Новый тип модификации ДНК. Направленное введение межолигомерных пирофосфатных связей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

НОВЫЙ ТИП МОДИФИКАЦИИ ДНК. НАПРАВЛЕННОЕ ВВЕДЕНИЕ МЕЖОЛИГОМЕРНЫХ ПИРОФОСФАТНЫХ СВЯЗЕЙ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Научные руководители: докт.хим.наук, профессор З.А.Шабарова канд.хим.наук,ст.научн.сотр. В.Л.Друца

Химический факультет

На правах рукописи

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОЛИГО- и ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ МЕШОНШЕРНЫМИ УЗЛАМИ. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Методы получения аналогов нуклеиновых кислот с различными типами модифицированных межмоно-мерных узлов

1.1.1. Фосфотриэфирные аналога олиго- и полинуклео-тидов

1.1.2. Фосфонатные аналоги олигонуклеотидов

1.1.3. Фосфитные аналоги олигонуклеотидов

1.1.4. Серусодержащие аналоги олиго- и полинуклео-тидов

1.1.4.1.Тиофосфатные аналоги олигонуклеотидов

1.1.4.2.Тионфосфатные аналоги олиго- и полинуклеоти

1.1.5. Фосфоамидные аналоги олиго- и полинуклеоти

1.2. Комплементационные взаимодействия олиго- и полинуклеотидов с модифицированными межмоно-мерными узлами •••••••;••••••••••••.

1.2.1. Неионные аналоги олигонуклеотидов

1.2.2. Поликатионные аналоги олигонуклеотидов

1.2.3. Полианионные аналоги олиго- и полинуклеотидов

1.3. Субстратные свойства нуклеиновых кислот с модифицированными межмономерными узлами

1.3.1. Нуклеазы

1.3.1.1.Неспецифические нуклеазы и РНазы

1.3.1.2.Эндонуклеазы рестрикции

1.3.2. Ферменты, катализирующие синтез межнуклеотидных связей

1.3.2.Г.ДНК-зависимая РНК-полимераза

1.3.2.2.ДНК-зависимые ДНК-полимеразы

1.3.2.3.Полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза)

1.3.2.4.Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза

1.3.3. Т4г-Полинуклеотидкиназа

1.3.4. Т4г-ДНК-лигаза

1.4. Биохимические свойства нуклеиновых кислот с модифицированными межнуклеотидными узлами

1.4.1. Влияние аналогов на белок-синтезирущую систему и рост клеток.

1.4.2. Интерфероногенная активность

ГЛАВА 2. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ПОЛИНУКЛЕОТЙДОВ С МЕЖ-0ЛИ1ШЕРНШИ З^ПИРОФОСФАТНЫМИ СВЯЗЯМИ

ОБШДШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)

2.1. Получение и комплементационные свойства ди-фосфатов олигонуклеотидов.

2.1.1. Получение 3^-дифосфатов олигонуклеотидов

2.1.2. Получение 3) 5^-дифосфатов олигонуклеотидов

2.1.3. комплементационные взаимодействия и 3^5дифосфатов олигонуклеотидов ••••••••••••••

2.2. Получение и физико-химические свойства дву-тяжевых ДНК с повторяющимися 3^5-пирофосфатными межнуклеотидными узлами •••.•••••••••.

2.2.1. Химическая матричная поликонденсация TGGCCAAGCTpp

2.2.2. Химическая матричная поликонденсация З^ди-фосфатов нона- и декануклеотидов

2.2.3. Сравнение эффективности образования различных типов межнуклеотидных связей в реакциях матричной конденсации . ПО

2.2.4. Выяснение возможного механизма ЕДЙ-индуцируе-мой матричной конденсации З1,5^-дифосфатов оли-гонуклеотидов •••••••••.

2.2.5. Физико-химические свойства полинуклеотидов с 3^5-пирофо сфатными межмономерными связями

2.3. Субстратные свойства полинуклеотидов с 3^-5^пирофосфатными межмономерными связями

2.3.1. Расщепление двутяжевых полинуклеотидов с шгрофо сфатными межмономерными связями эндо-нуклеазами рестрикции.

2.3.2. Транскрипция полинуклеотидов с пирофосфатными межмономерными узлами.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

Успехи химии природных соединений б развитии методов анализа первичных структур нуклеиновых кислот и белков, синтеза искусственных генов или их фрагментов, открытие большого числа новых ДНК-узнающих ферментов составили основу достижений молекулярной биологии последних лет и ее прикладной ветви - биотехнологии. Широкое применение в различных молекулярно-биоло-гических экспериментах нашли олиго- и полинуклеотиды с заданной последовательностью ыономерных звеньев. Современный уровень развития органической химии нуклеиновых кислот сделал доступными для исследователем не только синтетические фрагменты ДНК и РНК природного строения, но и различным образом модифицированные аналоги этих соединений. Получение и изучение свойств аналогов вносит существенный вклад в понимание биологических функций нуклеиновых кислот, их химических и физико-химических свойств.

В литературе описано множество способов модификации гетероциклических оснований и углеводных остатков компонентов ДНК и РНК /I/. В значительно меньшей степени разработаны методы получения олиго- и полинуклеотидов с неприродными мехшономерны-ми узлами, хотя такие соединения представляют большой интерес в качестве инструментов исследования репликации, транскрипции, трансляции и других клеточных процессов. Модификация фосфоди-эфирных связей обычно не приводит к существенным изменениям структуры и комплементационных свойств олиго- и полинуклеотидов и поэтому является одним из наиболее перспективных путей к выяснению участия меянуклеотидных фосфатных групп во взаимодействии с ферментами нуклеинового обмена. Однако, число известных к настоящему времени типов модификации менмономерных узлов нук леиновых кислот невелико, а методы синтеза модифицированных оли-го- и полинуклеотидов достаточно трудоемки. В связи с этим весьма актуальным является поиск новых типов модификации межмономер-ных узлов нуклеиновых кислот и разработка простых и эффективных методов синтеза аналогов ДНК и РНК.

