Синтез и изучение мембранотропных свойств дейтриймеченых пролинсодержащих липопептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ИСХЛКОВЛ ФЛОРА ХАНИФОВНА

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ МЕМБРАНОТРОПНЫХ СВОЙСТВ ДЕЙТЕРИЙМЕЧЕНЫХ П РОЛ И Н СОДЕРЖАЩИХ ЛИПОПЕПТИДОВ.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и

физиологически активных веществ. 03.00.23 - Биотехнология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

Москва 1995 г.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносом.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Звонкова Е.Н. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Преображенская М.Н,

доктор химических наук, профессор Шибнев В.А.

Ведущая организация: Всероссийский кардиологический научный центр РАМН

Защита состоится 1995 г. ь часов

на заседании диссертационного совета Д 063.41.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В Ломоносова по адресу: 117571, г.Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ по адресу: 119831, г.Москва, ул.М.Пироговская, 1. -

Автореферат разослан" /У " ^ С-ГУ2 1995 г. •

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник ' "Л н^Г1*^«-, Лктгик А. И..

)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. Среди 20 природных аминокислот пролин является единственной генетически кодируемой аминокислотой, в которой а-атом азота включен в жесткое пятичленное. кольцо. Эта особенность структуры обуславливает уникальную функциональную роль пролина в пептидах и белках. Как правило, пирролидиновое кольцо пролина не является плоским и его конформация непосредственно связана с цис- и /^/»^-конфигурацией пептидной X-Pro-связи. Цис-транс-изомеризация вокруг пролиновой пептидной связи влияет на кинетику сворачивания глобулярных белков в третичную структуру, определяет взаимодействие ряда пролин-содержащих белков с мембранами в процессе функционирования. Важность данного перехода подтверждается повсеместным распространением во всех клетках пептидил-пролил-до-лдаде-изомеразы, которая катализирует изомеризацию связи Х-Рго в пептидах и белках.

Эти факты объясняют интерес исследователей к прояинсодержащим пептидам, особенно коротким (до 5 аминокислотных остатков), так как они являются хорошим инструментом для изучения взаимосвязи структура - функция. Среди подобных пептидов особое место Занимают те, что содержат фрагменты Рго-О1у и Оу-Рго. Рго-С1у является основным структурным элементом р-поаорота при форм1фованни пространственной структуры белков: Вместе с остатками ароматических гидрофобных аминокислот РЬе и Тут фрагменты Рто-01у й 01у-Рго образуют трипешкдные последовательности, часто встречающиеся в составе природных биологически активных пептидов, например брадикинина и р-казоморфина, Взаимодействующих с мембранами. ■

В последние годы модификация биологически активных пептидов высшим алифатическим остатком по С- или по Т4-концу часто используется как целенаправленный

<

прием для того, чтобы пролонгировать действие этих пептидов и применять их в меньших концентрациях и с большей эффективностью. Кроме того, обнаружено, что соединения общей формулы

COOR,

где Ri или R2 являются высшими алифатическими остатками, облегчают проникновение через кожу и увеличивают в 2-20 раз поглощение активных лекарственных ингредиентов (антибиотиков, диуретиков, противовоспалительных,' антигипертензивных, психонейротропных препаратов и пр.) По-видимому, эта структура, а также ее потенциальные цис-транс конформационные переходы при различных условиях и окружении лежат в основе механизма синергического действия этого препарата.

В связи с этим представлялось весьма актуальным разработать пути синтетического получение N-стеароилькых и О-окгадециловых производных гидрофобных пептидов, содержащих фрагменты Pro-Gly и Gly-Pro, оценить их поведение в модельных мембранных структурах, исследовать их конформационные свойства в хлороформе в качестве первого приближения к амфифильной среде модельного фосфатидилхоли-нового бислоя и дать количественную оценку соотношения конформеров синтезированных соединений в равновесном состоянии.

Представленная работа является частью фундаментальных научных исследований, проводимых в МИТХТ им. М.В. Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме-13-866 "Конструирование лекарственных и диагностических препаратов с использованием принципов организации и функционирования биологических мембран" ( номер государственной регистрации 01.87.0010337). - •

Цель работы: Разработка удобных методов синтеза гидрофобных пептидов, содер-ашцих фрагменты Pro-Gly и Gly-Pro, их N-стеароильных и О-октадециловых производных, а также их дейтерированных аналогов, изучение их конформационных свойств методами 'Н- и ,3С- ЯМР-спектроскопии и методами компьютерного моделирования. Количественная оценка соотношения конформеров . синтезированных соединений в равновесном состоянии; изучение зависимости этого соотношения от структуры соединения (местоположения остатка Pro и места присоединения высшего алифатического остатка). Тестирование поведения синтезированных веществ в модель-

ном фосфатидилхолиновом бислое методами 31Р- и 2Н-ЯМР.

Няучдая яоюим я пряг"рч-«»в пгнгюеп. работы Разработаны схемы синтеза и получен набор гидрофобных пролинсодержащих пегпидег, модифицированных высшим алифатическим остатком (Си) по С- или по И- концу, а также та дейтерий-меченые аналоги. Выяснено, что различия з лабильности фрагментов н связанные с этим различия в подходах к выбору защитных групп, методам синтеза и очистки веществ уменьшаются для октадециловых эфкров, в отличие от {^-стсарокльных производных.

С помощью методов 'Н- и |3С-ЯМР-спектроскопии изучены конформацион-кые свойства синтезированных соединений в дейтерохлороформе. Установлено, что все синтезированные соединения, за исключением Вос-Рго-С1у-ОА1к, существуют в виде смеси двух конформеров, отличающихся конфигурацией имкдной связи Х-Рго (цие- и транс-). При этом только для одного соединения, а именно Вос-Рго-ОА11с, обнаружено преобладание /*иоконфориера над /туюжг-конформером. Установлено, что равновесие между «де-лдоме-конформерами по связи Х-Рю в дейтерохлороформе смещено в сторону лдомс-конформера намного сильнее, когда X • М-стеаро ильный остаток, чем когда X представляет собой остаток глицина или лдоп-бутилоксикарбонилькую группу, т.е. в молекулах коротких пептидов Ы-сгеароилькый остаток оказывает большее влияние на выбор предпочтительной кон формации. .

