Синтез и изучение мембранотропных свойств дейтериймеченых пролинсодержащих липопептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГБ ОД

2 8 АВГ 1995

На правах рукописи

ИСХАКОВА ФЛОРА ХАНИФОВНА

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ МЕМБРАНОТРОПНЫХ СВОЙСТВ ДЕЙТЕРИЙМЕЧЕНШ ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ЛИ ТОПЕПТИДОВ.

02.00.10- Биоорганическая хими" оных и

физиологически актив! 03.00.23 - Биотехнология.

3

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1995 г.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Звошсова Е.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Преображенская М.Н. Шибнев В.А.

Ведущая организация: Всероссийский кардиологический научный центр РАМН

на заседании диссертационного совета Д 063.41.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.ВЛомоносова по адресу: 117571, г.Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ по адресу: 119831, г.Москва, ул.М.Пироговская, 1. -

Защита состоится

// 1995 г в /Г",

часов

Автореферат разослан "

и

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Среди 20 природных аминокислот пролин является единственной генетически кодируемой аминокислотой, в которой а-атом азота включен в жесткое пятичленное. кольцо. Эта особенность структуры обуславливает уникальную функциональную роль пролина в пептидах н белках. Как правило, пирролидиновое кольцо пролина не является плоским и его конформация непосредственно связана с цис и т/кгмс-конфигурашей пептидной Х-Рго-саязи. Цис-транс-иэомеризация вокруг пролиновой пептидной связи влияет на кинетику сворачивания глобулярных белков в третичную структуру, определяет взаимодействие ряда пролин-содержащий белков с мембранами в процессе функционирования. Важность данного перехода подтверждается повсеместным распространением во всех клетках пептидил-пролил-до-лпроде-изомеразы, которая катализирует изомеризацию связи Х-Рго в пептидах и белках.

Эт факт объясняют интерес исследователей к гтролинсодержащим пептидам, особенно коротким (до 3 аминокислотных остатков), так кис они являются хорошим инструментом для изучения взаимосвязи структура - функция. Среди подобных пептидов особое место занимают те, что содержат фрагменты Рго-ЗДу и Фу-Рто. Рго-в1у является основным структурным элементом 0-поворота при формировании пространственной структуры белков. Вместе с остатками ароматических гидрофобных аминокислот РИе й Тут фрагменты Рго-01у и 01у-Рго образуют трипетндные последовательности, частовстречакнциеся в составе природных биологически активных пептидов, например брадикинйна и р-казоморфина, взаимодействующих с мембранами. . ■'

В последние годы модификациябиологически активных пептидоввысшимали-фатическим остатком по С- или по Ы-концу часто используется как целенаправленный

прием для того, чтобы пролонгировать действие этих пептидов н применять их в меньших концентрациях и с большей эффективностью. Кроме того, обнаружено, что соединения общей формулы

^y-COORj

где Rj или R2 являются высшими алифатическими остатками, облегчают проникновение через кожу и увеличивают в 2-20 раз поглощение активных лекарственных ингредиентов (антибиотиков, диуретиков, противовоспалительных, антигипертензивных, психонейротропных препаратов и пр.) По-видимому, эта структура, а также ее потенциальные цис-транс конформационные переходы при различных условиях и окружении лежат в основе механизма синергического действия этого препарата.

В связи с этим представлялось весьма актуальным разработать пути синтетического получения 1 N-стеароильных и О-октадециловых производных гидрофобных пептидов, содержащих фрагменты Pro-Gly и Gly-Pro, оценить их поведение в модельных мембранных структурах, исследовать их конформационные свойства в хлороформе в качестве первого приближения к амфифильной среде модельного фосфатидилхоли-нового бислоя и дать количественную оценку соотношения конформеров синтезированных соединений в равновесном состоянии.

Представленная работа является частью фундаментальных научных исследований, проводимых в МИТХТ им. М.В. Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме 13-866 "Конструирование лекарственных и диагностических препаратов с использованием принципов организации и функционирования биологических 'мембран" ( номер государственной регистрации 01.87.0010337).

Цель работы: Разработка удобных методов синтеза гидрофобных пептидов, содержанок фрагменты Pro-Gly и Gly-Pro, их N-стеароильных и О-октадециловых производных, а также их дейтерированных аналогов, изучение их конформационных свойств методами 'Н- и 13С- ЯМР-спектроскопии и методами компьютерного моделирования. Количественная оценка соотношения конформеров . синтезированных соединений в равновесном состоянии; изучение зависимости этого соотношения от структуры соединения (местоположения остатка Pro и места присоединения высшего алифатического остатка). Тестирование поведения синтезированных веществ в модель-

ном фосфатидилхолиновом бислое методами 31Р- и 2Н-ЯМР.

новизна ■ ираггичепИИ р«чщ>сть у»боты. Разработаны схемы синтеза и получен набор гидрофобных пролинсодержащих пептидов, модифицированных высшим алифатическим остатком (Сц) по С- или по N- концу, а также их дейтерий-меченые аналоги. Выяснено, что различия э лабильности фрагментов и связанные с этим различия в подходах к выбору защитных групп, методам синтеза и очистки Веществ уменьшаются для октаДецкловых эфиров, в отличие от N-сгеарокльных производных.

С помощью методов 'Н- и 1 *С-ЯМР-спектроскопии изучены конформацион-ные свойства синтезированных соединений в дейте рохлороформе. Установлено, что все синтезированные соединения, за исключением Вое-Pro-Gly-OAlk, существуют в виде смеси двух конформеров, отличающихся конфигурацией имидной связи Х-Pro (цио- и транс-). При этом только для одного соединения, а именно Boc-Pro-OAlk, обнаружено преобладание цдоконформера над лртю^конформером. Установлено, что равновесие между де-лдоягнеонформерами по связи Х-Рго в дейтерохлороформе смещено в сторону ¿дашр-хбнформера намного сильнее, когда X - N-сгеароильный остаток, чем когда X представляет собой остаток глицина или лфт-бутилоксикарбонильную группу, т.е. в молекул« коротких пептидов N-сгеароильный остаток оказывает большее влияние на выбор предпочтительной конформации. .

