Обнаружение и структурно-функциональная характеристика пролин- и глутаминспецифичных пептидаз из Tenebrio molitor тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Гоптарь Ирина Александровна обнаружение и структурно-функциональная характеристика

пролин- и глутаминспедифичных пепТидаз ш ТепеЬпо тойш

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

хуг-

Москва 200'8

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в отделе функциональной бжвдмщг биополимеров Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им, М.В. Ломоносова.

Научные руководители: Кандидат биологических наук

Элпидииа Елена Николаевна

Доктор химических наук Филиппова Ирина Юрьевна

Официальные оцпоненты: Доктор химических наук

Ротанова Татьяна Васильевна

Доктор биологических наук, профессор Валуева Татьяна Александровна

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский

институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится 20 мая 2008 года в 16.00 на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском университете им. М. В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 18 апреля 2008 года.

Ученый сежретарь Совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пролинспецифичные лептидазы (proline specific peptidases, PSP) представляют собой сравнительно небольшую группу высокоспецифичных экзо- и эндопептидаз, расщепляющих в белках и пептидах связи, образованные остатком пролина. Уникальность действия PSP обусловлена структурными особенностями пролина -единственной циклической иминокислоты среди 20 а-аминокислот, из которых построены белки и пептиды. Под действием других пептидаз, даже с очень широкой специфичностью, пептидные связи, образованные остатком пролина, практически не расщепляются. К настоящему времени накоплено достаточно информации о том, что остаток пролина в пептидной цепи может выполнять функции своеобразного регуляторного сигнала защиты пептидов от деградации ферментами с широкой специфичностью. Таким образом, PSP, участвующие в расщеплении пролинсодержащих белков и пептидов, оказываются вовлеченными в регуляцию различных метаболических процессов. Предполагается, что PSP участвуют в дифференциации и созревании клеток, секреции и процессинге белков, катаболических процессах, иммунном ответе. В связи с этим изучение PSP представляет несомненный научный интерес с точки зрения понимания фундаментальных процессов протеолиза и структурных основ регуляции метаболической стабильности биологически активных соединений. Практический интерес к PSP обусловлен их возможным использованием в научных исследованиях как инструментов структурного анализа белков и ферментативного пептидного синтеза. Особое значение имеет изучение PSP в медицинских целях, поскольку известно, что активность этих ферментов меняется при таких заболеваниях как диабет, рак, болезни Альцгеймера и Паркинсона, гипертония, нейропсихические заболевания. PSP заслуживают пристального внимания и как потенциальное лекарство против целиакии, аутоиммунного заболевания, связанного с нарушением пищеварения из-за неспособности человеческих пищеварительных пептидаз полностью гидролизовать богатые пролином белки.

Несмотря на громадный интерес к уникальным по своему действию PSP, на сегодняшний день подробно изучены свойства только ограниченного числа PSP, главным образом из млекопитающих, а сведения о функциональной роли этих ферментов носят противоречивый и неоднозначный характер. Таким образом, исследования, направленные на обнаружение PSP из различных источников и изучение их структурно-функциональных особенностей, весьма актуальны.

Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлся поиск и изучение PSP насекомого - личинок большого мучного хрущака Tenebrio molitor. Большой мучной хрущак является вредителем зерновых запасов, в состав диеты которого входят,

богатые пролином глиадины, являющиеся главными запасными белками семян пшеницы. Было логично предположить наличие PSP в спектре пищеварительных ферментов T. molitor. Однако на настоящий момент такие ферменты не были выявлены в пищеварительном комплексе насекомых, в том числе и у Т. molitor. Большой интерес представлял также поиск пептидаз Т. molitor, способных гидролизовать пептидные связи, образованные остатком глутамина, содержание которого в глиадинах достигает 30 - 50%.

В работе решались следующие задачи: (1) поиск и идентификация пролин- и глутаминспецифичных пептидаз; (2) очистка выявленных ферментов; (3) характеристика их физико-химических, энзиматических и функциональных свойств; (4) сравнительный анализ действия выделенных ферментов на глиадины.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые выделен и охарактеризован весь комплекс PSP из кишечника насекомого, включающий дипептидилпептидазу (DPP) IV, пролилкарбоксипептидазу (PCP), пролидазу и пролилолигопептидазу (POP). Обнаружено, что DPP IV и PCP находятся в содержимом кишечника, a POP и пролидаза локализованы внутри тканей кишечника. DPP IV, PCP и, вероятно, пролидаза являются пищеварительными ферментами, a POP - внутритканевым ферментом, не участвующим в пищеварении. PCP впервые обнаружена в спектре пищеварительных ферментов животных. Проведены выделение, очистка и детальное изучение физико-химических и энзиматических свойств этого фермента. Определены кинетические параметры гидролиза субстратов разной длины высокоочищенной PCP. Установлена первичная структура PCP из T. molitor.

Впервые обнаружено, что именно цистеиновые пептидазы из кишечника личинок Т. molitor гидролизуют пептидные связи по карбонильной группе глутамина.

Показано действие выявленных пролин- и глутаминспецифичных ферментов на глиадины. Предложена гипотетическая схема гидролиза глиадинов, в том числе и пептидов, устойчивых к действию пищеварительных ферментов человека и вызывающих целиакию у чувствительных людей.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы были представлены на 30-м конгрессе Федерации европейских биохимических обществ и 9-ой конференции Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (Будапешт, Венгрия, 2005), Международной конференцией по ингибиторам протеаз в рамках 4-го заседания Международного общества протеолиза (Квебек, Канада, 2005), 3-ей международной научно-практической школе-конференции МЕДБИОТЕК-2006 «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» (Москва, 2006), Международной конференции студентов и аспирантов

«Ломоносов» (Москва, 2007), VI симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2007), Международном конгрессе по использованию насекомых в биотехнологии и промышленности (Дегу, Корея, 2007).

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного пролинспецифичным пептидазам, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (266 ссылок). Диссертация изложена на 156 страницах и содержит 58 рисунков и 30 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выявление и общая характеристика РвР из Т. тоШог

1.1. Выявление РБР

На первом этапе работы на основе анализа литературных данных о субстратной специфичности известных РвР был проведен дизайн пептидных субстратов, необходимых для выявления всего пищеварительного комплекса РБР Т. тоШог. Использованные в работе субстраты, синтезированные в лаборатории химии белка Химического факультета МГУ, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Использованные в работе пептидные субстраты РЭР.

Субстрат РвР

2-А1а-Рго-рЫА* Пролилэндопептидаза (РЕР), Пролилолигопепгидаза (РОР)

А1а-Рго-рКА* Дипептидилпептидазы фРР) II и IV

Рго-рКА* Пролилиминопептидаза (Р1Р)

РЬе-Рго** Пролидаза

Рго-РИе** Иролиназа

Х-Рю-РЫ** Пролилкарбоксипептидаза (РСР) Карбоксипептидаза Р (СРР)

РЬе-Рго-Рго-ОМе** Аминопептидаза Р (АРР)

*Хромогенные субстраты.

**Пептидные субстраты, активность по которым определяли с помощью нингидрина.

Тестирование пролинспецифичной активности проводили на экстрактах содержимого передней (атйепот тевейего», АМ) и задней (рс^епот тевейетоп, РМ) частей средней кишки личинок большого мучного хрущака Т. тоШог при рН 5,6 и 7,9, соответствующих физиологическим значениям рН в содержимом АМ и РМ соответственно. Для разделения ферментов использовали гель-фильтрацию на сефадексе в-150 (рис.1).

250

—APpNA, pH 5,6 —APpNA, pH 7,9 -•-LpNA, pH 7,9 -—A280

150 200 250 300 350 400 450 объем элюции, мл

В

15 т-г 1

"PpNA, pH 5,6 -PpNA, pH 7,9 -ZAPpNA, рН5,6 .-ZAPpNA, рН 7,9 -А280

150 200 250 300 350 400 450 объем элюции, мл

д

150 200 250 300 350 400 450 объем элюции, мл

250

200

150

100

о ................. ! о

150 200 250 300 350 400 450 объем элюции, мл

Г

15 т-г 1

150 200 250 300 350 400 450 объем элюции, мл

-°-PF рН 5,6 -*-PF рН 7,9 ч-ZPF рН 5,6 -«-ZPF рН 7,9

FP рН 5,6 -*-FP рН 7,9 -«-FPP(OMe), рН 5,6 -^-FPP(OMe), рН 7,9 -♦-А280

150 200 250 300 350 400 450 объем элюции, мл

Рис. 1. Фракционирование экстрактов из AM (А, В, Д) и РМ (Б, Г, Е) на колонке с сефадексом G-150.

На профилях как в АМ, так и в РМ, были обнаружены активности 4-х новых пептидаз: Рер1, Рер2, РерЗ и Рер4. Фракции, содержащие соответствующую активность, были собраны и использованы для исследований. Следует отметить, что при тестировании РЭР также наблюдалась активность по субстрату Рго-рЫА, однако профиль активности по этому субстрату сходен с профилем активности по Ьеи-рЫА, что свидетельствует о принадлежности активности по Рго-рЫА уже известной аминопептидазе N. Активность по специфическим субстратам пролидазы и АРР - Рго-РЬе и РЬе-Рго-Рго-ОМе - в препаратах практически отсутствовала.

1.2. Характеристика выявленных РЗР 1.2.1. Пептидаза РерI

Пептидаза Рер 1 проявляла активность по субстрату А1а-Рго-рЫА. Молекулярная масса фермента как из АМ, так и из РМ, определенная по данным гель-фильтрации, равна 170 кДа. рН-Оптимум Рер1 соответствовал рН 7,9, пептидаза стабильна на участке рН 5,0 - 7,2 прп инкубации в течение 2 ч при 37°С. Тестирование активности образцов Рер 1 из АМ и РМ, проведенное после электрофоретического разделения в нативных условиях, выявило наличие одной одинаково движущейся полосы в обоих препаратах (рис. 2). Белки, обладающие активностью по субстрату А1а-Рго-р1ЧА, двигались к аноду при рН 7,2.

Рер1 РерЗ Рер4

АМ РМ АМ РМ АМ РМ АМ РМ АМ РМ АМ РМ

+ - + - +

Рис. 2. Постэлектрофоретическое тестирование активности пептидаз Рер1 (субстрат А1а-Рго-рЫА, рН 7,9), РерЗ (субстрат 2-А1а-А1а-Рго-рЫА,рН 7,9, 3 мМ БТТ) и Рер4 (субстрат г-А1а-А1а-Рго-рЫА, рН 5,6).

Ингибиторный анализ препаратов показал, что активность Рер1 из АМ и РМ подавляется ингибиторами сериновых пептидаз диизопропилфторфосфатом (БРР) и фенилметилсульфонилфторидом (РМБР) (табл. 2). Ингибиторы других подподклассов пептидаз - цистеиновых, аспартильных и металлопептидаз (Стране-эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино)бутан (Е-64), пепстатин и БОТА), не оказывали существенного влияния на активность ферментов. Специфические ингибиторы пролилолигопептидаз (Х-Тго-

проликаль) и аминопептидаз (бестатин) также мало влияли на активность Pepl. Однако HgCl2 существенно ингибировал ферменты, а активатор SH-зависимых ферментов DTT повышал активность ферментов на 10-20%.

Таким образом, свойства пептидазы Pepl полностью коррелируют со свойствами DPP IV (КФ. 3.4.14.5).

Таблица 2. Влияние ингибиторов и активаторов на активность выявленных PSP*.

Реагент Концентрация, М Остаточная активность, %

Pepl Pep2 РерЗ** Pe p4

AM PM AM PM AM PM AM PM

Контроль 100 100 100 100 17 24 100 100

EDTA 10" 102 99 27 34 114 102 115 91

10-J 104 101 38 42 106 107 119 86

10"4 107 105 68 75 103 103 118 86

DFP 10" 4 13 103 102 14 13 25 15

10-J 25 35 98 96 22 24 37 29

Ю-4 77 90 97 106 27 33 45 54

PMSF 10" 21 19 - - - - -

10"3 61 70 - - - - - -

Ю-4 99 93 - - - - - -

Пепстатин 10"4 97 93 97 97 105 94 90 81

10° 94 101 96 99 95 76 94 90

Ю"6 97 99 92 103 86 67 101 85

Е-64 10"4 92 99 101 106 76 67 109 113

10° 101 97 99 108 78 78 102 108

10"° 104 103 101 100 73 83 100 111

Z-Рго-пролиналь 10-J 60 67 - - - - 6 8

10"4 88 81 - - - - 12 17

lO"5 95 87 - - 5 ,_ 4 27 28

lO"6 - - - - 9 8 47 35

10" - - - - 34 32 59 55

Бестатин 10-J 99 97 98 96 - - - -

10"4 96 84 101 105 - - - -

10-5 97 88 101 103 - - - -

HgCfe 10'J 4 8 8 7 0 0 95 89

10-4 5 13 15 12 0 0 99 101

Z-Pro 10"' - - 15 18 - - - -

10"4 - - 27 29 - - - -

10"5 - - 38 35 - - - -

DTT 3*10"J 122 113 61 53 100 100 102 102

3*10-" 118 113 82 88 109 101 96 103

*Активность Рер1 определяли по субстрату А1а-Рго-рКА при рН 7,9; активность Рер2 - по субстрату РЬе-Рго при рН 7,9; активность РерЗ - по субстрату 2-А1а-А1а-Рго-рНА при рН 7,9 в присутствии 3 мМ БТТ и активность Рер4 - по субстрату 2-А1а-А1а-Рго-рЫА при рН 5,6. **Для пептидазы РерЗ за 100% принята активность в присутствии 3 мМ ОТТ. ***Прочерк означает, что при данной концентрации ингибитора измерения не проводились.

1.2.2. Пептидаза Рер2

Пептидаза Рер2 проявляла активность по субстрату РИе-Рго. Молекулярная масса Рер2 из АМ и РМ равна 110 кДа.

Исследуемый фермент является металлопептидазой: его активность подавлялась в присутствии ЕБТА, а ингибиторы других подподклассов пептидаз не оказывали влияния на активность (табл. 2). Специфический ингибитор пролидаз ¿-Рго сильно снижал активность фермента. Это однозначно свидетельствует о принадлежности Рер2 к пролидазам и подтверждается данными о рН-оптимуме фермента, соответствующем рН 7,5, как и у большинства описанных в литературе пролидаз (КФ. 3.4.13.9).