С применением методов компьютерного моделирования отобраны наиболее вероятные конформеры всех синтезированных соединений, рассчитаны их параметры и оценен вклад каждого конформера в равновесное состояние в вакууме и хлороформе. Результаты, полученные расчетными и спектральными методами, хорошо согласуются между собой." .

Смоделировано влияние солъмтной воды на конформационное поведение синтезированных М-стеароильных и О-октадециловых производных гидрофобных прсяин-содержащих пептидов. Обнаружено, что в результате образования сольвятиро ванного соединения для структур, содержащих фрагмент С1у-Рго, возможно значительное смещение цде-лумдо-равновесия в сторону как транс-, так и минорного ¿рто-конфор-мера, вплоть до его полного преобладания. Для соединений, содержащих фрагмент Рго-Оу, при образовании сольватов с водой не происходит качественного изменения состояния цис-транс-равновесия.

С помощью спектральных и расчетных методов установлено, что фрагмент bitPro является конформационно жестким. -Для его трехмерной пространственной структуры характерны преимущественно да/*7*оконфигурация имидной связи и С-эндо (DOWN) конформация пирролидинового кольца. Эта конформация остается доминирующей в вакууме и в хлороформе как при увеличении длины пептидной цепи, так и при образовании сольватов с водой, а также определяет конформацию следующего аминокислотного остатка в цепи - глицина. Большая степень вероятности предсказания пространственной структуры N-стеаро ильных и О-окгадециловых производных коротких гидрофобных пролинсодержащих пептидов делает <ix удобными инструментами для изучения взаимосвязи структура-функция.

Проведено тестирование синтезированных дейгериймеченых пролинсодержащих липопептадов на встраивание в модельный фосфатнш" "Ювый бнелой. Показано методами 2Н- и 31Р-ЯМР, что указанные вещества вза.содействуют с модельной мембраной без нарушения ее бислойной организации.

На защиту дыпомггея следующие основные волокеявя;

1. Синтез N-стеаро ильных и О-октадециловых производных гидрофобных пептидов, содержащих фрагменты Gly-Pro и Pro-Oly, и их дейгериймеченых аналогов.

2. Изучение конформационных свойств синтезированных соединений методами ■Н- и ,3С-ЯМР-спектроскопии.

3. Исследование конформационных свойств синтезированных соединений в

£_и в растворе с помощью методов компьютерного масслиррвания.

4. Тестирование взаимодействия синтезированных соединений с фьефрлшишч ным бислоем методами 2Н- и 31Р-ЯМР.

Пуй»11&аи8Н1 Р япройав^^ По материалам диссертационной работы

опубликованы две печатные работц. Материалы диссертации частично доложены на Всероссийской научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии" (Москва, 1993 г.).

Объея работы. Диссертационная работа изложена на страницах маши-

нописного текста, содержит // рисунков, /13 таблиц, S схемы и состоит in следующих разделов: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы, список литературы, включающий /<Л£ ссыл/Ои-

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В качестве объектов исследования в данной работе были выбраны N-creapo-кльные и О-октадециловые производные дипептидов Gl у-Pro и Pro-Gly, трипептидов, являющихся фрагментами ß-казоморфииа и брадикинииа ( Gly-Pro-Phe и Phe-Gly-Рго соответственно) и их рсгропоследовательностей. Поскольку в задачу работы входило изучение поведения этих пептидов в фосфолипионом бислос методами 2Н- и 3,Р-ЯМР, также были синтезированы кх аналоги с дейтериймеченьши глицином и фе-нил&ланином.

Darrel N-стаароашшх в О-шцириоии цоюмдюо пцрофоввых ш>о»«кпд>р1щ«т амицм ■ д дс&теуймечепы» мнвиа.

Нами были синтезированы октадециловые эфиры ди- и трипептидов, содержащих фрагменты Pro-Gly и Gly-Pro (схемы 1 и 2).

В качестве постоянной защитной группы на С-конце был использован октаде-циловый эфир (Alk). Практически это привело к устранению различий в синтезе окгадециловых производных дипептидов Pro-Gly и Gly-Pro и трипегтгидов на их основе. Как известно, подобные различия возникают вследствие большей лабильности связи Pro-Gly по сравнению со связью Gly-Pro, что приводит к побочным реакциям в процессе синтеза, удаления защитных групп, очистки синтезированных соединений и, в конечном итоге, к снижению выхода.

Исходные октадециловые эфиры глицина в меченом и немеченом вариантах были приготовлены прямой этерификацией 1-октадеканолом в присутствии л^голуол-сульфо кислоты как катализатора. Окпшециловый эфир я^явя-бутилоксикарбонилпро-лина (1) был получен по методу Позднева с использованием Вос20. B0C2O был также применен при синтезе Boc-Gly*-OH и Boc-Phe*-OH . Синтез дейтерированных производных пептидов (3, 5, За, 5а, 7, в, 10, 19«, 12, 13, 12а, 13а, 15, 18, 20, 22, 24, U, 30) нами был осуществлен на базе полученного по известному методу пентадейтерофенилаланина и коммерческого препарата меченного по а-углеродному атому дидейтероглицина.

Схема 1

Вос-Вос-

-ОН Y-H-

-ОН

ТТ^

Г

ЧЯГ

Pro

Вос-Вос-TFAH-

1а

-ОН

-OAlk

-OAlk

-OAlk

-ОAlk

-OAIk

Номер сосдмсия С F V Маги im fetrm Выход, %

1 - ' - • (Boc)jO 83

1а . - - - TFA 97

2 Oly Z DCC/HOBT IS

IBC IBC ! 79

3 4 Oly* Oly - * " Boc 8? П \

5 Oly» - - ' Boc IBC <0 И • •

и Oly - HBr HBr/CHjCOOH M

3» Oly* HBr HBr/CHjCOOH 90

4а Oly TFA TFA 98

9а Oly* - TFA TFA 97

С Oly Pbe DCC/HOBT 68

7 Oly* Phe DCC/HOBT 57

« Oly Phe* - DCC/HOBT 43

Примечание: здесь и далее звездочкой помечены дейтеркймеченые остатки.

