Определение первичной структуры регуляторных областей генов альфа субъединицы Na+,K+-АТФазы человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДМШ НАУК СССР

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ М.М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

Малышев Иван Владимирович

Определение первичной структуры регуляторных областей генов а суОъедшшцы На+Д+-АТФаз1г человека

Специальность - 02.00.10 - биоорганическая химия.

Автореферат диссертации на соискание учбной степени кандидат химических наук

Москва, 1991 г.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте Сиоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

Научные руководители: чл.-корр. АН СССР, доктор химических

наук Свердлов Е.Д. кандидат химических наук Смирнов Ю.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Янковский Н.К., член-корреспондент АН СССР Антонов В.К.

Ведущая организация: Межфакультетская Проблемная Научно-Исследовательская лаборатория им. А.Н.Белозерского при МГУ им. М.В.Ломоносова.

Защита состоится "/é 1991 г- в час.

на заседании специализированного совета при

инстиуте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: II787I, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан "/()" С^КТ^у-Ч 1991 г-

Учбный секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

В.А Несмеянов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'Актуальность проблемы.

На+,К+-АТФаза осуществляет АТФ-завискмое перераспределение ионов Ма1" и к!" между клеткой и внеклеточной средой, против градиента концентраций этих ионов. Этот фермент присутствует во всех исследованных клетках эукариот. Белок состоит уз двух субъединиц - а и р. а-субъединица формирует каталитический центр, участки связывания Ка+, К+ и сердечных, глжози.т:-'-» <1.В. ег

а1 1989). р-субъединица обладает рецепторяой функцией (Иоог Б. ег а1., 1990) и облегчает вс-р-ивание а-^убъединицы в клеточную мембрану (Сеег1я£ К. а1., 1989). Функциональные исследования Ка^^-АТФазы не могли дать ответа о механизме функционирования фермента без знания его первичной структуры, с-;'».-горный исследования На+ .^-АТФазы в ИБХ начались - 1985 году в лаборатории структуры и функции генома человека в сотрудничестве с лабораторией мембранных биоэнергетических систем. Была определена полная первичная структура аир субъединщ На+,К+-АТФазы из почек свиньи и создана модель расположения белковой молекулы в мембране.

Ко . времени начала данной работы было установлено, что у млекопитающих существует семейство генов а-субъединиц и определены структуры кДНК а1, а2 и .аЗ субъединиц, а на уровне генома было показано, что. существуют по крайней мере ещЭ три гена а-подобных субъединиц: ген Н1" .К^-АТФазы и гены аС и аВ, которые могут кодировать либо другие изоформы На+,К+-АТФазы, либо другие АТФазы. Следующим шагом по изучению семейства генов а субъединиц Ка+,К+-АТФазы явилось изучение экспрессии отдельных субъединиц в различных тканях и -'была доказана тканеспецифичность различных изоформ. Настоящее исследование представляет собой первый этап в работе по выяснению тканеспецифичности на уровне регуляции экспрессии генов. Определение структуры промотсрных областей и прилежащих к промотору. областей позволит в дальнейшем локализовать последовательности, участвующие в регуляции экспрессии и з частности обеспечиващие ткане специфическую экспрессию. Одним из возможных методов исследований является сравнительно-структурный анализ гомологичных регуляторных областей. Наличие консервативных участков может предполагать их функциональную значимость.

Паль работы. Настоящая работа является частью обширного исследования Ма+,К4"-АТФазы , проводящегося в насем институте и за рубежом. Работа посвящена молекулярному клонированию, определению нуклеотидной последовательности и анализу регуляторных областей генов а2 и аЗ !,та+ X -АТФазы человека. В связи с зтим в данной

работе были поставлены следующие задачи:

I. Найти в клонах, выделенных из геномных библиотек фрагменты, содержащие первый экзон и регуляторные области для генов а2 и аЗ Na+,K+-AT®a3H человека и определить нуклеотидную последовательность этих областей, определить точки инициации транскрипции для этих генов.

2. Провести анализ регуляторных областей изучаемых генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы в клонах из геномных библиотек найдены посльдпвательности 5" концевых областей генов а2 и аЗ Na+,K+-АТФазы человека . Для гена а2 определена первичная структура фрагмента, длиной 5700 п. о., ( в том числе последова1чльность части первого нитрона 3600 п.о.), а для гена аЗ - 1600 п.о.промоторная и дальняя 5' концевая области). Для гена аЗ определена точка инициации транскрипции. ПроведЗн анализ регуляторных областей изучаемых генов и выявлены потенциальные регуляторные элементы. Методом сравнительно-структурного анализа выявлены консервативные последовательности, которые, видимо играют определённую роль в функционировании генов а субъединиц. Эти исследования, с одной стороны уже дают общее представление о типе исследуемых промоторов, а с другой стороны они необходимы для последующей точной локализации' и детальной характеристики промоторных и эзхансерных элементов при помощи направленных делеций, мутаций и других генноинженерных методов исследования регуляции экспрессии.

Объём работы. Диссертационная работа изложена на 89 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсузадения результатов, экспериментальной части, выводов и списка датируемой литературы (127 ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности 5'концевой области гена а2 Иа+,К*-АТФазы человека.

Космидый клон RCI0-I6, содержащий 5' концевую область гена а2 Ма+,К+-АТФазы ( в дальнейшем ген а2 ), был выделен в нашей лаборатории из геномной библиотеки человека на основе космиды рНС79. Скрининг проводился на зонд рВ 159, содержащий последовательность кДНК al .изоформы Na1" ,KÎ" -АТФазы свиньи ( 32 нуклеотида 5' нетранслируемой области и первые 10 зкзонов) (Монастырская Г.С. и др., 1987). Ранее,в 1987 году была определена

структура 7 л 8 экзонов из клона А.ЖаМ)16, содержащего фрагмент того кз гона а2 (Sverdlov 2.D. et al., 1987) ( рис.1). Но первые 2 экзона, которые являются вариабельными в семействе а

субъелиниц Na+ .^-л^лярч гибридазовались на зонд рВ 159 и порвю? v-rCii си. оал найден в негибридизугцемся фрагменте ВашН1-ВалгН1, длиной 5,6 т.п.о. (рис.1). При определении первичной структуры (спквенировании) концов этого фрагмента была обнаружена часть первого экзона с последовательностью, кодирующей четыре яэрЕне о'^ыокислотк, и часть первого интрона. Далее, т.к клон ROin т-з сыл откартирован всего по 3-й растриктазам был проведбн анализ рестркктных фрагментов фрагмента BamHI-BamHI 2,7 т.п.о. Использовались ферменты рестрикции, совместимые с полилинкером бактериофага М13шр19.