1.2.3. Пептидаза РерЗ

Пептидаза РерЗ проявляла активность по субстрату г-АЬ-Рго-рИА. Молекулярная масса фермента - 63 кДа. рН-Оптимум РерЗ равен 7,9. Пептидаза РерЗ стабильна при рН от 5,5 до 7,9 при инкубации в течение 2 ч при 37°С. Постэлектрофоретическое тестирование активности образцов РерЗ из АМ и РМ выявило наличие одной одинаково движущейся полосы в обоих препаратах (рис. 2). Белки, обладающие активностью по субстрату 2-А1а-А1а-Рго-рЫА, двигались к аноду при рН 7,2.

Пептидазу РерЗ можно отнести к сериновым пептидазам, поскольку ее активность ингибировалась в присутствии БРР и на нее почти не влияли ЕРТА, пепстатин и Е-64 (табл. 2). В то же время, ЩСЬ полностью подавлял активность пептидазы, а в присутствии 3 мМ БТТ активность РерЗ возрастала в 5 раз по сравнению с контролем. Полученные данные позволяют предположить, что РерЗ является 8Н-зависимой сериновой пептидазой. Это свойство характерно для многих представителей семейства РОР благодаря наличию остатка цистеина вблизи субстратсвязывающего центра фермента. Специфический ингибитор РОР 1-Рю-пролиналь полностью подавлял активность фермента. Таким образом, на основании изученных свойств фермент можно отнести к РОР (КФ 3.4.21.26).

1.2.4. Пептидаза Рер4

Пептидаза Рер4 обладала активностью по субстратам 2-А1а-Рго-рЫА и г-Рго-Р1ге. Молекулярная масса фермента - 105 кДа. рН-Оптимум Рер4 соответствовал 5,6. Фермент стабилен при рН 4,0-8,4 при инкубации в течение 2 ч при 37 °С.

Постэлектрофоретическое тестирование активности Рер4 по субстрату 2-А1а-А1а-Рго-рЭДА при рН 5,6 выявило по одной полосе в препаратах из АМ и РМ, движущихся при рН 7,2 к аноду с одинаковой скоростью (рис. 2).

Ингибиторный анализ полученных препаратов свидетельствует о принадлежности Рер4 к сериновым пептидазам (табл. 2). Ни ЕБТА, ни пепстатин, ни Е-64, ни ВТТ, ни ^С12

не оказывали сильного влияния на активность Рер4 из AM и РМ. В то же время DFP значительно ингибировал активность фермента. Специфический ингибитор POP Z-Pro-пролиналь подавлял активность Рер4 только в значительных концентрациях, что не позволяет классифицировать данную пептидазу как POP.

Исходя из изученных физико-химических и энзиматических свойств, невозможно отнесение Рер4 к какому-либо семейству PSP. Для точной идентификации найденный фермент был очищен и проведено его подробное исследование.

1.3. Изучение пептидазы Рер4

Пептидазу Рер4 выделяли из AM, поскольку, как было показано, именно там преимущественно локализована искомая пептидаза. Для очистки пептидазы Рер4 была разработана 3-х стадийная схема (рис. 3 и табл. 3). На первой стадии была проведена гель-фильтрация на сефадексе G-100. Это позволило эффективно удалить сериновые и цистеиновые эндопептидазы, молекулярная масса которых не превышает 40 кДа, и привело к снижению протеолиза под действием этих ферментов в процессе очистки. На второй стадии применяли хроматографию на MonoQ, а на заключительном этапе - хроматографию на фенилсефарозе в режиме FPLC. В результате был получен препарат пептидазы Рер4 с выходом 12,5% и степенью очистки 1200 раз.

Таблица 3. Очистка пептидазы Рер4*.

Стадия очистки Содержание белка, мг Активность, нмоль/мин Удельная активность, нмоль/мин*мг Степень очистки Выход, %

Экстракт 192 120 0,625 1 100

Сефадекс G-100 8 81 10,13 16 67,5

MonoQ 0,32 32 100 160 26,7

Фенщгсефароза 0,02 15 750 1200 12,5

* Активность фермента измеряли по субстрату Z-Ala-Ala-Pro-pNA, рН 5,6.

Электрофоретическое изучение полученного препарата (рис. 3,Г) показало наличие одной преобладающей белковой полосы, электрофоретическая подвижность которой совпадала с подвижностью фермента, проявляющего активность по субстрату 2-А1а-А1а-Рго-рИА при рН 5,6 (рис. 3,Г, дорожка 2).

— Z-Ala-Ala-Pro-pNA

Z-Ala-Ala-Pro-pNA

250 350 450 объем элюции, мл

20 30 40 50 номер фракции

►-Z-Ala-Ala-Pro-pNA - содержание (NH4)2S04 А280

ШШ

0,01

0,00

10 20 номер фракции

Рис. 3. Очистка пептидазы Рер4. Хроматография Рер4 на сефадексе G-100 (A), MonoQ (Б) и фенилсефарозе (В). Электрофорез препарата пептидазы Рер4 после трех стадий очистки (Г): 1 - окраска белковых зон с помощью кумасеи G-250; 2 - постэлектрофоретическое определение активности по субстрату Z-Ala-Ala-Pro-pNA, рН 5,6.

Для идентификации пептидазы Рер4 было проведено масс-спектрометрическое исследование триптического гидролизата белковой полосы пептидазы Рер4, вырезанной из геля. С использованием MS/MS анализа были получены предположительные последовательности нескольких пептидов, входящих в состав исследуемой пептидазы Рер4. С помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) был проведен поиск гена, который бы содержал искомые или близкие последовательности в своей структуре, в полностью отсеквенированном геноме родственного организма - малого мучного хрущака Tribolium castaneum. В результате была найдена аминокислотная последовательность белка, включающая последовательности двух пептидов пептидазы Рер4. Эта последовательность в геноме Т. castaneum была аннотирована как «предположительный предшественник PCP» (КФ 3.4.16.2).

На следующем этапе работы была получена последовательность кДНК PCP уже из исследуемого организма - T. molitor. Вначале с использованием вырожденных праймеров прямого и обратного направления, соответствующих наиболее консервативным участкам

последовательности PCP, методами 3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), используя синтезированную кДНК, были получены последовательности 3'- и 5'- концов кДНК PCP. Затем с помощью 3'- и 5'-концевых праймеров была проведена амплификация полноразмерной кДНК искомой пептидазы, которая была клонирована. В результате были получены последовательности кДНК и кодируемого ею белка пептидазы Рер4, которые зарегистрированы в базе данных GenBank под номером EU311730.

Исходя из этой последовательности, был проведен повторный анализ масс-спектров трилтических пептидов пептидазы Рер4. Было идентифицировано 8 пептидов, совпадающих с предполагаемыми пептидами из клонированной последовательности (рис. 4). Это позволяет утверждать о том, что найденная последовательность принадлежит пептидазе Рер4. В правой части масс-спектра Рер4 остались неаннотированными 3 фрагмента с массами 2239,1, 2385,1 и 2734,3 Да. MS/MS анализ этих пептидов показал, что они очень похожи. Вероятно, в данном случае имеет место посттрансляционная модификация белковой цепи этих пептидов, характерная для PCP.

Расчетная молекулярная масса пептидной цепи зрелого фермента равна 55137 Да, а определенная по данным гель-фильтрации - 105 кДа, что говорит о вероятном существовании фермента в виде димера.

Рис. 4. Анализ MALDI масс-спектра триптического

гидролизата препарата Рер4 с использованием расшифрованной аминокислотной последовательности PCP.

Проведено выравнивание полученной аминокислотной последовательности пептидазы Рер4 с последовательностями PCP из различных организмов: насекомых - малого мучного хрущака Tribolium castaneum, комара Aedes aegypti, плодовой мушки Drosophila melanogaster, пчелы Apis mellifera; растения Arabidopsis thaliana; тропической рыбки Danio rerio; млекопитающих - мыши Mus musculus и человека Homo sapiens (рис.5). Видно, что последовательность из Т. moliíor имеет высокую степень гомологии с последовательностими PCP из других организмов (семейство S28 сериновых пептидаз).

teñe tri в aede dros apis dan i АКАВ musm huma

teñe trib aede dbos apis dani arab musm huma

teñe trib aede dros apis dani arab musm huma

teñe trib aede dros apis dani arab musm huma

- - MNTKETHSLI MILRDMGEAT

-------MELFN

---------MAT'

-----MAS HFCL

-------MGCRA

-------MGRRA[

JgCGQV-fs--------------------------------

V ÏLFRE-- FC-------------------------------

C1MTAQ- SA-------------------------------kïe

ILL---AGCDC--------------------------sqrfk

jwost-o--------hiflnkfygnyqkslniqnelhsakyr

\LF---RGKTEA—rpvcmrftvfkkenysneitshrdlsld

IVFPS-NGSSLSSSKLLPRFPRYTFQbJREARIQQFRGDRHEYR

ïgaaït^----------pprlktlgsphlsasptpdpavar-

iAPWAT A--------lrpalralgslhiiptnptslpavak-n

ttí|fevp tnna 36

'ttfldvf ffl 1 TNNA 37

qi' 1 ldvp Ж ? vnes 47

eiSefqvp 3¡R ¡i lina 53

elgtidmp i: svln 66

kegfkqi ? nslg 63

SB. ¡i adlp 76

svl|feqk щГ i; admr 64

svlgfqqk ntvk 66

tene -par] |g ; к 2 v'D jNY

trib -pgh G 5

aede -pkh g

dros lpeh v8 T e AM

apis -lnh g !j QY

dani -IPEj |GL0 Щ AV TE

arab natt s i AVF id

musm -sqh M i ae| rh

huma -srh| ■ ■■■ ae К H

3s AS|;V¡

As|vf

н . -т|

s ¡TjSL, H|d

sv N^A]

нЫ

H'vg

-rPgKTQS^DlVVNffiFSEI sp§ks-s| de* lefy initkaeditetff1 nagkmddgkkfld QPgKNENWEQgl tp-sspk; 'hü¿hg¡ rvgnstdp--p' sp|tsek-SptL

SPÍTSQ-;ÍQH|| " WETA-AALGEDA---------¡EDU

Inqta-aslgeeÍ

ANAYDDNMGTsl

s--vnsnadds^------

nnst-pqldall--------

YSLYVECADPrlcGLGFNSYAj DD---DPHGLDf

sqtttsslgsmI setatsslgtlS---------¡jgsi

101 108 120 128

138 141 151 136 138

196 203

215 218 229 214

216

278 284 295 297 306 293 295

341 341 349 354

366 374 374 365

367

tene 1 l m« Jtd—dh I ensp

trib I m| |d—n| enqs

aede w m| egsgkil ркка

dros i* |gs-et rtss

apis «gi-n| kpht

dani El - Bnv-тц ! pamp

arab Ëqe-ns pgyg

musm ! fi |gi-d| epfi

huma Ш fil ¡¡gv-d ephs

|fdt|sen 7fkkl|sdk¡ lekkjjsdl

fkdBae: 1lde|sn: gteqqreqyfflsk

IyssBkeemn |lekísnd«n

№lkelsddB1c

¡gJkqth|elpile ¡gJrqtnaelpile

"¡-kktvaltt i-kgjydiilr

I-qÍnlicek ! ¡-rSgwlktq -

j-r1kWVTTE

ík|-f|hwmtti rI-rÍswitti

sngfe

st; :

qspn qapn lrn®

tKsgg trd|||

TKDf!

cSyysrdrkffkntslyekvtfarrvnt-¡t&^yysrdknyfkksiffnkitythgnni-:qSrkmmg----------------------

AR®¡D@-

.qglktarkepf------------

.е0кн kk|jld¡|ysniq-,e§rh kngfir

416 416 425 429

441 449 454 440

442

488 488 476 475 480 500 513 491 4 96

musm _

huma : nfc:vaTPs ' -ШИНЫИтк" дтШЭ'г и-чДвтлЯЯв тяйвпеуп.чдккон Рис. 5. Выравнивание аминокислотной последовательности из Т. molitor (TEÑE) с PCP из T.m castaneum (TRIB), A. aegypti (AEDE), D. me/anogaster (DROS), A. mellifera (APIS), D. rerio (DANI), A. thaliana (ARAB), M. musculus (MUSM) и H. sapiens (HOMO). Последовательности взяты из базы данных NCBI. Стрелками обозначены остатки каталитической триады - Ser, Asp и His. N-конец зрелого фермента человека отмечен черным треугольником (А). Сигнальные пептиды, предсказанные программой SignalP, отмечены курсивом.

Для предсказания сигнальных пептидов в N-концевых фрагментах последовательностей PCP была использована программа SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/') (рис. 8). Все сигнальные пептиды, предсказанные программой, содержат большое количество гидрофобных остатков: Leu, Ile и других, но в то же время в целом все сигнальные пептиды значительно различаются и содержат от 15 до 22 аминокислотных остатков. N-конец зрелого фермента определен только у человеческой PCP, актщвационный пептид которой предположительно насчитывает 24 аминокислотных остатка. Активационные пептиды сходной длины предположительно имеют также PCP из A. mellifera, A. thaliana, D. rerio и M. musculus. PCP из D. melanogaster, по-видимому, имеет активационный пептид всего из двух аминокислот - SQ, а последовательности из T. molitor, T. castaneum и A. aegypti, по-видимому, вообще не имеют активационных пептидов.

С помощью пептидных субстратов разной длины и состава - Z-Ala-Ala-Pro-pNA, Z-Ala-Pro-pNA, Ala-Pro-pNA, Z-Gly-Pro-pNA, Z-Pro-pNA, Z-Pro-Phe, Pro-pNA - была изучена субстратная специфичность препарата PCP из T. molitor. Исследуемый препарат обладал активностью по всем использованным пролинсодержащим субстратам, кроме самого короткого - Pro-pNA. Для проверки наличия эндопептидазной активности у PCP были использованы субстраты Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA и Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA, в которых остаток Pro находится в середине пептидной цепи. Эти субстраты не расщеплялись PCP из Т. molitor, что свидетельствует об отсутствии активности, характерной для POP и PEP.