На стадии синтеза днпепткдов успешным оказался как метод смешанных ангидридов с помощью кзобугилхлоркарбонт (IBC) в присутствии N-метнлморфолина, так и дкцикдогсксилкарбодиимншшй (DCQ метод с использованием в качестве добавки Ьпироксибекзогриазола (HOBT). Окпдециловый эфир глицилпролина был синтезирован как в внос Вое-, так и в виде Z-производных. Бснзилоксихарбонильную защит-

Вое -Вое -Н -

-ОН

Схем* 2 Рго

Вос-Вос-Н -

■ОН

н

9,10

9а, 10*

11-13

Па-13а

-ОА1к - ОА1к -ОА1к •ОА1к ■ ОА1к

Номер е»> С Р Метем ыа Выхел.%

«пиша рмгеиг

9 . 01у - 1ВС 86

1» 01у* • 1ВС 73

Н • 01у - ТТА 97

1*1 01у* - ТРА 98

11 0!у РЬе ЭСС/НОВТ 75

12 0(у* Р1м П>СС/НОВТ 68

13 01у РЬе* ЕХХ/НОВТ 59

11а 01у РЬе ТРА . 95

12а 01у* РЬе ТРА пг то

13а 01у РЬе* ТРА 92

ную группу с соединений (2), (3) удалось снять лишь в достаточно жестких условиях (НВг в уксусной кислот:), попытки удалить ее мягким каталитическим гидрогенолиэом с использованием свежеприготовленного №-Яапеу не. увенчались успехом даже за 24 часа, хотя у 2-С1у-Рго-0Ме 2-защита удалялась в подобных условиях за 30 мин. Поэтому во всех остальных СТучадх мы использовали трет-бутп-оксюсар5о;;иль;г/я группу, учитывая легкость ее удаления и более выОСЕй выходы деблокированных пептидов при обработке трифгоруксусной кислотой в хлористом метилене.

На стадии получения трипептидов предпочтение было отдано ИСС/ НОВТ-ме-тоду. Более низкие выходы при получении Вос-РЬе-01у-Рго-ОА1к (6) и его дейтерий-меченых аналогов (7, 8) по сравнению с Вое-РЬе-Рго-С1у-ОА1к (11) и его аналогами

(12, 13) вероятно могут быть объяснены (информационными особенностями амино-компонента: остаток пролина в Н-С1у-Рго-ОА1к (2а-5я) придает молекуле свернутую конформацию и, по-видимому, делает аминогруппу глицина стерически более труднодоступной, чем иминофуппа пролина в Н-Рго-С1у-ОА1к (9а,10а).

Ы-стеароильные производные гидрофобных пролинсодержащих ди- и трипепти-дов были получены по схеме 3. Полностью защищенные дипептиды были синтезированы ОСС/НОВТ-методом, так как Г^ьО^-ОН и, особенно, ^Б^Рго-ОН образуют нереакционноспособные смешанные ангидриды с изобутилугольной кислотой. N-51-С1у-Рго и Ы-51-01у*-Рго были синтезированы в виде метиловых эфиров с выходом до 46%. Ранее было установлено, что при омылении метилового эфира у 2-?ю-О\у-0Ме связь Рго-01у почти полностью гидролизуется, а в случае 2-01у-Рго-0Ме потери, связанные с гидролизом этой связи составляют до 30 %. В нашем случае при замене щитной группы на стсароильную, удаление эфира также сопровождалось гидролизом связи О1у-Рго и выход составил 6996. В связи с этим, №5(-Рко-01у был синтезирован в виде луг/л-бутилового эфира (16). Даже в этом случае происходил частичный гидролиз связи Рго-01у при увеличении времени реакции, несмотря на то, что реакция проводилась в значительно более мягких условиях удаления лу*»я-бутильной защитой группы в присутствии трифгоруксусной кислоты по сравнению с условиями омыления метилового эфира. Для синтеза ^81-Рго-О1у*-0Н (22) и К-8ьРю-01у-0Н (21) мы воспользовались альтернативным путем, который заключался в присоединении Л-стеароильного остатка с помощью Н-гидроксисукцинимидного эфира стеариновой кислоты ($((Ж$и) к дипегггидам (19, 20).' Незащищенные дипептиды получали путем удаления Вос-защганой группы с Вос-Рго-01у-ОН (14) и Вос-Рго-01у*-0Н (15), синтезированных методом смешанных ангидридов.

При синтезе трипептидов мы вновь обратились к ОСС/НОВТ-методу. ^Бс-Рго-01у-РЬс-ОВи' (25) и ^8»-Гго-01у*-РЬе-0Ви1 (26) были синтезированы по схеме 2+1 с выходами 73% и 75% соответственно. При синтезе ^БЮ^-Рго-РИе-ОМе (29) и N-5Ю1у*-Рго-РЬе-ОМе (30) мы воспользовались схемой 1+2. Хотя в обоих случаях на С-конце карбоксикомпонента находился 01у, выход при синтезе соединений (29) и (30) достигал лишь 24%.

Таким образом, очевидно, что в отличие от О-октадециловых эфиров, при синтезе N-стсаро ильных производных связь 01у-Рго образуется труднее и с меньшими

it

X

х-

Схема 3 В

-ОН

14-1«

"ТОГ

21-24

- V -ОН

Phe

Н-

XX-

Вос-Вос-

-ОН Н--29Г30-

23,26 ОН Н-

27

28

Номер осдмсмя Л В < X V w Метод МАЯ реагент Выход %

14 Pro Oly Boc OH 1BC 57

13 Pro Oly» Boc OH I ВС 51

К Pro Oly St OBu1 DCC/HOBT 87

17 Oly Pro St OMc DCC/HOBT 46

18 Oly* Pro St OMe DCC/HOBT 45

19 Pro Oly H OH TFA 90

20 Pro Oly* H OH TFA 87

21 Pro Oly St - - TFA 90

StONSu 70

22 Pro Oly* St - - StONSu 65

23 Oly Pro St - - NaOH 65

24 Oly* Pro St - - NaOH 69

25 Pro Oly St - OBu1 DCC/HOBT 75 -

26 Pro Oly* St - OBu« DCC/HOBT 73

27 - Pro - - OMe IBC 87

28 - Pro - - OMe TFA 97

29 Oly Pro St - OMe DCC/HOBT 24

30 Oly* Pro St - OMe DCC/HOBT 19

выходами, a пептидная связь Pro-Oly настолько либильна, что гидролизуется даже в процессе перекристаллизации или проведения адсорбционной колоночной хроматографии.

