Определение положения протона в сильных водородных связях по изотопным эффектам в спектрах ЯМР 13С в растворах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ТОЛСТОЙ Петр Михайлович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОЖЕНИЯ ПРОТОНА В СИЛЬНЫХ ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЯХ

ПО ИЗОТОПНЫМ ЭФФЕКТАМ В СПЕКТРАХ ЯМР 13С В РАСТВОРАХ

Специальность 01.04.07 - физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004

Работа выполнена в отделе молекулярной спектроскопии Научно-исследовательского института физики Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: профессор, д-р ф.-м. н.

Официальные оппоненты: профессор, д-р ф.-м. н. доцент, к. ф.-м. н.

Ведущая организация: Институт Элементоорганических Соединений РАН (Москва).

Защита диссертации состоится на заседании диссертационного совета Д 212.232.33 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора физико-математических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9. ^ер^

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбГУ.

Отзывы на автореферат просьба высылать по адресу 198504, Санкт-Петербург, Петродворец, ул. Ульяновская 1, НИИ Физики СПбГУ, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.232.33.

Автореферат разослан Ученый секретарь дисссертационного совета,

доктор физико-математических наук ^^^^ Андрей Владимирович Лезов

Глеб Семенович Денисов

Владимир Иванович Чижик Владимир Анатольевич Шевелев

«29»

Апрель. 2004 г. в

¿7

Оо

час.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Методом низкотемпературной (110-150 К) ЯМР спектроскопии проведены экспериментальные исследования комплексов с водородной связью, образуемых в растворах сильных доноров и акцепторов протона в сжиженной смеси полярных фреонов. Анализ спектров позволил сформулировать эмпирические закономерности, позволяющие по спектрам ЯМР оценивать среднее положение протона в водородной связи. Сильные температурные изменения в спектрах интерпретированы как обусловленные зависимостью диэлектрической проницаемости растворителя от температуры.

Актуальность работы. В последнее время в литературе активно обсуждается вопрос о структуре сильных водородных связей и о возможности образования таких связей в жидких полярных средах. Меж- и внутримолекулярные комплексы изучаются с помощью различных экспериментальных методов (кристаллография, оптическая и радиоспектроскопия), широко применяется квантово-механический анализ. Интерес к сильным водородным связям обусловлен, в частности, ролью, играемой такими связями в процессах ферментативного катализа и взаимодействия лекарственных препаратов с биологическими молекулами. Образование водородных связей определяет вторичную структуру белков и строение многих молекулярных кристаллов, лежит в основе некоторых механизмов мутаций и, как считается, через механизмы молекулярного узнавания позволяет доставлять лекарственные средства непосредственно в нужную область клетки.

Геометрическое строение водородной связи определяется формой поверхности потенциальной энергии комплекса. Качественное определение вида этой поверхности представляет собой основную задачу в экспериментальном исследовании феномена сильной водородной связи. Неэмпирические квантово-механические расчеты позволяют решить эту задачу количественно. Многомерные потенциальные поверхности, учитывающие большое число колебательных степеней свободы комплекса, позволяют рассчитать средние значения межъядерных расстояний в основном и возбужденных колебательных состояниях. Во многих случаях точность вычислений приближается к точности экспериментальных данных в газовой фазе, полученных методами чисто вращательной и колебательно-вращательной спектроскопии. Изучение дифракции нейтронов на кристаллической решетке позволяет определять среднее положение протона в кристаллах. В то же время методов количественной оценки геометрических параметров водородной связи в жидких растворах практически не существует.

Одним из способов решения этой задачи являются попытки построения эмпирических корреляций спектроскопических параметров, легко измеряемых в конденсированной фазе, с межъядерными расстояниями. Такой подход является лишь нулевым приближением, позволяющим проследить за изменениями геометрии водородной связи, вызванными изменением внешних условий и изотопным замещением. Построение моделей, описывающих наблюдаемые корреляции, представляет собой следующую задачу, решение которой невозможно без использования квантово-механических расчетов на высоком уровне. Ввиду вычислительных сложностей, в данной работе такие расчеты выполнены лишь для отдельных (простейших) комплексов с водородной связью.

Целью работы являлась попытка извлечения структурной информации о комплексах с сильной водородной связью из спектров ЯМР на ядре "С, а также использование спектроскопии ЯМР для исследования зависимостей геометрических параметров комплексов от свойств среды.

Изучение водородных связей типа ОНО, OHN и NHN, присутствующих в биологически важных молекулах и комплексах, методом ЯМР, затруднено отсутствием сферических (со спином 14) магнитных ядер в непосредственной близости от водородного мостика. Протонные спектры таких систем в области сигналов мостиковых протонов, как правило, плохо разрешены, а получение спектров на ядре 15N требует селективного изотопного обогащения В этих условиях легко доступные и, как правило, хорошо разрешенные спектры ЯМР 13С могут быть главным источником информации. Однако, насколько нам известно, попыток связать 13С ЯМР спектры непосредственно с геометрическими параметрами межмолекулярной водородной связи до сих пор не предпринималось.

Главными объектами исследования были выбраны комплексы уксусной кислоты в качестве донора протона с рядом акцепторов протона (замещенные пиридина, фторид-ион, ацетат-ион и его замещенные). Вариация в широких пределах протоно-акцепторной способности молекул-партнеров и диэлектрической проницаемости среды позволила по спектрам проследить за постепенным смещением мостикового протона от карбоксильной группы до электронодонорного атома молекулы-партнера (О, N или F).

Использование низких температур было продиктовано необходимостью увеличения времени жизни индивидуальных комплексов для возможности наблюдения их раздельных сигналов на спектрах ЯМР. Преимуществами использовавшегося растворителя (смесь сжиженных газов кроме низкой точки плавления, является малая вязкость

и достаточно высокая растворяющая способность при температурах вплоть до 100 К. Такая важная особенность используемого растворителя как сильная зависимость диэлектрической проницаемости от температуры, позволяет исследовать зависимость спектральных параметров от полярных свойств среды, не меняя растворителя.

Основные задачи работы

1. Развитие методики низкотемпературной спектроскопии ЯМР в растворах в сжиженных газах применительно к спектрам на ядре комплексов с водородной связью карбоновых кислот. Получение спектров ЯМР комплексов донор-акцептор протона различного состава и определение химического строения этих комплексов.

2. Измерение H/D изотопных эффектов на химических сдвигах и константах спин-спинового взаимодействия ядер, образующих водородный мостик, в условиях медленного обмена. Использование этих данных для изучения кооперативных эффектов в комплексах с несколькими водородными связями.

3. Попытка использования дальних изотопных эффектов на химическом сдвиге ядра углерода карбоксильной группы для качественной характеристики вида потенциальной функции протона и для оценки средних межъядерных расстояний в водородной связи.

4. Изучение влияния диэлектрических свойств растворителя на спектральные характеристики межмолекулярных комплексов. Использование этих данных для оценки влияния полярной среды на геометрию водородной связи.

Основные положения, выносимые на защиту. Низкотемпературная спектроскопия ЯМР на ядрах 13С в условиях медленного обмена может давать ценную информацию о строении и динамических свойствах комплексов с сильной водородной связью в жидкой фазе, а именно:

1. Кратность изотопного расщепления в спектрах 1Н и 13С при частичном H/D замещении позволяет определить стехиометрию комплекса (в частности, определить число п в кластерах типа (АН)„ и (АН)„А~) и оценить скорость процесса вырожденного многопротонного перехода в этих кластерах, допускаемого симметрией.