С применением методов компьютерного моделирования отобраны наиболее вероятные конформеры всех синтезированных соединений, рассчитаны их параметры и оценен вклад каждого конформера в равновесное состояние в вакууме и хлороформе. Результат, полученные расчетными и спектральными методами, хорошо согласуются между собой. '.

Смоделировано влияние сольватной воды на конформаштоннре поведение синтезированных N-стеаронльных и О-октадециловых производных гидрофобных пролин-содержаших пептидов. Обнаружено, что в результате образования сальаотироаанного соединения для структур, содержащих фрагмент Gly-Pro, возможно значительное смешение цис-/лрано-рланавссия в сторону как транс-, так и минорного ^локонформера, вплоть до его полного преобладания. Для соединений, содержащих фрагмент Рго-Gly, при образовании сольватов с водой не происходит качественного изменения состояния фк--лдамс-равновесия.

С помощью спектральных и расчетных Методов установлено, что фрагмент St-Рго является конформационно жестким. Для его трехмерной пространственной структуры характерны преимущественно /этулмоконфигурацня имидной связи и С-эндо (DOWN) конформация пирролидинового кольца. Эта конформация остается доминирующей в вакууме и в хлороформе как при увеличении длины пептидной цепи, так и при образовании сольватов с водой, а также определяет коиформацию следующего аминокислотного остатка в цепи - глицина. Большая степень вероятности предсказания пространственной структуры N-стеароильных и О-октадециловых производных коротких гидрофобных пролил содержащих пептидов делает <tx удобными инструментами для изучения взаимосвязи структура-функция.

Проведено тестирование синтезированных дейтериймеченых продинсодержащих липопептидоа на встраивание в модельный фосфатидш" "ювый бислой. Показано методами 2Н- и 31Р-ЯМР, что указанные вещества взи.шодействуют с модельной мембраной без нарушения ее бислойной организации.

На затяту рняосятся исдуюшас рйшийс врлрксвия;

1. Синтез N-стеароильных и О-октадециловых производных гидрофобных пептидов, содержащих фрагменты Gly-Pro и Pro-Gly, и их дейтериймеченых аналогов.

2. Изучение конформационных свойств синтезированных соединений методами 'Н- и ,3С-ЯМР-спекгроскопии.

3. Исследование конформационных свойств синтезированных соединений в " - . и в растворе с помощью методов компьютерного адодишррвалия.

4. Тестирование взаимодействия синтезированных соединений с. ф&сфрлшша-г ным бислоем методами 2Н- и "Р-ЯМР.

Пт&внйяпии н аиройяпия раВптя. По материалам диссертационной работы опубликованы две печатные работы. Материалы диссертации частично доложены на Всероссийской научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии" (Москва, 1993 г.).

Объем работы. Диссертационная работа наложена на страницах маши-

нописного текста, содержит рисунков, таблиц, схемы и состоит из

следующих разделов: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы, список Д1ггературы, включающий ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В качестве объектов исследования в данной работе были выбраны 1Ч-стеаро-ильные и О-октадециловые производные дипептидов О1у-Рго и Рго-С1у, трипептидов, являющихся фрагментами 0-казоморфина и брадикинина ( 01у-Рго-РЪе и РЬе-01у-Рго соответственно) и их ретропоследоватеяьностей. Поскольку в задачу работы входило изучение поведения этих пептидов в фосфолипидном бислое методами 2Н- и }|Р-ЯМР, также были синтезированы их аналоги с дейгериймечеными глицином и фе-нилаланином.

Свято Н-стежрояльжыж ■ О-отдещиових прожзаодвых

мжтяоа ■ шх деАтеуаймечевых аналогов.

Нами были синтезированы октедециловые эфиры ли- и трипептидов, содержащих фрагменты Рго-Оу и С1у-Рго (схемы 1 и 2).

В качестве постоянной защитой группы на С-конце был использован октаде-циловый эфир (А1к). Практически это привело к устранению различий в синтезе октадециловых производных дипептидов Рго-Оу и Оу-Рго и трипептидов на их основе. Как известно, подобные различия возникают вследствие большей лабильности связи Рго-О1у по сравнению со связью О1у-Рго, что приводит к побочным реакциям в процессе синтеза, удаления зашитых групп, очистки синтезированных соединений и, в конечном итоге, к снижению выхода.

Исходные октадецилоаые эфиры глицина в меченом и немеченом вариантах были приготовлены прямой этерификацией 1-октадеканодом в присутствии л-толуол-сульфоки слоты как катализатора. Октадециловый эфир доотЧутлокснкарбокилщю-лина (1) был получен по методу Позднева с использованием Вос^О. Вос^О был также применен при синтезе Вос-С1у*-0Н и Вос-РЬе*-ОН . Синтез дейтерированных производных пептидов <3, 3, За, 5а, 7, 8,10, 10а, 12, 13, 12а, 13а, 15, 18, 20, 22, 24, 26, 30) нами был осуществлен на базе полученного по известному методу пенгиейтерофенклаланина и коммерческого препарата меченного по а-углеродному атому дидейтероглицина.

Схема 1

G

Вос-Вос-

-ОН

Y-Y-Y-H-

•ОН

TT

изг

Pro

Вое • Вос-TFA-H-

(а

Номер G F V Метел ш Buxe«,

емщшеши fiearwr %

1 - - (Boc)jO 83

и . - / TFA 97

г Oly z DCC/HOBT »5

IBC WW ; n

3 Oly* г ! - 89

4 . Oly - Boc 'IBC ■•....■ 1 n 1

$ Oly» Boc IBC SO -ib •

и Olу - HBr HBr/CHjCOOH и - '. <

За. Oly* HBr HBr/CHjCOOH 90

4а Oly TFA TFA 98

5i OJy* - TFA TFA 97

* Oly Pba • DCC/HOBT «8

7 Oly* Pbe DCC/HOBT 57

1 Oly Pbe* DCC/HOBT 4S

Примечание: здесь и далее звеааочхой помечены дейтернймеченые остатки.

