Новые варианты n-мерной планарной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

11-4 2840

На правах рукописи

ХРЕБТОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

НОВЫЕ ВАРИАНТЫ и-МЕРНОЙ ПЛАН АРНОЙ ХРОМАТОГРАФ МП

Специальность 02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Ордена Трудового Красного знамени Институте нефтехимического синтеза имени А.В.Топчиева РАН

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Березкин Виктор Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Красиков Валерий Дмитриевич

Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН, г. Санкт-Петербург

кандидат химических наук, доцент Смоленков Александр Дмитриевич

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Химический факультет, г. Москва

Ведущая организация:

Химический факультет Санкт-Петербургского государственного университета, г. Санкт-Петербург

Защита состоится 12 октября 2011 года в 15 часов 00 минут в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан_сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.й. Торочешникова

российская государственная 5;;г:лиотека 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), открытый в 1938г Н.А.Измайловым и М.С.Шрайбер, является современным, простым и достаточно эффективным методом жидкостной хроматографии в аналитической практике. ТСХ активно и успешно используют в научных исследованиях, медицине, фармацее, контроле окружающей среды и промышленности. В России этот метод используют более, чем в 10000 лабораторий, однако за рубежом ТСХ применяют более широко. Так, например. Британская фармакопея 2009 года содержит -2000 методик, в которых ТСХ используют для анализа фармпрепаратов, а XII Государственная фармакопея РФ, к сожалению, содержит не более 10 аналитических методик с применением ТСХ. Широкое распространение ТСХ во всем мире обусловлено следующими преимуществами метода: простотой, высокой селективностью, удовлетворительной экспрессностыо и высокой экономичностью.

Впервые Консденом, Гордоном и Мартином в 1944г был реализован метод двумерной (20) хроматографии на бумаге - первый метод и-мерной планарной хроматографии. В 1951 г Кирхнер и сотр. реализовали двумерный вариант в тонком слое, позволяющий на одной пластинке разделять принципиально большее число компонентов. Проведенная нами наукометрическая оценка современного состояния планарной хроматографии показала, что простейший вариант п-мерпой ТСХ является в настоящее время одним из наиболее часто используемых методов. Интересно отметить, что в период 1980-1990 гг, так же, как и в период 2000-2010 гг доля публикаций по использованию в ТСХ 20 варианта составила 11%. Разрешающая способность 20-ТСХ ограничена тем, что, во-первых, для разделения используют только две подвижные фазы и, во-вторых, эти две фазы используют для разделения всех компонентов разделяемой смеси. Поэтому актуальной задачей являлось развитие методов, в которых практически в одном аналитическом эксперименте используют различные селективные подвижные фазы, т.е. развитие методов

мпогомерной ТСХ. Это позволит существенно улучшить разделение компонентов смеси и, следовательно, расширить практическое применение метода.

Поскольку результат разделения в ТСХ определяется не только используемым методом, но и условиями его реализации (и, в первую очередь, используемой хроматографической камерой), представлялось необходимым уделить большее внимание изучению и оценке основных, используемых в ТСХ камер, обращая особое внимание на обоснование выбора наиболее оптимальной камеры, поскольку изучению этой важной области ТСХ уделялось недостаточное внимание, а в литературе отсутствовали данные, позволяющие сделать обоснованный выбор.

Цель работы: разработать новые, простые варианты и-мерной пленарной хроматографии, характеризующиеся повышенной разрешающей способностью и экспресспостыо.

Для достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие исследования:

• для объективного обоснования основных направлений работы следовало провести наукометрическую оценку современного состояния ТСХ;

• выявить особенности реализации хроматографических процессов в современных, наиболее часто используемых камерах для ТСХ, провести их сравнение с целью выбора оптимальной и при необходимости разработать новые, более оптимальные;

• изучить особенности механизма разделения в варианте ТСХ с контрпластинкой и предложить новые способы его реализации;

• показать аналитические возможности предложенного варианта ТСХ на практических примерах.

Научная новизна

Проведенное наукометрическое исследование за период 1980-2010гг позволило выявить основные тенденции ее развития. Результаты наукометрического исследования показали, что в настоящее время метод

двумерной ТСХ активно и успешно используется, что свидетельствует о целесообразности дальнейшего развития «-мерной ТСХ, было показано, что в качестве адсорбента в ТСХ наиболее часто используют силикагель, разделение выполняют в Ы- (75%) и 8-камерах (12%), выявлены 10 наиболее часто используемых подвижных фаз.

Предложен новый подход к развитию я-мерной ТСХ, в котором хроматограмму, полученную после первичного разделения разрезают па п пластинок, каждая из которых содержит группы частично разделенных соединений, далее каждую «дочернюю» пластинку проявляют, используя наиболее селективную для разделения содержащейся на ней группы частично или плохо разделенных соединений подвижную фазу. Реализованы варианты 3-х, 4-х и 5-ти-мерной ТСХ (возможно также реализовать «-мерную ТСХ с большим значением и), характеризующиеся высокой разрешающей способностью и экснрессностыо, так как каждое разделение, следующее после первичного, возможно выполнять одновременно и независимо. На новым вариант ТСХ получено решение Роспатента о выдаче патента РФ на «Способ многомерной тонкослойной хроматографии».

Проведено исследование особенностей проведения разделения па пластинках ТСХ в наиболее распространенных камерах (М-,8т;„-, 0-камсрах). Показано, что для получения воспроизводимых результатов при использовании Ы-камеры необходимо предварительно насыщать парами подвижной фазы атмосферу камеры и сорбционный слой пластинки ТСХ. Изучена зависимость результатов хроматографического разделения от степени предварительного насыщения слоя сорбента пластинки ТСХ парами подвижной фазы для 10 наиболее часто используемых подвижных фаз при выполнении анализа в М-камере; так, например, для насыщения сорбционного слоя пластинки парами этилацетата достаточно 5 мин, а парами этанола - 50 мин.

При исследовании результатов разделения, полученных при использовании 0-камеры, показано, что хроматографические характеристики существенно зависят от толщины и типа прокладки, используемой для

отдслсешя слоя сорбента от стеклянной стенки камеры. Отметим также, что данная камера, хотя и обладает определенными преимуществами, является более сложной в использовании, чем, например, Ы- или Б-камеры.

В результате систематического изучения характеристик хроматографического разделения, полученных в Б-камере с различными параметрами, предложен новый вариант Б^-камеры, отличительной особенностью которого является минимальное расстояние (с!) между слоем сорбента на пластинке и стенкой камеры (сМ). 1-0.2 мм). Это позволило существенно улучшить хроматографические характеристики метода ТСХ (продолжительность разделения сокращается на 25-30%, эффективность увеличивается на 20%). На конструкцию новой камеры получено решение Роспатента о выдаче патента РФ на «Сэндвич камера малого объема для тонкослойной хроматографии».

Изучены основные особенности хроматографических процессов в варианте ТСХ с контр-пластиикой и предложены новые варианты его реализации, позволяющие повысить разрешающую способность метода ТСХ, а также повысить его эффективность.

Практическая значимость проведенных исследований.

1. Новые варианты »-мерной хроматографии, в которых все разделения, реализуемые после первого, возможно выполнять одновременно и независимо, используя различные селективные подвижные фазы, позволили выполнять многомерное разделение, аналогичное по продолжительности проведению двумерного, и существенно улучшить результаты разделения.

2. Применение запатентованной конструкции предложенной в работе 8тт-камеры совместно с ФГУП ГосНИИгенетика к анализу смесей внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов позволило значительно сократить продолжительность анализа (-30%), так как данная камера позволяет выполнять воспроизводимое разделение без предварительного насыщения, и улучшить эффективность разделения (-20%) по сравнению с традиционной Ы-камерой. Разработана новая элюирующая

система для определения внутриклеточного пула рибопуклсозидов и рибонуклеотидов, в которой токсичный раствор аммиака заменен па раствор карбоната натрия, без снижения селективности разделения.

3. Разработанный метод многомерной ТСХ при реализации в Sm„,-камере был применен для разделения смесей красителей, пигментов красителей и смолы пиролиза бензина, содержащей полиароматические углеводороды.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты работы были изложены в 12 статьях в ведущих российских и зарубежных журналах и 2-х патентах РФ на изобретения, а также доложены и обсуждены на следующих международных и отечественных конференциях: Научной конференции ИНХС РАН, посвященной 75-летню Института (Москва. 2009), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и ланотехнологии» (Самара, 2009). 51'1 Conference on Separation and Related Techniques by Nordic Separation Science Society (Tallinn, Estonia, 2009), I Всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитической фармацевтической продукции" (Москва, 2009), Съезде аналитиков России (Москва, 2010), I Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар. 2010), Conference "Interfacial phenomenon yesterday, today and tomorrow" (Lublin. Poland, 2010), International Symposium for High-Performance Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 2011); а также сделай доклад на семинаре во время стажировки (01.03.2011-29.03.2011) в Институте химии Университета Яна Кохаиовского в Кельцах (Польша).

Вклад автора

Все проведенные экспериментальные исследования выполнены лично автором. Диссертантка принимала активное участие в интерпретации полученных результатов, написании статей, разработке патентов, подготовке докладов на конференциях и симпозиумах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование актуальности темы диссертации;

2. Новые более эффективные и экспрессные методы «-мерной пленарной хроматографии;

3. Особенности хроматографического разделения в основных типах хроматографических камер и новом варианте Бт^-камеры, характеризующимся минимальным расстоянием между стенкой камеры и слоем сорбента пластинки;

4. Сравнительная оценка основных типов камер в ТСХ: >]-камеры, Б-камеры и 0-камеры;

5. Особенности процесса хроматографического разделения в варианте ТСХ с контр-пластинкой и новые методы его реализации.

Объем н структура работы. Диссертационная работа объемом 201 страница машинописного текста состоит из общей характеристики работы, 4 глав, выводов, приложения, содержит 50 рисунков, 38 таблиц и списка литературы из 164 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 глава. Основные тенденции развития планарной хроматографии

содержит данные наукометрического исследования по изменению основных характеристик планарной хроматографии за последние 30 лет, что позволило выявить основные тенденции ее развития. Основное внимание было уделено рассмотрению следующих наиболее важных характеристик ТСХ: методы хроматографии, тип хроматографической камеры, способ проявления пластинки, предварительная подготовка камеры и пластинки к процессу хроматографического разделения, способы нанесения анализируемых проб на пластинку, подвижные и неподвижные фазы, и т.п. Полученные данные подтверждают актуальность темы диссертационной работы.

2 глава. Развитие л-мерной ТСХ. Новые методы ТСХ с повышенной разрешающей способностью включает обзор литературы по тематике многомерной планарной хроматографии, современное определение и-мерной ТСХ, обсуждение существующих вариантов двумерной хроматографии, теоретические основы метода, а также его практическое значение.

Трехмерная планарная хроматография, основанная на использовании известных принципов традиционной двумерной ТСХ. Ранее были высказаны только теоретические соображения 1 ' 2 о существенном увеличении разрешающей способности ТСХ при реализации трехмерного варианта (30) в объемном «кубике» сорбента на одной пластинке. Стандартная схема реализации трехмерной ТСХ, основанная на простом развитии метода двумерной ТСХ, приведена на рис.1.