В настоящей работе осуществлен синтез нового типа соединений - двутяжевых ДНК, содержащих межнуклеотидные з'-5-пирофосфат-ные связи в заданной положении полинуклеотидной цепи. Для получения протяженных модифицированных двутяжевых полинуклеотидов нами впервые использован метод химической матричной поликонденсации олигонуклеотидов. Изучение физико-химических свойств синтезированных соединений показало, что даже часто встречающиеся межнуклеотидные пирофосфатные связи практически не снижают термической устойчивости двутяжевых полинуклеотидных комплексов. Это дало возможность использовать такие соединения в качестве аналогов субстратов некоторых эндонуклеаз рестрикции, а также РНК-полимеразы CoE'l . Тем самым была продемонстрирована перспективность пирофосфатной модификации ДНК для изучения ДНК-связывающих ферментов. Кроме того, установлено, что в ряде случаев с помощью замены расщепляемого фосфодиэфирного узла на пи-рофосфатный можно конструировать негидролизуемые аналоги субстратов эндонуклеаз рестрикции.

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый тип модификации ДНК-направленное введение 3^5-пирофосфатных межнуклеотидных связей путем химической матричной конденсации Ы и 5^-концевых фосфатов, введенных в разрывы двутяжевой ДНК.

2. Разработана эффективная схема получения з]5-дифосфо-рилированных олигодезоксирибонуклеотидов с помощью"коммерческих препаратов Т4-полинуклеотидкиназы при использовании в качестве исходных соединений З^-монофосфорилированных олигонуклеотидов.

3. Найден наиболее эффективный способ синтеза 3^-5-пиро-фосфатной связи в разрывах двутяжевых ДНК - индуцируемая водорастворимым карбодиимидом конденсация 3^- и Б^фосфорилиро-ванных концов цепи ДНК.

4. Найдено, что скорость образования пирофосфатной связи при конденсации двух фосфатов в два раза превышает скорость образования фосфоамидной и в 25 раз - фосфодиэфирной.

5. Методом УФ-спектрофотометрии и КД показано, что введение двух фосфатных остатков в разрывы двутяжевых ДНК не приводит к существенному нарушению их вторичной структуры. Показано, что даже часто встречающиеся межолигомерные пиро-фосфатные узлы црактически не снижают термической устойчивости двутяжевых ДНК.

6. Показана перспективность пирофосфатной модификации ДНК для изучения ДНК-связывающих ферментов. Так, замена фланкирующего участок узнавания фосфодиэфирного узла на пирофос-фатный позволила выявить чрезвычайную чувствительность эндонуклеазы ДСи. Г к модификации углеводо-фосфатного остова ДНК.

В то же время пирофосфатный узел в антипараллельной цепи, расположенный напротив гидролизуемого узла, не препятствует расщеплению двутяжевой ДНК эндонуклеазой Wind Щ . На примере эндонуклеазы &С0 Rli экспериментально показано, что с помощью замены расщепляемого фосфодиэфирного узла на пирофосфатный можно легко конструировать негидролизуемые аналоги субстратов эндонуклеаз рестрикции.

7. Показано, что полидезоксирибонуклеотиды, содержащие межолигомерные пирофосфатные узлы, могут служить компетентными матрицами по крайней мере для РНК-полимеразы £, СоЕ.1 .При этом, несмотря на несколько пониженную скорость полимеризации, происходит точное считывание модифицированной матрицы.

1. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. - М., Химия, 1978, 582 с.

2. Шомштейн 8.А., Гиллер С.А."Модельные аналоги нуклеиновых кислот" в сб. Успехи химии гетероциклов. Рига, Зинатне, 1976, с. 307-322.

3. Miller P.S., Fang K.N., Kondo N.S., Ts»o P.0.P. Synthesis and properties of adinine and thymine nucleoside alkyl phospho-triesters, the neutral analogs of dinucleoside monophosphate. -J. Amer.Chem.Soc., 1971, v. 93, No. 24, p. 6657-6665.

4. Miller P.S., Chandrasegaran S., Dow d.L., Pulford S.M., Kan L.S. Synthesis and template properties of an ethyl phosphotriester modified decadeoxyribonucleotide. Biochemistry, 1982, v. 21, No. 22, p. 5468-5474.

5. Siebenlist V., Simpson R.B., Gilbert W. E.coli RNA-polymerase interacts homologously with two different promoters. Cell,1980, v. 20, No. 2, p. 269-281.

6. Siebenlist V., Gilbert V/. Contact between Escherichia coli RNA-polymerase and an early promoter of phage T7. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1980, v. 77, No. 1, p. 122-126.

7. Lu A.L., Jack W.E., Modrich P. DNA determinants important in sequence recognition by Eco RI endonuclease. J.Biol.Chem.,1981, v. 256, NO. 24, p. 13200-13206.

8. Vlassov V.V., Giege R., Ebel J.-P. The tertiary structure of yeast tRNApiie in solution studed by phosphodiester bond modification with ethylnitrosourea. FEBS Letters, 1980, v.120, No. 1, p. 12-16.

9. Kusmierek J.Т., Singer B. Sites of alkylation of poly(u) by agents of varying carcinogenicity and stability of products. -Biochira. et Biophys. Acta, 1976, v. 442, No. I , p. 420-431.

10. Власов В.В. Структурно-функциональное исследование тРНК в системе биосинтеза белка. Дисс. докт.хим.наук, Новосибирск, 1981, 333 стр.

11. Grams G.W., Letsinger R.L. Synthesis of a diribonucleosidemono-phosphate by the -cyanoethyl phosphotriester method. J. Org.Chem., 1970, v. 35, No. 3, p. 868-870.