Клоны Для спквенированкя в M1Smp18 и ШЗпр*0 '-".-../чани

методом направленного клонирование. (пуп котором какдый ресгрикционный фрагмент выделяется и клонируется в вектор индивидуально). Была определена структура 5' концевой области гена до левого сайта EccRI фрзгмэнта 0,5 т.п.о на рисунке I. Часть структуры первого интрона была определена при помощи метода направленных делений с использованием экзонуклвгзы III до позиции сайта Крп I, единственного во фрагменте BamHI-BamEI 5,6 т.п.о. Стратегия сиквенировання приведена на рисунке I. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера с модификациями. Нуклеотидная последовательность 5' концевой часта гена и части первого интрона приведена на рисунке 2.

2. Определение структуры 5' концевой области гена аЗ Na*,К^-АТФазк человека.

Последовательность 5' концевой области гена аЗ субъединицы На+,К+-АТФазы человека (в дальнейшем гена аЗ)была получена из библиотеки клонов на основе вектора EMBL4. Ко врекеки начала этой работы была известна' структура кДКК аЗ изофоруы (ИэкареЕкч О.И. и др., 1990) и геномный банк скринировзлся на зонд рВ2301 , содерггзЕИй 472 нуклеотида кДЕС соответствующих 5' концевой части «K-DC с2 кзофэрг-ы, в ток числе 140 нуклеоткдон из нетранслируэмой области. Клопы R38.1 и P.S5.1 (Ric.3), получэкгшэ из зтсго банка от К.Е.Петрухина (ИБХ, лаборатория мэмбргннлх биоэнергетических систем) оказались вденис'пшуи при анализе первичной структуры.

С 25-члекным зондом 441 (5- CTSGGCGGCyCCCGCGAGAGAGCC 3" ), комплементарным участку в нэтранслируемой 5' концевой ".асти мРНК аЗ изсфорш срнс.4) гибридизэвался фрэгмзнт Вал-;-:1-Ба\'Л1, длиной около 3 т.п. о. Методом ненаправленного клисгсэвакия с

|_ХАН31 Л

\ARS7_

\HKolRD16 ,

оозЯС1О -16 (

В: : ВатНХ 6.0 |2 0.15 .7 -5 5.6 | ¿.7 | 7,6 | А..г |1,7| З.Л |2

Н: 1 :Н±пс1111 18. Л 1 . 1 И ,8| зи |г,г| ¿.з | | ■1,1 |з,о

Л :БооК1 7.0 0,5 II 2.5| 8.1 1,2 0,9 2,2 III I 10.3 1 .0 I I 4.7

АТС • ТЭА

Рисунок!. Рестрккгпая карта гена сх2 На+,К+-АТФазы человека и стратег секвшжрования его Б'-коьшевой области. АТС я ТСА - соответствен инициирующий и терминирующий кодоны. Буквами обозначены сай ферментов рестрикции: В - ВашН1, Е - Н1пс1111, К - Крп1, И - ЕсоБ Р - Ра«, X - ХЬа1. Вверху показаны перекрывающиеся клоны из геномы библиотек. Щ - 5' концевая область и часть первого интрона определенной структурой. Цифры в верхней части рисунка обознача размеры фрагментов рестрикции в т.п.о. Внизу показана стратег сиквенирования. Координаты даны в п.с. относительно стар' транскрипции. Стрелки —показывают клоны, получешше метол направленных делеций, стрелки —>- показывает клоны, полученные метол направленного клонирования.

шп1ХАла>:;А0СААаллсщмсА(шшсшшт -1919

С1ЛАССТ0ССТСтаЗССАСТСТ<БА<Ш^ -1319

ТС^АСнСА03ОЭа<ЗААСТ(ШАТСТ^^ -1~1 ?

САОААЯОТТЭТКЯСШССТАСССАС^ -161?

7(£/ШТ(ЛСАЛС1ЖА0?етЗАСШШ:АСТТАТТТА -1513

тсссггда;Агад(зттсшст«шхжеАтеыст^ -1*10

СТСТСТОТТТтТГСАСТСАге/ШЛТАбАССТбСга^ -1313

бшспетотстсшшаяАетАбААсашзАССАС^ -1219

аТТСШТАСТШСШТбАКАВСААСААС/ШХЛ -1119 АААбАТАССтТССШХЕАО® АААВШАООСАТПСТ^ ГТССААТСТССССС -1019

АСТТСАПЮАСЛ5тГ1СТТСТСПА0СС1САВТССТ6САТбгТ0САетТ1ССТТат -919

СШСАШСТСТШАТТТ(ЗтТОАТАТТ(ШЛТСАСАСАСАТСТТЛ(Ш^ -319

СЛгаАТ/ШТСАЯСТ/ШЕГСТТСААСАССШО^^ -719

аШТСШЛСТАОСОТНХХЖШХЛСОТАЮЛ!^ -019

СТТСССТгаТСТ(ХШСТТСХШ7Г(ГСТСОТАЗССЛОТТТШ^ -519

ТСАШТттСТСШЛТСАСТСТОЭТаААССТСТ^^ -419 ' Ок1атюг

ТСШЗА5АССТКАШСТКет(ЛШСТТАТСААТ1]^^ САТНЗ -319

ТСТСТ(Ж:АТаЯ(таТТСТ6АСТСЛАСТССТС<ХШСА0ССА6АТСС1 -£19

И СТС1С/ШИ6АИ(ШЮ/ШЯЖ/ШШТБАВАСЗДШи^^ -119 5р1 5149 ТАТА-Ьох

¡шзшкшяшсстсАв^тостеттсж^ - 19

II II

<ШСА1ШСТСТ(ШХ:АА6аЬ?^гЬтСТ^ 182

■ МэШ1уАтк<31у • ■ ■

СТтаБШ(ШШаЗА/ШОСО0С6АЕ^^ 232

ССАСВЗОНСАСАТ/ШГГЩеСТСТ^^ 382

Рис.2. Первичная структура 5 концевой области и части первого экзона гена о2 Ма ,К -АТОазы человека. Сплошными линиями подчеркнуты потенциальные регуляторные элементы, а в первом интроне - чвредуюшаяся полипурин-иолипиримидиновая последовательность (обсуждение в тексте). Стрелками показаны точки начала транскрипции. Строчными буквами показана кодирующая последовательность первого экэона.