1D 3 соединения

2D 5 соединений

3D 17 соединений

1D 3 соединения

2D 5 соединений

3D 11 соединений

а б

Рис. 1. Хроматограммы разделения смесей красителей, полученные в результате реализации трехмерной ТСХ, стрелками указано направление движения подвижной фазы; пластинки

ПТСХ-АФ-В-УФ (ИМИД. Россия); а) проба, состоящая из 21 красителя (компоненты указаны в табл.2), б) проба, состоящая из 11 красителей (кристаллический фиолетовый, ксилсн ханол, нейтральный голубой, бромтимоловый синий, метаниловый желтый,

акридиновый оранжевый, индофенол, ариабсл красный, судан синий, судан II, димстиламиноазобензол). Разделение выполнено в Ы-камсрс без предварительного

насыщения.

Для того, чтобы оценить, является ли предложенный вариант ЗО-ТСХ более эффективным, по сравнению с одномерным и двумерным разделением, представлялось целесообразным выяснить изменение эффективности разделения при переходе от Ш- к ЗО-раздсленнго. Результаты разделения смесей красителей в вариантах Ю-, 20- и ЗО-ТСХ на пластинках размером 7x7см приведены в табл. 1.

Giddings J.C. Unified Separation Science. New York: John Wiley and Sons, 1991. -320 p.

2Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. М.: Научный совет РАН по хроматографии, 1990. Т.1.^05 е., Т.2.-348 с.

Таблица

Хроматарафические характеристики разделения смесей красителей,

Варианты л-мерного разделения Количество разделенных зон Средняя эффективность (N) Средняя продолжительность анализа(/ , мин)

рис. 1а рис. 16 рис.1а рие.16 рис. 1а рис.1б

ЮТСХ 3 из 21 3 из 11 960 810 Зв 32

20 ТСХ 5 из 21 5 из 11 1060 920 74 44

30 ТСХ 17 из 21 11 из 1 1 1190 1000 86 62

Приведенные в табл. 1 данные показывают, что при увеличении числа независимых разделений па одной пластинке увеличивается как число разделенных компонентов, так и эффективность разделения. Вариант ЗЭ-ТСХ является более эффективным на -30%, по сравнению с 2Б, и на -40%, по сравнению с Ш-ТСХ. К сожалспшо, вариант трехмерной ТСХ является более продолжительным по сравнению с одномерной и двумерной ТСХ, что ограничивает его применение. Однако нередко влияние этого недостатка можно существенно снизить, используя уменьшенные по размеру пластинки ТСХ.

Предложенный вариант трехмерной ТСХ позволяет разделять более сложные смеси, по сравнению с двумерной ТСХ (хотя, не всегда для полного разделения пробы достаточно трех подвижных фаз), однако он требует большей работы при интерпретации результатов, также вариант не обладает достаточной селективностью, так как все используемые подвижные фазы одновременно применяют ко всем соединениям разделяемой пробы.

Новый подход к развитию многомерной ТСХ. В основе разработки нового варианта многомерной ТСХ лежит, во-первых, осознание того факта, что при первом разделении исследуемой смеси аналитик получает, как правило, такое разделение, в котором можно выделить несколько групп соединений (например, три): 1) группа хорошо сорбируемых соединений (с низкими значениями 2) группа средне сорбируемых соединений (со средними значениями Я^) и 3) группа плохо сорбируемых соединений (с высокими значениями Я,). С целью независимого использования различных подвижных фаз для последующего разделения компонентов пробы, пластинку после первого разделения разрезали под прямым углом (к траектории движения подвижной фазы в первом направлении) на три меньших по ширине

прямоугольных пластинки, каждая из которых содержала, например, одну из частично разделенных групп соединений.

Для последующих «вторых» разделений, нам представлялось целесообразным использовать, не одну, а, например, три подвижные фазы с различной силой растворителя (в соответствии с тремя выделенными группами первично разделенных соединений). Поэтому после первого разделения, каждую из трех прямоугольных частей первоначальной хроматографической пластинки помещали в отдельную камеру, содержащую подвижную фазу, наиболее селективную для разделения содержащейся на ней группы соединений. Каждую из трех "дочерних" пластинок проявляли подвижной фазой, движущейся под углом 90е, по отношению к направлению первого проявления. На рис.2 показана схема реализации 40-ТСХ.

Рис. 2. Схема реализации 40-ТСХ. 1 - первичное разделение пробы; 2 - выделение близких (по удерживанию) групп соединений и разрезание пластинки для дальнейшего детального разделения групп компонентов; 3 - одновременное независимое разделение выделенных групп соединений с использованием различных подвижных фаз. Разделение выполнено в камере без предварительною насыщения на пластинках ПТСХ-АФ-В-УФ (ИМИД, Россия).

В табл. 2 приведены полученные характеристики величин удерживания

(Яг), эффективности ^ - число теоретических тарелок) компонентов, входящих в состав исследуемой смеси и продолжительности разделения (I, мин) 40-ТСХ.

Как следует из приведенных в табл.2 данных, применение нового варианта «-мерной ТСХ позволило получить полное разделение сложной смеси красителей, состоящей из 21 компонента, которые существенно различались по физико-химическим свойствам и структуре. Полученный положительный результат обусловлен возможностью использовать для разделения каждой группы выделенных соединений (см. рис.2) наиболее селективную подвижную фазу.

Таблнца 2. Хромагографичсскис характеристики разделенных компонентов 40-ТСХ в N1-камере без предварительного насыщения (п=7, р=0.95,5г=0.10-0.15)__

Этап разделения Подвижная фаза Наименование и помер компонента Величина удерживания, Яг Эффективность, N Продолжительность этапа, мин

Первое разделение исследуемой пробы

1 Толуол -этанол (6.5:3.5, у.ч>) 1. Метиловый красный 2. Сиба-Ф11 3. Флуорссцин 0.56±0.03 0.62±0.05 0.65±0.05 2670 2960 3370 38

Последующие разделения отдельных групп первого разделения на прямоугольных пластинках

2* Этанол -уксусная кислота (9:1, у:У) 4. Тимоловый синий 5.Кристаллический фиолетовый 6. Мстаниловый желтый 7. Бромфеноловый синий 8. Метиловый синий 9. Ксилсн ханол 0.07±0.01 0.60±0.05 0.40±0.03 0.75±0.04 0.51 ±0.04 0.58±0.03 5260 8800 1310 3530 4420 1530 36

3* Ацетон 10. Акридиновый оранжевый 11. Нейтральный голубой 12. Бромтимоловый синий 13. Бромфеноловый красный 14. Кислотный красный 15. Метиловый оранжевый 0.04±0.01 0.82±0.04 0.05±0.01 0.66±0.03 0.83±0.04 0.11±0.03 2500 3660 270 1250 3430 290 13

4* Толуол 16. Индофенол 17. Ариабел красный 18. Судан синий 19.'Судан 11 20. Диметил-аминоазобензол 21. Розалннин 1 0.05±0.01 0.13±0.01 0.26±0.02 0.39±0.02 0.52±0.03 0.80±0.03 80 180 1030 960 1270 2520 21

тгапы 2,3,4 осуществляются одновременно и независимо.

Одним из достоинств предложенного варианта, например, по сравнению с трехмерной ТСХ, является то, что на каждом этапе разделения не происходит дополнительного размывания зон соединений при использовании новых подвижных фаз, так как каждую пластинку ТСХ независимо проявляют только двумя фазами.

Новый вариант «-мерной ТСХ, характеризуется высокой селективностью (эта же смесь методом ЗЭ-ТСХ не была разделена полностью (рис.1а)), высокой разрешающей способностью (разделенные зоны не перекрывают друг друга) и высокой экспрессностыо.

Предложенный подход к разделению многокомпонентных смесей может быть также реализован как 3-х, 5-ти и »-мерный, «мерность» будет определяться в каждом случае поставленной задачей.

3 глава. Изучение особенностей реализации ТСХ в камерах различного тина. Обзор литературы по тематике аппаратурного оформления ТСХ показал отсутствие четких рекомендаций по выполнению хроматографического разделения и использованию различных камер, а также неоднозначность мнений по оптимальной реализации эксперимента: например о необходимости насыщения камеры, о ее оптимальной конструкции и т.п.

Для подробного изучения бьгли выбраны следующие основные гнпы камер, отличающиеся конструкцией и объемом газового пространства, контактирующего со слоем сорбента (V) (рис. 3): Ы-камера {V— 1500 см'). Б-камера (У<30 см1), и 0-камера («нулевая» камера) (\/=0).

В настоящее время 1Ч-камера является наиболее широко используемой камерой (более чем в 60% публикаций хроматографисты выполняют разделение в М-камере). При реализации хроматографического разделения и М-камере без предварительного насыщения погрешность результатов разделения составляет -15%, что может объясняться постоянной сорбцией, которая зависит от многих плохо контролируемых факторов, паров подвижной фазы слоем сорбента во время разделения. Отметим также, что осуществить ненасыщенную ТСХ в М-камере невозможно, причем процесс разделения без операции предварительного насыщения Ы-камеры выполняют наиболее часто.

Реализация проявления в М-камере существенно зависит от степени насыщения камеры, которая определяется продолжительностью насыщения, а также от того, насыщали ли предварительно парами подвижной фазы слой сорбента, на котором затем проводили разделение. Хроматографисты полагают, что они работают в режиме насыщенной ТСХ, хотя они обычно ограничивались только насыщением камеры и лишь в 2% публикаций предварительно насыщали сорбционный слой пластинки парами растворителя. В данной работе было выполнено разделение при различных условиях насыщения.

- 14-б„___2

Рис. 3. Основные типы хроматографичсских камер, используемых для реализации восходящего режима проявления: а - Ы-камера, б - Э-камера; в - 0-камсра для реализации ТСХ с закрытым сорбционным слоем. 1- камера, 2 - крышка камеры, 3 - пластинка ТСХ, 4 -подвижная фаза, 5 - покровные стекла, 6 - полимерная пленка (например, тефлоновая). Хроматограммы, полученные при разделении в насыщенной 1^-камере на

слое сорбента, предварительно насыщенном парами подвижной фазы, и в

ненасыщенных М-, Б-, 0-камерах, приведены на рис.4.

Насыщенная ТСХ П Г^-к-ямепе...... Разделение в ненасыщенной Разделение в Разделение в ненасыщенной

К-камере 0-камсрс Бшш-камере

* # * I * Ф Ф $ * :* % $ # * Ф £ * « * ♦ < 5 * < ф Ш # #

а б В Г

Рис.4. Хроматограммы, полученные при разделении смеси

красителей в различных типах камер; пластинки ПТСХ-АФ-В-УФ (Сорбфил), подвижная фаза - толуол.

Результаты хроматографического разделения, приведенные на рис. 4а,б, позволяют сделать вывод о том, что предварительное насыщение значительно снижает (на -50%) подвижность разделяемых соединений (Я^, однако при этом повышается и сходимость характеристик разделения до 5%. Однако продолжительность хроматографического процесса в насыщенной камере значительно меньше (на -50 %), по сравнению с продолжительностью аналогичного разделения в М-камере без предварительного насыщения (если не учитывать время, затраченное на насыщение), а разделение при этом хуже.

В работе предложен простой экспериментальный метод оценки степени насыщения слоя сорбента прами подвижной фазы. При проведении этого исследования использовали гравиметрический метод. Полученные данные позволили определить время, необходимое для достижения определенной

степени насыщения (X). Полученные экспериментальные данные по кинетике адсорбции паров подвижной фазы слоем сорбента удовлетворительно описываются следующим уравнением кинетики адсорбции: a(i) = />[| -е ' J (где а - общий вес адсорбированных на пластинке паров подвижной фазы за время /. к - константа скорости, b - предельная величина (вес) паров подвижной фазы, адсорбированных пластинкой). Экспериментальные данные по кинетике были получены для 10 наиболее часто используемых подвижных фаз для пластинок «ИМИД» (Россия) и «Мегск» (Германия). Погрешность результатов гравиметрического метода составляет менее 5%.