12. Cusack N.J., Reese C.B., van Boom J.H. Block synthesis of oligonucleotides by the phosphotriester approach. Tetrahedron Lett., 1973, No. 24, p. 2209-2212.

13. Neilson Т., Werstiuk E.S. Oligoribonucleotide synthesis III. Synthesis of trinucleotides using a stepwise phosphotriester method. Can. J. Chem., 1971, v. 49, p. 3004-3011.

14. De Boer G., Miller P.S., Ts*o P.O.P. Hydrogen-bonded complexes of adenine and thymine nucleoside alkyl phosphotriesters in deuteriochloroform. Biochemistry, 1973, v. 12, No. 4, p. 720726.

15. Miller P.S., Barrett J.C., Ts'o P.O.P. Synthesis of oligodeo-xyribonucleotide ethyl phosphotriesters and their specific complex formation with transfer ribonucleic Acid. Biochemistry, 1974, v. 13, No. 24, p. 4887-4896.

16. Miller P.S., Braiterman L.T., Ts'o P.O.P. Effect of a trinucleotide ethyl phosphotriester Gp( Et) Gp( Et)U on mammalian cells in culture. Biochemistry, 1977, v. 16, No. 9, p.1988-1996.

17. Ogilvie K.K., Blaucage S.L. Fluoride ion promoted deprotection and transesterification in nucleotide triesters. Nucleic Acids Res., 1979, v. 7, No. 3, p. 805-823.

18. Петренко BfA., Поздняков П.И., Сиволобова Г.Ф., Шубина Т.Н. Неионные аналоги олигонуклеотидов. Синтез алкиловых триэфиров олигонуклеотидов реакцией переэтерификации. Биоорган, химия,1980, т.6, № 3, с. 431-435.

19. Петренко В.А., Поздняков П.И. Синтез триэфирных аналогов дидезоксинуклеозидфосфатов, содержащих остаток гидроксиламина. -Биоорган, химия, 1983, т.9, № б, с. 832-837.

20. O'Connor P.J., Margison G.P., Craig A.W. Phosphotriesters in rat liver deoxyribonucleic acid after the administration of the carcinogen N,N—dimethylnitrosamin in vivo. Biochem. J., 1975, v. 145, No. 3, p. 475-482.

21. Bannon P., Verly W. Alkylation of phosphates and stability of phosphate triesters in DNA. Eur. J. Biochem., 1972, v. 31, No. 1, p. 103-111.

22. Sun L.f Singer B. The specificity of different class of ethy-lating agents toward various sites of Hela cell DNA in vitro and in vivo. Biochemistry, 1975, v. 14, No. 8, p. 1795-1802.

23. Jensen D.E. Reaction of DNA with alkylating agents. Differential alkylation of poly dA-dT by methylnitrosourea and ethylnitrosourea. Biochemistry, 1978, v. 17, No. 24, p. 51085113.

24. Jensen D.E., Reed D.J. Reaction of DNA with alkylating agents. Quantition of Alkylation by ethylnitrosourea of oxygen and nitrogen sites on poly dA-dT including phosphotriester formation. Biochemistry, 1978, v. 17, No. 24, p. 5098-5107.

25. Bodell W.J., Singer В., Thomas G.H., Cleaver J.E. Evidence for removal at different rates of 0-ethyl pyrimidines and ethylphosphatriesters in two human fibroblast cell lines. -Nucleic Acids Res., 1979, v. 6, No. 8, p. 2819-2829.

26. Singer В., Fraenkel-Conrat H. The specificity of different classes of ethylating agents toward various sites in RNA. -Biochemistry, 1975, v. 14, No. 4, p. 772-782.

27. Miller P.S., Dreon N., Pulford S.M., He Parland K.B. Oligo-thymidylate analogues having stereoregular, alternating me-thylphosphonate/phosphodiester backbones. J.Biol. Chem., 1980, v. 255, No. 20, p. 9659-9665.

28. Agarwal K.L., Riftina F. Synthesis and enzymatic propertiesof deoj^ibooligonucleotides containing methyl and phenylphos-phonate linkages. Nucleic Acids Res., 1979, v. 6, No. 9, p. 3009-3024.

29. Кирби А., Уоррен С. Органическая химия фосфора. М., Мир, 197I, 403 с.

30. Пурдела Д., Вылчану Р. Химия органических соединений фосфора. М., Химия, 1972, 722 с.

31. Killer P.S., Yano J., Yano E., Carroll C., Jayaraman K.,

32. Ts'o P.O.P. Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucleoside methylphosphonates. -Biochemistry, 1979, v. 18, No. 23, p. 5134-5143.

33. Miller P.S., Mc Parland K.B., Jayaraman K., Ts*o P.O.P. Biochemical and biological effects of nonionic nucleic acid methylphosphonates. Biochemistry, 1981, v. 20, No. 7, p. 18741880.

34. Engels J., Jager A. Eine neue synthese von Nucleosidmethylphos-phonaten. Angew. Chem., 1982, v. 94, No. 12, p. 931-933.

35. Sinha N.D., Grossbruchhaus V., Koster H. A new synthesis of oligodeoxynucleoside methylphosphonates on control pore glass polimer support using phosphite approach. Tetrahedron Lett., 1983, v. 24, No. 9, p. 877-880.

36. Miller P.S., Agris C.H., Blandin M., Murakami A., Reddy P.M., Spitz S.A., Ts'o P.O.P. Use of methylphosphonic dechloride for the synthesis of oligonucleoside methylphosphonates. Nucleic Acids Res., 1983, v. 11, No. 15, p. 5189-5204.

37. Nemer M.J., Ogilvie K.K. Ribonucleotide analogues having novel internucleotide linkages. Tetrahedron Lett., 1980, v. 21, No. 43, p. 4149-4152.