На стадии синтеза дипептидое успешным оказался как метод смешанных ангидридов с помощью изобутилхлоркарбоната (IBQ в присутствии N-метилморфаяина, так н дшиклогексилкарбодиимндный (DCQ метод с использованием в качестве добавки

• ' 's

1-гидроксибенэотриаэала (HOBT). Окгадсцкловый эфир глишипролина был синтезирован как в вше Вое-, так н в виде 2-производных. Бенэилоксикарбонильную защит-

Вое-Вое -Н -

-ОН

Сеема 2 Рго

Вос-Вос-Н -

■ОН

Н

9,10

9а, 10а

11-13

11а-13а

■ОА1к ■ ОА1к •ОА1к - ОА1к -ОА11с

Номер С Р Метод шш рмгмт Выход,%

9 01у - 1ВС 86

10 01у* - 1ВС 73

9ш • 01у - ТТЛ 97

1*а 01у* - ТТА 98

И 01у РЬе ОСС/НОВТ 73

и 01у* РЬе 1ЭСС/НОВТ , 68

13 01у РЬе ОСС/НОВТ 59

На 01у РИе ТТА . 93

Ш 01у* РЬе ТРА 96

13а 01у РЬе* ТТА 92

ную группу с соединений (2), (3) удалось снять лишь в достаточно жестких условиях (НВг в уксусной кислоте), попытки удалить ее мягким каталитическим гидрогенолиэом с использованием свежеприготовленного №-Яапеу не увенчались успехом даже за 24 часа, хотя у ¿-Оу-Рго-ОМе г-защита удалялась в подобных условиях за 30 мин. Поэтому во всех остальных случаях мы использовали трет-бутя-оксикарбонильную фуппу, учитывая легкость ее удаления к более высокие выходы деблокированных пептидов при обработке трифторуксусной кислотой в хлористом метилене.

На стадии получения трнпептКмС2 предпочтение было отдано БСС/ НОВТ-ме-тоду, Более низкие выходы при получении Вос-РЬе-О1у-Рго-0А1к (6) и его дейтерий-меченых аналогов (7, 8) по сравнению с Вос-РЬе-Рго-01у-ОА1к (11) и его аналогами

(12, 13) вероятно могут быть объяснены конформационнымн особенностями амино-компонекга: остаток пролина в Н-С1у-Рго-ОА1к (2а-5а) придает молекуле свернутую конформадию и, по-видимому, делает аминогруппу глицина стерически более труднодоступной, чем иминогруппа пролина в Н-Рго-С1у-ОА1к (9а,10а). '< Ы-стеароильные производные гидрофобных пролинсодержащих ди- и трипепти-дов были получены по схеме 3. Полностью защищенные дипептиды были синтезированы БСС/НО ВТ-методом, так как М-51-01у-0Ни, особенно, Ы^-Рго-ОН образуют нереакционноспособные смешанные ангидриды с изобушлугольной кислотой. N-51-С1у-Рго и ^8Ю1у*-Рго были синтезированы в вше метиловых эфиров с выходом до 46%. Ранее было установлено, что при омылении метилового эфира у Ъ-¥хо-0\у-0}Ле связь Рго-01у почти полностью гидролизустсн, а в 'Случае Z-Gly-Pгo-OMe потери, связанные с гидролизом этой связи составляют до 30 %. В нашем случае при замене Т.-защитной группы на стеароильную, удаление эфира также сопровождалось гидролизом связи 01у-Рк> и выход составил 69%. В связи с этим, №$1-Рго-01у был синтезирован в виде трет -бутилового эфира (16). Даже в этом случае происходил частичный гидролиз связи Рго-01у при увеличении времени реакции, несмотря на то, что реакция проводилась в значительно более мягких условиях удаления /доеп-бутильной защитной группы в присутствии трифгоруксусной кислоты по сравнению с условиями омыления метилового эфира. Для синтеза ^БиРго-ау^-ОН (22) и ^-БиРго-Шу-ОН (21) мы воспользовались альтернативным путем, который заключало! в присоединении И-сгеароильного остатка с помощью ^гмцроксисукцинимидного эфира стеариновой кислоты (БЮШи) к дипептидам (19, 20).° Незащищенные дипептиды получали путем удаления Вос-защитной группы с Вос-Рго-С1у-ОН (14) и Вос-Рп>-01у*-ОН (15), синтезированных методом смешанных ангидридов.

При синтезе трипешндов мы вновь обратились к ОСС/НОВТ-методу. М-Б^Рго-01у-РЬе-0Ви' (25) и К-81-Рго-01у*-РЬе-0Ви' (26) были синтезированы по схеме 2+1 с выходами 73% и 75% соответственно. При синтезе К-81-01у-Рго-РЬе-ОМе (29) и 14-БЮ^-Рго-РЬе-ОМе (30) мы воспользовались схемой 1+2. Хотя в обоих случаях на С-конце карбоксикомпонента находился 01у, выход при синтезе соединений (29) и (30) достигал лишь 24%.

Таким образом, очевидно, что в отличие от О-окгадециловых эфиров, при синтезе N-cтeаpoильныx производных связь С1у-Рго образуется труднее и с меньшими

XXXX-

XX-

Cxcmí 3 В

-он

н-

14-18

"W

21-24

Вос-Вос-

-ОН Н--29Г30-

-V ■ОН

27

28

Che

Н-

23.26 •ОН н-

• W

• W

• W

• w

■ w

■ w

X

Номер оедадеаая А В • X V w Метод im pciicii Выход %

14 Pro Oly Boc OH IBC 57

15 Pro Oly* Вас OH IBC 51

1С Pro Oly St OBu« DCC/HOBT 87

17 Oly Pro St OMe DCC/HOBT 46

18 Oly* Pro St OMe DCC/HOBT 45

19 Pro Oly H OH TFA 90

29 Pro Oly* H OH TFA 87

21 Pro Oly St - TFA 90

StONSu 70

22 Pro Oly* St - - StONSu 65

23 Oly Pro St - - NaOH 65

-24 Gly* Pro St - NaOH 69

25 Pro Gly St - OBu' DCC/HOBT 75 -

26 Pro Oly* St - OBu' DCC/HOBT 73

27 • Pro - - OMe IBC 87

28 - Pro - - OMe TFA 97

29 Gly Pro St - OMe DCC/HOBT 24

30 Oly* Pro St - OMe DCC/HOBT 19

выходами, а нетканая связь Pro-Gly настолько лабильна, что гидроличуется даже в процессе перекристаллизации или проведения адсорбционной колоночной хроматографии.

