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1; (2) определение кинетических параметров гидролиза субстратов цистеиновыми пептидазами различного происхождения; (3) анализ селективности субстратов; (4) использование субстратов для идентификации и характеристики цистеиновых пептидаз в составе сложных ферментных смесей на примере пищеварительного комплекса личинок большого мучного хрущака Т. тоНюг.
Научная новизна и практическая ценность работы. Проведен дизайн и химико-энзиматический синтез хромогенных и флуорогенных субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1. Показано, что полученные соединения являются эффективными и селективными субстратами пептидаз семейства С1 различного происхождения и могут использоваться для детекции активности цистеиновых пептидаз в сложных ферментных смесях. С использованием синтезированных флуорогенных субстратов предложена методика детекции активности цистеиновых пептидаз семейства С1 после нативного электрофореза в ПААГ.
С помощью синтезированных субстратов идентифицированы и охарактеризованы две пищеварительные цистеиновые пептидазы большого мучного хрущака ТепеЬгю тоШог, одна из которых является катепсин В-, а вторая - катепсин Ь-подобной пептидазой. Эти результаты расширяют представления об организации и эволюции пищеварительной системы насекомых, а также могут быть полезны для разработки экологически безопасных методов борьбы с насекомыми-вредителями.
Показано, что флуорогенные аналоги токсических пептидов глиадинов, вызывающих целиакию, расщепляются катепсин Ь-подобными пептидазами и не расщепляются катепсин В-подобными пептидазами из разных источников. Полученные данные могут быть использованы для разработки подходов к лечению целиакии.
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в реферируемых журналах и 2 статьи в сборниках трудов научных конференций. Результаты работы были представлены на 29 и 30 Европейском Пептидном Симпозиумах (Гданьск, Польша, 2006; Хельсинки, Финляндия, 2008), четвертом и пятом Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 и 2009), Второй международной конференции "Biocatalysis in Non-Conventional Media" (Москва, 2008), Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 9-ом Молодежном научном форуме и 34-ом конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Прага, Чехия, 2009).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного субстратной специфичности пептидаз семейства С!, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (137 ссылок). Содержит 117 страниц, 29 рисунков и 19 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Дизайн субстратов цистеииовых пептидаз семейства С1
В нашу задачу входило получение пептидных субстратов семейства папаина, которые отвечали бы следующим требованиям: 1) соответствие аминокислотной последовательности субстратов специфичности ферментов; 2) наличие в субстратах таких структурных элементов, которые обеспечивали бы возможность прямого детектирования ферментативной активности. В соответствии с этим структура субстратов может быть выражена общей формулой А-Хаа-YaajB, где А = Glp (пироглутамил), Abz (о-аминобензоил); В = pNA (л-нитроанилид), АМС (7-амидо-4-метилкумарин) и AFC (7-амидо-4-трифторметилкумарин); Хаа = Phe, Val; Yaa = Ala; место предполагаемого гидролиза субстратов показано стрелкой. Поскольку субстрат-связывающая область цистеиновых катепсинов невелика по размерам, предлагаемые субстраты - короткие ди- и трипептиды. Исходя из анализа имеющихся литературных данных, мы предположили, что в подцентре Pi субстратов может находиться небольшой по размеру аминокислотный остаток аланина (Yaa = Ala). В положении Р2, которое является определяющим для специфичности пептидаз семейства С1, находятся гидрофобные остатки (Хаа = Phe, Val). N-концевая группировка субстратов (А) представлена остатками пироглутаминовой (Glp) и о-аминобензойной кислот (Abz). Остаток пироглутаминовой кислоты, являясь более гидрофильным, чем большинство использующихся защитных групп, введен для обеспечения растворимости субстратов в водно-органических смесях. Группировка
Abz является флуорогенным маркером. В качестве С-концевых остатков (В) использованы хромогенная я-нитроаннлмдная (pNA) и флуорогенные 7-амино-4-метил- » 7-амнно-4-трифторметилкумарндные группировки (AMC) и (AFC) соответственно, присутствие которых обеспечивает простоту и высокую чувствительность анализа ферментативной активности по изменению спектральных и флуоресцентных характеристик субстратов в ходе гидролиза. Таким образом, нами были предложены следующие субстраты: GIp-Plie-Ala-pNA (I), Glp-Val-Ala-pNA (II), Abz-Plie-Ala-pNA (III), Glp-Phe-Ala-AMC (IV) и Glp-Phe-AIa-AFC (V).
Возможность всех предложенных соединений являться субстратами иистеиновых нептидаз семейства Cl была проверена с помощью метода молекулярного докннга. На рис. 1 (А -Г) показано возможное связывание предложенных субстратов с молекулами папаина, катепсннов В и L и моделью бромелаина, построенной гомологичным моделированием на основе пространственной структуры хпмопапаина. На рис 1Д представлены модули энергии связывания полученных комплексов. Было показано, что все вышеперечисленные соединения могут связываться в районе активного центра выбранных пептндаз в конформацин, благоприятствующей дальнейшему расщеплению субстратов только по предполагаемой для гидролиза пептидной связи, и, следовательно, являться субстратами исследованных пептидаз.
2. Хнмико-энзиматический синтез субстратов иистеиновых пептидаз семейства Cl
IIa первом этапе был проведен химический синтез карбоксильных и ряда аминокомпонентов пептидной конденсации. Для получения карбоксильных компонентов - Abz-Phe-OMe, GIp-Phe-OMe, Glp-Val-OMe были разработаны методики, основанные на применении метода активированных эфиров. Синтез аминокомпонентов пептидной конденсации - Ala-pNA и Gln-pNA проводили с Вос-производными аминокислот п я-нитроанилином в присутствии POCIî с последующим удалением защитных групп.
Заключительной стадией синтеза субстратов являлась ферментативная конденсация компонентов:
фермент
А-ХааОМе + Н-А1а-В — A-Xaa-Yaa-B + МеОН, где А = Glp, Abz; Хаа = Plie, Val; В = pNA, AMC, AFC
I
I
С.П' П(ИМ I катепгпнВ бромеламн папамн
Рис. 1. Моделирование положения субстратов (1)-(У) в зоне связывания папаина (А), бромелаина (Б), катепсина В (В), катепсина Ь (Г). 01р-РЬе-А1а-рЫА (I) отмечен желтым цветом, 01р-Уа1-А1а-рЫА (II) - зеленым, АЬг-РЬе-АЫ-рЫА (III) - красным, 01р-РЬе-А1а-АМС (IV) -голубым, 01р-Р11е-А1а-АРС (V) - фиолетовым. Д - модуль энергии связывания полученных комплексов.
Ферментативное образование пептидной связи гарантировало селективность протекания реакции, обеспечивало оптическую чистоту целевых соединений, а также позволило упростить схему синтеза и выделения продуктов. В качестве катализаторов использовались пептидазы а-химотрипсин (ХТР) и субтилизин Карлсберг (СЛ), специфичность которых удовлетворяла структуре синтезируемых субстратов. Возможность проведения ферментативного синтеза субстратов была исследована в двух вариантах: (1) под действием нативных ХТР и СЛ в смеси ОМР/водный буфер 50/50 об.%. и (2) с использованием модифицированных ферментов в безводной среде полярных органических растворителей (ОМР-МеСЫ (20/80 об. %)).
В случае проведения синтезов под действием нативных ферментов концентрация
исходных соединений составляла 0,13 М, концентрация ферментов - 50 мкМ ([8]:[Е] = 2600:1).
Смещение равновесия в сторону синтеза определялось ускорением образования ацилфермента
7
за счет активации карбоксильного компонента, содержащего сложноэфирную группу. Дополнительным фактором смещения равновесия в сторону синтеза являлось выведение продукта из сферы реакции за счет выпадения его в осадок.
Было показано, что под действием нативных пептидаз в водно-органической среде может быть проведен синтез только некоторых субстратов - Glp-Phe-Ala-pNA (I) под действием ХТР и СЛ с выходами 70% и 66% соответственно, Abz-Phe-Ala-pNA (III) под действием ХТР с выходом 70% и Glp-Phe-Ala-AFC (V) под действием ХТР и СЛ с выходами 50% и 18% соответственно.
Более универсальным оказалось проведение ферментативного синтеза субстратов в безводной органической среде под действием ХТР и СЛ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта (КПВС). Реакция проводилась в смеси DMF-MeCN (20/80 об. %), молярные соотношения фермент/субстрат составляли для синтеза с использованием СЛ 1/(3600-5600), ХТР - 1/(800-2200). Сдвиг равновесия в сторону синтеза осуществлялся благодаря недостатку воды в реакционной смеси. В отличие от водной среды, в органических растворителях под действием иммобилизованных ферментов удалось получить все субстраты, однако эффективность синтеза была различна. В исследованных нами условиях синтез субстратов (I) и (III)-(V), содержащих остаток Phe, проходил гораздо лучше под действием иммобилизованного ХТР (выходы целевых соединений варьировались от 11 до 100% (в случае Glp-Phe-Ala-AMC)), в то время как под действием иммобилизованного СЛ выходы не превышали 44% (Glp-Phe-Ala-pNA (I)). Вместе с тем, синтез Glp-Val-Ala-pNA (II) удалось осуществить только с использованием СЛ - в присутствии ХТР образования этого пептида не наблюдалось.
Рис. 2. Ферментативный синтез субстратов (1)-(У) с использованием нативных и иммобилизованных ферментов.
Возможность повторного использования иммобилизованных биокатализаторов была показана на примере синтезов Glp-Phe-Ala-pNA (I) и Glp-Phe-Ala-AMC (IV) под действием ХТР, иммобилизованного на КПВС. Выход пептида (I) был достаточно высоким (70-80%) и практически не менялся даже после 6-кратного использования одного и того же образца биокатализатора. В случае Glp-Phe-Ala-AMC эффективность синтеза была одинаковой на протяжении двух циклов. За 4 ч выход (IV) составил 50 % и достиг количественного за 48 ч.
В целом, эффективность синтеза производных с Phe выше при использовании ХТР, а с Val - при использовании CJI. Перспективным методом является получение целевых соединений в органических растворителях с использованием иммобилизованных на КПВС ХТР и СЛ, поскольку в этом случае решается проблема растворимости гидрофобных компонентов. Иммобилизация пептидаз в этом случае позволяет повысить устойчивость белков к денатурации и дает возможность повторного использования катализаторов. При проведении пептидного синтеза в водно-органических смесях под действием нативных ХТР и CJI выход целевых продуктов, как правило, выше, синтез проходит быстрее и с меньшим количеством биокатализатора.