38. Jones G.H., Albrecht H.P., Damodaran N.P., Moffatt J.G. Synthesis of isosteric phosphonate analogs of some biologicaly important phosphodiesters. J.Amer.Chem.Soc. - 1970, v. 92, No. 18, p. 5510-5511.

39. Albrecht H.P., Jones G.H., Moffatt J.G. S'-Deoxy-S'-Cdihydroxyphosphinylmethyl) nucleosides. Isosteric phosphonate analogs of nucleoside-3'-phosphate. J.Amer.Chem.Soc., 1970, v. 92, No. 18, p. 5511-5513.

40. Jones G.H., Hoffatt J.G. The synthesis of 6*-deoxyhomonucleo-side-б'-phosphonic acids. J.Amer.Chem.soc., 1968, v.90, No. 19, p. 5337-5338.

41. Ogilvie K.K., Nemer M.J. The synthesis of phosphite analogues of ribonucleotides. Tetrahedron Lett., 1980, v. 21, No. 43, p. 4145-4148.

42. Nemer M.J., Ogilvie K.K. Phosphoramidate analogues of diribo-nucleoside monophosphates. Tetrahedron Lett., 1980, v. 21, No. 43, p. 4153-4154.

43. Letsinger R.L., Lunsford W.B. Synthesis of thymidine oligonucleotides by phosphite triester intermediates. J.Amer. Chem.Soc., 1976, v. 98, No. 12, p. 3655-3661.

44. Ogilvie K.K., Theriault N., Sadana K.L. Synthesis of oligori-bonucleotides. J.Amer.Chem.Soc., 1977, v. 99, No. 23,p. 7741-7743.

45. Hatteucci M.D., Caruthers M.H. The synthesis of oligodeoxy-pyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett., 1980, v. 21, No. 7, P. 719-722.

46. Melnick B.P., Finnan J.L., Letsinger R.L. Oligonucleotide analogues with internucleoside phosphite links. J.Org.Chem., 1980, v. 45, No. 13, p. 2715-2716.

47. Letsinger R.L., Heavner G.A. Synthesis of phosphoromonoamidate diester nucleotides via the phosphite-azide coupling method.-Tetrahedron Lett., 1975, No. 2, p. 147-150.

48. Кумарев В.П., Богачев B.C., Кобзев В.Ф., Баранова Л.В., Рив-кин М.И., Рыбаков В.И. Тиофосфатные аналоги нуклеиновых кислот. П. Синтез и свойства 5'-s-тиофосфатных аналогов олиго-дезоксирибонуклеотидов. Биоорган.химия, 1982, т.8, № II, с. 1525-1534.

49. Michelson A.M., Polynucleotides. Part IV. Synthesis of oligonucleotide analogues substituted in the sugar portion. J. Chem.Soc., 1962, No. 3, p. 979-982.

50. Kress J., Nagpal K.L., Nagyvary J., Uchic J.T. The use of S-2-cyanoethyl phosphorothioate in the preparation of oligo-S'-deoxy-S^thiothymidylates. Nucleic Acids Res., 1975,v. 2, No. 1, p. 1-9.

51. Cook A.F. Nucleoside S-alkyl phosphorothioates. XV. Synthesis of nucleoside phosphorothioate monoesters. J.Amer.Chem. Soc., 1970, v. 92, No. 1, p. 190-195.

52. Кума рев В.П., Богачев B.C., Кобзев В.Ф., Баранова Jl.В. Тио-фосфатные аналоги нуклеиновых кислот I. Синтез и свойства мономеров для синтеза 5'- s-тиофосфатных аналогов олигоде-зоксирибонуклеотидов. Биоорган.химия, 1982, т.8, te II, с.1516-1524.

53. Stutz A., Scheit K.H. Properties of ATP and UTP analogues5»with P-S-C bonds. Eur. J. Biochem., 1975, v. 50, No. 2, p. 343-349.

54. Eckstein F. phosphorothiatanaloga von Nucleotiden-Werkzeuge zur Untersuchung biochemischer Prozess. Angev/. Chem., 1983, v. 95, No. 6, p. 431-447.

55. Frey P.A. Stereochemistry of enzymatic reactions of phosphates.-Tetrahedron, 1982, v. 38, No. 11, p. 1541-1567.

56. Eckstein F. Phosphorothioate analogues of nucleotides. Acc. Chem.Res., 1979, v. 12, No. 6, p. 204-210.

57. Eckstein F. Diuridin-3',5'-thiophosphat. Tetrahedron Lett., 1967, No. 36, p. 3495-3499.

58. Eckstein F. A dinucleoside phosphorothioate. Tetrahedron Lett., 1967, No. 13, p. 1157-1160.

59. Burgers P.M.J., Eckstein F. Synthesis of dinucleoside mono-phosphorothioates via addition of sulphur to phosphite tries-ter. Tetrahedron Lett., 1978, No. 40, p. 3835-3838.

60. Hoffmann F.M., Moore T.R. Organic phosphorus compounds. Isomeric alkyl phosphoro- and phosphonothioates. J.Amer.Chem. Soc., 1958, v. 80, No. 5, p. 1150-1154.

61. Marlier J.F., Benkovic S.G. A highly efficient chemical synthesis of Rp and Sp adenyl^'-S1)adenyl-0,0-phosphorothioate.-Tetrahedron Lett., 1980, v. 21, p. 1121-1124.

62. Eckstein F., Gindl H. Polyribonucleotides containing a thio-phosphate backbone. FEBS Lett., 1969, v. 2, No. 4, p. 262264.

63. Matzura H. Eckstein F. A polyribonucleotide containing alternating P»0 and P=:S linkages. Eur.j.Biochem., 1968, v. 3, No. 4, p. 448-452.

