Особенности превращения свободных радикалов при радиолизе замороженных растворов желатина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.09 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ®ЗШ® им. Н.Н.СЕМЕНОВА

На правах рукописи УДК: 541.15, 577.391

СВАНИДЗЕ Елена Отаровна

ОСОБЕННОСТИ ПРЕВРАЩЕНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ ПРИ РАДИОЛИЗЕ ЗАВОРОЖЕННЫХ РАСТВОРОВ ЖЕЛАТИНА

02.00.09 - Радиационная химия

АВТОРЕФЕРАТ

днссертацвя на соискание ученой степени кандидата хжгачесасия наук

Воеква - 1992

Работа выполнена в Институте химической физики Российской АН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Е.М.НАНОБАШВИМ

доктор химических наук, профессор В.А.ШАРГШЫЙ

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор И.М.БАРКАДОВ

доктор химических наук, профессор Л.Т.БУГАЕНКО

Ведущая организация - Грузинский технический университет.

Защита диссертации состоится " ^ " ^ & 1992 в ^^ часов на заседании Специализированного Совета Д 002.26.04 в Институте химической физики Российской АН по адресу: 117977 Москва, В-334, ГСП-1 ул.Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики Российской АН.

Автореферат разослан " /¿7 " 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Д.002.26.04 л

кандидат химических наук / ЩЪс- ( А.В.ВОЛЫНСКАЯ

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность ггробле?д.>. Проблема лучевого поражения белка является одной' из сами актуальна* з современной радиационной химии и радиационной ÖKOJioriraV так как известно , что все стадии жизне- -деятэльнсстЕ! клетап и организма в целом совершаются при непременном участия белков. Белки - высокомолекулярные оргаккческие соединения, кмегщие елоетгу» структурнуэ организации. Необходимость исследования механизма лучевого поражения белковых молекул определяется тем, что: во-первых, белки составляя? 60-70 % от веса сухой тзакя п поэтому язлквтся основным "резервуаром" поглощаемой энергии ионизирующих излучений, во-вторых, белки в качестве фрагменте» входят в сосг&а «акйг, например, прнродннх комплексов, как хроматин, глкконротвкдм, липоаротеиря, гсоторуе формирует структуры клетки, ответственною за наследственные и иммунные функции ор-гаяизиа, функции транспорта через мембраны и т.п. Именно эти функции организма в значительной степени изменяются под влиянием об-лученая. Кроме того, белки-ферменты вклочены в система, репарируэ-щне повреждения при облучении клеток. Работа эти* систем также наруваетея под действием излучений на клетку. Отсюда несомненна г.-—Isert сведений о местах локализации первоначальных повреждений в белковых молекулах к механизмах развития этих повреждений вплоть до образования кокечкнх молекулярных химических продуктов радиолн-за.

Для понимания процессов, происходящих под действие!/ ионизи-рущнх излучений, лреяде всего необходимы знания первичных стадий радиолой банков, что даст возможность пеленаправлено влиять на арогехеаазяе процессы. Интерес к псслсдиванйп радиотрюкно-хямичее-ках врзцессов, протекавдзе в водных растворах беккоз, обусловлен тем, что большкнетво биологических систем вклвчае-г две тесно ssa-яйодвйсгауире ыезду еобо* подвггтемнг белжовуи подсистему и водное окруз5£йЦ8. Поотоку, .можно полагать, что ьедугзур роль в радиационных превраценяяг белков долины играть свободосрадьагыогс реакция радикальных продуктов радяолиза води.

К коыенгу постановки данной работа в литературе накопилось до?сяько иного ксследоланкй по радяоякзу белков, » т^лтеоетя, же-латяна. Шлг устаног;;'Мг^ осиоашо зффзято действия радоадеп ка зтет белег:: денатурации 5 деструкция и структурироаанае атого био-яолиерь ' сйраосьайзо enrasos), ¡кдеитяфицвровзя р.^т; ш.зиоиоягиу-лярнпх продувов Есесеззу .тэ родколгза (te^xer«* моле-

кул, приводящий к этгл.1 кояетези эффектам оставался неясинм. Имггз-

щиеся в литературе сведения о механизмах радиолиза таких модельных систем, как аминокислоты, пептиды и полиамиды лишь с большой осторожностью могут быть перенесены на белковые системы, в связи со сложностью и специфичностью радиологического поведения последних. До сих пор, например, непонятно, почему противоречивы данные о выходах тех или иных процессов, какова роль воды и роль продуктов радиолиза воды в пораженки белка и,в частности, желатина, какова роль свободных радикалов в формировании таких эффектов как деструкция и сшивки макромолекул, каков механизм их формирования, не идентифицировано большинство радикалов в желатине. На эти вопросы хотелось получить ответ.

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма первичных стадий лучевого поражения белковой молекулы и особенностей превращения свободных радикалов в облучаемом водном растворе желатина.