Результаты хроматографического разделения, полученного па пластинках, сорбционный слой которых имеет различную степень насыщения, покачали, что при проявлении пластинки в насыщенной N-камере (без операции предварительного насыщения адсорбционного слоя парами подвижной фазы) возможно получить разделение, близкое к разделению, полученному в ненасыщенной предварительно N-камере на пластинке, сорбционный слой которой был насыщен в течение 2-10 мин (при этом X составляет 45-60%. причем значения подвижностей разделенных зон и величины их размывания будут близкими по величине). Однако, чем больше степень насыщения, тем ниже погрешность результатов разделения.

Сравнивая общие затраты времени на реализацию различных методов ТСХ, несомненно, необходимо учитывать общую продолжительность процесса, которая включает сумму времен: 1) предварительного насыщения и 2) собственно разделения.

На рис. 5 приведена зависимость степени разделения (Rs) ог степени предварительного насыщения сорбционного слоя пластинки парами элюен га (X).

Как следует из данных рис.5, значения критерия Rs для компонентов исследуемой смеси заметно уменьшаются при переходе от ненасыщенной ТСХ (Rss=3.0-5.0) к насыщенной (Rs« 1.2-1.6). причем наибольшее уменьшение величины Rs происходит в области, соответствующей минимальной степени адсорбционного насыщения пластинки X = 45-70%.

А

Rs

ж

♦ Сиба -Fll-Индофенол д Индофенол-Ариабел красный Ариабел красный-Судан синий ж Судан синий-Судан II

степень насыщения, %

О

О

10 20 30 40 50 60 70 80 90

Рис.5. Зависимость критерия разделения Кз (среднее значение) для исследуемых красителей от степени насыщения пластинки ТСХ парами подвижной фазы (толуола). Условия разделения: Ы-камсра, пластинки ПТСХ-АФ-В-УФ (ИМИД, Россия), Т=24°С.

Проведенное исследование для Ы-камеры позволяет сделать вывод о том,

что максимальную степень разделения возможно достичь в ненасыщенных условиях на ненасыщенных пластинках или после предварительного насыщения в течение нескольких минут, однако при этом сходимость результатов серии экспериментов весьма низкая (-15%).

Многие годы усилия хроматографистов были направлены на создание таких условий эксперимента, которые было бы несложно воспроизвести, и воспроизводимо повторить, причем хроматографический процесс не был бы длительным. Многие известные хроматографисты, работающие в области пленарной хроматографии, многократно отмечали, что наличие газовой атмосферы, окружающей пластинку, отрицательно влияет на воспроизводимость хроматографического процесса и на результаты хроматографического разделения2' 3 . В связи с этим, представлялось целесообразным реализовать хроматографическое разделение в 0-камере4, которую можно рассматривать как плоскую прямоугольную квази-колонку. При реализации процесса в данной камере эффективность разделения, как

; Issaq H.J. (Ed) A Century of Separation Scicncc. New York: M. Dckker, 2002. - P. 755.

Bcrezkin V.G., Buzaev V.V. New thin-layer chromatography plate with a closcd sorbent layer and

details of its application // J. Chromatogr. A. 1997. V. 758. P. 125-134.

известно 5 , несколько выше, чем при проведении ТСХ в Ы-камере. а продолжительность эксперимента заметно меньше (па 25-30%). Хроматограммы. полученные при разделении в 0-камсре, приведены па рнс.4и.

Хроматограммы па рис.46) и в) позволяют заключить, что при осуществлении разделения в 0-камере подвижность разделенных соединении выше, чем в 1Ч-камере без предварительного насыщения (на -20%). однако размывание зон разделенных соединений несколько выше (на -10%), чем в камере, при этом сходимость результатов разделения (вг) в 0-камере составляет менее 10%.

Неоднократно хроматографисты отмечали, что "только при использовании ненасыщенной в-камеры удается получить правильную оценку хроматографических характеристик"2. Однако па основании проведенной наукометрической оценки литературы, можно сказать, что в настоящее время Б-камеры используются только в -12 % публикаций.

Следует отметить, что различные авторы предлагали и использовали различные конструкции Б-камер. Вначале это была камера с величиной характеристического расстояния между адсорбционным слоем и стенкой камеры сН3 мм и впоследствии величина с/ была уменьшена до 1 мм. Однако роль величины расстояния с! в литературе не обсуждалась.

С целью обоснования оптимальной конструкции Б-камеры нами была изучена зависимость характеристик хроматографического процесса от важнейшей характеристики Б-камеры - величины с/ (в пределах от 0.05 мм до 4 мм) для однокомпонентных подвижных фаз. Результаты, полученные при выполнении данного исследования, приведены на рис. 6, поскольку пластинки ТСХ отечественного и зарубежного производства имеют различную структуру поверхности, то приведены экспериментальные данные для двух видов пластинок.

5 Berezkin V.G., Kormishkina E.V. Study of a New Version of Classical Thin-Layer Chromatography with a Closed Adsorbent Layer //.I. Planar Chromatography. 2006. V.19. P. 81-85.

1Ю0 I

" нлсл

dulI-0,1 мм для пластинок "Merck"

1' характеристическое растояние d, мм

0 0,3 0,6 0.9 1.2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3

Рис. 6. Зависимость продолжительности разделения (1, мин) и эффективности разделения (N) от величины d для пластинок 10x10см; подвижная фаза - толуол; значения эффективности приведены средние для смеси из 6 компонентов. На основании представленных на рис. 6 данных видно, что с увеличением

расстояния d продолжительность анализа увеличивается, по неравномерно. Так,

например, при увеличении расстояния d от 0.4 мм до 2 мм продолжительность

анализа изменяется незначительно (на -5%), однако эта характеристика

увеличивается резко (па 20%) при изменении величины d от 0.05 мм до 0.3 мм.

Отмстим, что полученные данные об ускорении процесса разделения

полностью согласуются с результатами, полученными нами при оценке

времени диффузии молекул подвижной фазы, в зависимости от величины d,

используя уравнение диффузии Эйнштейна if=2Dt (где d - среднее расстояние

диффузии, D - коэффициент диффузии, t - время). Продолжительность (t)

диффузии молекул подвижной фазы, например, на расстояние d= 1.0 мм в 100

раз больше, чем время диффузии молекул на расстояние ¿/=0.1 мм.

Отмстим, что с увеличением расстояния d изменяется также и

эффективность разделения исследуемых соединений. Максимальная

эффективность разделения получена в S-камере с минимальным расстоянием d.

Так эффективность разделения при осуществлении разделения иа пластинках

Silica gel F254 (Merck, Германия) в S-камере с расстоянием d=0A мм выше

эффективности разделения, достигаемой в N-камере в среднем на -25%, на

пластинках ПТСХ-АФ-В (ИМИД, Россия) в S-камере с d= 0.2 мм - на -20%.

Следовательно, по наиболее важным хроматографическим параметрам

(продолжительности, эффективности и величинам подвижности), оптимальной является S-камера с величиной ¿/=0.2 мм для пластинок ПТСХ-АФ-В (ИМИД, Россия) и с величиной d= 0.1 мм для пластинок Silica gel F2>4 (Merck, Германия). При использовании для разделения S-камеры с межплоскостным расстоянием d= 0.2 мм продолжительность анализа сокращается на 20% (по сравнению с разделением в N-камере), при использовании S-камеры с расстоянием d= 0.1 мм - на 35%. Аналогичные зависимости получены для 10 наиболее широко используемых подвижных фаз.

С целыо дополнительного увеличения разрешающей способности метода ТСХ представляло интерес изучить вариант Smin-KaMepi»i с сухой контрпластинкой. Использование в Smj„-KaMepe вместо покровного стекла пластинки ТСХ с адсорбционным слоем позволит фактически использовать для разделения пробы дополнительный объем подвижной фазы в результате ее адсорбции на слое контр-пластинки. Механизм расхода подвижной фазы на проведение процесса разделения в 5]Шп-камере с контр-пластинкой приведен на рис. 7.

Рис.7. а) Схема реализации эксперимента и Smi„-KaMopc с сухой контр-пластинкой. б) Схема массообмсна подвижной фазы в системе Smin-камсры с сухой контрпластинкой. 1, емкость с подвижной фазой. 2, разделяющая пластинка, 3, сухая контрпластинка, 4, ограничитель, 5, "мокрая"

часть разделяющей пластинки, 6, фронтальный участок жидкой подвижной фазы, 7, насыщенная парами подвижной фазы часть контр-пластинки, 8, сухая часть контр-пластинки, на которой происходит адсорбция паров подвижной фазы, 9, пары подвижной фазы.

Следует отметить принципиальную особенность процесса разделения в Smin-камере с контр-пластинкой (рис. 76): десорбция подвижной фазы с разделяющей пластинки и ее последующая адсорбция па контр-пластиике имеет место только в области фронта подвижной фазы на разделяющей пластинке, поскольку в области, находящейся позади фронта подвижной фазы, нет условий для следующего двухстадийного процесса: 1) десорбция

подвижной фазы в газовую фазу, и 2) последующая адсорбция насыщенных паров па коптр-пластинку по следующей причине: часть адсорбционного слоя коптр-пластиики уже "занята" - поскольку она уже содержит равновесно адсорбированные молекулы подвижной фазы. Это позволяет обосновать механизм улучшения разделения в рассматриваемой 8пшГкамере с контрпластинкой, который был подтвержден экспериментально.

Использование сухой контр-пластинки в 8тчГкамере, позволило, во-первых. увеличить разрешающую способность метода (~25 %), что особенно важно для разделения соединений с низкими значениями величин подвижности (Яг<0.2), во-вторых, существенно (до 50%) увеличить величины Я, (особенно в области малых значений подвижности ЛрО-О.З), в-третьих, повысить эффективность разделения в 2.0-2.5 раза. Однако необходимо отметить, что при разделении в 8,,,,,,-камере с сухой контр-пластиикой происходит также некоторое увеличение продолжительности эксперимента (на 20-50%, в зависимости от размеров используемой пластиики), однако во всех случаях хроматографические характеристики заметно улучшаются, по сравнению с разделением в тех же условиях, но без использования контр-пластинки.

Сравнение хроматографических характеристик, полученных в различных типах хроматографических камер. Для характеристики различных камер па рис. 8 приведены полученные зависимости расстояния, пройденного фронтом подвижной фазы ) от времени (I).

Согласно полученной зависимости, продолжительность разделения в Биокамере с минимальным расстоянием (0.1 мм) на -10% выше, чем в 0-камере; однако существенно меньше (на -35%), чем в К-камере.

Полученные характеристики эффективности Н (ВЭТТ) приведены в табл. 3, в которую также включены величины степени разделения Из исследуемых соединений.

Z'

60

, см ©'/©с

V * / У г

? Ч// ß '/ / у/ ....... » | : I--*' ! ■ ■ ■

5 10 15 20 25 30 35 продолжительность движения фрокга подвижной фазы, мин

Рис.8. Зависимость пройденного расстояния для

различных камер or продолжительности движения фронта подвижной фазы. I -0-камсра; 2 - SmiP-Ka,\icpa (с/= 0.1 мм); 3 — S„lln-KaMcpa (¿/=0.2mm); 4 - N-камера. Пластинки Silica gel Fi5.i (Merck. Германия), подвижная фаза -толуол, Т=24"С.