64. Eckstein F., Armstrong V.W., Sternbach H. Stereochemistry of polymerization by DNA-dependent RNA-polymerase from Escherichiacoli: an investigation with a diastereomeric ATP-analogue• -Proc. Natl. Acad. SCi. U.S.A., 1976, v. 73, No. 9, p. 2987-2990.

65. Eckstein F., Gindl H. Polyribonucleotides containing a phos-phorothioate backbone. Eur. J. Biochem., 1970, v. 13, No. 3, p. 558-564.

66. Burgers P.H.J., Eckstein F. Stereochemistry of internucleoti-de bond formation by polynucleotide phosphorylase from Micrococcus luteus. Biochemistry, 1979, v. 18, No. 3, p. 450-454.

67. Burgers P.M.J., Eckstein F. A study of the mechanisme of DNA polymerase I from Escherichia coli with diastereomeric phos-phorothioate analogues of deoxyadenosine triphosphate. J. Biol.Chem., 1979, v. 254, No. 15, p. 6889-6893.

68. Vosberg H.P., Eckstein F. Incorporation of phosphorothioate groups into fd and <j6x 174 DNA. Biochemistry, 1977, v. 16, No. 16, p. 3633-3640.

69. Brody R.S., Frey P.A. Unambiguous determination of the stereochemistry of nucleotidyl transfer catalyzed by DNA polymerase I from Escherichia coli. Biochemistry, 1981, v. 20, No. 5, p. 1245-1252.

70. Romaniuk P.J., Eckstein F. A study of the mechanism of T4 DNA polymerase with diastereomeric phosphorothioate analogues of deoxyadenosine triphosphate. J.Biol.Chem., 1983, v. 257, No. 13, p. 7684-7688.

71. Kunkel T.A., Eckstein F., Mildvan A.S., Koplitz R.M., Loeb L.A. Deoxynucleoside 1-thio triphosphates prevent proofreading during in vitro DNA synthesis. Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A., 1981, v. 78, No. 11, p. 6734-6738.

72. Brody R.S., Adler S., Modrich P., Stec W.J., Leznikowski Z.J., Frey P.A. Stereochemical course of nucleotidyl transfer catalyzed by bacteriophage T7 induced DNA polymerase. Biochemistry, 1982, v. 21, No. 10, p. 2570-2572.

73. Barlett P.A., Eckstein F. Stereochemical course of polymerization catalyzed by avian myeloblastosis virus reverse transcriptase. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, No. 15, p. 8879-8884.

74. Eckstein F., Sternbach H., Haar F. Stereochemistry of inter-nucleotidic bond formation by tRNA nucleotidyltransferase from baker's yeast. Biochemistry, 1977, v. 16, No. 15, p. 34293432.

75. Schlimme E., Haar F., Eckstein F., Cramer F. Chemically modified phenylalanine transfer Ribonucleic Acid from yeast. -Eur. J. Biochem., 1970, v. 14, No. 2, p. 351-356.

76. Usher D.A., Erenrich E.S., Eckstein F. Geometry of the first step in the action of ribonuclease A. Proc.Natl.Acad.sci. U.S.A., 1972, v. 69, No. 1, p. 115-118.

77. Sun I.Y., Allfrey V.G. Labeling and selective recovery of newly syntesized viral DNA from simian virus 40-infected cells incubated with inorganic thiophosphate. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 1982, v. 79, No. 15, p. 4589-4593.

78. Chen J.-Т., Benkovic S.J. Synthesis and separation of diaste-reomers of deoxynucleoside 5'-0-(1-thio)triphosphates. Nucleic. Acids. Res., 1983, v. 11, No. 11, p. 3737-3751.

79. Letsinger R.L., Mungall W.S. Phosphoramidate analogues ofoligonucleotides. J.Org.Chem., 1970, v.35, No.11, p.3800-3803.

80. Громова Е.С., Тяглов Б.В., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Изучение вторичной структуры дезоксиимидилил-(3'-5')-аденозина и его амидов. Мол.биол., 1970, т.в.2, с.284-288.

81. Соколова Н.И., Пономаренко И.В., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Обратимая модификация межнуклеотидных фосфатных групп в оли-годезоксирибонуклеотидах. Докл. АН СССР, 1980, т.253, № 6, с. 1395-1398.

82. Соколова Н.И., Мельникова В.И., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Синтез тимидилил-(3'-»5')уридин-(Ри-»к )фенилаланина. Вест. Моск.универс., сер.химия, 1966, № 5, II9-I2I.

83. Воробьев О.Е., Соколова Н.И., Мельникова В.И., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Динуклеозидфосфо-(Рм— N)-аминокислоты. -Докл. АН СССР, 1966, т.166, te I, с.95-98.

84. Соколова Н.И., Гурова Г.И., Гатинская Л.Г., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Свойства межнуклеотид-(Рм-»- и)-пептидного узла в модельных соединениях. 1969, т.З, вып.6, с.837-845.

85. Gromova E.S., Tyaglov B.V., shabarova Z.A. Optical rotatory-dispersion and circular dichroism of mono- and oligonucleoti-de-aminoacids (amidates). Biochim. et Biophys. Acta, 1971, v. 240, No. 1, p. 1-11.

86. Рябова T.C., Шабарова 3.A., Прокофьев М.А. Избирательное расщепление фосфоамидной связи в аденилил-(5'- n )-пептидах.-Докл. АН СССР, 1965, т.162, Ш 5, с.1068-1070.

87. Jastorff В., Hettler Н. Nucleotid-analog von S'-amino-S'-de-soxynucleosiden. Chem. Ber., 1969, v. 102, No. 12, p. 41194127.

88. Mungall W.S., Greene G.L., Heavner G.A., Letsinger R.L. Use of asido group in the synthesis of 5'-terminal aminodeoxythymidine oligonuclotides, J.Org.Chem., 1975, v. 40, No. 11, p. 1659-1662.