Все синтезированные вещества (схемы I - 3 ) были охарактеризованы данными ТСХ, ВЭЖХ, 'Н- и ,3С-ЯМР-спектроскопии, элементного анализа. 'Н-ЯМР-спектры полученных соединений позволяют проследить наличие и положение дейтерисвой метки, поскольку в спектрах дейтсриро ванных веществ отсутствуют сигналы соответствующих протонов и наблюдаются изменения мультиплстности сигналов протонов, взаимодействующих с протонами, замещенными на дейтерий

Оценка мембраютуоамых свойств пршшиоаых лааоямггцдов. ')

После того, как нами был получен набор ди- и трипегтгидов с различным положением пролина в пептидном фрагменте и различным положением высшего алифатического остатка, а также дейтериймеченые по Gly и Plie аналоги этих соединений, мы перешли к изучению, поведения этих веществ в модельных фосфолипидных мембранах методами 2Н- и 3,Р-ЯМР. Совместное применение этих методов позволяет контролировать как полиморфное состояние фосфолипидных агрегатов, так и подвижность молекул в определенных участках, содержащих ядра дейтерия.

Для приготовления модельных мембран мы использовали яичный фосфатидил-холин (ФХ) (индекс окисленности <0,2), дающий в избытке воды ламеллярные структуры в широком интервале температур.

Спектры 3,Р-ЯМР для всех изученных гидратированных смесей ФХ и пептидов в соотношении 10 : 1 были практически идентичны и неотличимы от спектров чистого ФХ. Они характеризовались отрицательной анизотропией химического сдвига порядка S0 мл., что свидетельствует, как известно из литературы, о бислойной организации фосфолипидных агрегатов. В 2Н-ЯМР-спсктрах дейтсриро ванных по остаткам глицина пептидов (5а), (10а), (12а), (13а), (22), (24), диспергированных вместе с фосфатидилхолином в воде, наблюдалось квадрупольное расщепление (табл. I).

') Съемка и интерпретация спектров выполнены к.х.н., н.с. кафедры Биотехнологии МИТХТ Дубовскнм П.В. под руководством д.х.н., проф. Василенко И.А.

Пептидные молекулы ориентированы в бислое таким образом, что их концевая заряженная группа находится в полярной оЛласти бислоя, а углеводородный фрагмент расположен вдоль жирнокислотных немей молекул фосфолилидов. По величине квалруиолыюго растепления можно судить о степени отклонения пептидной цепи относительно нормали к поверхности бислоя. чем меньше значение растепления, тем ■»начитечьнее отклонение.

(«блина I Квадруиольное растепление (кГи) в 2Н-ЯМР-спсюрах

(кмлношение ФХ/иетид 10 ; I)

N во схемам MUIU KHWMIMM рквшям, кГц

T- JOJ к T- 333 К

10а Н - Рго-Oly* -OAlk 15.1

5а H-Oly'-Pro-OAlk 20,5 18,5

22 St-Pro-Oly*-OH 6.3 ; 9.7 9,1 ; 13,1

24 Sl-Oly*-Pro-OH 7,0

12а H-Phe-Pro-Qly'-OAlk 2.6 ; 14,1 13.4

'За H- Phe'- Pro-Oly-OAlk 10,0; 39 8,3 ; 35

Из литературы известно, что в мицеллярном окружении пролинсодержащие пег пилы, в основном, сохраняют конформации, характерные для них в кристаллическом состоянии или в растворе. Однако, для достаточно "гибких" пептидов, содержащих связь Gly-Pro, подобное окружение способно значительно смещать цис-транс-равновесие по сравнению с состоянием в растворе. При этом, доля минорного в растворе конформера (как правило, цио) может значительно возрасти и даже стать преобладающей (Bruch et al., 1992). Можно предположить, что те же тенденции будут сохраняться и для пролинсодержаших пептидов в гидр атиро ванной дисперсии фосфатидил-холина. В зависимости от структуры, для липопептида будут рсализовываться одна или две основных конформации. Для трех из шести тестированных соединений (10а), (5а) и (24) наблюдалось по одному сигналу квадрупольного расщепления в 2Н-ЯМР-спектре. Соединение (10а) не содержит связи Х-Pro и не способно к цис-транс-иэомеризации, в отличие от соединений (5а) и (24а), которые содержат связь Gly-Pro. По-видимому, для них в бислое реализуется какая-то одна' предпочтительная

u

конформации. Для остальных соединений (22), (12а) и (13а) наблюдалось по два сигнала квадруиольн»ю расщепления. Соотношение интенсивносгей этих сигналов в спектре соединения (13а) позволило отнести их к сигналам от дейтеронов фенил-аланина в 4-м положении ароматического кольца (39 кГц) и дейтеронов в положениях 2, 3, S и 6 (10 кГц). Два сигнала с разными квадрупольными расщеплениями водном и тем же спектре соединений (22) и (12а) могут быть обусловлены как присутствием двух кокформеров по Х-Рго-связи, так и неэквивалентностью дейтеронов а «положении глицина. Надо отметить, что для соединения (12а) наблюдалась температурная зависимость: при увеличении температуры с 303 К до 333 К один сигнал квадру-польного расщепления (2,6 кГц) исчезал. Для того, чтобы снять неоднозначность в спектрах соединений (22) и (12а), а также выяснить, какие конформации для пролин-содержащих липопешидов предпочтительны в гид рати ро ванной дисперсии фосфати-дилхолина, необходимо было более подробно изучить потенциальные способности синтезированных соединений принимать различные устойчивые конформации в неполярной среде - растворе хлороформа в качестве первого приближения к среде фосфолилидного бислоя.

Исследование коаформащюшшх свойств сшггезароаашшх сосдашешй методам« 1Н- ■ |3С-ЯМР-сае«троскошш.