Таблица 3. Изменение эффективности и степени разделения для пластинок Silica gel I (Мерк, Германия) при проведении процесса в Smjn-, 0- и N-камсрах, подвижная фаза -- шлуол.

№ Хроматографнрусмое соединение 0-камсра S„,¡„-камера* N-камсра

Н, мкм Rs H, мкм Rs H. mum Rs

1 Сиба-Ф И 20 Rsi -=3.7 19 Rs, 1-З.6 39 Rs, ,= 1.5

2 Индофенол 31 23 29

3 Ариабел красный 20 Rs2.3=3.I 18 Rsj.j=3.l 26 Rs, >-2.8

4 Судан синий 27 Rsi.4=2.6 23 Rs3.4=2.5 21 Rsi .i=2.()

5 Судан 11 18 Rs4.5=3.7 15 Rsj ,=3.7 20 Rsj <=■•?.3

6 Димстиламиноазобензол 13 Rs5,6=2.9 13 Rss.i,=2.8 24 Rs5,,=2.6

Эти. - Этт-камера с (1= 0.1 мм разделение проводили без предварительного насыщения Ы-камсры.

Как следует из данных табл.3, эффективность хроматографпческоп

системы и величины Кб при использовании для разделения 0- и 5т,„-камср близки между собой, однако заметно выше, чем в И-камере. Полученные результаты позволяют заключить, что применение 0- и 8п1|„-камср позволяет реализовать максимальную эффективность и лучшее разделение в режиме ненасыщенной ТСХ.

Важной хроматографической характеристикой разделяемых соединений, которая часто используются для их идентификации, является величина удерживания Яг. Сравнение значений величин подвижности, полученных при разделении хроматографируемых соединений в различных камерах (в К-. и 0-камерах), приведено в табл. 4.

Таблица 4. Сравнение величин Яг исследуемых соединений, полученных в камерах различного типа на пластинках ПТСХ-АФ-В-УФ (ИМИД, Россия) в режиме ненасыщенной

Разделяемое соединение 0-камера втш-каме ра М-камера

Кг Яг Яг вг Кг вг

Тимоловый синий 0.08±0.04 0.07 0.07±0.02 0.05 0.05±0.03 0.14

Нейтральный красный 0.40=0.05 0.07 0.41±0.03 0.04 (>.37±0.07 0.14

Оранжевый желтый 0.84±0.06 0.05 0.84±0.04 0.03 0.78±0.08 0.08

Родамин 0.95±0.07 0.05 0.95±0.05 0.03 0.84±0.08 0.09

*

5лш1 - 5тш-камсра с с!= 0.2 мм;

разделение пластинок проводили без предварительного насыщения Ы-камсры.

Как следует из данных табл.4, значения величин подвижности Яг,

полученных в 5пш,-и 0-камсрах, практически совпадают, что свидетельствует о незначительном влиянии газовой фазы на хроматографические процессы в 8т;п-камере. При разделении проб в ненасыщенной Ы-камере, значения Яг заметно ниже (на -20%), чем в Б,™,- и 0-камерах. Однако отметим, что сходимость характеристик разделения, полученных в ЗППщ-камере, выше, чем в М-камере без предварительного насыщения и в ненасыщенной 0-камере.

Важно отметить, что хроматографичекий процесс в 0-камере является примером строго ненасыщенного хроматографического процесса в ТСХ. На основании проведенных исследований можно сказать, что процесс в 5„11Г1-камере также является квази-ненасыщенным (почти ненасыщенным). Хроматограмма, полученная при реализации разделения в 8тт-камере, приведена на рис. 4г и аналогична хроматограмме, приведенной 4в, однако с меньшим размыванием хроматографических зон.

Проведена оценка использования вщ^-камеры и традиционной IV-камеры (без предварительного насыщения) при реализации многомерных разделений. В табл.5 приведены основные хроматографические характеристики, полученные при реализации 2Э-ТСХ в различных камерах.

Интересно отметить, что хотя величины Яг, полученные при реализации 20-ТСХ в М- и 8шш-камерах, близки друг к другу, однако для всех рассмотренных соединений величины удерживания, полученные в Ы-камере, несколько меньше, чем в Б.^-камере, независимо от используемой подвижной фазы, т.е. К|(1Ч-камера)/Я({$т1Г,-камера)<1.0. Проведение 2В-ТСХ в 5шт-камере так же позволяет получить несколько лучшее по эффективности разделение,

чем при использовании >]-камеры. Как и следовало ожидать, реализация двумерной ТСХ в Бш^-камере позволяет сократить продолжительность хроматографического разделения более, чем на 20%. как и при выполнении одномерного разделения.

Таблица 5. Основные хроматографичсскис характеристики разделяемых соединении.

Соединение Величины Кг Эффективность Н, мкм

Ы-камера1 ^тт-камера 1 н | (¿=0.1 мм) | л,.(5„„„) ^¡.„„-камера! //(У ) Ы-камсра! / Г,, , ' - 1 | ((7=0. 1 мм) | //( У)

1 направление, подвижная фаза - ацетон

Бриллиантовый зеленый 0.05±0.01 0.06±0.01 0.83 75 70 0.93

Родамин С 0.29±0.03 0.31 ±0.02 0.94 34 30 0.8.V

Эритрозин 0.56±0.04 0.58±0.02 0.97 22 21 0.95

Неразделенная зона 0.91 ±0.04 0.93±0.02 0.98 22 21 0.95

5г 0.07-0.15 0.03-0.05

2 направление, подвижная фаза - эти л ацетат

Родамин С 0.08±0.01 0.11±0.0 Г 0.73 63 61 0.97

Эритрозин 0.36±0.03 0.39±0.02 0.92 48 47 0.9,У

Нейтральный красный 0.40±0.03 0.45±0.02 0.89 45 44 ОМ

Метиловый красный 0.85±0.05 0.90±0.01 0.94 13 11 0.85

Оранжевый С 0.95±0.05 0.97±0.01 0.98 10 9.0 0.90

Яг 0.07-0.12 0.03-0.05

Общее время 1. мин 43.3±0.5 35.9±0.5

Сравнение результатов разделения, полученных в 14- и Бтт-камерах, было также проведено и при реализации 40-ТСХ, результаты которого подтверждают закономерности, выявленные при двумерном разделении в Б,,,,,,-камере: а именно при использовании для разделения 5т|п-камеры получено более эффективное и экспрессное разделение. Таким образом, проведенное исследование подтверждает преимущества использования БцНп-камеры, положительные характеристики которой сохраняются и при выполнении многомерного разделения.

4 глава. Практическая реализация предложенных подходов. В работе показана целесообразность использования 5т;„-камеры для разделения рибонуклеозидов и рибонуклеотидов внутриклеточного пула с использованием трехкомпонентных подвижных фаз. Использование Б™¡„-камеры позволило не только повысить разрешающую способность разделения аналитов (на -20%),

по и сократить продолжительность анализа (на -30%). Следует отметить, что использование SITljri-KaMepbi позволило также исключить стадию предварительного насыщения, которая в данном случае составляла 45 мин. Для разделения вышеуказанных компонентов предложена элгоирующая система, позволившая заменить токсичный раствор 25-% аммиака, входящего в состав элюеита, на раствор карбоната натрия, причем селективность разделения при этом не изменилась.

На основании сравнительного анализа предложенной Smj„-KaMepbi и коммерчески-доступпой горизонтальной DS-камеры (Chronicles, Польша), которая с 1990г была использована более чем в 150 работах, при разделении различных смесей (эфиров, красителей методом 1D-TCX и витаминов методом 2D-TCX) сделан вывод о практической равноценности вышеуказанных камер. Проведенное исследование позволяет рекомендовать к использованию в аналитической практике S,„¡„-камеру, конструкция которой отличается простотой н малой стоимостью, наряду с коммерчески доступной горизонтальной DS-камсрой.

Основные выводы

1. Проведено наукометрическое исследование развития ТСХ (методы, аппаратура, области применения и т.д.) за последние 30 лет, позволившее выявить основные тенденции ее развития и обосновать актуальность работы.

2. Разработан новый подход к развитию «-мерной ТСХ, позволяющий существенно повысить разрешающую способность метода при существеном сокращении продолжительности эксперимента. Новый подход основан на независимом и одновременном использовании различных селективных подвижных фаз для разделения отдельных фракций частично разделенных соединений, полученных после первого разделения.

3. Для S-камеры изучена зависимость хроматографических характеристик от величины d. Показано резкое увеличение эффективности и сокращение продолжительности анализа в области малых значений величины d. Показана

целесообразность практического использования при реализации в 5,,,,,,-камерс традиционной одномерной и »-мерной ТСХ.

4. Исследованы основные закономерности проведения хроматографичсского разделения в основных хроматографических камерах, используемых в ТСХ. Показано, что по основным хроматографическим параметрам (продолжительности, эффективности, подвижности, критерию разделения) наиболее оптимальной является Sm¡n-KaMepa с минимальным расстоянием d.

5. В результате исследования малоизученной S-камеры с коптр-пластипкой выяснены основные особенности хроматографичсского процесса в этой камере. Показано, что улучшающее разделение увеличение рабочего объема подвижной фазы является результатом испарения паров подвижной фазы с разделяющей пластинки на сухой слой контр-пластинки, причем испарение паров подвижной фазы происходит только в области фронта подвижной фазы па разделяющей пластинке. Использование для разделения Sm¡n-KaMCpbi с сухой копгр-пластинкой позволяет, во-первых, существенно (до 50%) увеличить величины Rf (особенно в области малых значений Rf (0.0-0.3)), во-вторых, повысить эффективность разделения в 2.0-2.5 раза, и, в третьих, увеличить разрешающую способность метода (-на 25%).

Основные результаты диссертации изложены в 12 статьях и следующих российских и зарубежных журналах:

1. Bcrczkin V.G., Kulakova N.Y., Khrebtova S.S. Thrcc-Dimcnsional Thin-Layer Chromatography with open and closcd adsorption layer // J. Planar Chromatography. 2009. V. 22. №5. P. зГз-319.

2. Бсрсзкии В.Г., Хрсбтова С.С.. Кулакова Н.Ю. Четырехмерная тонкослойная хроматография // Доклады Академии наук. - 2009. - Т. 429, № 3. - С. 343-346.

3. Бсрсзкии В.Г., Хрсбтова С.С., Редина H.A., Егорова Е.В. Комбинированный вариант планарной хроматографии // Журнал аналитической химии. - 2010. - Т.65, № 5. - С. 507-512.

4. Bcrczkin V., Khrebtova S., Kulakova N. Four-dimensional TLC on plates with open and closcd adsorbent layers // Chromatographia. 2010. V. 71, № 9-10. P. 907-911.

5. Хрсбтова С.С'., Тяглов Б.В., Королькова Н.В., Миронов A.C., Бсрсзкии В.Г. Новый метод определения внутриклеточного пула рибонуклеозидов п рибопуклеотп.чои па пластинках для ТСХ «Сорбфил» // Биотехнология. - 2010. -№3. - С. 84-90.

6. Bcrczkin V.G., Khrebtova S.S. Investigation of TLC chromatographic processes in N-chamber // Chromatographia. 2010. V. 72, № 11/12. P. 1169-1176.

7. Берсзкин В.Г., Хрсбтова C.C. S-камсра малого объема для тонкослойной хроматографии /У Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2011. - Т. 77, № 1. - С. 4-7.