Все синтезированные вещества (схемы ) - Э ) были охарактеризованы данными ТСХ, ВЭЖХ,'Н-и иС-ЯМР-спектроскопии, элементного анализа. 'Н-ЯМР-спектры полученных соединений позволяют проследить наличие и положение дейтериевой метки, поскольку в спектрах дейтерированных веществ отсутствуют сигналы соответствующих протонов и наблюдаются изменения мультиплетиости сигналов протонов, взаимодействующих с протонами, замещенными на дейтерий

Оценка мембрапотровных свойств ородововых дивосевтидов. '>

После того, как нами был получен набор ди- и трипептидов с различным положением пролина в петидном фрагменте и различным положением высшего алифатического остатка, а также дейтернймеченые по С1у н Plie аналоги '/тих соединений, мы перешли к изучению, поведения этих веществ в модельных фосфолипидных мембранах методами 2Н- и -"Р-ЯМР. Совместное применение этих методов позволяет контролировать как полиморфное состояние фосфолипидных агрегатов, так и подвижность молекул в определенных участках, содержащих ядра дейтерия.

Для приготовления модельных мембран мы использовали яичный фосфатидил-холин (ФХ) (индекс окислснности <0,2), дающий в избытке воды ламеллярные структуры в широком интервале температур.

Спектры }|Р-ЯМР для всех изученных гидратированных смесей ФХ и пептидов

«

в соотношении 10 : I были практически идентичны и неотличимы от спектров чистого ФХ. Они характеризовались отрицательной анизотропией химического сдвига порядка S0 мл., что свидетельствует, как известно из литературы, о бислойной организации фосфолипидных агрегатов. В *Н-ЯМР-спектрах дейтерированных по остаткам глицина пептидов (5а), (10а), (12а), (13а), (22), (24), диспергированных вместе с фосфатидилхолином в воде, наблюдалось квадрупольнос расщепление (табл. 1).

" Съеика и интерпретация спектров выполнены к.х.н., н.с. кафедры Биотехнологии МИТХТ Дубовским П.В. под руководством д.х.и., проф. Василенко И.А.

Пептидные молекулы ориентированы в бислое таким образом, что их концевая заряженная группа находится в полярной области бислоя, а углеводородный фрагмент расположен вдоль жирнокислотных испей молекул фосфолипидов. По Величине квалруиольного растепления можно судить о степени отклонения пегггидной цепи относительно нормали к поверхности бислоя: чем меньше значение растепления, тем значительнее отклонение.

Ьблица I Квадрупольнос расщепление (кГц) в гН-ЯМР-спектрах

(«нпношгние ФХ/пентид 10 ; I)

N DO сшима . вмггвд ItaunntnaN ркцнмии, кГц

T- JOJ К T- 333 К

10а H-Pro-Oly*-OAlk 15,1

$• H-Oly'-Pro-OAlk 20,5 18.5

22 St-Pro-Oly*-OH 6,3 ; 9.7 9.1 ; 13,1

24 S»-Oly*-Pro-OH 7.0 .

12а H-Phe-Pro-Oly'-OAik 2,6; 14,1 13,4

13« H-Phe'-Pro-Oly-OAlk 10,0 ; 39 8.3 ; 35

Из литературы известно, что в мицеллярном окружении пролинсодержащие пептиды, в основном, сохраняют конформации, характерные для них в кристаллическом состоянии или в растворе. Однако, для достаточно "гибких" пептидов, содержащих связь Gly-Pro, подобное окружение способно значительно смещать цис-тране-ръа-новесие по сравнению с состоянием в растворе. При этом, доля минорного в растворе конформера (как правило, цис-) может значительно возрасти и даже стать преобладающей (Bruch et al., 1992). Мржно предположить, что те же тенденции будут сохраняться и для пролинсодержащих пептидов в гидратированной дисперсии фосфатидил-холина. В зависимости от структуры, для липопептида будут реализовываться одна или две основных конформации. Для трех из шести тестированных соединений (10а), (5а) и (24) наблюдалось по одному сигналу квадрупольного расщепления в 2Н-ЯМР-спектре. Соединение (10а) не содержит связи Х-Pro и не способно к цис-транс-иэомеризации, в отличие от соединений (5а) и (24а), которые содержат связь Gly-Pro. По-видимому, для них в бислое реализуется какая-то одна' предпочтительная

конформация. Для остальных соединений (22), (12а) и (13а) наблюдалось по два сигнала кводрупольною расщепления. Соотношение интенсивностей этих сигналов в спектре соединения (13а) позволило отнести их к сигналам от дейтеронов фенил-аланина в 4-м положении ароматического кольца (39 кГц) и дейтеронов в положениях 2, 3, 5 и 6 (10 кГц). Два сигнала с разными квадрупольными расщеплениями водном и том же спектре соединений (22) и (12а) могут быть обусловлены как присутствием двух конформеров по Х-Рго-свяэи, так и неэквивалентностью дейтеронов в а-положении глицина. Надо отметить, что для соединения (12а) наблюдалась температурная зависимость: при увеличении температуры с 303 К до 333 К один сигнал квадру-польного расщепления (2,6 кГц) исчезал. Для того, чтобы снять неоднозначность в спектрах соединений (22) и (12«), а также выяснить, какие конформации для прояин-содержащих липопептидов предпочтительны в гид ратиро ванной дисперсии фосфати-дилхолина, необходимо было более подробно изучить потенциальные способности синтезированных соединений принимать различные устойчивые конформации в неполярной среде - растворе хлороформа в качестве первого приближения к среде фосфолипидного бислоя.

Исследование кояформяцвошшх свойств сшггезяровашшх сосдшешй методами 'Н- в 13С-ЯМР-ся«жтросаоаая.

Конформационные особенности пролинсодержащих пептидов, связанные с возможностью цис-транс-изомеризации кмидной Х-Рго связи, как известно, проявляются в спектрах "С- и 'Н-ЯМР соответствующих производных.