89. Green G.L., Letsinger R.L. Formation of internucleotide 3'-5'-phosphoramidate links by direct coupling of phosphoryl and amino groups. Nucleic Acids Res., 1975, v. 2, No. 7, p. 11231127.

90. Azhayev A.V., Krayevsky A.A., Smrt J. Synthesis of phosphorami-date analogues of ribonucleoside phosphates. Coll. Czech. Chem.Commun., 1979, v. 44, No. 3, p. 792-798.

91. Ажаев А.В. Синтез модифицированных субстратов и ингибиторов пептидилтрансферазного центра рибосом. Дисс.канд.хим.наук, Москва, 1979, 156 с.

92. Озолс A.M. Синтез коротких олигонуклеотидов на основе З'-дезок-си-З'-аминонуклеотидов. Дисс.канд.хим.наук, Москва, 1980, 180 стр.

93. Ажаев А.В., Озолс A.M., Краевский А.А., Гнучев Н.В., Готтих Б.П. Аминонуклеозиды и их производные. Синтез коротких олиго-рибонуклеотидов, содержащих фосфамидные межнуклеотидные связи.-Биоорган.химия, 1982, т.8, Ш 9, с.1218-1223.

94. Krayevsky A.A., Azhaev A.V., Kukhanova M.K. Synthesis of oligonucleotides with S'-S'-phosphoamidoester bond. Nucleic Acids. Res.y Simp.ser., 1981, No.9, p. 203-205.

95. Горкун А.Ф. Твердофазный синтез модифицированных олигонуклеотидов. Дис.канд.хим.наук, Москва, 1983, 132 стр.

96. Горкун А.Ф., Вейко В.П., Потапов В.К., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Твердофазный синтез модифицированных олигонуклеотидов. Докл. АН СССР, 1984-, т.275, № I, с.

97. Letsinger R.L., Wilkes J.S., Dumas L.B. Enzymatic synthesis of polydeoxyribonucleotides possessing internucleotide phos-phoramidate bonds. J. Amer. Chem. Soc., 1972, v. 94, No.1, p. 292-293.

98. Letsinger R.L., Wilkes J.S., Dumas L.B. Incorporation of S'-amino-S'-deoxythimidine-S'-phosphate in polynucleotides by use of DNA polymerase I and а фх 174 DNA template.

99. Biochemistry, 1976, v. 15, No. 13, p. 2810-2816.

100. Letsinger R.L., Hapke В., Petersen G.R., Dumas L.B. Enzymatic synthesis of duplex circular 0x 174 DNA containing phosphoramidate bonds in the (-) strand. Nucleic Acids

101. Res., 1976, v. 3, No. 4, p. 1053-1063.

102. НО. Данилюк H.K., Петренко B.A., Поздняков П.И., Попов С.Г., Сиволобова Г.Ф., Шубина Т.Н. Комплексы неионных триэфирных аналогов олигонуклеотидов с полинуклеотидами. Мол.биол., 1982, т.16, вып. 5, III6-II20.

103. Kan L.S., Cheng D.M., Miller P.S., Yano J., Ts'o P.О.P.

104. Proton NMR studies on dideoxyribonucleoside methylphospho-nates. Biochemistry, 1980, v. 19, No. 10, p. 2122-2132.

105. Rybakov V.N., Rivkin M.I., Kumarev V.P. Some substrate pro51perties of analogues of oligothymidylates with p-s-c bonds.-Nucleic Acids Res., 1981, v. 9, No. 1, p. 189-201.

106. Ильичева И.А., Туманян В.Г., Краевекий А.А., Куханова И.Л. Готтих Б.П. Сравнительный конформационный анализ динуклео-зидфоефата СрА и его аналога C(3'nh )рА. Мол.биол.,1982, т.16, вып. б, е.1300-1313.

107. Дэвидсон Д. Биохимия нуклеиновых кислот.-М., Мир,1976,412 с.

108. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloming. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 545 p.

109. Dudman N.P.B., Zerner B. Enzymatic preparation of an optically active phosphotriester, assymmetric only at phosphorus. J.Amer.Chem.Soc., 1973, v. 95, No. 9, p. 3019-3021.

110. Rammler D.H., Bagdasarian A., Morris F. Inhibition of mic-rococcal nuclease with S'-deoxythymidine-S'-phosphonic acid containing oligomers. Biochemistry, 1972, v. 11, No. 1, p. 9-12.

111. Eckstein F., Scheit K.H. Modified polynucleotides. In: Procedures in nucleic acids research, Cantoni G.L., Davies D.R. eds., New-York, 1971, v. 2, p. 665-679.

112. De Clercq E., Eckstein F., Sternbach H., Merigan Т.О. The antiviral activity of thiophosphate-substituted polyribonucleotides in vitro and in vivo. Virology, 1970, v. 42,1. No. 2, p. 421-428.

113. Saenger W., Suck D., Eckstein F. On the mechanism of ribo-nuclease A. Crystal and molecular structure of uridine 31-O-thiophosphate methyl ester triethylammonium salt. Eur. J.Biochem., 1974, v.46, No. 3, p. 559-567.

114. Smith H.O. Nucleotide sequence specificity of restriction endonucleases. Science, 1979, v. 205, No. 3, p. 455-462.

115. Vosberg H.P., Eckstein F. Effect of deoxynucleoside phosphorothioates incorporated in DNA on cleavage by restriction enzymes. J.Biol.Chem., 1982, v.257» No. 11, p. 6595-6599.

116. Корнберг А. Синтез ДНК. M., Мир, 1977, 359 с.

117. Потапов В.А., Рыбаков B.H., Богачев B.C., Ривкин М.И., Ky-марев В.П. Репарирующая репликация 5'-s -тиофосфатного аналога гексадекадезоксирибонуклеотида, катализируемая ДНК-поли-меразой I E.coli .Биоорган.химия,1983,т.9,№ 7, с.954-957.