Все синтезированные пептиды представляют собой устойчивые кристаллические соединения. Все соединения охарактеризованы величинами хроматографической подвижности в нескольких системах (ТСХ), временами удерживания (ВЭЖХ), данными аминокислотного анализа, масс-спектрометрии и ЯМР (табл. 1). Получены спектры поглощения п-нитроанилидных производных, а также спектры возбуждения и испускания соединений, содержащих флуоресцентные маркерные группировки. Полученные физико-химические характеристики синтезированных соединений (I)-(V) свидетельствуют об их химической гомогенности и спектральной чистоте.
3. Гидролиз субстратов цистеиновыми пептидазами семейства С1
Гидролиз полученных пептидомиметиков (I)-(V) изучали под действием цистеиновых пептидаз семейства С1 - растительных ферментов папаина, бромелаина, фицина, а также лизосомальных катепсинов млекопитающих и человека В и L. Для анализа субстратной специфичности вышеперечисленных пептидаз мы использовали также Z-Ala-Ala-Gln-pNA (VI). Все исследуемые субстраты расщеплялись цистеиновыми пептидазами семейства С1. Однозначность расщепления соединений (I)-(VI) по единственной связи между аминокислотным остатком в Pi-положении и соответствующей маркерной группировкой (pNA, AMC, AFC) была показана на примере гидролиза их папаином методом ВЭЖХ.
Таблица 1. Физико-химические характеристики синтезированных субстратов
Субстрат АК анализ тех ВЭЖХ 3 Мг (рассч./ обнар.) ЯМР 'Н, ОМЭО-Об, 5, м.д.
АЬг-РЬе-А1а-рЫА РЬе:А1а 1,04:1 0,32 1 23,5 мин 475,1/ 475,1 1,32 д (ЗН, -СНз), 2,91 (1Н, -СН-ОЬ-С6Н,), 3,09 д. д (1Н, -СН-СН2-С6Н5), 4,39 д. д (1Н, -СН-СН2-С6Н5), 4,65 м (1Н, -СН-СНз), 6,20 с (2Н, -ШЛ 6,42 д. д (1Н, -и-С6(0)Н4-Ш2), 6,57 д (1Н, -о-С6(0)Н4-]МН2), 7,05 д. д (1Н, -и-С6(-ЫН2)Н4=0), 7,1-7,30 м (5Н, -СН2- С6Нз), 7,39 д (1Н, -о-Сй(-МН2)Н4=0), 7,80 д (2Н, -м-С6(-РШ)Н4-М02), 8,16 д (2Н, -о-С,,(-ЫН)Н4-К02), 8,16 с (1Н, -С(0)-ЫН-СН- в А1а), 8,49 с (1Н, -С(0)-Ш-СН- в РЬе), 10,6 с (1Н, -С(0)-]ЧН-СН- в рИА)
Ир-РЬе-АЬ-рИА С1и:РЬе:А1а 1,02: 1:1,05 Я/=0,8б' 19,7 мин 467,2/ 467,2 1,38 д (ЗН, -СНз). 1,73 м (1Н, -СН2-СНгСН-), 2,02 м (2Н, -С(0)-СН2-СН2-), 2,20 м (1Н, -СН2-СН,-СН-). 2,81 д. д (1Н, -СН-СНз-СбН;), 3,09 д. д (1Н, -СН-СНГСЙН3), 3,97 д. д (1Н, -С[Г-СН2-С6Н5), 4,44 м (1Н, -СН-СНз), 4,58 м (1Н, -ЫН-СН-СН2-), 7,17-7,27 м - (5Н, -СЙЬ), 7,71 с (1Н, -С(0)-КтН-СН- в Ир), 7,88 д (2Н, ■ 1\'Н-С()Н4-К02), 8,08 д (1Н, -С(0)-ЫН-СН- в А1а), 8,25 д (2Н, -К1[-С6Н.-К02), 8,46 д (1Н, -С(0)-МН-СН- в РЬе), 10,61 с (1Н, -С(0)-ЫН-СН- в рИА)
ар-РЬе-А1а-АМС 01и:РЬе:А1а 1,08:1:1 0,32 1 15,9 мин 504,2/ 504,2 1,31 д (ЗН, -СНз в А1а), 1,73 м (1Н, -СНГСН2-СН-), 2,01 м (2Н, -С(0)-СН2-СН2-), 2,20 м (1Н, -СН2-СН,-СН-), 2,39 с (ЗН, -СН, в АМС), 2,73 м (1Н, -СН-СН2-С6Н5), 2,87 м (1Н, -СН-СНГС<,Н5), 3,95 д. д (1Н, -СН-СН2-СбН,), 4,44 м (1Н, -СН-СНз), 4,56 м (1Н, -Ш-СН-СН2-), 6,27 с (1Н, -СН-С-СН3), 7,27 м - (5Н, -С(,Ш, 7,487,73 м (2Н, -ЫН-о-С9Н402Рз), 7,75 (1Н, -С(0)-Ш-СН- в ар), 7,77 (2Н, -КН-л1-С,Н402Р3), 8,07 д (1Н, -С(О)-ЫН-СН- в А1а), 8,43 д (1Н, -С(0)-МН-СН-в РЬе), 10,44 с (1Н, -С(0)-ЫН-СН- в АМС)
С1р-РЬе-А1а-АРС Glu-.Phe-.Ala 1,4:1:1,2 Я/= 0,53 1 23,0 мин 558,2/ 558,3 1,35 д (ЗН, -СНз), 1,71 м (1Н, -СН2-СДг-СН-), 1,99 м (2Н, -С(0)-СЫг-СН2-), 2,18 м (1Н, -СНГСН2-СН-), 2,70 м (1Н, -СН-СН2-С6Н5), 2,87 н (1Н, -СН-ОЬ-СбН,), 3,93 д. д (1Н, -СН-СН2-С6Н5), 4,39 м (1Н, -СН-СНз), 4,54 м (1Н, -ЫН-СН-СН2-), 6,89 с (1Н, -СН-С-СИз), 7,23 м - (5Н, -С6Н5), 7,52-7,69 м (2Н, -МН-о-СУШ-Рз), 7,88 д (1Н, -С(0)-МН-СН- в С1р), 7,92 (2Н, -МН-л»-С9Н402Рз), 8,03 д (1Н, -С(0)-КН-СН- в А1а) 8,41 д (1Н, -С(0)-МН-СН- в РЬе), 10,59 с (1Н, -С(0)-ЫН-СН- в АРС)
ар-Уа1-А1а-рКА аи:РЬе:А1а 1:0,7:1,2 Я/= 0,88 2 21,0 мин 419,2/ 419,2 0,83 д. д (6Н, -СН, в Уа1), 1,15 м (1Н, (СН3)2СН-СН-), 1,30 д (ЗН, -СНз в А1а), 1,87 м (1Н, -СН2-СН2-СН-): 2,09 м (2Н, -С(0)-СН2-СНГ), 2,22 м (1Н, -СН,-СН2-СН-), 4,13 м (1Н, -СН-СН(СН3)2), 4,20 м (1Н, -СН-СН3), 4,57 (1Н, -Ш-СН-СН-), 7,83 д (2Н, -Ш-СбШ-Шг), 7,91 с (1Н, -С(0)-Ш-СН- в Уа1), 7,93 д (1Н, -С(О)-ЫН-СН- в А1а), 8,22 д (2Н, -Ш-С6Н4-К02), 8,34 д (1Н, -С(0)-ЫН-СН- в С1р), 10,59 с (1Н, -С(0)-Ш-СН- в рЫА)
В системе бензол-ацетон-уксусная кислота (100:25:4) В системе н-бутанол-вода-пиридин-уксусная кислота (15:12:10:3)
3 0,1% ТРА в линейном градиенте МеСК (1 мл/мин) от 10 до 70% за 30 мин на колонке С18 (4,6x250 мм)
Субстраты (1)-(У1) сравнивались по двум характеристикам: (1) по эффективности гидролиза цистеиновыми пептидазами семейства С1, которая характеризуется скоростью гидролиза и оценивается коэффициентом специфичности ферментативной реакции кса,/Км и (2) по селективности, т.е. устойчивости субстратов к действию пептидаз других кланов.
3.1. Кинетика гидролиза субстратов цистеиновыми пептидазами семейства С1
Кинетические константы гидролиза синтезированных субстратов цистеиновыми пептидазами представлены на рис. 3. Видно, что флуорогенные субстраты по эффективности гидролиза, определяемой величиной ксм/Км, на порядок превосходят хромогенные субстраты, причем для всех изученных ферментов, за исключением катепсина Ь, 01р-РЬе-А1а-АМС и С1р-РЬе-А1а-АРС расщеплялись гораздо лучше, чем АЬг-А1а-РЬе-рКА. В случае флуорогенных субстратов ксМ/Км была максимальной при гидролизе АЬг-РЬе-А1а-рЫА катепсином Ь, а в случае хромогенных субстратов - при расщеплении Glp-Phe-Ala-pNA папаином. Наибольшая эффективность гидролиза всех хромогенных субстратов наблюдалась для папаина, а наименьшая - для катепсина Ь; в случае папаина, фицина и катепсина В наилучшим субстратом являлся 01р-РЬе-А1а-рКА; бромелаин с сопоставимой эффективностью гидролизовал также й1р-Уа1-А1а-рЫА; катепсин Ь лучше всего гидролизовал 2-А1а-А1а-01п-рЫА.
Рис. 3. Эффективность гидролиза флуорогенных (А) и хромогенных (Б) субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1. Условия реакции: рН 5,6, 1 мМ БТТ, 2,5% ИМР, концентрация пептидаз 20-50 нМ, диапазон концентрации флуорогенных субстратов 1,25-75 мкМ, хромогенных субстратов 25-1000 мкМ.
3.2. Селективность субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1
Селективность синтезированных субстратов была исследована с использованием сериновых пептидаз - трипсина, а-химотрипсина, субтилизина Карлсберг; аспартильной -пепсина и металлопептидазы - термолизина. Активность ферментов была измерена в условиях,
оптимальных для работы цистеиновых пептидаз: в слабокислой среде и в присутствии восстановителя дитиотреитола. Полученные данные представлены на рис. 4.