Наиболее выраженные различия 4<п>лг/«мс-конформсров связи Х-Рго наблюдаются по химическим сдвигам 0- и у-углеродных атомов пиррол идинового кольца в ,3С-ЯМР-спек1ре: сигнал (З-СНз-атома ^«р-конформера смещен на 0,5-1,8 м.д. в сторону более слабого поля по сравнению с сигналом лг/иде-конформера. Наоборот, сигнал у-СНг-атома дожонформера смещен в сторону более сильного поля по сравнению с соответствующим сигналом ддоде-конформера (см.рисунок 1). На рисунке видно, что в ряде случаев наблюдается перекрывание сигналов р-углеродного атома пнрролндинового кольца и сигналов атомов углеродов высшего жирного остатка. Кроме того, метод ,3С-ЯМР-спсктроскопии требует достаточно большой концентрации

р,

Вос-Рго-ОАЖ (l)

ca Vй

Ptrua ^irans

зЬ.....

Ptían.

"lo"

Boc-Gly-Pro-OAIk* (4)

30

i J i i

¥

St-Pro-OH* (31)

Ptram

Sc-Gly-Pro-OH (23)

S5T

^Ctt

-Г 30

T

Ptnns ^ttant

Boc-Phs-Pro-Gty-OAlk

(И) Рев

Si-Gly- Pro-Phe-OMe (29)

I I I | l I МЛ

ТГ4

I 1 1 1 1 JL

20

Рисунок 1. Положение ■ интенсивность сигналов в 13С-ЯМР-спегграх синтезированных соединений, содержащих Х-Рго-связь. 'Примечание: сигнал 0-углерадного пома цмс-конформера перекрывается сигналом высшего жирного остатка.

исследуемого вещества, а это может вызвать агрегацию пептидов и .как следствие, сдвиг цие^тронс-решовстя. Различные времена релаксации для разных атомов углерода позволяют лишь приблизительно оценить соотношение конформеров.

Не менее информативным является метод 'Н-ЯМР-спектроскопии. Некоторые из протонных сигналов пролинсодержащих соединений проявляются в 'Н-ЯМР-спектрах как совокупность мажорного (М) и минорного (ш) (рисунок 2 и таблица 2). В первую очередь это относится к сигналу а-СН-протона Пронина. Когда равновесие значительно сдвинуто в сторону одного из конформеров, часто интерпретация спектров бывает за1руднена вследствие сложности и незначительной интенсивности минорного мультиплста а-СН-протона пролина. Поэтому удобно следить за наличием и соотношением конформеров по другим сигналам, проявляющимся как совокупность мажорного и минорного, например по сигналу Вос-группы, амидных протонов, метельной группы ( см. таблицу 2 ).

7Г

-II

Уч.

_Х\А

I ' ' '

4.0

—11111-1-1—I-г-

3.0 2.0

—'— 1.0 м.д.

Рисунок 2. 'Н-ЯМР-спектр Вос-Рго-ОА1к в СОС13

Таблица 2. Химические сдвиги (5. м.д. ) характеристических мажорных (М) и минорных (111) сигналов в 'Н-ЯМР-спектрах цис-транс-конфорисроъ пептидов,

содержащих связь Х-Рго.

N по схемам Соединение1' Вое а-СН Рго а-СН, 01у N4 01у и/или N4 Р1кг ОМе или ОВи1 Соотношение ттнен-ьноеттй (М):(.п)

1 Вос-Рго-ОА!* 1,40 (М) 1,45 (ш) 4,18 дл(М) 4,30 дд(ш) - - - 3:2

2 г-01у-Рг0-0А1к 4,35 дд(т) 4,50 ад(М) 3.93 дд 4.03 дд 5.57 I - * 9:1

4 Вос-О1у-Рго-0А1к 1.40 (ш) 1,40 (М) 4,35 дд(т) 4,50 дц(М) 3.86 дд 4.01 дд 5,4 1 - 4:1

9 Вос-Рго-О1у-Оли 1,45 4,3 ушир. 3.95 дд 4.06 дд 5,37 т - *

6 Вос-РЬе-01у-Рго-ОА1к 10 мг/мл 1.36 (М) 1.37 (ш) 4,45 ушир11 3.99 д 6,77 с(ш) 6.84 с(М) - 9:1

70 мг/мл 1,34 4,45 ушир*> 3,99 д 6,8 с 4,96 дд • -

12 Вос-РЬе-Рго-01у-ОА1к 1,57 (га) 1.40 (М) 4,35 да(т) 4,65 (М) 3.87 дд 3,99 дд 6,98 т<М) 7,73 т(га) 5,10 д(т) 5.28 д(М) 4:1

- Вос-Рго-ОН 1,38 (ш) 1.45 <М> 4,23 да(га) 4.34 дд(М) - - . - 3:2

31 81-Рго-ОН 4.20 дд(го) 4.57 дд(М) - - - >10:1

21 5»-Рго-01у-0Н - 4,40 дд(т) 4,57 дд(М) 3.88 дд 4.09 дд 7,1 т(т) 7.37 КМ) • 4:1

23 81-01у-Рго-0Н • 4,37 дд (т) 4,55 дд(М) 3,99 дд 4.16 м 6,57 т(М) 6.90 т(т) - 3:2

16 51-Рго-01у-0Ви' 4,33 дд (т) 4.62 ад (М) 3.85 дд (т) 3,97 дд(т) 3.86 д(М) 6,40 Т(т) 7.36-КМ) 1.44 с 6:1

17 Б^у-Рго-ОМе - 4,40 м(т) 4.55 м(М) 1.99 дд 4.11 дд 6,42 Т 3,73 с(М) 3,76 с(ш) 4:1

25 а-Рго-О^Ик-ОВи1 4,30 дд(го) 4,45 дд(М) 3,69 дд 4,13 дд * 6.30 д(т) 6.97 д(М) 6,75 дд(т) 7.43 дд(М) 1,35 с(М) 1,39 с(т) >10:1

29 8«-01у-Рго-РЬе-0Ме 4,30 дд(га) 4,54 дд(М) 3.82 ш 4,03 я» 6,40 т 6,80 д(т) 7.10 ЖМ)" 3,73 с 10:1

Примечания: 1) соогтетствующне лейте риймеченые соединемя* (ЗД7,»,10,12,13,18,22.24,26,10) имели те же спектральные характеристики, эа исключением'сигналов.пропяв» 01у* и РЬе*.