2. Впервые обнаруженная в данной работе тонкая структура сигналов, обусловленная скалярным спин-спиновым взаимодействием между ядром 13С и протоном карбоксильной группы, позволяет оценить нижнюю границу скорости вырожденного двухпротонного перехода в циклических димерах карбоновых кислот в жидкой фазе.

3. Дальние H/D изотопные эффекты на химических сдвигах ядра 1ЭС карбоксильной группы могут служить для оценки среднего положения протона в водородном мостике. Однако в случае двуямного потенциала, характерного для комплексов с очень сильной водородной связью, знания среднего значения колебательной координаты протона еще не достаточно для определения полной геометрии водородного мостика и его спектральных характеристик. Необходима дополнительная информация об относительной заселенности уровней в двойной потенциальной яме, которая может быть получена, например, из спектров ЯМР на ядрах 15N.

4. Увеличение константы диэлектрической проницаемости растворителя приводит к дополнительному усилению формально симметричной водородной связи типа (AHA) за счет уменьшения кулоновского отталкивания двух фрагментов, несущих частичный одноименный заряд. В случае несимметричной водородной связи (AHA') усиление полярности среды приводит к постепенному смещению протона в сторону менее компактного и, следовательно, слабее сольватируемого фрагмента.

Научная и практическая значимость работы Обнаруженная высокая чувствительность H/D изотопного эффекта на химическом сдвиге сигнала 13С карбоксильной группы к слабым изменениям среднего положения протона в водородной связи может быть использована для изучения строения комплексов, образующихся в сложных системах, например, при фермент-субстратном взаимодействии. Насколько нам известно, найденная в работе зависимость этих двух величин является единственной (опубликованной) закономерностью такого рода для водородных связей в растворе. Предложенный метод определения кратности ассоциации молекул в растворе (числа л в кластерах типа по кратности изотопного расщепления сигналов ЯМР

имеет самостоятельное значение для физики ассоциированных жидкостей. Обнаруженный эффект сильного влияния полярности среды на спектры ЯМР систем с водородной связью может использоваться для решения обратной задачи -спектроскопического определения эффективной (микроскопической) диэлектрической проницаемости там, где она не может быть измерена прямо, например, в активных центрах ферментов и фермент-субстратных комплексов, в той или иной степени экранированных от водной среды. Необходимость решения подобных задач возникает при рассмотрении механизмов ферментативного катализа и других биохимических реакций.

Апробация работы. Результаты работы доложены на следующих научных конференциях: Всероссийская конференция «ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, Россия, 2000); 5-ый Международный Семинар по Магнитному Резонансу < (Спектроскопия и Томография) (Ростов-на-Дону, Россия, 2000); First Russian-Ukrainian-Polish Conference on Molecular Interactions (Gdansk, Poland, 2001); XV International School-Seminar 'Spectroscopy of Molecules and Crystals" (Chernihiv, Ukraine, 2001); 31st Congress AMPERE (Poznan, Poland, 2002); Gordon Research Conference "Isotopes in Biological and Chemical Sciences" (Ventura, USA, 2002); XV Conference-Workshop "Horizons in Hydrogen Bond Research" (Berlin, Germany, 2003).

Работа выполнялась при поддержке фантов РФФИ-ННИО № 03-03-04009, РФФИ № 02-03-32668, MAC № 03-03-06504, а также при поддержке стипендии имени Кекуле Фонда Химической Индустрии Германии.

Публикации. Основное содержание работы изложено в 2-х статьях и 8-ми тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 8-ми глав, в том числе введение и заключение, и списка цитированной литературы из 117 наименований и содержит 124 страницы машинописного текста, в том числе 47 рисунков и 21 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы исследования, сформулирована цель работы, аргументирован выбор экспериментальной методики и объектов исследования.

Первая глава. Первая глава отражает современное состояние вопросов, относящихся к теме диссертации. Короткие водородные связи (также называемые сильными или низкобарьерными - определение зависит от метода, используемого для их изучения) привлекают к себе постоянное внимание, поскольку по ряду характеристик занимают промежуточное положение между межмолекулярными взаимодействиями и ковалентной связью. Кроме того, короткие водородные связи обладают уникальными спектроскопическими свойствами (огромной шириной и интегральной интенсивностью полосы продольного колебания протона в ИК спектрах, химическим сдвигом протона-порядка 20-22 м.д.). В случае наиболее «прочных» связей (таких как в моноанионе малеиновой кислоты или в нейтральном комплексе коллидина с фтористым водородом) понятия ковалентной и водородной связей протона с тяжелыми атомами теряют свой смысл; мостиковый протон включен в трехцентровую четырехэлектронную связь (в этом случае можно даже говорить о формально двухвалентном водороде). Экспериментальным признаком трехцентровой связи считается сильное скалярное спин-спиновое взаимодействие между тяжелыми ядрами мостика. Анион FHF", например, как случай предельно сильной водородной связи, имеет симметрию D«,,, т.е. протон занимает строго центральное равновесное положение между ядрами фтора.

Высокая прочность коротких водородных связей используется для объяснения высокой каталитической активности многих ферментов: образование в переходном состоянии Короткой сильной водородной связи, по мнению некоторых авторов, может обеспечивать понижение энергии активации на 10-20 ккал/моль, что приводит к ускорению реакции на несколько порядков. Другие авторы объясняют роль короткой водородной связи несколько иначе. Короткая водородная связь может приводить к образованию на электронодонорном атоме активного центра значительного индуцированного заряда, что и понижает энергию активации химической стадии, минуя

термодинамически невыгодную стадию переноса протона на молекулу субстрата. Выбор между этими двумя гипотезами может быть сделан на основе количественных оценок как геометрии, так и прочности коротких водородных связей и позволит уточнить механизм катализа.

Как и для ковалентных связей, прочность водородной связи коррелирует с ее геометрией и вопрос об энергии (и, очевидно, симметрии) часто рассматривается в терминах геометрии связи, т.е. расстояний от протона до тяжелых ядер или общей длины водородного мостика. В настоящее время не существует методов прямого измерения межъядерных расстояний в водородном мостике в растворах, но в литературе предложено несколько корреляционных зависимостей, связывающих спектроскопически измеримые параметры, такие как частоты колебаний (продольного и поперечных) мостикового протона, химические сдвиги ядер и константы спин-спинового взаимодействия, с геометрией водородного мостика внутри данного класса комплексов. При этом используются либо кристаллографические данные о межъядерных расстояниях, либо данные квантово-механических расчетов.

Одним из эффективных методов исследования комплексов с сильной водородной связью является метод низкотемпературной ЯМР спектроскопии. Использование низких температур позволяет достичь режима медленного молекулярного и протонного обмена, когда на спектре разрешаются не только сигналы от комплексов различного состава и строения, но и сигналы от различных изотопомеров одного комплекса, а также становятся видны расщепления спектральных линий за счет скалярного спин-спинового взаимодействия ядер водородного мостика. В спектрах ЯМР трехцентровый характер водородной связи проявляется в виде значительного спин-спинового взаимодействия через водородный мостик, аномально высокого значения химического сдвига сигналов протона и дейтрона, а также положительного знака первичного изотопного эффекта, определяемого как разность химических сдвигов дейтрона и протона. Анализ химических сдвигов, констант спин-спинового взаимодействия и изотопных эффектов на них позволяет решать сложные структурные задачи. В частности, в случае формально симметричной водородной связи (AHA)" становится возможным отличить истинную симметрию с центральным равновесным положением протона от эффективной, вызванной вырожденным переходом протона, быстрым в шкале

времени ЯМР.