Основные задачи исследования: I) Используя приемы низкотемпературного облучения в сочетании с термо- и фотоотжигом образцов выяснить роль радикалов воды (е н ОН), при радиолизе желатина;

2) Выяснить места атахи в молекуле белка первичными продуктами радиолиза воды - установить по спектрам ЭПР природу макрорадикалов;

3) Изучить превращения первичных макрораднкалов белка; 4) Используя метод радиотермолюминесценции (РТЛ), изучить структурные характеристики водных замороженных растворов желатина в области температур 77-270 К и, сопоставив данные ЭПР и РТЛ - измерений, выяснить возможные направления превращений стабилизированных при 77 К первичных продуктов радиолиза - свободных радикалов, заряженных частиц; 5) Установить связь между превращениями первичных макрорадикалов и накоплением конечных химических продуктов радиолиза белков; б) Свести материальный баланс по основным продуктам низкотемпературного радиолиза растворов желатина.

Научная новизна. В работе определены наиболее вероятные места атаки продуктами радиолиза вода в молекуле белка, определены парциальные выходы различных типов радикалов и впервые оценено количество электронов и радикалов ОН, атакующих полипептидную цепь, идущих на ответвления и стабилизированных в системе. На основании полученных результатов сведен материальный баланс по промежуточным продуктам радиолиза водного раствора белка. Показаны особенности превращения свободных радикалов в облучаемом желатине.

Практическая значимость полученных результатов состоит в том, что: I) предложен механизм образования и особенностей превращения

регистрируемых свободных радикалов в водном замороженном растворе желатина; 2) на основании полученных данных и имеющихся в литературе превращения первичных макрорадикалов связаны с образованием

таких конечных эффектов в системе, как возникновение разрывов в

-----полипептидной цепи и изменение конформации исходной макромолекулы,

процессами дезаминярованкя, декарбонсилирования~и-др:;--3) разработана методика с кспользованием неагрессивного раствора-матрицы для изучения антирадахальной активности соединений; 4) определены относительные константы скорости иссле,дуемых веществ по отно-яенш к электрону а радикалам ОН (^О4-).

Воггсосн, выносимые па завтту:

- обсузкдается природа макрорадиналоа, идентифицированных в водных замороженных и сухих препаратах белков (желатине, гистоне, тимусе телекса, кэратте яерсти мергнсса 61 К),

- электроны атакуют аминокислотные оетаткг: лязпна, фенилаланина, двсулъфидше связи, радикалы ОН - остатки глицина и аланина (связи Сс4 - Н в полнпепткдной цепи),

- деетрухция (уменьшение молекулярной массы) молекул белка связана с изомеризацией первичных анион-макрорадикалов йц , макрорадикалов типа Я* с расщеплением связей в полнпепткдной цепи,

- в случае аналогичного превращения анион-макрорадикалов со свободной валентности, локализованной на прояиновых остатках, происходит не разрыв яолипептидяой степи, а изменение конформации кеходаой белковой молекулы,

- предлагеется схт& превращения осясзнчх типов первичтэтс мая-рорадикело« я облученных растворах яелатана,

- на основе РТЛ-лзмерений облученнкх замороженных растворов желатина разработана методою оденяп ан*крздккаяьяс8 актагкоста (ркцепторгйяс свсЯстз) ра^плют соединен?«;! по отнбшагяэ г зяелтро-г.ал н редтаглам ОН ( И90+ ),

Апробация тботы. Материалы диссертация докладывались на: У Р'-г^оря*-''-'^ г'^-'и^нс^ол-'о/аио" кок'ффгттцтп: "^тто.тсгвя клетки" (Тбк--.'■и-л?., 1907 г.1'1; Л1 -^"¿ер?-."^-' ''¡а&гиптаки у,езег:»чс в

биологии и медицине" (Черноголовка, 1989 г.); а БсесоааасЛ гонфе-ргащки "Еяоантеоясидан?* (Москва, 1989 г.); П Симпозиуме "Кинети-а-й переноса анергии в гомогеннкг и гетерогенная: системах" памяти р-.'огон-дл ( "■-.^уиП . 79':*' "..у, "ОЛОДИГ

ГГ' О Т.',.

о го,х":;!,/. с: 1г. ~г-¿г.--

Структура и объем работы. Диссертация изложена на № страницах машинописного текста, включая библиографию, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов к списка цитируемой литературы', содержит 12 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 202 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе I дан обзор литературы, посвященной основным радио-литическим эффектам в желатине. Проанализированы данные о природе первичных промежуточных продуктов, образующихся при радяолизе желатина и коллагена. На примере ряда работ отмечается противоречи-• вость сведений, касающихся природы первичных макрорадикалов, и полное отсутствие сведений о механизмах их превращений по стадиям вплоть до формирования конечных продуктов облучения белковых молекул .

Несмотря на появившиеся в литературе в последние годы различные публикации по промежуточным стадиям радиолиза белков (Са-пежинский И.И.,1988; Савич A.B., 1977; Девкин В.й., Михайлов А:й., 1978; Кудряшов Ю.Б., Беренфельд B.C.,1982; Милинчук В.К., Клин-шпонт Э.Р., Пшежецкий С.Я.,1980) и результаты исследований поведения облученных белков как полимеров (Нанобашвилн E.H.,1952; Высоцкая H.A., Руссаковский В.М., 1987, 1991; Дузгенкова H.A., Савич A.B., 1983), вопрос о механизме радиолиза белка в водном растворе все еще далек от полного разрешения.