2) сигнал перекрываете* сигналам а-С№ проток» И>»:

3) сигнал перекрывается сигналом ароматического-кольца.Пм ''

Помимо местоположения остатка Pro, на соотношение образующихся цис-транс-конформеров влияет ряд таких факторов, как растворитель, концентрация, а также рН и температура. Так, при увеличении Концентрации Boc-Phe-Gly-Pro-OAlk (6) и его дей-териймеченых аналогов (7, 8) в CDClj от 10 мг/мл до 70 мг/мл мы обнаружили исчезновение в спектре 'Н-ЯМР минорных сигналов (NH глицина и протонов Вос-группы), которые вновь появлялись при разбавлении образца.

При анализе 13С- и 'Н-ЯМР-спектров были установлены следующие особенности:

Мажорный сигнал а-С Н-протона пролина в 'Н-ЯМР-спектрах всех синтезированных N-стсароильных производных, включая N-St-Pro-OH (31), а также всех синтезированных октадецкловых производных, за исключением Вос-Рго-OAlk (1) и Boc-Pro-Gly-OAlk (9, 10), находится в области 4,45-4,65 мх, тогда как минорный сигнал смешен в область более сильного поля. Следовательно, для этих соединений (2-§, 11-13, 16-19, 22-26, 29-30 ) в хлороформе преобладают конформеры с одинаковой ориентацией связЛ Х-Рто, независимо от природы X (N-St, Вое- или Oly). Из рассмотрения спектров 13С-ЯМР ясно, что доминирующим является лдодо-конформер. Лишь для одного соединения - Boc-Pro-OAlk (1) - в условиях съемки спектра (С 10-50 мг/мл, CDClj) наблюдается преобладание «де-конформера над /»/»л^конформером. Вероятно, что именно остаток высшего алифатического спирта в виде октадецилового эфира так заметно влияет на сдвиг подвижного до-лдолоравновесия в сторону ^^конфигурации имидной связи Х-Рго, поскольку известно, что для Вос-Рго-ОН, Boc-Pro-Gly-OH и Boc-Pto-OCHj-CO-QHj в тех же условиях наблюдается преобладание транс -конформера (Hondrelis J., 1990).

Из всех синтезированных соединений только Boc-Pro-Gly-OAlk (9) и его дейте-риймеченый аналог (10) существуют в условиях съемки спектра в одной конформаци-онной форме. По данным ,3С-ЯМР спектра, это троне-конформер.

Все остальные соединения (1-8, 11-18, 22-26, 29-30 ) существуют в CDClj в условиях съемки спектра в виде смеси цис-транс-конформеров, причем вклад /¿до-конфор-мера может быть незначителен (< 10%) (для соединений 25-26, 29-31), а может превышать 40% (для соединений 1, 23, 24).

Равновесие между фж-лукме-конформерами по связи Х-Рго для Н-сгеароильных производных в хлороформе смешено в сторону щрамс-конформер* намного сильнее, когда X - И-сгеароильный остаток ( в соединениях 16, 21, 22, 23, 26, 31), чем когда X представляет собой остаток глицина ( в соединениях 17, 18, 23, 24, 29, 30) или лдот-бутилоксикарбонильную группу. Ы-Б^Рго-ОН существует в растворе практически в виде одного - лдою-конформера, тогда как Вос-Рго-ОН - в виде смеси двух конфор-меров с соотношением 3:2 . Иными словами, в молекулах коротких пептидов Ы-стеароильный остаток оказывает большее влияние на форму предпочтительной конформации, чем аминокислотный остаток глицина или Вос-групла.

Увеличение длины пептидной цепи на один аминокислотный остаток (РЬе) в № стеароильных производных приводит к заметному смещению равновесия цис-транс в пользу последнего. Соотношение ингенсивносгей сигналов (М) и (т) меняется от 4:1 для 1Ч-8Ю1у-Рго-ОМе (17) до 10:1 для И-8ь01у-Рг0-Р11е-0Ме (29), и от 6:1 для N-51-Рго-01у-0Ви1 (16) до >10:1 для Н-а-Рго-О1у-Р!1е-0Ви1 (25). Для октадециловы>, производных это справедливо лишь для труппы соединений Вос-Рго-ОА1к (1), Вос-С1у-Рго-ОА1к (4), Вос-РЬе-01у-Рго-ОА1к (6), т.е. для тех, в которых высший алифатический остаток присоединен в виде эфира к остатку пролина.

Сигнал а-СН2-протонов глицина в 'Н-ЯМР-спепрах всех синтезированных немеченых N-стеароильных и О-окгадециловых производных ди- и трипептидов, кроме мажорных сигналов а-СНг-протонов глицина у К-БЮ^-Рго-ОВи1 (16), а также Вос-РЬе-01у-Рго-ОА1к (6), представляет собой совокупность двух дублетов дублетов (система АВХ). Это говорит о неэквивалентности этих; протонов и наличии затруднений свободном вращении вокруг связей ИН-СНг-СО-фрагмента молекул пептидов ( 2-г 13, 17-18,21-26,29,30).

Для того, чтобы установить, какие элементы пространственной структуры ^стеароильных и О-октадециловых производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов влияют на вышеназванные закономерности, можно использовать двухмерную ЯМР-спеюроскопию и интерпретацию вицин альных констант спин-спинового взаимодействия. Не менее эффективным для решении эюй задачи и наглядным является метод компьютерного моделирования, который позволяет учесть влияние среды (вакуум, хлороформ), а также отдельных молекул воды, которые способны сыетяШ положение ^«¿-да/юло-равновесия, образуя сольваты с липопептидами. Тем самым условия,

моделируемые при расчете, существенно приближаются к реальным условиям существования липопептидд в гидратированной фосфолипидной дисперсии

Изучение пафчиимш свойств cwtiiptuma сослшишй с помощь« методов кмиывтерюго имяуииш.