В случае сильных водородных связей, образованных молекулами карбоновых кислот, ближайшим к водородному мостику магнитно-активным ядром является углерод карбоксильной группы. Однако, в современной литературе практически отсутствуют данные, позволяющие интерпретировать 13С ЯМР сигналы карбоксильного углерода в терминах структуры водородной связи. Тем самым, крайне желательным является построение корреляционных зависимостей, связывающих геометрические и спектральные характеристики связи СОО...Н...В.

Вторая глава содержит описание техники эксперимента, экспериментальных установок и методики обработки результатов.

В качестве растворителя в работе использовалась специально синтезированная смесь дейтерированных фреонов CDF3/CDF2CI, с температурой замерзания ниже 100 К. Изменения относительных концентраций сказывается, в первую очередь,

на величине константы диэлектрической проницаемости растворителя. Однако, основные изменения этой константы происходят при изменении температуры. Так, диэлектрическая проницаемость эквимолярной смеси изменяется в два раза, от 20 до 40, при понижении температуры от 170 до 110 К.

Основные Эксперименты проводились на спектрометре Bruker АМ>(-500 (рабочие частоты 500 MHz для 1Н, 470 MHz для 19F, 125 MHz для "С, 76 МНгдля гН и 50 MHz для 15N), оборудованном низкотемпературными датчиками и системой охлаждения рабочего объема потоком испаряющегося азота Данная система позволяла варьировать температуру в диапазоне 300-100 К. Приготовление образцов для исследования происходило на установке высокого вакуума,

Обработка результатов проводилась в стандартных пакетах программного обеспечения, предлагаемых фирмой-изготовителем спектрометра. В тех случаях, когда это было необходимо, для численного разделения частично перекрывающихся линий использовалась программа, специально написанная для этой цели в пакете MatLab. Контуры линий предполагались гауссовскими. Построение и анализ аппроксимационных кривых проводились по методу наименьших квадратов с помощью встроенных в пакет Ongin процедур.

Третья глава посвящена исследованию ассоциации молекул уксусной кислоты и ацетат иона в апротонном полярном растворителе при низкой температуре методами 1Н, 2Н и 13С ЯМР спектроскопии.

Использование оригинальной методики вицинального НЮ изотопозамещения позволило доказать, что в данных условиях самоассоциация молекул уксусной кислоты идет исключительно путем образования циклических димеров (а не димер-тримерного равновесия, как, например, в случае ассоциации фосфиновой кислоты в аналогичных условиях) ослабление (удлинение) одной из водородных связей циклического димера при H/D изотопозамещении приводит к кооперативному ослаблению другой. Соответственно, сигнал мостикового протона частично дейтерированного комплекса смещается в сильное поле (см рис. 1).

бдоедтаый в шкале времен ЯМ^ц^ перенос протона убедительно доказывается JU s„(HD) »„доз^ мультиплетностью сигнала 13С,

(HD) jrD = о 35 Т = 110К

........... .................. „ возникающей при частичном

13 12 мл '32 131 130

" дейтерировании гидроксильной

8С(НН) 8с(НО) _____о группы Этот процесс может быть

8с(оо) и^с->3</ сн3 обнаружен и при рассмотрении

'ОИ V____<—</ тонкой структуры линий в 1Н

спектре, возникающей за счет

"С_l\J\k Т = 110К

I I I I I I I I I I I I

скалярного спин-спинового

рис. 1.1Н и ,3С спектры циклического димера уксусной

взаимодействия между ядром

кислоты *0-доля дейтерия углерода и протоном карбоксильной

группы, впервые измеренного в данной работе. Без учета этого взаимодействия вырожденный перенос протона в 1Н спектрах никак не проявляется. Таким образом, константа 2Jen несет в себе качественно новую структурную информацию.

При добавлении к раствору уксусной кислоты избытка SbCI5 впервые удалось изолировать мономер уксусной кислоты при низкой температуре. Самоассоциация уксусной кислоты в этих условиях подавлена за счет образования комплекса с переносом заряда, понижающего лротоноакцепторную способность кислорода карбоксильной группы. Строение такого мономера также было доказано при рассмотрении тонкой структуры сигналов и с использованием селективной развязки от протонов

Обнаружено, что в присутствии избытка ацетата тетрабутиламмония происходит образование бис-ацетата-аниона, . По знаку первичного H/D

изотопного эффекта было доказано наличие движения протона в двуямном потенциале;

этот факт получил дополнительное подтверждение в 13С спектрах ЯМР, где два ядра углерода карбоксильной группы магнитно эквивалентны (рисунок 2а).

По мере уменьшения относительного количества ацетат-иона было обнаружено формирование комплексов сложного состава, содержащих две и три молекулы кислоты, связанные водородными связями с ацетатом (пример на рисунке 26). Только при рассмотрении 13С спектров H/D изотопомеров стало возможным продемонстрировать наличие динамического процесса, приводящего к эквивалентности всех ядер углерода

карбоксильных групп внутри комплекса. В диссертации предложены схемы этого механизма.

Итак, структура сигналов карбоксильного углерода различных изотопомеров комплексов с формально симметричной водородной связью позволяет обнаружить сложные динамические процессы, происходящие в системе, а методика вицинального изотопозамещения может быть использована для исследования взаимного влияния соседних водородных связей. По таким качественным признакам как кратность изотопного расщепления и знаки вицинальных эффектов удается определять стехиометрию комплекса, делать выводы о конфигурации системы водородных связей и о характере кооперативного взаимодействия между ними.

Четвертая глава. В четвертой главе обсуждаются экспериментальные данные, полученные для гетеросопряженных ионов уксусной, моно-, ди- и трихлоруксусной кислот, а также для моноанионов малеиновой и цитраконовой кислот, полученные методами низкотемпературной 1Н, 2Н и 13С ЯМР спектроскопии в растворах в смеси фреонов CDF3/CDF2CI.

В предыдущей главе рассматривались комплексы, содержащие водородные связи типа ОНО между фрагментами, эквивалентными за счет быстых процессов протонного обмена. Нарушение такого рода эффективной (формальной) симметрии приводит к тому, что снимается усреднение сигналов

углерода различных карбоксильных групп и становится возможным раздельное наблюдение сигналов от каждого фрагмента. Наглядным примером служат спектры моноаниона малеиновой кислоты (формально симметричная система) и моноаниона

цитраконовой кислоты (симметрия нарушена введением метильной группы), см. рис 3. Видно, что несимметричное возмущение очень сильной внутримолекулярной водородной связи мало сказывается на 1Н и 2Н ЯМР спектрах, тогда как изменения на 13С спектрах качественные: сигналы неэквивалентных карбоксильных групп хорошо разрешены, а изотопный эффект на химическом сдвиге оказывается крайне чувствительным к слабым структурным изменениям, обусловленным асимметризацией.

К аналогичному выводу приводит и рассмотрение серии спектров гетеросопряженных анионов молекулы уксусной кислоты с моно-, ди- и трихлорацетатами. Здесь при последовательном уменьшении основности замещенного ацетата и, как следствие, ослаблении водородной связи, происходит монотонное уменьшение величины H/D изотопного эффекта на химическом сдвиге сигнала углерода карбоксильной группы молекулы уксусной кислоты. Стоит подчеркнуть, что величина изотопного сдвига не может полностью определяться средним расстоянием до протона, т.к. в этом случае знак эффекта был бы противоположным для обоих фрагментов, как ацетата, так и замещенного ацетата, что противоречит эксперименту - сигналы обоих углеродов смещаются в сильное поле при дейтерировании.