Препарат не гидролизовал субстраты Bz-Arg-pNA, Glp-Ala-Ala-Leu-pNA, Glp-Phe-Ala-pNA и Leu-pNA, являющиеся специфическими субстратами для пептидаз других классов. Это свидетельствует о строгой специфичности полученного препарата PCP по отношению к остатку Pro, а также об отсутствии в нем примесей трипсино- и химотрипсиноподобных, а также цистеиновых пептидаз и лейцинаминопептидаз соответственно.

Были определены кинетические характеристики гидролиза я-нитроанилидных субстратов, по которым наблюдалась активность препарата. Опыты проводили при рН 5,6 при концентрациях субстрата от 0,01 до 0,5 мМ в присутствии 2,5% диметилформамида. Кинетические характеристики гидролиза субстратов пептидазой Рер4 - константа Михаэлиса Кт и максимальная скорость гидролиза субстратов Vmax - приведены в таблице 4.

Лучше всего из использованных субстратов с ферментом связывался Z-Ala-Pro-pNA. Удлинение или укорочение этого субстрата на один остаток Ala, замена Ala на Gly, а также удаление N-защитной группы приводило к ухудшению Кт.

Таблица 4. Кинетические характеристики гидролиза субстратов PCP из T. molitor.

Субстрат Km, mkM Vlnax, HM/C Vma\/ Km, С

Z-Ala-Ala-Pro-pNA 340 ± 26 14,0 ± 1,2 4,1*10"5

Z-Ala-Pro-pNA 95 ±13 2,9 ±0,7 3,0* 10"5

Ala-Pro-pNA 157 ±20 5,0 ±0,7 3,2* 10'5

Z-Gly-Pro-pNA 147 ±27 0,13 ±0,04 8,7* 10'7

Z-Pro-pNA 170 ±28 0,10 ±0,03 5,9* 10"7

Несмотря на то, что субстрат Z-Ala-Ala-Pro-pNA связывался с ферментом наименее эффективно, скорость его расщепления была максимальной. Это приводит к тому, что он эффективнее других гидролизовапся пептидазой. При сравнении субстратов Z-Ala-Pro-pNA и Ala-Pro-pNA оказывается, что первый из них лучше связывается, а второй быстрее гидролизуется, в результате чего гидролиз обоих субстратов протекает с одинаковой эффективностью. Значения максимальных скоростей гидролиза субстратов Z-Gly-Pro-pNA и Z-Pro-pNA на порядок ниже, чем для остальных. Таким образом, специфический субстрат POP, Z-Gly-Pro-pNA, а также Z-Pro-pNA оказываются худшими для PCP из T. molitor.

Была определена константа ингибирования К, PCP из T. molitor Z-Рго-пролиналем (рис. 6). Прямые зависимости скоростей реакции от концентрации субстрата, построенные в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка, пересекаются в одной точке на оси ординат, что свидетельствует о конкурентном ингибировании Z-Рго-пролиналем. К, PCP из T. molitor Z-Рго-пролиналем составила 3,7* 10"6 М, что на порядок выше, чем для человеческой PCP (К, = 2,6*10 "7 М) и на два порядка выше, чем для POP (К, ~ 10"8 М).

100000

80000

л с;

I 60000

73

> 40000

5 10 15 1/[s], м N1-1

Рис. 6. Ингибирование PCP из T. molitor Z-Рго-пролиналем. Концентрации ингибитора: 1,9*10"5 (1), 1,3* 10"5 (2), 6,3*10-6 (3) и 2,5*10"6 (4) М, 5 - без ингибитора.

1.4. Изучение функций PSP из T. molitor

Для выяснения функций найденных в кишечнике Т. molitor ферментов изучена их локализация и изменение активности в процессе пищеварения. Показано, что все выявленные PSP являются растворимыми ферментами, но локализация их различна. DPP IV и PCP являются секретируемыми ферментами и обнаружены в содержимом кишки, a POP и пролидаза находятся в тканях кишки Т. molitor (табл. 5).

Таблица 5. Распределение PSP из Т. molitor.

Часть средней кишки Активность PSP, % от суммарной

DPPIV(Pepl) Пролидаза (Рер2) POP (РерЗ) PCP (Рер4)

AM 60 37 48 74

РМ 40 63 52 26

Локализация в средней кишке В содержимом В тканях В тканях В содержимом

Изучение локализации PSP выявило различия в распределении ферментов вдоль средней кишки Т molitor (табл.5). Известно, что изученные ранее секретируемые пищеварительные ферменты локализуются преимущественно в той части средней кишки Т. molitor, в которой физиологическое значение рН (5,6 в AM и 7,9 в РМ) соответствует области максимальной активности и стабильности ферментов. Именно так локализована и PCP, проявляющая максимальную активность при рН 5,6: 74% активности PCP обнаружено в AM, В случае с DPP IV 60% активности также обнаружено в AM, однако оптимум активности пептидазы лежит при рН 7,9. Возможно, такая локализация связана с особенностями рН-стабильности DPP IV. При рН 5,0-7,0 DPP IV проявляет максимальную стабильность, а при щелочных значениях рН ее стабильность уменьшается: при рН 8,0 она примерно в 1,5 раза меньше.

Как POP, так и пролидаза являются внутритканевыми цитоплазматическими ферментами, что было определено посредством субклеточного фракционирования тканей средней кишки, однако их локализация различается. POP равномерно распределена вдоль кишечника и, по-видимому, не участвует в пищеварении. В то же время пролидаза, вероятно, важна для завершающих стадий пищеварения, поскольку из литературных данных известно о существовании абсорбции из содержимого кишечника не только аминокислот, но и дипептидов, которые, возможно, гидролизуются пролидазой в цитоплазме эпителиальных клеток кишечника. Это предположение подтверждается данными о локализации пролидазы

вдоль средней кишки T. molitor: 63% ее активности локализованы главным образом в РМ, где как раз и происходят заключительные этапы гидролиза пищевых белков.

Для подтверждения функций найденных ферментов было изучено изменение их активности в процессе пищеварения. Измерения активности проводили в экстрактах из средней кишки голодных личинок, а затем через 2, 4, 6 и 8 часов после начала пищеварения. Активность PCP, DPP IV измеряли в содержимом кишечника (AM или РМ), а активность POP - в экстракте ткани кишечника (AM или РМ) (рис.7). Для тестирования активности использовали хромогенные пептидные субстраты, а также азоказеин для определения общей протеолитической активности.

12 4 6 8 время пищеварения, час

0 2 4 6 время пищеварения, час

Рис. 7. Изменение активностей пептидаз в процессе пищеварения в AM (А) и РМ (Б). 1 - DPP IV (Ala-Pro-pNA, рН 7,9), 2 - общая протеолитическая активность (азоказеин, рН 5,6 для AM и 7,9 для РМ), 3 - POP (Z-Ala-Ala-Pro-pNA, рН 7,9), 4 - PCP (Z-Ala-AIa-Pro-pNA, рН 5,6).

Характер изменения активностей PCP и DPP IV сходен с динамикой изменения общей протеолитической активности в процессе пищеварения как в AM, так и в РМ (рис.7), что указывает на принадлежность PCP и DPP IV к пищеварительным ферментам. Характер изменения активности POP иной, что может указывать на неучастие этого фермента в пищеварении.

Таким образом, в кишечнике Т. molitor обнаружены 4 PSP: DPP IV, пролидаза, POP и PCP. Их свойства в сравнении с литературными данными о PSP из других организмов суммированы в таблице 6.

Пептидаза Рер! Рер2 РерЗ Рер4

Предположительная идентификация DPPIV Пролидаза РОР РСР

Наши данные Лит. данные Наши данные Лит. данные Наши данные Лит. данные Наши данные Лит. данные

Субстраты АРр^ ОРрЫА АРрЫА БР ХР* гААРрКА, гАРрИА, гвРрЫА, гАРр!ЧА, гОРрИА, ZAAPpNA, ZAPpNA, APpNA ZPF АРрМ, грх*

Молекулярная масса, кДа 170 160-260 105 ПО, 185 63 65-85 105 (димер) 115,210 (димер, тетрамер)

Эффективные ингибиторы 0¥Р, НяС12, РМББ БЕР, ЩС\2 (иногда), РМБР ЕБТА, г-Рго EDTA, Z-Pro ББР, г-Рго- пролиналь, НёС12 ВЕР, г-Рго-пролиналь, HgCl2 (иногда) DFP, Z-Pro-пролиналь БРР, 2-Рго- пролиналь

рН-оптимум 7,9 8,0-9,0 7,5 7,5 7,9 7,0-8,5 5,6 5,0-5,5

Локализация в кишечнике В содержимом кишечника В апикальных мембранах эпителия В тканях кишечника В цитоплазме клеток кишечника В тканях кишечника В тканях кишечника В содержимом кишечника Нет данных

* X - любая аминокислота.

2. Идентификация постглутаминрасщепляющих пептидаз в пищеварительном комплексе личинок Т. molitor.

Наиболее распространенным аминокислотным остатком в пищевых белках Т. molitor является глутамин. Мы провели поиск и идентификацию пищеварительных пептидаз, гидролизующих пищевые белки насекомого по этому остатку. С использованием хромогенного пептидного субстрата Z-Ala-Ala-Gln-pNA было показано, что подавляющая часть постглутаминрасщепляющей активности сосредоточена в содержимом кишечника; местом преимущественной локализации активности (около 70% от общей) является содержимое AM.

Нами проведена очистка и характеристика постглутаминрасщепляющих пептидаз (glutamine specific peptidase, GSP). Экстракты из AM и РМ фракционировали на колонке с сефадексом G-100 и измеряли их активность по субстрату Z-Ala-Ala-Gln-pNA, а также высокоспецифичному субстрату цистеиновых пептидаз - Glp-Phe-Ala-pNA (рис. 8).

-GIpFApNA -ZAAQpNA -А280

250 350

объем элюции, мл

150 250 350 450 550 объем элюции, мл

Рис. 8. Профиль гель-фильтрации экстрактов из АМ (А) и РМ (Б) личинок Т. тоШог на колонке с сефадексом й-100. Активность определяли по субстратам Z-Ala-Ala-Gln-pNA и Ир-Нге-Ак-рКА; концентрацию белка оценивали по поглощению при 280 нм.

На профиле элюции экстракта из АМ присутствует один пик ввР, полностью совпадающий с пиком активности цистеиновых пептидаз по специфическому субстрату 01р-Р11е-А1а-рНА. Этот пик был обозначен как 08Р2Ам- Профиль вБР из РМ (рис. 8,Б) также совпадает с профилем активности по 01р-РИе-А1а-рЫА и содержит 2 пика - ОЭРЬм и 08Р2рм. Молекулярные массы йЭР и цистеиновых пептидаз одинаковы и составляют для 08Р2ам - 21 кДа, вБРЬм - 39 кДа, 08Р2РМ - 23 кДа.

Фракции, содержащие активность СЭР, были собраны, сконцентрированы и обессолены.

Был проведен ингибиторный анализ препаратов 08Р2дм, вЗРЬм и 08Р2рм (табл. 7). Было показано, что препараты неактивны в отсутствие БТТ, так же как и в присутствии ингибитора цистеиновых пептидаз Е-64 при концентрациях 10"4, 10"5, 10"6 М. РМ8Б, ЕЭТА и пепстатин мало влияли на активность всех препаратов 08Р.

Таблица 7. Влияние ингибиторов и активаторов на активность препаратов йБР*.

Остаточная активность**, %

Реагент Концентрация, М 08Р2дм в8Р1рм 08Р2РМ

ОТТ 0 1 1 0

З'Ю-3 100 100 100

3-Ю"4 31 33 35

РМБР*** ю-3 110 106 91

10"4 107 101 90

ю-5 95 92 100

Пепстатин*** Ю-4 98 93 85

ю-5 103 96 87

10"6 96 102 96

БИТА*** Ю-2 127 121 129

ю-3 114 111 116

ю-4 103 102 105

Е-64*** 10"4 0 0 0

Ю-5 0 0 0

10'6 0 0 0

*Активность измеряли по субстрату 2-А1а-А1а-01п-рЫА

**3а 100 % принята активность препарата в присутствии 3 мМ БТТ.

** «Измерения активности были проведены в присутствии 3 мМ БТТ.

Ингибиторный анализ препаратов, содержащих искомые активности, а также идентичность распределения активностей по субстрату 2-А1а-А1а-01п-рЫА и субстрату цистеиновых пептидаз 01р-РЬе-А1а-рМА при гель-фильтрации (рис.8), свидетельствуют о принадлежности ферментов, активных по субстрату г-Ак-Ак-Ип-рНА, к подподклассу цистеиновых пептидаз. Таким образом, постглутаминрасщепляющая активность в

содержимом кишечника Т. тоШог, по-видимому, принадлежит цистеиновым пептидазам. Наши данные коррелируют с данными других авторов о присутствии у ряда цистеиновых пептидаз постглутаминрасщепляющей активности. Известно, что главной цистеиновой пищеварительной пептидазой Т. тоШог является катепсин Ь-подобная пептидаза (в нашей работе это, по-видимому, 08Р2дм и 08Р2рМ). Как следует из наших опытов, эта пептидаза способна гидролизовать пептиды, содержащие в Р| - положении остаток Ип, причем гидролитическая активность цистеиновых пептидаз по субстрату 2-А1а-А1а-01п-рКА сопоставима с активностью по их специфическому субстрату 01р-РЬе-А1а-рМА.

3. Гидролиз глиадинов.

Мы провели сравнительное изучение вклада цистеиновых и сериновых пептидаз из кишечника Т. тоШог в гидролиз главных пищевых белков насекомого - глиадинов пшеницы. Для этого был использован препарат 08Р2ДМ, в котором присутствует активность как цистеиновых, так и сериновых, преимущественно химотрипсиноподобных пептидаз, не разделяющихся при гель-фильтрации, поскольку величины их молекулярных марс близки (~ 20-25 кДа). Изучение вклада ввР в гидролиз глиадинов проводили двумя методами -электрофоретически и с помощью нингидрина, определяя количество образовавшихся свободных >Ш2-групп.