Синтезированные нами флуорогенные субстраты Glp-Phe-Ala-AMC и Glp-Phe-Ala-AFC были селективны для цистеиновых пептидаз семейства С1 и не гидролизовались пептидазами других кланов. Субстрат Abz-Phe-Ala-pNA расщеплялся химотрипсином с высокой скоростью и, следовательно, селективным не являлся (рис. 4, А-Б).
Среди хромогенных субстратов селективными являются Glp-Phe-Ala-pNA и Glp-Val-Ala-pNA. Субстрат Z-Ala-Ala-Gln-pNA расщеплялся субтилизином Карлсберг (рис. 4, ВТ).
Была исследована также селективность распространенных коммерческих хромогенных субстратов Z-Phe-Arg-pNA (VII), Z-Arg-Arg-pNA (VIII), Bz-Arg-pNA (IX), которые в настоящее время широко используются для тестирования ферментативной активности цистеиновых пептидаз семейства Cl. Z-Phe-Arg-pNA (VII) является специфичным субстратом для всего семейства цистеиновых пептидаз семейства Cl, Z-Arg-Arg-pNA (VIII) позволяет разделить по активности катепсины В и L, a Bz-Arg-pNA (IX) является самым распространенным субстратом для определения активности цистеиновых пептидаз семейства С1. Для сравнения проводили гидролиз коммерческих субстратов (VII)-(IX) использованными в работе цистеиновыми пептидазами и перечисленными выше пептидазами других кланов (рис. 4, Д-Е). Z-Phe-Arg-pNA хорошо расщеплялся всеми исследованными цистеиновыми пептидазами, причем наибольшую активность проявлял папаин. Субстрат Z-Arg-Arg-pNA расщеплялся бромелаином и катепсином В, a Bz-Arg-pNA гидролизовался всеми цистеиновыми пептидазами, но с низкой скоростью. Таким образом, все коммерческие субстраты не являются селективными, т.к. с высокой скоростью расщепляются трипсином.
|50
Упапаин Убромелаин и фицин В катепсин В У катепсин I
J
ЛЬг-РЬе-Л1л-рЫД 61р-Р11е-Л1а-ЛМС С1р-РЬе-Л1а-ЛРС
в бромелаин У фицин
61р-РЬе-А1з-рМА в1р-\/а1-Л1а-рМЛ 2-А1а-А1а-61п-рМА
В папаин в бромелаин У фицин В катепсин В У катепсин I.
2-РИе-А^-рЫА г-Аг§-А^-рМ
70
1 60 £
1 50
г
1 40 :
5
< 30
20 10 0
У а-химотрипсин У субтилизин Карлсберг У трипсин У пепсин У термолизин
АЬг-РЬе-А1а-рМА С1р-РИе-А1а-АМС ар-РЬе-А1а-АРС
12
2
< 2
В а-химотрипсин У субтилизин Карлсберг У трипсин У пепсин У термолизин
61р-РЬе-А1а-рМА 61р-Уа1-А1а-рМА 2-А1а-А1а-б1п-рМА
У а-химотрипсин У субтилизин Карлсберг У трипсин У пепсин У термолизин
I
г-РЬе-АГЁ-рИА г-А^-Лге-рМ
Вг-Агу-рМА
Рис. 4. Активность цистеиновых пептидаз семейства С1 и пептидаз других кланов при гидролизе исследуемых субстратов. Условия реакции: рН 5,6, 1 мМ ОТТ, 2,5% БМИ, концентрация пептидаз 20-100 нМ, концентрация флуорогенных субстратов 25 мкМ, хромогенных субстратов 200 мкМ.
3.3. Постэлектрофоретическая детекция активности папаина с использованием синтезированных субстратов
Выявленные преимущества синтезированных флуорогенных субстратов С1р-РЬе-А1а-АМС и Ир-РЬе-Ак-АБС позволили разработать высокочувствительный экспресс-метод
детекции активности цистеиновых пептидаз после нативного электрофореза в ПААГ. Активность пептидаз в геле детектировали визуально под УФ-светом. На рис. 5 представлены результаты детекции папаина в геле (в диапазоне 9 - 174 пмоль) с использованием предложенного подхода в сравнении с другими способами детекции. На полосе А показаны результаты визуализации фермента при окраске геля кумасси, ниже - детекция папаина с использованием хромогенного субстрата Glp-Phe-Ala-pNA (I). Этот метод обнаружения фермента - непрямой и включает наложение на гель мембраны, пропитанной субстратом, с последующим диазотированием выделяющегося и-нитроанилина. На полосах В и Г показаны результаты визуализации папаина с использованием синтезированных нами Glp-Phe-Ala-AMC (IV) и Glp-Phe-Ala-AFC (V). В отличие от использования хромогенного субстрата Glp-Phe-Ala-pNA, применение флуорогенных соединений (IV) и (V) позволяет детектировать активность непосредственно в геле без проведения дополнительных операций. Преимуществом этого подхода является также повышение чувствительности детекции и возможность безошибочной локализации в геле белковой полосы для дальнейшего анализа.
Папаин, пмоль Окраска папаина Кумасси G-250 Детекция активности по Glp-Phe-Ala-pNA Детекция активности по Glp-Phe-Ala-AMC
Детекция активности по Glp-Phe-Ala-AFC
Рис. 5. Различные способы детекции папаина после нативного электрофореза в ПААГ.
4. Идентификация и характеристика цистеиновых пептидаз Tenebrio molitor 4.1. Фракционирование пептидаз Tenebrio molitor
Синтезированные нами субстраты оказались незаменимы и очень эффективны при исследовании цистеиновых пептидаз личинок жука-вредителя зерновых и крупяных запасов большого мучного хрущака Т. molitor (Coleóptera: Tenebrionidae). Отличительной чертой этих ферментов является их высокая нестабильность, обусловленная как их склонностью к автолизу, так и нахождением в составе многокомпонентного пищеварительного комплекса Т. molitor. Представление о сложном составе пищеварительного комплекса этого насекомого иллюстрируют результаты хроматографического разделения методом гель-фильтрации
14
экстракта пищеварительных ферментов (рис. 6). В составе комплекса выявлены цистеиновые пептидазы по субстратам Glp-Phe-Ala-pNA и 2-А1а-А1а-01п-рЫА, трипсиноподобные - по Bz-Arg-pNA, химотрипсиноподобные - по 01р-А1а-А1а-Ьеи-рЫА, пролилкарбоксипептидаза по - 2-А1а-Рго-рКА, дипептидилпептидаза IV - по А1а-Рго-рЫА, а также ряд других экзопептидаз. В связи с этим использование синтезированных нами селективных субстратов являлось необходимым залогом успеха в детектировании и идентификации цистеиновых пищеварительных пептидаз Т. тоШог., На рис. 7 приведены профили элюции пептидаз, тестированных по синтезированному нами 01р-РЬе-А1а-рЫА и коммерческому субстрату цистеиновых пептидаз 2-Р11е-А^-рЫА в условиях, оптимальных для работы цистеиновых пептидаз (рН 5,6, 1 мМ ЭТТ) и трипсиноподобных пептидаз (рН 7,9, без ОТТ). Видно, что активность по субстрату Glp-Phe-AIa-pNA детектировалась только в условиях, оптимальных для работы цистеиновых пептидаз, в пиках ТтСР1 и ТтСРП. Активность по субстрату 2-Р11е-А^-рЫА проявлялась в обоих рассматриваемых условиях, а также в большем количестве фракций, которые соответствовали элюции не только цистеиновых, но и трипсиноподобных пептидаз. Таким образом, только использование предложенных в нашей работе селективных субстратов позволило однозначно выявить активность цистеиновых пептидаз в столь сложной природной смеси, как пищеварительный комплекс личинок Т. тоШог.
150 200 250 300 350 400 450 500 550
ТтСР1 ТтСРИ
Рис. 6. Фракционирование экстракта пищеварительных пептидаз личинок Т. тоШог на колонке с БерЬаёех 0-100, элюция 0,01 М фосфатным буфером, рН 5,6, содержащим 0,5 М ЫаС1.
Рис. 7. Использование синтезированного субстрата Glp-Phe-Ala-pNA в сравнении с коммерческим Z-Phe-Arg-pNA для выявления цистеиновых пептидаз при фракционировании экстракта пищеварительных ферментов личинок Т. molitor на колонке с Sephadex G-100. Условия эксперимента аналогичны рис. 6.
4.2. Идентификация цистеиновых пептидаз Tenebrio molitor
Нами были предприняты многочисленные попытки очистить цистеиновые пептидазы TmCPI и TmCPII с помощью ионообменной и гидрофобной хроматографии, ковапентной хроматографии с пиридилдисульфидным сорбентом, а также аффинной хроматографии с использованием в качестве лиганда соевого ингибитора трипсина. Однако все способы и их различные комбинации оказались неэффективными ввиду значительной потери активности пептидаз и невозможности получить очищенные ферменты. В связи с этим мы разработали методику на основе предложенных нами селективных флуорогенных субстратов, позволившую идентифицировать пептидазы Т. molitor после всего лишь одной хроматографической стадии очистки. Частично очищенные препараты TmCPI и TmCPII (рис. 6 и 7) подвергали дальнейшему фракционированию посредством нативного электрофореза, после чего непосредственно в геле детектировали активность цистеиновых пептидаз по расщеплению Glp-Phe-Ala-AMC (рис. 8). Флуоресцирующие полосы вырезали из геля и анализировали триптические гидролизаты TmCPI и TmCPII с помощью масс-спектрометрии. Последовательности некоторых из полученных триптических пептидов были определены методом MS/MS. Чистота полученных ферментных препаратов была показана с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Поиск подходящих аминокислотных последовательностей белков был проведен в базах данных NCBI и предоставленной д-ром Брендой Опперт (США) базой кДНК из кишечников личинок Т. molitor. Таким образом,
препарат ТтСР! был идентифицирован как катепсин В-подобная пептидаза Т. то/Ног (25 кДа). Препарат ТтСРП был идентифицирован как катепсин Ь-подобная пептидаза (25 кДа), присутствующая в виде близких изоформ, различающихся несколькими аминокислотными заменами. Сравнение последовательностей исследованных цистеиновых пептидаз с другими пептидазами из семейства С1 показано на рис. 9.