„Пятая глава содержит описание экспериментальных данных по измерению низкотемпературных 1Н и t3C ЯМР спектров комплексов, образованных молекулами уксусной кислоты и рядом азотсодержащих оснований в растворе в

Нейтральные межмолекулярные комплексы с сильной водородной связью типа OHN между карбоновыми кислотами и гетероциклическими основаниями представляют значительный интерес вследствие широкого распространения таких связей в биологических системах. Например, детальное знание структуры водородных связей в активных центрах фермент-субстратных комплексов аспарагиновых протеаз позволяет описывать механизмы ферментативного катализа. Однако, часто вопрос о положении протона внутри водородной связи остается открытым. Большой информативностью в

этих случаях обладают спектры ЯМР 15N, т.к. химический сдвиг азота в гетероциклических основаниях чувствителен, в первую очередь, к среднему расстоянию до протона, так же как и константа скалярного спин-спинового взаимодействия К сожалению, использование метки 15N не всегда возможно. В этих случаях ближайшим к водородной связи ЯМР-активным ядром оказывается углерод-13С карбоксильной группы молекулы кислоты. Тем не менее, в современной литературе крайне мало данных о связи спектроскопических параметров углерода карбоксильной группы со структурой водородной связи.

В диссертации изложены результаты, полученные методами 1Н и 13С спектроскопии для серии комплексов состава 1:1 между частично дейтерированной по гидроксильной группе молекулой уксусной кислоты-13С (CH313COOD) и азотсодержащими основаниями с различной протоноакцепторной способностью, CH313COO...H(D)...N (см. рис. 4). Так как в водородном мостике АНВ монотонное увеличение протоноакцепторной способности основания В приводит к постепенному переходу протона и формированию цвиттерионного комплекса А...НВ*, вариация акцепторов протона (в данном случае -замещенные пиридина, амины) позволила наблюдать спектры ряда сходных комплексов, различающихся средним положением мостикового протона и, соответственно, значениями спектральных параметров. Для каждого комплекса была дополнительно снята температурная зависмость1Н и 13С спектров. Таким образом, использование набора акцепторов протона и влияния диэлектрической проницаемости растворителя (при разных температурах) позволило проследить за процессом переноса протона в водородном мостике OHN. Интерпретация полученных зависимостей 1Н, 13С химических сдвигов, а также H/D изотопного эффекта, в терминах межъядерных расстояний проведена в следующей главе.

В шестой главе рассматривается вопрос о возможности корреляции легко измеряемых в жидкой фазе параметров ЯМР (химических сдвигов ядер, констант спин-спинового взаимодействия) со структурой водородного мостика, т.е. со средними межъядерными расстояниями.

Рассмотрение большого числа кристаллографических данных показывает, что два межъядерных расстояния, характеризующие линейную водородную связь не являются независимыми: изменение одного из расстояний приводит к закономерному изменению другого. Этот факт находит себе полуколичественное объяснение уже в рамках простой модели водородной связи, где потенциал продольного колебания протона принимается равным сумме двух «двухатомных» потенциалов. Можно показать, что для суммы потенциалов Морзе при некоторых допущениях выполняется уравнение вида - расстояния в

свободных молекулах АН и ВЫ, а öAH и ЬНв являются параметрами функции Морзе, определяющими крутизну стенок потенциальной ямы.

Следовательно, в рамках грубой аппроксимации, для описания геометрии линейной водородной связи можно ограничиться лишь одной переменной. В данной работе в качестве такой переменной используется степень структурной асимметрии водородной связи, Г= Уг[1АН -Гнв).

Вопрос о наличии универсальных соотношений, связывающих спектральные характеристики водородной связи с этим геометрическим параметром, решался в данной работе эмпирически, путем анализа достаточно широкого набора систем с водородной связью. Некоторым обоснованием таких корреляций является то, что функции магнитного экранирования ядер водородного мостика (в тех немногих случаях, когда их удалось рассчитать неэмпирически, на высоком уровне теории), выглядят весьма сходно для комплексов совершенно различного типа (симметричных и несимметричных, заряженных и нейтральных). Типичным видом функции экранирования протонов от параметра асимметрии водородной связи является функция с глубоким минимумом вблизи нуля.

Функции экранирования тяжелых ядер водородного мостика (15N, 13C), как правило, изменяются монотонно с перемещением протона от одного тяжелого атома к другому.

Пример использования полученных таким образом величин степени асимметрии водородной связи г для построения эмпирической корреляции H/D изотопного эффекта на химическом сдвиге 13С со средним положением протона показан на рис. 5. Видно, что абсолютная величина этого эффекта растет с растяжением ковалентной связи О-Н (усилением водородной связи), однако при дальнейшем малом смещении протона к центру она резко падает от своего максимального значения до нуля. Такая резкая зависимость может быть использована для наблюдения малых возмущений равновесной геометрии комплексов с участием карбоновых кислот.

Причиной падения величины H/D изотопного эффекта на химическом сдвиге сигнала карбоксильного углерода в комплексах с водородной связью OH...N может быть сдвиг таутомерного равновесия OH...N 4->0"...HN*, приводящий к тому, что

экранирование ядра 13СООН перестает

чувствовать дальнейшее смещение протона. Однако для сильных внутримолекулярных водородных связей типа [ОН...О] (например, кислых малеат- и цитраконат- ионов), где такое равновесие, судя по квантовохимическим расчетам, отсутствует, такое объяснение уже неприемлимо. Резкое падение изотопного эффекта на ядре 13С при приближении протона к центру противоречит гладкому и монотонному виду самой функции и требует специального квантово-

механического объяснения, возможно, вне рамок чисто геометрической модели.

В седьмой главе рассматриваются спектры ЯМР комплексов в средах с различной диэлектрической проницаемостью. Использование эмпирических корреляций, обсуждавшихся в предыдущей главе, позволило количественно оценить изменение геометрии водородной связи как при фазовом переходе (раствор в полярном растворителе - кристалл), так и при плавном изменении диэлектрической проницаемости за счет температуры, без смены растворителя (см главу 2).

Среднее положение мостикового протона в системах с водородной связью чувствительно к наличию внешнего электрического поля, которое может создаваться, в частности, окружающими комплекс атомами и молекулами. В жидкой фазе существенный вклад вносит реактивное поле, связанное с ориентационной поляризацией молекул растворителя, обладающих дипольным моментом. Так, например, нейтральные комплексы с водородной связью типа ОН ..Ы претерпевают при помещении в полярную среду сильные изменения, связанные со смещением протона к атому азота (полной или частичной ионизацией, В качестве движущей силы такой

трансформации естественно предлагалась преимущественная сольватация цвиттерионной формы, обладающей более высоким дипольным моментом.

В данной работе низкотемпературные 15Ы ЯМР спектры ряда комплексов коллидина- с кислотами, снятые в смеси фреонов сравнивались с

данными, полученными ранее в кристаллической фазе. При сравнении параметров

СИ,

сн,

О -20

0.4

- 0.2

рис. 6.