Электрофоретическое исследование показало, что суммарный препарат глиадинов представляет собой смесь нескольких белков (рис. 12,А). В присутствии ингибитора цистеиновых пептидаз Е-64 в препарате доминируют сериновые пептидазы; гидролиз через 15 мин, 30 мин, 1 ч и 2 ч, протекает слабо (дорожки 9,10,11,12). В то же время в присутствии РМ8Б - ингибитора сериновых пептидаз гидролиз значителен уже через 30 мин (дорожка 6), а через 1 ч (дорожка 7) глиадины были разгидролизованы практически полностью. Это свидетельствует о том, что основной вклад в гидролиз глиадинов вносят цистеиновые пептидазы.

Сравнение начальных скоростей гидролиза глиадинов ферментами из препарата 08Р2дм проводили, детектируя нингидрином образовавшиеся свободные ЫНг-группы. Как видно из рисунка 9,Б, 08Р2АМ в присутствии ингибитора сериновых пептидаз РМЭР гидролизует глиадины в 4 раза быстрее, чем в присутствии ингибитора цистеиновых пептидаз Е-64, что полностью согласуется с результатами электрофореза.

Mw, kDa 1 2

94.6 — . 66.2 — • 'MS ta»™*- '

45 - *"*•' tl'-f

31 - фф-Щ

21.5 - |

14.4 _„

4 5 6

О rl 'щШ ilSl

9 10 11 12 13

«ГЦ!

20 40 60 в0 100 120 время, мин

Рис. 9. Гидролиз глиадинов под действием пептидаз из препарата GSP2am. à - Электрофорез в ПААГ: 1 - маркеры; 2 - глиадины; 3 - глиадины + GSP2am + Е-64 + PMSF, 2 ч инкубации; 4 - GSP2am + PMSF (контроль); 5,6,7,8 - глиадины + GSP2AM + Е-64 + PMSF 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч инкубации соответственно; 9,10,11,12 - глиадины + GSP2Am + Е-64 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч инкубации соответственно; 13 - GSP2Am + Е-64 (контроль). Б - Гидролиз глиадинов препаратом GSP2Am в присутствии 1 мМ PMSF (1) или 0,1 мМ Е-64 (2). Детекция проводилась с помощью нингидрина.

Мы изучили также действие на глиадины обнаруженных пролинспецифичных экзопептидаз DPP IV и PCP и совместное действие эндо- и экзопептидаз из АМ. Для этого сравнивали гидролиз глиадинов под действием эндопептидаз из препарата GSP2am (цистеиновые и сериновые пептидазы), какой-либо из экзопептидаз (DPP IV или PCP), выделенных из АМ, и совместное воздействие эндо- и экзопептидаз. Детекцию образовавшихся NFE-rpynn проводили с помощью нингидрина (рис. 10).

0,10----Ц=====1==р^?(<:--0,10

5 0,08 «0,08

< 0,06 у* ^^^ <0,06

0,04 у? о-"-"11 °'04

0,02 -----* 0.с2

0,00 0,00

о 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 10

время, мин время, мин

Рис. 10. Гидролиз глиадинов под действием препаратов ферментов из АМ.

Оказалось, что DPP IV проявляет в 1,5 раза большую активность по глиадинам, чем PCP, причем при добавлении DPP IV к препарату GSP2Am скорость гидролиза глиадинов возрастала в 2 раза. В то же время добавление PCP увеличивало скорость гидролиза глиадинов только на 30 %. Следует подчеркнуть, что в обоих случаях совместное действие эндо- и экзопептидаз оказывается большим, чем сумма действий ферментов по отдельности. Это, по-видимому, свидетельствует о том, что при гидролизе глиадинов под действием

эндопептидаз образуются пептиды, которые являются субстратами для экзопептидаз, что и приводит к увеличению скорости расщепления глиадинов.

Базируясь на полученных данных, мы предложили гипотетическую схему гидролиза пищеварительными ферментами из T. molitor глиадина на примере у-глиадина. В состав этого белка входят повторы PQQPFPQ. Рассмотрим последовательность, состоящую из 3 таких повторов. Вначале пищеварительные цистеиновые пептидазы Т. molitor с высокой степенью вероятности гидролизуют пептидные связи между двумя остатками глутамина (рис. 11). Получающиеся фрагменты являются субстратами для DPP IV, и она последовательно отщепляет от них дипептиды QP • и FP. Оставшиеся трипептиды QPQ являются «плохими» субстратами для DPP IV, но с высокой эффективностью гидролизуются PCP. Образовавшиеся в результате дипептиды являются субстратами пролидазы, которая завершает деградацию пептида. Из этой схемы видно, что три из обнаруженных PSP важны для полного переваривания пролинбогатых пищевых белков T. molitor. Выявленная в тканях средней кишки POP, по-видимому, не принимает участия в пищеварении.

4 4 1) цистеиновые пептидазы

QPFPQPQQPFPQPQQPFPQPQ

I

| | Ii II 2) DPP IV

QPFPQPQ + QPFPQPQ + QPFPQPQ

I

III 3)PCP

QP + FP + QPQ + QP + FP + QPQ + QP + FP + QPQ

1

III III III 4) пролидаза

QP + FP + QP + Q + QP + FP + QP + Q + QP + FP + QP + Q

I

Q + P + F + P + Q + P + Q + Q + P + F + P + Q + P + Q + Q + P + F + P + Q Рис. 11. Гипотетическая схема гидролиза глиадинов.

Схема, предложенная на рис. 11, интересна тем, что она может подходить для большинства пептидных или белковых фрагментов глиадинов, в том числе для а- и ю-глиадинов, а также пептидов глиадинов, которые, как показывают опыты in vitro, не гидролизуются человеческими пищеварительными пептидазами и являются причиной аутоиммунного заболевания целиакии.

выводы

1. Впервые изучен комплекс пролинспецифичных пептидаз в кишечнике насекомого. В личинках Tenebrio molitor обнаружены дипептидилпептидаза IV, пролидаза, пролилкарбоксипептидаза и пролилолигопептидаза.

2. Изучены физико-химические и энзиматические свойства очищенных пролинспецифичных пептидаз.

3. Установлена первичная структура пролилкарбоксипептидазы из Т. molitor.

4. Обнаружено, что все выявленные пролинспецифичные пептидазы PSP являются растворимыми ферментами, но локализация их различна. Дипептидилпептидаза IV и пролилкарбоксипептидаза выявлены в содержимом, а пролилолигопептидаза и пролидаза - в тканях кишечника Т. molitor. Показано, что дипептидилпептидаза IV, пролилкарбоксипептидаза и, вероятно, пролидаза, являются пищеварительными ферментами, а пролилолигопептидаза - внутритканевым ферментом, не участвующим в пищеварении.

5. Впервые показано, что именно цистеиновые пептидазы из кишечника личинок Т. molitor гидролизуют пептидные связи по карбонильной группе глутамина.

6. С использованием охарактеризованных ферментов предложена гипотетическая схема гидролиза глиадинов, в том числе и пептидов, устойчивых к действию пищеварительных ферментов человека и вызывающих целиакию у чувствительных людей.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Goptar I.A., Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Vinokurov K.S., Zhuzhikov

D.P., Bulushova N.V., Zalunin I.A., Dunaevsky Ya.E., Belozersky M.A., Oppert B. and Elpidina

E.N. Localization of post-proline cleaving peptidases in Tenebrio molitor larval midgut. Biochimie. 2008. V. 90. № 3. P. 508-514.

2. Гоптарь И.А., Кулемзина И.А., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Жужиков Д.П., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Элпидина Е.Н. Изучение свойств постпролинрасщепляющих ферментов из Tenebno molitor. Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. №3. С. 310-316.

3. Elpidina E.N., Goptar I.A. Digestive peptidases in Tenebrio molitor and possibility of use to treat celiac disease. Entomological Research. 2007. V. 37. № 3. P. 139-147.

4. Goptar LA., Lysogorskaya E.N., Filippova I.Yu., Vinokurov K.S., Zhuzhikov D.P., Elpidina E.N. 2005. Prolyl endopeptidases fiom the midgut of the yellow mealworm Tenebrio molitor. FEBS Journal. 2005. V. 272 № SI, P. 154-155. Abstracts of 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference. Budapest, Hungary, 2005.

5. Elpidina E.N., Oppert В., Vinokurov K.S., Tsybina T.A., Prabhakar S., Krylov S.V., Goptar I.A., Filippova I.Yu. Digestive proteinases in a stored product pest Tenebrio molitor. Abstracts of the 4th General Meeting of the International Proteolysis Society Associated with the International Conference 011 Protease Inhibitors. Quebec City, Canada, 2005. P. 148.

6. Элпидина E.H., Гоптарь И.А., Филиппова И.Ю. Пищеварительные пролилэндопептидазы: новые возможности в медицине, промышленности и науке. Материалы третьей международной научно-практической школы-конференции МЕДБИОТЕК-2006 «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине». Москва, Россия, 2006. С. 107-108.

7. КулемзинаИ.А., Гоптарь И.А. Некоторые свойства пролилэндопептидаз из средней кишки личинок Tenebrio molitor. Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов», секция «Биоинженерия и биоинформатика». Москва, МГУ, 2007, С. 24-25.

8. Гоптарь И.А., Филиппова И.Ю, Лысогорская Е.Н., Винокуров КС., Жужиков Д.П., Элпидина Е.Н. Изучение свойств пролилэндопептидаз из средней кишки личинок Tenebrio molitor. Тезисы докладов и стендовых сообщений VI Симпозиума "Химия протеолитических ферментов". Москва, 2007. С. 81.

9. Elpidina E.N., Goptar I. A. Digestive peptidases in Tenebrio molitor and possibility of use to treat celiac disease. Proceedings of International Congress of Insect Biotechnology and Industry. Daegu, Republic of Korea, Entomological Research, 2007. V 37, № SI, P. A7-A8.

Заказ № 107/04/08 Подписано в печать 15 04.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

-;>, ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru ; e-mail:info@,cfr.ru

Введение

Список сокращений

1. Пролинспецифичные пептидазы (Обзор литературы)

1.1. Краткая характеристика пролинспецифичных пептидаз

1.2. Пролилолигопептидазы'

1.3. Дипептидилпептидазы IV

1.4. Дипептидилпептидазы II

1.5. Пролилкарбоксипептидазы

1.6. Пролилэндопептидаза из Aspergillus niger

1.7. Пролилиминопептидазы

1.8. Аминопептидазы Р

1.9. Пролидазы

1.10. Пролиназы (цитозольные неспецифические дипептидазы)

1.11. Карбоксипептидазы Р

Пролинспецифичные пептидазы (proline specific peptidases, PSP) представляют собой сравнительно небольшую группу высокоспецифичных экзо- и эндопептидаз, расщепляющих в белках и пептидах связи, образованные остатком пролина. Уникальность действия PSP обусловлена структурными особенностями пролина — единственной циклической иминокислоты среди 20 а-аминокислот, из которых построены белки и пептиды. Под действием других пептидаз, даже с очень широкой специфичностью, пептидные связи, образованные остатком пролина, практически не расщепляются. К настоящему времени накоплено достаточно информации о том, что остаток пролина в пептидной цепи может выполнять функции своеобразного регуляторного сигнала защиты пептидов от деградации ферментами с широкой специфичностью. Таким образом, PSP, участвующие в расщеплении пролинсодержащих белков и пептидов, оказываются вовлеченными в регуляцию различных метаболических процессов. Предполагается, что PSP участвуют в дифференциации и созревании клеток, секреции и процессинге белков, катаболических процессах, иммунном ответе. В связи с этим изучение PSP представляет несомненный научный интерес с точки зрения понимания фундаментальных процессов протеолиза и структурных основ регуляции метаболической стабильности биологически активных соединений. Практический интерес к PSP обусловлен их возможным использованием в научных исследованиях как инструментов структурного анализа белков и ферментативного пептидного синтеза. Особое значение имеет изучение PSP в медицинских целях, поскольку известно, что активность этих ферментов меняется при таких заболеваниях как диабет, рак, болезни Альцгеймера и Паркинсона, гипертония, нейропсихические заболевания. PSP заслуживают пристального внимания и как потенциальное лекарство против целиакии, аутоиммунного заболевания, связанного с нарушением пищеварения из-за неспособности человеческих пищеварительных пептидаз полностью гидролизовать богатые пролином белки.

Несмотря на громадный интерес к уникальным по своему действию PSP, на сегодняшний день подробно изучены свойства только ограниченного числа PSP, главным образом из млекопитающих, а сведения о функциональной роли этих ферментов носят противоречивый и неоднозначный характер. Таким образом, исследования, направленные на обнаружение PSP из различных источников и изучение их структурно-функциональных особенностей, весьма актуальны.

Основной целью данной работы являлся поиск и изучение PSP насекомого — личинок большого мучного хрущака Tenebrio molitor. Большой мучной хрущак является вредителем зерновых запасов,, в состав диеты которого входят богатые пролином глиадины, являющиеся главными запасными белками семян пшеницы. Было логично предположить наличие PSP в спектре пищеварительных ферментов Т. molitor. Однако , на настоящий момент такие ферменты не были выявлены в пищеварительном комплексе насекомых, в том числе и у Т. molitor. Большой интерес представлял также поиск пептидаз Т. molitor, способных гидролизовать пептидные связи, образованные остатком- глутамина, содержание которого в глиадинах достигает 30 - 50%.

В работе решались следующие задачи:

• поиск и идентификация пролин-и глутаминспецифичных пептидаз;

• очистка выявленных ферментов;

• ■ характеристика их физико-химических, энзиматических и» функциональных свойств;

• сравнительный анализ действия выделенных ферментов на глиадины.

Впервые выделен и охарактеризован весь комплекс PSP из кишечника насекомого, включающий дипептидилпептидазу (DPP) IV, пролилкарбоксипептидазу (РСР), пролидазу и пролилолигопептидазу (POP). Обнаружено, что DPP IV и PGP находятся в содержимом кишечника, a POP и пролидаза локализованы внутри тканей кишечника. DPP IV, РСР и, вероятно, пролидаза: являются пищеварительными ферментами, a POP - внутритканевым ферментом, не участвующим в пищеварении. РСР впервые обнаружена в спектре пищеварительных ферментов животных. Проведены выделение, очистка , и детальное изучение физико-химических щ • энзиматических свойств этого фермента. Определены кинетические параметры гидролиза субстратов разной длины высокоочищенной РСР. Установлена первичная структура РСР из Т. molitor.