Глава П. Выбор желатина в качестве основного объекта исследования обусловлен отсутствием в данном белке серосодержащих и незначительным количеством ароматических аминокислотных остатков, которые являются преимущественным местом атаки в белковой молекуле радикалов ОН к ё ГИдр (Амирагова М.И. и др.,1973), что существенно осложняет анализ ЭГГР спектров облученньтх белков.

В работе использовался пищевой желатин (мол.масса 153 тыс. дальтон, рН=6,0) Минералводского желатинового завода. Растворы ' желатина концентраций 2-20 % (вес.) приготовлялись на бидистилля-« те при осторожном нагревании на водяной бане предварительно набухшего желатина до 318-323 К. Препараты коммерческого желатина очищались путем многократной декантации бидистиллята е набухшего образца желатина до удаления примесей, обладающих поглощением в области 250-300 нм. Приготовление образцов, облучение при 77 К, "~*ЭПР- и РТЛ-измерения образцов проводились по общепринятым методикам.

Глава Ш. 3.1. Описаны регистрируемые при 77 К спектры ЭПР облуяемшх 5, 10 и 20 %~тгл растворов желатина. Спектры 311? ос-¡::.:иетр:г.гп.т, с обцей яирпиоП ¿Hojj4~I2~I4 к? я представляю'; собой, как показал еяаляз, результат налогфнхй ЗТТР-лнкнП радпкаготг ОЯ-, - -«с„ и раджагов• Зегка, И ^ (табл. I).

Пр™ т*пз"1енки кривых накопления радикалов в облучаемых при 77 К 5-20? р.'?стгср9_" келатяка установлен аналитический вид крп-внх С (К) = (1-е-кф), где С(Ю к С^ - концентрация радикалов, к - ког?С;\л'г:^ гкбелт: р&иахш'ОР непосредственно rrpíi обличений, 5D - догве оЗлучтк:':.. По "клейки?.' анаморфозам кривы:; кг;:ог;::Римя радикалов рассчитаны радиационно-химические выходи ( <3- = kCw) сум-,rLI пя Tiuvn jrf-H . ííx i! Gil « бслКй. .

Высокие значения выходов раднкалез и 2(Й-кьзс раггзера:: те-"-тина, близкие к таковым в случае яидкофазного радиолиза, свидетельству»1? о тон, что,во~первых;данная система представляет собой однородный; твердый, стеклообразный раствор, во-вторых, свободные радикалы белка играют доминирующую роль в деструнции белка даже в условиях его низкотемпературного облучения.

При длительном хранении (до 4-х месяцев) облученных растворов з жадном •я?«?'?'* су-гаяркад концентрация раджалоп белка и ра-р'-ткалоз ОН умекмагте.'! гфвд/^рнг на 20 Вкд спст-етра ЭП? облученного образца за вргкя хранезшк не изменяется, несколько уменыа-

г:?нгр*лi.rcí сюктр.ч s; радпхги.л: СЛ.

Йахясстдссг-. vmwmíp«.--« л^-ц^^рлдк:; радтаалог ОН сс ьрекеяеи

оЗрг?"т??« т г^лм азо?-? егоно епряу-

лтете.-- п »•о'>|).7Г.кз?«.г fOH >•-- EgT , что t«oк^т сч^де-таъсгвоз&ть j воалггаглг: - .^v-of' мегака;;?'^. ■гуиьйЛяровшшя злех'/т-о;:;..

(Забаваот У К.., Хайругд;.'!с:: Р.З. , "fecafbov Í.K., Гольда::С;п:й Б.И., 1971).

?дг ^-«¡.рораю-г??.:^ с ^с-г-лгзттпс*

"•'■'о:;'?',, ка потлпеп?::"'*;.^ целя ( я ) Í процесс г^рчиоьд-ния разр-jroB в белковой молекуле изучалось накопление радикалов в облучаемых при 77 К 5%-:шх замороженных растворах.

Таблица I

Характеристики радикалов, идентифицированных по спектрам ЭПР в облученных при 77 К в отсутствие кислорода растворах (5-2СЙ) желатина

Радикал Число компонент СТС Общая ширина спектру мТ а, мТ р. о 4 Содержание радикала, оценка для 2С$, %,& Предполагаемая структура радикала Реакция образования Температурная область регистрации, п

I 2 3 4 5 6 7 8 9

^ лиз 6, секстет (1:3:4:4:3:1) 12,5 а= аг2,3 а^=4,6 2,002 >10 ~0,3 'СНг-СНГ ^ЫНз^-ОН^СН^ 77-123

НаР 9, триплет (1:2:1) триплетов (1:2:1) »10 0^4,2 ав =0,8 2,002 >3 0,09 н Н н н 77-153

2, дублет (1:1) 3,5-4 а~ з 2,002 35 0,72 -№С(0>№Н 77-183

Продолжение таблицы I

I 2 "-з -1 4 5 б 7 8 ,:9

^ пр01 5, квинтет Г 1:2:2:2:1 9 О^й ..=1,9 <£=3.8 2,003 0,24 0 -¿-N14 * ¡1 0 У Р" —С-А/^сН-С'ИН-- -г (СН^ ' 0 0 и • и Ыи 153-183

гли 3,5 1,7 2,0024 20 0,37. -ед-м-сн- ОН 77-223

4 ала 4, кваотет (1:3:3:1) 6 1,7 2,0024 ¿Н3 ¿нэ -»ч-СИЗ}-ЫН'С- - tнi0 ¿Ид

I, екнгпет 1,2 1,2 ~2 133-203

ОН 2, ассимет- ричный дуплет -10,5 4 - 20 0,4 ОМ На0+ -» он -С нч Н40* -» н 6н 77-Ю5

е ст I .сигярт ~1 — > 7 0,16 € — ест 77-123

Таблица 2.