а (4) „'■**' „• (5)

б N \ «I *'-.,<=> \

|>0

1 >4: '>р

асимметрии п И Г5 для этих комплексов в двух фазах (I -жидкая, в - твердая фаза) оказалось, что кристаллизация из раствора во всех случаях привела к смещению протона в сторону атома кислорода. Более того, впервые было найдено, что некоторые, существенно цвиттерионные, комплексы типа переходят в чисто молекулярную

форму ОН...М при кристаллизации (см. рис. 6). Этот результат естественно объясняется тем, что часть диэлектрической проницаемости среды, обусловленная ориентационной

поляризацией, при кристаллизации падает до нуля.

В отличие от нейтральных комплексов с водородной связью, движение протона в заряженном комплексе не сопровождается заметным изменением абсолютной; величины дипольного момента. Поэтому обнаруженные в данной работе сильные температурные изменения в спектрах анионных комплексов молекул уксусной кислоты с фторид ионом, а именно

[Асоня]" и [(Асоьед-,

представляются неожиданными. В комплексе [ДсОНР] образуется крайне сильная водородная связь, в которой протон занимает практически центральное положение между тяжелыми атомами. Изменения в Н ЯМР спектрах обоих комплексов (главным образом, постепенное уменьшение константы скалярного спин-спинового взаимодействия соответствуют плавному сдвигу протона от атома фтора к кислороду карбоксильной группы при понижении температуры. Подобное смещение обусловлено энергетически более выгодной сольватацией компактного фторид иона по сравнению с ацетат-ионом, где отрицательный заряд распределен между двумя атомами кислорода. Обнаруженный эффект преимущественной сольватации более компактного иона, однако, должен отсутствовать в системах с симметричной водородной связью типа ОН...О. Изменения в Н спектрах ЯМР иона [АсО..Н..ОАс]~ с формально симметричной связью были интерпретированы в рамках другой электростатической модели, а именно, учитывающей уменьшение кулоновского отталкивания между атомами кислорода, несущими одноименный заряд.

Следует особо отметить, что обнаруженные в работе эффекты сильной чувствительности геометрии водородной связи к возмущающему действию среды позволяют, в принципе, решать обратную задачу: определение эффективной (микроскопической) диэлектрической проницаемости там, где она не может быть измерена непосредственно (например, в активных центрах белковых молекул, в той или иной степени экранированных от водной среды). В более общем случае возникает потенциальный метод восстановления свойств молекулярного окружения с помощью спектров ЯМР комплекса - зонда, помещенного в данную среду.

Изменение геометрии и ЯМР ,ина с бензойными кислотами

параметров при кристаллизации

комплексов 1:1

Восьмая глава. В восьмой главе рассматриваются перспективы использования 13С ЯМР спектроскопии в области сигналов углерода карбоксильной группы для исследования процессов с участием водородной связи и перехода протона в биологических системах.

Зачастую ближайшим к исследуемому водородному мостику магнитно-активным ядром оказывается углерод 13С карбоксильной группы, оказываясь, тем самым, наиболее прямым источником информации о строении водородной связи, который доступен методом ЯМР. Например, ранее предпринимались как экспериментальные, так и теоретические попытки использования H/D изотопного эффекта на химическом сдвиге карбоксильного углерода для определения структуры фермент-субстратного комплекса протеазы вируса иммунодефицита человека с пепстатином в качестве ингибитора (HIV-1 PR / Pepstatin). В диссертации показано, что интерпретация на основе «здравого смысла» может приводить к явно неверным результатам, тогда как квантово-механический расчет одного конкретного комплекса не позволяет делать достаточно аргументированные выводы для сходных систем. В то же время использование систематических зависимостей параметров наблюдаемых изотопных эффектов, их общего числа, величины и знаков от геометрии комплекса позволяет делать полуколичественные выводы о строении системы по ее ЯМР спектрам. В частности, возможность существования сильной водородной связи в комплексе следующая

из предложенной в диссертации интерпретации экспериментальных H/D изотопных эффектов в 13С спектрах, подтверждается независимыми кристаллографическими данными

Кооперативное взаимодействие цепочки водородных связей, играющее, например, ключевую роль в процессах ферментативного катализа сериновых протеаз, также должно отражаться на виде мультиплета, возникающего в 13С спектре при H/D изотопозамещении. Развитая в работе методика позволяет надежно относить линии изотопомеров, описывать характер кооперативности и предсказывать структуру комплекса. Тем самым, результаты работы могут быть распространены на широкий класс биологических систем.

В заключении сформулированы основные результаты работы:

1. Для широкого набора кислотно-основных комплексов с участием карбоновых кислот построена корреляционная зависимость, связывающая величину H/D изотопного эффекта на химическом сдвиге сигнала углерода карбоксильной -группы и среднее положение протона в водородном мостике. Эти результаты позволяют определять структуру комплексов по 13С спектрам ЯМР.

2. Предложена методика определения стехиометрии и структуры комплексов с несколькими водородными связями по количеству линий изотопомеров в спектрах ЯМР 1Н и 13С. С помощью схемы расщепления линий при изотопозамещении, а также константы спин-спинового взаимодействия ^(СООНХ обнаружены и интерпретированы различные динамические процессы, происходящие в системах с кооперативными водородными связями на примере самоассоциатов уксусной кислоты.

3. Для комплексов с несимметричным водородным мостиком АНВ увеличение константы диэлектрической проницаемости среды приводит к смещению равновесного положения протона (или к смещению таутомерного равновесия) к основанию; в зависимости от изначальной геометрии комплекса это может означать как усиление, так и ослабление водородной связи. В случае же системы типа (AHA)- увеличение диэлектрической проницаемости приводит к уменьшению электростатического отталкивания двух частично заряженных фрагментов А, т.е. к дополнительному сокращению (усилению) водородной связи.

4. Показано, что введение в комплекс с формально симметричной водородной связью заместителей, понижающих симметрию системы, позволяет по величине H/D изотопных эффектов в спектрах ЯМР 13С определять особенности формы потенциала продольного колебания протона.

Значительное участие в руководстве работой принимали вне. к.ф -м н. НС. Голубев и проф. д-р. Х.Х. Лимбах.

Материалы диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Schah-Mohammedi P., Shenderovich I. G., Detering С, Limbach H.-H., Tolstoy P. M., Smimov S. N.. Denisov G. S., Golubev N. S. //Hydrogen/Deuterium Isotope Effects on NMR Chemical Shifts of Formally Symmetric Complexes with a Strong Intermolecular Hydrogen Bond in Liquid Solutions at 100-150K. /J. Am. Chem. Soc. (2000), v.122(51), p.12878-12879.

2. Детеринг К., Толстой П. М., Голубев Н. С, Денисов Г. С, Лимбах Х.-Х. //Вицинальные H/D изотопные эффекты в спектрах ЯМР комплексов с кооперативно взаимодействующими водородными связями. Фосфорные кислоты. /Доклады Академии Наук (2001), том 379(3), стр. 353-356.

3. Толстой П. М., Смирнов С. Н., Детеринг К., Гиндин В. А., Голубев Н. С. //Использование вицинальных H/D изотопных эффектов на химических сдвигах для исследования симметричных водородных связей. /3-я Всероссийская Конференция «ЯМР в Структурных Исследованиях» - Казань, Россия, 4-7.04.2000, стр.63.

4. Смирнов С. Н , Толстой П. М., Гиндин В. А., Детеринг К., Шендерович И. Г., Лимбах X. X, Голубев Н. С. //Исследование коротких низкобарьерных водородных связей методом низкотемпературного ЯМР в сжиженных фреонах. /5-ый Международный Семинар по Магнитному Резонансу (Спектроскопия и Томография) - Ростов-на-Дону, Россия, 19-22.09.2000, стр.80.