Конформационные особенности пролинсодержащих пептидов, связанные с возможностью дог-дг/мде-нзомеризации имидной Х-Pro связи, как известно, проявляются в спектрах |}С- и 'Н-ЯМР соответствующих производных.

Наиболее выраженные различия цис-транс-конформеров связи Х-Pro наблюдаются по химическим сдвигам р- и у-углеродных атомов пирролидянового кольца в иС-ЯМР-спектре: сигнал Р-СНгатома цис-конфориера смещен на 0,5-1,8 м.д. в сторону более слабого поля по сравнению с сигналом транс-конформера. Наоборот, сигнал y-CHj-атома «мжонформера смещен в сторону более сильного поля по сравнению с соответствующим сигналом /фвмо-конформера (см.рисунок I). На рисунке видно, что в ряде случаев наблюдается перекрывание сигналов p-углеродного атома пирролцшшового кольца и сигналов атомов углеродов высшего жирного остатка. Кроме того, метод 13С-ЯМР-спектроскопии требует достаточно большой концентрации

Вос-Рго-OAIi (I)

э,

trans 1 trans

Ptrans

Boc-Gly-Pro-OADc*

(4)

i i i ' I

30

T

^ trans

St-Pro-OH* (31)

•w 'A' '

Ptra

Дт-т

St-Gly-Pio-OH (23)

дг

Kce

~r

30

11 11 I 20

■'tram

Boc-Phe-Pro-Gfy-OAlk (П) Pa,

—I I I

iu

ТГ

ГГ

T

Si-Gly-Pro-Phe-OMe (29)

i I i | i—г «X

T

I I I I

Рисунок 1. Положение я интенсивность сигналов а 13С-ЯМР-спехтрах синтезированных соединений, содержащих Х-Рго-связь. 'Примечание: сигнал р-угаеродного атома щк-конформсра перекрывается сигналсы высшего жирного остатка.

исследуемого вещества, а это может вызвать агрегацию пептидов и ,как следствие, сдвиг цистранс-равновесия. Различные времена релаксации для разных атомов углерода позволяют лишь приблизительно оценить соотношение конформеров.

Не менее информативным является метод 'Н-ЯМР-спектроскопии. Некоторые из протонных сигналов п рол ин содержащих соединений проявляются в 'Н-ЯМР-спектрах кок совокупность мажорного (М) и минорного (ш) (рисунок 2 и таблица 2). В первую очередь это относится к сигналу а-СН-пропгона пролина. Когда равновесие значительно сдвинуто в сторону одного из конформеров, часто интерпретация спектров бывает запруднена вследствие сложности и незначительной интенсивности минорного мультиплета а-СН-протона пролина. Поэтому удобно следить за наличием и соотношением конформеров по другим сигналам, проявляющимся как совокупность мажорного и минорного, например по сигналу Вос-группы. амидных протонов, мстильной группы ( см. таблицу 2).

а-СН Рго о (М)

1-Б-¡Т

Уч.

1/чА

■. I

7Г"

II I—г-

]—■—I—г—■—|—I—I—

1.0 м.д.

3.0 2.0

Рисунок 2. 'Н-ЯМР-спектр Вос-Рго-ОАШ в СОС13

Таблица 2. Химические сдвиги (5, м.д. ) характеристических мажорных (М) и минорных (т) сигналов в 'Н-ЯМР-спектрах цис-транс-конформеров пептидов.

содержащих связь Х-Рго.

1 по мам Соединение" Вое и-СН Рго а-СН, 01у NN 01у и/или NN Р1>е ОМе или ОВи1 Соотношение интенси-ьностей (М):(т)

Вос-Рго-ОА1к 1,40 (М) 1.45 (т) 4,18 дд(М) 4,30 дд(т) - - - 3:2

2-01у-Рго-0А1к 4.35 да(т) 4,50 дд(М) 3.93 дд 4,03 ад 5.57 » - " 9:1

Вос-01у-Рго-ОА1к 1,40 (т) 1,43(М) 4,35 дд(т) 4.50 дд(М) 3.86 дд 4,01 дд 5.4 т - 4:1

Вос-Рго-01у-0Аи 1.45 4,3 ушир. 3.95дд 4.06 м 5,37 т - -

Вос-РЬе-01у-Рго-ОА1к 10 мг/мл 1.36 (М) 1.37 (т) 4,45 ушир1' 3,99 д 6,77 с(ш) 6,84 с(М) - 9:1

70 мг/мл 1.34 4,45 ушир2» 3,99 д 6.8 с 4.96 дд - -

1 Вос-РЬе-Рго-01у-<М1к 1.37 (т) 1,40 (М) 4,35 дд(т) 4.65 (М) 3.87 дд 3.99 д» 6.98 т(М) 7,73 т<ш) 5.10 д(ш) 5.28 д(М) 4:1

- Вос-Рго-ОН 1.38 (т) 1.45 (М) 4,23 дд(т) 4,34 да(М) - - - 3:2

1 5|-Рго-ОН 4.20 дд(т) 4.57 дя(М) - - - >10:1

1 51-Рго-01у-0Н - 4,40 дд(т) 4.57 дд(М) 3,88 дд 4.09 ДД 7,1 т<т) 7.37 т(М) • 4:1

> 51-С1у-Рго-ОН - 4,37 да (т) 4.55 дя(М) 3,99 дд 4.16 дд 6,57 1<М) 6,90 т(ш) - 3:2

i 5|-Рго-01у-0Ви' 4,33 м (т) 4,62 м(М) 3.85 дд (т) 3,97 дд(т) 3.86 д (М) 6,40т<т) 7.36 т(М) 1,44 с 6:1

1 вКНу-Рго-ОМе - 4,40 м(ш) 4.55 м(М) 3.99 м 4.11м 6,42 т 3,73 с(М) 3.76 с(ш) 4:1

5 »-Рго-СЛу-РЬе-ОВи1 4,30 да(т) 4.45 дд(М) 3,69 м 4,13 м ' 6,30 д(ш) 6.97 д(М) 6,75 ди(ш) 7.43 м(М) 1,35 с(М) 1,39 с(га) >10:1