\NKaB10-3

I_I

МЛСаПЗ .2

I_I

ЫЖеНШ I__I

ХК28.1

1_I

ЛИЗ5.1

I_1

0.5

0,4 Н:ЕсоН1

||3.5 \г. 1 !_£5.7_1 4.8 | 3_7 |2.Р

0.2 Н:Н1пс11ХХ

|_17,8_|_22.7___

В:ВатН1

_5.2 ! В,О_| 7.0 __15.8_I 2. 3.3

Рис.3. Структура гена ей «а+ .К^-АТФазы человека, буквенные ^означения -как на рисунке 1. В верхней части показаны обнаруженные зрекрьгвакгкэся -клоки из геногошл библиотек , на основе фагэ лямбда.

иокззанк .рзс-гриктные карты для отдельных фзр.ч-зктов; в середине шй сводт.я карта гена, где ШШ - участок 5' лсндезой области гена с тродз.я?нко;: перэнчпой структурой. На присутствие сайт? Н<Л1 гстнгог.злсй лишь фрагмент ЗагНИ-Велг^!, 8 КЬ. Йсгау показана стратегия

псвенр.ровгтая. Стрглкой —........ показан клон 32. Сгре:зс: -— показывают

:энъ\ ззлучепянг методом деланий. Нол«- коср^яаг - ".очка начала :зь*с-::р:'лпик.

V-1J5J ...... V-1S55

AGTQGuGAGG СПСААСТТС TTGCOTCCA GTGGjCITGGC TGJiTGGGGTG TTGTGTGTCG ¡EAGCAGar TGGGGTGTQ3 CTGOCGGCTG TG7ATCTGTG

V-1C55

TGT 67 ACATA TACTGTGACG AG7TCTGTGT GTCATGTQGG TGAGGGCGTT Q3GGTGTGIT Tr^AGGTGCA ACAAAGATOT CTGCGATAGI ОЛ5лАТАА

V-U55

CGTGATCTGT егатстстш GAG3IGTGTG S3TGTCCSGT 6ACTICTSTT TGAATTATTG TnCTATGTGT ¡UGTGTGTGC ассптттк лбтсаттса

»-1055

CAGTTASCAT ТЭХААСПТ gcactgtggg CCGTTGCTCA TGCCCAAÁCA CACTGGGGAG CAGTGTGTGT GAGGATGTGT QCGACATCjT GGGATCATGC

v-955

aacgatgtcc acamggctg atgtagtgtg ictggaggca gigtgaqxc tctgcgtgtg тшюгат gagtgcaqqt gtgtgr/jgt iiatggotig

v-655

cacgatotc-g ctttctaigt gagatggtgg gaoctcaggt 6TGGTAGAGT GIGTGATGTG TGAGTCTGCG ATHTCTGAG TGICXVTGTT AGTCCGCACA

v-755

CEACTTTGTG CnGTGATTA.tgagtctcn GTGGTGIGAT GG3TGTGTAA GGTSIGtGOC CTATCTGTGT TTCACTCTAT GniGAGACT CTGTGTGTQ3

»-£55

tggg3tggtg ttgtgtctgt gagggtacat gctggcciat ggtogaatat gagigcaaoc ctgtggtgtg tgcgtgtcuj cagcatctgg gctatcagtg ¿

.»-555 I

tgatgstcci gtgtaactct 6acotg30c attttctggg cctcctggqs ccatccicca ccgtgttgtg тсгссссгег aocctctgtg gitgigdcto

»-455

aiiggatagc tcaggcgtag tgggggggca cccacagtga gggaatcica gggctcctcc cgccawacc cctcctcaat tgcaaggcct ttcttgctct ■

V-S55

cttgtgttx сттссаасгт гспстолос a3ggccctct ccctgaacag cactaccccc сошстсс agggtcoctg gtgxacact gcagtgattc

3p¡-VI v-255

accobqcttc алсссаот- cotctcacta cccgcccccc erraras: стиотгст ccgtgatggc acacccccac aatgagagga тттсссвээт

»-155

tttctttccc tuffictccw itcttggtgg ccctactcca tattgagq3g gtctccaagt cccctattgc ggaggtcicjr gggaatcccc ccaoccccgc

Spl-V СЛЛТ-Ьох v-S5

agcgctcccc сгтсзгзлс ccactttffig' gagccaaggg gaggacagct GCAGIACCAG (ИГОЙИ GCGGQXGTC CGTCAGCACG GOTTATTS;

Sill-ÍV »»40

cagcgccgcc сгостссге: 3ixgck:a tatgaggacc cggacggcgg сотгках сгсгатаз igggaccaac ggacggacgs аоззагшк

ív-féir ргнюг ^ ^ SpJ-lü Spi-II Spl-I £S-palr pr/rer »44(5

gcacctaccs гагетта: утз"дс;<й ctcccagccc aagcctgagc ctgagcoik oxgaggicc ccgccccgcc qoxtggctc tctcgcctoa

»ПК

5xgxaag3 t^ji

Рис.4. Первичная структура 5' концевой области гена с.3 Ма+,К+-АТФазы человека. Сплошными линиями подчеркнуты потенциальные регудяторные элементы, и последовательности, комплементарные олигонуклеотидам, использованным для реакции удлиннения праймера и S1 картирования, стрелками показаны точки инициации »naoníraimura гтппииши ^стсяаии показана колиоуюшая последовательность первого экзона.