8. Берсзкин В.Г., Хрсбтова С.С. Особенности тонкослойной хроматографии и камерах различного типа // Журнал физической химии. - 2011. - Т. 85, № 2. - С. 365-371.

9. Bcrczkin V.G., Khrcbtova S.S. About some specific features of thin layer chromatography in ultra small volume S-chambcr and chamber with closed sorption layer// Chromatomaphia. 2011. V. 73. №3. P. 329-337.

10. Bcrczkin V.G.. Khrcbtova S.S. The use of an S,„.„-chamber for implementation of two- and multidimensional TLC // Mendeleev Communications. 2011. V. 21, №. 2. P. 101-102.

11. Bcrczkin V.G.. Khrcbtova S.S., Witkiewiez Z. The rapid analysis by two dimensional TLC on the plates of small size using the Smm-chambcr// Aparatury Badawczej i Dydaktyeznej. 2011. V. XVI, №4 (in print).

12. Bcrczkin V.G., Khrcbtova S.S. The development of planar chromatography in 1980-1990 and 2000-2010 (the scicntomctric study) //J. Planar Chromatography. 2011. V. 24, № 6 (in print).

n 2 патентах на изобретения:

13. Березкнн В.Г.. Хребтова С.С. Сэндвич камера малого объема для тонкослойной хроматографии / Решение Роспатента о выдаче патента ог 17.03.2011 (заявка №• 2010122283/28 от 02.06.2010).

14. Березкнн В.Г., Хребтова С.С'. Способ многомерной тонкослойной хроматографии / Решение Роспатента о выдаче патента от 06.06.2011 (заявка № 2010118257/28 от 07.05.2010).

а также доложены на следующих международных и отечественных конференциях:

15. Хребгова С.С., Редина Е.А., Бсрезкии В.Г. Сочетание восходящей и нисходящей хромаю! рафии и ТСХ И Тезисы докладов научном конференции ИНХС РАН, посвященной 75-летшо Института (Москва, 6-8 апреля 2009). - С. 104.

16. Хребгова С.С.. Кулакова Н.Ю., Березкнн В.Г. Новый вариант ТСХ: четырехмерная хроматография // Тезисы докладов научной конференции ИНХС РАН, посвященной 75-jiei ню Института (Москва, 6-8 апреля 2004). - С. 105.

17. Кулакова Н.Ю.. Хрсбтоиа С.С.. Березкнн В.Г. Трехмерная тонкослойная хроматография // Тезисы докладов научной конференции ИНХС РАН, посвященной 75-лстию Институ т (Москва, 6-8 апреля 2009). - С. 106.

18. Березкнн В.Г., Кулакова Н.Ю., Хребтова С.С. Трехмерная тонкослойная хроматография // Тезисы Всероссийской конференции "Теория и практика хроматографии. Хроматография и папотехноло! пи" (Самара, 6-10 июля 2009). - С. 78.

19. Березкнн В.Г., С.С. Хребгова, Н.Ю. Кулакова. Новый вариант многомерной тонкослойной хроматографии /У Тезисы Всероссийской конференции "Теория и практика хроматографии. Хроматография и панотсхиологии" (Самара, 6-10 июля 2009). - С. 79.

20. Березкнн В.Г., Хребтова С.С., Редина 12.Л. Комбинированный восходящий-нисходящий вариант ТСХ // Тезисы Всероссийской конференции "Теория и практика хроматографии. Хроматография и ианотсхнологии" (Самара, 6-10 июля 2009). - С.80.

21. Bcrczkin V.G., Khrcbtova S.S., Kulakova N.Yu. Four-Dimensional Thin-Layer Chromatography // Abstract book of 5th Conference on Separation and Related Tcchniqucs by Nordic Separation Science Society (Tallinn, Estonia 26-29 august 2009). - P. 107.

22. Бсрезкии В.Г.. Хребтова С.С., Тяглов Б.В. Определение нуклеотидов методом планарпой хроматографии // Тезисы 1 Всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитической фармацевтической продукции" (Москва, 1-4 декабря 2009. - С. 23-24.

23. Бсрезкии В.Г., Хребтова С.С. S-камера со свсрхмалым газовым объемом и се основные аналитические характеристики // Сборник тезисов съезда аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Клязьма, 26-30 апреля 2010). - С.43-44.

24. Хребгова С.С. Особенности хроматографичсского процесса в насыщенной и ненасыщенной ТСХ // Сборник тезисов съезда аналитиков России "Аналитическая химия -новые методы и возможности" (Клязьма, 26-30 апреля 2010). - С. 313-314.

25. Бсрезкии В.Г., Хребтова С.С. Повышение разрешающей способности метода ТСХ // Материалы конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Туапсе, 27.09-1.10.10). - С. 61.

26. Bcrczkin V.G., Khrcbtova S.S. S-chambcr and its main analytical characteristics // Conference "lnlcrfacial phenomenon yesterday, today and lomonow" (Lublin, Poland, 1-3 October 2010).

27. Bcrczkin V.G., Khrcbtova S.S. The new variant of multidimensional planar chromatography // Book of abstracts of International Symposium for High-Pcrformancc Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 6-8 July 2011). - P. 23.

28. Bcrczkin V.G., Khrcbtova S.S. The development of planar chromatography in 1980-2010 (scientomctric study) // Book of abstracts of International Symposium for High-Pcrformancc Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 6-8 July 201). - P. 73.

29. Bcrczkin V.G., Khrcbtova S.S. A new variant of the S-chambcr with an ultra small gas volume // Book of abstracts of International Symposium for High-Pcrformancc Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 6-8 July 2011). - P. 75.

Подписано в печать 07 сентября 2011 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 343 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

И -^6 87?

2010010677

2010010677

j Общая характеристика работы. i

Глава 1. Основные тенденции развития планарной хроматографии.

I 1.1. Методы планарной хроматографии.

1.2. Тематика публикаций в планарной хроматографии.

1.3. Виды тонкослойной хроматографии.

1.4. Развитие традиционной ТСХ.

J, 1.4.1. Используемые сорбенты в ТСХ.

1.4.2. Подготовка пластинки к разделению.

1.4.3. Нанесение анализируемых проб на пластинку.

1.4.4. Хроматографические камеры.

1.4.5. Подвижные фазы.

1.4.6. Температура хроматографического процесса.

1.4.7. Многомерная ТСХ. а 1.4.8. Область применения ТСХ. i 1.4.9: Постхроматографическое определение.

Актуальность работы

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), открытый в 1938г Н.А.Измайловым и М.С.Шрайбер, является современным, простым и достаточно эффективным методом жидкостной хроматографии в аналитической практике. ТСХ активно и успешно используют в научных исследованиях, медицине, фармацее, контроле окружающей среды и промышленности. В России этот метод используют более, чем в 10000 лабораторий, однако за рубежом ТСХ применяют более широко. Так, например, Британская фармакопея 2009г [1] содержит -2000 методик, в которых ТСХ используют для анализа фармпрепаратов, а XII Государственная фармакопея РФ1 [2], к сожалению, содержит не более 10 аналитических методик с применением ТСХ. Широкое распространение ТСХ во всем мире обусловлено следующими преимуществами метода: простотой, высокой селективностью, удовлетворительной экспрессностью и высокой экономичностью.

Как и любой практически важный метод, ТСХ продолжает развиваться, причем особое внимание многие исследователи обращали на повышение разрешающей способности этого варианта хроматографии. Впервые Консденом, Гордоном и Мартином [3] в 1944г был реализован метод двумерной (2Б) хроматографии на бумаге — первый метод «-мерной планарной хроматографии. В 1951г Кирхнер и сотр. [4] реализовали двумерный вариант в тонком слое, позволяющий на одной пластинке разделять большее число компонентов. В 1975г Перри [5] был предложен метод многократного элюирования, который также рассматривается в настоящее время как один из методов п-мерной хроматографии.

Проведенная наукометрическая оценка развития планарной хроматографии показала, что двумерная ТСХ является в настоящее время наиболее распространенным методом и-мерной хроматографии. Интересно отметить, что в период с 1980-1990 гг, также как и в период с 2000-2010 гг доля публикаций по использованию в ТСХ двумерной хроматографии составила 11%. Однако дальнейшего развития в области многомерной ТСХ не происходило, несмотря на то, что существующим методам многомерной ТСХ присущи определенные недостатки. Так, например, все используемые подвижные фазы к разделению одной пробы применяют ко всем группам разделяемых соединений, что зачастую является нецелесообразным. Несомненно, что дальнейшее развитие методов многомерной ТСХ будет способствовать расширению практического применения ТСХ.

Поскольку результат разделения * в ТСХ определяется не только используемым методом, но и условиями его реализации (и, в первую очередь, используемой хроматографической камерой), представлялось необходимым уделить большее внимание изучению и оценке основных, используемых в ТСХ камер, обращая особое внимание на> обоснование выбора наиболее оптимальной камеры, поскольку изучению этой важной области ТСХ уделялось недостаточное внимание, а в литературе отсутствовали данные, позволяющие сделать обоснованный выбор.

Цель работы: разработать новые, простые варианты «-мерной планарной- хроматографии, характеризующиеся повышенной разрешающей способностью и экспрессностью.'

Для достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие исследования:

• для объективного обоснования основных направлений работы следовало провести наукометрическую оценку современного состояния ТСХ;

• выявить особенности реализации хроматографических процессов в современных, наиболее часто используемых камерах для ТСХ, провести их сравнение с целью выбора оптимальной и при необходимости разработать новые, более оптимальные;

• изучить особенности механизма разделения варианта ТСХ с контрпластинкой и предложить новые способы его реализации;

• показать аналитические возможности предложенного варианта ТСХ на практических примерах.

Научная новизна

Проведенное наукометрическое исследование за период 1980-2010 показало современное состояние ТСХ и позволило выявить основные тенденции ее развития. Результаты наукометрического исследования показали, что в настоящее время метод двумерной ТСХ активно и успешно используется, что свидетельствует о целесообразности дальнейшего развития и-мерной ТСХ, было показано, что в качестве адсорбента в ТСХ наиболее часто используют силикагель, разделение выполняют в И- (75%) и 8-камерах (12%), выявлены 10 наиболее часто используемых подвижных фаз.

Предложен новый подход к развитию и-мерной ТСХ, в- котором хроматограмму, полученную после первичного разделения разрезают на п пластинок, каждая из которых содержит группы, частично разделенных соединений, далее каждую «дочернюю» пластинку проявляют, используя наиболее селективную для разделения содержащейся на ней группы частично или плохо разделенных соединений подвижную фазу. Реализованы варианты 3-х, 4-х и 5-ти-мерной-ТСХ (возможно также реализовать «-мерную ТСХ с большим значением и), характеризующиеся высокой разрешающей способностью и экспрессностью, так как каждое разделение, следующее после первичного, возможно выполнять одновременно и независимо. На новый вариант ТСХ получено решение Роспатента о выдаче патента РФ на «Способ многомерной тонкослойной хроматографии».

Проведено исследование особенностей проведения разделения на пластинках ТСХ в наиболее распространенных камерах (М-,8тщ-, 0-камерах). Показано, что для получения воспроизводимых результатов при использовании Ы-камеры необходимо предварительно насыщать парами подвижной фазы атмосферу камеры и сорбционный слой пластинки ТСХ. Изучена зависимость результатов хроматографического разделения от степени предварительного насыщения слоя сорбента пластинки ТСХ парами подвижной фазы для 10 наиболее часто используемых подвижных фаз при выполнении анализа в И-камере; так, например, для насыщения сорбционного слоя пластинки парами этилацетата достаточно 5 мин, а парами этанола - 50 мин.