) 51-01у-Рго-РЬе-0Ме 4,30 дд(га) 4.54 дп(М) 3,82 м 4,03 да 6,40 т 6,80 д(ш) ■V® а(М)» 3,73 о 10:1

Примечания: I) соответствующие дейтериймечоные соедииемя» РД7А10.12.13,18,22,24,26,30) ли те же спектральные характеристики, я исключвнием'сипиию»првтипг (Ну* к Им*. 1) сигнал перекрывается сигналом а-СН' протон» Мл-. 3) сигнал перекрывается сигналом арошшческого'вояыи.вьв ''

Помимо местоположения остатка Pro, на соотношение образующихся цис-транс-конформеров влияет ряд таких факторов, как растворитель, концентрация, а также рН и температура. Так, при увеличении Концентрации Boc-Phe-Gly-Pro-OAlk (4) и его дей-териймеченых аналогов (7, 8) в CDClj от 10 мг/мл до 70 мг/мл мы обнаружили исчезновение в спектре 'Н-ЯМР минорных сигналов (NH глицина и прогонов Вос-группы), которые вновь появлялись при разбавлении образца.

При анализе ,3С- и 'Н-ЯМР-спектров были установлены следующие особенности:

Мажорный сигнал а-СН-протона пролина в 'Н-ЯМР-спектрах всех синтезированных N-стеароильных производных, включая N-St-Pro-OH (31), а также всех синтезированных остадециловых производных, за исключением Вос-Рго-OAlk (I) и Boc-Pro-Gly-OAlk (9, 10), находится в области 4,45-4,65 мх, тогда как минорный сигнал смещен в область более сильного поля. Следовательно, для этих соединений (28, 11-13, 16-19, 22-24, 29-30 ) в хлороформе преобладают конформеры с одинаковой ориентацией cbh3i( Х-Pro, независимо от природы X (N-St, Вое- или Gly). Из рассмотрения спектров 1}С-ЯМР ясно, что доминирующим является трансконформер. Лишь для одного соединения - Вос-Рго-OAlk (1) - в условиях съемки спектра (С 10-50 мг/мл, CDClj) наблюдается преобладание дочеонформера над ддамжонформером. Вероятно, что именно остаток высшего алифатического спирта в виде октадецилового эфира так заметно влияет на сдвиг подвижного цис-трано-фйвыоъсст в сторону «ас-конфигурации имидной связи Х-Рго, поскольку известно, что для Boc-Pro-OH, Boc-Pro-Gly-OH и Boc-Pro-OCHj-CO-QHs в тех же условиях наблюдается преобладание транс -конформера (Hondrelis J., 1990).

Из всех синтезированных соединений только Boc-Pro-Gly-OAlk (9) и его дейте-риймеченый аналог (10) существуют в условиях съемки спектра в одной конформаци-онной форме. По данным 13С-ЯМР спектра, это транс-конформер.

Все остальные соединения (1-8, 11-18, 22-26, 29-30 ) существуют в CDClj в условиях съемки спектра в виде смеси цис-транс-конформеров, причем вклад w-конфор-мера может быть незначителен (< 10%) (для соединений 25-26, 29-31), а может превышать 40% ( для соединений 1, 23, 24).

Равновесие между цис-транс-конформерами по связи Х-Рго для 1Ч-стеаронльных производных в хлороформе смешено в сторону /иуляю-конформера намного сильнее, когда X • 1Ч-стеаронльный остаток ( в соединениях 16, 21, 22, 25, 26, 31), чем когда X представляет собой остаток глицина ( в соединениях 17, 18, 23, 24, 29, 30) или /гуюя-бутилоксикарбонильную группу. 1Ч-8г-Рго-ОН существует в растворе практически в виде одного - да/мда-конформера, тогда как Вос-Рго-ОН - в виде смеси двух конфор-меров с соотношением 3:2 . Иными словами, в молекулах коротких пептидов Ы-стеароильный остаток оказывает большее влияние на форму предпочтительной конформашш, чем аминокислотный остаток глицина или Вос-группа.

Увеличение длины пептидной цепи на один аминокислотный остаток (РЬе) в Ы-стеароильных производных приводит к заметному смещению равновесия цис-транс в пользу последнего. Соотношение интенсивностей сигналов (М) и (т) меняется от 4:1 для И-вЮ^-Рго-ОМе ( 17) до 10:1 для 1Ч-8Ю!у-Рго-РЬе-ОМе (29), и от 6:1 для N-51-Рго-О^-ОВи» (16) до >10:1 для К-Й-Рго-О^-РЬе-ОВи1 (25). Для октадециловьс. производных это справедливо лишь для группы соединений Вос-Рго-ОА1к (1), Вос-01у-Рго-0А1к (4), Вос-РЬе-01у-Рго-ОА1к (в), т.е. для тех, в которых высший алифатический остаток присоединен в виде эфира к остатку Пронина.

Сигнал а-СН2-гтротонов глицина в 'Н-ЯМР-спектрах всех синтезированных немеченых N-стеароильных и О-октадециловых производных ди- и трипептидов, кроме мажорных сигналов а-СН2-протюнов глицина у N-St-01y-Pro-0Bu, (16), а также Вос-РЬе-01у-Рго-0А1к (6), представляет собой совокупность двух дублетов дублетов (система АВХ). Это говорит о неэквивалентности этих, протонов и наличии затруднений » свободном вращении вокруг связей ЫН-СН^-СО-фрагмента молекул пептидов (2-' 13, 17-18, 21-26, 29, 30).

Для того, чтобы установить, какие элементы пространственной структуры М-стеа-роильных И О-октадециловых производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов влияют на вышеназванные закономерности, можно использовать двухмерную ЯМР-спектроскопию и интерпретацию вицинальных констант спин-спинового взаимодействия. Не менее эффективным для решения Этой задачи и наглядным является метод компьютерного моделирования, который Полюляег учесть влияние среды (вакуум, хлороформ), а также отдельных молекул воды, которые способны смещать положение цис-транс-равновсст, образуя сольваты с липопептидами. Тем самым условия,

моделируемые при расчете, существенно приближаются к реальным условиям существования липопептида в гидратированной фосфолипидной дисперсии

Изучешк кошформаямшх смйсп сиимцимп сосдмеш* с помощи» методоа ммышумга модошромная.