I
, препарат ТтСР1 препарат ТтСРП
12 3 4 М, кДа 5 6 7 8 М, кДа
Рис. 8. Электрофоретический анализ ТтСР1 и ТтСРП (показаны стрелками). После нативного электрофореза дорожки 1 и 5 окрашивали Кумасси С-250 для визуализации белка, на дорожках 2 и 6 тестировали активность цистеиновых пептидаз с использованием 01р-РЬе-А1а-АМС. На дорожках 3 и 7 представлены результаты электрофореза в денатурирующих условиях фракций ТтСР1 и ТтСРП, изолированных из дорожек 2 и 6, соответственно. Дорожки 4 и 8 - маркеры молекулярной массы. Дорожки 3, 4, 7 и 8 окрашивали серебром.
papain
bromelain
TmCPII-1
TmCPII-2
TmCPII-3
cathepsin_L
cathepsin_B
TmCPI
papain
bromelain
TmCPII-1
TmCPII-2
TmCPII-3
cathepsin_JL
cathepsin_B
TmCPI
papain
bromelain
TmCPII-1
TmCPII-2
TmCPII-3
cathepsin_L
cathepsin В
TmCPI
сигнальный пептид-] E R F N I_N G
mamipsiskllfvaiclfvymg|sfgdfsivgysqndltsterliqlfeswmlkhnkiyknidekiyríí1fkdnIky|detnkkn----n|ywlg|
-------mawkvqvvflflflcImwaspsaasade----psdpmmkrfeewmveygrvykdndekmrrfqÍfknnJnhIetfnsrne—nBytlgI
------------mselgilvlcIafaatlal--------pkslfqeqwsqfklthkksysspieeirrqlIfkdn¡ak|aehnakfekgevmyska''
------------mktl—lvlcIafaatlal--------pkslfqeqwsqfklthkksysspieeirrqlBfkdnBakIaehnakfekgevÍysk
-mnptlilaafcBgiasatlt--------fdhsleaqwtkwkamhnrlyg-mneegwrraJJwek elhnqeyregkh|ft
-mwqlwaslccIlvlanars---------------------------------rpsfhpIsde nkr--------nItwqaghn
vgasvalsyg---------------------------------gvklhp§sde nsk--------q|tv)kagrn
-mkcvllcivvlasvalsyg
-gvklhpbsde nsk-
dvngpish|
пропептид^
siagnytttelsyeevlndgdvnJpeyW
gisrplnierepvfsfddvdisalpqr gkaqkpkhpenlrBpyvs-skkp|aa| gkaqkpkhpenlrIpyvs-skkpIa
GKAQKPKHPENLR§pyvs-skkp|ax|
fqnrkprkgkvfqeplfy-eap---r
tflggpkppqr-v)|ftedlkl---pasf
vlpkkanapkl-p|kthavnlda(pe|f
yrnt------------
sgai------------
sesa------------
sesa------------
sesa------------
SEES------------
gglyeshvgcrpysippc: gglygvdegckaysikpcd
3qkg-----avíp!
Idyg-----aKs
sn------avse]
sn------at
Jsn------aB:
Iekg-----^■pj
Éeqwpqcptik-и jeawpectsi|ge|
;srekgpyaakt iTNG-vpnsayiti ¡fds-sqsvttls [fds-sqsvttls
!fds-sqsvttls
iYNP-KYSVANDT
saw: ие g ijklrt— niney AAIAtBeSIYkIkK— ifepf, a1qr--
¡qr— frkt--
cIhtnahvsveJ cIhsdasvkvrI
|vngsrppgtgegdtpkcskicepgysptykqdkhygynsysvsns ;diqrtpackkscdstsdleyksdlrrgs-aysipks|
gpcg—nkl ¡ngpcg—ts iydqtcnqsd
lydqtcnqsd ydqtcnqsd
fepdcssed| [qhvtg-emmgg
iHVSG-EAEGI
papain
bromelain
TmCPII-1
TmCPII-2
TmCPII-3
cathepsin_L
cathepsinB
TmCPI
gygpn--------
pYGQDS---ngk
gyisd----ngq
gygsd----ngq
gyisd----ngq
GYGFESTESDNN ^bven----gtpl
GTGjB§en§ílglKÍ!¡GTGNSYG' IarHeaHiImaBdvs SSSGll |sgHesHw§qv||nygnn---j
nygnn
nygnn---
drrnh
vkn------------------
tlesranveaikmvsesrssv al-------------------
Ul-------------------
al-------------------
tv-------------------
il|gqdh----|jg|esevvagiprtdqyweki-
345 356 330 328 254 333 339 286
Рис. 9. Сравнение последовательностей исследованных цистеиновых пептидаз с идентифицированными пептидазами Т. molitor. Красным отмечены пептиды, найденные методом пептидного фингерпринта с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, подчеркнуты пептиды, последовательность которых определена методом MS/MS. Аннотированные элементы (сигнальный пептид и пропептид с консервативными ERFNIN и GNFD-мотивами - по аналогии с папаином, остатки Q, С, Н и N активного центра обозначены «*», НН в дополнительной петле катепсинов В обозначены «ЕЕ», аминокислотные остатки в Зг-положении связывания субстрата обозначены «2») отмечены зеленым.
4.3. Субстратная специфичность цистеиновых пептидаз Т. тоШог
Субстратную специфичность идентифицированных пептидаз Т. тоГиог изучали с использованием синтезированных (1)-(У1) и коммерческих (УП)-(ГХ) субстратов. Активность ТшСР1 и ТтС'РП была определена с учетом титрования активных центров ферментов специфическим необратимым ингибитором Р-64 (1_-траис-эпоксисукцииил-лейциламидо(4-гуанпдино) бутаном) и измерена в присутствии ингибиторов еернновых пептидаз РМ8Р (фенилметилсульфонилфторида) и 8Т1 (соевого ингибитора трипсина Куница). Обе пептндазы расщепляли все исследуемые субстраты, но с разной эффективностью (рис. 8). Наибольшую активность пептндазы проявляли при гидролизе субстрата 2-Р11е-А^-рЫА. С удовлетворительной скоростью расщеплялись хромогенный субстрат С1р-РЬе-А1а-рЫА и его флуорогенные аналоги 01р-Р11е-А1а-АМС ч 01р-Р11е-А1а-АРС. Катепсин В-подобная пептндаза, как и ее гомолог из млекопитающих, также хорошо расщепляла 7-А^-А1^-рЫА. Специфичность катепсин [.-подобной пептндазы из ТепеЬг'ю тоШог не кореллирует со специфичностью катепсина Ь млекопитающих (см. рис. 4).
Рис. 10. Субстратная специфичность цистеиновых пептидаз Т. тоГиог. Условия реакции: рН 5,6, 1 мМ 13ТТ, 2,5% ОМР, концентрация хромогенных субстратов 200 мкМ, флуорогенных субстратов 25 мкМ.
4.4. Гидролиз аналогов токсических пептидов глиадинов катепсиними сп различных источников
В работе были использованы флуорогенные аналоги токсических пептидов
I глиадинов АЬг-ЬРУРдРОЬРО-ЕООпр (X) и АЬг-ОР(Х)РРРС>-ЕООпр (XI), любезно
предоставленные д-ром Луисом Джулиано (Бразилия). Это пептидомиметики с
19
|
внутримолекулярным тушением флуоресценции (Abz - флуорофор, EDDnp (этилендиамин 2,4-дннитрофенил) - тушитель флуоресценции). Поскольку цистеиновые пептидазы TmCPI и ТтСРП способны расщеплять пептидные связи после остатка Gin в субстрате Z-Ala-Ala-GIn-pNA (см. рис. 10), нами было предположено, что они могут расщеплять и токсические пептиды глиадинов. Активность цистеиновых пептидаз Т. molitor по субстратам (X) и (XI) была измерена в присутствии ингибиторов ссриновых пептидаз PMSF и STI. Для сравнения в этих же условиях был проведен также гидролиз этих субстратов гомологичными пептидазами млекопитающих - катепсинами В и L. Оказалось, что аналоги токсических пептидов расщеплялись катепсин L-подобными пептидазами и не гидролизовались катепсин В-подобными пептидазами из разных источников (рис. 11). Субстрат (XI) гидролизовался обоими катепсинами L с сопоставимой скоростью, в то время как субстрат (X) расщеплялся в 5 раз эффективнее пептидазой ТтСРП. Таким образом, пищеварительная цистеиновая пептидаза ТтСРП из личинок Т. molitor может быть предложена в качестве кандидата для создания лекарственного препарата против целиакии.
катепсинВ катепсин L TmCPI TmCPII
и Abz-lPYPQPQLPQ-EDDnp Ы Ab^-QPQQPFPQ-EDDnp
Рис. 1 1. Гидролиз аналогов токсических пептидов глиадинов катепсин-подобными цистеиновыми пептидазами.. Условия реакции: рН 5,6, 1 мМ ОТТ, 2,5% ЭМР, концентрация субстратов 25 мкМ.
выводы
1. Проведен дизайн и осуществлен химико-энзиматическпй синтез ряда хромогенных и флуорогенных субстратов цистеиновых пептидаз семейства CI: Glp-Phe-Ala-pNA, GIp-Val-Ala-pNA, Abz-Plie-Ala-pNA, Glp-Phe-Ala-AMC, Glp-Phe-Ala-AFC.
2. Определены кинетические параметры гидролиза синтезированных субстратов пептидазами семейства С1 различного происхождения: растительными ферментами папаином, бромеланном и фицнном, а также катепсинами В и L млекопитающих и человека. Показано, что эффективность гидролиза флуорогенных субстратов значительно выше, чем хромогенных.
3. Синтезированные пироглутамилпептиды Glp-Phe-Ala-pNA, Glp-Val-Ala-pNA, Glp-Phe-Ala-AMC и Glp-Phe-Ala-AFC селективны для цистеиновых пептидаз семейства С1 и, в отличие от коммерчески доступных субстратов, не расщепляются пептидазами других кланов.
4. Предложен высокочувствительный экспресс-метод детекции цистеиновых пептидаз семейства С1 после нативного электрофореза в ПААГ с использованием синтезированных флуорогенных субстратов Glp-Phe-Ala-AMC и Glp-Phe-Ala-AFC.
5. С использованием синтезированных субстратов идентифицированы и охарактеризованы катепсин В- и катепсии L-подобные пищеварительные цистеиновые пептидазы из личинок большого мучного хрущака Tenebrio mo/itor.
Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:
1. Аникина О.М., Семашко Т.А.. Оксенойт Е.С., Лысогорская Е.Н., Филиппова И.Ю. Субтилизин Карлсберг, нативный и модифицированный, эффективный катализатор синтеза пептидной связи в органической среде. Биоорганическая химия, 2006, Т. 32, № 2, с. 116-121.
2. Семашко Т.А., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Бачева А.В., Филиппова И.Ю. Химико-энзиматический синтез новых флуорогенных субстратов цистеиновых протеиназ семейства папаина. Биоорганическая химия, 2008, Т. 34, № 3, с. 376-381.
3. Belyaeva A.V., Semashko Т.А., Lysogorskaya E.N., Lozinsky V.I., Filippova I.Yu. Enzymatic synthesis of high specific substrate for cysteine proteases assay. Proceedings of the 29th European Peptide Symposium, 2006, Poland, Gdansk, paper 0319.
4. Semashko Т.. Popletaeva S., Oksenoit E., Lysogorskaya E., Filippova I. New selective substrates for detection of cysteine proteinases. Proceedings of the 30th European Peptide Symposium, 2008, Finland, Helsinki, p. 468-469.
5. Семашко Т.А.. Лысогорская Е.Н., Филиппова И.Ю. Новые флуорогенные субстраты папаииа. Четвертый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2007, Россия, Москва, секция 6. «Биокатализ и биокаталитические технологии», часть 2, с. 303.
6. Semashko Т.A.. Lysogorskaya E.N., Filippova I.Yu. Synthesis of substrates for cysteine proteinases catalyzed by immobilized enzymes. 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media", 2008, Moscow, p. 49.
7. Semashko T.A.. Lysogorskaya E.N., Bacheva A.V., Lozinsky V.I., Filippova I.Yu. Stable Biocatalysts Based on Proteases Immobilized on Polyvinyl alcohol) Cryogel for Peptide Bond Formation. 8th International Conference on Protein Stabilisation, 2009, Austria, Graz, p. 73.
8. Семашко T.A.. Оксенойт E.C., Лысогорская E.H., Бачева А.В., Филиппова И.Ю. Биокаталитическая схема синтеза пептидных субстратов протеаз. Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2009, Москва, т. 2., с. 308.
9. Семашко Т.А. Предсказание субстратной специфичности цистеиновых пептидаз семейства CI. XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», 2009, Россия, Москва, секция «Биоинженерия и биоинформатика», подсекция «Биоинформатика», с. 23.
10. Семашко Т.А.. Поплетаева С.Б., Бабкин П.А.. Гоптарь И.А., Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н. Поиск протеиназ, способных расщеплять трудногидролизуемые пептиды глиадина. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», 2009, Россия, Казань, с. 380.
11. Semashko Т.А., Popletaeva S.B., Filippova I.Yu., Elpidina E.N. Digestive cysteine cathepsins against celiac disease. 9th Young Scientist Forum and 34th FEBS Congress, 2009, Czech Republic, Prague. FEBS Journal, V.276, p. 388.
Заказ № 19-А/05/2011 Подписано в печать 05.05.2011 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,25
ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru
ВВЕДЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЦИСТЕИНОВЫХ ПЕПТИДАЗ СЕМЕЙСТВА С1 (Обзор литературы).
1.1. Классификация цистеиновых пептидаз.
1.2. Распространение, биологические функции и применение пептидаз семейства С
1.3. Процессинг пептидаз семейства С1.
1.4. Структура пептидаз семейства С1.
1.5. Типы ферментативной активности пептидаз семейства С1.
1.6. Активный центр и механизм катализа.
1.7. Активация и ингибирование ферментов.
1.8. Зона связывания пептидаз семейства С1.
1.9. Группы, используемые для детекции ферментативного гидролиза пептидаз.
1.10. Субстраты пептидаз семейства С1.
1.11. Специфичность пептидаз семейства С1.
Пептидгидролазы семейства С1 (папаина) относятся к клану цистеиновых пептидаз, содержащих в активном центре остаток цистеина. Они выявлены в различных группах организмов. Родоначальником этого семейства является растительная пептидаза папаин. Этот фермент, а также близкие к нему цистеиновые пептидазы из тропических фруктов бромелаин и фицин имеют важное практическое значение и используются в пищевой промышленности, фармакологии, научных исследованиях. Большую группу цистеиновых пептидаз семейства С1 составляют цистеиновые лизосомальные катепсины млекопитающих и человека. Цистеиновые катепсины не только осуществляют неселективную лизосомальную деградацию белков, но и принимают участие в более специфических процессах как в нормальных физиологических условиях (активации проферментов, созревании гормонов, презентации антигенов и т.д.), так и при развитии различных патологий (остеопорозе, ревматоидном артрите, атеросклерозе, метастазировании и инвазии раковых опухолей и т.д.). Большой интерес представляют также цистеиновые пептидазы некоторых групп насекомых, у которых катепсин-подобные ферменты выполняют пищеварительную функцию. Сведения об организации и эволюции пищеварительной системы насекомых важны как с фундаментальной точки зрения, так и для разработки экологически безопасных методов борьбы с насекомыми-вредителями.
Идентификация и характеристика цистеиновых пептидаз семейства С1 (папаина) в природном материале требует их селективной детекции. Однако синтетические субстраты, обычно используемые для определения активности этой группы ферментов, больше удовлетворяют специфичности сериновых трипсиноподобных пептидаз. Это снижает как селективность, так и чувствительность корректного определения активности пептидаз семейства папаина. В связи с этим весьма актуальной задачей является разработка селективных и эффективных субстратов для тестирования активности ферментов этого семейства, как в гомогенном состоянии, так и в составе сложных ферментных смесей. Примером таких многокомпонентных систем служит комплекс пищеварительных пептидаз ряда насекомых-вредителей зерновых запасов. Наиболее изученным представителем этой группы насекомых является большой мучной хрущак ТепеЪпо тоШог, пищеварительный комплекс которого содержит цистеиновые и сериновые пептидазы. Ключевую роль в протеолизе пищевых белков играют цистеиновые пептидазы. Основными пищевыми белками Т. тоШог являются главные запасные белки семян пшеницы - глиадины, которые в значительных количествах присутствуют и в пищевом рационе человека. Однако употребление в пищу глиадинсодержащих продуктов 5 может вызывать тяжелое аутоиммунное заболевание ЖКТ целиакию (диагносцируемое у 2% населения). Отдельные пептиды глиадинов, вызывающие аутоиммунный ответ у больных целиакией, устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека и большинства известных пептидаз. Мы предположили, что способностью гидролизовать токсические пептиды глиадинов могут обладать главные пищеварительные цистеиновые пептидазы этого насекомого-вредителя. На сегодняшний день лекарств от целиакии нет. В связи с этим, одной из целей данной работы являлась идентификация и исследование субстратных свойств цистеиновых пептидаз из Т. тоШог, которые могут иметь весьма важное значение как потенциальные лекарственные средства в лечении целиакии.
Основной целью данной работы являлся дизайн, синтез и применение новых селективных пептидных субстратов для идентификации и характеристики субстратной специфичности цистеиновых эндопептидаз семейства С1.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Использованы международные однобуквенные и трехбуквенные сокращения названий аминокислот. Все аминокислоты в Ь-ряда, если не оговорено особо.
Abz- о-аминобензоил (антранилоил)
Ас- ацетил
-АСС 7-амино-4-карбамоилметилкумарин
-AMC 7-амино-4-метилкумарид
-AFC 7-амино-4-трифторметилкумарид
Вое- трет-бутилоксикарбонил
BtOH N-гидрокси-бензотриазоловый эфир
Bz- бензоил
Bzl- бензил
DCC 1^,М'-дициклогексил-карбодиимид
DMF диметилформамид
DMSO диметилсульфоксид
Dnp 2,4-динитрофенил
DTT дитиотреитол
Е-64 Ь-транс-эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино) бутан
EDDnp этилендиамин 2,4-динитрофенил
EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота
Et этил
For- формил
FPLC быстрая (высокоскоростная) жидкостная хроматография белков
Glp- пироглутамил
HEPES К-2-гидроксиэтилпиперазин-]М'-этансульфоновая кислота
IUBMB (=The International Union of Biochemistry and Molecular Biology)
Международный союз биохимии и молекулярной биологии
Me метил
MES 2-(1\Г-морфолино)этансульфоновая кислота
Рас- фенилацетил
PMSF фенилметилсульфонилфторид
PSA персульфат аммония
-pNA л-нитроанилид
РИА р-нафтиламид додецилсульфат натрия вп соевый ингибитор трипсина Куница
Бис- сукцинил
ТЕМЕБ ]М,]Ч-тетраметилэтилендиамин
ТшСР цистеиновая пептидаза ТепеЬгю тоШог
Тпв трис-гидроксиметиламинометан ъ- бензилоксикарбонил вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография
2,2'ДПДС 2,2' -дипиридилдисульфи д
4,4'ДПДС 4,4'-дипиридилдисульфид
ДТНБК 5,5' -дитиобис-(2-нитробензойная кислота)
КПВС криогель поливинилового спирта
ПААГ полиакриламидный гель
ТЭА триэтиламин
УБ ацетат-фосфат-боратный универсальный буфер
выводы
1. Проведен дизайн и осуществлен химико-энзиматический синтез ряда хромогенных и флуорогенных субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1: 01р-РЬе-А1а-рМА, С1р-Уа1-А1а-рМА, АЬг-РЬе-А1а-рЫА, С1р-РЬс-А1а-АМС, 01р-РЬс-А1а-АРС.
2. Определены кинетические параметры гидролиза синтезированных субстратов пептидазами семейства С1 различного происхождения: растительными ферментами папаином, бромелаином и фицином, а также катепсинами В и Ь млекопитающих и человека. Показано, что эффективность гидролиза флуорогенных субстратов значительно выше, чем хромогенных.
3. Синтезированные пироглутамилпептиды 01р-РЬе-А1а-рКА, 01р-Уа1-А1а-рМА, С1р-РЬе-А1а-АМС и 01р-РЬе-А1а-АРС селективны для цистеиновых пептидаз семейства С1 и, в отличие от коммерчески доступных субстратов, не расщепляются пептидазами других кланов.
4. Предложен высокочувствительный экспресс-метод детекции цистеиновых пептидаз семейства С1 после нативного электрофореза в ПААГ с использованием синтезированных флуорогенных субстратов 01р-РЬе-А1а-АМС и 01р-РЬе-А1а-АРС.