Выходы накопления свободных радикалов (суммарная величина, радикалы белка и ОН) и константы скорости разложения радикалов в ^-облучаемых при 77 К растворах желатина и гистона тимуса различной концентрации

Концентрация белка, % 'Чл и» ксн бон

Гистон

I 0,54*0,14 0,94*0,2 0,4*0,1 0,5 0,1

5 0,40*0,11 0,40*0,1 0,64*0,17 0,4 0,15 0,2

10 0,30*0,09 0,20*0,06 0,64*0,16 0,5 0,2 0,3

Желатин

5 0,60*0,12 0,70-0,15 1,04^0,2 1,8*0,5 0,8 1,5

10 0,50*0,11 0,64*0,16 0,52*0,12 3,1*0,6 2,3 1,2

20 0,26*0,07 0,22*0,06 0,33*0,08 6,3*0,4 3,5 2,7

Были определены б (Ип) и ОШ^ ). После облучения при 77 К образцы были разморожены. Методом электрофоретического анализа определялась молекулярная масса белка*\ По изменению средней величины молекулярной массы фракций облученного образца и контроля определены парциальные величины выхода разложения Фракций желатина. Установлен выход разрывов в 5^-ном растворе желатина,&^ра31рЫВ)=0,03/100эЕ Полученное значение удовлетворительно согласуется с величиной выхода разрывов, определенной методом ЭПР по радикалам.

3.2. Описываются экспериментальные данные по РТЛ растворов желатина (2-5-10$) (рис.1).

Установлена фазовая однородность, гомогенность 5 и 1(Ж растворов, для которых характерна кривая высвечивания с одним пиком при Т.,.,, „=105-2 К, в отличие от 2^ растворов. В качестве актива-

макс

тора свечения использовали тимин '0,025 М). Оценка энергии активации процесса РТЛ, проведенная на образцах после 6 часов хранения в исследуемых системах по наклону кривых зависимости £«. Тт) от 1/Т дает среднее значение 2,5-0,8 ккал/моль.

55' Опыты проводились совместно с Н.В.Закатовой.

Рис. I. Кривые высвечивания облученных при 77 К в дозе 10 кГр растворов желатина: а-- 10%-ные в присутствии тимина (0,025 М везде) - активатора свечения - I; то же + 5*I0~3M No-NOj- '''■< то ке а присутствии цистекна (0,2 И - 3; 0,4 М - 4); б - 5%-ные - I; то зе + 0,IM CHgCOONa - 2'; то же + 0,1 М CgHjgOg - 3. Запись кривых ъьу^ ? (а) я Х-.п с (б) после прекращения облучения.

■J X

---j--1--г-1-1--г—:—I-1 ■ I "

« £э is i-j an w <so сз ш

^г.анечип^'-**'

: ... —гти 77 К облученного (доза. 10

СИ я линейная вЫи.«/**»«:: ■ ?": •• г- •• "

Обращает на себя внимание форма кривых высвечивания (рис.1) растворов желатина - кривые асимметричны, свечение начинается не с нуля, т.е. образцу излучают свет непосредственно при температуре жидкого азота. Обнаружено существование свечения облученных образцов при 77 К - изотермическая люминесценция (ИГЛ), длившаяся в течение 4-6 часов после прекращения облучения. Затухание свечения в этом временном интервале следует гиперболической зависимости 10/1~Ь хран ^'

С ростом дозы интенсивность РТЛ возрастает, причем, начиная с 10-15 кГр кривая изменения интенсивности РТЛ от дозы проявляет тенденцию к выходу на плато. Аналогичная зависимость от дозы характерна и для изменения светосумш свечения РТЛ.

Полученные экспериментальные данные, а именно, обнаруженное явление ИТЛ, исчезновение свечения (ИТЛ и РТЛ) после отбеливания образцов нефильтрованным светом лампы накаливания, эффект хранения в жидком азоте, тенденция к выходу на плато кривых зависимости и *РТЛ от Я03" свыше кГр, позволили сделать вывод, что за свечения при 77 К (ИТЛ) и РТЛ (пик при Тмакс =105+2 К) ответственны электроны, высвобождающиеся из ловушек.

Изучено влияние вводимых в раствор-матрицу веществ-добавок на интенсивность свечения в условиях РТЛ и ИТЛ. Введение веществ-акцепторов радикалов в небольших концентрациях (от 10"^ до Ю~*М) не сказывается на форме кривой высвечивания и положении пика при Тмакс=105+2 К (рис. I а,б). Сохраняется при этом и гиперболическая зависимость интенсивности свечения, светосуммы свечения и интенсивности ИГЛ от времени хранения образцов в жидком азоте в течение нескольких часов. Присутствие акцептора электронов-ионов N03 приводит к уменьшению интенсивности люминесценции (ИТЛ и РТЛ) (рис. 1а). При введении в матрицу веществ-акцепторов радикалов ОН интенсивность ИТЛ и пика РТЛ возрастает (рис. 16). С увеличением концентрации этих веществ в растворе интенсивность свечения возрастает. При пересчете на молярную концентрацию связей С-Н данных соединений восходящие ветви концентрационных кривых изменения 1макс совмещаются (рис. 3). Это свидетельствует о протекании однотипных реакций во всех трех соединениях.