использованием рестриктазы Sau3A, с последующей гибридизацией на зонд 441 было найдено несколько идентичных клонов определена последовательность первых 550 нуклеотидов одного sj них S2. Эта структура включала 150 нуклеотидов первого интронг., первый экзон и часть промоторной области. При анализе последог.'^ельности в ней был найден сайт рестриктазы Notl, который при проверке оказался единственным в гибридизукхцемся фрагменте Вэ/Л1-ВашН1. Плазмида pBR322, содержащая исследуемый фрагмент BamHI-BamHI была обработана рзстриктазой Notl, а затем были проведены делеции при помощи экзонуклеазы III в обе стороны от -айта Notl. Полученные делеционные фрагменты 'переклонировал"с:, ' М13 тр19 и по методике Эгстера и Трахсела (Aegster Ь., Traehsel H., 198Т) с использованием клона S2 была определена группа клонов, содержащих делеции в 5* область гена аЗ к ¿>ти клоны сиквенировались. Так как структура 5' области гена аЗ определялась лишь по одной цепи электрофорез в структурных гелях выполнялся в условиях, сводящих к минимуму ■"компрессии", а участки с трудно разрешаемыми компрессиями сиквенировались с использованием Taq-полимэразы и деазагуанозина. Карта гена аЗ и стратегия сиквенирования приведены на • рисунке 3. Определённая нуклеотиднаа последовательность приведена на рисунке 4.

3. Определение точки инициации транскрипции для гена аЗ Ка*,К^-АТФазы человека.

Для определения местоположения промотора необходимо знать точку инициации транскрипции мРНК с изучаемого гена. Такой эксперимент был выполнен для гена аЗ изоформы. Для корректного определения старта транскрипции необходимо определять его двумя независимыми методами: S1-картированием и анализом с удлинением праймера. Эксперименты были выполнены на поли(А+)мРНК из мозга человека. Анализ с удлинением праймера был выполнен на двух праймерах - 441 И 535 (5' GCTGGGAGCCTCTGCAGCGC 3'), (рис.4). Праймер 441, успешно использованный для поиска 5" области гена аЗ, давал в результате удлиннения праймера около 10 фрагментов. Праймер 535 давал гибридизацию в виде одной полосы на блоте с полиА(+)РНК. Эта полоса соответствовала по размерам мРНК аЗ изоформы. в результате реакции удлиннения этого праймера было обнаружено 3 фрагмента (рис.5.1).

Обратная транскрипция терминировалась на нуклеотидах, находящихся на расстоянии 152, 154 и 155 нуклеотидов от А в инициаторном ATG-кодоне (эти же полосы присутствовали и были наиболее интенсивными и в наборе фрагментов, получающихся при анализе с

Рис.5. Определение точек начала транскрипции гена альфаЗ-изоформы каталитической субъедаяицы Ыа+,К+-АТФазы.

5 Л Реакция удлинения праймера.

А - последовательность гена альфаЗ, ( клон Б2, сикЕенированный с меченым праймером 535 ).

В - результаты реакции удлинения с праймером 535.

5.2 - Б1-картирование.

А - проба отожжена с ро1у(А+)-мРНК без обработки нуклеазой Б1.

В - последовательность гена альфаЗ, ( клон Б2, сиквенированный с меченым праймером 535 ).

С- то же, что и А, плюб обработка Б1-нуклеазой (слева направо -100, 200, 300 ед. Б1 -нуклеазы).

праймером 441). Остальные фрагменты, полученные в реакции с пуаймером 441 были признаны артефактом, и был сделан вывод о большей пригодности праймера 535 для анализа старта транскрипции.

S1-картирование проводили используя 535 праймер и в результате получили 2 фрагмента, указывающие на расстояние 5' конца мРНК в 152 и 155 нуклеотидов от А в инициаторном ATG-кодоне (рис. 5.2). Таким образом, по-видимому, в мозге человека для гена альфз-' функционируют две точки начала транскрипции, находящие".' '-а расстоянии 155 и 152 от инициирующего кодона, а третт^ сайт, появлявшийся только в анализе с удлинением праймрр'', является артефзктом. Результаты анализов представлены ня т^сунке 5. Сайт в

положении 152 имеет структуру СА, более характерную для старта

эукариотнческой трансляции, чем сайт в положении 155, имеющий т

структуру GC. С последнего, судя по интенсивности полос в мозге человека затравляется в процентном отношении меньше мРНК, чем с т

сайта СА. В аналогичных исследованиях гена альфа2-изоформы праймер, выбранный для анализа старта транскрипции, оказался неудачным и, к тому же, в это время появились данные о результатах такого исследования за рубежом. Shull с соавторами обнаружили кластер сайтов инициации .транскрипции, находящийся на расстоянии 104, 103, 100 и 99 нуклеотидов от ATG кодона (Slmll et al. ,1989) (рис. 2).

4. Анализ регуляторяых областей генов а2 и аЗ изоформ Ка^Д^-АТФазы человека.

В консенсусной структуре, выведенной для последовательности

вокруг инициаторного ATG кодона - GCCGCCgCCATGG M. Козак обнаружила два наиболее важных для эффективности трансляции нуклэотида: -3 (А или G) и +4 (G) (КогаК М. 1987). Эти нуклеотвды присутствуют в генах а2 и аЗ изоформ. Триплеты GCC сразу "влево" от ATG в одной рамке считывания с кодирующей областью, дополнительно усиливающие трансляцию присутствуют лишь в гене аЗ, где последовательность вблизи АТС следующая: GCCGCCAAGATGG, а у гена а2 (структура TGCCCCAAGATGG) их нет.

Активно транскрибируемые гены всегда те ют высокое содержание G и С нуклеотидов в последовательности промоторной области (GC-богатые области) (Waaylyk в., 1988). Более того во всех 5' областях "iiouseksepiung" и некоторых тканэспецифических генов содержатся CpG островки. CpG островки - GC-богатые области неметилированной ДНК, с высоким содержанием динуклеотцда CpG.

GC-состав 5" областий генов изоформ а2 и аЗ Ка+,К+-АТФазы

человека и сравнение их с аналогичной областью гена al человека (Shull H.M. с-1 al., 1990) привед8н в таблице 1. 5" области были условно разделены на область потенциального промотора от +30 до -250 (п.о. относительно точки начала транскрипции), ближнюю к промотору 5' концэвую область - от -251 до -500, и дальнюю область от -501 до последнего определенного нуклеотида в 5' сторону. Из данных видно, что в первых двух областях 5' область аЗ имеет высокий GC-состав ( сравнимый с GC-составом al ) и более высокий, чем аналогичные области для гена а2 изоформы. GC-богатая область последнего распространяется лишь • на область потенциального промотора. В дальней 5' области GO-состав двух генов одинаков.

Таблица 1

GC и CpG-состав регуляторных областей гонов a субъединиц 11а+,К+-АТФазы человека.