118. Shortle D., Grisafi P., Benkovic S.J., Botstein D. Gap mis-repair mutagenesis: efficient site-directed induction of transition, transversion and frameshift mutations in vitro.-Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 1982, v. 79, No. 5, p.1588-1592.

119. Narang S.A., Itakura K., Katagiri N. Oligonucleotides containing phosphotriester internucleotidic groups as novel substrates for polynucleotide enzymes. Can.J.Biochem.,1975, v. 53, p. 392-394.

120. Richardson С.С. Polynucleotide kinase from Es'herichia coli infected with bacteriophage T4. In: Procedures in nucleic acids research, Harper and Row Publishers, New-York, 1972, v. 2, p. 815-828.

121. Рыбаков B.H., Ривкин М.И., Богачев B.C., Кумарев В.П. Сшивка аналогов олигодезоксинуклеотидов с P-s -С(5*)-связями поли-нуклеотидлигазой фага Т4. Биоорган.химия, 1981, т. 7,9, с.1423-1425.

122. Lisy V., Eckstein F., Skoda J. Reduced ability of guanylylSdiuridine phosphorothioate GpUpU to stimulate binding of 14

123. С —valyl—tRNA to ribosome. Coll.Czech.Chem.Commun.,1968, v. 33, p. 2734-2736.

124. Barrett J.C., Miller P.S., Ts»0 P.O.P. Inhibitory effect of complex formation with oligodeoxyribonucleotide ethylphospho-triesters on transfer ribonucleic acid aminoacylation. Biochemistry, 1974, v. 13, No. 24, p. 4897-4906.

125. De Clercq E., Eckstein F., Merigan Т.е. Interferon induction increased through chemical modification of a synthetic polyribonucleotide. Science, 1969, v. 165, No. 3898, p. 11371139.

126. Naylor R., Gilham P.T. Studies on some interactions and reactions of oligonucleotides in aqueous solutions. Biochemistry, 1966, v. 5, No. 8, p. 2722-2728.

127. Shabarova Z.A., Prokofiev M.A. A model of enzymatic synthesis of the internucleotide bond between oligodeoxynucleotides. —■ PEBS Lett., 1970, v. 11, No. 4, p. 237-240.

128. Попов С.Г., Шамовский Г.Г. Индуцируемая водорастворимым кар-бодиишдом конденсация гексатимидилата в двухспиральном комплексе с полирибоадениловой кислотой. Изв.Сиб.отд.АН СССР, сер.хим. н., 1976, вып. 3, N2 7, с.14-19.

129. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Drutsa V.L., Melnikova N.P.,

130. Purmal A.A. DNA-like duplexes with repetitions. III. Efficient template-guided chemical polymerization of d(TGGCCAAGCTp). -Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, No. 21, p. 5747-5761.

131. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Turkin S.I., Gromova E.S. DNA-like duplexes with repetitions I. Properties of concate-mer duplexes formed by d(T-G-C-A-C-A-T-G). Nucleic Acids Res., 1980, v. 8, No. 11, p. 2413-2429.

132. Громова E.C., Виноградова M.H., Елов А.А., Вейко В.П., Долинная Н.Г., Друца В.Л., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. ДНК-подобные дуплексы с повторами. УП. Синтез и свойства фрагментов ДНК субстратов эндонуклеазы рестрикции

133. Есо RII.Moл.Биoл. 1984, т.18, № 2, с. 370-381.

134. Eshaghpour H., Soli D., Crothers D.H. Specific chemical labeling of DNA fragments. Nucleic Acids Res., 1979, v. 7, No.6, p. 1485-1495.

135. Brown G.L., Hartman R.P., Rose S.D. Enzymatic addition ofmodified cytosine nucleotides to DNA. Methacrylate polymerisation by an azo pyrimidine. Biochim. et Biophys. Acta, 1980, v. 608, No. 2, p. 266-276.

136. Hoard D.E., Ott D.G. Conversion of mono- and oligodeoxyribo-nucleotides to 5'-triphosphates. J. Amer. Chem. Soc., 1965, v. 87, No. 8, p. 1785-1788.

137. Мишенина Г.Ф., Самуков В.В., Шубина Т.Н. Синтез 5*«трифосфатов дезоксиолигонуклеотидов и их превращение в Jj'-амиды.-Биоорган.химия, 1976, т.2, № 2, стр. 179-188.

138. Kozarich J.W., Chinault А.С., Hecht S.M. Ribonucleoside phosphates via phosphorimidazolidate intermediates. Synthesisof pseudoadenosine 5'-triphosphate. Biochemistry, 1973,v. 12, No. 22, p. 4458-4463.

139. Карпейский М.Я., Михайлов C.H., Падюкова Н.Ш. Синтез 5'-моно-, ди- и трифосфатов 5'-с-метилуридинов. Биоорган.химия, 1982, т.8, № 7, с.933-939.

140. Готтих М.Б., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Получение фос-фамидов моно- и олигонуклеотидов в водной среде. Биоорган, химия, 1983, т.9, № 8, с.1063-1067.

141. Reid T.W., Wilson I.B. E.coli alkaline phosphatase. In:

142. The Enzymes, Boyer P.D. ed., Academic press, New-York, 1971» v. 4, 3rd ed. p. 313-328.

143. Efstratiadis A., Vournakis J.N., Donis-Keller H., Choconas G., Dougall D.K., Kafatos F. End labeling of enzymatically decap-ped mRNA. Nucleic Acids Res., 1977, v. 4, No. 12, p. 41654174.

144. Shimotohno K., Kodama Y., Hashimoto J., Miura K. Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in enka-ryotic protein synthesis. Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A.,1977, v. 74, No. 7, p. 2734-2738.