Впервые обнаружено, что именно цистеиновые пептидазы из кишечника личинок Г. molitor гидролизуют пептидные связи по карбонильной группе глутамина;

Показано действие выявленных пролин- и глутаминспецифичных ферментов на глиадины. Предложена гипотетическая схема гидролиза глиадинов, в том числе и пептидов, устойчивых к действию пищеварительных ферментов человека и вызывающих целиакию у чувствительных людей.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ПААГ — полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция ADA - аденозиндезаминаза

AM (=anterior mesenteron) - передняя часть средней кишки АМС - 7-амино-4-метилкумарин

BBMV (brush border membrane vesicles) — фракции мембран щеточной каемки

Вое - /я/ге/и-бутилоксикарбонил

Bz - бензоил

DMF - диметилформамид

DPA - дефицит пролидазной активности

DTT - дитиотреитол

FPLC - высокоскоростная жидкостная хроматография белков

Glp - пироглутамил

Нур - 4-гидроксипролин pNA - р-нафтиламид pNA - гс-нитроанилид

ОМе - метиловый эфир

ONp - гс-нитрофениловый эфир кислоты

РМ (^posterior mesenteron) - задняя часть средней кишки

SDS - додецилсульфат натрия

Sue - сукцинил

Z — бензилоксикарбонил

Все аминокислоты L-ряда, если не указано особо. Ферменты:

АРР - аминопептидаза Р СРР - карбоксипептидаза Р

CND (=cytosol nonspecific dipeptidase) - цитозольная неспецифичная дипептидаза DPP II — дипептидилпептидаза II DPP IV - дипептидилпептидаза IV

GSP (= glutamine specific peptidase) -глутаминспецифичные пептидазы

РСР - пролилкарбоксипетидаза PIP - пролилиминопетидаза PEP - пролилэндопептидаза POP - пролилолигопептидаза

PSP (=praline specific peptidase) - пролинспецифичные пептидазы Ингибиторы:

DFP - диизопропилфторфосфат

Е-64 - Ь-/иранс-эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино) бутан EDTA — этилендиаминтетрауксусная кислота РСМВ — «-хлоромеркурибензоат PMSF - фенилметилсульфонилфторид

выводы

1. Впервые изучен комплекс пролннспецифичных пептидаз в кишечнике насекомого. В личинках Tenebrio molitor обнаружены дипептидилпептидаза IV, пролидаза, пролилкарбоксипептидаза и пролилолигопептидаза.

2. Изучены физико-химические и энзиматические свойства очищенных пролннспецифичных пептидаз.

3. Установлена первичная структура пролилкарбоксипептидазы из Т. molitor.

4. Обнаружено, что все выявленные пролинспецифичные пептидазы PSP являются растворимыми ферментами, но локализация их различна. Дипептидилпептидаза IV и пролилкарбоксипептидаза выявлены в содержимом, а пролилолигопептидаза и пролидаза - в тканях кишечника Т. molitor. Показано, что дипептидилпептидаза IV, пролилкарбоксипептидаза и, вероятно, пролидаза, являются пищеварительными ферментами, а пролилолигопептидаза — внутритканевым ферментом, не участвующим в пищеварении.

5. Впервые показано, что именно цистеиновые пептидазы из кишечника личинок Т. molitor гидролизуют пептидные связи по карбонильной группе глутамина.

6. С использованием охарактеризованных ферментов предложена гипотетическая схема гидролиза глиадинов, в том числе и пептидов, устойчивых к действию пищеварительных ферментов человека и вызывающих целиакию у чувствительных людей.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне признателен руководителям работы Ирине Юрьевне Филипповой и Елене Николаевне Элпидиной за ценные советы в ходе выполнения работы и помощь во время ее написания. Автор особенно благодарен Е.С. Оксенойт за синтез отдельных использованных субстратов, Д.П. Жужикову за предоставление образцов из насекомых и К.С. Винокурову за помощь в проведении экспериментов. Автор также признателен сотрудникам НИИ ФХБ им. Белозерского Я.Е. Дунаевскому, М.А. Белозерскому и B.JI. Друце за советы по выполнению экспериментов и за помощь в анализе получившихся результатов. Автор чрезвычайно признателен отделу хроматографии НИИ ФХБ им. Белозерского в лице JI.A. Баратовой, Н.В. Федоровой, A.JL Ксенофонтова и А.В. Тимофеевой за помощь в проведении необходимых опытов по ВЭЖХ. Автор хотел бы поблагодарить студентов факультета ББФ МГУ И.А. Кулемзину, Е.С. Горячеву и С.А. Даниленко за активное участие в экспериментах и ценные советы по биоинформатическому анализу данных. Автор признателен всем сотрудникам лаборатории химии белка кафедры ХПС МГУ, в том числе Е.Н. Лысогорской, Ю.А. Смирновой, О.М. Аникиной и А.В. Бачевой. Автор хотел бы выразить отдельную благодарность Т.А. Семашко за помощь в написании работы и за моральную поддержку на протяжении всего времени выполнения работы.

1.12. Заключение

Таким образом, для гидролиза пептидных связей, образованных пролином, в природе существуют различные ферменты, специфичность действия которых зависит от положения остатка пролина в полипептидной цепи субстрата.

PSP, катализирующие гидролиз пептидной связи, в образовании которой принимает участие иминогруппа пролина — АРР и пролидазы - являются металлопептидазами, относятся к М24 семейству, и, вероятно, имеют общего предшественника. Ферменты, специфически гидролизующие полипептидную цепь по карбонилу пролина, относятся к сериновым пептидазам: POP и DPP IV — к семейству S9, DPP И, РСР и PEP из A. niger - к S28, a PIP - к S33. На основании анализа аминокислотных последовательностей было сделано предположение о существовании общего предшественника у семейств S9 и S28-[124], а на основании-данных о пространственной структуре вблизи активного центра - о возможном общем предшественнике у семейств S9 и S33 [162]. По всей видимости, все ферменты из семейств S9, S28 и S33 вообще имели одного предшественника, изменения в специфичности которого затронули лишь вариации в необходимом количестве остатков субстрата с обеих сторон от расщепляемой связи. При этом изменения не затронули первичную специфичность ферментов - все они гидролизуют связи с С-конца пролина и со значительно меньшими скоростями — аланина.

Несколько в стороне находятся пролиназы (CND) и СРР — металлопептидазы, также способные гидролизовать связи по карбонилу остатка пролина. Однако у этих пептидаз наблюдается намного меньшая селективность по отношению к остатку Pro в Pi положении. Эти ферменты способны гидролизовать связи, образованные и другими аминокислотными остатками, со сравнимыми или большими скоростями.

Многие PSP млекопитающих являются хорошо изученными ферментами. Так, охарактеризованы физико-химические и энзиматические свойства, а также разрешена пространственная структура POP, DPP IV, АРР, пролидазы I типа и PIP. В значительно меньшей степени изучена DPP II, а о пролидазе II типа и РСР известно очень мало. Сведения о функциях PSP носят противоречивый характер. Даже для POP - наиболее изученного представителя PSP, физиологическая функция до сих пор не выявлена. Между тем, PSP представляют большой интерес для медицины, поскольку изменения в их активности наблюдаются при различных заболеваниях. Эти ферменты интересны и с точки зрения изучения механизмов протеолиза пролинсодержащих белков, в том числе в связи с их возможным применением в сыроварении и при лечении целиакии.

Сведения о PSP насекомых крайне скудны. POP была выявлена у серой мясной мухи Sarcophaga peregrina [8] и плодовой мушки Drosophila melanogaster [9], где они экспрессируются в имагинальных дисках. Была частично очищена DPP IV из мозга и кишечника таракана [53]. Кроме того, были получены и частично изучены продукты 2 генов из Drosophila melanogaster, идентифицированые как DPP IV [54] и АРР [172]. Функции PSP насекомых практически не изучены.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как следует из литературного обзора, свойства большинства PSP подробно изучены только для представителей млекопитающих, а такие ферменты, как РСР и СРР, вообще слабо охарактеризованы. Сведения о функциональной роли этих ферментов и их участии в протеолизе пролинсодержащих белков носят противоречивый и неоднозначный характер.

Таким образом, исследования, направленные на обнаружение PSP из различных источников и изучение их структурно-функциональных особенностей, весьма актуальны.

Основной целью данной работы являлся поиск и изучение PSP'насекомого -личинок большого мучного хрущака Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae). Большой мучной хрущак является одним из самых распространенных насекомых -вредителй зерновых и крупяных запасов, портящим муку и мучные продукты, причем основной вред наносят именно личинки. Изучение пищеварения у личинок Т. molitor показало наличие градиента рН в содержимом средней кишки, где локализованы пищеварительные ферменты: значение рН увеличивалось от 5,6 в передней части средней кишки (anterior mesenteron, AM) до значения 7,9 в задней части средней кишки (posterior mesenteron, РМ) [137]. Такое различие в значениях рН приводит к разному распределению пищеварительных ферментов в кишечнике: цистеиновые пептидазы и пептидазы, имеющие рН-оптимум активности в кислой области, локализованы преимущественно в AM, а сериновые пептидазы и металлоэкзопептидазы, проявляющие максимальную активность в нейтральной и щелочной области, выявлены преимущественно в РМ [237-241].

В состав диеты Tenebrio molitor входят богатые пролином глиадины, являющиеся главными запасными белками семян пшеницы. Глиадины состоят на 1030% из остатков Pro и на 30-50% из остатков Gin [37,38]. Было логично предположить наличие PSP в спектре пищеварительных ферментов Т. molitor. Однако на настоящий момент такие ферменты не были выявлены в пищеварительном комплексе насекомых. Большой интерес представлял также поиск пептидаз Т. molitor, способных гидролизовать пептидные связи, образованные остатком глутамина, содержание которого в глиадинах достигает 30 - 50%.

В работе решались следующие задачи: (1) поиск и идентификация пролин- и глутаминспецифичных пептидаз;

2) очистка выявленных ферментов;

3) характеристика их физико-химических, энзиматических и функциональных свойств;

4) сравнительный анализ действия выделенных ферментов на глиадины.

2.1. Выявление и общая характеристика пролинспецифичных пептидаз 2.1.1. Выявление PSP

На первом этапе работы на основе анализа литературных данных о субстратной специфичности известных PSP был проведен дизайн пептидных субстратов, необходимых для выявления всего пищеварительного комплекса PSP Т. molitor. Использованные в работе субстраты, синтезированные в лаборатории химии белка Химического факультета МГУ, представлены в табл. 12.

1. Cunningham D. F., O'Connor В. Proline specific peptidases, Biochim. Biophys. Acta, 1997, V. 1343, P. 160-186.

2. Walter R. Partial purification and characterization of post-proline cleaving enzyme: enzymatic inactivation of neurohypophyseal hormones by kidney preparations of various species, Biochim. Biophys. Acta, 1976, V. 422, P. 138-158.

3. Koida M., Walter R. Post-proline cleaving enzyme. Purification of this endopeptidase by affinity chromatography, J. Biol. Chem., 1976, V. 251, P. 7593-7599.

4. Sharma K.K., Ortwerth В J. Purification and characterization of prolyl oligopeptidase from bovine lens, Exp Eye Res., 1994, V. 59, P. 107-115.

5. Cunningham D. F., O'Connor B. A study of prolyl endopeptidase in bovine serum and its relevance to the tissue enzyme, Int. J. Biochem. Cell Biol., 1998, V. 30, P. 99-114.1

6. Yoshida K., Inaba K., Ohtake H., Morisawa M. Purification and characterization of -prolyl endopeptidase from the Pacific herring, Clupea pallasi, and its role in the activation of sperm motility, Dev. Growth Differ., 1999, V. 41, P. 217-225.

7. Ohtsuki S., Homma K., Kurata S., Komano H., Natori S. A prolyl endopeptidase of Sarcophaga peregrina (flesh fly): its purification and suggestion for its participation in the differentiation of the imaginal discs. J. Biochem., 1994, V. 115, P. 449-453.

8. Amin A., Li Y., Finkelstein R. Identification of a Drosophila prolyl endopeptidase and analysis of its expression, DNA Cell Biol., 1999, V. 18, P. 605-610.

9. Sattar A.K., Yamamoto N., Yoshimoto Т., Tsuru D. Purification and characterization of an extracellular prolyl endopeptidase from Agaricus bisporus, J. Biochem., 1990, V. 107, P. 256-261.

10. Shan L., Marti Т., Sollid L.M., Gray G.M., Khosla C. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl endopeptidases: implications for coeliac sprue, Biochem. J., 2004, V. 383, P. 311-318.

11. Беседин Д.В., Руденская Г.Н. Пролинспецифичные эндопептидазы, Биоорган, химия, 2003, Т. 29, С. 3-20.13. http://merops.sanger.ac.uk

12. Rea D., Fulop V. Structure-Function Properties of Prolyl Oligopeptidase Family Enzymes, Cell Biochem. Biophys., 2006, V. 44, P. 349-365.

13. Walter R., Yoshimoto T. Postproline cleaving enzyme: kinetic studies of size and stereospeciflcity of its active site, Biochemistry, 1978, V. 17, P. 4139-4144.

14. Harris M.N., Madura J.D., Ming L.-J., Harwood V.J. Kinetic and Mechanistic Studies of Prolyl Oligopeptidase from the Hyperthermophile Pyrococcus furiosus, J. Biol. Chem., 2001, V. 276, P. 19310-19317.

15. Noula C., Kokotos G., Barth Т., Tzougraki C. New fluorogenic substrates for the study of secondary specificity of prolyl oligopeptidase, J Pept Res., 1997, V. 49, P. 4651.

16. Kaspari A., Diefenthal Т., Grosche G., Schierhorn A., Demuth H.U. Substrates containing phosphorylated residues adjacent to proline decrease the cleavage by proline-specific peptidases, Biochim Biophys Acta, 1996, V. 1293, P. 147-153.