При исследовании результатов разделения, полученных при использовании 0-камеры, показано, что хроматографические характеристики существенно зависят от толщины и типа прокладки, используемой для отделения слоя сорбента от стеклянной стенки камеры. Отметим также, что данная камера, хотя и обладает определенными1 преимуществами; является более сложной в использовании, чем, например, 1М- или 8-камеры.

В результате систематического изучения характеристик хроматографического разделения, полученных в Э-камере с различными параметрами, предложен новый вариант 8т;п-камеры, отличительной особенностью которого является минимальное расстояние (сИ)> между слоем сорбента на пластинке и стенкой камеры. (¿/=0.1-0.2 мм). Это позволило существенно улучшить хроматографические характеристики метода ТСХ (продолжительность разделения сокращается, на 25-30%, эффективность увеличивается на 20%). На конструкцию новой камеры- получено решение Роспатента о выдаче патента РФ на «Сэндвич камера малого объема для тонкослойной хроматографии».

Изучены основные особенности хроматографических процессов в варианте ТСХ с контр-пластинкой и предложены новые варианты его реализации, позволяющие повысить разрешающую способность метода ТСХ, а также повысить его эффективность.

Практическая значимость проведенных исследований.

1. Новые варианты и-мерной хроматографии, в которых все разделения, реализуемые после первого, возможно выполнять одновременно и независимо, используя различные селективные подвижные фазы, позволили выполнять многомерное разделение, аналогичное по продолжительности проведению двумерного, и существенно улучшить результаты разделения.

2. Применение запатентованной конструкции предложенной в работе Smin-камеры совместно с ФГУП ГосНИИгенетика к анализу смесей внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов позволило значительно сократить продолжительность анализа (—30%), так как данная камера позволяет выполнять воспроизводимое разделение без предварительного насыщения, и улучшить эффективность разделения (-20%) по сравнению с традиционной N-камерой. Разработана новая элюирующая система для определения внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов, в которой токсичный раствор аммиака заменен на раствор карбоната натрия, без снижения селективности разделения.

3. Разработанный метод многомерной ТСХ при реализации в Smm-KaMepe был применен для разделения смесей красителей, пигментов красителей и смолы пиролиза бензина, содержащей полиароматические углеводороды.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты работы были изложены в 12 статьях в ведущих российских и зарубежных журналах и 2-х патентах РФ на изобретения, а также доложены и обсуждены на следующих международных и отечественных конференциях: Научной конференции ИНХС РАН, посвященной 75-летию Института (Москва, 2009), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Самара, 2009), 5th Conference on Separation and Related Techniques by Nordic Separation Science Society (Tallinn, Estonia, 2009), I Всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитической фармацевтической продукции" (Москва, 2009), Съезде аналитиков России (Москва, 2010), I Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), Conference "Interfacial phenomenon yesterday, today and tomorrow" (Lublin, Poland, 2010),

International Symposium for High-Performance Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 2011); а также сделан доклад на семинаре во время стажировки (01.03.2011-29.03.2011) в Институте химии Университета Яна Кохановского в Кельцах (Польша).

Вклад автора

Все проведенные экспериментальные исследования выполнены лично автором. Диссертантка принимала активное участие в интерпретации полученных результатов, написании статей, разработке патентов, подготовке докладов на конференциях и симпозиумах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование актуальности темы диссертации;

2. Новые более эффективные и экспрессные методы и-мерной планарной хроматографии;

3. Особенности хроматографического разделения в основных типах хроматографических камер и новом варианте 8т,п-камеры, характеризующимся минимальным расстоянием между стенкой камеры и слоем сорбента пластинки;

4. Сравнительная оценка основных типов камер в ТСХ: N-камеры, S-камеры и 0-камеры;

5. Особенности процесса хроматографического разделения в варианте ТСХ с контр-пластинкой и новые методы его реализации.

Основные выводы

1. Проведено подробное наукометрическое исследование развития ТСХ за последние 30 лет, позволившее выявить основные тенденции ее развития (методы, аппаратуру, применение) и обосновать актуальность работы.

2. Разработан новый подход для развития «-мерной ТСХ, позволяющий существенно повысить разрешающую способность метода при сокращении продолжительности эксперимента. Новый подход основан на независимом и одновременном использовании-различных селективных подвижных фаз для разделения отдельных фракций частично разделенных соединений исследуемой смеси, полученных при первом разделении.

Получено решение Роспатента на выдачу патента на изобретение: Березкин В.Г., Хребтова С.С. Способ многомерной тонкослойной хроматографии (заявка № 2010118257/28 от 07.05.2010).

3 . Для Б-камеры изучена зависимость хроматографических характеристик от величины й. Показано резкое увеличение эффективности (~ на 20%) и. сокращение продолжительности анализа (~ на 30%) в 8тщ-камере малого объема. Показана целесообразность практического использования нового метода и-мерной ТСХ при реализации в8т;п-камере.

Получен патент РФ № 2428685. Березкин В.Г., Хребтова С.С. Сэндвич камера малого объема для тонкослойной хроматографии.

4. Исследованы основные закономерности проведения хроматографического разделения в основных камерах, используемых в ТСХ. Показано, что по основным хроматографическим параметрам (продолжительности, эффективности, подвижности, критерию разделения) наиболее оптимальной является 8тщ-камера с минимальным расстоянием с1.

5. В результате исследования малоизученной Б-камеры с контрпластинкой выявлены основные особенности хроматографического процесса в этой камере. Показано, что увеличение рабочего объема подвижной фазы, улучшающее разделение, является результатом испарения паров подвижной фазы с разделяющей пластинки на сухой слой контр-пластинки, причем испарение паров подвижной фазы происходит в области фронта подвижной фазы на разделяющей пластинке. Использование для разделения 8тщ-камеры с сухой контр-пластинкой позволяет, во-первых, существенно (до 50%) увеличить величины (особенно в области малых значений (0.0-0.3)), во-вторых, повысить эффективность разделения в 2.0-2.5 раза, и, в третьих, увеличить разрешающую способность метода (на —25%).

6. Применение предложенной в работе 8т;п-камеры совместно с ФГУП ГосНИИгенетика к анализу смесей внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов позволило значительно сократить продолжительность анализа (-30%) и улучшить эффективность разделения (—20%) по сравнению с традиционной Ы-камерой.' Разработана новая элюирующая система для определения внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов, в которой токсичный раствор аммиака заменен на раствор карбоната натрия, без снижения селективности разделения.

Заключение

Проведенное экспериментальное сравнение производимой- в Польше горизонтальной БЗ-камеры (СЬготёеБ, Польша), которая широко используется хроматографистами различных стран, и 8тщ-камеры, разработанной в ИНХС РАН, показало, что хроматографические характеристики, полученные при разделении одной и той же смеси в исследуемых камерах имеют очень близкие значения*. Однако* при использовании для разделения 8т[п-камеры в восходящем режиме продолжительность анализа больше (максимально на 15%). Данная разница объясняется тем, что, во-первых, в горизонтальной 08-камере пластинка предварительно насыщается парами подвижной фазы (на —10%), следовательно, в этом случае реализуется "насыщенная" ТОХ, и, во-вторых, при горизонтальном движении подвижной фазы силы сопротивления значительно меньше, чем при восходящем потоке подвижной фазы.

Принимая во внимание простоту и невысокую стоимость 8т1П-камеры, 8тщ-камеру, наряду с коммерчески доступной горизонтальной БЗ-камерой, можно рекомендовать для использования в аналитической практике.

1. British Pharmacopoeia. The Stationery Office on behalf of the Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (MHRA) 2009. - 10950 p.

2. Государственная фармакопея Российской Федерации. Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. — 704 с.

3. Consden R., Gordon А.Н., Martin A .J.P. Qualitative Analysis of Proteins: a Partition Chromatographic Method Using Paper // Biochem. J. 1944. V. 38. P. 224-232.

4. Kircher J.G., Miller J.M., and Keller G.L. Separation and identification of some terpenes by a new chromatographic technique // Anal. Chem. 1951. V. 23. P. 420-425.

5. Perry J.A. Programmed multiple development. Lateral spot reconcentration //J. Chromatogr. 1975. V. 110. P. 27-35.

6. Краткая Российская энциклопедия, том 2. Большая Российская энциклопедия. М.:ОНИКС 21 век, 2003. 415 с.

7. Налимов Б.В., Мульченко Э.М. Наукометрия. М.: Наука, 1969. 192 с.

8. Хайтун С.Д. Наукометрия. Состояние и перспективы. М.: Наука, 1983. -344 с.

9. Золотов Ю.А. (ред.) Внелабораторный химический анализ. Проблемы аналитической химии. Т. 13. - М.: Наука, 2010. 564 с.

10. Березкин В.Г., Королев А. А., Смирнов А.Г. Описание опубликованных газохроматографических методик путем распределения по параметрам // Зав. лабор. 1972. - Т. 38, №5. - С. 543-545.

11. Berezkin V.G., Chernysheva T.Yu. Some trends in the development of analytical chemistry and chromatography as deduced from an analysis of the literature // J. Chromatogr. 1977. V. 141. P. 241-246.

12. Березкин В.Г., Кошевник M.A. Наукометрический анализ современного состояния хроматографии //Ж. анал. химии. 1992. - Т. 47, № 1.-С. 80-89.

13. Berezkin V.G., Chernysheva T.Yu., Bolotov S.L. Evaluation of the role of chromatography in analytical chemistry based on the analysis of the subject matter of publications // J. Chromatogr. 1982. V. 251. P. 227-233.

14. Braun Т., Bujdozo E., Schubert A. Literature of analytical chemistry: A Scientometric Evolution. Boca Raton, Fl: CRC Press, 1987. -392 p.

15. Березкин В.Г., Ретунский B.H. Состояние и тенденции развития аналитической хроматографии (наукометрическое исследование) // Ж. аналит. химии. 1988.-Т. 43, №1. -С. 166-171.

16. Березкин В.Г., Малюкова И.В. Основные параметры методик в капиллярной хроматографии по данным наукометрического исследования // Ж. анал. химии. -1997. Т. 52; №8. - С. 798-799.

17. Berezkin V.G., Victorova E.N. Changes in the basic experimental parameters of capillary gas chromatography in the 20th century // J Chromatogr. A. 2003. V. 985. P. 3-10.

18. Архипов Д.Б., Березкин В.Г. Развитие аналитической химии во второй половине 20-го века (Наукометрический анализ) // Ж. анал. химии. 2002. - Т. 57. - С. 699-703.

19. Руденко Б.А. (Ред.) 100 лет хроматографии. М.: Наука, 2003. С. 698-736.

20. Яшин Я.И., Яшин А.Я. Наукометрическое исследование состояния и тенденций развития методов жидкостной хроматографии и аппаратуры // Ж. аналит. химии. —1999. — Т. 54. С. 593-602.21. http://www.camag.eom/v/support/whatchromatogramdevelopment. html

21. Sherma J. Planar Chromatography // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 2653-2662.

22. Sherma J. Planar Chromatography // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 3251-3262.

23. Sherma* J. Planar Chromatography // Anal. Chem. 2006. V. 78. P. 3841-3852.

24. Sherma J. Planar Chromatography // Anal. Chem. 2008. V.80. P: 4253-4267.

25. Sherma' J. Planar Chromatography // Anal. Chem. 2010. V. 82". P. 4895—4910.

26. Березкин В.Г., Чаусов A.B. Новые варианты круговой тонкослойной хроматографии // Доклады Академии наук. 2009. - Т. 424, № 2. - С.205-209.