5. Tolstoy P. M., Denisov G. S., Golubev N. S.f Shenderovich I. G., Detering C, Limbach H.-H. //The Influence of Intermolecular Interactions on the Equilibrium Geometry and NMR Spectra of Symmetric Hydrogen Bonds. /First Russian-Ukrainian-Polish Conference on Molecular Interactions - Gdansk, Poland, 10-16.06 2001, p.52.

6. Tolstoy P. M., Shenderovich I. G., Schah-Mohammedi P., Detering C, Smimov S. N.. Gindin V. A., Golubev N. S., Denisov G. S., Limbach H.-H. //Structure of Formally Symmetric Hydrogen Bonded Anions in Polar Solution. /Proceedings of the XV International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals" - Chemihiv, Ukraine, 23-30.06.2001, p.162.

7. Tolstoy P. M., Golubev N. S., Denisov G. S., Limbach H.-H. //H/D Isotope Effects on 13C NMR Chemical Shift of Carboxylic Carbon Nuclei in Simple Acid-Base Complexes. /31st Congress AMPERE - Poznan, 14-19.07.2002, p.247.

8. Tolstoy P. M., Shenderovich I. G., Smirnov S. N., Golubev N. S., Denisov G. S., Limbach H.-H. //Temperature Dependencies of NMR Indications of Low-Barrier Hydrogen Bonds In Polar Environment. /Gordon Research Conference "Isotopes in Biological and Chemical Sciences"-Ventura, USA, 17-22.02.2002.

9. Tolstoy P. M., Smirnov S. N., Golubev N. S., Denisov G. S., Limbach H.-H. //Spectroscopic Study of Acetic Acid Interaction with the Fluoride Anion in Polar Aprotic Environment. /XV Conference-Workshop "Horizons in Hydrogen Bond Research" - Berlin, Germany, 16-20.09.2003, 3P54.

10. Tolstoy P. M., Golubev N. S., Denisov G. S., Limbach H.-H. //Deprotonation of the Carboxylic Group Monitored by H/D Isotope Effects on 13C NMR Chemical Shift Measured in Slow Exchange Regime. //XV Conference-Workshop "Horizons in Hydrogen Bond Research" -Berlin, Germany, 16-20.09.2003, 3P10.

ЛР № 040815 от 22.05.97.

| Подписано к печати 10.03.2004 г. Формат бумаги 60X84 1/16. Бумага офсетная.

Печать ризографическая. Объем 1 пл. Тираж 100 экз. Заказ 3186. I Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ

; с оригинал-макета заказчика.

{ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26.

р-56 ей

Глава 1. Введение и постановка задачи

Применение ЯМР для исследования водородных связей

Основные цели работы

Структура диссертации

Глава 2. Описание экспериментальных установок и техники эксперимента

Описание спектрометра

Техника низкотемпературной ЯМР спектроскопии

Синтез и очистка смеси фреонов

Методика приготовления образцов

Измерение и обработка спектров ЯМР

Синтез некоторых из исследовавшихся соединений

Глава 3. H/D изотопные эффекты в'Ни 13С спектрах ЯМР уксусной кислоты в растворах, анализ структуры димеров и гомосопряженных ионов

Комплекс уксусной кислоты с SbCls

Циклические димеры уксусной и хлоруксусной кислот

Комплекс 1:1 уксусной кислоты с ацетат анионом

Комплекс 2:1 уксусной кислоты с ацетат анионом

Комплекс 3:1 уксусной кислоты с ацетат анионом

Эффекты кооперативности

Глава 4. Исследование сильной водородной связи уксусной кислоты с анионами по 'Н, 2Н, ,3С и I9F спектрам ЯМР

Комплексы уксусной кислоты с хлор-замещенными ацетатами

Комплексы уксусной кислоты с фторид анионом

Малеат и цитраконат анионы

Глава 5. Исследование водородной связи OH.N в комплексах уксусной кислоты с замещенными пиридина с использованием

H/D изотопных эффектов

Перенос протона

Использовавшиеся основания

Низкотемпературные и 13С спектры

Глава 6. Построение корреляционных зависимостей, связывающих параметры ЯМР спектров с геометрическими характеристиками водородной связи

Взаимозависимость межатомных расстояний в водородной связи

Связь ЯМР параметров с геометрией водородной связи

Связь 'Н химического сдвига с геометрией водородного мостика ОНО

Связь !Н химического сдвига с геометрией водородного мостика OHN

Связь геометрии комплекса с H/D изотопными эффектами 79 Связь химических сдвигов 815N, 5I9F и констант спин-спинового взаимодействия 'Jfh с геометрией комплексов

Глава 7. Влияние полярности растворителя на геометрию несимметричного водородного мостика. Анализ температурных зависимостей в JH, ,5N и ,9F спектрах ЯМР

Выбор объектов исследования 86 ЯМР параметры и структура комплексов коллидина с различными донорами протона

Влияние кристаллизации на геометрию водородной связи 94 Температурные зависимости в комплексах уксусной кислоты с фторид анионом

Глава 8. Основные результаты работы, перспективы их развития и применения

Перспективы развития и использования результатов

и постановка задачи. В последние годы внимание исследователей межмолекулярных взаимодействий сконцентрировано на сильной водородной связи. Актуальность изучения этого явления определяется назревшей необходимостью выяснения основных свойств и особенностей этого типа "неклассических" химических связей. В ряде экспериментальных и теоретических работ было показано, что для описания свойств сильных (и даже средних по силе) водородных связей недостаточно только электростатических представлений и что эти связи имеют определенные признаки ковалентности (ограничимся ссылками на несколько последних статей [1-5]). Для наиболее сильных водородных связей термины "ковалентная" и "водородная" связь теряют свое значение, т.к. мостиковый протон включен в трех-центровую четырех-электронную связь. В этом случае можно даже говорить о формально двухвалентном водороде. Например, анион [FHF]" относится к группе симметрии Dooh, т.е. протон занимает строго центральное положение между двумя ядрами фтора. Поэтому исследование энергетики, динамики, спектральных свойств самых сильных водородных связей, выяснение их специфики даст возможность серьезно дополнить существующие представления о природе химической связи. С другой стороны, быстро возрастает потребность в этих данных у смежных наук, среди которых наиболее быстро развиваются ферментативный катализ и нековалентный синтез наноструктур. Одна из основных целей синтеза наноструктур состоит в создании новых материалов, и дальнейшее развитие этого направления требует сведений о неаддитивиом взаимодействии сильных водородных связей, это самоорганизация молекулярных систем, молекулярное узнавание. Число таких работ стремительно растет, достигнуты впечатляющие результаты. Например, в [6] сообщается о создании методом самосборки наноструктуры из 27 компонент со 144 кооперативно взаимодействующими водородными связями. Размер образца 5 нм, есть перспектива для его увеличения. Роль водородных связей в подобных структурах освещена в обзорах [7-9]. Авторы отмечают, что материалы, созданные этим методом могут, подобно биополимерам, иметь исключительные механические свойства, нести гигантский запас информации, обладать высокоселективной каталитической активностью. Предположение о принципиальной роли сильной водородной связи в механизме ферментативного катализа впервые было высказано в 1994 г. [10-13] и породило большое число публикаций (упомянем только несколько обзоров и наиболее содержательных статей последних лет [14-22]). Прочность коротких водородных связей используется для объяснения высокой каталитической активности многих ферментов: образование в переходном состоянии короткой сильной водородной связи, по мнению некоторых авторов, может обеспечивать понижение энергии активации на 10-20 ккал/моль, что приводит к ускорению реакции на несколько порядков. Другие авторы объясняют роль короткой водородной связи несколько иначе. Короткая водородная связь может приводить к образованию на электронодонорном атоме активного центра значительного индуцированного заряда, что и понижает энергию активации химической стадии, минуя термодинамически невыгодную стадию переноса протона на молекулу субстрата. Выбор между этими двумя гипотезами может быть сделан на основе количественных оценок как геометрии, так и прочности коротких водородных связей и позволит уточнить механизм катализа. Упомянем, однако, что некоторые биохимики отнеслись скептически к этой идее. Впервые это сомнение сформулировано в [23], встречается оно и в отдельных публикациях последнего времени [24]. Сложность вопроса в значительной степени определяется тем, что в реакционном комплексе имеется несколько водородных связей, сильно взаимодействующих друг с другом и усиливающих (а иногда ослабляющих) друг друга за счет кооперативного эффекта. Кроме того, структура комплекса и кинетические характеристики процесса, включающего переход протона по водородной связи, зависят от влияния молекулярного окружения. Особенно важным представляется оценка влияния водного окружения или других полярных групп на строение водородной связи. Исследование кооперативных взаимодействий в комплексах с несколькими сильными водородными связями и влияния внешнего возмущения активно обсуждается в литературе и стало быстро развивающимся направлением физики ковденсированного состояния.Характеризуя состояние вопроса в настоящий момент, можно утверждать, что пока разработка проблемы находится в стадии накопления фактов и попыток их объяснения на основе нескольких предложенных моделей, но не вышла еще на уровень, позволяющий конструировать системы с заданными свойствами. Применение ЯМР для исследования водородных связей Одним из эффективных методов исследования комплексов с сильной водородной связью является низкотемпературная спектроскопия ЯМР. В диапазоне температур 100150 К замедляются процессы молекулярного и протонного обменов, что приводит к