5. С использованием синтезированных субстратов идентифицированы и охарактеризованы катепсин В- и катепсин Ь-подобные пищеварительные цистеиновые пептидазы из личинок большого мучного хрущака ТепеЬгю тоШог.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор искренне признателен руководителям работы Ирине Юрьевне Филипповой и Елене Николаевне Элпидиной за ценные советы в ходе выполнения работы и помощь во время ее написания. Автор особенно благодарен E.H. Лысогорской и Е.С. Оксенойт за синтез отдельных использованных субстратов и советы по выполнению экспериментов, Д.П. Жужикову за предоставление образцов из насекомых. Автор также признателен Я.Е. Дунаевскому и М.А. Белозерскому за советы и помощь в проведении некоторых экспериментов. Автор благодарен отделу Хроматографии НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ в лице Л. А. Баратовой, Н. В. Федоровой, А. Л. Ксенофонтова и Л. В. Кордюковой за проведение аминокислотного анализа и помощь в анализе данных по ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Автор также признателен сотрудникам Лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН В.И. Лозинскому и Б.Л. Шаскольскому за предоставленные криогель поливинилового спирта, методики и внимание. Автор благодарен A.A. Байкову за консультации в области ферментативной кинетики. Автор признателен сотруднице отдела Биоэнергетики Е.А. Поповой за помощь в работе с микропланшетным флуориметром и внимание. Автор хотел бы поблагодарить студентов Химического факультета МГУ Д.П. Василькову, Е.А. Воротникову, С.С. Терехова, студентов факультета Биоинженерии и биоинформатики МГУ В.Р. Голяева, П.А. Бабкина, А.Г. Мартынова за участие в экспериментах. Автор также хотел бы поблагодарить Г.Н. Баландину, Т.И. Величко, A.B. Беляеву, О.М. Аникину, И.А. Гоптарь, Ю.А. Смирнову, М.С. Исакова, Т.А. Семенову и М.А. Семашко за моральную поддержку на протяжении времени выполнения работы. Автор хотел бы выразить отдельную благодарность A.B. Бачевой за ценные советы и помощь при выполнении и написании работы и за внимание.
1.12. Заключение
Цистеиновые пептидазы семейства С1 (папаина) - обширная группа ферментов, схожих по первичной и пространственной структуре, а также по строению активного центра, каталитическому механизму, оптимальным условиям проявления каталитической активности. Для многих представителей семейства С1 проведен рентгеноструктурный анализ, на основании которого и данных по субстратной специфичности с использованием набора синтетических пептидов сформировано представление о строении зоны связывания. Эта довольно протяженная область, насчитывающая до 7 подцентров (S1-S4 и Si'-S3'). Общим для семейства является предпочтение в Pi-положении субстратов остатков Arg, Lys, а также Gin и Leu. Определяющим для специфичности цистеиновых пептидаз семейства папаина считается аминокислотный остаток в положении Р2, причем наилучшим в этой позиции рассматривается гидрофобный ароматический остаток Phe. Недавние исследования по скринингу ферментативной активности цистеиновых пептидаз семейства папаина с использованием комбинаторных пептидных библиотек показали, что, вопреки устоявшемуся мнению, положение Р2 могут занимать и небольшие алифатические аминокислотные остатки, например, Val. Следует отметить, что и более удаленные от расщепляемой связи подцентры связывания также вносят заметный вклад в скорость гидролиза субстратов.
Анализ литературы показывает, что использование комбинаторных пептидных библиотек позволяет провести быстрый скрининг ферментативной активности, но в силу неоднозначности получаемых результатов такой подход не может заменить пока стандартные исследования ферментов с использованием набора субстратов.
В качестве субстратов для тестирования ферментативной активности цистеиновых пептидаз семейства С] описано большое разнообразие модифицированных пептидов. Наиболее широко применяемыми хромогенными субстратами являются п-нитроанилиды пептидов, содержащие в положениях Pi и Р2 от расщепляемой связи остатки Arg и Phe соответственно. Эти соединения обладают умеренной растворимостью, высокой стабильностью в водных смесях, удовлетворительными кинетическими характеристиками, но низкой селективностью, поскольку расщепляются ферментами семейства трипсина. Используемые флуорогенные субстраты цистеиновых пептидаз также неселективны.
Таким образом, основным недостатком использующихся в настоящее время синтетических пептидных субстратов цистеиновых пептидаз является их низкая
51 селективность. Это в значительной степени снижает чувствительность корректного определения активности этой группы ферментов. Серьезной проблемой является также необходимость использования для получения субстратов сложного многостадийного синтеза, что приводит к снижению выхода оптически чистого продукта. В связи с этим разработка новых селективных субстратов для тестирования цистеиновых пептидаз семейства папаина и эффективных (в том числе и ферментативных) методов их синтеза является актуальной проблемой.
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Основной целью данной работы являлся дизайн, синтез и применение новых селективных пептидных субстратов для идентификации и характеристики субстратной специфичности ряда цистеиновых пептидаз семейства С1.
Объектами исследования являлись цистеиновые пептидазы этого семейства различного происхождения: растительные ферменты папаин, бромелаин и фицин, лизосомальные катепсины млекопитающих и человека - катепсины В и Ь, а также цистеиновые пептидазы насекомого - вредителя зерновых запасов ТепеЬпо тоШог (ТшСР).
Выбор этих ферментов из всего многообразия цистеиновых пептидаз семейства С1 был обусловлен их практической и функциональной значимостью в различных протеолитических процессах, что было подробно рассмотрено в обзоре литературы.
Цистеиновые пептидазы растений используются как в научных исследованиях при структурном анализе белков, так и в медицине, фармацевтической, пищевой и косметической промышленности.
Внимание к цистеиновым катепсинам обусловлено ключевой ролыо этих ферментов в лизосомальной деградации белков в норме и при развитии патологических состояний.
Уникальность цистеиновых пептидаз из Т. тоШог состоит в том, что они являются секретируемыми пищеварительными ферментами (у человека и животных цистеиновые пищеварительные пептидазы отсутствуют). Следует отметить, что по сравнению с цистеиновыми пептидазами растений и млекопитающих, цистеиновые пищеварительные пептидазы из насекомых исследованы довольно скупо. Это связано, прежде всего, с их чрезвычайно высокой нестабильностью, что сводит к минимуму все усилия по их выделению и очистке, и, следовательно, характеристике. Между тем, эти ферменты могут иметь весьма большое значение как потенциальные лекарственные средства в лечении целиакии. Это тяжелое аутоиммунное заболевание (диагносцируемое у
2% населения), связанное с нарушением пищеварения из-за стойкой непереносимости запасных белков злаков - проламинов. На сегодняшний день лекарств от целиакии нет: больным предлагается строгое пожизненное исключение из пищи продуктов, содержащих проламины (глютен) из пшеницы, ржи и ячменя. Отдельные пептиды проламинов, вызывающие аутоиммунный ответ у больных целиакией, устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека и большинства известных пептидаз [112]. Исходя из того, что глиадины (главные запасные белки пшеницы) являются основным пищевым
53 субстратом насекомого-вредителя Т. molitor, мы предположили, что способностью гидролизовать токсические пептиды глиадинов могут обладать пищеварительные цистеиновые пептидазы из этого насекомого-вредителя. В связи с этим, одной из целей данной работы являлась идентификация и исследование субстратных свойств цистеиновых пептидаз из Т. molitor.
В работе решались следующие задачи:
1. дизайн и химико-энзиматический синтез селективных пептидных субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1;
2. определение кинетических параметров гидролиза субстратов цистеиновыми пептидазами различного происхождения;
3. анализ селективности субстратов;
4. использование субстратов для идентификации и характеристики цистеиновых пептидаз в составе сложных ферментных смесей на примере пищеварительного комплекса личинок большого мучного хрущака Т. molitor.
2.1. Дизайн субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1
В нашу задачу входило получение пептидных субстратов семейства папаина, которые отвечали бы следующим требованиям:
1. соответствие аминокислотной последовательности субстратов специфичности ферментов;
2. наличие в субстратах таких структурных элементов, которые обеспечивали бы достаточную растворимость целевых соединений и возможность прямого спектрофотометрического или флуориметрического детектирования ферментативной активности.
В соответствии с этим, структура субстратов может быть выражена общей формулой A-Xaa-YaajB, где А = Glp (пироглутамил), Abz (о-аминобензоил); В = pNA (п-нитроанилид), AMC (7-амидо-4-метилкумарин) и AFC (7-амидо-4-трифторметилкумарин); Хаа = Phe, Val; Yaa = Ala, место предполагаемого гидролиза субстратов показано стрелкой.
Поскольку субстрат-связывающая область цистеиновых катепсинов невелика по размерам, предлагаемые субстраты - короткие ди- и трипептиды. Исходя из анализа имеющихся литературных данных по субстратной специфичности исследуемых ферментов, мы предположили, что в подцентре P¡ субстратов может находиться небольшой по размеру аминокислотный остаток аланина (Yaa = Ala). В положении Рг,
54 которое является определяющим для специфичности семейства С1, находятся гидрофобные остатки Хаа = Phe, Val. Введение в это положение остатка Val основано на анализе литературных данных по скринингу пептидных библиотек, согласно которым эффективность гидролиза субстратов, содержащих Val в этом положении, примерно в 2 раза выше, чем с Phe [89, 108]. N-концевая группировка субстратов (А) представлена остатками пироглутаминовой (Glp) и о-аминобензойной кислот (Abz). Остаток пироглутаминовой кислоты, являясь более гидрофильным, чем большинство использующихся защитных групп, введен для обеспечения растворимости субстратов в водно-органических смесях. Группировка Abz является флуорогенным маркером. В качестве С-концевых остатков (В) использованы хромогенная и-нитроанилидная (pNA) и флуорогенные 4-амино-7-метил- и 4-амино-7-трифторметилкумаридные группировки (AMC) и (AFC) соответственно, присутствие которых .обеспечивает удобство и точность контроля ферментативной активности по изменению спектральных и флуоресцентных характеристик субстратов в ходе гидролиза. Таким образом, нами были предложены следующие субстраты:
Glp-Phe-Ala-pNA (I) Glp-Val-Ala-pNA (II) Abz-Phe-Ala-pNA (III) Glp-Phe-Ala-AMC (IV) Glp-Phe-Ala-AFC (V)
Возможность всех предложенных соединений являться субстратами цистеиновых пептидаз семейства С1 была проверена с помощью метода гибкого молекулярного докинга.