27. Kaiser R. Е. // J. Planar Chromatogr.-Mod. TLC. 2008. V. 21. P. 8-9.

28. Shibukawa M., Ohta N. Thin-layer chromatography of tris(l,10-phenanthroline)iron(II) and tris(2,2'-bipyridine)iron(II) on Sephadex G gels // Chromatographia. 1980. V. 13, № 9. P. 531-537.

29. Caman V., Kreibik S., Vlassa M. Planar dielectrochromatography in a vertical chamber // J. Planar Chromatogr. Mod. TLC. 2008. V. 21. P. 373378.

30. Хроматография в тонких слоях под ред. Э.Шталя, перевод с нем. М.И.Яновского. М.: Издательство «Мир», 1965. 508 с.32. http://www.chromdes.com/index.htm3 3. http://www.sarstedt.com/php/main.php?newlanguage=en

31. Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. М.: Научный совет РАН по хроматографии, 1990. Т.1. 405 е., Т.2. 348 с.

32. Lide D.R. CRC Handbook of Chemistry and Physics 88th edition CRC Press Taylor and Francis Group. 2008. — 2616 p."

33. Сан ПИН 2.2.5.1313-03 Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны. 2003.

34. Zarzycki Р.К. Simple horizontal chamber for thermostated micro-thin-layer chromatography // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1187. P. 250-259.

35. Tuzimski T. Strategy for separation of complex mixtures by multidimensional planar chromatography // J. Planar Chromatogr. 2008. V. 21. P. 49-54.

36. Berezkin V., Khrebtova S., Kulakova N. Four-Dimensional TLC on Plates with Open and Closed Adsorbent Layers // Chromatogr. 2010. V. 71. P. 907-911.

37. Choma I. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis // LCGC Europe. 2005. V. 18, № 9.

38. Giddings J.C. Unified Separation Science. New York: John Wiley and Sons, 1991.-320 p.

39. Ruoff A.L., Giddings J.C. Paper geometry and. flow velocity in paper chromatography // J. Chromatogr. 1960.V. 3. P.438-442.

40. Belenki B.G., Kolegov V.I., Nesterov V.V. Theory of thin-layer chromatography effect of the structure of the adsorption layer on spreading of spots // J. Chromatogr. 1975. V. 107. PI 265-283.

41. Siouffi A.M., Guiochon G. Study of the performances of thin-layer chromatography HE Flow Velocity of the mobile phase // J: Chromatogr. Sci. 1978. V. 16. P. 598-609.

42. Giddings J.C., Stewart G.H., Ruoff A.L. Zone migration in paper chromatography // J. Chromatogr. 1960. V. 3. P. 239-251.

43. Siouffi A.M., Guiochon G. Study of the performances of TLC. II. Band broadening and plate height equation // J. Chromatogr. Sci. 1978. V. 16. P. 470-481.

44. Johnson E.K., Nurok D., Computer simulation as an aid, to optimizing continuous-development two-dimensional thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1984. V. 302 P. 135-147.

45. Mangold H.K. Thin-layer Chromatography of lipids // J. American Oil Chemists' Society. 1961. V. 38. P. 708-727.

46. Svec F. Two-Dimensional High-Performance Liquid Chromatography // The chemical educator. New York: Springier-Verlag. 1997. V.2, № 6. P. 1-6.

47. Calvin M. The path of carbon in photosynthesis // Harvey Lect. 1950-1951. V. 46. P. 218-251.

48. Calvin M. The photosynthetic carbon cycle Ed. Liebecq C. 11 Proc. Int. Congr. Biochem. 3rd (Brussels 1955). New York: Academic Press, 1956. — 211 p.

49. Chain E.B. Recent Studies on Carbohydrate Metabolism// Brit. Med. J. 1959. V. II. P. 709-719.

50. Hais I.M. Two-dimensional // J. Chromatogr. 1980. V. 187. P. 466-467.

51. Ettre L.S. Nomenklature for chromatography // Pure Appl. Chem. 1993. V. 65, №4. P. 819-872.

52. Nyiredy Sz. Planar Chromatography A Retrospective View for the Third Millenium. Budapest: Springer Sci. Publ., 2001. - 614 p;

53. Giddings J.G. Concepts and comparison in multidimensional separations // J. High resolution chromatography & Chromatography Communications. 1987. V. 10. P. 319-323.

54. Guiochon G., Gonnord M.F., Siouffi A., Zakaria M. Study of performances of thin-layer chromatography. Spot capacity in thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1982. V. 250: P. 1-20.

55. Fenimore D.C., Davis Ch.M. High Performance Thin-Layer Chromatography // Anal. Chem, 1981. V. 53; № 2. P. 252A-266A.

56. Guiochon-G., Gonnord M.F., Zakaria M. Chromatography with a two-dimensional column // Chromatogr. 1983. V. 17, № 3. P. 121-124.

57. Randerath K. Dijnnschicht-Chromatography. Weinheim/Bergstr.: Verlag Chemic, GmbH, 1965. -328 p.

58. Heimler D. Cluster analysis in the comparison* of two-dimensional chromatograms // J. Chromatogr. 1989. V. 466. P. 371-378.

59. Zakaria M., Gonnord M.F., Guiochon G. Applications of two-dimensional thin-layer chromatography//J. Chromatogr. 1983. V. 271 P. 127-192.

60. Karger B.L., Snyder L.R., Horv'ath C. An Introduction to Separation Science. New York: Wiley-Interscience. 1973. 560 p.

61. Giddings J.C. Two-dimensional separations: concept and promise // Anal. Chem. 1984. V. 56. P. 1258A-1270A.

62. Guiochon G. Implamentation of two-dimensional liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1189. P. 109-168.

63. Felinger A. Data Analysis and Signal. Processing in Chromatography. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier, 1998. —441 p.

64. Giddings J.C. Sample dimensionality: A predictor of order-disorder in component peak distribution in multidimensional separation // J. Chromatogr. A. 1995. V. 703. P. 3-15.

65. Peters S., Viv'o-Truyols G., Marriott P.J., Schoenmakers P.J. Development of a resolution metric for comprehensive two-dimensional chromatography // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1146. P. 232-241.

66. Davis J.M. Statistical theory of spot overlap in two-dimensional separations //Anal. Chem. 1991. V. 63. P. 2141-2152.

67. Giddings J.C. In: H.J. Cortes (Ed.) Multidimensional Chromatography. New York: Marcel Dekker. 1990. P. 1-28.

68. Schure M. Quantification of resolution for two-dimensional separations // J. Microcol. Sep. 1997. V. 9. P. 169-176.

69. Oros F J., Davis J.M. Comparison of statistical theories of spot overlap in two-dimensional separations and verification of means for estimating the number of zones // J. Chromatogr. 1992. V. 591. P. 1-18.

70. Martin M. On the potential of two- and multi-dimensional separation systems // Fres. J. Anal. Chem. 1995. V. 352. P. 625-632.

71. Felinger A., Pasti L., Dondi F. Fourier analysis of multicomponent chromatograms. Theory and models//Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 1846-1853.

72. Felinger A., Pasti L., Reschiglian P. Fourier analysis of multicomponent chromatograms. Numerical evaluation of statistical parameters // Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 1854-1860.

73. Felinger A., Pasti L., Dondi F. Fourier analysis of multicomponent chromatograms. Recognition of retention patterns // Anal. Chem. 1992. V. 64. P. 2164-2174.

74. Dondi F., Betti A., Pasti L., Pietrogrande M.C., Felinger A. Fourier analysis of multicomponent chromatograms. Application to experimental chromatograms // Anal. Chem. 1992. V. 65. P. 2209-2222.

75. Pietrogrande M.C., Dondi F., Felinger A., Davis J.M. Statistical study of peak overlapping in multicomponent chromatograms: importance of the retention pattern // J. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 1995. V. 28. P. 239-258.

76. Dondi F., Bassi A., Cavazzini A., Pietrogrande M.C. A Quantitative theory of the statistical degree of peak overlapping in chromatography // Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 766-773.

77. Pietrogrande M.C., Marchetti N., Dondi F., Righetti P.G. Spot overlapping in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis separations: A statistical study of complex protein maps // Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 283-291.

78. Marchetti N., Felinger A., Pasti L., Pietrogrande M.C., Dondi F. Decoding two-dimensional complex multicomponent separations by autocovariance function // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 3055-3068.

79. Davis J.M., Giddings J.C. Statistical method for estimation of number,of components from single complex chromatograms: theory, computer-based testing, and analysis of errors // Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 2168-2177.

80. Davis J.M., Giddings J.C. Statistical method for estimation of number of components from single complex chromatograms: application to experimental chromatograms // Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 2178-2182.

81. Martin M., Herman D.P. Guiochon G. Probability distributions of the number of chromatographically resolved peaks and resolvable components in mixtures // Anal. Chem. 1986. V. 58. P. 2200-2207.

82. Gonnord M.F., Levi F., Guiochon G. Computer assistance in the selection of the optimum combination of systems for two-dimensional chromatography // J. Chromatogr. 1983. V. 264, № 1. P. 1-6.

83. Steinbrunner J.E., Johnson E.K., Habibi-Goudarzi S., Nurok. D. Planar Chromatography Ed. R.E. Kaiser. Heidelberg: Heuthig Verlag. 1986. V. 1. — 239 p:

84. Nurok D., Habibi-Goudarzi S.,.Kleyle R. Statistical approach to solvent selection- as applied to- two-dimensional thin-layer chromatography // Anal. Chem. 1987. V. 59. P.2424-2428*.

85. Steinbrunner J.E., Malik D.J., Nurok D. Contour diagrams for presentation of separation quality in two-dimensional thin-layer chromatography // J. Hight Resolut. Chromatogr. & Chromatogr. Commun. 1987. V. 10, №10. P. 560563.

86. De Spiegeleer B., Bossche W.V., De Moerloose P., Massart D. A strategy for two-dimensional, high-performance thin-layer chromatography. Applied to local anesthetics // Chromatogr. 1987. V.'23, № 6. Pc 407-411.

87. Habibi-Goudarzi S., Ruterbories K.J., Steinbrunner J.E., Nurok D: A computer-aided survey of systems for separating steroids by two-dimensional thin-layer chromatography // J. Planar Chromatogr. 1988. V. IP. 161-167.

88. Geiss F., Schlitt H. Ein neues' vielseitiges Entwicklungssystem zur Dunnschicht-Chromatographie („KS-Variokammer")// Chromatogr. 1968. V. l.P. 392-402.

89. Markowski W.,.Soczewinski E. Computer-aided optimization of stepwise gradient and multiple-development thin-layer chromatography // Chromatogr. 1993. V. 36. P. 330-336.

90. Nienstedt W. Characterization of C19 steroids by two-dimensional thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1985. V. 329. P. 171-177.

91. Matysik G., Soczewinski E. Stepwise gradient development in thin-layer chromatography. II Ttwo-dimensional gradients for complex mixtures // J. Chromatogr. 1986. V. 369. P. 19-25.

92. Mulder J.L., Veenstra G.J. Concentrating compounds by continuous horizontal thin-layer chromatography // J Chromatogr. 1966. V. 24. P. 250252.

93. Svetashev V.I., Zhukova N.V. Analysis of labeled fatty acid methyl esters by argentation and reversed-phase two-dimensional • thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1985. V. 330. P. 396-399.

94. Von Wandruszka R., Gottschalk F. Inexpensive instrument for programmed multiple development in thin-layer chromatography // Rev. Sci. Instrum. 1986. V. 57, № l.p. 119-121.