Молекулярное моделирование всех синтезированных N-сгеароильных и О-октаде-циловых производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов было проведено в программе PC MODEL (версия PI 3.2, Serena Software, PO Box 3076, Bloomington, IN, USA) с использованием силового поля M MX.

Расчет производился no следующему алгоритму:

1. Конструирование структур исследуемых молекул с помощью программы ALCHEMY-II (TRIPOS Associates St. Louis. Mo., Sigma Chemical Company, каталог 1991 r.,N A9806). Для каждого из соединений (1, 9, 16, 21, 25, 31) было построено по 4 конформера, отличающихся конфигурацией имидной Х-Рго-связи (цис~ или троне-) и информацией г ирролидинового кольца пролина (С-экэо (UP) или С-эндо (DOWN)); дм соединений ( 2, 4, é, 11, 17, 23, 29 ) было построено по 8 конформеров, которые различались конфигурацией связи ацил-Gly (Phc).

2. Первичная оптимизация структур В программе ALCHEMY-II.

3. Перевод структур соединений в формат программы PC MODEL через интерфейс "SYBYL INTERFACE" программы ALCHEMY-II.

4 .Оптимизация структур в программе PC MODEL

5. Сканирование конформационного пространства и генерирование конформеров путем вращения фрагментов молекул вокруг более чем двух связей с заданным разрешением (опция MLTOR).

6. Минимизация полученных конформеров (опция ММХ-М в программе PCMODEL).

7. Сортировка полученных конформеров по энергии и определение вклада каждого из них в равновесное состояние с помощью распределения Больцмана.

8. Сравнение полученных результатов со спектральными данными.

Стадии 4-7 выполнялись как для вакуума (е-1,5), так и для хлороформа (с—5,1). Предполагалось, что состояние молекулы в вакууме является приближением твердого состояния вещества (в порошке), а состояние молекулы в хлороформе не только

определяет ее поведение в растворе хлороформа, но и является приближением состояния молекулы в неполярной среде модельного мембранного фосфатндилхолинового бислоя.

Таблица 3. Соотношение конформеров транс : цис синтезированных соединений,

полученное экспериментальными и расчетными методами.

N по схеме Соединение . ч Соотношение конформеров транс : цис

Расчет* Эксперимект

вакуум CHCIj CHCIj+ HjO 'Н- ЯМР 13С-ЯМР

1 Boc-Pro-OAli 5:4 1 :1 1:2 2 : 3 1:2

9 Вое- Pro-Oly-OAlk 99:1 28:1 16:1 транс транс

4 Boc-Oly- Pro-OAlk 5:1 3:1 10:1 4 1 5:1"

2 Z-Oty-Pro-OAlk 3:1 9 1 5:1

6 Вое- Phe-O ly- Pro-OAUc 3,5:1 4:1 32:1 9 1 4:1

11 Boc-Phc-Pro-Oly-OAlk 7:1 Э: 1 3:2 4 1 4:1

31 St-Pro-OH 14; t 4 :1 24:1 10: 1 7 : 1

21 SJ-Pro-Oly-OH 27 г 1 4,5:1 3:1 4:1 транс

23 Sl-Oly-Piro-OH 3:2 6:1 3:2 3:1

X St-Pro-Oly-OBu' >100:1 7:1 99:1 6:1 транс

18 St-Oly-Pro-OMe 5,5:1 5:1 1:13 4:1 5:1

25 Sjt-jP^QIy-Phe-OBu4 »100:1 5:1 4:1 > 10:1 транс

29 Sji-Qfy-Pro-rfrc-OMo 24:1 6:1 7:1 10:1 транс

'Примечание: р цел*? £ододс#1 наглядности точные значения в процентах округлены до целых чисел и приведены к ралу, обрдоу в *сед*р*мс>гт*дышмн данными.

Результаты расчетов в хлороформе доказали хорошую сходимость со спектральными данными (см. таблицу 3). В свою очередь, сравнение результатов распределения конформеров в вакууме и в хлороформе подтвердило, что в растворе молекулы обладают большей подвижностью и доля до-конформероа увеличивается. Методой наложения структур друг на друга в различных комбинациях был проведен сравнитель-

ный анализ отобранных и рассчитанных соединений. В результате этого анализа 6. выявлены следующие закономерности:

1. В коротких молекулах Вос-Рго-OAlk (1) и N-St-Pro-OH (31) пирролидиновое кольцо является достаточно подвижным, обе конформации кольца UP и DOWN являются энергетически выгодными и присутствуют примерно в равных количествах у цис- и у транс- изомеров по имндной связи Х-Рго и в хлороформе, и в вакууме (рисунок 3). Для молекул пептидов уже наблюдается некоторая избирательность по конформациям кольца. Так, для «уолкмаомера N-St-Pro-Gly-OBu' (К) и для N-St-

Риеунок 3. ООУОТ-ф«: (а) и ЫР(б) конформеры молекулы Вос-Рго-ОА1к, отличающиеся конформацией кольца (ориентацией С,-атома относительно плоскости, проходящей через С., С* и С«-атомы). Из рисунка видно, что при изменении конформации кольца, общая пространственная структура молекулы практически не изменяется. Здесь и далее жирной линией обозначена конфигурация связи Х-Рго.

2. Для соединений, содержащих фрагмент М-&-Рго, отмечена практически полная структурная аналогия этого фрагмента в труппе соединений К-Бт-Рто-ОН (31), N-51-Рго-О1у-Он (21), М-й-Рго-Оу-ОВи1 (19, К-а-Рго-01у-РЬе-0Ви« (25) по каждому из четырех конформеров как в вакууме, так и в хлороформе. Следовательно, можно говорить« что фрагмент М-&-Рто является достаточно жестким и увеличение длины пептидной цепи не влияет на его пространственную структуру (рисунок 4).

3. Для доминирующих конформеров каждой из трех молекул М-81-Рго-01у-0Н (21), Н-81-Рго-01у-ОВи1 (1С), М-БиРто-О^-РЬе-ОВи1 (23) совпадают пространственные

структуры фрагмента М^-Рго-Оу. Таю<м образом, фрагмент N-81-?«) определяет конформацию следующего за ним аминокислотного остатка, а именно 01у .