Глава 1У. На основании полученных данных методом ЭПР и измерений люминесценции (ИТЛ и РТЛ) сделан вывод о протекании при 77 К в облученных растворах желатина процессов рекомбинации радикалов ё + ОН -»> ОН" ё + Н^ расположенных попарно.

Ряс.З. Зависимость интенсивности свечения при Тмакс=105±2 К 10% растворов желатина и тимина от концентрации вводимых добавок а : I - СНоСООМа , 2 - Сс£ (СН3СОО)2, 3 - глюкоза; б : данные

пересчитаны на молярнуэ концентрации С-Н - связей.

Одинаковый ход кривых зависимости спада интенсивности ИТЛ и интенсивности РГЛ - пина при Тмакс=105±2 К свидетельствует о молекулярной "подвижности" компонентов в данной системе, т.е. о нестабильности ловушек электрона дате при 77 К (мягкая матрица).

Наблюдаемое отклонение от линейности зависимости в координатах 10 /I после хранения облученных образцов в жидком азоте в течение нескольких часов можно объяснить тем, что стабилизированные электроны , а именно электроны , находящиеся в ловушках, в тех млкрообластях, которые представляют собой мягкую матрицу, за эти несколько часов вступили в реакции, а оставшаяся часть электронов стабилизирована лишь на ловушках, располоконных в микрообластях, формирующих более жесткую матрицу. Исходя из этого г.ъг предположили существование з стеклообразных водных замороженных раствора:: желатина двух типов струхтурирэтакнвх биополимере* молекул годы. Порвнй Аориадоот "мягкую". второй - "жесткую" !гатргт;м л, таким образом, пары стабилизированных в этих матрицах радикалов Р и ё ... ОН распределена гсглс бы в разим* микрообластях системы "белок-вода".

По спектрам Э1ТР идентифицированы радикалы, образующиеся в результате атаки электроном желатина в растворе "лизиновыо" тлиз'' "ароматические" (йар) и "пролиновые" (Нпрол). Кпрол является своеобразным "индикатором" на образование радикалов типа !?„, со свободной валентностью, локализованной на атоме кислорода пептидной связи. Ивдефицированы радикалы П^, , Еапа, возникающие в результате атаки связи С* -Н в полипептидной цепи радикалами ОН Н при радиолизе сухих белков). Определены парциальные ра-диационно-химические выходы основных типов радикалов.

Сопоставляя эти величины для келаткка, гистона, кератина шерсти (сухой препарат) (табл.3) отметим, исключая конечно, ди-сульфидные связи для шерсти, одинаковую последовательность в по-ражаемости электроном отдельных фрагментов молекулы Г(5-5}] > (пептидные сзязи)> (лизин)> (ароматика) во Есех этих трех белках. При этом отметим также, что каждый белок в этой последовательности характеризуется'своей собственной шкалой относительной поражаемое™ указанных фрагментов: желатин - 4:3:1; гистон - 9:4:1; шерсть - 3:1:1. Примечательно, что по отношение к электрону ароматика оказалась на последнем месте в этом ряду, а реакционная способность карбогрулп пептидных связей выше, «см у положительно заряженных аминогрупп, т.е. данная последовательность явно не соответствует шкале реакционной способности индивидуальных аминокислот по отнопеиию к электрону. Можно было предположить, что такая последовательность - отражение вклада молекулярной доли аминокислотных остатков в белке (данные в таблице 3 е скобках). Однако, анализируя данные по рздколизу растворбв желатина, cyr.xy.p-ного гистона тимуса (10%) к кератина шерста (сухой препарат) при низкотемпературном облучении и приняв за I пораженке поптадних связей з каждом из откх белков, получили, что относительное поражение яисгаа и аргпшша в составе золкжа в два ра&& бокше.чен в растаоре тестона. Кэдду тем, колярная дсяя эта: оссаткоь в жа^.г-тине цргмарно з дпа раса гельггз по сразигкя» с гясуоном.

Из дачных ЭГР - г.-змерогпг! п оапоп по РТЛ облученных расчес-ров желаткна и гистона следует, что стеклообразные растворы халатика более однороги по фазе, пек пояЕф5:сяал;гаческяе рассори гкетоиа той те концентрации. Отсмда напрашивается вывод, что по-рзга&моегь того или иного емшоккслотного остатка б зс.\;ороксннсм растворе белка оаькзк? главным образов от *ого, насколько "тесно" связан оп с иояекулаж растворителя - воде, образует лк с кк».:г

Таблица 3

Парциальный выход первичных радикалов (%) и относительная поражеемость электроном фрагментов молекул е различных белках; (в скобках - молярная доля <%) аминокислотных остатков в составе белка ^ ~~~ --------- -------------