Для этого на первом этапе необходимо было провести анализ первичной и пространственной структуры ферментов. Особый интерес представлял анализ локальных изменений в структуре субстрат-связывающей области.
Исследуемые нами ферменты изучены в разной степени. Для папаина и катепсинов В и L известны первичные и пространственные структуры предшественников и зрелых пептидаз. Для бромелаина в базе данных белковых последовательностей UniProt
113] известно две последовательности, Р14518 (определенная секвенированием зрелого белка) и 023799 (определенная на уровне транскрипта), имеющие небольшое различие в области одной из важных для каталитического механизма аминокислот Asn-175. В соответствии с масс-спектрометрическими данными триптического гидролизата препарата коммерческого бромелаина, для -дальнейшего анализа была выбрана
55 последовательность 023799. Для фицина известны только фрагменты аминокислотной последовательности Ы-конца и в районе активного центра.
Сравнение последовательностей цистеиновых пептидаз, изучаемых в работе, приведено на рисунке 23. В районах, включающих аминокислотные остатки активного центра Суз-25,1 Пй-1 59, 01п-19 Азп-175, наблюдается высокая степень гомологии. Следует отметить протяженный пропептид, присущий цистеиновым пептидазам семейства С1. В соответствии с литературными данными, катепсин Ь- (или папаин-) подобные пептидазы имеют более длинный пропептидный участок, в котором присутствуют высококонсервативные мотивы ЕКБНП\Т и СЫРО, в отличие от катепсин В-подобных пептидаз. Следует обратить внимание на участок дополнительной петли, присутствующий в катепсин В-подобных пептидазах и включающий два последовательных остатка гистидина, связывание с которыми С-конца субстрата обуславливает пептидил-дипептидазную активность катепсина В. Из представленного выравнивания видно, что аминокислоты, определяющие специфичность пептидаз в Зг-положении, различны. Для папаина и катепсин Ь-подобных пептидаз это положение занимают гидрофобные аминокислоты, тогда как для бромелаина и катепсина В в нем присутствуют также отрицательно заряженные остатки, что может приводить к связыванию в Бг-положении не только гидрофобных аминокислот субстратов, но и положительно заряженных (табл. 15).
1. Enzyme Nomenclature. Academic Press, San Diego, California, 1992. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/
2. Rawlings N.D., Morton F.R., Kok C.Y., Kong J., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res., 2008, 36, 320-325. http://merops.sanger.ac.uk/
3. Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press, 1998.
4. Hartley B.S. Proteolytic enzymes. Annu. Rev. Biochem., 1960, 29, 45-72.
5. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidases. Biochem. J., 1993, 290, 205-218.
6. Otto H.-H., Schirmeister T. Cysteine proteinases and their inhibitors. Chem. rev., 1997, 97, 133-171.
7. Chang A., Scheer M., Grote A., Schomburg L, Schomburg D. BRENDA, AMENDA and FRENDA the enzyme information system: new content and tools in 2009. Nucleic Acids Res., 2009, 37, 588-592. http://www.brenda-enzvmes.org
8. Schomburg, I., Hofmann, O., Baensch, C., Chang, A., Schomburg, D. Enzyme data and metabolic information: BRENDA, a resource for research in biology, biochemistry, and medicine. Gene Fund. Dis., 2000, 3(4), 109-118. http://www.brenda-enzymes.org
9. Brocklehurst K., Salih E. A re-evaluation of the nomenclature of the cysteine proteinases of Carica papaya and a rational basis for their identification. Biochem J., 1983, 213(2), 559560.
10. Kimmel J.R., Smith E.L. Crystalline papain. I. Preparation, specificity, and activation. J. Biol. Chem., 1954, 207, 515-531.
11. Yamamoto H., Tabata M. Correlation of papain-like enzyme production with laticifer formation in somatic embryos of papaya. Plant Cell Rep. 1989, 8, 251-254.
12. Konno K, Hirayama C, Nakamura M, Tateishi K, Tamura Y, Hattori M, Kohno K. Papain protects papaya trees from herbivorous insects: role of cysteine proteases in latex. Plant J., 2004, 37(3), 370-378.
13. Polaina J., MacCabe A.P. Industrial enzymes: structure, function and applications, ra. 11. GrzonkaZ., Kasprzykowski F., Wiczk W. Cysteine proteinases. Springer, 2007, 181-195
14. Shuren J. Topical Drug Products Containing Papain; Enforcement Action Dates. United States Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services, 2008. http://www.fda.gov/QHRMS/DQCKETS/98fr/FDA-2008-N-0481 -n.pdf
15. Chobotova K., Vernallis A.B., Majid F.A. Bromelain's activity and potential as an anticancer agent: Current evidence and perspectives. Cancer Lett., 2010, 290(2), 148-156.
16. Bethune M.T., Strop P., Tang Y., Sollid L.M., Khosla C. Heterologous expression, purification, refolding, and structural-functional characterization of EP-B2, a self-activating barley cysteine endoprotease. Chem Biol. 2006,13(6), 637-47.
17. Barrett A.J., Kirschke H. Cathepsin B, Cathepsin H, and cathepsin L. Methods Enzymol., 1981,80, 535-561.
18. Bohley P., Seglen P.O. Proteases and proteolysis in the lysosome. Cellular and Molecular Life Sciences, 1992, 48(2), 151-157.
19. Lecaille F., Kaleta J., Bromme D. Human and parasitic papain-like cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent developments in inhibitor design. Chem Rev., 2002,102(12), 4459-4488.
20. Palermo C., Joyce J.A. Cysteine cathepsin proteases as pharmacological targets in cancer. Trends in Pharmacological Sciences, 2008, 29(1), 22-28.
21. Rengel Y., Ospelt C., Gay S. Proteinases in the joint: clinical relevance of proteinases in joint destruction. Arthritis Res Ther., 2007, 9(5), 221-231.
22. Biihling F., Waldburg N., Reisenauer A., Heimburg A., Golpon H., Welte T. Lysosomal cysteine proteases in the lung: role in protein processing and immunoregulation. Eur Respir J., 2004, 23(4), 620-628.
23. Vasiljeva O., Reinheckel Т., Peters C., Turk D., Turk V., Turk B. Emerging roles of cysteine cathepsins in disease and their potential as drug targets. Curr Pharm Des., 2007, 13(4), 387-403.
24. Dickinson D.P. Cysteine peptidases of mammals: their biological roles and potential effects in the oral cavity and other tissues in health and disease. Crit Rev Oral Biol Med., 2002, 13(3), 238-275.
25. Rosenthal P.J., Kim K., McKerrow J.H., Leech J.H. Identification of three stage-specific proteinases of Plasmodium falciparum. J Exp Med., 1987, 166(3), 816-821.
26. Sabnis Y.A., Desai P.V., Rosenthal P.J., Avery M.A. Probing the structure of falcipain-3, a cysteine protease from Plasmodium falciparum: Comparative protein modeling and docking studies. Protein Science, 2003,12(3), 501-509
27. Руденская Г.Н., Пупов Д.В. Цистеиновые протеиназы микроорганизмов и вирусов. Биохимия, 2008, 73(1), 3-17.
28. Sajid М., McKerrow J.H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol., 2002,120(1), 1-21.
29. Yasuhara Т., Takai Т., Yuuki Т., Okudaira H., Okumura Y. Biologically active recombinant forms of a major house dust mite group 1 allergen Der f 1 with full activities of both cysteine protease and IgE binding. Clin Exp Allergy., 2001, 31(1), 116-124.
30. Shakib F., Ghaemmaghami A.M., Sewell H.F. The molecular basis of allergenicity. Trends Immunol., 2008, 29(12), 633-642.
31. Terra W.R., Ferreira C. Insect digestive enzymes: properties, compartmentalization and function. Comparative Biochemistry and Physiology, 1994,109B, 1-62.
32. Wieman K.F., Nielsen S.S. Isolation and partial characterization of a major gut proteinase from larval Acanthoscelides obtectus Say (Coleoptera: Bruchidae). Comp. Biochem. Physiol., 1988, 89B, 419-426.
33. Wiederanders B. Structure-function relationships in class CA1 cysteine peptidase propeptides. Acta Biochim Pol., 2003, 50(3), 691-713.
34. Rowan A.D., Mason P., Mach L., Mort J.S. Rat procathepsin B. Proteolytic processing to the mature form in vitro. J. Biol. Chem., 1992, 267(22), 15993-15999.
35. Guay J., Falgueyret J.P., Ducret A., Percival M.D., Mancini J.A. Potency and selectivity of inhibition of cathepsin K, L and S by their respective propeptides. Eur J Biochem., 2000, 267(20), 6311-6318.
36. Cygler M., Sivaraman J., Grochulski P., Coulombe R., Storer A.C., Mort J.S. Structure of rat procathepsin B: model for inhibition of cysteine protease activity by the proregion. Structure, 1996, 4, 405-416
37. Coulombe R., Grochulski P., Sivaraman J., Cygler M. Structure of human procathepsin L reveals the molecular basis of inhibition by the prosegment. EMBO J., 1996, 15(20): 54925503.
38. Nagler D.K., Sulea T., Menard R. Full-length cDNA of human cathepsin F predicts the presence of a cystatin domain at the N-terminus of the cysteine protease zymogen. Biochem Biophys Res Commun., 1999, 257(2), 313-318.
39. Drenth J. , Jansonius J. N., Koekoek R., Swen H.M., Wolthers B. G. Structure of Papain. Nature, 1968,218, 929-932.
40. Kamphuis I.G., Kalk K.H., Swarte M.B., Drenth J. Structure of papain refined at 1.65 A resolution. JMol Biol., 1984,179(2), 233-256. .
41. McGrath M.E. The lysosomal cysteine proteases. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1999, 28, 181-204.
42. Storer A.C., Menard R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol., 1994, 244, 486-500.
43. Shokhen M., Khazanov N., Albeck A. Challenging a paradigm: theoretical calculations of the protonation state of the Cys25-Hisl59 catalytic diad in free papain. Proteins, 2009, 77(4), 916-926.
44. Polgar L., Halasz P. Current problems in mechanistic studies of serine and cysteine proteinases. Biochem J., 1982, 207(1), 1-10.