145. Shinshi H., Miwa M., Kato K., Nogushi M., Matsushima Т., Su-gima T. A novel phosphodiesterase from cultured Tabacco Cells.-Biochemistry, 1976, v. 15, No. 10, 2185-2190.

146. Белова Л.А. Ферментативный анализ нуклеотидных пирофосфатов.-Дипломная работа, Москва, 1982, 70с.

147. Cameron V., Uhlenbeck О.С. 3'-Phosphatase activity in T4-po-lynuclotide kinase. Biochemistry, 1977, v. 16, No. 23,p. 5120-5126.

148. Soltis D.A., Uhlenbeck O.C. Independent locations of kinase and З'-phosphatase activities on T4 polinucleotide kinase. -J.Biol.Chem., 1982, v. 257» No. 19, p. 11340-11345.

149. Uhlenbeck O.C., Cameron V. Equimolar addition of oligoribo-nucleotides with T4-RNA ligase. Nucleic Acids Res., 1977, v. 4, No. 1, p. 85-98.

150. Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии. М., "Мир", 1972, 467 с.

151. Uhlenbeck О., Harrison R., Doty P. Some effects on noncomple-mentary bases on the stability of helical complexes of polyribonucleotides. In: Molecular association in biology, Pullman ed., Academic press, New-York, 1968, p. 107-114.

152. Lipsett M.N. Complex formation between polycytidylic acid and guamine oligonucleotides. J.Biol.Chem., 1964, v. 239, No. 4, p. 1256-1260.

153. Lipsett, Heppel L.A., Bradley D.F. Complex formation between oligonucleotides and polymers. J.Biol.Chem., 1961, v. 236, No. 3, p. 857-863.

154. Королева O.H., Друца В.Л., Долинная Н.Г., Цытович А.В., Шабарова З.А. ДНК-подобные дуплексы, содержащие повторы УЛ.

155. Химико-ферментативный синтез полимеров с фрагментами природных промоторов. Мол.биол., 1984, т.18, вып.1, 146-160.

156. Brahms J., Maurizot J.С., Pillet J. Interactions contributing to the stability of a polynucleotide helical chain role of the 2»-hydroxyl and of the phosphate groups. Biochim et Biophys. Acta, 1969, v. 186, No. 1, p. 110-123.

157. Меламед H.B., Попов С.Г., Шамовский Г.Г. Изучение индуцируемой водорастворимым карбодиимидом конденсации тридезокси-аденилата в трехтяжевом комплексе с полиуридиловой кислотой.

158. Изв. Сиб.отд. АН СССР, сер.хим.н., 1974, № 12, вып.5, с.90-98«

159. Shabarova Z.A., Ivanovskaya M.G., Isaguliants M.G. DNA-like duplexes with repetitions: efficient template-guided poly-condensation of decadeoxyribonucleotide imidazolide. FEBS Lett., 1983, v; 154, No. 2, p. 288-292.

160. Shuster S., Kaplan N.O., Stolzenbach F.E. The reaction of pyridine nucleotides with trifluoroacetic acid anhydride. -J.Biol.Chem., 1955, v. 215, No. 1, p. 195-202.

161. Maxam A., Gilbert W. A new method for sequencing DNA. -Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1977, v. 74, No. 2, p. 560564.

162. Studier F.W. Sedimentation studies of the size and shape of DNA. J.Mol.Biol., 1965, v. 11, No. 2, p. 373-390.

163. Martin F.H., Uhlenbeck O.C., Doty P. Self-complementary oli-goribonucleotides: adenylic Acid Uridylic acid block copolymers. J.Mol.Biol., 1971, v. 57, No. 2, p. 201-215.

164. Соколова Н.И., Каграманова В.К., Долинная Н.Г. Специфическое комплексообразование в водных растворах с участием моно- и олигонуклеотидов. Успехи химии, 1975, т.44, вып.1, с.104-133.

165. Берлин Ю.А., Буткус В.В. Синтез олигодезоксинуклеотидов, содержащих последовательности ggtacc и их взаимодействие с эндонуклеазами рестрикции крш. Биоорган.химия, 1981, т.7, № 8, с.1224—1232.

166. Zinoviev V.V., Gorbunov J.A., Baclanov М.М., Popov S.G., Malygin E.G. Structure subtraction as an approach to investigation of the mechanism of restriction enzyme action. -FEBS Lett., 1983, v. 154, No. 2, p. 282-284.

167. Woodbury J., van Hippel P.H. On the determination of deoxyribonucleic acid-protein interaction parameters using the nitrocellulose filter-binding assay. Biochemistry, 1982, v. 22, No. 20, p. 4730-4737.

168. Donis-Keller H., Maxam A.M., Gilbert W. Mapping adenine, guanine and pyrimidine in RNA. Nucleic Acids Res., 1977, v.4, No. 8, p. 2527-2538.

169. Косых В.Г., Пунтежис С.А., Бурьянов Я.И., Баев А.А. Выделение, очистка и характеристика рестрикционной эндонуклеазы eco rii.Биохимия, 1982, т.4-7, вып. 4, с.619-625.

170. Грачев М.А. Ультрамикроанализ нуклеиновых кислот. Ред. Кнорре Д.Г., Венкстерн Т.В. М., Наука, 1973, с.104-122.

171. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и центрифугирование. М., Наука, 1981, с. 7-173.

172. Боуэн Т. Введение в ультрацентрифугирование. М., Мир, 1973, с. 55.

173. Такакува Т. Приложение к книге Краббе П. Применение хироп-тических методов в химии. М., Мир, 1972, с.139-166.

174. Горина И.А., Яковлева В.И. Быстрый метод определения содержания белка в клетках микроорганизмов. Прикладная биохимия и микробиол., 1980, т.16, вып. 6, с.936-939.