* Координаты G + С +30/-250 G + С -25I/-500 Ü + и -50I/-2I34 (02) -50I/-I6IO (03) CpG + GpC ATGN-450 GpG + СрС ATG4-450

% aZ 61,1 46,8 53,9 8,2 25

% аЗ ТЫ 63,2 53,6 23,2 28

% а! 72,6 69,7 структура не определена 25,7 27

*)Координаты даны от старта транскрипции, за исключением состав; динуклэотидов (две последние колонки), где исследовалась облает! длиной 450 нуклеотидов в 5' сторону от инициирующего кодона.

При теоретическом случайном распределении нуклеотидов на двуцепочечной ДНК (A%=i%=G%=C%) содержание динуклеотида CpG составляет 12,52-. Это значение обозначено горизонтальной чертой на рисунке 6, показывающем распределение встречаемости CpG динуклеотида в 5' областях генов а субъединиц На+,К+-АТФазы человека (анализ прсвэд5н при помощи программы из пакета программ "DNA star"). Представленный на этом рисунке анализ показывает, что в промоторной области А2 нет CpG островка. Его GC богатая область образуется за счет высокого содержания динуклеотидсв СрС и GpG (таблица 1). У A3 гена в промоторе есть небольшой CpG

АТв

АТС

Рисунок 6. Распределение встречаемости СрС динуклэотида в 5' областях генов а субъедшшц Ка+Д+-АТФазн человека. Ноль координат - инициируются ко дон.

островок, около 350 п.о. длиной, а у AI гена его длина, как видно, превышает I kb. Эти данные согласуются с представлением о том, что housekeeping гены обязательно содержат CpG островки, в то время как ткане и время-специфические гены содержат их не всегда. Среди изоформ а субединицы "housekeeping" белком считается al, поскольку именно al обнаруживается почти во всех тканях (Broude N.E. et al., 1990). Продукты генов ей и аЗ имеют гораздо более ограниченное распространение в тканях человека (и несхожее друг с другом) и считаются тканеспецифическими.

4.1. Анализ потенциальных сайтов связывания регуляторных факторов.

Был проведбн копьютеркый анализ 5" областей генов а2 и аЗ с целью поиска известных сайтов связывания для регуляторных белков. Такой анализ является полезным для последующего функционального изучения 5* областей на предмет регуляции транскрипции. Результаты представлены в таблицах 2 и 3 и на рисунке 7. Было проверено наличие потенциальных сайтов связывания для факторов влияющих на базальный уровень транскрипции: TATA бокс, сайт связывания Sp1, ССААТ боксы (в том числе сайт связвания NF-1), октамер и сайтов связывания, опосредующих активацию через протеинхиназы С и А: сайты связывания АР-1, АР-2, АР-3. Известно, что экспрессия генов Na+ ,К+-АТФазы регулируется минералокортикоидами, глюкокортикевдами и трийодтиронином (Llngrel J.В. et al, 1989). Консенсуса сайта связывания рецептора минералокортикоидов ещ9 не описано, но известно,что он может узнавать сайты связывания глюкокортикоидного рецептора (Cato А.С.В., Weinman J., 1988).

На рисунке 7.1 показаны промоторные области трех генов и потенциальные регуляторные последовательности, которые работают только В промоторах: TATA, GC, и СААТ боксы.

Как видно, гены al и ой содержат TATA боксы на их характерных местах, в то время как ген аЗ не имеет ТАТА-подобной последовательности. Здесь (на координатах -26 - -20) расположена последовательность CATATGA, которая возможно" выполняет роль TATA бокса. Для выяснения вопроса, связывается ли с ней TFIID или какой либо другой фактор необходимо провести футпринт-исследования. Координаты здесь и далее даны в п.о. от первой точки инициации транскрипции (155 п.о. от ишщиирулцего кодона). В гене а2 ТАТА-бокс, видимо, относится к"подклассу ТАТТТАТ боксов, например, как в раннем промоторе SV40 (Simon К.С. et al., 1988).

СААТ бокс (являющийся потенциальным сайтом связывания СТР) на своем характерном месте -40 - -100 присутствует только в промоторе гена аЗ. Он располагается в обратной ориентации и имеет

Таблица 2. Анализ потенциальных регуляторных элементов из 5' области гена альфаЗ изоформы Ыа+,К+-АТФазы челозека.

Фактор или Консенсус Найденная Ориента- 2 гомо- Коорди-регуляторный последова- ция логии наты элемент_тельность_ _

ТСАрТСА АР1 тсгстсА тслетсг ТСАстег ТС&СТСА ТСАгТСА 85 85 85 85 85 -1483 -1050 -990 -716 -516

АГ2 ССССАССС ССССАССС ССССАССа 3' З1 -5' -5' 100 87 -1543 -768

САССС фактор СССАСАССС сССАСАССС ССвАСАССС СССАСАаСС С^АСАССС 3' 3" 3' -5' -51 -5" 88 88 88 88 -1538 -1381 -721 -443

ССААТ бокс ССССААГ ЮёРШ АЮСААТ гСССААТ 3' 31 3' -5' -5' -5' 71 85 85 -59 -542 -1144

Глюкоко- ССТАСАпппТСТТСТ ртикоидный рецептор GGTAgAgtgTGTgaT GGTACAtgcTGgcCT 75 83 -1068 -873

КР-1 ТТСССТпппАОССАА вайССТсссАСССсА 75 +65

Рецептор трийодти- ССО^С^ ронина ССОТСС ССйАСС СССАСС 3' -5" 100 100 100 -384 + 18 + 112

Бр1

3р1 -I сССССССССС 1« -5' 90 +112

БЫ -II СССССССССа 31 -5' 90 +107

Бр1 - III ССССССССсТ о » -5' 90 +93

ЗШ -IV ССОСССОсСС 3' -5' 90 -49

Бр1 -V ссссссссос 100 -94

-VI сссссссога 'З » -5' 80 -324

АР-3 СССТСТСОАААСТ

СССТСГС^ААнОТ

85 -815

Таблица 3. Анализ потенциальных регуляторных элементов из 5' области гена альфа2 изоформы Ыа+,К+-АТФазы человека.