17. Fulop V., Bocskei Z., Polgar L. Prolyl oligopeptidase:an unusual р-propeller domain regulates proteolysis, Cell, 1998, V. 94, P. 161-170.

18. Ollis D.I., Cheah E., Cygler M., Dijkstra В., Frolow F., Franken S. M., Harel M., Remington S.J., Silman I., Schrag J., Sussman J.L., Verschueren K. H.G., Goldman A. The o/p hydrolase fold, Protein Eng., 1992, V. 5, P. 197-211.

19. Polgar L. The prolyl oligopeptidase family, Cell. Mol. Life Sci., 2002, V. 59, P. 349-362.

20. Szeltner Z., Renner V., Polgar L. The non-catalytic р-propeller domain of prolyl oligopeptidase enhances the catalytic capability of the peptidase domain, J. Biol. Chem., 2000, V. 275, P. 15000-15005.

21. Shan L., Mathews I.I., Khosla C. Structural and mechanistic analysis of two prolyl endopeptidases: role of interdomain dynamics in catalysis and specificity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, V. 102, P. 3599-3604.

22. Gass J., Khosla C. Prolyl endopeptidases, Cell. Mol. Life Sci., 2007, V. 64, P. 345355.

23. Yoshimoto Т., Ogita K., Walter R., Koida M., Tsuru D. Post-proline cleaving enzyme. Synthesis of a new fluorogenic substrate and distribution of the endopeptidase in rat tissues and body fluids of man, Biochim Biophys Acta, 1979, V. 569, P. 184-92.

24. Williams R.S.B. Prolyl oligopeptidase and bipolar disorder, Clin. Neurosci. Res., 2004, V. 4, P. 233-242.f133

25. Ohtsuki S., Homma K., Kurata S., Natori S. Molecular cloning of cDNA for Sarcophaga prolyl endopeptidase and characterization of the recombinant enzyme produced by an E. coli expression system, Insect Biochem. Moll Biol., 1997, V. 27, P. 337-343.

26. Ishino Т., Ohtsuki S., Homma K., Natori S. cDNA cloning of mouse prolyl endopeptidase and its involvement in DNA synthesis by Swiss3T3-cells, J. Biochem., 1998, V. 123, P. 540-545.

27. Kato Т., Okada M., Nagatsu T. Distribution of post-proline cleaving enzyme in human brain and the peripheral tissues, Mol Cell Biochem., 1980, V. 32, P. 117-121.

28. Goossens F., De Meester I., Vanhoof G., Scharpe S. Distribution of prolyl oligopeptidase in human peripheral tissues and body fluids, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1996, V. 34, P. 17-22.

29. O'Leary R.M., B. O'Connor. Identification and localization of a synaptosomal membrane prolyl endopeptidase from bovine brain, Eur. J. Biochem., 1995, V. 227, P. 277-283.

30. O'Leary R.M., Gallagher S.P., O'Connor B. Purification and characterization of a novel membrane-bound form- of prolyl endopeptidase from bovine brain, Int: J. Biochem. Cell Biol., 1996, V. 28, P. 441-449.

31. Kimura A., Yoshida I., Takagi N., Takahashi T. Structure and localization of the mouse prolyl oligopeptidase gene, J. Biol. Chem., 1999, V. 274, P. 24047-24053.

32. Brandt I., Scharpe S., Lambeir A.M. Suggested functions for prolyl oligopeptidase: a puzzling paradox, Clin Chim Acta, 2007, V.377, P. 50-61.

33. Atack J.R., Suman-Chauhan N., Dawson G., Kulagowski J.J. In vitro and in vivo inhibition of prolyl endopeptidase, Eur. J. Pharmacol., 1991, V. 205, P. 157-163:

34. Schulz I., Zeitschel U., Rudolph Т., Ruiz-Carrillo D., Rahfeld J.-U., Gerhartz В., Bigl V., Demuth H.-U., Robner S. Subcellular localization suggests novel functions for prolyl endopeptidase in protein secretion, J. Neurochem., 2005, V. 94, P. 970-979.

35. Shewry P.R., Tatham A.S. The prolamin storage proteins of cereal seeds: structure and evolution. Biochem. J., 1990, V. 267, P. 1-12.

36. Shewry P:R., Halford N.G. Cereal seed storage proteins: structures, properties and role in grain utilization. J. Exp. Botany, 2002, V. 53, P. 947-958.

37. Shan L., Molberg O., Parrot I., Hausch F., Filiz F., Gray G.M., Sollid L.M., Khosla C. Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue, Science, 2002, V. 297, P. 22752279.

38. Piper J.L., Gray G.M., Khosla C. Effect of Prolyl Endopeptidase on Digestive-Resistant Gliadin Peptides in Vivo, J. Pharm. Exp. Ther., 2004, V. 311, P. 213-219.

39. Shan L., Qiao S.W., Arentz-Hansen H., Molberg O., Gray G.M., Sollid L.M., Khosla C. Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implications for celiac sprue, J. Proteome Res., 2005, V. 4, P. 1732-1741.

40. Marti Т., Molberg O., Li Q., Gray G.M., Khosla C., Sollid L.M. Prolyl endopeptidase-mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten: chemical and immunological characterization. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005, V. 312, P. 19-26.

41. Khosla C., Gray G.M., Sollid L.M. Putative efficacy and dosage of prolyl endopeptidase for digesting and detoxifying gliadin peptides, Gastroenterology, 2005, V. 129, P. 1362-1363.

42. Siegel M., Bethune M.T., Gass J., Ehren J., Xia J., Johannsen A., Stuge T.B., Gray G.M., Lee P.P., Khosla C. Rational design of combination enzyme therapy for celiac sprue, Chem. Biol., 2006, V. 13, P. 649-658.

43. Gass J., Vora H., Bethune M.T., Gray G.M., Khosla C. Effect of barley endoprotease EP-B2 on gluten digestion in the intact rat, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2006, V. 318, P. 1178-1186.

44. Erickson R.H., Bella A.M., Brophy E.J., Kobata A., Kim Y.S. Purification and molecular characterization of rat intestinal brush border membrane dipeptidyl aminopeptidase IV, Biochim. Biophys. Acta, 1983, V. 756, P. 258-265.

45. Brownlees J;, Williams. C.H., Brennan G.P:, Halton D.W. Purification and immunochemical studies of dipeptidyl peptidase IV from bovine kidney, Bioll Ghem. Hoppe Seyler, 1992, V. 373, P. 911-914.

46. Buckley S.J., Collins P.J., O'Conner B.F. The purification, and characterization of novel dipeptidyl peptidase IV-like activity from bovine serum, Int. J. Biochem. Cell Biol., 2004, V. 36, P. 1281-1296.

47. Peters I;D., Rancourt D:E., Davies P.L., Walker V.K. Isolation and characterization of an antifreeze protein precursor, from transgenic Drosophila: evidence ; for partial processing, Biochim. Biophys. Acta, 1993, V. 1171, P. 247-254.

48. Davy A., Thomsen K.K., Juliano М.А., Alves L.C., Svendsen I., Simpson D.J. Purification and Characterization of Barley Dipeptidyl Peptidase IV, Plant Physiology, 2000, V. 122, P. 425-431.

49. Kabashima Т., Yoshida Т., Ito К., Yoshimoto Т. Cloning, sequencing, and expression of the dipeptidyl peptidase IV gene from Flavobacterium meningosepticum in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys., 1995, V. 320; P. 123-128.

50. Gazi M.I., Cox S.W., Clark D.T., Eley B.M. Comparison of host tissue and bacterial dipeptidyl peptidases! in human gingival crevicular fluid by analytical isoelectric focusing, Arch. Oral Biol., 1995, V. 40, P. 731-736.

51. Kyouden Т., Himeno M:, Ishikawa Т., Ohsumi Y., Kato K. Purification and characterization of dipeptidyl peptidase IV in rat liver lysosomal membranes, J: Biochem., 1992, V. Ill, P. 770-777.

52. Misumi Y., Hayashi Y., Arakawa F., Ikehara Y. Molecular cloning and sequence analysis of human dipeptidyl peptidase IV, a serine proteinase on the cell' surface. Biochim. Biophys. Acta, 1992, V. 1131, P. 333-336.

53. Jobin M.-C., Martinez G., Motard J., Gottschalk M., Grenier D. Cloning, Purification, and Enzymatic Properties of Dipeptidyl Peptidase IV from the Swine Pathogen Streptococcus suis, J. Bacteriology, 2005, V. 187, P. 795-799.

54. Rahfeld J., Schierborn M., Hartrodt В., Neubert K., Heins J. Are diprotin A (Ile-Pro-Ile) and diprotin В (Val-Pro-Leu) inhibitors or substrates of dipeptidyl peptidase IV? Biochim. Biophys. Acta, 1991, V. 1076, P. 314-316.

55. Kopcho L.M., Kim Y.B., Wang A., Liu M.A., Kirby M.S., Marcinkeviciene J. Probing prime substrate binding sites of human dipeptidyl peptidase-IV using competitive substrate approach. Arch. Biochem. Biophys., 2005, V. 436, P. 367-376.

56. Thoma R., Loffler В., Stihle M., Huber W., Ruf A., Hennig M. Structural^Basis of Proline-Specific Exopeptidase Activity as Observed in Human Dipeptidyl Peptidase-IV Structure, 2003, V. 11, P. 947-959.

57. Rasmussen H.B., Branner S., Wiberg F.C., and Wagtmann, N. Crystal structure of human dipeptidyl peptidase IV/CD26 in complex with a substrate analog, Nat. Struct. Biol., 2003, V. 10, P. 19-25.

58. Ohkubo I., Huang K., Ochiai Y., Takagaki M., Kani K. Dipeptidyl peptidase IV from porcine seminal plasma: purification, characterization, and N-terminal amino acid sequence, J. Biochem., 1994, V.l 16, P. 1182-1186.

59. Kurktschiev D., Adler D., Subat S., Lehmann H.U., Schentke K.U. Dipeptidyl-peptidase IV of human lymphocytes in patients with primary biliary cirrhosis and UDCA therapy. Z. Gastroenterol., 1993, V. 2, P. 104-105.

60. Smyth M., O'Cuinn G. Dipeptidyl aminopeptidase activities of guinea-pig brain. Int. J. Biochem., 1994, V. 26, V. 913-921.

61. Jackman H.L., Tan F., Schraufnagel D., Dragovic Т., Dezso В., Becker R.P., Erdos E.G. Plasma membrane-bound and lysosomal peptidases in human alveolar macrophages, Am. J. Respir. Cell Mol Biol., 1995, V. 13, P. 196-204.

62. Ajami K., Abbott C.A., Obradovic M., Gysbers V., Kahne Т., MaCaughan G.W., Gorrell M.D. Structural requirements for catalysis, expression, and dimerization in the CD26/DPIV gene family, Biochemistry, 2003, V. 42, P. 694-701.

63. Tiruppathi C., Miyamoto Y., Ganapathy V., Leibach F.H. Genetic evidence for role of DPP IV in intestinal hydrolysis and assimilation of prolyl peptides, Am. J. Physiol., 1993, V. 265, P. G81-89.

64. Kameoka J., Tanaka Т., Nojima Y., Schlossman S. F., Morimoto C. Direct association of adenosine deaminase with a T cell activation antigen, CD26, Science, 1993, V. 261, P. 466-469.

65. Ludwig K., Fan H., Dobers J., Berger M., Reutter W., Bottcher C. 3D structure of the , CD26-ADA complex obtained by cryo-EM and single particle analysis. Biochem.

66. Biophys. Res. Commun., 2004, V. 313, P. 223-229.

67. Aertgeerts K., Ye S., Shi L., Prasad S.G., Witmer D., Chi E., Sang B.C., Wijnands R.A., Webb D.R., Swanson R.V. N-linked glycosylation of dipeptidyl peptidase IV

68. CD26): effects on enzyme activity, homodimer formation, and adenosine deaminase binding, Protein Sci., 2004, 13, 145-154.

69. Weihofen W.A, Liu J., Reutter W., Saenger W., Fan H. Crystal structure of CD26/dipeptidyl-peptidase IV in complex with adenosine deaminase reveals a highly amphiphilic interface, J. Biol. Chem., 2004, V. 279, P. 43330-43335.

70. De Meester I., Vanham G., Kestens L., Vanhoof G, Bosmans E, Gigase P, Scharpe S. Binding of adenosine deaminase to the lymphocyte surface via CD26, Eur. J. Immunol:, 1994, V. 24, P. 566-570.

71. Cheng H.C., Abdel-Ghany M., Pauli B.U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis, J. Biol. Chem., 2003, V. 278, P. 24600-24607.

72. Loster K., Zeilinger K., Schuppan D., Reutter W. The cysteine-rich region of dipeptidyl peptidase IV (CD 26) is the collagen-binding site, Biochem. Biophys.Res. Commun., 1995, V. 217, P. 341-348.

73. Busek P., Malik R., Sedo A. Dipeptidyl peptidase IV activity and/or structure homologues (DASH) and their substrates in cancer, Int. J. Biochem. Cell Biol., 2004, V. 36, P: 408-421.

74. Drucker D. J. Minireview: the glucagon-like peptides, Endocrinology, 2001, V. 142, P. 521-527.

75. Vilsboll Т., Krarup Т., Deacon C. F., Madsbad S., Hoist J.J. Reduced postprandial concentrations of intact biologically active glucagon-like peptide 1 in r type 2 diabetic patients, Diabetes, 2001, V. 50, P. 609-613.

76. Asada Y., Aratake Y., Kotani Т., Marutsuka K., Araki Y., Ohtaki S., Sumiyoshi A. Expression of dipeptidyl aminopeptidase IV activity in human lung carcinoma, Histopathology, 1993, V. 23, P. 265-270.

77. Takahashi N., Sato T. Dipeptide utilization by the periodontal pathogens Porphyromonas gingivalis,Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens and Fusobacteriumnucleatum, Oral Microbiol. Immunol., 2002, V. 17, P. 50-54.