95. Belay M.T., Poole C.F. Determination of vanillin and related flavor compounds in natural vanilla extracts and vanilla-flavored foods by thin layer chromatography and automated multiple development // Chromatogr. 1993. V.37, № 7/8. P. 365-373:

96. Scholl Y., Asano N., Drager B. Automated multiple development thin layer chromatography for calystegines and their biosynthetic precursors // J. Chromatogr. A. 2001. V. 328. P: 217-224.

97. Taube Dl, Neuhoff V. Quantitative and automatic digital evaluation of one- and two-dimensional thin-layer chromatograms using vertical surface absorption at an optimum wavelength // J. Chromatogr. 1988. V. 437. P. 411421.

98. Mayfield K.J., Shalliker R.A., Sweeney A.P., Wong V., Guiochon G. Viscous fingering induced flow instability in multidimensional liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1080. P. 124-131.

99. Catchpoole H:J., Shalliker R.A., Dennis G.R., Guiochon G. Visualising the onset of viscous fingering, in chromatography columns // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1117. P! 137-145.

100. Munier R.L., Meuner S. Two-dimensional separations and behavior of alkaloids-of various polarities on unmodified silica-gel in polar and very polar neutral or acidic mobile phases // Chromatogr. 1980. V. 13, № 5. P. 259-262.

101. Chowdhury B.K., Rai P.P., Bhattacharyya P. Separation of Carbazole Alkaloids by Two-Dimensional Thin-Layer Chromatography // Chromatogr. 1987. V. 23; №3. P. 205-206.

102. Kirchner J.G. Advances in Thin-Layer Chromatography // J. Chromatogr. 1971. V. 63. P. 3-5.

103. Filipi T.J., Mazzei M.E. Two dimensional two phase thin layer chromatography plate and method / IlaT. CIHA № 4313906. 1979.

104. Pumphrey A.M. A two-dimensional thin-layer chromatographic method which allows a different type or thickness of adsorbent to be used in the second dimension // Biochem J. 1967. V. 102. P. 30.

105. Bond P.S. A two-dimensional thin-layer chromatographic technique for the separation of admixtures of 5-bromouracil and DNA bases // J. Chromatogr. 1968. V. 34. P. 554-555.

106. Pandey R.C., Misra R., Rinehart Jr. K.L. Graft thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1979. V. 169. P: 129-139.

107. Beesley T.E., Heiweil E. Two Phase, Two-Dimensional TLC for Fingerprinting and Confirmation Procedures // J. Liquid Chromatogr. 1982. V. 5, №8. P. 1555-1566.

108. Petit J., Gaillard G., Meyniel G. Possibilités analytiques nouvelles des couches minces chromatographiques sur support plastique souple // J. Chromatogr. 1969. V. 39. P. 167-172.

109. Nigam I.C., Sahasrabudhe M., Levi L. Coupled gas liquid thin layer chromatography: simultaneous determination of piperitone and piperitone oxide in essential oils // Can. J. Chem. 1963. V. 41. P: 1535-1539.

110. Kaser R. Direkte und automatische Kopplung der Dunnschicht-Chromatographie an Gras-Chromatographen // Fresenius1 J. Anal. Chem. 1964. V. 205. P. 284-298.

111. Ooij W.J., Houtman J.P.W. The use of electrophoresis and chromatography for the separation and quantitative determination of radioactive iridium compounds in normal and carrier-free amounts // Fresenius' J. Anal. Chem. 1968. V. 236, № V. P. 407-419.

112. Isbell D.T., Gusev A.I., Taranenko N.I., Chen C.H., Hercules D.M. Analysis of nucleotides directly from TLC plates using MALDI-MS detection //Fresenius' J. Anal. Chem. 1999. V. 365. P. 625-630.

113. Wankat P.C. Two-dimensional development in staged systems // Separ. Sci. 1972. V. 7, № 4. P. 345-360.

114. De Deyne V.J.R., Vetters A.F. Techniques to reduce errors in quantitative thin-layer chromatography using elution // J Chromatogr. 1967. V. 31. P. 261-262.

115. Perry J. A., Jupille Т.Н., Glunz LJ. Programmed multiple development in thin-layer chromatography // Separation and purification Reviews. 1975. V. 4, № 1. P. 97-165.

116. Jupilli Т.Н. Programmed Multiple Development: High Performance Thin Layer Chromatography // J. the American Oil Chemists' Society. 1977. V. 54. P. 179-182.

117. Гармаш A.B., Сорокина H.M. Метрологические основы аналитической химии. Издание 2-е, исправленное и дополненное (учебно-методическая разработка). М.: Химфак МГУ, ВХК РАН, 2005. -40 с.

118. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Использование значений точности на практике. Введен 01.11.2002. М.: Стандартинформ, 2002. - 43 с.

119. Калмановский В.И. Метрология для химиков. Нижний Новгород: Ю.А.Николаев, 2007. 131 с.

120. Cazes J. Encyclopedia of chromatography. New York: Marcel Dekker, 2001.-P. 851-854.

121. Красиков В.Д. Основы, планарной хроматографии. СПб.: Химиздат, 2005. -232 с.

122. Kiselev А.V., Yashin- Ya.I. Gas Adsorption Chromatography. New.York; Plenum Press, 1969: 254 p.

123. Poole C.F. The Essence of Chromatography. Amsterdam: Elsevier, 2003.-925 p.

124. Deinstrop E.Hahn. Applied Thin-Layer Chromatography. Weinheim. Welley VCH Verlag, 2007. 314 p.

125. Berezkin V.G., Buzaev V.V. New thin-layer chromatography plate with a closed sorbent layer and details of its application // J Chromatogr A. 1997. V. 758. P. 125-134.

126. Березкин В.Г., Кормишкина E.B. Вариант традиционной тонкослойной хроматографии с контактно закрытым сорбционным слоем (Бескамерная ТСХ) // Ж. аналит. химии. —2006. -Т.61, № 10. -С. 1074-1080.

127. Березкин В.Г., Кормишкина Е.В. Вариант круговой тонкослойной хроматографии с закрытым сорбционным слоем // Ж. прикладной химии. 2007. - Т.80, № 6. - С.932-937.

128. Tyihak Е., Micscovics Е., Kalasz Н. New planar liquid chromatographic technique: overpressured thin-layer chromatography// .Chromatography. 1979. V.174. P.75-81.

129. Tyihak E., Micscovics E., Kalasz H. Resolution and retention behaviour of some dyes in overpressured thin-layer chromatography // J.Chromatogr. 1980. V.191. P.293-300.

130. Tyihak E., Micscovics E., Kalasz H., Nagy J. Optimization of operating parameters in overpressured thin-layer chromatography // J.Chromatogr. 1981 V.211. P.45.

131. Березкин В.Г., Бузаев B.B. Новый вариант ТСХ с закрытым сорбционным слоем // Доклады Академии наук. 1996. -Т.347, № 4. -С.481-485.

132. Berezkin V.G., Kormishkina E.V. Study of a New Version of Classical Thin-Layer Chromatography with a Closed Adsorbent Layer // J. Planar Chromatogr.— Mod. TLC. 2006: V. 19. P. 81-85.

133. Wall P.E. Thin-layer chromatography. A modern practical approach. Poole, Dorset: VWR International Ltd, 2005. 180 p.

134. Wasicky R. Entwichlung von Dünnschichtchromatogrammen ohne Anwendung geschlossener Entwicklungskammern // Naturwissenschaften. 1963. V. 50, № 17. P. 569-570.

135. Davies B.H. A simple saturation chamber for thin layer chromatography// J. Chromatography. 1963. V. 10. P. 518-521.

136. Janchen D. Under die Verwendung extreme kleinvoluminger Trennkammern in der Dünnschicht-Chromatographie // J. Chromatogr. 1964. V. 14. P. 261-264.

137. Janchen D. The apparent influence of layer thickness on Rf values of thin-layer chromatograms / J. Chromatogr. 1968. V. 33. P. 195-198.

138. Fenringer N.V., Westfall J.E. Separation and identification of DDT analogs in the presence of polychlorinated biphenyl compounds by two-dimensional thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1971. V. 57. P. 397405.

139. Markowski W., Soczewinski E. Computer-aided optimization of stepwise gradient and multiple-development thin-layer chromatography // Chromatographic 1993. V. 36. P. 330-336.

140. Brenner M.,, Niederwieser A. Durchlaufende dünnschicht -Chromatographie//Experientia. 1961. V. 17, № 5.P. 237-238.

141. Geiss F., Schlitt H., Klose A. Zur Reproduzierbarkeit in der Dünnschichtchtchromatographie. Einflub von Luftfeuchtigkeit, Kammerform und -Atmosphäre auf das Chromatographische Resultat // Fresenius' J. Analytical Chemistry. 1965. V. 213. P. 331-346.

142. Geiss F., Schlitt H. What means "saturation" in thin layer chromatography // Chromatogr. 1968. V. 1. P. 387-391.

143. Geiss F., Schlitt H. A new and versatile thin layer chromatography separation system CKS-Vario-Chamber // Chromatogr. 1968. V.l. P. 392-402.

144. Dzido Т.Н., Soczewinski E. Modification of a horizontal sandwich chamber for thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1990. V. 516. P. 461-466.

145. Gasparuk J. Laboratory handbook of paper and thin-layer chromatography. Chichester: Ellis Horwood, 1978. —361 p.

146. Handbook of Thin-Layer Chromatography Eds J.Sherma, B.Fried. New York: Marcel Dekker, 2003. 1016 p.154. www.wolfram.com

147. De Zeeuw R.A. The role of solvent vapour in thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1968. V. 32. P. 43-52.

148. Березкин В.Г. Традиционная тонкослойная хроматография на пластинках с закрытым сорбционным слоем // Завод, лабор. — 2009. -Т. 75, №10.-С. 3-9.

149. Thierry-Palmer М., Gray Т.К. Separation of the hydroxylated metabolites of vitamin D3 by high-performance thin-layer chromatography. // J. Chromatogr. 1983. V. 262. P: 460-463.

150. Ponder E.L., Fried В., Sherma J. Thin-layer chromatographic analysis of hydrophilic vitamins in standards and from Helisoma trivolvis snails // Acta Chromatographica. 2004 V. 14. P. 70-81.

151. Bauer-Petrovska В., Petrushevska-Tozi L. Mineral and watersoluble vitamin content in the kombucha drink // Int. J. Food Sci. Technol. 2000. V. 35. P. 201-205.

152. Рука A., Babuska M., Dziadek A., Gurak D. Comparison of spectrodensitograms of the selected drugs on different chromatographic sorbents // J. Liq. Chromatogr. & Relat. Technol. 2007. V. 30, No. 9. P. 1385-1400i

153. Justova V. Thin-layer chromatography as an efficient alternative to high performance liquid chromatography in the assay of plasma vitamin- D3 metabolites//J. Chromatography. 1989. V.496. P. 242-244.

154. Hachula U. Determination of vitamin Ki and Bi in pharmaceutical separations after chromatographic separation // J.Planar Chromatogr. 1997. V. 10. P. 131-132.

155. Winkler W., Hachula U. Determination of vitamin Bi2 in pharmaceuticals after chromatographic separation // J.Planar Chromatogr. 1997. V.10. P. 386-387.

156. Watanabe F., Miyamoto E. TLC separation and analysis of В12 and related compounds in food // J. Liq. Chromatogr. & Relat. Technol. 2002. V. 25. P: 1561-1577.