Рисунок 4. Доминирующие в хлороформу вднфо^меры фОУШ-трм.'ф молекул N-51-Рго-ОН (а), М-51-Рго-01у-0№ (б)> М.51-Ргог01у.-ОВи!'(д),и,К-81-Рго-01у-РЬе-ОВи< (г). Пунктиром обозначена водородная связь.

4. Образуется более устойчивая и энергетически более выгодная структура, если в процессе генерирования она стабилизируется с помощью внутримолекулярной водородной связи. Так, в доминирующих конформерах (Т>ОУ/и-транс) всех структур, содержащих фрагмент Ы^-Рго (16, 21, 25, 31), рассчитанных в вакууме присутствует внутримолекулярная водородная связь между карбонильным кислородом стеароильного остатка и амидным протоном 01у, образуя так называемый у-поворот (со связью 3-»1). Доминирующие конформеры Ы-51-Рг0-01у-0Ви1 фОМЧ-луюнг) и М-81-Рго-01у-РЬе-ОВи* (00\УК-/я/*7Л£), рассчитанные в среде хлороформа, также' стабилизированы внутримолекулярной Н-связью. В этом случае трипептнд менее "изогнут" чем дипептид, образуя 0-поворот со связью типа 4-»1 между карбонильным кислородным атомом стеароильного остатка и амидным прогоном Пи

б)

Рисунок 5. Доминирующие в хлороформе конформеры ( ООУЛЧ•транс) молекул г-Оу-Рго-ОА1к (а), Вос-РЬе-С1у-Рго-ОА1к (б), Вос-О1у-Рго-0А1к (в).

5. Молекулы, в которых высший жирный остаток присоединен к остатку пролина не в виде N-стеароила, а в виде октадецилового эфира, обладают большей гибкостью по сравнению с первыми. Однако, и в этом случае наблюдается структурное сходство фрагмента Pro-OAlk дня конформеров молекул Boc-Pro-OAlk (1) и Boc-Gly-Pro-OAlk. (4) Интересно, что Z-Gly-Pro-OAlk (2) обладает большим структурным сходством с Boc-Phe-Gly-Pro-OAlk (б), чем с Boc-Gty-Pro-OAlk (4) (рисунок 5)

6. Структуры, в которых высший алифатический остаток ( N-стеароил или октадециловый эфир) присоединен не к остатку пролина, а к остатку глицина, обладают существенно большей гибкостью и для них не было обнаружено конформационно устойчивых фрагментов.

Закономерности, выявленные в результате расчетов в среде вакуума и хлороформа, в.основном, дают ключ к пониманию возможного поведения синтезированных лилопептидов о составе модельных мембран. Однако, необходимо учитывать, что пептидная часть этих соединений, встроенных в фосфаткдилходиновый бислой. находится вблизи поверхности раздела литщд-вода и не может не испытывать влияния молекул структурированной воды. Как упоминалось выше, результатом этого влияю« может явиться сдвиг цис-тракс-рымоъьсня. Использование опции DOCK позволило смоделировать ситуацию образования сольвата с молекулой субструктуры, в данном случае с молекулой воды в среде хлороформа. После расчета соотношения конформеров по формуле Больцмана, было обнаружено, что происходит смешение цис-транс-равновесия, по сравнению с состоянием в "чистом" хлороформе. Для соединений, содержащих фрагмент Gly-Pro, наблюдалось значительное изменение качественной картины разновесного состояния. У Boc-Gly-Pro-OAIk (4), Boc-Phe-G!1 Pro-OAlk (б) и N-St-Gly-Pro-OH (23) происходило смещение равновесия в crept,лу сильного преобладания /л/ю/лжонформера; у N-St-Cly-Pro-OMe (18) начинал преобладать 4'да-конформер, вклад которого в "чистом" хлороформе в равновесное состояние составлял 17% процентов (таблица 3). Образование сольватов не влияло существенным образом на распределение конформеров для окгадецнловых и N-стеарочльиых производных соединений, содержащих связь Pro-Gly.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны схемы синтеза и получены ' N-стсароильные и О-октадецилоаые производные гиорофобных пролин содержащих пептидов и их дейтериймеченыс аналоги.

2. Изучено влияние присоединения высшего алифатического остатка по С- или по N-концу на синтез пелггидов, содержащих связь Pro-Giy и Gly-Pro. Установлено, что использование октадецилового эфира в качестве постоянной защитной группы уменьшает различия в лабильности этих двух связей.

3. Методами 2Н- и }|Р-ЯМР-спекгроскопии показано, что пролинсодержящис ли-попехтгиды способны встраиваться в фосфатидилхолиновый бислой без нарушения его структуры.

4. С помощью методов 'Н-, |}С-ЯМР и компьютерного моделирования установлено, что все синтезированные пролин содержащие липопегттиды, за исключением Вое-Pro-Gly-OAlk, существуют в растворе хлороформа в виде смеси «мг-лдоде-конформеров по Х-Рго-связи.

5. Смоделировано образование сояьватов липопептидов с водой в неполярной среде хлороформа. Продемонстрировано, что сольватация способна вызвать качественное изменение цис-транс~равновесия у "гибких" структур, содержащих фрагмент Gly-Pro, в отличие от соединений, содержащих фрагмент Pro-Gly.

6. Методами 'Н-, 1 *С-ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования установлено, что N-St-Pro является конформационно жестким фрагментом, в котором имидная связь существует преимущественно в «рвме-конфшурации. Пространственная структура этого фрагмента не изменяется с увеличением длины пептидной цепи и добавлении сольватной воды как в твердом состоянии (вакууме), так и в распоре (хлороформе).

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1) Исхакова Ф.Х., Есипова О.В., Звонкова ЕН. Синтез октадециловых производных гидрофобных пролин содержащих пептидов.// Биоорганичесхая химия. 1995. Т.21. N 7. С. 518-523.

2) Исхакова Ф.Х., Есипова О.В., Звонком ЕН. Синтез стеароидьных производных гидрофобных пролинсодержащих пептидов.// Биоорганическая химия. 1995. Т.21. N 8. С 596-603.