78. Fukasawa K., Fukasawa K.M., Hiraoka B.Y., Harada M. Purification and properties of. dipeptidyl peptidase II from rat kidney, Biochim. Biophys. Acta, 1983, V. 745, P. 611.

79. Lynn K.R. The isolation and some properties of dipeptidyl peptidases II andTIIfrom porcine spleen, Int. J. Biochem., 1991, V. 23, P. 47-50.

80. Eisenhauer D.A., McDonald J.K. A novel dipeptidyl peptidase II from the porcine ovary. Purification and characterization of a lysosomal serine protease showing enhanced specificity for prolyl bonds, J. Biol. Chem., 1986, V. 261, P. 8859-8865.

81. Sakai Т., Kojima K., Nagatsu T. Rapid chromatographic purification of dipeptidyl-aminopeptidase II from human kidney, J. Chromatogr., 1987, V. 416, P. 131-137.

82. Bogitsh B.J., Dresden M.H. Fluorescent histochemistry of acid proteases in adult Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum, J'. Parasitol.,.1983, V. 69, P. 106110.

83. Bogitsh В J. Haematoloechus medioplexus: light and electron microscope localization of dipeptidyl aminopeptidases I and II in the gastrodermis, Exp. Parasitol., 1985, V. 59, P. 300-306.

84. Choi W.S., Fu Q., Jones Т.Н. Purification and characterization of a novel dipeptidyl peptidase from Dictyostelium discoideum, Biochem. Mol. Biol. Int., 1999, V. 47, P. 455-464.

85. Murao S., Kitade Т., Oyama H., Shin T. Isolation and characterization of a dipeptidyl aminopeptidase from Streptomyces sp. WM-23, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1994, V. 58, P. 1545-1546.

86. White B.A., Clewell D.B. Identification and partial purification of a dipeptidyl aminopeptidase from Streptococcus faecalis, J. Gen. Microbiol., 1986, V. 132, P. 1269-1276.

87. Maes M.-B., Scharpe S., De Meester I. Dipeptidyl peptidase II (DPPII), a review, Clinica Chimica Acta, 2007, V. 380. P. 31-49.

88. Huang K., Takagaki M., Kani K., Ohkubo I. Dipeptidyl peptidase II from porcine seminal plasma: purification, characterization, and its homology to granzymes, cytotoxic cell proteinases (CCP1-4), Biochim. Biophys. Acta, 1996, V. 1290, P. 149156.

89. Stockel-Maschek A., Mrestani-Klaus C., Stiebitz В., Demuth H., Neubert K. Thioxo amino acid pyrrolidides and thiazolidides: new inhibitors of proline specific peptidases, Biochim. Biophys. Acta, 2000, V. 1479, P. 15-31.

90. Sentandreu M.A., Toldra F. Partial purification and characterisation of dipeptidyl peptidase II from porcine skeletal muscle, Meat Sci., 2001, V. 57, P. 93-103.

91. Mentlein R., Struckhoff G. Purification of two dipeptidyl aminopeptidases II from rat brain and their action on proline-containing neuropeptides, J. Neurochem., 1989, V. 52, P. 1284-1293.

92. Fukasawa K.M., Fukasawa К., Higaki К., Shiina N., Ohno M., Ito S., Otogoto J., Ota N. Cloning and functional expression of rat kidney dipeptidyl peptidase II, Biochem. J, 2001, V. 353, P. 283-290.

93. Chiravuri M., Lee H., Mathieu S.L., Huber B.T. Homodimerization via a leucine zipper motif is required for enzymatic activity of quiescent cell proline dipeptidase, J. Biol. Chem., 2000, V. 275, 26994-26999.

94. Gossrau R., Lojda Z. Study on dipeptidylpeptidase II (DPP II), Histochemistry, 1980, V. 70, P. 53-76.

95. Sannes P.L., McDonald J.K., Allen R.C., Spicer S.S. Cytochemical localization and biochemical characterization of dipeptidyl aminopeptidase II in macrophages and mast cells, J. Histochem. Cytochem., 1979, V. 27, P. 1496-1498.

96. Imai K., Hama Т., Kato T. Purification and properties of rat brain dipeptidyl aminopeptidase, J Biochem., 1983, V. 93, P. 431-437.

97. Smid J.R., Monsour P.A., Rousseau E.M., Young W.G. Cytochemical localization of dipeptidyl peptidase II activity in rat incisor tooth ameloblasts, Anat. Rec., 1992, V. 233, P. 493-503.

98. Ito M., Yoshida M., Karasawa N. Immunohistochemical distribution of DAP II and tyrosine hydroxylase in the rat brain, Biog. Amines, 1986, V. 3, P. 267-277.

99. Fujita K., Hagihara M., Nagatsu Т., Iwata H., Miura T. The activity of dipeptidyl peptidase II and dipeptidyl peptidase IV in mice immunized with type II collagen, Biochem. Med. Metab. Biol., 1992, V. 48, 227-234.

100. Hagihara M., Mihara R., Toagri A., Nagatsu T. Dipeptidyl-aminopeptidase II in human cerebrospinal fluid: changes in patients with Parkinson's disease, Med. Metab. Biol., 1987, V. 37, P. 360-365.

101. Klener P., Lojda Z., Haber J., Kvasnicka J. Possible prognostic significance of the assessment of dipeptidylpeptidase II in peripheral ; blood lymphocytes of patients with chronic lymphocytic leukemia, Neoplasma^ 1987, V. 34, P. 581-586.

102. Mantle D. Characterization of dipeptidyl and tripeptidyl aminopeptidases in human kidney soluble fraction. Clin. Chim. Acta, 1991, V. 196, P. 135-142.

103. Odya C.E.; Marinkovic D.V.; Hammon K.J.; Stewart T.A.; Erdos E.G.; Purification and properties of procarboxypeptidase (angiotensinase C) from human kidney, J. Biol. Chem., 1978, V. 253, P: 5927-5931.

104. Tan F;, Morris P.W., Skidgel R.A., Erdos E.G. Sequencing and cloning of human prolylcarboxypeptidase (angiotensinase C). Similarity to both serine carboxypeptidase and prolylendopeptidase families, J. Biol. Chem., 1993, V. 268, P; 16631-16638.

105. Kakimoto Т., Oshima G., Yeh H.S.J;, Erdos E.G., Purification! of lysosomal prolycarboxypeptidase. angiotensinase C, Biochim. Biophys. Acta, 1973, V. 302, P; 178-182. /л

106. Suzawa- Y., Hiraoka B.Y., Harada M., Deguchi T. High-performance, liquid chromatographic determination of prolylcarboxypeptidase activity in monkey kidney, J. Chromatogr. В Biomed. Appl., 1995, V. 670, P. 152-156.

107. Suga K., Ito K., Tsuru D., Yoshimoto T. Prolylcarboxypeptidase (angiotensinase C): purification and characterization of the enzyme from Xanthomanas maltophilia, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1995, V, 59, P. 298-301.

108. Shariat-Madar. Z., Mahdi F., Schmaier A.H. Recombinant prolylcarboxypeptidase activates plasma prekallikrein, Blood, 2004, V. 103, P. 4554-4561.129: Rawlings N.D., Barrett A.J. Families of serine peptidases, Methods Enzymol., 1994, V. 244, P. 19-61.

109. Kumamoto K., Stewart T.A., Johnson: A.R., Erdos E.G. Prolylcarboxypeptidase (angiotensinase C) in human cultured cells, J. Clin. Invest., 1981, V. 67, P. 210-215.

110. Skidgel R.A., Wickstrom F., Kumamoto K., Erdos E.G. Rapid radioassay for prolylcarboxypeptidase (angiotensinase C), Anal. Biochem., 1981, V. 118, P. 113-119.

111. Yang H.Y.T., Erdos E.G., Chiang T.S. New enzymatic route for the inactivation of angiotensin, Nature, 1968, V. 218, P. 1224-1226.

112. Odya C.E., Erdos E.G. Human.procarboxypeptidase, Methods Enzymol., 1981, V. 80, P. 460-466.

113. Skidgel R.A., Jackman H.L., Erdos E.G. Metabolism of substance P and bradykinin by human neutrophils, Biochem. Pharmacol., 1991, V. 41, P. 1335-1344.

114. Skidgel R.A., Erdos E.G. Cellular carboxypeptidases, Immunol. Rev., 1998, V. 161, P. 129-141.

115. Duff J.L., Marrero M.B., Paxton W.G., Schieffer В., Bernstein K.F., Berk B.C. Angiotensin II signal transduction and the mitogen-activated protein kinase pathway, Cardiovasc. Res., 1995, V. 30, P. 511-517.

116. Li P., Chappell M.C., Ferrario C.M., Brosnihan K.B. Angiotensin-(1-7) augments bradykinininduced vasodilation by competing with ACE and releasing nitric oxide, Hypertension, 1997, V. 29, P. 394-400.

117. Moreira C.R., Schmaier A.H., Mahdi F., da Motta G., Nader H.B., Shariat-Madar Z. Identification of prolylcarboxypeptidase as the cell matrix-associated prekallikrein activator. FEBS Lett., 2002, V. 523, P. 167-170.

118. Lopez M., Edens L. Effective prevention of chill-haze in beer using an acid proline- • specific endoprotease from Aspergillus niger, J. Agric. Food Chem., 2005, V. 53, P. 7944-7949.

119. Edens L., Dekker P., van der Hoeven R., Deen F., de Roos A., Floris R. Extracellular prolyl endoprotease from Aspergillus niger and its use in the debittering of protein hydrolysates, J. Agric. Food Chem., 2005, V. 53, P. 7950-7957.

120. Augustyns K., Borloo M., Belyaev A., Rajan P., Goossens F., Hendriks D., Scharpe S., Haemers A. Synthesis of peptidyl acetals as inhibitors of prolyl endopeptidase, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, V. 5, P. 1265-1270.

121. Li J., Wilk E., Wilk S. Inhibition of prolyl oligopeptidase by Fmoc-aminoacylpyrrolidine-2-nitriles. J. Neurochem., 1996, V. 66, P. 2105-2112.

122. Mitea С., Havenaar R., Drijfhout J.W., Edens L., Dekking L., Koning F. Efficient degradation of gluten by a prolyl endoprotease in a gastrointestinal model: implications for coeliac disease, Gut, 2008, V. 57, P. 25-32.

123. Yoshimoto Т., Tsuru D. Proline iminopeptidase from Bacillus coagulans: purification and enzymatic properties, Biochem, 1985, V. 97, P. 1477-1485.

124. Albertson N.H., Koomey M. Molecular cloning and characterization of a proline iminopeptidase gene from'Neisseria gonorrhoeae, Mol. Microbiol., 1993, V. 9, P. 1203-1211.

125. Alonso J., Garcia J.L, Proline iminopeptidase gene from Xanthomonas campestris pv. citri, Microbiology, 1996, V. 142, P. 2951-2957.

126. Bolumar Т., Sanz Y., Aristoy M.C., Toldra F. Purification and characterization of a prolyl aminopeptidase from Debaryomyces hansenii, Appl. Environ. Microbiol., 2003, V. 69, P. 227-232.

127. Basten D.E., Moers A.P., Ooyen A J., Schaap P.J. Characterisation of Aspergillus niger prolyl aminopeptidase, Mol. Genet. Genomics, 2005, V. 272, P. 673-679.

128. Sattar A.K.M.A., Yoshimoto Т., Tsuru D. Purification and characterization of proline iminopeptidase from Lyophyllum cinerascens, J. Ferment. Bioeng, 1989, V. 68, P. 178-182.

129. Hiwatashi K., Hori K., Takahashi K., Kagaya A., Inoue S., Sugiyama Т., Takahashi S. Purification and characterization of a novel prolyl aminopeptidase from Maitake (Grifola frondosa), Biosci. Biotechnol. Biochem., 2004, V. 68, P. 1395-1397.

130. Ninomiya K., Tanaka S., Kawata S., Ogata F., Makisumi S. Substrate specifictiy of a proline iminopeptidase from apricot seeds, Agric. Biol. Chem., 1983, V. 47, P. 629630.

131. Nordwig A., Mayer H. The cleavage of prolyl peptides by kidney peptidases. Detection of a new peptidase capable of removing N-terminal praline, Hoppe Seylers Z Physiol. Chem., 1973, V. 354, P. 380-383.

132. Khilji M.A., Bailey G.S. The purification of a bovine kidney enzyme which cleaves melanocyte-stimulating hormone-release inhibiting factor, Biochim. Biophys. Acta, 1978, V. 527, P. 282-328.

133. Turzynski A., Mentlein R. Prolyl aminopeptidase from rat brain and kidney. Action on peptides and identification as leucyl aminopeptidase, Eur. J. Biochem., 1990, V. 190, P. 509-515.

134. Matsushima M., Takahashi Т., Ichinose M., Miki К., Kurokawa К., Takahashi К. Structural and immunological evidence for the identity of prolyl aminopeptidase with leucyl aminopeptidase, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, V. 178, P. 14591464.

135. Kitazono A., Yoshimoto Т., Tsuru D. Cloning, sequencing, and high expression of the proline iminopeptidase gene from Bacillus coagulans, J. Bacteriol., 1992, V. 174, P. 7919-7925.

136. Gobbetti M., Smacchi E., Semeraro M., Fox P.F., Lanciotti R., Cogan T. Purification and characterization of an extracellular proline iminopeptidase from Corynebacterium variabilis NCDO 2101, J. Appl. Microbiol., 2001, V. 90, P. 449-456.

137. Yoshimoto Т., Kabashima Т., Uchikawa K., Inoue Т., Tanaka N., Nakamura K.T., Tsuru M., Ito K. Crystal structure of prolyl aminopeptidase from Serratia marcescens, J. Biochem., 1999, V. 126, P. 559-565.

138. Medrano F.J., Alonso J., Garcia J.L., Romero A., Bode W., Gomis-Ruth F.X. Structure of proline iminopeptidase from Xanthomonas campestris pv. citri: a prototype for the prolyl oligopeptidase family, EMBO J., 1998, V. 17, P. 1-9.

139. Ito K., Inoue Т., Kabashima Т., Kanada M., Huang H.S., Ma X.H., Azmi N., Azab E., Yoshimoto T. Substrate recognition mechanism of prolyl aminopeptidase from Serratia marcescens, J. Biochem., 2000, V. 128, P. 673-678.