Фактор или консенсус регуляторный элемент

Найденнаяориента-% гомо-коорди-последова- ция логии наты тельность

ШЧ ТТСССТЛШАСССАА ггасссикгссссг 6Т -1565

ТаСССсгсГсСССАА 75 -1457

КТгСаяаядАСССАА 67 -183

аясоссаЗадсгм 60 -135

ттсгстйгсгсссла: 67 -1

АР-1 ТСАрТСА ТгАСТСА 85 -1211

V ТСкСТСА 85 -1160

ТСАстсг 85 -1064

ТСАСТСс 85 -573

* ТСсСТСА 85 -546

ТСАСТСА 100 -297

АР-2 ССССАССС ССССАССС СССяАССС ССаСАССС ССССАССС аСССАССС ССаСАССС З'-б1 100 8787 100 87 87 -1949 -1911 -1856 -1101 -242 -199

ССААТ бокс ССААТ ССССААТ ССССААТ пссаат АгССААТ З'-б' 71 71 71 85 -1972 -1934 -1031 -431

Гляжоко- ССТАСАНШТСТТСТ

ртикоидный ССаАСА^С^ГСТ 83 -468

рецептор

САССС фактор СССАСАССС аСаАСАССС сгссСАОсс СввАСАССС 78 78 78 -1190 -723 -627

Эр1 с т СССССС^ ССССССССА^ 90 -119

Рецептор трийодти- ронина ССС^Сц СвСАСС СССТСС БССАСС ССХлАСС 3* П 1 и 3" -5" -5' -5* 100 100 100 100 -1629 -1483 -245 +80

Октамер АТССАААТ АПСАААТ 87 -386

АГ-3 М;СТСТССАААСТ ССС^ТССАААСТ 3" -5' 85 -1109

7.1 А1 1

А2

>S1

ata

АЗ

АТАТТТТ

Г

ATQ

I

ТАТТТААА

САТАТ

лта

-400

-200

i

о

7.2 А1 А2

АЗ

А2

Т Т n n

А2

АЗ А2

АЗ

т т а

n nn nn

til

Q А1 Т о

f*T NN |N

аз

£>Т Т

n_

-2000

•1600

-1000

т

7.3 ATG ATG

а2 т т n n аз а2 с г* q а1 т 3 i ' т со nn n -

i tata tata i tata 1 tata i 1

-2000 -1600 - 1C00 -600 0

Рисунок 7. Расположение потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов в 51 областях генов а субъединиц Na+,К+-АТФазы человека. 7.1. Промоторкые области. Озал - сайт Sp1, Прямоугольник - СААТ бокс, стрелки показывают ориентацию сайтов.

7 2. 5' области. Сайты связывания: А1 - АР1 , А2 - АР2, АЗ - АРЗ, G глюкокортикоидного рецептора, Н - NF1. О - октамер, Т - тироидногс рецептора.

7.3. 5' область гена а2. TATA - ТАТА-подобная последовательность, s -сайт связывания Sp1, С - СААТ бокс, - открытая рамка трансляции.

-не-

последовательность TGGCAAT. Известно, что с последовательностью GCAAT более специфично чем CTF, связывается фактор СВР (Graves B.J. et al., 1987) GC-боксы IV и V фланкируют этот ССААТ бокс и располагаются в тех псе ориентациях по отношению к старту транскрипции, что и в промоторе тимидинкиназы вируса герпеса, для которого предполагается кооперативное взаимодействие между этими сайтами (Kadonaga J.Т. et al., 1986). В каждом кз двух других генов ближайший СААТ бокс находится "выше" координаты -400 и, скорее всего, не является функциональным.

Промоторы генов а!1^ к аЗ содержат большое число GC-боков - 5 у al к 6 у аЗ гена. В аЗ промоторе 3 сайта расположены "ниже" старта траноджпции в потенциальном нижнем промоторном элементе. Причем два из них перекрываются к, вероятно, не могут работать одновременно. Обычно наиболее важным для активации транскрипции является самый 3" концевой сайт в области ст -40 до -100. Такое положение соответствует сайту IV (рис. 2, 7.1).

На рисунке 7.2 схематически изображено расположение потенциальных связывающих сайтов в 5" областях генов а субъединиц Ыа+,К+-АТФазы человека. Здесь изображены не все найденные сайты, а лишь совпадающие с консенсусом более, чем на 85%.

Последовательность, называемая октамаром, найдена б 5" областях большого числа генов. В неликвидных клетках она узнаётся фактором OTF-1 (Sturm R. et al, 1988). Ген oZ содержит 1 последовательность, совпадающую с октамером в 7 из 8 нуклеотидов (табл. 3, рис. 7.2). Гены с£3 и а1 такой последовательности не содержат. Все три гена . содержат последовагельности, похожие на сайты связывания АР-1, АР-2 и АР-3, и если некоторые из них функциональны, то экспрессия этих генов может регулироваться через протеинкиназу С и цАК5Ф-зависимув протеинкиназу А, а также посредством продуктоз протоонкогенов Jun и los (Kltchsll P.J.,.TJan R., 198S).

У трбх сравниваемых геЕов содержится по 2 потенциальных сайта связывания рецептора трийодтиронина в предполагаемой промоторной облает;: (остальные дальше), причбм у гена аЗ и с1 они расположены "ниже" старта транскрипции, в предполагаемых ншских промэторнш: элементах. Найдены потенциальные сайта связывания глюкокортикоидного рецептора, неплохо совпадающие с консенсусами -2 в гене оЗ и по 1 е гене а2. Ни одкн кз найдеких потенциальных CACG0 Ссксов, которые способны стетерп-гчески уст^тавэть действие сз?тов связывания глвкпкортиковдннл. рецепторов, кз находится з

' ^Последовательность 5' области гена а1 и потенциальные сайты связывания регуляторнкх Факторов из работы (Stroll К.М. et al., 1990).

непосредственной близости от последних.

Первичные последовательности 5' областей трбх сравниваемых генов сильно отличаются друг от друга и достоверного выравнивания их, при помощи программ из пакета программ "DNA star", не получается.

Таким образом сравнение регуляторных областей а2 и аЗ изофсрм позволяет выявить резкие различия в их строении. Это может отражать различие экспрессии этих генов в различных тканях и в течение онтогенеза. Однако, реальную значимость цис-последовательностей может определить лишь функциональный анализ регуляторных областей. Косвенные данные может дать сравнение гомологичных регуляторных областей.