1. Archer, Е. A.; Sochia, А. Е.; Krische, М. J., Chem. Eur. J. 2001, 7,2059.

2. Humbel, S., J. Phys. Chem. A 2002,106, 5517.

3. Souda, R., J. Phys. Chem. В 2001, 105, 5.

4. Gilli, G.; Gilli, P., J. Mol. Struct. 2000,552, 1.

5. Mueller-Dethlefs, K.; Hobza, P., Chem. Rev. 2000,100, 143.

6. Paraschiv, V.; Crego-Calama, M.; Fokkens, R. H.; Padberg, C. J.; Timmerman, P.; Reinhoudt, D. N., J. Org. Chem. 2001, 66, 8297.

7. Archer, E. A.; Gong, H.; Krische, M. J., Tetrahedron 2001,57,1139.

8. Timmerman, P.; Prins, L. J., Europ. J. Org. Chem. 2001,17, 3191.

9. Timmerman, P.; Reinhoudt, D. N.; Prins, L. J., Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40,2382.

10. Голубев, H. С.; Гиндин, В. А.; Лигай, С. С.; Смирнов, С. Н., Биохимия 1994,50, 613.

11. Cleland, W. W.; Kreevoy, М. М., Science 1994,264, 1887.

12. Frey, P. A.; Whitt, S. A.; Tobin, J. В., Science 1994, 264, 1927.

13. Golubev, N. S.; Denisov, G. S.; Gindin, V. A,; Ligay, S. S.; Limbach, H.-H.; Smirnov, S. N., J. Mol. Struct. 1994,322, 83.

14. Overgaard, J.; Schiott, В.; Larsen, F. K.; Iversen, В. В., Chem. Eur. J. 2001, 7,3756.

15. Katz, B. A.; Erlod, K.; Luong, C.; Rice, M. J.; Mackman, R. L.; Sprengeler, P. A.; Spencer, J.; Hataye, J.; Jane, J.; Link, J.; Litvak, J.; Rai, R.; Rice, K.; Sideris, S.; Verner, E.; Young, W., J. Mol. Biol. 2001,307, 1451.

16. Northrop, D. В., Acc. Chem. Res. 2001,34,790.

17. Kim, K. S., Biochemistry 2002,41,5300.

18. Cleland, W. W., Arch. Biochem. Biophys. 2000,382, 1.

19. Gerlt, J. A., Compr. Nat. Prod. Chem. 1999,5,5.

20. Schowen, К. В.; Limbach, H.-H.; Denisov, G. S.; Schowen, R. L., Biochem. Biophys. Acta 2000,1458,43.

21. Shan, S. O.; Herschlag, D., Methods Enzymol. 1999,308, 246.

22. Perrin, C. L.; Nielson, J. B. Annu. Rev. Phys. Chem. 1997, 48, 511.

23. Warshel, A.; Papazyan, A.; Kollman, P. A., Science 1995,269,102.

24. Stratton, J. R.; Pelton, J. G.; Kirsch, J. F., Biochemistry 2001,40, 10411.

25. Garcia-Viloca, M.; Gelabert, R.; Gonzalez-Lafont, A.; Moreno, M.; Lluch, J. M., J. Phys. Chem. A 1997,101, 8727.

26. Kumar, G. A.; McAllister, M. A., J. Org. Chem. 1998, 63, 6968.

27. Del Bene, J. E.; Perera, S. A.; Bartlett, R. J., J. Phys. Chem. A 1999,103, 8121.

28. Lorente, P.; Shenderovich, I. G.; Buntkowsky, G.; Golubev, N. S.; Denisov, G. S.; Limbach, H.-H., Magn. Res. Chem. 2001,39, SI8.

29. Shenderovich, I. G.; Smirnov, S. N.; Denisov, G. S.; Gindin, V. A.; Golubev, N. S.; Dunger, A.; Reibke, R.; Kirpekar, S.; Malkina, O. L.; Limbach, H.-H., Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1998,102,422.

30. Grzesiek, S.; Cordier, F.; Dingley, A. J., Biolog. Magn. Res. 2003,20,255.

31. Del Bene, J. E.; Bartlett, R. J.; Elguero, J., Magn. Res. Chem. 2002, 40,161.

32. Sternberg, U.; Brunner, E., J. Magn. Res. A 1994,108,142.

33. Harris, Т. K.; Zhao, Q.; Mildvan, A. S., J. Mol. Struct. 2000,552,97.

34. Wei, Y.; McDermott, A. E., Modeling NMR Chemicals Shifts: Gaining Insights into Structure and Environment, Ed.: J. C. Facelli and A. C. de Dios, 1999,177.

35. Smith, R.; Brereton, I. M.; Chai, R. Y.; Kent, S. В. H., Nature Struct. Biol. 1996,3, 946.

36. Siegel, J. S.; Anet, F. A. L., J. Org. Chem. 1988,53,2629.

37. Shenderovich, I. G.; Burtsev, A. P.; Denisov, G. S.; Golubev, N. S.; Limbach, H.-H., Magn. Res. Chem. 2001,39, S91.

38. Grant, R. F.; Davidson, D. W.; Gray, P. J., J. Chem. Phys. 1960, 33, 1713.

39. Chapman, K.; Crittenden, D.; Bevitt, J.; Jordan, M. J. Т.; Del Bene, J. E., J. Phys. Chem. A 2001,105, 5442.42. (a) Delanoye, S. N.; Herrebout, W. A.; van der Veken, B. J., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124,11854. (b) ibid, page 7490.