Б е л к и !__Тктте радикалов

1 R П " S- S ¿J ст

Желатин ,0 30 15 о 15

■V ¿Cíe р-р I 0,75 0,25

(100?) (Щ) '2,5«)

— со -i- - с. / . О /,0 о 0

суммарный I 0,4 0,1

102 р-р (I00Í) (2.2%) <4,4*)

Кератин 25 >10 7 40 0

шерсти I 0,4 0,3

'100« ао?) (7*) <Ш)

единую скстрму, одну и ту ие Лазу, и потоку - насколько облегчрн

к кр"у доступ свободных радикалов и, в частности, электронов. Из полученных данных следует, что з водных закороченных растворах яеяитина полярные группы лизин» и аргинина болте доступны электронам, чем з замороченных растворах гистона. Очевидно, эти амино-кксготггы* остатки и молекулк воды з растворах желатина в силу его структурнь-х особенностей образуют при замораживании одну и ту ¡пазу, что способствует направленной передаче поглотаемой растворителем энергии 'у,здикалсв воды) ка эти Фрагменты С.яховоР молекул^ и большему поражению этих аминокислотных остатков. Таким образом, г; р дяиком случае >а» пряхоцкм к виъоду о аущрстгюв&ннк структури-ровс1П<кх ::оляркн;.-ц группами ¿укчякпепо? ;^сле:;ул воды.

Глава У. В этой главе приводятся основные направления превращений зарегистрированных по спектрам ЭПР первичных макрорадикалов по стадиям С с учетом данных ЗП? измерений образцов при тер»»о- и ".'.'"таг,-; -">'гь Л''. р'П-гелр.-рогг^п'.дх« г-^мг-ь:?- и

Г.Г^ГГЛ'"'. р "Г.'-О Л И ¡1; г. Г'^кч;^л К •по

- г.-; :•>' *:'ПР""т:гл Кдприпр по порванным

' .....г ~~ 1 ;; г'"'!"т—;■ >"•" рр-д-- -- - • ,

нс«' их у адиап;'снно-хкмич«'пко! ч> нмход-ч.

Макрорадикалы Я лиз возникают в актах взаимодействия протони-рованных аминогрупп лизинового остатка с электронами (табл.1).При этом одновременно с образованием радикала выделяется аммиак (процесс дезаминирования белка). Этот акт сопровождается образованием в молекуле дополнительных гидрофобных групп (действительно регистрируемых), например, по реакции:

й ♦•СНА-1СНА}-~ * ССН^-СН^]: СИЛ~СНХ~"

При нагревании облученного при 77 К раствора белка происходит протонирование анион-макрорадикалов И и затем изомеризация их с расщеплением связей N-С^ . Это приводит к уменьшению молекулярной массы макромолекул и образованию амидного азота:

В результате гидролиза связей С-1x1^. образуется амидный аммиак. Таким образом, выход амидного аммиаку должен равняться выходу первичных макрорадикалов Я п, а точнее - выходу разрывов полипептидной цепи, С- (разр )' обусловленным участием в реакциях электрона. При локализации неспаренного электрона в радикале Я п вблизи аминокислотных остатков пролина и оксипролина изомеризация протони-рованного Я п не сопровождается разрывом цепи: р д

— с-а'ч'/С'н- с - ~ -*-с-ы-сн-с-~т^-С-*н ¿н-е-—

ЮН^ ' С««! 0 (СИД, ' К'Н «

(или+г,н4Г +

В этом случае должна лить измениться лонформация исходной макромолекулы.

Превращение радикалов И^ (Я гпи и Я апа), образующихся по реакции молекул белка с.радикалами ОН (табл.1), также должно сопровождаться расщеплением пептидной связи и поэтому - образованием разрыва в полипептидной цепи. При этом возникают радикалы типа Я-С=0 (а затем при их распаде - оксид углерода) и "шиффово" основание. Превращение последнего в результате взаимодействия с водой должно также приводить к образованию аммиака и одновременно альдегидной группы. Таким образом, суммарный выход аммиака соответствует выходу разрывов и радикалов лизинового типа:

&( ЯПИЗ) + &( яп) - &( Япрол) + ПА) =&( МН3) Полученные значения удовлетворительно согласуются с литературными данными по величине выхода дезаминирования желатина.

Выход процесса деструкции полимера (уменьшения молекулярной массы) за счет радикалов ОН, таким образом, должен соответствовать выходу "радикалов'и" равняться величине-G (СО). - ------- -----

Радикалы R рли, R ша в процессе термоотжига облученных образцов - замороженных растворов белков и сухих препаратов исчезают всегда одновременно, практически при одной температуре. Эти радикалы могут реагировать между собой с образованием дегидроала-нина, такие производные среди продуктов радиолиза действительно регистрируются. Этот процесс с наибольшим выходом протекает при облучении сисих препаратов^ ^

• и -и и У 9

w-I\!-C-C-~+~-N-(>-C-----—N-C-C-~+~-N-C-C-~

ii i) i и i I

Н СН3 Н Н Н СНг Н Н

Дегидроаланин может реагировать с аминогруппами аминокислотных остатков, благодаря чему возможно образование дополнительных сшивок - орнитиналаниновых связей. При взаимодействии дегидроаланино-вых звеньев с сульфгидрильными анионами (в облученной шерсти) образуются связи (сшивки) типа лантиониновых:

9 li+ У 9

~ - » +-Н | |

I н i i

Н СНЯ Н CH^-S-ft

Глава У1. Одной из задач исследования являлся поиск модельной системы - раствopa-матрицы для наблюдения за реакциями продуктов радиолиза воды с растворенными (испытуемыми) веществами (потенциальными радиопротекторами) и количественной оценки акцепторных свойств по отношению к радикала ОН и ё. Нами предлагается 1(Ж водный замороженный раствор желатина, содержащий в качестве активатора свечения тимин (0,025 М). Преимущества этой системы-матрицы: данная матрица - стеклообразный, однородный, твердый раствор; - в отличие от других стеклообразных растовороп-матриц, имеет нейтральный рН, т.е. не агрессивна по отношению к исследуемому соединению; - водный раствор балка является хорошей модельной системой для изучения антирадикальной активности соединений, потенциальных радиопротекторов, еще и потому, что процессы взаимодействия радикалов вода изучаются на «фоне радиолиза белка.

Для получения сведений об акцепторные свойствах соединений по отношению к радикалам (ё и ОН) изучалась люминесценция водных растворов желатина и тимина. Захват электронов, образующихся при облучении, вводимыми добавками, как уже отмечалось, должен снижать

выход этих частиц, стабилизирующихся на ловупках. Это в конечном итоге должно проявиться в уменьшении интенсивности свечения. Наоборот, захват зарядов противоположного знаьа должен приводить к большому выходу процесса стабилизации электронов на ловушках, что должно проявиться в возрастании интенсивности пика термогоминесценции (рис. I).

Предположив, что для исследовавшихся систем справедливо выражение для скорости реакции захвата электронов акцептором:

V =

где к - (аналогично, ) ~ коэффициенты пропорцио-

нальности, соответствующие константе скорости реакции в жидкой фазе, и, приняв, что при сопоставлении эффективности соединений одинаковое изменение интенсивности Д ?макс (спад или подъем) у двух веществ свидетельствует об одинаковой"скорости увода электрона (или ОН) е реакции, можно записать:

4=4= кДШм = [А10

Тогда: к^ГАКД/ОМд

Приняв к 2 за единицу, например, в случае глицина (наименее реакционноспособного из изучавшихся соединений по отношении и к электрону к к радикалам ОН), можно сопоставить эффективность соединений по отношения к радикалам с данными о реакционной способности веществ, полученных в случае жидкофазного радполиза (табл.4).

Таблица 4.

Относительная реакционная способность исследовавшихся соединений по отношении к электронам и радикалам ОНШ^СТ)

С о е д и н е н и е к- Спит,) ^ОН клк + №* (лит.

кгА + ОН

Глицин I I I I (рН 6)

3-оксиппридин 7 - 20 -

2-эткя-6-метил-3-оксипирндш 4 г 3 ! -

2,б-диметкл-3-оксипиридин 3 - 3 -

Пэгинол 15 - 50

Э Я К 200 - 30 500

Глутатнон 300 390 1500 880 (рН I)

Глакоза 0,3 0,5 I 100 (рН 7)

Цкстенн 500 1000 1000 . 790 (рН I)

Глутаминоаая кислота ~Ю 2,4 <рН в) 10 7,9 (рН 2)

Ацетат натрия 5 < 10 ! 5 4,3 (рН 9)

Ацетат кадмия 160 1 28

На.Ы 03 500 1200 I9 0,15

Из этого сопоставления сделан вывод об удовлетворительном соответствии сравниваемых величин.

в и ВОД н

-Т.-Изучена зависимость накопления свободных-радикалов в-об-.-

ду7;оо!.о;х ¡тр? 7'7 ~Ч раствора -елатанг. риг;-игчио'~- 7снгс('.г"рэг,;;и, определены всл'кчлиы :ci радкацкклю-ххккческсго шодда..

Г:. У',' спектрам ЗПР облученных годных ваыоро?:;онньвс растворив п сухих препаратов балков (желатин, гистонн тчг'усч т«лен;га, кератин горсте мерипосп 64 К) идепттгйяцирояяиь' осиовнь,в тип" "якрп-рвукалов, установлен;.' места a"Y¡Kh белковой молекулы пег.п»п<кь'мт; радикалами ОН, Н,ё. Электроны атакуют аминокислотные остатки ли-римя. ifiPHwiier&HUHa, рисуя wfw,иные связи, ОН - остатки глицина и яланинр (связи G-> -Kr иолипемтилной цепи).

í-v

3. При облучении водных замороженных растворов желатина и сухих препаратов кератина шерсти определены парциальные выходы основных типов радикалов при 77 К. Сведен материальный баланс (на 80/S) по окислительным к восстановительным продуктам радиолиза воды и белка.

4. Установлено, что деструкция белковой молекулы (уменьшение молекулярной массы) связана с изомеризацией протонированных первичных яняон-иакрорадикалов (R п) к макрерадякаяов типа . В случае анкон-мйярсредикалоБ со свободной валентностью, локализованной н.я протпснпБЫ;' остатнах, :тх превращение приводит не к разрыву пол'дпептидпой пени, a i: >:з:.'сиеш® кскЛ-ормаиии исходно'/, бсл-коьой молекулы. Предложены схем/ превращения основных первичных \сакрэрадакалов з облученных растворах белков, сбъяеняюциг процессы дсг«а>»ияировйния,обра!'овя»ия разрывов в полиг^лтняной пего» к ист-отеркх мезс- я внутримолекулярных описок, гидрофобных групп и т.п.