140. Tamura Т., Tamura N., Lottspeich F., Baumeister W. Tricorn protease (TRI) interacting factor 1 from Thermoplasma acidophilum is a proline iminopeptidase, FEBS Lett., 1996, V. 398, P. 101-105.

141. Carnio M.C., Eppert I., Scherer S. Analysis of the bacterial surface ripening flora of German and French smeared cheeses with respect to their anti-listerial potential, Int. J. Food Microbiol., 1999, V. 47, P. 89-97.

142. Rusu I., Yaron A. Aminopeptidase P from human leukocytes, Eur. J. Biochem., 1992, V. 210, P. 93-100.

143. Ryan J.W., Valido F., Benyer P., Chung A.Y., Ripka J.E. Purification and characterization of guinea pig serum aminoacylproline hydrolase (aminopeptidase P), Biochim. Biophys. Acta, 1992, V. 1119, P. 140-147.

144. Simmons W.H., Orawski A.T. Membrane-bound aminopeptidase P from bovine lung. Its purification, properties, and degradation of bradykinin, J. Biol. Chem., 1992, V. 267, P. 4897-903.

145. Simmons W.H., Orawski A.T. Purification and properties of membrane-bound aminopeptidase P from rat lung, Biochemistry, 1995, V. 34, P. 11227-11236.

146. Bhargava S., Kulkarni G.V., Deobagkar D.D., Deobagkar D.N. Distribution of aminopeptidase P like immunoreactivity in the olfactory system and brain of frog, Microhyla ornate, Neurosci. Lett., 2006, V. 396, P. 81-85.

147. Laurent V., Brooks D.R., Coates D., Isaac R.E. Functional expression and characterization of the cytoplasmic aminopeptidase P of Caenorhabditis elegans, Eur. J. Biochem., 2001, V. 268, P. 5430-5438.

148. Kulkarni G.V., Deobagkar D.D. A cytosolic form of aminopeptidase P from Drosophila melanogaster: molecular cloning and characterization, J. Biochem., 2002, V. 131, P. 445-452.

149. Hauser F., Strassner J., Schaller A. Cloning, Expression, and Characterization of Tomato (Lycopersicon esculentum) Aminopeptidase P, J. Biol. Chem., 2001, V. 276, P. 31732-31737.

150. Yoshimoto Т., Tone H., Honda Т., Osatomi K., Kobayashi R., Tsuru D. Sequencing and high expression of aminopeptidase P gene from Escherichia coli HB101, J. Biochem., 1989, V. 105, P. 412-416.

151. Arima J., Uesugi Y., Iwabuchi M., Hatanaka T. Streptomyces aminopeptidase P: biochemical characterization and insight into the roles of its N-terminal domain, Protein Eng. Des. Sel., 2008, V. 21, P. 45-53.

152. Yoshimoto Т., MurayamaN., Honda Т., Tone H:, Tsuru D. Cloning and expression of aminopeptidase P gene from Escherichia coli HB101 and characterization of expressed enzyme, J. Biochem., 1988, V. 104, P. 93-97.

153. Harbeck H.T., Mentlein R. Aminopeptidase P from rat brain. Purification and action on bioactive peptides, Eur. J. Biochem., 1991, V. 198, P. 451-458.

154. Vanhoof G., De Meester I., Goossens F., Hendriks D., Scharpe S., Yaron A. Kininase activity in human platelets: cleavage of the Argl-Pro2 bond of bradykinin by aminopeptidase P, Biochem. Pharmacol., 1992, V. 44, P. 479-487.

155. Hooper N.M., Hryszko J., Turner A J. Purification and characterization of pig kidney aminopeptidase P. A glycosyl-phosphatidylinositol-anchored ectoenzyme, Biochem. J., 1990, V. 267, P. 509-515.

156. Prechel M.M., Orawski A.T., Maggiora L.L., Simmons W.H. Effect of a new aminopeptidase P inhibitor, apstatin, on bradykinin degradation in the rat lung, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1995, V. 275, P. 1136-1142.

157. Maggiora L.L., Orawski A.T., Simmons W.H. Apstatin analogue inhibitors of aminopeptidase P, a bradykinin-degrading enzyme, J. Med. Chem, 1999, V. 42, P. 2394-2402.

158. Yoshimoto Т., Orawski A.T., Simmons W.H. Substrate specificity of aminopeptidase P from Escherichia coli: comparison with membrane-bound forms from rat and bovine lung, Arch. Biochem. Biophys., 1994, V. 311, 28-34.

159. Orawski' A.T., Simmons W.H. Purification and properties of membrane-bound aminopeptidase P from rat lung, Biochemistry, 1995, V. 34, P. 11227-11236.

160. Wilce M.C.J., Bond C.S., Dixon N.E., Freeman H.C., Guss J.M., Lilley P.E., Wilce J.A. Structure and mechanism of a proline-specific aminopeptidase from Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, V. 95, P. 3472-3477.

161. Graham S.C., Maher M.J., Simmons W.H., Freeman H.C., Guss J.M. Structure of Escherichia coli aminopeptidase P in complex with the inhibitor apstatin, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2004, V. 60, P. 1770-1779.

162. Graham S.C., Bond C.S., Freeman H.C., Guss J.M. Structural and functional implications of metal ion selection in aminopeptidase P, a metalloprotease with aIdinuclear metal center, Biochemistry, 2005, V. 44, P. 13820-13836.

163. Lowther W. Т., Matthews B. W. Metalloaminopeptidases: common functional themes in disparate structural surroundings, Chem. Rev., 2002, V. 102, P. 4581-4607.

164. D'Souza V.M., Bennett В., Copik A.J., Holz R.C. Divalent metal binding properties of the methionyl aminopeptidase from Escherichia coli, Biochemistry, 2000, V. 39, P. 3817-3826.

165. Cottrell G.S., Hooper N.M., Turner A.J. Cloning, expression, and characterization of human cytosolic aminopeptidase P: a single manganese(II)-dependent enzyme, Biochemistry, 2000, V. 39, P. 15121-15128.

166. Cosper N.J., D'Souza V.M., Scott R.A., Holz R.C. Structural evidence that the methionyl aminopeptidase from Escherichia coli is a mononuclear metalloprotease, Biochemistry, 2001, V. 40, P. 13302-13309.

167. Lasch J., Koelsch R., Steinmetzer Т., Neumann U., Demuth H.-U. Enzymic properties of intestinal aminopeptidase P: a new continuous assay, FEBS Lett., 1988, V. 227, P. 171-174.

168. Linz W., Wiemer G., Gohlke P., Unger Т., Scholkens B.A. Contribution of kinins to the cardiovascular actions of angiotensin-converting enzyme inhibitors, Pharmacol. Rev., 1995, V. 47, P. 25-49.

169. Hendriks D., De Meester I., Umiel Т., Vanhoof G., van Sande M., Scharpe S., Yaron A. Aminopeptidase P and dipeptidyl peptidase IV activity in human leukocytes and in stimulated lymphocytes, Clin. Chim. Acta, 1991, V. 196, P. 87-96.

170. Kitamura S., Carbini L.A., Carretero O.A., Simmons W.H., Scicli A.G. Potentiation by aminopeptidase P of blood pressure response to bradykinin, Br. J. Pharmacol., 1995, V. 114, P. 6-7.

171. Yoshimoto Т., Matsubara F., Kawano E., Tsuru D. Prolidase from bovine intestine: purification and characterization, J. Biochem., 1983, V. 94, P. 1889-1896.

172. Browne P., O'Cuinn G. The purification and characterization of a proline dipeptidase from guinea pig brain, J. Biol. Chem., 1983, V. 258, P. 6147-6154.

173. Ни M., Cheng Z., Zheng L. Functional and Molecular Characterization of Rat Intestinal Prolidase, Pediatr. Res., 2003, V. 53, P. 905-914.

174. Suga К., Kabashima Т., Ito К., Tsuru D., Okamaura H., Katoaka J., Yoshimoto T. Prolidase from Xanthomonas maltophilicr. purification and characterization of the enzyme, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1995, V. 59, P. 2087-2090.

175. Ohhashi Т., Ohno Т., Arata J., Sugahara K., Kodama H. Characterization of prolidase I and II from erythrocytes of a control, a patient with prolidase deficiency and her mother, Clin. Chim. Acta, 1990, V. 187, P. 1-10.

176. Liu G., Nakayama K., Awata S., Tang S., Kitaoka N., Manabe M., Kodama H. Prolidase isoenzymes in the rat: their organ distribution, developmental change and specific inhibitors, Pediatr. Res., 2007, V. 62, P. 54-59.

177. Myara I. Effect of long preincubation on the two forms of human erythrocyte prolidase, Clin. Chim. Acta, 1987, V. 170, P. 263-270.

178. Mock W.L., Green P.C., Boyer K.D. Specificity and pH dependence for acylproline cleavage by prolidase, J. Biol. Chem., 1990, V. 265, P. 19600-19605.

179. Butterworth J., Priestman D. Substrate specificity of manganese-activated prolidase in control and prolidase-deficient cultured skin fibroblasts, J. Inherit. Metab. Dis., 1984, V. 7, P. 32-34.

180. Maher MJ.1, Ghosh M., Grunden A.M., Menon A.L., Adams M.W., Freeman H.C., Guss J.M. Structure of the prolidase from Pyrococcus furiosus, Biochemistry, 2004, V. 43, P. 2771-2783.

181. Der Kaloustian V.M., Freij В J., Kurban A.K. Prolidase deficiency: an inborn error of metabolism with major dermatological manifestations, Dermatologica, 1982, V. 164, P. 293-304.

182. Tanoue A., Endo F., Matsuda I. Structural organization of the gene for human prolidase (peptidase D) and demonstration of a partial gene deletion in a patient with prolidase deficiency, J. Biol. Chem., 1990, V. 265, P. 11306-11311.

183. Tanoue A., Endo F., Awata H., Matsuda I. Abnormal mRNA and inactive polypeptide in a patient with prolidase deficiency, J. Inherit. Metab. Dis., 1991; V. 14, P. 777-782.

184. Maxwell S.A., Rivera A. Proline oxidase induces apoptosis in tumor cells, and its expression is frequently absent or reduced in renal carcinomas, J. Biol. Chem., 2003, V. 278, P. 9784-9789.

185. Davis C., Smith E.L. Partial purification and specificity of iminodipeptidase, J. Biol. Chem., 1953, V. 200, P. 373-384.

186. Mayer H., Nordwig A. The cleavage of prolyl peptides by kidney peptidases. Purification of iminodipeptidase (prolinase), Z. Physiol. Chem., 1973, V. 354, P. 371379.

187. Akrawi A.F., Bailey G.S. Purification and specificity of prolyl dipeptidase from bovine kidney, Biochim. Biophys. Acta, 1976, V. 422, P. 170-178.

188. Priestman D.A., Butterworth J. Prolinase and non-specific dipeptidase of human kidney, Biochem. J., 1985, V. 231, P. 689-694.

189. Lenney J.F. Human cytosolic carnosinase: evidence of identity with prolinase, a nonspecific dipeptidase, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1990, V. 371, P. 167-171.

190. Lenney J.F. Separation and characterization of two carnosine-splitting cytosolic dipeptidases from hog kidney (carnosinase and non-specific dipeptidase), Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1990, V. 371, P. 433-440.

191. Das M, Radhakrishnan A.N. Glycyl-L-leucine hydrolase, a versatile 'master' dipeptidase from monkey small intestine, Biochem J., 1973, V. 135, P. 609-615.

192. Plancot M.T., Han K.K. Purification and characterization of an intracellular dipeptidase from Mycobacteriumphlei, Eur. J. Biochem., 1972, V. 28, P. 327-333.

193. Lenney J.F., Peppers S.C., Kucera-Orallo C.M., George R.P. Characterization of human tissue carnosinase, Biochem. J., 1985, V. 228, P.653-660.

194. Peppers S.C., Lenney J.F. Bestatin inhibition of human tissue carnosinase, a nonspecific cytosolic dipeptidase, Biol. Chem. Hoppe Seyler, 1988, V. 369, P. 1281-1286.

195. Kunze N., Kleinkauf H., Bauer K. Characterization of two carnosine-degrading enzymes from rat brain. Partial purification and characterization of a carnosinase and a beta-alanyl-arginine hydrolase, Eur. J. Biochem., 1986, V. 160, P. 605-613.

196. Wang W., Liu G., Yamashita K., Manabe M., Kodama H. Characteristics of prolinase against various iminodipeptides in erythrocyte lysates from a normal human and a patient with prolidase deficiency, Clin. Chem. Lab. Med., 2004, V. 42, P. 1102-1108.

197. Rowsell S., Pauptit R.A., Tucker A.D., Melton R.G., Blow D.M., Brick P. Crystal structure of carboxypeptidase G2, a bacterial enzyme with applications in cancer therapy, Structure, 1997, V. 5, P. 337-347.

198. Nagai K., Niijima A., Yamano Т., Otani H., Okumura N., Tsuruila N., Nakai M., Kiso Y. (2003) Possible role of Lcarnosine in the regulation of blood glucose through controlling autonomic nerves. Exp. Biol. Med., V. 228, P. 1138-1145.

199. Imai K., Nagatsu Т., Yajima Т., Maeda N., Kumegawa M., Kato T. Developmental changes in the activities of prolinase and prolidase in rat salivary glands, and the effect of thyroxine administration, Mol. Cell. Biochem., 1982, V. 42, P. 31-36.

200. Miech G., Myara I., Mangeot M., Voigtlander V., Lemonnier A. Prolinase activity in prolidase-deficient fibroblasts, J. Inherit. Metab. Dis., 1988, V. 11, P. 266-269.

201. Dehm P., Nordwig A. The cleavage of prolyl peptides by kidney peptidases. Partial purification of an "X-prolyl-aminopeptidase" from swine kidney microsomes, Eur. J. Biochem., 1970, V. 17, P. 364-371.

202. Hedeager-Sorensen S., Kenny A.J. Proteins of the kidney microvillar membrane. Purification and properties of carboxypeptidase P from pig kidneys, Biochem. J., 1985, V. 229, P. 251-257.j