40. Becker, H. G. O., Orgartikum; Barth: Leipzig, 1993, p. 170.

41. Dimroth, K., Angew. Chem. 1960,10, 331.

42. Luecke, H.; Schobert, В.; Richter, H. Т.; Cartailler, J. P.; Lanyi, J. K., J. Mol. Biol. 1999, 291, 899.

43. Mildvan, A. S.; Massiah, M. A.; Harris, Т. K.; Marks, G. Т.; Harrison, D. H. Т.; Viragh, C.; Reddy, P. M.; Kovach, I. M., J. Mol Struct. 2002, 615,163.

44. Golubev, N. S.; Denisov, G. S.; Koltsov, A. I., J. Mol. Struct. 1981, 75, 333.

45. Golubev, N. S.; Denisov, G. S.; Smirnov, S. N.; Shchepkin, D. N.; Limbach, H. H., Z.f. Phys. Chem. 1996,196, 73.

46. Jentschura, U.; Lippert, E., Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1971, 75, 556.

47. Shenderovich I. G.; Limbach H. H.; Smirnov, S. N.; Tolstoy, P. M.; Denisov, G. S.; Golubev, N. S., Phys. Chem. Chem. Phys. 2002,4, 5488.

48. Pecul, M.; Leszczynski, J.; Sadlej, J., J. Chem. Phys. 2000,112, 7930.

49. Brbot-Saranovic, A.; Hadzi, D.; Hodoscek, M.; Orel, В., J. Mol. Struct. 1986,140, 269.

50. Smirnov, S. N.; Golubev, N. S.; Denisov, G. S.; Benedict, H.; Schah-Mohammedi, P.; Limbach, H.-H., J. Am. Chem. Soc. 1996,118,4094.

51. Emsley, J.; Hoyte, O. P. A., J. Chem. Soc. Perkin Trans. II1977,2079.

52. Clark, J. H.; Emsley, J., J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1974,1125.

53. Garcia-Viloca, M.; Gonzalez-Lafont, A.; Lluch, J. M., J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 1081.

54. Fernandez-Berridi, M. J.; Iruin J. J.; Irusta, L.; Mercero, J. M.; Ugalde, J. M., J. Phys. Chem. A 2002,106,4187.

55. Langner, R.; Zundel, G., J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1995,91, 3831.

56. Magonski, J., J. Phys. Org. Chem. 2002,15,204.

57. Dega-Szafran, Z.; Szafran, M., Heterocycles 1994,37, 627.

58. Drichko, N. V.; Kerenskaia G. Yu.; Schreiber, V. M., J. Mol. Struct. 1999,477,127.

59. Coates, L.; Erskine, P. Т.; Crump, M. P.; Wood, S. P.; Cooper, J. В., J. Mol. Biol. 2002, 318,1405.

60. Topf, M.; Varnai, P.; Richards, W. G., J. Am. Chem. Soc. 2002,124, 14780.

61. Barrow, G. M., J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 5802.76. (a) Fortes, A. D.; Brodholt, J. P.; Wood, I. G.; Vocadlo, L., J. Chem. Phys. 2001,115, 7006. (b) Katrusiak, A., NATOSci. Ser. //2001, 48, 73.

62. Hunter, Е. P.; Lias, S. G., J. Phys. Chem. Ref. Data 1998, 27, 413.

63. Augustin-Nowacka, D.; Makowski, L.; Chmurzynski, L., Analytica Chemica Acta 2000, 418,233.

64. Chmurzynski, L., Analitica Chemica Acta 1996,321,237.

65. Benedict, H.; Limbach, H.-H.; Wehlan, M.; Fehlhammer, W.-P.; Golubev, N. S.; Janoschek, R., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120,2939.

66. Steiner, Т., J. Phys. Chem. A 1998,102, 7041.

67. Smirnov, S. N.; Benedict, H.; Golubev, N. S.; Denisov, G. S.; Kreevoy, M. M.; Schowen, R. L.; Limbach, H. H., Can. J. Chem. 1999, 77, 943.

68. McDermott, A.; Ridenour, C. F., Encyclopedia of Nuclear Magnetic Resonance. Eds, D. M. Grant, R. K. Harris, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, 1996, p. 3820.

69. McAllister, M. A., Can. J. Chem. 1997, 75,1195.

70. Ladner, H. K.; Led, J. J.; Grant, D. M., J. Magn. Res. 1975,20, 530.

71. Hansen, P. E.; Langgaerd, M.; Bolvig, S., Polish J. Chem. 1998, 72, 269.

72. Ramos, M.; Alkorta, I.; Elguero, J.; Golubev, N. S.; Denisov, G. S.; Benedict, H.; Limbach, H.-H., J. Phys. Chem. A 1997,101,9791.

73. Barnes, A. J.; Latajka, Z.; Biczysko, M., J. Mol. Struct. 2002, 614,11.

74. Andrews, L.; Wang, X., J. Phys. Chem. A 2001,105, 6420.

75. Andrews, L.; Wang, X.; Mielke, Z., J. Phys. Chem. A 2001,105, 6054.

76. Tomasi, J.; Persico, M., Chem Rev. 1994,94,2027.

77. Golubev, N. S.; Melikova, S. M.; Shchepkin, D. N.; Shenderovich, I. G.; Tolstoy, P. M.; Denisov, G. S., Z.f. Phys. Chem. 2003,217, 1549.

78. Foces-Foces, C.; Llamas-Saiz, A. L.; Lorente, P.; Golubev, N. S.; Limbach, H.-H., Acta Cryst. С1999, C55,377.

79. Benedict, H.; Shenderovich, I. G.; Malkina, O. L.; Malkin, V. G.; Denisov, G. S.; Golubev, N. S.; Limbach, H.-H., J. Am. Chem. Soc. 2000,122,1979.

80. Duthaler, R. O.; Roberts, J. D., J. Am. Chem. Soc. 1978,100,4969.

81. Hayashi, S.; Hayamizu, K., Bull. Chem. Soc. Japan 1991, 64, 688.

82. Pen-in, C. L.; Ohta, В. K., J. Mol. Struct. 2003,644, 1.

83. Smallwood, C. J.; McAllister, M. A., J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 11277.

84. Golubev, N. S.; Shenderovich, I. G.; Tolstoy, P. M.; Shchepkin, D. N., J. Mol. Struct. 2004, in press.107. (a) Piana, S.; Sebastiani, D.; Carloni, P.; Parrinello, M., J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 8730. (b) Piana, S.; Carloni, P., Proteins 2000,39,26.

85. Borgstahl, G. E. O.; Williams, D. R.; Getzoff, E. D., Biochemistry 1995,34, 6278.

86. Dux, P.; Rubinstenn, G.; Vuister, G. W.; Boelens, R.; Mulder, F. A. A.; Hard, K.; Hoff, W. D.; Kroon, A. R.; Crielaard, W.; Hellingwerf, K. J.; Kaptein, R., Biochemistry 1998, 37, 12689.

87. Kandori, H.; Iwata, Т.; Hendriks, J.; Maeda, A.; Hellingwerf, K. J., Biochemistry 2000, 39, 7902.

88. Xie, A.;Hoff, W.D.;Kroon, A.R.;Hellingwerf,K. J.,Biochemistry 1996,35,14671.