45. Ma S., Devi-Kesavan L.S., Gao J. Molecular dynamics simulations of the catalytic pathway of a cysteine protease: a combined QM/MM study of human cathepsin K. J Am Chem Soc., 2007,129(44), 13633-13645.
46. Murray D.R. The activation of papain by cyanide and other substances. I. Biochem J., 1933, 27(2), 543-556.
47. Werner G.J. The Activation of Papain and Related Plant Enzymes with Sodium Thiosulfate. Archives of biochemistry, 1945, 8(3), 385-393.
48. Purr A. The activation phenomena of papain and cathepsin. Biochem J., 1935, 29(1), 1320.
49. Aoyagi T., Takeuchi T., Matsuzaki A., Kawamura K., Kondo S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. JAntibiot (Tokyo), 1969, 22(6), 283-286.
50. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun., 1967, 27(2), 157-162.
51. Turk D., Guncar G., Podobnik M., Turk B. Revised definition of substrate binding sites of papain-like cysteine proteases. Biol Chem., 1998, 379(2), 137-147.
52. Bromme D., Bonneau P.R., Lachance P., Storer A.C. Engineering the S2 Subsite Specificity of Human Cathepsin S to a Cathepsin L- and Cathepsin B-like Specificity. The Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(48), 30238-30242.
53. Гершкович A.A., Кибирев B.K. Хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты протеолитических ферментов. Биоорг. Химия, 1988,14(11), 1461-1488.
54. Lottenberg R., Christensen U., Jackson C.M., Coleman P.L. Assay of coagulation proteases using peptide chromogenic and fluorogenic substrates. Methods Enzymol. 1981, 80C, 341-361
55. Smith R.E. Contributions of histochemistry to the development of the proteolytic enzyme detection system in diagnostic medicine. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1983,31(1A), 199-219.
56. Smith R.E., Bissel E.R., Mitchell A.R., Pearson K.W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis research, 1980,17(314), 393-402.
57. Tchoupe J.R., Moreau Т., Gauthier F., Bieth J.G. Photometric or fluorometric assay of cathepsin B, L and H and papain using substrates with an aminotrifluoromethylcoumarin leaving group. Biochem. Et Biophys. Acta, 1991,1076, 149-151.
58. Kamboj R.C., Pal S., Raghav N., Singh H. A selective colorimetric assay for cathepsin L using Z-Phe-Arg-4-methoxy-beta-naphthy 1 amide. Biochimie, 1993, 75(10), 873-878.
59. Ohlsson B.G., Westrom B.R., Karlsson B.W. Enzymoblotting: a method for localizing proteinases and their zymogens using para-nitroanilide substrates after agarose gel electrophoresis and transfer to nitrocellulose. Anal Biochem., 1986,152(2), 239-244.
60. Fareed J., Messmore H.L., Walenga J.M., Bermes E.W. Jr. Diagnostic efficacy of newer synthetic-substrates methods for assessing coagulation variables: a critical overview. Clin Chem., 1983, 29(2), 225-236.
61. Weder J.K.P., Kaiser K.-P. Fluorogenic substrates for hydrolase detection following electroforesis. Journal of Chromatography A, 1995,698, 181-211.
62. Smith R.E. Identification of protease isozymes after analytical isoelectric focusing using fluorogenic substrates impregnated into cellulose membranes. J Histochem Cytochem., 1984, 32(12), 1265-1274.
63. Sinha P., Gossrau R. Investigation of proteases with chromogenic substrates after isoelectric focusing (IEF). Histochemistry, 1984, 81, 161-165.
64. Sato E., Matsuhisa A., Sakashita M., Kanauka Y. New water-soluble fluorogenic amine. 7-Aminocoumarin-4-methanesulfonic acid (ACMS) and related substrates for proteinases. Chem. Pharm. Bull., 1988, 36(9), 3496-3502.
65. Sato E., Matsuda K., Kanaoka Y. New fluorogenic substrates for microdetermination of cathepsin C. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 1990, 38(7), 2043-2044.
66. Harris J.L., Backes B.J., Leonetti F., Mahrus S., Ellman J.A., Craik C.S. Rapid and general profiling of protease specificity by using combinatorial fluorogenic substrate libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(14), 7754-7759.
67. Филлипова И.Ю., Лысогорская E.H., Оксенойт E.C., Комаров Ю.Е., Степанов В.М. Флуоресцентные субстраты аспартатных протеиназ с внутренним тушением флуоресценции. Биоорг. Химия, 1986,12(9) 1172-1180.
68. Lecaille F., Authie Е., Moreau Т., Serveau С., Gauthier F., Lalmanach G. Subsite specificity of trypanosomal cathepsin L-like cysteine proteases. Probing the S2 pocket with phenylalanine-derived amino acids. Eur. J. Biochem., 2001, 268, 2733-2741.
69. Garcia-Echeverria C.s Rich D.H. Effect of P2' substituents on kinetic constants for hydrolysis by cysteine proteinases. Biochem. and Biophys. Res. Com., 1992,187(2), 615-619.
70. Lecaille F., Serveau C., Gauthier F., Lalmanach G. Revisiting the S2 specifity of pa-pain by structural analogs of Phe. FEBS Letters, 1999, 445, 311-314.
71. Gray C.J., Boukouvalas J., Szawelski R.J., Wharton C.W. Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases. Biochem J., 1984, 219(1), 325-328.
72. Gray C.J., Sullivan J.M. Synthesis of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) derivatives and their hydrolysis by plant cysteine proteinases. J. Chem. Tech. Biotechnol., 1989, 46, 11-26.
73. Filippova I.Y., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine-p-nitroanilide a chromogenic substrate for thiol proteinase assay .Anal. Biochem., 1984,143(2), 293-297.
74. Vinokurov K.S., Oppert В., Elpidina E.N. An overlay technique for postelectrophoretic analysis of proteinase spectra in complex mixtures using p-nitroanilide substrates. Anal. Biochem., 2005, 337, 164-166.
75. Taralp A., Kaplan H., Sytwu I.I., Vlattas I., Bohacek R., Knap A.K., Hirama Т., Huber C.P., Hasnain S. Characterization of the S3 subsite specificity of cathepsin B. J Biol Chem., 1995, 270(30), 18036-18043.
76. Alves L.C., Almedia P.C., Franzoni L., Juliano L., Juliano M.A. Synthesis of Na-protected aminoacyl 7-amino-4-methyl-coumarin amide by phosphorous oxycloride and preparation of specific fluorogenic substrates for papain. Pept. Res., 1996, 9(2), 92-96.
77. Fukal L., Kasafirek E. Sensitive assay of cysteine proteinases using new peptide p-nitroanalides. Biotechnol. Appl. Biochem., 1988,10, 473-475.
78. Serveau C., Juliano L., Bernard P., Moreau Т., Mayer R., Gauthier F. New substrates of papain, based on the conserved sequence of natural inhibitors of the cystatin family. Biochimie, 1994, 76(2), 153-158.
79. Gosalia D.N., Salisbury C.M., Ellman J.A., Diamond S.L. High Throughput Substrate Specificity Profiling of Serine and Cysteine Proteases Using Solution-phase Fluorogenie Peptide Microarrays. Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4, 626-636.
80. Puzer L., Cotrin S.S., Alves M.F., Egborge Т., Araujo M.S., Juliano M.A., Juliano L., Bromme D., Carmona A.K. Comparative substrate specificity analysis of recombinant human cathepsin V and cathepsin L. Arch Biochem Biophys., 2004, 430(2), 274-283.
81. Piper J.L., Gray G.M., Khosla C. Effect of prolyl endopeptidase on digestive-resistant gliadin peptides in vivo. J Pharmacol Exp Ther., 2004, 311(1), 213-219.
82. The UniProt Consortium. The Universal Protein Resource (UniProt) in 2010. Nucleic Acids Res., 2010, 38, 142-148. http://www.uniprot.org
83. Schwede Т., Kopp J., Guex N., and Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res., 2003,31, 3381-3385. http://swissmodel.expasy.org/workspace
84. Stewart F.H.C. A sintetic approach to peptides of o- and /?-aminobenzoic acids. Aust. J. Chem., 1983,36(8), 1629-1638.
85. Гершкович А. А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. Наумова Думка, Киев, 1992.
86. Noda К., Oda М., Sato М., Yoshida N. A facile method for preparation of t-bulyloxycarbonylamino acid p-nitroanilides. Int. J. Peptide Protein Res., 1990, 36, 197-200.
87. Rowan A.D., Mason P., Mach L., Mort J.S. Rat procathepsin B. Proteolytic processing to the mature form in vitro. J. Biol. Chem., 1992, 267, 15993-15999.
88. Соловьева T.A., Беляев C.B., Степанов B.M. Очистка пепсина ионообменной хроматографией на аминосилохроме. Химия природ, соед., 1977, 3, 398-403.
89. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. Мир, Москва, 1976.
90. Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н., Филиппова И.Ю., Маркарян А.Н., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. Биоорган, химия, 1987,13, 748-753.
91. Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул. Биотехнология, 1995,1(2), 32-37.
92. Nicholas К.В., Nicholas Н.В. Jr., and Deerfield D.W. II. GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation. EMBNEW. NEWS, 1997, 4, 14 http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/
93. Bendtsen J.D., Nielson H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol, 2004,340, 783-795. http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
94. Dolinsky T.J., Czodrowski P., Li H., Nielsen J.E., Jensen J.IL, Klebe G., Baker N.A. PDB2PQR: Expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations. Nucleic Acids Res, 2007, 35, 522-525.
95. Baker N.A., Sept D., Joseph S., Hoist M.J., McCammon J.A. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 10037-10041. http://www.poissonboltzmann.org,
96. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics, 1996,14, 33-38.131. http://vvww.pymol.org/
97. Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул. Биотехнология. 1995,1(2), 32-37.
98. Аникина O.M., Семашко T.A., Оксенойт E.C., Лысогорская Е.Н., Филиппова И.Ю. Субтилизин Карлсберг, нативный и модифицированный, эффективный катализатор синтеза пептидной связи в органической среде. Биоорганическая химия, 2006, 32(2),
99. Frugoni J.A.C. Tampone universale di Britton e Robinson a forza ionica constant. Gazz. Chem. Ital., 1957, 87,403-407.
100. McLellan T. Electrophoresis buffers for Polyacrylamide gels at various pH. Anal. Biochem., 1982,126, 94-99.
101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly at the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685.116.121.