Молекулярное моделирование всех синтезированных N-стеароильных и О-октаде-циловых производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов было проведено • программе PC MODEL (версия PI 3.2, Serena Software, PO Box 3076, Bloomington, IN, USA) с использованием силового поля ММХ.

Расчет производился по следующему алгоритму:

1. Конструирование структур исследуемых молекул с помощью программы ALCHEMY-II (TRIPOS Associates St. Louis. Mo.. Sigma Chemical Company, каталог 1991 r.,N A9806). Для каждого из соединений (1, 9, 16, 21, 25, 31) было построено по 4 конформера, отличающихся конфигурацией имидной Х-Рго-связи или транс-) и конформацией гирролидинового кольца пралине (С-экэо (UP) или С-эндо (DOWN)); для соединений ( 2, 4, 6, 11, 17, 23, 29 ) было построено по 8 конформеров, которые различались конфигурацией связи ацил-Gly (Phe).

2. Первичная оптимизация структур в программе ALCHEMY-II.

3. Перевод структур соединений в формат программы PC MODEL через интерфейс "SYBYL INTERFACE" программы ALCHEMY-II.

4 .Оптимизация структур в программе PC MODEL

5. Сканирование конформационного пространства и генерирование конформеров путем вращения фрагментов молекул вокруг более чем двух связей с заданным разрешением (опция MLTOR).

6. Минимизация полученных конформеров (опция ММХ-М в программе PCMODEL).

7. Сортировка полученных конформеров по энергии и определение вклада каждого из них в равновесное состояние с помощью распределения Больцмана.

8. Сравнение полученных результатов со спектральными данными.

Стадии 4-7 выполнялись как для вакуума (е-1,5), так и для хлороформа (е-5,1). Предполагалось, что состояние молекулы в вакууме является приближением твердого состояния вещества (в порошке), а состояние молекулы в хлороформе не только

определяет ее поведение в растворе хлороформа, но и является приближением состояния молекулы в неполярной среде модельного мембранного фосфатидилхолинового бисяоя.

Таблица 3. Соотношение конформеров троне : цис синтезированных соединений,

полученное экспериментальными и расчетными методами.

N по схеме Соединение • ь Соотношение конфорйеров транс : цис

Расчет" Эксперимент

вакуум СНС1} СНС1}+ Н]0 'Н- ЯМР 13С-ЯМР

1 Вос-Рю-ОАШ 5,4 1:1 1:2 2 :3 1:2

9 Вое- Рго-01у-ОА1к 99: 1 28:1 16:1 транс транс

4 Вос-01у-Рго-ОА1к 5:1 3:1 10:1 4:1 5:1"

2 г-01у-Рго-()А1к 3:1 9:1 5:1

б Вос-РЬе-01у-Рго-ОА1к 3,5:1 4:1 32:1 9:1 4:1

11 Вос-РЬе-Рго-01у-ОА1к 7:1 3:1 3:2 4:1 4:1

31 5»-Рго-ОН 14; 1 4:1 24:1 10:1 7:1

21 &-Рго-01у-0Н 27:1 4,5:1 3:1 4:1 транс

23 &-01у-Рго-0Н 4:1 3:2 6:1 3:2 3: 1

16 а-Рге-01у-рВи« . >100:1 7.1 99:1 6:1 транс

18 &-01у-Рго-0Ме 5.5:1 5:1 1:13 4:1 5:1

2$ »100:1 5:1 4:1 > 10:1 транс

29 24:1 6М 7:1 10:1 транс

'Примечание: р цводс наглядности точные значения в процентах округлены до

целых чисел и приведены к мигу, обрдоУ« ивдаримекпиииыми данными.

Результаты расчетов в хяорофорце пантхн Хорошую сходимость со спектральными данными (см. таблицу 3). В свою очередь, (равнение результатов распределения конформеров в вакууме и в хлороформе подтвердило, что в растворе молекулы обладают большей подвижностью н доля «до-конформеров увеличивается. Методом наложения структур друг на друга в различных комбинациях был проведен фавнитель-

ный анализ отобранных и рассчитанных соединений. В результате этого анализа о. выявлены следующие закономерности:

1. В коротких молекулах Boc-Pro-OAlk (1) и N-St-Pro-OH (31) пирролидиновое кольцо является достаточно подвижным, обе конформации кольца UP и DOWN являются энергетически выгодными и присутствуют примерно в равных количествах у цис- и у транс- изомеров по имионой связи Х-Рго и в хлороформе, и в вакууме (рисунок 3). Для молекул пептидов уже наблюдается некоторая избирательность по конформациям кольца. Так, для /я/юл^изомера N-St-Pro-Gly-OBu1 (16) и для N-St-

Рисумок 3. ООМП4-4МГ (а) и 11Р-цис (б) конформеры молекулы Вос-Рго-ОАШ, отличающиеся конформацией колы» (ориентацией С,-аггома относительно плоскости, проходящей через С., С» и С*-огомы). Из рисунка видно, что при изменении конформации кольца, общая пространственная структура молекулы практически не изменяется. Здесь и далее жирной линией обозначена конфигурация связи Х-Рго.

2. Для соединений, содержащих фрагмент отмечена практически полная структурная аналогия этого фрагмента в группе соединений К-Б1-Рго-ОН (31), N-51-Рго-01у-0Н (21), М^-Рго-Оу-ОВи« (1в), Ы^-Рго-ау-РЬе-ОВи' (25) по каждому из четырех конформеров как в вакууме, так и в хлороформе. Следовательно, можно говорить« что фрагмент К-БьРго является достаточно жестким и увеличение длины пептидной цепи не влияет на его пространственную структуру (рисунок 4).

3. Для доминирующих конформеров каждой из трех молекул Ы-Бт-Рго-СНу-ОН (21), Ы-51-Рго-О1у-0Ви' (К), К-Б^Рто-О^-РЬе-ОВи1 (25) совпадают пространственные

структуры фрагмента М-81-Рго-01у. Таким образом, фрагмент И^-Рго определяет конформацию следующего за ним аминокислотного остатка, а именно в(у .