Интересной особенностью 5' фланкирующей области гена а2 изоформы является. наличие длинной открытой рамки считывания, находящейся на противополозшой от гена aZ цепи ДНК в обратной ориентации рис. 7.3, 8. Открытая рамка считывания начинается с координаты -1697 и не заканчивается до конца сжвенированкого фрагмента. Структура гипотетического балка не имеет видимой гомологии с послодовательностями базы данных NBEF-PIR. В том случае,если открытая рамка считывания представляет собой начало

Met Gly Pro Thr Gly Pro Sei- His Gly Pro leu Ser Glu leu

AGGGTGGGIAGG ATG GGG CCA AOA GC-G С CT TCT CAT GGC CCC CTC TCC GAG CTC 69T -1733'

irg Plie Gly Leu Gly Ars Glu ïrp Ala Glu Gly Gly Asn Asn Glu Gly Glr.

AGA TTT GGT CIT GGG AGA GAA TGC- GCA GAG GGA GGA AAC AAT GAA GGG CAA

"-1739 -1789"

Gin lie Pro Val Gln Pro Lea Cys Val Glu Gly Glu Ser Glu Arg Gly Val

С AG ATA CCA GTT GAG CCG CTC- TGT CTT GAA GGA GAG AGT GAG AGG GGA GTA

"-1790 -1840"

Ala Gly Lys Pro Val Val Arg His Gin Glu Arg Leu Ser Lys Ala Lys Ser

GCG GGA AAG СCT GÏG GTT AGA CAC CAG GAG AGA CTG TCT AAA GCA AAG TC¿

"-1841 -1891-

teu C-ln Ser Gly Pro Glu Ala Ala Are Glu Ile Asn Ile Gly Ata Gly Ici.

CTC CAG AGT GGC CCC GAG GGA GOT AGG GAG АТС AAC ATT GGG GCA GGG TTC

"-1892 -1942'

Pro Gly Gly Суз Gly Asn Asn Met Ile Asn Trp Gly leu Gly Ser Jla Cys

CCT GGG GGC TGT GGG AAC AAC ATG ATA AAT TGG GGT TTA GGA AGС GCC TGT

"-1943 -1993'

3er Val Gly Ser Trp Val Gly Ile

TCC GTA GGT TCC TGG GTT GGA ATT С

"-1994 -2018"

Рисунок 8. Белковая последовательность, выведенная из открытой рамки считывания, найденной в 5' концевой области гена а2 На+,К+-АТФазы. координаты даны по рисунку 4. Обсуждение в тексте.

ковэго гена, ориентированного "голова к голове" относительно гена а1 или ATPIAI (по номенклатуре Human Genome Map), то транскрипция нового гена могла бы инициироваться с участием ТАТА-подобной последовательности, находящейся в положении -1587 или на координате -1522. Альтернативными кандидатами на промоторную область мог бы быть участок с ТАТА-блоком положении -II28 и СААТ боксом в положении -I03I или участок с ТАТА-блокок в положении -477 и СААТ-блоком в положении -431. В любом случае сайты инициации транскрипции двух генов разделены протяженной последовательностью ДНК содержащей участки связывания факторов транскрипции двунаправленного действия например Sp1-, Api- и Ар2-связывахщие участки, октамер- и формируя, таким образом, общую регуляторную область двух генов. Это, при подтверждении функционирования второго, неизвестного гена давало бы основание предполагать участие продуктов обоих генов в одном каскаде биохимических реакций.

4.2. Необычные последовательности ДНК.

В первом интроне гена а2 на координатах 1333 - 1367 находится чередущаяся пурин-пиримидиновая последовательность вида (TG)n'(AC)n, общей длиной 34 п.о. с минорными нарушениями и минимальной ненарушенной структурой длиной 12 п.о. Известно, что подобные структуры могут образовывать лэвозакрученную Z-форму ДНК, которая имеет свойство негативного влияния на транскрипцию (lîaylor L.H., Clark î.K., 1990). Другая необычная и скорее всего неслучайная последовательность расположена сразу перед TATA боксом гена а2 - полипурин-полипиримидиновая последовательность, где полипуриновый олигонуклеотид расположен на кодирующей цепи. Длина еб - 35 п.с. с одним нарушением в середине последовательности. Интересно, что на координатах -1440 - -1404 расположена другая полипурин- -полипиримидиновая последовательность длиной 36 п.о., ко с полипиримидкновым олигонуклеотидом в кодирующей цепи. Если эта дальняя структура функциональна и играет ту же роль, что и первая полипурин-полипиримидиновая последовательность, то дальняя структура может относится ко второй найденной рамке считывания.

В предполагаемом нижнем промоторном элементе гена аЗ располагаются четыре тандемно расположенных прямых повтора GGAC:

+18 Тут Туг? ' Туг? +46

4¿GGAC¿AA¿GGAC¿GA¿GGAC¿GApGCGC

Перед этими повторами располагается найденный компьютерным анализом потенциальный сайт связывания рецептора трийодтиронина

(ТЗ), полностью совпадающий с консенсусом, выведенным Норманом с соавторами - ССС^С^ (Иогтап М.У., Ьау1п Т.И., 1989). Показанные со знаком вопроса дополнительные предполагаемые сайты связывания рецептора ТЗ отличаются от указанного консенсуса в одной (первой) букве. Такое расположение потенциальных сайтов связывания рецептора ТЗ даЭт основание говорить о возможной кооперативное™ связывания и активации через них. Дополнительным косвенным свидетельством в пользу реальной значимости этих сайтов может служить структура аналогичного .района в гене аЗ крысы: +17 Туг Тут? +46

¿ССАСЙСА6ССАС6САСАСАСССАСССТСС

Здесь нет тандемных повторов ССАС, но также, как и в гене' человека на расстоянии 2 п.о. располагается сайт, отличающийся от выведенного консенсуса заменой первого 2 на С.

4.3. Гомология в структура 5' областей генов а1, а2 и аЗ.