ö. Обнар;ужено изотермическое свечение облученных замороженных растворов жепптта при температуре жидкого азота, интенсивность коте poro снижается в присутствии веществ - акцепторов ял^ктрочов. Изучена радаотерколюминесценцая растворов .т.елатина концентрации 2—10% в интервале температур от 77 К до 250 К; регистрируемое возгорание люминесценции в низкотемпературной области с максимумом ггт- Т ^ТО^0 Ч ебт-г-енготая г^субянацисй ОН w гчдотптов белке с -»лсктрэнпми, зыгвоб.огдак'янмкея у о яспуйг , гсотпрыр яагфуз'эются в результате структурных изменений при нагревании облученных растворов т'отятинч. Подобраны условия активации свсчсни» введением .. раотзор--::птрицу тнмнна в концентрации 0,0.2с- !<!. Оценена знехгкя

активации процесса РТЛ Е = 2,5±0,8 ккал/моль. На основании данных ИТЛ-, РТЛ- и ЭПР-измерений предполагается существование двух типов структурированной желатином воды: молекул воды более и,. . менее жестко связанных с белковой молекулой.

б. На основе РТЛ-измерений облученных растворов желатина предложена методика оценки антирадикальной активности различных соединений (акцепторных свойств) по отношении к электрону и радикалу ОН. Изучена антирадикальная активность веществ, представителей различных классов "органических соединений, природных к синтетических, используемых в качестве терапевтических средств при лучевой и раковой патологии.

Публикации по теме диссертации:

1. Радиотермолюминесценция растворов желатина /Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А., Нанобашвили Е.М./ /Сообщ.АН ГССР, -I98I.-T.I04, - № I; - С.73-76.

2. Радиотермолвминесценция растворов желатина, содержащих цистеин и глутатион /Сванидзе Е.О., Закатова Н.В., Шарпатый В.А., Нанобашвили Е.М.// Сообщ.АН ГССР, -1982.-Т.107.- №3, - С.533-536.

3. Деструкция желатина при низкотемпературном облучении его водных растворов /Закатова Н.В., Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А.// Радиобиология, -1983.- Т.23, -2 - С.227-230.

4. Взаимодействие ОН я ё с 3-оксипиридинами при 77 К в стеклообразных растворах / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Изв.АН СССР, сер.Хим. -1984. - Т.2. - С.448-450.

5. Изучение реакции ОН в замороженных раствбрах методом термолюминесценции / Шарпатый В.А., Сванидзе Е.О. // Изв.Ali СССР, сер. Хим. - 1984. - Т.2, - С.445-448.

6. РадиотермолЕминесценция растворов желатина в присутствии глута-тиона и его предшественников / Сванидзе Е.О., Нанобашвили Е.М., Шарпатый В.А. // Изв.АН СССР, сер.Биол. -1985. -Т.4.-С.628-631.

7. Изучение реакционной способности экстракта печени катрана к других лекарственных препаратов по отношении к восстановительным к окислительным радикалам / Сванидзе Е.О., Бегиашвшш Ц.М., Клочгсо A.B., Шарпатый В.П. // Енояогия клетки.: Труды У Всесоюзной межуниверситетской конференции, - Тбилиси - 1987. -

с.562-565.

8. Определение реакшюнноК способности антнкскдантов и других хп-кйпескю. соединений по отнстзснма к первичным радгкалам радиолиза вода методом радиотермолгукнесценция / Сванидзе S.O., Шар-

пятый В.Л. // Исследование синтетических и природных антиок-сидантов ¿n vivo и In vitro : Методическое пособие под редакцией Кругляковой_К.Е. -Черноголовка. - 1987.

9. О природе макрорадикалов в гамма-сблученных"белках / Б?рва H.H., Садова С.Ф. , Сванидзе Е.О., Ильясова В.Б., Шарпатый В.А. //" Магнитный резонанс в биологии и медицине: Тез. УП Всесоюзной конференции. - Черноголовка. - 1989, - С.44-45.

10.Изучение антирадикальной активности биоактиоксидов, природных и синтетических методами радиационной химии / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Биоантиохсидант: Тез. И Всесоюзной конференции, - Москва, - 1989.» - С. 15-16.

П.Туннелировакие олектропа в водных замороженных растворах биополимеров / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Кинетика переноса энергии в гомогенных и гетерогенных системах: Тез. П Симпозиума памяти Р.Догонадзе. - Батуми. - 1989. - С.77-79.

12.Оценка реакционной способности некоторых антиоксидантов по отношению к окислительным и восстановительным частицам радиолиза воды методом РТЛ / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Фиэхимия-90: Тез. У1 Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов по физической химии. - Москва. - 1990, - С.96-97.

13.Радиолитическая деструкция белковой молекулы и радиозащита / Шарпатый В.А., Сванидзе Е.О. // Биоантиоксидант: ГУ Всесоюзная конференция - Москва.- Г992. - (в печати).

СУ