Рисунок 4. Доминирующие в хлороформу вднфоямеры молекул N-51-

Рго-ОН (а), Н-5£-Рш-01у-0Н! (б), Ь^Ь-Рго-Оу-ОВи!' (я), н, Н-81-Рго-С1у-РЪе-0Ви' (г). Пунктиром обозначена водородная связь.

4. Образуется более устойчивая и энергетически более выгодная структура, если в процессе генерирования она стабилизируется с помощью внутримолекулярной водородной связи. Так, в доминирукмЬих конформерах фОМЛМ-лдомс) всех структур, содержащих фрагмент Ы-БиРго (16, 21, 25, 31), рассчитанных в вакууме присутствует внутримолекулярная водородная связь между карбонильным кислородом стеароильного остатка и амидным протоном 01у, образуя так называемый у-поворот (со связью 3—+1). Доминирующие конформеры И-Л-Рто-О^-ОВи1 и К-Б1-Рго-О1у-Р1»е-

ОВи1 (ЕЮ\УК-/»у*м<<г), рассчитанные в среде хлороформа, также' стабилизированы внутримолекулярной Н-связью. В этом случае трипептид менее "изогнут'' чем дипептид, образуя (3-поворот со связью типа 4-»1 между карбонильным кислородным атомом стеароильного остатка и амидным протоном РЬе

б)

»)

Рисунок 3. Доминирующие в хлороформе конформеры ( ИОУГН-транс) молекул г-Оу-Рго-ОА1к (а), Вос-РЪе-тау-Рто-ОАЦс (б), Вос-О1у-Рго-0А1к (в).

5. Молекулы, в которых высший жирный остаток присоединен к остатку пролина не в виде N-стеароила, а в виде окгадецилового эфира, обладают большей гибкостью по сравнению с первыми. Однако, и в этом случае наблюдается структурное сходство фрагмента Рго-OAlk для конформеров молекул Boc-Pro-OAlk (1) и Boc-Gly-Pro-OAlk. (4) Интересно, что Z-Gly-Pro-OAlk (2) обладает большим структурным сходством с Boc-Phe-Gly-Pro-OAlk (б), чем с Boc-Gly-Pro-OAlk (4) (рисунок 5)

6. Структуры, в которых высший алифатический остаток ( N-стеароил или окгадециловый эфир) присоединен не к остатку пролина, а к остатку глицина, обладают существенно большей гибкостью и для них не было обнаружено конформационно устойчивых фрагментов.

Закономерности, выявленные в результате расчетов в среде вакуума и хлороформа, в основном, дают ключ к пониманию возможного поведения синтезированных липопегтгидов в составе модельных мембран. Однако, необходимо учитывать, что пептидная часть этих соединений, встроенных в фосфатидилхолиновый бислой, находится вблизи поверхности раздела липид-вода и не может не испытывать влияния молекул структурированной воды. Как упоминалось выше, результатом этого влияния может явиться сдвиг //«о/я/^яс-равновесия. Использование опции DOCK позволило смоделировать ситуацию образования сольвата с молекулой субструктуры, в данном случае с молекулой воды в среде хлороформа. После расчета соотношения конформеров по формуле Больцмана, было обнаружено, что происходит смешение цис-транс-равновесия, по сравнению с состоянием а "чистом" хлороформе. Для соединений, содержащих фрагмент Gly-Pro, наблюдалось значительное изменение качественной картины равновесного состояния. У Boc-Gly-Pro-OAlk (4), Boc-Phe-Gb Рго-OAlk (б) и N-St-Gly-Pro-OH (23) происходило смещение равновесия в стс^ >*у сильного преобладания /n/w/оконформера; у N-St-Oly-Pro-OMe (18) начинал преобладать /до-конформер, вклад которого в "чистом" хлороформе в равновесное состояние составлял 17% процентов (таблица 3). Образование сольватов не влияло существенным образом на распределение конформеров для октадециловых и N-стеароильных производных сосдинешгй, содержащих связь Pro-Gly.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны схемы синтеза и получены М-стеаро ильные и О-октадециловые производные гидрофобных прол^»содержащих пептидов и их дейтериймеченые аналоги.

2. Изучено влияние присоединения высшего алифатического остатка по С- или по N-кoнuy на синтез пептидов, содержащих связь Рго-01у и С1у-Рго. Установлено, что использование октадецилового эфира в качестве постоянной защитной группы уменьшает различия в лабильности этих двух связей.

3. Методами 2Н- и 31Р-ЯМР-спектроскопии показано, что пролинсодержащие ли-попептиды способны встраиваться в фосфатидилхолиновый бислой без нарушения его структуры.

4. С помощью методов 'Н-, 13С-ЯМР и компьютерного моделирования установлено, что все синтезированные пролинсодержащие липопептиды. за исключением Вос-Рто-С1у-ОА1к, существуют в растворе хлороформа в виде смеси до-луоде-конформеров по Х-Рто-связи. „

5. Смоделировано образование сольватов лилопептндов с водой в непалярной среде хлороформа. Продемонстрировано, что сольватация способна вызвать качественное изменение цисчп/чгмо-равновесия у "гибких" структур, содержащих фрагмент <31у-Рто, в отличие от соединений, содержащих фрагмент Рго-Оу.. -.

6. Методами 1Н-, "С-ЯМР-спектроскопин и компьютерного моделирования установлено, что Л-Бт-Рто является коиформационно жестким фрагментом, « котором имндная связь существует преимущественно в лумж-конфшурации. Пространственная . структура этого фрагмента не изменяется с увеличением длины леппшной цепи и добавлении сольватной воды как в твердом состоянии (вакууме), так и в растворе (хлороформе).

Основные результаты работа изложены в следующих публикациях:

1) Исхакова Ф.Х., Есипова О.В., Звоихова Е.Н. Синтез октадециловых производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов.// Биоорганическая химия. 1995. Т.21. N 7. С 518-523.

2) Исхакова Ф.Х., Есипова О.В., Звоихова ЕН. Синтез стеароильных производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов.// Биоорганическая химия. 1995. Т.21. N 8. С 596-603.