Несмотря на сильные различия, видные из сравнения найденных потенциальных регуляторных элементов в 51 областях генов а1, а2 и аЗ, сравнение их между собой может дать полезную информация, которую не может дать сравнение регуляторных областей выполненное, например для гена аЗ из 1срысы и человека. При сравнении генов сЗ человека и крысы (В.С.Ра№ак е'Е а1., 1990) совпадают прстнзбннгго последовательности в двух регуляторы^: областях, т.к. эти гепы днзергировали по генетическим понятиям нэ так давно и в Оольпсшстз? случаев невозможно выделив из п;п Бзхгыэ для зкгатрессиз сайты связквгния, скорое веэго .чо.кно лишь выделить яэвзжнке для трзнскр'пшяи последовательности. В денном случае продуктивнее сравнивать болео далёкие в филогенетическом отноиенит организм (5" области генов а субмдиниц которых пока не определены) или ке, как поступили ш - регулпторные области разных изоформ ¡-¡е::;ду собой, полагая, что должны Сыть некоторые общие регуляторные последовательности, участвующие в контроле транскрипции этих генов. Расхождение изоформ относят ко времени около 400 миллионов лет назад (Ероуде Н.Е., 1990) - времени' за которое каждый нухлзотид з последовательности из 15 нуклеотидов (самый большой размер из известных сайтов связывания транскрипционных факторов) полностью смените" более, чем один раз при услоеии отсутствия давления естественного отбора на эту последовательность.

Кроме указаных генов а изоформ была взята регуляторная область гена а1 изоформы лошади, определённая Капо с соавторами (Капо I.

et al.,1989) и считалось, что в данном случае межвидовые различия играют меньшую роль, чем различия между генами изоформ. Для сравнения 5* нетранслируемых областей генов а1, а2 и аЗ изоформ Кг+,К+-АТФазы был выбран алгоритм Вильбура и Липмана, основанный на поиске совпадающих участков заданной заданной длины и последующем выравнивании последовательностей относительно найденных фрагментов. Можно предположить, что этот алгоритм больше подходит для выравнивания нетранслируеных участкоБ генов, чем классический алгоритм Нидлмана и Вунаа. Найденные области еысокой гомологии регуляторных участков генов субъединиц включают в себя олигонуклеотидкые блоки, возможно участвующие во взаимодействии с транскрипционными факторами.

Последовательность в гене а2 на координатах -177 - -170 обнаруживает гомологию с последовательностями из двух других генов - al и аЗ ( для гена al лошади: координаты здось и далее даны от старта трансляции):

al (лошадь) -380 TTGGAGCOAAGGCACAG -365 *********** **

al(человек) -111 GCGGAGCCA-GGCCCAC -97 ************

аЗ -125 GCGGAGCCAAC-GGGAGG -111 * ************ **

а2 -179 GAGGAGCCAAGCGGGGG -165

В последовательности, общей для генов трЭх изоформ: GGAGCAAGG трЗх изоформ, присутствует правое плечо сайта связывания NT-1: AGCCAA -минимальный участок, необходимый для связывания этого фактора (Mitchell P.J., TJan R., 1989), но, возможно, что здесь связывается и другой регуляторный фактор (по-видимому при определении последовательности 5' области гена a1 человека был пропущен остаток аденозина). Существенно, что во всех трбх генах найденная гомологичная последовательность находится приблизительно на одном и том же расстоянии от старта транскрипции.

Вторая интересная находка - область гомологии между генами al лошади и аЗ:

а! -243 CGCGGACGAACGGCG-GAGGAGGCCGACA -216 ******** ************

аЗ -36 CGCGGACGCGGCA5ATGAGGAGGCGGACG -9 Здесь область гомологии разбита как бы на две полозикки. Б обеих половинках гомологичной последовательности ( гг исключением правой половинки у al ) присутствует олигонуклэот:^ CGGACC-, который идентичен олкгокуклеоткду, предполагаемому наш! для связывания рецептора ТЗ (стр. 21). Правая половинка содержит также совпадающий олкгонуклеотид GAGGAGG, для которого не удалось найти сходстзо с каким-либо из консенсусов связывания регуляторных факторов.

ВЫВОДЫ

1. Определена первичная структура 5" концевой области гена а2 субъединицы На+,К+-АТФазы человека, длиной 2123 п.о., считая от инициирующего кодона.

2. Определена первичная структура 5' концевой области гена аЗ субъединицы На+,К+-АТФазы человека, длиной 1610 п.о., считая от инициирузсщего кодона.

3. Определены точки инициации транскрипции для гена аЗ субъединицы На+,К+-АТФазы человека на расстоянии 155 и 152 п. о. от инициирующего кодона.

4. Цроведбн анализ 5" областей исследуемых генов и компьютерным поиском найдены потенциальные сайты связывания регуляторных факторов в этих областях.

5. В результате сравнения регуляторных областей генов а1, а2 и аЗ изоформ На+,К,"-АТФазы человека удалось выявить существенные различия в них: в целом это негомологичнныэ области с различным СС и СрС составами, различными ишаки ТАТА-последовательности, разным количеством и расположением потенциальных связывающих сайтов, отвечающих за базальную и индуцибельную экспрессию. Эти различия скорее всего отражают разные механизмы тканеспэцифичности экспрессии этих генов. С другой стороны были ЕыяЕлены элементы сходства: промоторные области генов СС-богатые, расположение некоторых потенциальных регуляторных сайтов сходно. В промоторной области генов тр5х изоформ (а1, а2, аЗ) найдена гомологичная для всех трбх генов последовательность.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. Sverdlov E.D., Monastyrskaya G.S., Broude N.E., Uahkaryov, Yu.A., Allikmets R.L., Melkov A.M., Smirnov Yu.V., Malyshev I.V., Dulubova I.E., Petruchin K.E., Grishln A.V., Kijatkln N.I., Kostina M.B., Sverdlov E.V., Jfodyanov N.N., Ovchinnlkov Yu.A. The family or human Na+,K+-ATPase genes. Ко less than live genes and/or pseudogenes related to the a-subunlt. - FEBS Lett., 1987, V.217.-N2, pp.275-278.

2. Sverdlov E.D., Bessarab D.A., Malyshev I.V., Petukhin K.E., Smirnov Yu.V., üshkaryov Yu.A., Monastyrskaya G.S., Broude N.E. and Modyanov N.N. Family of human Na+ .K1"-ATPase genes. Structure oi the putative regulatory region of the a+-gene. - IEBS Lett., 1989, v.44, pp.481-483.

3. Malyshev I.V., Bessarab D.A., Orlova M.Yu., Petruchin K.E., Volik S.V., Broude N.E., Monastyrskaya G.S., Modyanov N.N. and Sverdlov E.D. A comparative analysis of the putative regulatory regions of human genes coding for св-subunit of Näf" .K1"-ATPase. -Biomedical Science, 1991, v.2, pp.54-62.